Inibidiores de Tirosinase

7/24/2019 Inibidiores de Tirosinase

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PAULA MONTEIRO DE SOUZA

ATIVIDADE DE INIBIO ENZIMTICA POR ESPCIES VEGETAIS DO BIOMA

CERRADO

Braslia, 2011


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UNIVERSIDADE DE BRASLIA

FACULDADE DE CINCIAS DA SADE

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS DA SADE


ATIVIDADE DE INIBIO ENZIMTICA POR ESPCIES VEGETAIS DO BIOMA

CERRADO

Dissertao apresentada como requisito paraa obteno do Ttulo de Mestre em Cinciasda Sade pelo Programa de Ps-Graduaoem Cincias da Sade da Universidade deBraslia.

Orientadora: Profa. Prola de Oliveira Magalhes Dias Batista

Braslia2011


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ATIVIDADE DE INIBIO ENZIMTICA POR ESPCIES VEGETAIS DO BIOMACERRADO

Dissertao apresentada como requisito paraa obteno do Ttulo de Mestre em Cinciasda Sade pelo Programa de Ps-Graduaoem Cincias da Sade da Universidade deBraslia.

Aprovado em 23 de fevereiro de 2011.

BANCA EXAMINADORA

Profa. Prola de Oliveira Magalhes Dias BatistaFaculdade de Cincias da Sade da Universidade de Braslia UnB

Presidente

Profa. Dmaris Silveira

Faculdade de Cincias da Sade da Universidade de Braslia UnB

Prof. Edivaldo Ximenes Ferreira FilhoInstituto de Cincias Biolgicas da Universidade de Braslia UnB


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AGRADECIMENTOS

Professora Prola pela orientao, pela amizade, pela confiana e por todos os

momentos de aprendizado que passamos juntas.

minha me, ao meu pai e aos meus irmos pelo incentivo, pelas preocupaes e

por sempre apoiarem minhas decises. Ao Felipe pelo amor, incentivo e

compreenso.

Professora Dmaris pela colaborao no projeto, por disponibilizar os extratos

vegetais do bioma Cerrado, pelos ensinamentos, apoio e ateno.

Ao Professor Luiz Alberto Simeoni pelo conhecimento, ateno e colaborao

nossa pesquisa, e por disponibilizar espao e estrutura do Laboratrio de

Farmacologia Molecular (FARMOL/UnB).

Professora Maria de Ftima Borin pelos ensinamentos, apoio e colaborao.

Ao Professor Francisco de Assis Rocha Neves por disponibilizar espao e estrutura

do Laboratrio de Farmacologia Molecular (FARMOL/UnB).

Ao Professor Antonio Teixeira do Laboratrio Multidisciplinar de Pesquisa em

Doena de Chagas por disponibilizar o uso do equipamento de leitor de microplacas.

Ao Professor Elton Clementino da Silva por disponibilizar os extratos da espcie

vegetal Eugenia dysenterica.

Aos colegas Paloma Michelle de Sales, Thas Almeida Pereira, Cntia Alves deMatos Silva, Pedro Ges Mesquita, Silas Dino de Sousa e Juliana de Oliveira

Pasiani pela colaborao, apoio e amizade.

FAPDF pelo apoio financeiro ao projeto de pesquisa. CAPES pela bolsa de

pesquisa e ao Programa de Ps-Graduao em Cincias da Sade.


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RESUMO

A pesquisa por substncias ativas presentes em plantas que possam inibir uma

enzima chave em um determinado processo metablico, de forma que sua ao seja

a mais seletiva possvel e com menores efeitos indesejveis, tem sido o alvo das

pesquisas na rea de medicamentos. O Brasil est entre os pases de maior

biodiversidade mundial, abrigando cerca de 55 mil espcies de plantas superiores

(aproximadamente 22% do total mundial). No entanto, o Cerrado que o segundo

maior bioma brasileiro com uma enorme variedade de espcies vegetais apresenta

at ento poucos estudos quanto a seus efeitos teraputicos, principalmente como

inibidores enzimticos. Nessa direo, este projeto props avaliar espcies vegetais

presentes no bioma Cerrado quanto atividade de inibio das enzimas -amilase,-glicosidase, tirosinase e acetilcolinesterase. Os inibidores de -amilase e de -

glicosidase, so utilizados no tratamento da diabetes por inibirem a hidrlise de

carboidratos no trato digestivo diminuindo a absoro de glicose pelo organismo. A

tirosinase est envolvida na formao da melanina, por isso seus inibidores so

clinicamente importantes para o tratamento de doenas relacionadas a

hiperpigmentao. O principal papel da acetilcolinesterase hidrolisar rapidamente a

acetilcolina na fenda sinptica das transmisses colinrgicas, sendo alvo para o

tratamento de doenas como Alzheimer. Para atingir o objetivo proposto, foraminvestigados 39 extratos de 14 espcies oriundas de 9 famlias do bioma Cerrado

sobre a atividade das enzimas. Os extratos com potencial atividade de inibio sobre

a -amilase foram os extratos aquosos das folhas de Pouteria torta, Pouteria caimito,

Pouteria ramiflora e Eugenia dysenterica, alm do extrato etanlico da casca do

caule de Stryphnodendron adstringens. Sobre a atividade da -glicosidase, os

extratos das espcies do gnero Pouteria, S. adstringens e E. dysenterica

demonstraram um elevado potencial de inibio. Os extratos que apresentaram

potencial de inibio sobre a enzima tirosinase pertencem s espcies Morus nigra,S. Adstringens, E. dysenterica, P. caimitoe P. torta. Porm, nenhum extrato testado,

foi capaz de influenciar na atividade enzimtica da acetilcolinesterase.

Palavras-chave: inibio enzimtica; -amilase; -glicosidase; tirosinase;

acetilcolinesterase; Cerrado.


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ABSTRACT

The search for active in plants that inhibit a key enzyme in a particular metabolic

process, so that its action is more selective as possible and with less side effects,

has been the focus of research in medicine. Brazil is the one of greatest biodiversity

in the world, gathering around 55.000 species of higher plants (about 22% of world

total). Cerrado is the second largest biome of Brazil with a widw variety of plant

species, so far has been poorly studied to evaluate the efficacy and therapeutic

effects of crude extracts or isolated compounds, mainly as enzyme inhibitors. The

aim of the present study was to investigate the inhibitory activity of Cerrado plant

extracts against -amylase, -glucosidase, tyrosinase and acetylcholinesterase. -

Amylase and -glucosidase inhibitors delay the digestion of carbohydrates,producing a reduction in the rate of glucose absorption and consequently reduction

of the postprandial plasma glucose. Tyrosinase is involved in formation of melanin,

so their inhibitors are clinically important for treatment of dermatological disorders

related to melanin hyperpigmentation. The main role of acetylcholinesterase is rapidly

hydrolyzes the neurotransmitter acetylcholine at brain cholinergic synapses as well

as at neuromuscular junctions, thus acetylcholinesterase inhibitors become targets

for the treatment of Alzheimers disease. This study was designed to establish the

inhibitory activity of 39 extracts prepared from 14 species from 9 families of Cerradoagainst -amylase, -glucosidase, tyrosinase and acethylcolinesterase. The plant

extracts which demonstrated a significant capability to inhibit -amylase were the

leaves of Pouteria torta, Pouteria caimito, Pouteria ramiflora and Eugenia dysenterica

aqueous extratcs, and the stem bark of Stryphnodendron adstringens ethanolic

extract. On the activity of -glucosidase, the extracts of the genus Pouteria, S.

adstringens and E. dysenterica demonstrated a high potential of inhibition. The

extracts that showed potential for inhibition of tyrosinase belonging to the species

Morus nigra, S. adstringens, E. dysenterica, P. caimito and P. torta. However noextract was able to influence the enzymatic activity of acetylcholinesterase.

Keywords: Enzymatic inhibition; -amylase; -glucosidase; tyrosinase;

acetylcholinesterase; Cerrado.


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LISTA DE FIGURAS

Figura. 1a. Estrutura da amilose (54)........................................................................21

Figura. 1b. Estrutura da amilopectina (54). ...............................................................22

Figura 2. Estrutura tridimensional da -amilase. O domnio A est representado em

vermelho, o domnio B em amarelo e o domnio C em azul. No centro

cataltico, o on clcio est representado como uma esfera azul e o on

cloreto como esfera amarela. As estruturas verdes so ligantes da enzima

na superfcie do stio ativo e na sua fenda (56).........................................23

Figura 3. Estrutura tridimensional da -amilase. O centro cataltico est representado

em vermelho (Domnio A), o domnio N-terminal em amarelo (Domnio N),o domnio C-terminal proximal em azul (Domnio C), o domnio C-terminal

distal em verde (Domnio D), o subdomnio B em violeta e o subdomnio B

em laranja (63). .........................................................................................25

Figura 4. Ligaes dos tomos de Cobre no stio ativo da enzima tirosinase (68)....26

Figura 5. Biossntese de melanina (67).....................................................................26

Figura 6. Estrutura da acetilcolinesterase. O estreitamento semelhante a uma

garganta (gorge) est representado como uma superfcie rosa. A entrada

para o stio ativo est no topo do estreitamento (80). ...............................28

Figura 7. Reao do DNS com o acar redutor (142). ............................................42

Figura 8. Valores de IC50 sobre a atividade da -amilase dos extratos vegetais do

Cerrado. Acarbose como controle positivo. (1) S. adstringens CC(e); (2)

P.torta F(a); (3) P. ramiflora F(a); (4)P. caimito F(a); (5)E. dysenterica

F(a)............................................................................................................56

Figura 9. Valores de IC50 sobre a -glicosidase. (Deox) Controle positivo

desoxinojirimicina; (1) G. americana F(e); (2) P. neochilus F(a); (3) P.

neochilusF(h); (4) H. speciosaF(h); (5)A. blanchettiFr(h); (6) H. speciosaF(e); (7) E. dysentericaF(h); (8) P. caimito F(e); (9) P. gardneriF(e); (10)

P. ramiflora F(e); (11) P. caimito F(a); (12) P. torta CFr(e); (13) E.

dysentericaF(e); (14) S. adstringensCC(e); (15) E. dysentericaF(a); (16)

P. ramifloraF(a); (17) P. torta F(a)............................................................62


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Figura 10. Valores de IC50sobre a tirosinase. cido kjico como controle positivo; (1)

E. dysentericaF(e); (2) P. caimitoF(a); (3) S. AdstringensCC(e); (4) P.

tortaF(a); (5) E. dysentericaF(a); (6) M. Nigra F(e)..................................69

Figura 11. Reaes envolvidas no mtodo de Ellman (181).....................................71


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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Extratos vegetais de plantas do Cerrado avaliados quanto a inibio

enzimtica............................................................................................40

Tabela 2 - Atividade de inibio dos extratos vegetais sobre a -amilase ................52

Tabela 3 - Valores de IC50dos extratos com atividade de inibio sobre a -amilase

.............................................................................................................55

Tabela 4 - Atividade de inibio dos extratos vegetais sobre a -glicosidase...........58

Tabela 5 - Valores de IC50 dos extratos com atividade de inibio sobre a -

glicosidase ...........................................................................................61

Tabela 6 - Atividade de inibio dos extratos sobre a tirosinase...............................65

Tabela 7 - Valores de IC50dos extratos com atividade de inibio sobre a tirosinase

.............................................................................................................68

Tabela 8 - Atividade de inibio dos extratos sobre a acetilcolinesterase.................72


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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AChE Acetilcolinesterase

DMSO Dimetilsulfxido

DNS cido dinitrosaliclico

DTNB cido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzico

IC50 Concentrao capaz de inibir 50% a atividade mxima

L-Dopa L-3,4-dihidroxifenilalanina

OMS Organizao Mundial de Sade

UB Herbrio da Universidade de Braslia

UEC Herbrio da Universidade Estadual de Campinas

UV Ultra-Violeta

NP -nitrofenol

NPG -nitrofenil--D-glicopiranosdeo


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SUMRIO

1 INTRODUO .......................................................................................................132 REVISO BIBLIOGRFICA..................................................................................15

2.1 PATOLOGIAS...................................................................................................15

2.1.1 Diabetes .....................................................................................................15

2.1.2 Hiperp igmentao da pele........................................................................16

2.1.3 Doena de Alzheimer ................................................................................19

2.2 ENZIMAS ENVOLVIDAS..................................................................................21

2.2.1 Amilase .................................................................................................21

2.2.2 -Glicos idase.............................................................................................232.2.3 Tirosinase ..................................................................................................25

2.2.4 Acetilcol inesterase ...................................................................................28

2.3. INIBIDORES ENZIMTICOS EXTRADOS DE PLANTAS..............................29

2.3.1 Inibidores de -amilase ............................................................................29

2.3.2 Inibidores de -gl icosidase......................................................................31

2.3.3 Inibidores de ti ros inase............................................................................33

2.3.4 Inibidores de acetilcolinesterase.............................................................34

2.4 CERRADO........................................................................................................36

3 OBJETIVOS...........................................................................................................39

4 MATERIAIS E MTODOS .....................................................................................40

4.1 EXTRATOS OBTIDOS DE PLANTAS DO BIOMA CERRADO ........................40

4.2 DETERMINAO DA ATIVIDADE DE INIBIO SOBRE A-AMILASE........41

4.2.1 Preparo das solues ...............................................................................41

4.2.3 Ensaio da atividade enzimtica da -amilase.........................................42

4.2.3 Controle positi vo para a atividade de inibio sobre a -amilase........43

4.3 DETERMINAO DA ATIVIDADE DE INIBIO SOBRE A -GLICOSIDASE

................................................................................................................................44


4.3.2 Ensaio da atividade enzimtica da -glicosidase ..................................45

4.3.3 Controle positi vo para a atividade de inibio sobre a -glicosidase .45

4.4 DETERMINAO DA ATIVIDADE DE INIBIO SOBRE A TIROSINASE.....46


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4.4.2 Ensaio da atividade enzimtica da t irosinase ........................................47

4.4.3 Controle positi vo para a atividade de inibio sobre a ti rosinase .......47

4.4 DETERMINAO DA ATIVIDADE DE INIBIO SOBRE A

ACETILCOLINESTERASE.....................................................................................47


4.4.2 Ensaio da atividade enzimtica da acetilcolinesterase .........................49

4.4.3 Controle posi tivo para a atividade de inibio sobre a

acetlcolinesterase ..............................................................................................49

4.5 DETERMINAO DA PORCENTAGEM DE INIBIO ENZIMTICA.............50

4.6 DETERMINAO DOS VALORES DE IC50DOS EXTRATOS VEGETAIS .....50

4.7 INFLUNCIA DOS SOLVENTES UTILIZADOS NA DILUIO DOSEXTRATOS VEGETAIS .........................................................................................51

4.8 ANLISE ESTATSTICA ..................................................................................51

5 RESULTADOS E DISCUSSO .............................................................................52

5.1 AVALIAO DA INIBIO DA ENZIMA-AMILASE POR ESPCIES DO

BIOMA CERRADO .................................................................................................52

5.2 AVALIAO DA INIBIO DA ENZIMA-GLICOSIDASE POR ESPCIES DO

BIOMA CERRADO .................................................................................................58

5.3 AVALIAO DA INIBIO DA ENZIMA TIROSINASE POR ESPCIES DOBIOMA CERRADO .................................................................................................64

5.4 AVALIAO DA INIBIO DA ENZIMA ACETILCOLINESTERASE POR

ESPCIES DO BIOMA CERRADO........................................................................70

6 CONCLUSO ........................................................................................................74

7 PERSPECTIVAS....................................................................................................75


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1 INTRODUO

A utilizao de plantas medicinais para tratamento humano, cura e preveno

de doenas, realizada pela humanidade h muito tempo. Certamente, a

teraputica moderna no teria atingido o grau de desenvolvimento atual se no

fosse o auxlio desse recurso como fonte de substncias ativas (1).

As plantas produzem uma variedade de substncias bioativas importantes

para a formulao de fitoterpicos, sendo assim uma importante fonte para

tratamentos de doenas. Segundo a OMS, planta medicinal qualquer planta que

possui, em um ou em vrios de seus rgos, substncias que podem ser utilizadas

com finalidade teraputica e exercem algum tipo de ao farmacolgica (2).Entre as estratgias utilizadas em todo mundo para o isolamento e

identificao de sustncias com potencial teraputico, a pesquisa por substncias

presentes em fontes naturais se destaca como uma das mais importantes, sendo

que as plantas e microrganismos cultivveis so as principais fontes de molculas

biologicamente ativas e terapeuticamente teis (3). Estima-se que 40% dos

medicamentos disponveis na teraputica atual foram desenvolvidos a partir de

fontes naturais, sendo as plantas responsveis por 25% desse total (4).

Em todo o mundo, apenas 17% da biodiversidade mundial foram estudadasquanto ao seu emprego medicinal e, na maioria dos casos, sem grande

aprofundamento nos aspectos fitoqumicos e farmacolgicos. Esses dados

apresentam o enorme potencial das plantas para a descoberta de novos

fitoterpicos e fitomedicamentos (4, 5).

O Brasil est entre os pases de maior biodiversidade mundial, abrigando

cerca de 55 mil espcies de plantas superiores (aproximadamente 22% do total

mundial). Entretanto, apenas uma pequena parcela da flora brasileira tem sido

pesquisada cientificamente quanto ao seu potencial farmacolgico (6).A pesquisa e o desenvolvimento de novos frmacos constituem uma das

etapas mais complexas do ponto de vista tecnolgico, pois, compreende as

atividades e o conjunto de conhecimentos necessrios gerao de novos

frmacos. A maior parte dos processos de produo resultam da sntese qumica de

novas substncias ou da extrao de princpios ativos de fontes naturais, que

passam por uma srie de testes de eficcia, toxicidade, potencial teratognico,


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testes farmacolgicos, estudos farmacotcnicos e ensaios clnicos, tornando essa

primeira etapa a mais complexa do ponto de vista tecnolgico (7).

Atualmente existe um grande nmero de plantas medicinais cujo potencial

teraputico tem sido estudado em uma variedade de modelos experimentais, e cujos

mecanismos de ao tm sido investigados quanto atividade de inibio

enzimtica. Estes estudos tm providenciado informaes teis para o

desenvolvimento de novas farmacoterapias a partir dessas plantas para o tratamento

de vrias doenas, inclusive diabetes, doena de Alzheimer e doenas relacionadas

a hiperpigmentao da pele.

Frmacos que inibem uma enzima chave em um determinado processo

metablico, de forma que sua ao seja a mais seletiva possvel e com menores

efeitos indesejveis, tm sido alvo de pesquisas na rea de medicamentos, taiscomo inibidores da -amilase, -glicosidase, tirosinase e acetilcolinesterase. Com

este intuito, enzimas, extratos vegetais, suas fraes e produtos isolados tm sido

objeto de pesquisa constante.

Neste sentido, a identificao de espcies vegetais do bioma Cerrado com

atividade inibitria das enzimas acetilcolinesterase, -amilase, -glicosidase e

tirosinase, poder contribuir para o desenvolvimento de novos medicamentos,

melhorando a qualidade de vida dos pacientes com doenas como Alzheimer,

diabetes e hiperpigmentao da pele, alm de promover uma explorao racional eauto-sustentvel do Cerrado Brasileiro.


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2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 PATOLOGIAS

2.1.1 Diabetes

Diabetes uma desordem metablica de etiologia mltipla caracterizada por

hiperglicemia crnica e alteraes no metabolismo e carboidratos, gorduras e

protenas (8), causada pela deficincia herdada ou adquirida na secreo de

insulina, resultando em um aumento do nvel de glicose no sangue (9).

Os efeitos em longo prazo da doena diabetes incluem alteraes micro e

macrovasculares que levam a disfuno, dano ou falncia de vrios rgos. As

complicaes crnicas incluem a nefropatia, com possvel evoluo para

insuficincia renal crnica; a retinopatia, com a possibilidade de cegueira;

neuropatias, com risco de lceras nos ps e amputaes e manifestaes de

disfuno autonmica, incluindo disfuno sexual. Pessoas com diabetes

apresentam risco maior de doena vascular arterosclertica, como doena

coronariana, doena arterial perifrica e doena vascular cerebral (10-12).

Diabetes considerado um problema de sade pblica que afeta milhes de

indivduos no mundo. Estima-se que em 2010 a doena tenha afetado 285 milhes

de adultos (20-79 anos) no mundo, aumentando para 439 milhes em 2030 (13, 14).

Esse nmero continuar crescendo devido ao aumento e envelhecimento da

populao, urbanizao crescente e ao aumento da prevalncia da obesidade e do

sedentarismo (15). Alm disso, a Federao Internacional de Diabetes (International

Diabetes Federation IDF) estima que 3,9 milhes de mortes tenham sido causadaspela doena diabetes em 2010, o que representa 6,8% da mortalidade mundial (13).

No Brasil, estima-se a existncia de mais de 7 milhes de indivduos com diabetes.

A previso de que o nmero chegue a 12 milhes em 2030 (14).

A doena diabetes classificada de acordo com a sua etiologia, podendo

existir em duas formas. O diabetes tipo 1 uma doena auto-imune do pncreas,

caracterizada pela diminuio absoluta da secreo de insulina devido destruio


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das clulas -pancreticas (16). O desenvolvimento do diabetes tipo 1 pode ocorrer

de forma rapidamente progressiva, afetando principalmente crianas e adolescentes

(11).Pacientes com diabetes tipo 1 devem administrar insulina exgena para evitar o

desenvolvimento de cetoacidose e reduzir o nvel elevado de glicemia (16).

O diabetes tipo 2 uma doena caracterizada pela resistncia insulina ou

pela deficincia da secreo de insulina (16). O diabetes tipo 2 prevalente em 90%

dos pacientes em todo o mundo (17). As estratgias teraputicas para o tratamento

da diabetes tipo 2 incluem diferentes tipos de mecanismo: estimulao da secreo

de insulina endgena, que incluem as sulfoniurias e meglitinidas; o aumento da

sensibilidade insulina, como as biguanidas e tiazolidinodionas; e a inibio da

degradao de oligossacardeos e dissacardeos, formado pelos inibidores das

enzimas -amilase e -glicosidase (10, 17).Uma das abordagens para o tratamento do diabetes tipo 2 a inibio da

captao de carboidratos pelas clulas intestinais, utilizando-se para isso os

inibidores das enzimas -amilase e -glicosidase. A -amilase responsvel pela

degradao de carboidratos em oligossacardeos e dissacardeos. Na membrana de

clulas intestinais, as -glicosidases so responsveis pela hidrolise desses oligo e

dissacardeos em monossacardeos (18). Assim, a inibio competitiva dessas

enzimas reduz a taxa de absoro de monossacardeos, levando a reduo da

hiperglicemia ps-prandial (18, 19). Atualmente, os inibidores de -amilase e -glicosidase incluem acarbose, miglitol e voglibose (8, 19-21).

2.1.2 Hiperpigmentao da pele

Hiperpigmentao da pele ou hipercromias so alteraes patolgicas na

colorao da pele que deixam manchas de cor varivel, causadas pelo aumento daproduo de melanina ou pela distribuio anormal de melanina e esto

relacionadas a fatores genticos e ambientais (22-24). O aumento da melanina

(melanodermias) tem cor varivel do castanho claro ao escuro, azulado ou preto

(23).

A melanina um biopolmero heterogneo, pigmentado, polifenlico de alto

peso molecular, responsvel pela cor da pele, do cabelo e dos olhos (25, 26). A


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melanina secretada pelos melancitos na camada basal da epiderme e

produzida dentro de organelas especializadas chamadas melanossomas, as quais

possuem especficas enzimas que controlam a produo de pigmentos (22, 26). Os

melancitos so clulas dendrticas que na epiderme agem em conjunto com

queratincitos e interagem na produo e distribuio de melanina humana durante

o processo de pigmentao (27). Melanina formada atravs de uma srie de

reaes oxidativas envolvendo o aminocido tirosina na presena da enzima

tirosinase (28). As melaninas podem ser classificadas em dois diferentes grupos, as

eumelaninas e as feomelaninas (29). As eumelaninas so pigmentos negros ou

marrons, geralmente insolveis, formados por seqncias de reaes oxidativas, a

partir da tirosina, L-Dopa, dopamina ou outras catecolaminas. As feomelaninas so

pigmentos de cores mais claras como vermelho ou amarelo, e podem ser obtidas deforma semelhante s eumelaninas, mas tambm possuem como precursores a

cistena ou a glutationa (25).

Alm da colorao da pele, a melanina protege a pele contra os raios

ultravioleta. Como filtro solar, a melanina difrata ou reflete a radiao UV. Aps a

irradiao, os melanossomas se reagrupam em torno do ncleo protegendo o

material gentico da clula (30, 31). Melanina tambm desempenha um papel

fundamental na absoro de radicais livres gerados no citoplasma (28). Apesar da

melanina ser importante para proteo da pele contra raios UV, sua produodesordenada pode levar formao de hipercromias (30). Entre as hipercromias

adquiridas mais comuns esto, o melasma, a melanose solar, as hipercromias

medicamentosas, as melanodermias txicas, nevos melancitos comum (conhecidos

como pintas) e as fitofotodermatoses (23).

A hiperpigmentao da pele ocorre devido a vrios fatores, como

envelhecimento, exposio ao sol, gravidez, distrbios endcrinos e tratamento com

hormnios. Estudos demonstraram que as radiaes UV so as principais

responsveis pela maioria desses distrbios de hiperpigmentao da pele, seguidaspelos hormnios e fatores externos (30).

As hipercromias podem ser tratadas por diferentes tcnicas como utilizao

de agentes despigmentantes, esfoliao da pele (peeling) e tratamentos com laser.

As substncias despigmentantes possuem diversos mecanismos de ao, como

inibio da sntese da tirosinase; inibio da atividade da tirosinase, toxicidade


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seletiva aos melancitos, esfoliao, adsoro de melanina pr-formada, reao de

reduo e estimulao da melanina dos queratincitos (32).

Vrios inibidores de tirosinase so utilizados em cosmticos para o tratamento

de clareamento e no tratamento de desordens dermatolgicas relacionadas a

hiperpigmentao (33). As substncias despigmentantes mais utilizadas na

teraputica so cido kjico, hidroquinona e arbutina. Entre os agentes

despigmentantes, a hidroquinona um dos mais prescritos. Essa substncia um

hidroxifenol de estrutura qumica semelhante ao precursor da melanina e atua na

inibio da tirosinase reduzindo a hidroxilao da tirosina em dihidroxifenilalanina (L-

Dopa) (34). Porm, essa substncia possui efeito citotxico sobre os melancitos e

potencial mutagnico sobre as clulas de mamferos (31). Como resultado disso e

de outros efeitos colaterais, o uso de hidroquinona tem sido proibido em diversospases (31, 34). A arbutina um glicopiranosdeo natural derivado da hidroquinona,

atua como um potente inibidor de tirosinase e menos txico que a hidroquinona

(31, 34). O cido kjico uma substncia natural produzida por fungos e possui

ao clareadora devido a sua propriedade quelante de ons cobre, responsvel pela

inativao da enzima tirosinase e conseqente inibio na formao de melanina. O

principal efeito indesejvel relatado pelo uso do cido kjico a presena de

eritema facial (31, 34). No entanto, estudos no Japo relataram um elevado potencial

para causar sensibilizao e dermatite irritante, e encontraram uma correlao entreo uso tpico do cido kjico e a ocorrncia de tumores hepticos (35). O cido kjico

tambm est associado a efeitos mutagnicos (34). Alm de causar efeitos txicos

s clulas, a baixa estabilidade limita sua aplicao (31).

A descoberta e caracterizao de novos inibidores da enzima tirosinase so

teis devido a seus potenciais para aplicaes na preveno de hipercromias e

outros problemas relacionados sade humana. Dessa forma, o mercado para

agentes despigmentantes com ao inibidora da tirosinase muito grande e a

descoberta de novos compostos naturais com tal propriedade tem sido largamenteestimulada pela indstria de cosmticos e de medicamentos dermatolgicos.


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2.1.3 Mal de Alzheimer

A doena de Alzheimer uma patologia neurodegenerativa progressiva

caracterizada pela perda de memria, disfuno cognitiva, distrbios

comportamentais, e dificuldade em realizar atividades dirias (36). A doena

freqentemente comea com perdas de memria de curto prazo, e continua com

disfuno emocional e cognitiva mais generalizada (37).

O diagnstico da doena de Alzheimer baseado em caractersticas clnicas,

embora deva ser confirmado pelo exame histopatolgico do crebro. Existem trs

estgios clnicos da doena - leve, moderada e grave - com declnio cognitivo e

funcional, que se estende por 5 a 8 anos. A fase inicial dura geralmente entre 2 a 3anos e caracterizada pela diminuio da memria de curto prazo, muitas vezes

acompanhada por sintomas de ansiedade e depresso. No estgio moderado, estes

sintomas aparecem como manifestaes neuropsiquitricas, tais como alucinaes

visuais, falsas crenas e inverso de padro do sono podem surgir. A grave a fase

final caracterizada por sinais motores, tais como o rigidez motora e declnio cognitivo

(38).

A doena de Alzheimer a causa mais comum de demncia entre as pessoas

idosas (39). Em 2006, estima-se que existiam 26,6 milhes de pessoas comAlzheimer no mundo. Para o ano 2050, a prevalncia mundial da doena de

Alzheimer aumentar para 106,8 milhes de casos (40, 41). A incidncia da doena

alta e afeta 0,9% de pessoas com idade de 65 anos, 4,2% com 75 anos e 14,7%

dos que possuem 85 anos ou mais (41). A expectativa que o nmero de pacientes

com Alzheimer aumente diretamente com a expectativa de vida e o crescimento da

populao idosa (37).

As alteraes bioqumicas decorrentes da doena de Alzheimer afetam as

regies cerebrais associadas s funes mentais superiores, particularmente ocrtex frontal e o hipocampo (42). As caractersticas neurodegenerativas mais

evidentes da doena so as formaes de placas -amilides e os emaranhados

neurofibrilares (43). O acmulo anormal das placas -amilides e dos emaranhados

neurofibrilares levam a perda das conexes entre os neurnios e morte celular.

Como a morte dos neurnios acontece em todo o crebro, as regies afetadas

comeam a diminuir em um processo denominado atrofia cerebral. Na fase final da


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doena o dano generalizado e o tecido cerebral se encontra significativamente

diminudo (44, 45). Todo este processo resulta em perda da funo neuronal e dano

sinptico, com subseqente comprometimento da memria, da coordenao motora

e do raciocnio, alm de perda da capacidade cognitiva e demncia (42).

Pacientes com doena de Alzheimer apresentam uma diminuio nos nveis

de acetilcolina no processo sinptico, diminuindo a neurotransmisso colinrgica

cortical (46). Observa-se que muitos relatos de dficits cerebrais ligados a doena

esto associados ao sistema colinrgico, ou seja, as disfunes cognitivas,

funcionais e comportamentais associadas com a doena de Alzheimer podem ser

causadas por uma incapacidade de transmitir impulsos neurolgicos em toda

sinapse colinrgica (37). Alm da acetilcolina, a doena de Alzheimer est associada

reduo das taxas de outros neurotransmissores, como noradrenalina, dopamina,serotonina, glutamato e substncia P em menor extenso (42).

As opes teraputicas para o tratamento da doena de Alzheimer esto

focadas em modificar os sistemas de neurotransmissores, em especial o sistema

colinrgico, para maximizar a atividade dos neurnios restantes (38). Entre os

diferentes tipos de drogas que podem modificar a transmisso colinrgica, os

frmacos inibidores da acetilcolinesterase (AChE) so aqueles que apresentam os

melhores resultados clnicos no tratamento da doena de Alzheimer. A inibio da

enzima AChE parece promover o aumento da concentrao da acetilcolina nasinapse, diminuindo ou retardando a progresso dos sintomas associados a doena

(37).

Atualmente, os inibidores de AChE aprovados para o tratamento de pacientes

com doena de Alzheimer so donepezil, rivastigmina e galantamina (47). Essa nova

gerao de inibidores de AChE relativamente bem tolerada, no hepatotxica e

possui um regime de dosagem mais rigoroso (37). Entretanto, estudos clnicos

relataram alguns efeitos adversos como nusea, vmito, diarria, perda de peso,

insnia, alteraes no sono, espasmos musculares, bradicardia, desmaio e fadiga(47). O donepezil e a galantamina so inibidores seletivos de AChE. Os inibidores de

AChE so indicados para pacientes com doena de Alzheimer leve a moderada,

entretanto alguns estudos sugerem um pequeno benefcio em paciente em estgios

mais avanados da doena (38).


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2.2 ENZIMAS ENVOLVIDAS

2.2.1 Amilase

A -amilase pode ser encontrada em microrganismos, plantas e animais, e

um dos principais produtos secretados pelo pncreas (cerca de 5-6%) e glndulas

salivares, desempenhando um papel na digesto de amido e glicognio (48, 49). -

Amilases (-1,4-glicano-4-glicanohidrolases, E.C.3.2.1.1) so enzimas da famlia de

endoamilases que catalisam a hidrlise das ligaes glicosdicas -1,4 do amido,

formando unidades menores de oligossacardeos (48-52). Os produtos finais da

ao da -amilase so oligossacardeos de diversos tamanhos em uma

configurao anomrica e dextrinas limites (53), na qual constituem uma mistura

de maltose, maltotriose, e oligossacardeos de 6-8 unidades de glicose que contm

ligaes -1,4 e -1,6 (48). Outras enzimas amilolticas participam no processo de

hidrlise do amido, porm a contribuio da -amilase essencial para o incio do

processo (51).

O amido, importante constituinte da dieta humana, constitudo por dois tipos

de polmeros de glicose: amilose e amilopectina (Figuras 1a e 1b). A amilose um

polmero linear composto de at 6000 unidades de glicose com ligaes glicosdicas

-1,4. A amilopectina constituda por pequenas cadeias lineares de ligaes

glicosdicas -1,4 com 10-60 unidades de glicose e cadeias laterais de ligaes

glicosdicas -1,6 com 15-45 unidades de glicose. As -amilases so capazes de

clivar as ligaes -1,4 presentes na parte interna das cadeias de amilose ou

amilopectina (53-55).

Figura. 1a. Estrutura da amilose (54).


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Figura. 1b. Estrutura da amilopectina (54).

A -amilase humana uma enzima dependente de clcio, composta de 512

aminocidos com peso molecular de 57,6 kDa. A enzima contm 3 domnios: A, B e

C (Figura 2). O domnio B est inserido entre os domnios A e C e est ligado ao

domnio A por ligao dissulfeto. O domnio C com uma estrutura de folha est

ligado ao domnio A por uma simples cadeia polipeptdica e parece ser um domnio

independente, com funo desconhecida. O stio ativo da -amilase est situado em

uma fenda longa entre os domnios A e B. O clcio (Ca2+) est localizado entre os

domnios A e B e pode atuar na estabilizao da estrutura tridimensional e comoativador alostrico. Alm da ligao com o clcio, a enzima possui um stio ligante de

cloro no domnio A prximo ao stio ativo.O stio de ligao ao substrato contm 5

substios com o stio cataltico posicionado no substio 3. A -amilase cliva

preferencialmente as ligaes glicosdicas -1,4 presentes no interior da molcula

(48).


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Figura 2. Estrutura tridimensional da -amilase. O domnio A est representado em vermelho, o domnio B em

amarelo e o domnio C em azul. No centro cataltico, o on clcio est representado como uma esfera azul e o

on cloreto como esfera amarela. As estruturas verdes so ligantes da enzima na superfcie do stio ativo e nasua fenda (56).

2.2.2 -Glicosidase

As -glicosidases (E.C 3.2.1.20, -D-glicosideo glicohidrolase ) so enzimas

que catalisam a hidrlise das ligaes glicosdicas -1,4 de dissacardeos ou

oligossacardeos liberando unidades de glicose (57). Glicosidases so classificadas

de acordo com a especificidade da clivagem da ligao glicosdica, dependendo do

nmero, posio ou configurao do grupo hidroxila na molcula do acar (58).

Assim, as -glicosidases so um grupo de exo-glicosdeo hidrolases capazes de

clivar os resduos -glicosila das extremidades no reduzidas de substratos -

ligados para liberar -D-glicose (59).

As enzimas -glicosidases esto amplamente distribudas na natureza,

podendo ser encontradas em microrganismos, plantas e animais (57). A enzima -

glicosidase participa de processos bioqumicos fundamentais do metabolismo, como

degradao dos polissacardeos provenientes da alimentao, tornando disponveis

unidades de monossacardeos para gerao de glicognio e glicoprotenas

celulares, biossntese e modificao de -glicoprotenas, e catabolismo de

peptidioglicanos e outros glicoconjugados (60). As -glicosidases esto envolvidas

no processamento de glicoprotenas e a regio oligossacardica destes


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glicoconjugados desempenha funes fundamentais nos processos biolgicos, como

resposta imune, reconhecimento intercelular, proliferao e diferenciao celular,

enovelamento, estabilidade e solubilidade das protenas, alm dos processos

patolgicos, como cncer e inflamao (58).

As mltiplas funes da enzima -glicosidase no organismo justifica a procura

por agentes teraputicos como potenciais inibidores para serem utilizados no

tratamento de doenas como diabetes, obesidade, infeces pelo HIV e tumores

(58, 61).

As -glicosidases esto localizadas na membrana da borda em escova de

clulas intestinais e so enzimas essenciais para a digesto dos carboidratos. Aps

a hidrlise do amido pela -amilase, a maltose e as unidades menores de

oligossacardeos so clivadas pela ao da -glicosidase, levando a produo deglicose que ser absorvida pelo organismo (62). A -glicosidase cliva as unidades

terminais de glicose da amilose ou amilopectina, tendo preferncia por

malto-oligossacardeos menores, liberando glicose com uma configurao (53).

A enzima -glicosidase contm 4 domnios (A, C, D e N) e 2 subdomnios (B e

B) (Figura 3). O domnio N-terminal interage intimamente com o domnio cataltico e

pode estar envolvido diretamente na ligao com o substrato e na manuteno da

arquitetura do stio ativo. O domnio N pode conter tambm stios secundrios de

reconhecimento de carboidratos. A capacidade de ligao da -glicosidase ao amidopode ser atribuda a uma regio do domnio D. O domnio C contribui para a

compacidade da estrutura dos outros domnios e parece desempenhar um papel de

proteo do domnio cataltico contra solventes. O domnio A a regio cataltica

localizada prxima os subdomnios. A proximidade do subdomnio B sugere um

papel na ligao da enzima ao substrato. O stio ativo est posicionado do lado C-

terminal, importante para a catlise e ligao ao substrato. Regies dos domnios B,

N e B contribuem para o ambiente do stio ativo (63, 64).

-Glicosidases so conhecidas tambm pelos nomes: isomaltase, maltase,maltase cida, glicoinvertase, glicosideosacarase, -glicosidase lisossomal e

maltase-glicosidase (65).


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Figura 3. Estrutura tridimensional da -amilase. O centro cataltico est representado em vermelho (Domnio A),

o domnio N-terminal em amarelo (Domnio N), o domnio C-terminal proximal em azul (Domnio C), o domnio C-

terminal distal em verde (Domnio D), o subdomnio B em violeta e o subdomnio B em laranja (63).

2.2.3 Tirosinase

As tirosinases (EC 1.14.18.1; polifenol oxidase; difenol oxidase, catecolase)

so enzimas bifuncionais que catalisam a converso dos monofenis em duas

etapas consecutivas, que envolvem o oxignio molecular. A atividade monoxigenase

ou creolase envolve a o-hidroxilao de monofenis para o-difenis e a oxidaosubseqente dos o-difenis para o-quinonas est relacionada atividade difenolase

ou catecolase (25, 66).

Tirosinase amplamente distribuda na natureza, estando presente em

plantas, animais e microrganismos, e possuem um papel fundamental na biossntese

de melanina e em outros processos fisiolgicos. As tirosinases so enzimas

tetramricas, com massa molar na ordem de 120kDa e com dois stios ativos por

molcula. Cada um destes stios consiste em dois tomos de cobre que interagem

com o oxignio molecular (67). No stio ativo, os tomos de cobre esto ligados a 6molculas de histidinas (68), conforme apresentado na Figura 4.


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Figura 4. Ligaes dos tomos de Cobre no stio ativo da enzima tirosinase (68).

Na sntese de melanina, a tirosinase converte L-tirosina (monofenol) em L-

Dopa (o-difenol). Em seguida, a L-Dopa oxidada a o-dopaquinona (o-quinona), a

qual espontaneamente ciclizada na forma de leucodopacromo que rapidamente

convertido em dopacromo, o qual polimerizado formando melanina (25, 66, 69).

Essas reaes esto representadas na Figura 5.

Figura 5. Biossntese de melanina (67).

As tirosinases constituem um vasto campo para pesquisa devido

importncia dessas enzimas nas indstrias farmacuticas e de alimentos, alm das


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suas aplicaes biotecnolgicas e ambientais, pois so utilizadas tanto para

descolorao quanto para remoo de fenis presentes em efluentes (70). Para a

indstria farmacutica, os inibidores de tirosinase so importantes para o tratamento

de algumas patologias dermatolgicas associadas hiperpigmentao causada pela

produo anormal de melanina (71). Alm disso, inibidores de tirosinase tem sido

empregados na indstria cosmtica para o clareamento da pele e despigmentao

aps queimaduras solares (72).

Um dos maiores problemas para a indstria de alimentos o escurecimento

desfavorvel de frutas, verduras e bebidas, resultando numa vida til curta e menor

valor no mercado (73). A formao de melanina considerada deletria para a

qualidade da cor desses alimentos e a preveno desse escurecimento tem sido

feita atravs da adio de inibidores de tirosinase nos alimentos (74). Alm disso, atirosinase uma das principais enzimas envolvidas no processo de renovao do

exoesqueleto de insetos, podendo ser importante na busca de inibidores como

agentes de controle de insetos (74). Isso amplia a possibilidade de utilizao de

inibidores de tirosinase como aditivos alimentares, alm de agentes contra insetos e

agentes de clareamento.

Dentre as aplicaes biotecnolgicas, as tirosinases so utilizadas para a

sntese de frmacos o-difenlicos, como a L-Dopa (74). No Sistema Nervoso Central

a tirosinase participa da sntese de dopamina que precursora direta de outrascatecolaminas importantes como a noradrenalina e adrenalina, sendo recentemente

implicada em inmeras doenas neurodegenerativas, como a doena de Parkinson

(75). A tirosinase tambm tem aplicaes industriais na preparao de biossensores

para oxignio e fenis, na sntese estereoespecfica de quinonas, fenis e

polmeros, e na biorremediao de resduos contaminados por fenis (76).

Em funo dos efeitos indesejveis causados ou associados ao da

tirosinase, a busca por compostos que sejam inibidores dessa enzima tem sido de

interesse crescente na rea da pesquisa e da indstria farmacutica, que tminteresse em agentes eficazes nos distrbios de pigmentao.


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eficiente por causa da proximidade do nuclefilo serina e a catlise da histidina,

sendo que mais de 10.000 molculas de acetilcolina so hidrolisadas por segundo

por um nico stio ativo (82).

A AChE encontrada no sistema nervoso central em regies como

hipotlamo, substncia negra, estriado, hipocampo, cerebelo e tambm no fluido

crebro espinhal (82). Esta enzima secretada nas terminaes nervosas, sendo

esta taxa de secreo modulada pela estimulao neuronal, pelo nvel de

neurotransmissor na fenda sinptica, bem como, pelo tratamento com drogas (83).

A acetilcolina uma molcula orgnica, liberada nas terminaes nervosas

como neurotransmissor. Nos neurnios colinrgicos, a acetilcolina produzida pela

enzima colina acetiltransferase que usa acetilcoenzima-A e colina como substrato

para sua formao (84). As molculas de acetilcolina so liberadas no momento daestimulao nervosa nas junes neuromusculares, nas sinapses das fibras pr-

ganglionares simpticas e parassimpticas, e nas sinapses das fibras nervosas ps-

anglionares parassimpticas (82). No entanto, a reduo de neurotransmissores

como a acetilcolina podem levar a doenas neurodegenerativas. A inibio da

enzima AChE leva ao um aumento das molculas de acetilcolina nas sinapses,

melhorando os sintomas cognitivos, comportamentais e funcionais relacionados s

demncias hipocolinrgicas, como a doena de Alzheimer (85).

2.3. INIBIDORES ENZIMTICOS EXTRADOS DE PLANTAS

2.3.1 Inibidores de -amilase

Existem diversos estudos que descrevem o potencial das plantas medicinaiscomo inibidores de -amilase. A disponibilidade de mtodos simples e rpidos para

a anlise de grande nmero de extratos vegetais com atividade de inibio sobre a

-amilase facilita e estimula a busca por inibidores mais eficazes.

Inibidores de -amilase so encontrados nas sementes da espcie Phaseolus

vulgaris, conhecido como feijo comum, e em outras espcies do gnero Phaseolus

(86). Existem trs isoformas de inibidores de -amilase, conhecidos como -AI1, -


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AI2 e -AI3, que so encontrados no gnero Phaseolus. O composto -AI1 a

principal isoforma presente na maioria das espcies de feijo, sendo o nico com

atividade de inibio sobre a -amilase de mamferos (87). Outro estudo isolou o

composto faseolamina das sementes de P. vulgaris, sendo identificado como um

inibidor especfico para -amilase de animais (88). A faseolamina uma protena

utilizada como ativo em suplementos alimentares para o tratamento de obesidade.

Acredita-se que pela inibio da digesto dos carboidratos complexos, a

faseolamina pode reduzir a absoro de calorias, promovendo a perda de peso (89).

Vrios extratos da espcie Amaranthus caudatus (Amaranthaceae)

mostraram atividade de inibio sobre a -amilase em diferentes concentraes. Os

extratos metanlico, hexnico e de acetato de etila da semente apresentaram

atividades entre 20 e 90% (90). O extrato metanlico da espcie Amaranthusspinosustambm apresentou uma significativa inibio sobre a atividade enzimtica

da -amilase (91).

Fraes contendo polifenis isolados da espcie Garcinia mangostana(Clusiaceae)

apresentaram alta atividade de inibio sobre a -amilase comparvel a da acarbose

(71). A acarbose um pseudotetrassacardeo isolado de fungos do gnero

Actinoplanes sp., com atividade de inibio competitiva e reversvel sobre a -

amilase (92). Outra atividade semelhante a da acarbose foi observada no extrato da

folha da espcie Vaccinium uliginosum (93).O cido rosmarnico encontrado em nas folhas das espcies da famlia

Lamiaceae, como Melissa officinalis e Origanum vulgare, apresentou uma elevada

inibio da atividade da enzima -amilase (94). Dentro da mesma famlia, a espcie

Salvia acetabulosatambm apresentou alta atividade de inibio sobre a -amilase

quando comparada a acarbose (95). Um estudo com espcies do gnero Salvia

demonstrou que os extratos etanlicos de S. verticillata e S. virgata inibiram

significativamente a atividade da -amilase (96).

Uma espcie da famlia Myrtaceae bastante estudada a Syzygium cumini(Eugenia jambolana). Extratos das sementes e do fruto apresentaram uma reduo

significativa dos nveis de glicose no sangue de ratos (97, 98). Outro estudo relatou

que o extrato aquoso da semente dessa espcie obteve uma alta inibio sobre a

atividade da -amilase. Os compostos identificados com atividade de inibio foram

o cido betulnico e uma flavonona (98). Outros flavonides como quercetina,


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luteolina, miricetina e eupafolina so descritos como inibidores da atividade da -

amilase (99-101).

Plantas do bioma Cerrado tambm mostraram inibio sobre a enzima -

amilase. Diferentes extratos das espcies Byrsonima crassa, Calophyllum

brasiliense, Kielmeyera coriacea (Clusiaceae), Qualea grandiflorae Qualea parviflora

(Vochysiaceae) apresentaram atividades maiores que 70% (102).

2.3.2 Inibidores de -glicosidase

Diversos inibidores de -glicosidase foram isolados, identificados, sintetizados

e investigados quanto a sua atividade de inibio sobre a enzima. Atualmente, os

compostos disponveis na teraputica como inibidores de -glicosidases so

acarbose, miglitol, voglibose e desoxinojirimicina, sendo os trs primeiros indicados

para tratamento de diabetes e o ltimo para o controle da doena de Gaucher,

doena relacionada ao acmulo de glicolipdios nos lisossomos (103). A acarbose

um sacardeo e apresenta uma inibio competitiva sobre a -glicosidase. A

voglibose um derivado de valiolamina e possui uma maior atividade de inibio

sobre a enzima, sendo 20-30 vezes mais potente que a acarbose (58, 104). Ambos

compostos foram isolados de microrganismos (21).

A desoxinojirimicina, um potente inibidor de -glicosidase foi isolado de folhas

e cascas dos caules de espcies do gnero Morus. A espcie Morus albapossui

uma grande quantidade de desoxinojirimicina, sendo a maior concentrao

encontrada nas folhas e ramos (105). O fruto da espcie Morus nigra tambm

apresenta uma quantidade razovel do composto (105). A desoxinojirimicina um

alcalide polihidroxilado e apesar de sua excelente atividade de inibio sobre a -

glicosidase, sua eficcia in vivo mostrou ser moderada. Por isso, h na literatura umgrande nmero de derivados de desoxinojirimicina que esto sendo identificados e

sintetizados com a finalidade de aumentar sua atividade in vivo (106). O miglitol

um derivado de desoxinojirimicina comercialmente disponvel para o tratamento da

diabetes (107). Esse composto apresenta uma forte inibio sobre a enzima -

glicosidase e absorvido completamente pelo intestino delgado, ao contrrio dos

outros inibidores acarbose e voglibose. O miglitol tem maior efeito na reduo dos


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nveis de glicose ps-prandial, pois pode ser administrado a pacientes em

concentraes relativamente elevadas apresentando baixa incidncia de efeitos

colaterais (104).

Estudos in vitromostraram que o extrato da semente de Eugenia jambolana

(Myrtaceae) so mais efetivos na inibio da -glicosidase quando comparados a

acarbose e desoxinojirimicina (62). Fraes do extrato etanlico das folhas de

Eugenia uniflora apresentaram atividades de inibio sobre a -glicosidase maiores

que 80% (108). O extrato da casca de Eugenia malaccensis tambm apresentou

atividade de inibio sobre a -glicosidase, sendo encontrado como composto ativo

o alcalide casuarina (107). Outros alcalides identificados como radicaminas,

isolados da espcie Lobelia chineses(Campanulaceae), tambm mostraram inibio

sobre a enzima (107).Salacia reticulata, encontrada nas regies do Sri Lanka e florestas da ndia,

tem sido utilizada como suplemento alimentar no Japo para evitar a obesidade e

diabetes. Salacinol e kotalanol foram identificados como os componentes inibidores

da enzima -glicosidase na frao solvel em gua de razes e caules da espcie S.

reticulata (58, 106). O salacinol um potente inibidor competitivo da enzima -

glicosidase, sendo sua atividade maior que a da acarbose. O kotalanol, um derivado

de salacinol, mostrou uma potente atividade de inibio maior que a do salacinol e

da acarbose (58).A partir do extrato metanlico das folhas de Origanum majorana da famlia

Lamiaceae foram isolados 5 flavonides com atividade de inibio sobre a -

glicosidase (107). O flavonide baicaleina um potente inibidor de -glicosidase e

tambm foi isolado das folhas de O. majorana (58). Espcies da mesma famlia

tambm apresentam compostos com atividade de inibio sobre a enzima, como o

extrato das folhas de Hyssopus officinalis, que possui dois compostos fenlicos

ativos (107).

Atualmente, diversos inibidores de -glicosidase de origem natural ou sintticatm sido descritos na literatura. Existem revises detalhadas sobre a diversidade

estrutural, relao estrutura-atividade e mecanismo de ao destes compostos,

sendo importantes para o desenvolvimento de novos frmacos e para o

planejamento de compostos anlogos mais especficos. O isolamento de agentes

inibidores de fontes naturais ou da sntese qumica fornece alternativas para o


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tratamento de diversas doenas como cncer, diabetes, obesidade, doena de

Gaucher e infeces pelo HIV (58, 106, 107).

2.3.3 Inibidores de t irosinase

A melanina desempenha um papel fundamental de proteo da pele contra

fotocarcinognese. No entanto, a produo anormal da melanina um srio

problema esttico em seres humanos. Inibidores de tirosinase so considerados

como um dos tratamentos padres para doenas relacionadas a hiperpigmentao,

alm de serem importantes como agentes clareadores na indstria de cosmticos.

Uma variedade de agentes inibidores de fontes naturais que inibem as atividades

monofenolase e difenolase da enzima tirosinase j foram identificados (28, 31).

Alguns flavonides com potente atividade de inibio sobre a tirosinase, tais

como quercetina e kaempferol, podem ser isolados de vrias plantas (28, 69). A

quercetina est presente nas flores de Heterotheca inuloides (Asteraceae), espcie

vegetal conhecida no Mxico pelo nome arnica (109). O kaempferol foi isolado das

ptalas da espcie Crocus sativus(aafro), pertencente a famlia Iridaceae (110). O

kaempferol e a quercetina inibem de forma competitiva a atividade da tirosinase pela

capacidade de quelar o cobre presente no stio ativo da enzima, levando a

inativao da tirosinase (31).

Alm desses flavonides, a moracina foi isolada das folhas da espcie Morus

alba e apresentou uma tima atividade de inibio sobre a tirosinase de 80% na

concentrao de 100g/mL (53). Outro composto isolado da espcie M. alba o

oxiresveratrol, um agente clareador com alta afinidade pela enzima tirosinase. O

oxiresveratrol exibiu uma potente atividade de inibio sobre a tirosinase maior que o

cido kjico, um agente clareador utilizado no tratamento de hiperpigmentao. Oefeito de despigmentao do oxiresveratrol ocorre devido a inibio reversvel da

atividade da tirosinase (62, 111).

Outro polifenol bastante estudado quanto a sua atividade de inibio sobre a

enzima tirosinase o cido glico. Diversos derivados do cido glico foram isolados

das espcies Galla rhois e Camellia sinensis (ch verde), e alguns deles foram

identificados como potentes inibidores de tirosinase (31, 112). Alm disso, o cido


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glico parece agir como um substrato para a enzima, sendo oxidado antes da L-

Dopa (113).

A aloesina isolada da folha de Aloe vera age como um potente inibidor

competitivo da enzima tirosinase. Atualmente, aloesina e arbutina so usadas na

indstria de cosmticos como agentes clareadores (31). Tratamentos combinados de

arbutina e aloesina exibiram efeitos sinrgicos por apresentarem mecanismos de

inibio competitiva e no-competitiva da tirosinase, respectivamente (81, 114). A

arbutina um derivado de hidroquinona glicosilada, podendo ser encontrada em

diversas espcies, comoArctostaphylos uva-ursi (Ericaceae), Orignanum majorana

(Lamiaceae), Pyrus communis (Rosaceae) e Myrothamnus flabellifolia

(Myrothamnaceae) (115). Estruturalmente relacionada a hidroquinona, a arbutina

inibe a atividade da tirosinase pela interao com o cobre no stio ativo da enzima(69). Vrios estudos demonstram a atividade de inibio da arbutina sobre a enzima

tirosinase e sua efetividade no tratamento da hiperpigmentao da pele (28, 69).

2.3.4 Inibidores de acetilco linesterase

Diversos estudos relatam a capacidade de plantas com atividade de inibio

sobre a enzima AChE, demonstrando um potencial teraputico para o tratamento de

doenas neurodegenerativas, como a doena de Alzheimer (36, 46, 116, 117).

Abordagens etnofarmacolgicas e estudos fitoqumicos fornecem caminhos para a

identificao de plantas e compostos isolados como inibidores de AChE, e

conseqentemente levam descoberta de drogas relevantes para o tratamento da

doena de Alzheimer (117, 118). A busca por novos compostos bioativos a partir de

plantas medicinais levou ao isolamento e a elucidao de estruturas de uma grande

quantidade de novos fitoconstituintes (117).A fisostigmina um alcalide indlico isolado da espcie Physostigma

venenosum(Leguminosae), utilizada como um dos primeiros inibidores de AChE na

teraputica. Devido ao seu curto tempo de meia vida, a fisostigmina no mais

utilizada clinicamente, porm sua estrutura qumica foi til como modelo para o

desenvolvimento de novos inibidores, como a rivastigmina, um inibidor de AChE

aprovado para o tratamento de pacientes com doena de Alzheimer. Isso implica na


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abertura de novos caminhos onde alcalides isolados de plantas com atividade de

inibio da AChE podem ser importantes para o desenvolvimento de drogas mais

adequadas para o tratamento da doena de Alzheimer (117).

A galantamina um alcalide isolado primeiramente da espcie Galanthus

nivalis(Amaryllidaceae), planta utilizada tradicionalmente na Bulgria e Turquia para

o tratamento de condies neurolgicas (117). Atualmente, a galantamina pode ser

isolada das espcies Narcisus confusese Lycorus radiate, tambm pertencentes

famlia Amaryllidaceae, alm de ser obtida sinteticamente (37). A galantamina um

inibidor seletivo de AChE e proporciona uma biodisponibilidade completa pela

administrao via oral, alem de ser um modulador dos receptores nicotnicos

cerebrais o que mostrou valor adicional para o tratamento da doena de Alzheimer

(37, 117). Em 2001, o uso da galantamina foi aprovado para o tratamento da doenade Alzheimer em diversos pases (37), por ser uma droga bem tolerada e com uma

significativa ao no melhoramento das funes cognitivas (117). Outros alcalides

isolados de espcies da famlia Amaryllidaceae, tais como assoanina,

epinorgalantamina, oxoassoanina, sanguinina, 11-hidroxigalantamina tambm

demonstraram atividade de inibio sobre a enzima AChE (119).

Vrios estudos foram realizados para avaliar o potencial de inibio de

espcies da famlia Apocynaceae sobre a atividade da AChE. O gnero

Tabernaemontanaapresenta muitos estudos realizados com relao ao potencial deinibio. Alcalides indlicos como coronaridina, voacangina, hidroxindolenina

voacangina e rupicolinaisolados do extrato de T. australisapresentamatividade de

inibio sobre a AChE nas mesmas concentraes quea fisostigmina e galantamina.

Um levantamento de plantas utilizadas tradicionalmente na Tailndia mostrou que a

espcie T. divaricata foi capaz de inibir 93,5% a atividade da enzima AChE (116).

Alcalides obtidos das espcies T. laeta e T. hytrix (isovoacristina, olivacina,

affinisina, ibogamina, affinina, conodurina e histrixnina) demonstraram atividade de

inibio sobre a enzima AChE (120).A huperzina A, um alcalide quinolizidnico isolado da espcie Huperzia

serrata (Lycopodiaceae), um potente inibidor da acetilcolinesterase e utilizado na

China para o tratamento de pacientes com doena de Alzheimer. A huperzina A

mais seletiva para a enzima AChE e menos txica que os inibidores sintticos

donezepil e tacrina (117).


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Entre as espcies de plantas investigadas para o tratamento de doenas

neurodegenerativas, as espcies do gnero Salvia so as mais pesquisadas da

famlia Lamiaceae e so capazes de inibir a AChE em 60% , alm de apresentarem

atividade nicotnica (117). Um levantamento mostrou que espcies da famlia

Fumariaceae, Papaveraceae e Ericaceae so potentes inibidores da enzima AChE,

apresentando atividade de inibio entre 80 e 90% na concentrao de 1 mg/mL

(36).

As espcies pertencentes s famlias Amaryllidaceae, Apiaceae, Asteraceae,

Leguminosae, Fumaraceae, Lamiaceae so as mais estudadas quanto a atividade

de inibio sobre a AChE (46, 117). A alta atividade destas espcies pode estar

relacionada sua rica composio em alcalides, pois a maioria dos inibidores de

AChE apresentam nitrognio em sua estrutura (121).Atualmente, o alcalide leptomerina foi isolado do extrato etanlico do caule

da espcie Esenbeckia leiocarpa (Rutaceae), um espcie nativa do Brasil e

popularmente conhecida como goiabeira. A leptomerina apresentou elevada

atividade anticolinestersica com um potencial de inibio sobre a AChE similar ao

da galantamina (122).

A pesquisa de novos compostos inibidores de AChE com ao prolongada,

com maior potncia e com menores riscos de efeitos adversos, ainda permanece

como foco de diversos pesquisadores.

2.4 CERRADO

O Brasil considerado como um dos pases de maior biodiversidade no

mundo, pois se calcula que nada menos do que 10% de toda a biota terrestre

encontram-se no pas (123).O Cerrado o segundo maior bioma brasileiro e possuiuma das maiores floras vegetais do mundo, estimada em aproximadamente 7 mil

espcies, compondo um cenrio de exuberante diversidade biolgica (124). Cobre

uma rea contnua de aproximadamente dois milhes de km2 que corresponde a

cerca de 23 % do territrio nacional (125, 126).

Com uma grande diversidade de espcies vegetais, as plantas do Cerrado

so fontes de compostos com potencial farmacolgico e biotecnolgico (127). A


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diversidade qumica presente e sua vegetao deve-se a diferentes maneiras de

adaptao s condies climticas, de solo e geogrficas (123).

Muitas dessas plantas so utilizadas na medicina popular na regio para o

tratamento de vrias patologias, como malria, leishmaniose, lcera gstrica,

diabetes, entre outras (126, 128, 129). No entanto, a rica flora do bioma Cerrado tem

sido pouco estudada para avaliar os efeitos teraputicos dos seus extratos e

compostos isolados (130). Muitas espcies vegetais no so utilizadas na medicina

popular e no se conhece ainda seu potencial teraputico ou txico expondo a

necessidade de maiores estudos que mostrem as caractersticas biolgicas dessas

plantas (131).

Espcies do gnero Pouteria (Sapotaceae) so encontradas no bioma

Cerrado, correspondendo a mais de 400 espcies e so muito utilizadas na medicinapopular para o tratamento de vrias patologias. A espcie P. torta apresenta

atividades biolgicas antimicrobiana e antioxidante (132, 133). Alm da atividade

antioxidante, a espcie P. ramifloratambm apresenta propriedades antimicrobiana,

antiinflamatria e antinociceptiva. O extrato das folhas de P. caimito tambm

apresentam propriedades antioxidantes (134). Atividade contra o protozorio

Trypanosoma cruzifoi encontrada no extrato da espcie P. gardneri (135).

A famlia Apocynaceae encontra-se bem representada na vegetao do

Cerrado. Existem no Brasil cerca de 850 espcies, sendo os gneros maisconhecidos representados por Allamanda, Aspidosperma, Plumeria, Rauwolfia,

Tabernaemontanae Hancornia. Vrios compostos ativos isolados de espcies da

famlia Apocynaceae apresentam diversas propriedades biolgicas, como

leishmanicida, antimicrobiana, anticancergena e anti-HIV (131). Estas atividades

esto relacionadas principalmente aos alcalides produzidos por essas plantas. A

espcie Aspidosperma macrocarpon apresentou atividade antiparasitria contra o

protozorio Trypanosoma cruzy (135). Atividades biolgicas tais como

antimicrobiana, vasodilatadora e antiinflamatria so observadas na espcieHancornia speciosa. Estudos realizados com os extratos de Tabernaemontana

catharinensismostraram que a atividade anticancergena ocorre devido a presena

dos alcalides voacangina e coronaridina na espcie (131).

Outra famlia encontrada no bioma Cerrado a Myrtaceae, possuindo cerca

de 129 gneros e 4620 espcies. Um importante membro dessa famlia o gnero

Eugenia, sendo constitudo por aproximadamente 500 espcies (136). No Cerrado,


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essa famlia representada pelas espcies Eugenia uniflora, Eugenia jambolanae

Eugenia dysenterica. Atividades antimicrobianas, antioxidantes, diurticas, anti-

hipoglicemiante e anti-hipertensiva so relatadas em estudos com essas espcies

(126, 131, 137).

Stryphnodendron adstringens (Leguminosae), popularmente conhecido como

barbatimo, est presente de forma abundante no Cerrado brasileiro. Estudos

farmacolgicos mostraram que o extrato aquosos da casca do barbatimo possui

propriedades antiinflamatria, analgsica, gastroprotetora e antimicrobiana (126,

138). Essas atividades ocorrem principalmente pela presena de taninos na casa da

espcie (139). Outro importante membro da famlia Leguminosae o gnero

Bauhinia, conhecido como pata-de-vaca, e algumas espcies so utilizadas

popularmente para diabetes. Estudos realizados com as espcies Bauhinia manca,Bauhinia divaricata, Bauhinia purpureae Bauhinia variegatademonstraram atividade

hipoglicemiante em animais (140).

Dessa forma, considerando as possveis atividades biolgicas que essas

espcies presentes no bioma Cerrado podem apresentar, o estudo dessas plantas

torna-se relevante para o desenvolvimento de novos agentes teraputicos.


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3 OBJETIVOS

Este trabalho tem como objetivo avaliar espcies vegetais presentes no bioma

Cerrado do Distrito Federal e arredores, quanto atividade de inibio das enzimas

-amilase, -glicosidase, tirosinase e acetilcolinesterase. Para que o objetivo

proposto fosse alcanado, os seguintes objetivos especficos foram estabelecidos:

- Identificar os extratos brutos de espcies vegetais do bioma Cerrado

com provvel atividade de inibio enzimtica;

- Estudar a interferncia dos solventes utilizados no processo de

extrao na metodologia de quantificao enzimtica;- Determinar a concentrao capaz de inibir 50% da atividade mxima

(IC50) dos extratos com atividade significativa;

- Avaliar a capacidade de inibio das enzimas tirosinase,

acetilcolinesterase, -amilase e -glicosidase pelos extratos bruto de

espcies do bioma Cerrado.


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4 MATERIAIS E MTODOS

4.1 EXTRATOS OBTIDOS DE PLANTAS DO BIOMA CERRADO

Os extratos das plantas do Cerrado, obtidos de folhas, caules e frutos, foram

gentilmente cedidos pela Prof. Dmaris Silveira da Faculdade de Cincias da Sade

da Universidade de Braslia UnB. As plantas foram coletadas no bioma Cerrado

nos arredores de Braslia-DF e as exsicatas foram depositadas no Herbrio da UnB

(UB) e no Herbrio da Unicamp (UEC) para assegurar a autenticidade da espcie

coletada. A Tabela 1 apresenta as espcies vegetais que foram usadas para aavaliao da inibio das enzimas.

Tabela 1 - Extratos vegetais de plantas do Cerrado avaliados quanto a inibio enzimtica

FamliaEspcie

Parte usada(solvente)

Nmero deHerbrio

ApocynaceaeAllamanda blanchettiA.DC. 1F(e,h), 2C(e), 3Fr(e,h) (UEC) 142021Hancornia speciosa Gomes F(e,h) (UEC) 142204Tabernaemontana solanifolia A.DC. F(e,h) (UB) 487

MorceaMorus nigraL. F(a,e,h) (UB) 17837

MyrtaceaeEugenia dysenterica DC. F(a,e,h) (UB) 914

LeguminosaeStryphnodendron adstringens(Mart.) Coville 4CC(e) (UB) 911

LamiaceaePlectranthus neochilusSchltr. F(a,e,h) (UB) 913

RubiaceaeGenipa americanaL. Var. caruto (H.B.K) K. Shum. F(e,h), Fr(e,h), 5CF(e) (UB) 915

SapotaceaePouteria gardneri (Mart. & Miq.) Baehni F(e,h) (UB) 3672Pouteria ramiflora Radlk. F(a,e,h) (UB) 3671Pouteria caimito Radlk. F(a,e,h) (UB) 27284Pouteria torta Radlk. F(a,e,h), Fr(e), CF(e) (UB) 3674

CaryocaraceaeCaryocar cf. villosum(Aubl.) Pers. Fr(e) (UB) 907

SapindaceaeSapindus saponariaL. variedade inaequalis (DC.) Radlk. Fr(e) (UB) 916

1F: Folha, 2C: Caule, 3Fr: Fruto, 4CC: Casca do caule, 5CF: Casca do fruto.Solventes: h: hexano, e: etanol, a: gua.


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4.2 DETERMINAO DA ATIVIDADE DE INIBIO SOBRE A -AMILASE

4.2.1 Preparo das solues

Soluo de -amilase 40,0U/mL

-amilase pancretica de porco (Tipo VI, Sigma Aldrich) 15,0mg

Tampo fosfato de sdio 20mM pH 6,9 10,0mL

Soluo Tampo fosfato de sdio 20mM pH 6,9

Fosfato de sdio monobsico 1,25g

Fosfato de sdio dibsico 2,95g

NaCl 0,388g

gua destilada q.s.p. 1000mL

Soluo de amido 1,0%

Amido (Sigma Aldrich) 0,2g

Tampo fosfato de sdio 20mM pH 6.9 q.s.p. 20,0mL

Soluo reagente de cido dinit rosaliclico (DNS)

cido 3,5-dinitrosaliclico (Sigma Aldrich) 10,6g

Tartarato de potssio de sdio 306,0g

NaOH 19,8g

Bissulfito de sdio 8,3g

gua destilada q.s.p 1000mL

Soluo de acarbose 1mg/mL Contro le positivoAcarbose (Sigma Aldrich) 10,0mg

Tampo fosfato de sdio 20mM pH 6,9 q.s.p. 10,0mL

Soluo de Triticum aestivum 1mg/mL Controle positivo

Triticum aestivum (Tipo I, Sigma Aldrich) 10,0mg

gua destilada q.s.p. 10,0mL


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Soluo de extrato vegetal

Os extratos etanlicos e hexnicos foram diludos em etanol e DMSO (3:1), e os

extratos aquosos foram preparados em gua destilada. A concentrao da soluo

me de cada extrato foi ajustada para uma concentrao final no ensaio de 1mg/mL.

4.2.3 Ensaio da atividade enzimtica da -amilase

Vrias tcnicas de anlise esto disponveis na literatura para a determinao

da atividade da -amilase. A maioria dos procedimentos quantitativos geralmente

utilizados envolve a medio de acares redutores formados a partir da hidrliseamiloltica do amido. Dentre esses mtodos, o mtodo que utiliza o DNS o mais

comumente usado devido sua confiabilidade e simplicidade (54). Neste ensaio, a

atividade da -amilase avaliada atravs da formao de maltose resultante da

ao desta enzima sobre o amido presente no meio. A maltose, um dissacardeo

formado por duas molculas de glicose, reduz o DNS formando um produto de cor

alaranjada caracterstica cuja absorbncia determinada a 540nm. A reao

envolvida no ensaio a reduo do DNS (cido 3,5 dinitrosaliclico) para cido 3-

amino-5-nitroslico, enquanto que os grupos aldedos da maltose so oxidados paragrupos carboxlicos (Figura 7) (141). Assim, para a verificao da atividade da

enzima -amilase, optou-se por utilizar amido solvel como substrato e o DNS como

reagente cromognico.

Figura 7. Reao do DNS com o acar redutor (142).

A atividade de inibio da -amilase foi determinada segundo o mtodo

descrito por Bernfeld (1955), com adaptaes (143). A -amilase pancretica suna

(EC 3.2.1.1, tipo VI, Sigma) foi dissolvida em tampo fosfato de sdio 20mM (pH 6,9)

contendo cloreto de sdio 6,7mM para obter uma soluo com concentrao de


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40U/mL. Um total de 40L de soluo do extrato em solvente apropriado e 100L da

soluo da enzima foram incubados em banho-maria por 30 min a 25oC. Aps a pr-

incubao, 500L do pr-incubado foram misturados com 1mL de amido 1% em

tampo fosfato de sdio 20mM (pH 6,9). A mistura de reao foi ento incubada por

20 min a 40oC em banho-maria. A reao foi interrompida com a adio de 1mL de

soluo do reagente DNS. As amostras foram ento aquecidas em ebulio por 5

min e resfriadas a temperatura ambiente. A mistura de reao foi diluda adicionando

9mL de gua destilada. A atividade da amilase foi determinada pela absorbncia em

espectrofotmetro a 540nm (Shimadzu, UV-1601).

Foram preparadas solues denominadas branco do extrato, contendo

soluo de amido, extrato vegetal e DNS, visando eliminar variaes relacionadas

colorao caracterstica do extrato vegetal, alm da possibilidade de atividadeamiloltica do mesmo ou o teor de maltose e acares redutores presentes no

extrato antes do experimento. Solues contendo DNS e tampo foram utilizadas

para zerar o aparelho antes da leitura da absorbncia das amostras.

4.2.3 Controle pos itivo para a atividade de inibio sobre a -amilase

Como controles positivos de inibio da -amilase foram utilizados os

inibidores acarbose e o Triticum aestivum. A acarbose um inibidor desta enzima

atualmente comercializado como medicamento em diferentes concentraes e o

Triticum aestivumum inibidor da atividade de -amilase, recomendado como padro

de inibio pela Sigma Aldrich. A curva dose-resposta para acarbose foi construda

com concentraes variando entre 1 e 80g/mL. A curva dose-resposta para o

Triticum aestivum foi construda com concentraes variando entre 20 e 140g/mL.

A soluo denominada branco do controle foi preparada subistituindo a enzima portampo fosfato de sdio 20mM (pH 6,9 com 6,7 mM cloreto de sdio).


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4.3 DETERMINAO DA ATIVIDADE DE INIBIO SOBRE A -GLICOSIDASE


Soluo de -glicosidase 1,0U/mL

-glicosidase de Saccharomyces cerevisiae(100U/mL,Sigma Aldrich) 100L

Tampo fosfato e sdio 50 mM pH 6,8 q.s.p. 10mL

Soluo de tampo fosfato de sdio 50mM pH 6,8




Soluo de -nitrofenil--D-glicopiranosdeo (NPG) 1mM

-nitrofenil--D-glicopiranosdeo (Sigma Aldrich) 57,25mg

Tampo fosfato e sdio 50mM pH 6,8 q.s.p. 250mL

Soluo de bicarbonato de sdio 10,0%

Bicarbonato de sdio 50,0g


Soluo de desoxinojirimic ina 5mg/mL Controle posi tivo

Cloridrato de 1-Desoxinojirimicina (Sigma Aldrich) 5,0mg

gua destilada 1,0mL

Soluo de extrato vegetalOs extratos etanlicos e hexnicos foram primeiramente diludos em DMSO e

em seguida diludos em gua destilada, obtendo uma soluo de DMSO a 5%. Os




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4.3.2 Ensaio da atividade enzimtica da -glicosidase

A atividade enzimtica de -glicosidase foi determinada segundo Shinde

(2008) (62), atravs da estimativa do -nitrofenol (NP) liberado a partir do

-nitrofenil--D-glicopiranosdeo (NPG). Este ensaio baseado na determinao da

hidrlise contnua do NPG em NP. A formao do NP produz uma colorao

amarela dependente de Na2CO3, que medida em espectrofotmetro a 405nm. O

PNG utilizado como substrato para uma maior especificidade do mtodo de

determinao da atividade da -glicosidase (144).

Em microplacas de 96 poos, a enzima -glicosidase (10L) foi pr-incubada

com 20L de extrato vegetal durante 5 min a 25oC. Foram adicionados 40L de

soluo de NPG (1mM) em tampo fosfato de sdio 50mM (pH 6,8). A reao foi

incubada a 37oC durante 30 min em banho-maria. Aps incubao, a reao foi

interrompida pela adio de 100L de soluo 10% de bicarbonato de sdio e a

absorbncia lida a 405nm (Leitor de microplacas - DTX 800 Multimode Detector

Beckman Coulter).

Para o branco do extrato, foram utilizadas amostras contendo o extrato

vegetal e NPG, visando eliminar variaes relacionadas colorao caracterstica

do extrato vegetal e possveis variaes relacionadas absorbncia da colorao do

NPG.

4.3.3 Controle pos itivo para a atividade de inibio sobre a -glicosidase

Como controle positivo de inibio da -glicosidase fori utilizado o inibidor

desoxinojirimicina. A curva dose-resposta para desoxinojirimicina foi construda com

concentraes variando entre 1,95 e 4000g/mL. A soluo denominada branco do

controle foi preparada substituindo a enzima por tampo fosfato de sdio 50mM (pH

6,8).


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4.4 DETERMINAO DA ATIVIDADE DE INIBIO SOBRE A TIROSINASE


Soluo de t irosinase 25U/mL

Tirosinase de cogumelo (25KU/mL, Sigma Aldrich) 100L

Tampo fosfato de sdio 50mM pH 6,5 q.s.p. 10mL

Tampo fosfato de sdio 50mM pH 6,5




Soluo de L-Tirosina 2mM

L-Tirosina (Sigma) 9,0mg

Tampo fosfato de sdio 50mM pH 6,5 q.s.p. 25,0mL

Soluo de cido k jico Controle positivo

cido kjico (Sigma Aldrich) 20,0mg

gua destilada q.s.p 1,0mL


Os extratos etanlicos e hexnicos foram diludos em DMSO e depois foram

novamente diludos em gua destilada, obtendo uma soluo de DMSO a 5%. Os




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4.4.2 Ensaio da atividade enzimtica da tirosinase

Os ensaios da atividade enzimtica da tirosinase foram realizados segundo o

mtodo utilizado por Khatib (2005), com algumas modificaes (145). Em

microplacas de 96 poos foram adicionados 30L de soluo de tirosinase 25U/mL,

60 L de soluo tampo fosfato de sdio 50mM pH 6,5 e 10L da soluo de

extrato. Essa mistura foi incubada por 5 min a 25oC. Ento foram adicionados 100L

de soluo de L-tirosina para reao a 25oC. Aps 20 min, a absorbncia foi medida

a 475nm (Leitor de microplacas BioTeK Synergy HT). Para o branco do extrato,

foram utilizadas amostras contendo o extrato vegetal e L-tirosina, visando eliminar

variaes relacionadas colorao caracterstica do extrato vegetal e variaes

relacionadas absorbncia da colorao de L-tirosina.

4.4.3 Controle pos itivo para a atividade de inibio sobre a tirosinase

Como controle positivo de inibio da tirosinase foi utilizado o inibidor cido

kjico. A curva dose-resposta para cido kjico foi construda com concentraes

variando entre 0,24 e 1000g/mL. A soluo denominada branco do controle foi

preparada substituindo a enzima por tampo fosfato de sdio 50mM (pH 6,5).

4.4 DETERMINAO DA ATIVIDADE DE INIBIO SOBRE A

ACETILCOLINESTERASE


Soluo de acetilcolinesterase

A acetilcolinesterase de Electrophorus electricus (500U, Sigma Aldrich) foi

diluda em 10mL de tampo base-Tris 50mM pH 8,0, aliquotada em microtubos e


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armazenadas a 80oC. Para o ensaio, 100l da soluo estoque foram diludos em

25mL de soluo de albumina de soro bovino a 0,1%.

Soluo de Tampo A - Base-Tris 50 mM pH 8,0

Base-Tris 6,0g


HCl (ajuste pH)

Soluo de acetiltiocolina 15mM

Iodeto de acetiltiocolina (Sigma Aldrich) 21,7mg

gua destilada q.s.p. 5,0mL

Soluo de Tampo C

NaCl 2,92g

MgCl2 20,33g


Soluo de DTNB 3mM

cido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzico (Sigma Aldrich) 29,72mg

Tampo A q.s.p. 250mL

Soluo de Tampo B - albumina 0,1 %

Albumina de soro bovino (Sigma Aldrich) 0,5g

Tampo base-tris 50 mM pH 8,0 q.s.p. 500mL

Soluo de eserina Contro le positi vo

Eserina (Sigma Aldrich) 20mg

Tampo A 1mL


Os extratos etanlicos e hexnicos foram diludos em etanol na concentrao

de 10mg/mL e depois foram diludos mais 10 vezes em Tampo A at a

concentrao de 1mg/mL. Os extratos aquosos foram preparados em Tampo A na

concentrao de 10mg/mL.


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4.4.2 Ensaio da atividade enzimtica da acetilco linesterase

O ensaio in vitro da atividade da acetilcolinesterase foi realizado em

microplacas de 96 poos a partir do mtodo desenvolvido por Ellman (1961) (146). A

enzima hidroliza o substrato acetiltiocolina resultando na produo de tiocolina, que

reage com o DTNB para produzir 2-nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina e 5-tio-2-

nitrobenzoato, o qual pode ser detectado a 405nm. Em microplacas de 96 poos,

25L de soluo de acetilcolinesterase, 125L de soluo de DTNB, 50L de

Tampo B foram adicionados a 25L de cada amostra e a absorbncia foi medida a

405nm a cada 13 segundos por cinco vezes (Leitor de microplacas - DTX 800

Multimode Detector Beckman Coulter). Em seguida, foram adicionados 25L de

soluo de iodeto de acetiltiocolina e absorbncia novamente determinada a cada

13 segundos por oito vezes. Um possvel aumento na absorbncia devido hidrlise

espontnea do substrato foi corrigido pela subtrao da absorbncia antes da adio

da enzima pela absorbncia depois da adio da enzima.

4.4.3 Controle posit ivo para a atividade de inib io sobre a acetlcolinesterase

Como controle positivo de inibio da acetilcolinesterase foi utilizado o inibidor

eserina, tambm chamado de fisostigmina. A curva dose-resposta para eserina foi

construda com concentraes variando entre 0,007 e 2000g/mL. A curva de

inibio foi obtida plotando a % de inibio versus o logaritmo da concentrao de

eserina. Os parmetros de regresso no-linear foram traados para cada curva e

os valores de IC50foram obtidos utilizando o software GraphPad Prism 5.0.


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4.5 DETERMINAO DA PORCENTAGEM DE INIBIO ENZIMTICA

As porcentagens de inibio sobre as enzimas foram calculadas comparando-

se a absorbncia das amostras (ensaio contendo extrato + enzima + substrato) com

a do controle da enzima (ensaio contendo tampo + enzima + substrato). Os valores

correspondentes absorbncia do controle da enzima forneceram o referencial da

atividade mxima da enzima utilizada para a realizao dos experimentos, ou seja,

refere-se capacidade mxima da enzima para a formao dos produtos a partir dos

seus substratos, tendo sido considerada a atividade da enzima igual a 100%. Dessa

forma as porcentagens de inibio das amostras foram calculadas de acordo com a

seguinte equao: % Inibio = [(C-A) x 100]/C, onde: C representa a absorbnciado controle da enzima, subtrada do branco do substrato e A representa a

absorbncia da amostra subtrada do branco do extrato (extrato vegetal + substrato

+ tampo).

4.6 DETERMINAO DOS VALORES DE IC50DOS EXTRATOS VEGETAIS

Os extratos que apresentaram atividade de inibio foram selecionados para

a avaliao do potencial de inibio em diluies seriadas. Foram construdas curvas

dose-resposta para cada extrato selecionado determinando-se o valor do IC50. A

concentrao capaz de inibir a metade da inibio mxima (IC50) a medida da

eficcia de um composto na funo biolgica ou bioqumica de inib

Documents

Inibidiores de Tirosinase