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JOHNATT ALLAN ROCHA DE OLIVEIRA

INVESTIGAÇÃO DAS ETAPAS PARA O PROCESSO DE PRODUÇÃO DE

ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DA BIOMASSA DO C AROÇO DE

AÇAÍ ( EUTERPE OLERACEA)

Campinas, 2014

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

JOHNATT ALLAN ROCHA DE OLIVEIRA

INVESTIGAÇÃO DAS ETAPAS PARA O PROCESSO DE

PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DA

BIOMASSA DO CAROÇO DE AÇAÍ ( EUTERPE OLERACEA)

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade

de Engenharia Química da Universidade

Estadual de Campinas, como requisito para

obtenção do título de Doutor em Engenharia

Química

Orientador: Prof. Dr. Rubens Maciel Filho

Este exemplar corresponde à versão final da Tese de Doutorado defendida por Johnatt

Allan Rocha de Oliveira sob a orientação do Prof. Dr. Rubens Maciel Filho

Campinas, 2014

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS E PRODUTOS

TESE DE DOUTORADO

Investigação das etapas para o processo de produção de etanol de segunda geração a partir da biomassa do caroço de açaí (euterpe oleracea)

Autor: Johnatt Allan Rocha de Oliveira

Orientador: Prof.Dr. Rubens Maciel Filho

A Banca Examinadora composta pelos membros abaixo aprovou esta Tese:

Campinas, 09 de dezembro de 2014.

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ABSTRACT

The use of lignocellulosic wastes to ethanol production has become a focus of research in several parts of the world. Each region of the world focused in a specific waste from your local industry. However the Brazil is a country of immense agro-industrial production and with different residues that can be explored within each region one of its regions. Such as açaí seeds in northern of Brazil. A central composite experimental design rotational 23 for evaluation of pretreatment with H2SO4 diluted of açaí seeds was carried outj and study conditions were : concentration of H2SO4 (0.5 - 1.5% w/v), solids loading (5-15% w/v) and time (30-90 min). Then delignification of pretreated seeds açaí was evaluated through an experimental design 22 under the following conditions: 1% NaOH (w/v), solids loading (10-40% w/v), temperature (50-100 °C) and time 60 minutes. Both materials were hydrolysed enzymatically (enzyme load of 15FPU/g seed and 25CBU/g of seed) chemically and characterized via HPLC (high performance liquid chromatography). The best conditions achieved for the pretreatment and delignification were used to evaluate the effect of loading solids (5-15% w/v) and agitation (100-200 rpm) on the enzymatic hydrolysis (in reactor) through an experimental design 32. The optimum conditions for pre-treatment dilute sulfuric acid was 1% acid, 10% solids at 60°C. While the optimum conditions for delignification sequential was 25% solids at 75°C. For the enzymatic hydrolysis, the solids loading of 3% allowed for conversion the highest values (78.97%). However the highest values of g glucose (g/L) were obtained for 10 and 15% solids in the reactor 200rpm (best condition of agitation). The fermentation of the hydrolyzate from the material pretreated with dilute sulfuric acid and sequentially deslignificated was one which produced the highest yield of ethanol (21,65g/L). It was concluded that the steps of pretreatment and delignification of seeds of acai allowed the release of good levels of sugars and subsequent ethanol production.

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RESUMO

O aproveitamento de resíduos lignocelulósicos para a produção de etanol combustível tem se tornado um foco de pesquisas em diversas partes do mundo. Cada região do mundo focou em um resíduo de sua indústria local o que é típico da industria de biocombustíveis. Entretanto o Brasil é um país de imensa produção agroindustrial e com diferentes resíduos que podem ser explorados para cada região, como é o caso do caroço de açaí na região norte do Brasil. Dentro deste contexto o objetivo desse trabalho é propor e investigar as etapas de processos para a obtenção de etanol a partir do caroço de açaí (Euterpe oleracea). Para tanto foi realizado um planejamento experimental central composto rotacional 23 para a avaliação do pré-tratamento do caroço de açaí com H2SO4 diluído, e as condições do estudo foram: concentração de H2SO4 (0,5 - 1,5% m/v), carga de sólidos (5-15% m/v) e o tempo (30-90 min). Em seguida a deslignificação do caroço de açaí pré-tratado foi avaliada através de um planejamento experimental do tipo 22 nas seguintes condições: 1% de NaOH (m/v), carga de sólidos (10-40% (m/v), temperatura (50-100 °C) e tempo de 60 minutos. Ambos os materiais foram hidrolisados enzimaticamente (carga enzimática de 15FPU/g de caroço e 25CBU/g de caroço) e caracterizados quimicamente via HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência). As melhores condições obtidas para o pré-tratamento e deslignificação foram utilizadas para avaliar o efeito da carga de sólidos (5-15%) e agitação (100-200 rpm) na hidrólise enzimática (em reator) através de um planejamento experimental 32. A fermentação dos hidrolisados obtidos foi realizada e os hidrolisados e fermentados foram caracterizados via HPLC. As condições consideradas ótimas para o pré-tratamento com H2SO4 diluído foi de 1% de ácido, 10% de sólidos durante 60°C, enquanto que a melhor condição para a deslignificação sequencial foi de 25% de sólidos a 75°C. Para a hidrólise enzimática, a carga de sólidos de 3% foi a que permitiu maiores valores de conversão (78,97%). Entretanto, os maiores valores de glicose (g/L) foram obtidos para 10 e 15% de sólidos em reator a 200rpm (melhor condição de agitação). A fermentação do hidrolisado obtido a partir do material pré-tratado com H2SO4 diluído e sequencialmente deslignificado foi aquela que produziu o maior índice de etanol (21,65 g/L). Foi possível concluir que as etapas de pré-tratamento e deslignificação do caroço de açaí permitiram a liberação de índices aceitáveis de açúcares e posterior produção de etanol.

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SUMÁRIO CAPÍTULO 1

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 1 1.1 OBJETIVOS ................................................................................................................................................. 3 1.2 OBJETIVO GERAL ..................................................................................................................................... 3 1.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................................................... 3

CAPÍTULO 2

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................................................... 6 2.1 AÇAÍ ............................................................................................................................................................ 6 2.2 BIOMASSAS ............................................................................................................................................... 8 2.3 PAREDE CELULAR E COMPOSIÇÃO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS ........................... 12 2.3.1 Celulose ................................................................................................................................................... 14 2.3.2 Hemicelulose ........................................................................................................................................... 18 2.3.3 Lignina .................................................................................................................................................... 21 2.3.4 Substâncias pécticas ................................................................................................................................ 24 2.3.5 Extrativos................................................................................................................................................. 26 2.3.6 Outros constituintes ................................................................................................................................. 27 2.4 PRÉ-TRATAMENTOS .............................................................................................................................. 27 2.4.2 Pré-tratamento com ácidos diluídos ........................................................................................................ 32 2.5 DESLIGNIFICAÇÃO ALCALINA COM NaOH ..................................................................................... 38 2.6 HIDRÓLISES ............................................................................................................................................. 40 2.6.1 Hidrólise ácida ......................................................................................................................................... 40 2.6.2 Hidrólise enzimática ou sacarificação ..................................................................................................... 42 2.7 FERMENTAÇÃO ...................................................................................................................................... 46

CAPÍTULO 3

3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL ......................................................................................................... 51 3.1 REAGENTES ............................................................................................................................................. 51 3.3 MATÉRIA-PRIMA .................................................................................................................................... 52 3.3.1 Preparação da matéria-prima ................................................................................................................... 53 3.4 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO CAROÇO DE AÇAÍ ...................................................... 55 3.4.1 Determinação do teor de umidade ........................................................................................................... 55 3.4.1.1 Em estufa .............................................................................................................................................. 56 3.4.1.2 Em infravermelho (usado para controle e verificação) ......................................................................... 56 3.4.2 Teor de extrativos totais .......................................................................................................................... 57 3.4.3 Determinação dos componentes lignocelulósicos do caroço de açaí ....................................................... 57 3.4.3.1 Hidrólise ácida para caracterização química do caroço de açaí ............................................................ 57 3.4.3.2 Determinação do teor de lignina ........................................................................................................... 58 3.4.3.3 Determinação do teor de Cinzas ........................................................................................................... 60 3.4.3.5 Determinação o teor de proteínas ......................................................................................................... 65 3.4.4 Técnicas espectroscópicas e de imagem aplicadas para a caracterização do caroço de açaí. .................. 66 3.4.4.1 Análise dos materiais lignocelulósicos por microscopia eletrônica de varredura (MEV) .................... 66 3.4.4.2 Espectroscopia de difração de Raios-X (DRX) .................................................................................... 67 3.4.4.3 Infravermelho com Transformada de Fourier (FTRI). ......................................................................... 67 3.5 PRÉ-TRATAMENTO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO ................................................................ 68 3.5.1 Planejamento experimental e fator de severidade aplicado para o estudo do pré-tratamento com ácido sulfúrico diluído ............................................................................................................................................... 70

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3.6 DESLIGNIFICAÇÃO COM HIDRÓXIDO DE SÓDIO (NAOH) ............................................................ 71 3.7 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E SUAS ETAPAS ....................................................................................... 73 3.7.1 Enzimas utilizadas ................................................................................................................................... 73 3.7.2 Preparo do Tampão citrato utilizado........................................................................................................ 73 3.7.3 Preparação do DNS e Tartarato ............................................................................................................... 73 3.7.4 Determinação da atividade enzimática da celulase .................................................................................. 73 3.7.6 Hidrólise enzimática do caroço de açaí pré-tratado e deslignificado para obtenção de dados cinéticos . 78 3.7.7 Estudo da variação da carga de sólidos e agitação na etapa de hidrólise enzimática .............................. 79 3.8 FERMENTAÇÃO ...................................................................................................................................... 80 3.8.1 Preparação do padrão glicose .................................................................................................................. 80 3.8.2 Preparo do hidrolisado ............................................................................................................................. 80 3.8.3 Esterelização dos hidrolisados ................................................................................................................. 80 3.8.4 Microrganismo ........................................................................................................................................ 81 3.8.5 Ativação do microrganismo ..................................................................................................................... 81 3.8.6 Crescimento do microrganismo ............................................................................................................... 81 3.8.7 Fermentação dos hidrolisados ................................................................................................................. 82 3.8.8 Métodos analíticos utilizados para avaliar a fermentação ....................................................................... 82

CAPÍTULO 4

4. RESULTADOS DA CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO CAROÇO DE AÇAÍ “ IN NATURA” ............ 85

CAPÍTULO 5

5. RESULTADOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM ÁCIDO SULFÚRICO (H2SO4) DILUÍDO DO CAROÇO DE AÇAÍ ........................................................................................................................................ 89 5.1 RESULTADOS OBTIDOS PARA A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA FRAÇÃO SÓLIDA RECUPERADA APÓS O PRÉ-TRATAMENTO ........................................................................................... 89 5.2 RESULTADOS OBTIDOS PARA A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA FRAÇÃO LÍQUIDA APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO .................................................................... 100 5.3 RESULTADOS OBTIDOS PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO ..................................................................................... 108 5.4 RESULTADOS OBTIDOS PARA AS CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICAS DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉTRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO ............................................................ 113

CAPÍTULO 6

6. RESULTADOS DA DESLIGNIFICAÇÃO DO CAROÇO DE AÇAI PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO ................................................................................................................................ 118 6.1 RESULTADOS DA CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA FRAÇÃO SÓLIDA APÓS A DESLIGNIFICAÇÃO. ................................................................................................................................... 118 6.2 RESULTADOS OBTIDOS PARA A LIGNINA PRECIPITADA RECUPERADA NA FRAÇÃO LÍQUIDA APÓS A DESLIGNIFICAÇÃO DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO ................................................................................................................................ 127 6.3 RESULTADOS OBTIDOS PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAI PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO E DESLIGNIFICADO ............................................... 128 6.4 RESULTADOS OBTIDOS PARA AS CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICAS DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO ....................................................................................................................................... 130 6.5 BALANÇO DE MASSA PARA A ETAPA DE DESLIGNIFICAÇÃO DO MATERIAL PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO E POSTERIORMENTE DESLIGNIFICADO ....................................................................... 132

xiii

CAPÍTULO 7

7. MUDANÇAS ESTRUTURAIS E VISUAIS NO CAROÇO DE AÇAI E PODER CALORÍFICO .......... 136 7.1 ANÁLISE VISUAL DO CAROÇO DE AÇAI ........................................................................................ 136 7.2 ANÁLISE DE MICROSCOPIA ELETRÕNICA DE VARREDURA (MEV) DO CAROÇO DE AÇAI “ IN NATURA”, APÓS PRÉ-TRATAMENTO, DESLIGNIFICAÇÃO E HIDRÓLISE ENZIMÁTICA....... 138 7.3 RESULTADOS DA ANÁLISE DE CRISTALINIDADE POR ESPECTROSCOPIA DE DIFRAÇÃO DE RAIO X (DRX) .............................................................................................................................................. 140 7.4 RESULTADOS DA ESCTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM TRASFORMADA DE FOURIER (FTIR) ........................................................................................................................................... 143

CAPÍTULO 8

8. RESULTADOS DA VARIAÇÃO DA CARGA DE SÓLIDOS E AGITAÇÃO NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAI ...................................................................................................... 148 8.1 ANÁLISE E TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAI PRÉ-TRATADO APENAS COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO ........................................................................................................................................................................ 148 8.2 ANÁLISE E TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAI PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO ............................................................................................... 154 8.3 RESULTADOS OBTIDOS PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DA CELULOSE APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM ÁCIDO SULFÚRICO E DESLIGNIFICAÇÃO ...................................................... 158

CAPÍTULO 9

9. FERMENTAÇÃO ...................................................................................................................................... 165 9.1 RESULTADOS OBTIDOS PARA A FERMENTAÇÃO DOS HIDROLISADOS ................................ 165 CAPÍTULO 10. CONCLUSÕES ................................................................................................................... 171 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................................... 174 SUGESTÃO PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................................................................ 173

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Dedico a minha mãe, pai e avós

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AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente à Deus, sem o qual acredito que nenhuma realização em

minha vida teria sido possível. Agradeço a minha mãe, que foi, e é meu maior exemplo em

todos os sentidos de minha vida e que sempre me apoiou em minhas escolhas e sonhos. Ao

meu pai e avós que foram fundamentais para que os mesmos sonhos se tornassem reais.

Agradeço ao meu orientador o Dr. Rubens Maciel, por me fornecer sempre um bom

conselho, uma boa contribuição para o trabalho, e que será sempre um exemplo para mim

de pesquisador e professor. Agradeço ao CNPQ pela bolsa fornecida durante parte da

realização deste trabalho e à FAPESP que através do BIOEN me proporcionou a estrutura

técnica necessária ao bom andamento deste trabalho.

Agradeço à Universidade Federal do Pará (UFPA) pelo apoio concendido através do

meu afastamento durante a finalização desta Tese e que também forneceu estrutura para a

realização de alguns experimentos. Sou muito grato a Universidade Estadual de Campinas

(UNICAMP) onde realizei este doutorado, do qual pude obter muito conhecimento técnico-

profissional, e à todos os professores e funcionários que a tornam a grande universidade

que é.

Aos Membros da Banca por aceitarem avaliar esta Tese e contribuirem com

sugestões de grande importância.

Não poderia esquecer dos meus grandes amigos Luiza Helena, Andrea Komesu,

Debora Kono e Rodrigo Gouvêa pela ajuda em importantes momentos deste trabalho. Fica

aqui o meu muito obrigado à todos!

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Lembre-se da minha ordem: “seja forte e corajoso! Não fique desanimado nem tenha medo, porque eu, o eterno, o seu Deus, estarei com você em qualquer lugar, para onde você for!”

(JOSUÉ 1:9)

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xxi

LISTA DE FIGURAS FIGURA 1.1. DIAGRAMA DE BLOCOS DAS PRINCIPAIS ETAPAS REALIZADAS NESTE TRABALHO. ........................... 4 FIGURA 2.1 A) AÇAIZEIROS; B) FRUTOS “ IN NATURA”; C) CAROÇOS DESPOLPADOS; D) CAROÇO SECIONADO E

E) ESQUEMA DA SECÇÃO. ........................................................................................................................... 7 FIGURA 2.2 VÁRIOS RESÍDUOS AGRÍCOLAS LIGNOCELULÓSICOS E CULTURA PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL ... 10 FIGURA 2.3 FRACIONAMENTO DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA PARA A PRODUÇÃO DE BIOCONBUSTÍVEIS ..... 12 FIGURA 2.4 ESTRUTURA E COMPONENTES DA PAREDE CELULAR VEGETAL ....................................................... 14 FIGURA 2.5 ESTRUTURA MOLECULAR DA CELULOSE ......................................................................................... 15 FIGURA 2.6 CELULOSE E SUA ESTRUTURA ......................................................................................................... 16 FIGURA 2.7 ESTRUTURA DA CELULOSE E QUEBRA ENZIMÁTICA ........................................................................ 18 FIGURA 2.8 HEMICELULOSES: (A) GLUCURONOARABINOXILANAS (GAX), PRINCIPAIS POLISSACARÍDEOS

HEMICELULÓSICOS, CONSISTEM EM UMA CADEIA DE XILANAS, COM SUSTITUÇÕES DE ARABINOSE, ÁCIDO

D-GLUCURÔNICO E ÁCIDO FERÚLICO E (B) Β-GLUCANAS COM LIGAÇÕES MISTAS, CONSISTEM EM

UNIDADES DE CELOTRIOSE E CELOTETRAOSE UNIDAS POR LIGAÇÕES Β(1-4) QUE SE ENTRELAÇAM POR

LIGAÇÕES Β(1-3)....................................................................................................................................... 20 FIGURA 2.9 PRECURSORES TÍPICOS, FENILPROPANÓIDES, UTILIZADOS NA BIOSSÍNTESE DE LIGNINA DA BIOMASSA

VEGETAL .................................................................................................................................................. 22 FIGURA 2.10 TIPOS DE LIGAÇÕES PROPOSTAS ENTRE LIGNINA E OS POLISSACARÍDEOS; A) L IGAÇÕES ÉTER

BENZÍLICAS; B) LIGAÇÕES ESTER BENZÍLICA ............................................................................................. 23 FIGURA 2.11 ESTRUTURA HIPOTÉTICA DA LIGNINA E OS TIPOS DE LIGAÇÕES POSSÍVEIS ENTRE SUAS UNIDADES

ESTRUTURAIS............................................................................................................................................ 24 FIGURA 2.12 UM SEGMENTO DE REPETIÇÃO DA MOLÉCULA DE PECTINA E GRUPOS FUNCIONAIS: (B) CARBOXILO;

(C) ÉSTER; (D) AMIDA NA CADEIA DE PECTINA .......................................................................................... 25 FIGURA 2.13 DIFERENTES PRÉ-TRATAMENTOS .................................................................................................. 29 FIGURA 2.14 LIBERAÇÃO DE PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO A PARTIR DOS CARBOIDRATOS DA BIOMASSA

DURANTE O PRÉ-TRATAMENTO COM ÁCIDOS ............................................................................................ 34 FIGURA 2.15 DEGRADAÇÃO DA CELULOSE ........................................................................................................ 35 FIGURA 2.16 DEGRADAÇÃO DA XILANA ............................................................................................................ 36 FIGURA 2.17 MECANISMO DE DEGRADAÇÃO EM MEIO ÁCIDO – QUEBRA DA LIGAÇÃO Β-O-4 ............................ 36 FIGURA 2.18 MODELO QUE REPRESENTA AS REAÇÕES DE HIDRÓLISE E AS PROVÁVEIS ALTERAÇÕES

OBSERVADAS NA ESTRUTURA SUPRAMOLECULAR DO MATERIAL LIGNOCELULÓSICO DURANTE A HIDRÓLISE

COM ÁCIDOS DILUÍDOS ............................................................................................................................. 37 FIGURA 2.19 MECANISMO DE HIDRÓLISE DA CELULOSE CATALISADA POR ÁCIDO ............................................. 42 FIGURA 2.20 DEGRADAÇÃO ESQUEMÁTICA DA CELULOSE POR CELULASES ...................................................... 45 FIGURA 2.21 MODO DE AÇÃO DAS GLICOSIDASES ............................................................................................. 45 FIGURA 2.22 ESQUEMA SIMPLIFICADO DA FERMENTAÇÃO ALCOOLICA ............................................................ 47 FIGURA 3.1 V ISTA DE SATÉLITE DA REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM-PA ................................................... 53 FIGURA 3.2 FLUXOGRAMA DE PROCESSAMENTO DO CAROÇO DE AÇAÍ UTILIZADO NOS EXPERIMENTOS. ........... 54 FIGURA 3.3 AÇAÍ ANTES E DEPOIS DA LAVAGEM (DA ESQUERDA PARA A DIREITA) ........................................... 54 FIGURA 3.4 CAROÇO DE AÇAÍ APÓS SECO E TRITURADO .................................................................................... 55 FIGURA 3.5 BIOMASSA NOS TUBOS SCHOTT ANTES DE SEGUIREM PARA O AUTOCLAVE..................................... 69 FIGURA 5.1 CONCENTRAÇÃO DE AÇUCARES NA FRAÇÃO LÍQUIDA DO PRÉ-TRATAMENTO (LICOR) .................. 103 FIGURA 5.2 GRÁFICO DE PARETO PARA OS TEORES DE XILOSE NOS LICORES OBTIDOS A PARTIR DO PRÉ-

TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO. ....................................................................................................... 107 FIGURA 5.3 RESULTADOS OBTIDOS PARA CONVERSÃO E RENDIMENTO GLOBAL OBTIDOS PARA O MATERIAL

PRÉ-TRATADO. ........................................................................................................................................ 110 FIGURA 5.4 GRÁFICO DE PARETO PARA O TEOR DE G DE GLICOSE/ G DE CAROÇO CRU. ................................... 112 FIGURA 5.5 GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 1E 2. ......................................................... 113 FIGURA 5.6 GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 3 E 4. ........................................................ 114

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FIGURA 5.7 - GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 5 E 6. ...................................................... 114 FIGURA 5.8 - GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 7 E 8. ...................................................... 114 FIGURA 5.9 - GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 9 E 10. .................................................... 115 FIGURA 5.10 - GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 11 E 12. ................................................ 115 FIGURA 5.11 - GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 13 E 14. ................................................ 115 FIGURA 5.12 GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 15, 16 E 17. ............................................. 116 FIGURA 6.1 SOLUBILIZAÇÃO DOS COMPONENTES LIGNOCELULÓSICOS CALCULADOS EM RELAÇÃO AO MATERIAL

PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO DILUÍDO. ....................................................................................................... 125 FIGURA 6.2 SOLUBILIZAÇÃO DOS COMPONENTES LIGNOCELULÓSICOS CALCULADOS EM RELAÇÃO AO MATERIAL

“ IN NATURA”. ......................................................................................................................................... 126 FIGURA 6.3 LIGNINA RECUPERADA NO LICOR OBTIDO APÓS A DESLIGNIFICAÇÃO DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-

TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO............................................................................................................... 127 FIGURA 6.4 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADA PARA OS ENSAIOS 1 E 2. ................................ 130 FIGURA 6.5 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADA PARA OS ENSAIOS 3 E 4. ................................ 131 FIGURA 6.6 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADA PARA OS ENSAIOS 5 E 6. ................................ 131 FIGURA 6.7 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADA PARA OS ENSAIOS 7 E 8. ................................ 131 FIGURA 6.8 CINÉTICA ENZIMÁTICA REALIZADA PARA OS PONTOS CENTRAIS 9. ............................................... 132 FIGURA 6.9 BALANÇO DE MASSA PARA O PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO DO CAROÇO DE AÇAÍ. ....... 133 FIGURA 6.10 BALANÇO DE MASSA PARA O PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO E DESLIGNIFICAÇÃO

SEQUENCIAL DO CAROÇO DE AÇAÍ. ......................................................................................................... 134 FIGURA 7.1 BIOMASSA DO CAROÇO DE AÇAÍ “ IN NATURA” (A) E PRÉ-TRATADA (B). ...................................... 136 FIGURA 7.2 CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM 0,2% (A); 1,0% (B) E 1,84%(C) DE H2SO4. ...................... 137 FIGURA 7.3 CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM 1,84% E DESLIGNIFICADO. ................................................ 137 FIGURA 7.4 A E B FOTOMICROGRAFIAS DO CAROÇO DE AÇAÍ “ IN NATURA” (A E B DA ESQUERDA PRA DIREITA).

OS AUMENTOS E BARRAS DE COMPARAÇÃO ESTÃO APRESENTADAS EM CADA FIGURA. .......................... 138 FIGURA 7.5 A E B FOTOMICROGRAFIAS APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO (A E B DA ESQUERDA

PRA DIREITA). OS AUMENTOS E BARRAS DE COMPARAÇÃO DE ESTÃO APRESENTADAS EM CADA FIGURA. ............................................................................................................................................................... 139

FIGURA 7.6 A E B FOTOMICROGRAFIAS APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO E DESLIGNIFICADO COM

NAOH (A E B DA ESQUERDA PRA DIREITA). OS AUMENTOS E BARRAS DE COMPARAÇÃO DE ESTÃO

APRESENTADAS EM CADA FIGURA. ......................................................................................................... 139 FIGURA 7.7 FOTOMICROGRAFIAS APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO E DESLIGNIFICADO E

POSTERIOR HIDRÓLISE ENZIMÁTICA. ....................................................................................................... 140 FIGURA 7.8 CURVAS DE DIFRAÇÃO OBTIDAS PARA O CAROÇO DE AÇAÍ. .......................................................... 141 FIGURA 8.1 VALORES OBSERVADOS VS. VALORES PREDITOS OBTIDOS PARA OS VALORES DE G DE GLICOSE/ G DE

CAROÇO “ IN NATURA” A 95% DE CONFIANÇA ......................................................................................... 152 FIGURA 8.2 GRÁFICO DE PARETO OBTIDO PARA OS EFEITOS ESTIMADOS DOS VALORES DE G DE GLICOSE/ G DE

CAROÇO “ IN NATURA” EM UM INTERVALO DE 95% DE CONFIANÇA ........................................................ 152 FIGURA 8.3 SUPERFÍCIE DE RESPOSTA GERADA PARA OS VALORES DE G DE GLICOSE / G DE CAROÇO “ IN

NATURA”. ............................................................................................................................................... 153 FIGURA 8.4 VALORES OBSERVADOS VS. VALORES PREDITOS OBTIDOS PARA OS VALORES DE G DE GLICOSE/ G DE

CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO PARA UM INTERVALO DE 99% DE CONFIANÇA (CAROÇO PRÉ-TRATADO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO) ................................................................................. 156

FIGURA 8.5 GRÁFICO DE PARETO OBTIDOS DOS EFEITOS ESTIMADOS PARA OS VALORES DE G DE GLICOSE/ G DE

CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO EM INTERVALO DE 99% DE CONFIANÇA. .......................... 156 FIGURA 8.6 SUPERFÍCIE DE RESPOSTA OBTIDA PARA OS VALORES DE G DE GLICOSE/ G DE BAGAÇO PRÉ-TRATADO

COM H2SO4 DILUÍDO .............................................................................................................................. 157 FIGURA 8.7 RESULTADOS DA CONVERSÃO DA CELULOSE OBTIDOS PARA O CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM

H2SO4 DILUÍDO E PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO. ............. 159

xxiii

FIGURA 8.8 RESULTADOS DA CONVERSÃO ENZIMÁTICA OBTIDA PARA A CELULOSE DO CAROÇO DE AÇAÍ APENAS

PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO, PRÉ-TRATADO E DESLIGNIFICADO SEQUENCIALMENTE E “ IN NATURA”

A 200 RPM............................................................................................................................................... 160 FIGURA 8.9 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADAS PARA O CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM

H2SO4 DILUÍDO (1° DA ESQUERDA PARA DIREITA) E CAROÇO DE AÇAÍ “ IN NATURA”/BRUTO (2° DA

ESQUERDA PARA DIREITA) DURANTE 96 HORAS A 200RPM. .................................................................... 161 FIGURA 8.10 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADAS PARA O CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM

H2SO4 DILUÍDO E DESLIGNIFICADO SEQUENCIALMENTE DURANTE 96 HORAS A 200RPM. ....................... 162 FIGURA 8.11 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADAS PARA O CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO

APENAS COM H2SO4; PRÉ-TRATADO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO E CAROÇO “ IN

NATURA”/BRUTO DURANTE 96 HORAS A 200RPM. .................................................................................. 162 FIGURA 8.12 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADAS PARA O CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO

APENAS COM H2SO4; PRÉ-TRATADO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO E CAROÇO “ IN

NATURA”/BRUTO DURANTE 96 HORAS A 200RPM A 3% DE SÓLIDOS. ...................................................... 163 FIGURA 9.1 GRÁFICOS DAS CINÉTICAS DE FERMENTAÇÃO DOS HIDROLISADOS PADRÃO (GLICOSE PADRÃO),

HIDROLISADO OBTIDOS COM O CAROÇO DE AÇAÍ APENAS PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO E

HIDROLISADO OBTIDO COM O CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO (DA

ESQUERDA PARA DIREITA). ..................................................................................................................... 169

xxiv

xxv

LISTA DE TABELAS TABELA 3-1 REAGENTES UTILIZADOS NOS EXPERIMENTOS. .............................................................................. 51 TABELA 3-2 FAIXA DE CONCENTRAÇÃO DOS PADRÕES USADOS NA CURVA DE CALIBRAÇÃO. ........................... 62 TABELA 3-3 PH E VOLUME DE H2SO4 A 72% ADICIONADO PARA A HIDRÓLISE ÁCIDA DO LICOR, PARA POSTERIOR

QUANTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS E INIBIDORES PRESENTES. ................................................................ 65 TABELA 3-4 FAIXA DAS VARIÁVEIS ESTUDADAS NO PLANEJAMENTO 23

DO PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4. .... 71 TABELA 3-5 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL DO PRÉ TRATAMENTO COM H2SO4 ............................................. 71 TABELA 3-6 PLANEJAMENTO 22

REALIZADO PARA O ESTUDO DA DESLIGNIFICAÇÃO DO CAROÇO DE AÇAÍ. ....... 72 TABELA 3-7 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL APLICADO PARA A VARIAÇÃO DA CARGA DE SÓLIDOS E AGITAÇÃO.

................................................................................................................................................................. 79 TABELA 4-1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA BIOMASSA DO CAROÇO DE AÇAÍ “ IN NATURA” EM BASE SECA. ............ 85 TABELA 4-2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DE ALGUNS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS. ............................................ 88 TABELA 5-1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA FRAÇÃO SÓLIDA OBTIDA DO PRÉ TRATAMENTO COM H2SO4 (SEM A

CORREÇÃO) .............................................................................................................................................. 91 TABELA 5-2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA FRAÇÃO SÓLIDA OBTIDA DO PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DA

BIOMASSA DO CAROÇO DE AÇAÍ (COM A CORREÇÃO DO RENDIMENTO DO PRÉ-TRATAMENTO) ................. 93 TABELA 5-3 RESULTADOS ESTATÍSTICOS OBTIDOS PARA OS PRINCIPAIS COMPONENTES DA FRAÇÃO SÓLIDA

OBTIDA APÓS O PRÉ TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO. ......................................................................... 99 TABELA 5-4 RESULTADOS DA ANOVA REALIZADA PARA OS TEORES DE CELULOSE RECUPERADA NA FRAÇÃO

SÓLIDA APÓS O PRÉ TRATAMENTO ÁCIDO NO NÍVEL DE 90% DE CONFIANÇA. ......................................... 100 TABELA 5-5 BALANÇO DE MASSA DA FRAÇÃO LÍQUIDA PROVENIENTE DO PRÉ TRATAMENTO COM H2SO4...... 102 TABELA 5-6 RESULTADOS DOS TEORES DE XILOSE E INIBIDORES RECUPERADOS NO LICOR. ............................ 104 TABELA 5-7 RESULTADOS DOS EFEITOS ESTIMADOS E SIGNIFICÂNCIA DAS RESPOSTAS: XILOSE, HMF E

FURFURAL OBTIDOS PARA O PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO . ................................................... 106 TABELA 5-8 RESULTADOS DA ANOVA PARA O TEOR DE XILOSE PRESENTE NO LICOR (HIDROLISADO) .......... 108 TABELA 5-9 RESULTADOS OBTIDOS PARA OS TEORES DE GLICOSE (G/G DE BIOMASSA CRUA), CONVERSÃO

ENZIMÁTICA E RENDIMENTO GLOBAL. .................................................................................................... 109 TABELA 5-10 ANÁLISE DOS EFEITOS PRINCIPAIS E DE INTERAÇÃO DAS VARIÁVEIS DO PRÉ-TRATAMENTO COM

H2SO4. .................................................................................................................................................. 111 TABELA 5-11 ANÁLISE DA VARIÂNCIA (ANOVA) PARA A CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE LIBERADA APÓS A

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO BAGAÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4. ......................................................... 113 TABELA 6-1 TABELA DA COMPOSIÇÃO DA FRAÇÃO SÓLIDA DO MATERIAL DESLIGNIFICADO (SEM CORREÇÃO

PARA A BASE DO RENDIMENTO). ............................................................................................................. 121 TABELA 6-2 TABELA DA COMPOSIÇÃO DA FRAÇÃO SÓLIDA DO MATERIAL DESLIGNIFICADO (NA BASE DO

RENDIMENTO) EM RELAÇÃO AO MATERIAL PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO DILUÍDO. .................................... 122 TABELA 6-3 BALANÇO DE MASSA PARA A COMPOSIÇÃO DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO E DESLIGNIFICADO

EM RELAÇÃO AO MATERIAL “ IN NATURA” .............................................................................................. 124 TABELA 6-4 RESULTADOS OBTIDOS COM A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA BIOMASSA DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-

TRATADO (NA CONDIÇÃO CONSIDERADA ÓTIMA) E DESLIGNIFICADO. ..................................................... 128 TABELA 6-5 ANÁLISE DOS EFEITOS PRINCIPAIS E DE INTERAÇÃO DAS VARIÁVEIS DE DESLIGNIFICAÇÃO DO

CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO. ....................................................................................... 129 TABELA 6-6 RESULTADOS DA ANOVA REALIZADA OS TEORES DE GLICOSE LIBERADA APÓS A HIDRÓLISE

ENZIMÁTICA DO BAGAÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 E DESLIGNIFICADO. ............................................. 129 TABELA 8-1 RESULTADOS OBTIDOS PARA O PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL UTILIZADO PARA AVALIAR O

EFEITO DA AGITAÇÃO E DA CONCENTRAÇÃO DE SÓLIDOS NA LIBERAÇÃO DE GLICOSE APÓS A HIDRÓLISE

ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO E/OU PRÉ-TRATADO E

DESLIGNIFICADO. .................................................................................................................................... 149

xxvi

TABELA 8-2 ANÁLISE DOS EFEITOS PRINCIPAIS DAS VARIÁVEIS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO (G DE GLICOSE/ G DE CAROÇO “ IN NATURA”) PARA UM INTERVALO DE

95% DE CONFIANÇA. .............................................................................................................................. 150 TABELA 8-3 ANÁLISE DE VARIÂNCIA (ANOVA) REALIZADA PARA OS VALORES DE G DE GLICOSE/ G DE CAROÇO

“ IN NATURA” OBTIDOS PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO

PARA UM INTERVALO DE 95% DE CONFIANÇA. ....................................................................................... 151 TABELA 8-4 ANÁLISE DOS EFEITOS PRINCIPAIS DAS VARIÁVEIS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO PRÉ-

TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO (G DE GLICOSE/ G DE CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO) PARA UM INTERVALO DE 99% DE CONFIANÇA. ..................................... 154

TABELA 8-5 ANÁLISE DOS EFEITOS PRINCIPAIS DAS VARIÁVEIS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO (G DE GLICOSE/ G DE CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO) PARA UM INTERVALO DE 99% DE CONFIANÇA. ..................................... 155

TABELA 9-1 CINÉTICA DOS VALORES DE CELOBIOSE, GLICOSE, ETANOL, MASSA SECA, HMF, ÁCIDO ACÉTICO E

FURFURAL OBTIDOS PARA O HIDROLISADO PROVENIENTE DA CARGA DE SÓLIDOS DE 15% DE CAROÇO

APENAS PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO (FERMENTAÇÃO DE 24H). ................................................. 166 TABELA 9-2 CINÉTICA DOS VALORES DE CELOBIOSE, GLICOSE, ETANOL, MASSA SECA, HMF, ÁCIDO ACÉTICO E

FURFURAL OBTIDOS PARA O HIDROLISADO PROVENIENTE DA CARGA DE SÓLIDOS DE 10% DE CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO (FERMENTAÇÃO DE 24H) .......... 166

TABELA 9-3 CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO OBTIDA PARA SOLUÇÃO PADRÃO DE GLICOSE ................................ 167

xxvii

LISTA DE SIGLAS

ATP-Adenosina trifosfato

DRX - Espectroscopia de difração de Raios-X

FTRI - Infravermelho com Transformada de Fourier

GAX - Glucuronoarabinoxilanas

HMF- Hidroximetil furfural

HPLC- High Performance Liquide Chromatography

IBGE-Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

LRAC - Laboratório de Recursos Analíticos e de Calibração

MEV- Microscopia eletrônica de varredura

MLC- Materiais lignocelulósicos

NREL- National Renewable Energy Laboratory

UFPA-Universidade Federal do Pará

UNICAMP- Universidade Estadual de Campinas

xxviii

1

CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

A crise do petróleo associada às tendências globais de redução das emissões de

gases do efeito estufa têm sido um dos principais fatores de incentivo ao desenvolvimento

de novas tecnologias no setor de combustível, principalmente as relacionadas com

biocombustíveis, bioenergia e química de produtos de fontes renováveis. Esta necessidade

de processos ecoeficientes têm motivado extensivas pesquisas com o objetivo de converter

resíduos industriais e agrícolas em produtos comercialmente valorizados (CHRISTOS et

al., 2013).

Entre os principais produtos que podem ser obtidos a partir do material

lignocelulósico está o etanol de segunda geração (SÁNCHEZ & CARDONA, 2008). O

etanol de segunda geração ou etanol lignocelulósico é obtido por hidrólise dos

polissacarídeos presentes na parede celular da biomassa (SIMS et al., 2010).

Para a produção de etanol de segunda geração, é essencial aplicar à biomassa

utilizada pré-tratamentos para aumentar a acessibilidade da enzima e consequente aumento

do rendimento em etanol (MOSIER et al., 2005). Um dos primeiros pré-tratamentos que

apresentaram bons resultados para o aumento efetivo da hidrólise enzimática foi o

tratamento com ácidos diluídos, principalmente aquele realizado com o ácido sulfúrico

(H2SO4), produto com valor relativamente reduzido com relação a outros ácidos. Este

tratamento pode estar associado a temperaturas relativamente elevadas e a uma ampla

variedade de tipos e concentrações de ácido (CHRISTOS et al., 2013). Durante o

tratamento com ácidos diluídos, remove-se basicamente a fração hemicelulósica que, de

maneira geral, impede a adsorção eficiente da celulase na celulose, reduzindo assim os

índices de bioconversão. Dessa forma, a remoção dessa fração teria um efeito positivo no

aumento dos valores de hidrólise enzimática. Entretanto, parte da lignina permanece no

material pré-tratado com H2SO4 diluído (HENDRIKS & ZEEMAN, 2009). A lignina é um

dos fatores que mais impedem o acesso das enzimas hidrolíticas ao substrato. Logo a

remoção dessa fração pode ser um fator crucial para o aumento na eficiência produtiva de

açúcares para a posterior fermentação e produção de etanol (CHRISTOS et al., 2013). Um

2

dos métodos de deslignificação do qual se tem maior conhecimento é aquele realizado com

NaOH. Neste método soluções do reagente promovem a solubilização de até 90% da

lignina presente na biomassa tratada, possibilitando aumento no rendimento das taxas de

hidrólise.

Nos últimos anos, tem aumentado o uso de diferentes biomassas para a produção de

etanol de segunda geração, que requer adaptação ou desenvolvimento de processos para

alcançar o desempenho desejado (CHRISTOS et al., 2013). Um dos importantes aspectos

da produção de etanol de primeira ou segunda geração, o que é típico de biocombustíveis, é

que cada região do mundo escolheu, de certa forma, um resíduo ou uma matéria-prima de

grande produtividade local e volume de resíduo, como a beterraba na Europa, o milho nos

Estados Unidos ou a cana-de-açúcar no Brasil.

Entretanto, o Brasil apresenta uma imensa produção agroindustrial, com os mais

diferentes resíduos lignocelúlósicos provenientes de suas diferentes regiões, que

apresentam hábitos de consumo e de produtividade local diferenciada. Assim, os diferentes

resíduos lignocelulósicos de cada região do país poderiam ser aproveitados para a produção

local de etanol e, dessa maneira, diminuir a pressão comercial sofrida pelo etanol

primariamente produzido a partir da cana-de-açúcar, proveniente em sua maior parte, na

região sudeste do país.

No caso da região norte do país, um dos produtos de maior consumo é o açaí do

qual tem-se como resíduo, o seu caroço. Os caroços de açaí são considerados resíduos

urbanos e, atualmente, se configuram como um enorme inconveniente ao bem-estar e

higiene sanitária das cidades no norte do Brasil, como Belém. A possibilidade de converter

o resíduo obtido após o processo de obtenção da polpa do açaí em etanol, seria interessante

do ponto de vista comercial e ambiental. De acordo com a literatura, este material contém

grandes quantidades de celulose e hemicelulose (45%), o que justifica a sua utilização para

a produção do etanol de segunda geração (KIM et al., 2005). Poucos estudos para o

aproveitamento do caroço com fins energéticos são relatados na literatura, dentre os quais

se destaca a queima do resíduo (PADILHA et al, 2005) para produção de energia. No

entanto, este processo de queima é caracterizado como um processo de baixo valor

agregado e, a princípio, ecologicamente incorreto. Além disso, não há relatos até o

3

momento do aproveitamento do caroço para a produção de etanol combustível, o que

motivou a realização deste trabalho.

1.1. OBJETIVOS

1.2. OBJETIVO GERAL

O objetivo geral deste trabalho foi estudar as etapas para a produção de etanol a partir do caroço de açaí.

1.3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Realizar a caracterização química do caroço de açaí “in natura” (Capítulo 4);

• Realizar o pré-tratamento com H2SO4 diluído do caroço de açaí e observar a melhor

condição (Capítulo 5);

• Estudar a deslignificação alcalina com NaOH do caroço de açaí pré-tratado com

H2SO4 diluído (Capítulo 6);

• Estudar as mudanças morfológico-estruturais no caroço de açaí após o pré-

tratamento com H2SO4 diluído e com sequencial deslignificação alcalina com NaOH

(Capítulo 7);

• Estudar o efeito da variação da carga de sólidos de material pré-tratado e/ou

sequencialmente deslignificado e agitação na hidrólise enzimática realizada em reator

(Capítulo 8);

• Realizar a fermentação dos hidrolisados de caroço de açaí e verificar os índices de

produtividade de etanol (Capítulo 9).

Na Figura 1.1, é apresentado o diagrama de blocos que descreve as principais etapas

realizadas neste trabalho.

4

Figura 1.1. Diagrama de blocos das principais etapas realizadas neste trabalho.

5

1.4. PRINCIPAIS CONTRIBUIÇÕES DESTE TRABALHO

Dentre as principais contribuições deste trabalhos, podem-se citar:

• A obtenção de maiores informações técnicas sobre as características químicas e

morfológico-estruturais para o caroço de açaí (Capítulos 4 e 7);

• Obtenção de dados sobre os efeitos de pré-tratamentos já conhecidos sobre uma

matéria-prima ainda pouco explorada do ponto de vista científico (Capítulos 5 e 6);

• Fornecimento de dados sobre a hidrólise enzimática do caroço de açaí, avaliação a

influência de importantes parâmetros e a possibilidade de se produzir um componente de

alto valor agregado após a fermentação, o etanol (Capítulos 8 e 9).

6

CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O Capítulo apresenta a Revisão Bibliográfica sobre os temas abordados no decorrer

desta Tese de Doutorado com a finalidade de fundamentar o estudo realizado pela mesma.

Foram abordados os aspectos que tornam o caroço de açaí uma potencial biomassa para a

produção de etanol. Neste mesmo capítulo, são mostradas outras biomassas, das quais já se

têm relatos na literatura de sua utilização para a produção de etanol. Em seguida, são

descritas os componentes da parede celular que constituem o material lignocelulósico:

celulose, hemicelulose, lignina, substâncias pécticas e extrativos. São ainda abordadas as

demais etapas para a produção do etanol de 2ª geração: pré-tratamentos (pré-tratamento

com H2SO4 diluído e deslignificação com NaOH), hidrólise (ácida e enzimática) e a

fermentação alcoólica.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. AÇAÍ

O açaí (Euterpe oleracea) é uma palmeira amazônica que tem a polpa obtida dos

seus frutos amplamente consumidos pela população do norte do Brasil e que tem tido seu

consumo expandido para o mercado internacional com o aumento das exportações da polpa

do fruto para diferentes fins tecnológicos, principalmente alimentícios (GALOTTA &

BOAVENTURA, 2005).

Arecaceae pertence à família e gênero Euterpe, a Euterpe oleracea, Euterpe edulis e

Euterpe precatoria denominadas de "açaí" (POULOSE et al., 2012). O açaí da espécie E.

oleracea Mart. é uma fruta exótica que, quando madura muda de verde para roxo escuro

com uma única semente coberta por uma pequena polpa comestível que representa cerca de

13-15% do fruto (SCHAUSS et al., 2006) .

O gênero Euterpe congrega cerca de 28 espécies e ocorre principalmente nas

Américas Central e do Sul, o qual encontra-se distribuído por toda a bacia Amazônica

(MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE, 1998). De acordo com Rogez (2000), o fruto do

açaí é arredondado, tendo de 1 a 2 cm de diâmetro e um peso médio de 0,8 a 2,3g, sendo

seu epicarpo de cor violáceo; púrpura quase negro e muito fino. O mesocarpo também é

7

bastante fino, tem de 1 a 2 mm de espessura. O epicarpo e o mesocarpo constituem a parte

comestível do fruto.

O caroço de açaí nos últimos anos tem se mostrado como um resíduo de

processamento, para o qual foram desenvolvidas poucas alternativas tecnológicas de

aproveitamento. Esse resíduo tem se apresentado como um transtorno ambiental para as

cidades do norte do Brasil, principalmente Belém e Manaus (SILVA & ROCHA, 2003) e

ainda continua assim nos dias de hoje. Na Figura 2.1, são mostradas algumas características

botânicas do caroço de açaí.

Figura 2.1 A) Açaizeiros; B) Frutos “in natura”; C) Caroços despolpados; D) Caroço secionado e E) Esquema da secção (adaptado de ROGEZ, 2000; EMBRAPA, 2013).

Principal subproduto da indústria de processamento do açaí, o caroço é uma

semente oleaginosa, formada por um pequeno endosperma sólido ligado a um tegumento,

que na maturidade é rico em celulose (53,20%), hemicelulose (12,26%) e lignina (22,30%)

(RODRÍGUEZ-ZÚÑIGA et al., 2008) e que mesmo após a remoção da polpa ainda

apresenta elevados teores de celulose e hemicelulose (ALTMAN, 1956).

8

O estado do Pará atualmente é o maior produtor nacional de açaí com 120.890

ton/ano do fruto. Deste total 93.521 ton/ano é de resíduo (caroço), ou seja, cerca de 83%

(IBGE, 2008). Somente na cidade de Belém existem cerca de 3 mil estabelecimentos que

comercializam o açaí processado, que representa um consumo diário de 440 mil quilos do

fruto (IBGE, 2008) e que gera um excedente de 365 toneladas por dia de lixo orgânico,

constituído principalmente de caroços, descartados em aterros sanitários e cursos de água.

Na Tabela 2.1 são mostrados os principais Estados produtores de açaí no Brasil.

Tabela 2-1 Principais produtores de Açaí no Brasil (IBGE, 2008)

Brasil e Unidades

da Federação

Variável

Quantidade (ton/ano) Valor (mil reais) Participação (%) sobre a quantidade

Brasil 120.890 133.746 100 Pará 107.028 122.638 89

Maranhão 9.191 7.432 8 Acre 1.537 745 1

Amapá 1.294 939 1 Amazonas 1.274 1.392 1 Rondônia 314 385 0

Bahia 250 213 0 Tocantins 2 4 0

2.2. BIOMASSAS

A produção e crescimento da biomassa têm início na conversão da energia solar

capturada e fixada como carbono na biomassa via fotossíntese, durante a qual o dióxido de

carbono (CO2) é convertido em compostos orgânicos no qual, para cada grama mol de

carbono fixado cerca de 470 kJ (112 Kcal) são absorvidos (KLASS, 2004). Este processo é

descrito pela equação (2.1).

CO2 + H2O + luz + clorofila (CH2O) + O2 (2.1)

São caracterizados como biomassa, os materiais de natureza orgânica (de origem

animal ou vegetal) e ainda aqueles que se apresentam sob a forma de resíduos da

agricultura, pesca ou pecuária que são acumulados anualmente, no mundo em grandes

9

quantidades (MCKENDRY, 2002). Dentre a matéria orgânica de origem vegetal, ou seja, a

biomassa vegetal, pode-se citar (PEREIRA Jr., 2007):

• Biomassa Natural;

• Biomassa Alimentícia;

• Biomassa Residual;

• Biomassa de Cultivos Energéticos.

De acordo com Ballesteros, (2001) os maiores usos da lignocelulose concentram-se

nas polpas e indústrias de papéis, proteína para ração, em meios tecnológicos de

alimentação, além de poderem gerar energia através da produção de etanol. Deve ser ainda

considerada a produção de energia por queima direta do material lignocelulósico como, por

exemplo, a produção de energia elétrica através da queima do caroço de açaí.

Dentre as biomassas residuais, podem-se destacar as de composição lignocelulósica

(resíduos lignocelulósicos) que em função da sua natureza renovável e seu baixo custo têm

sido utilizada amplamente como matéria-prima para geração de energia, ração animal e

ainda como fonte de carboidratos para processos de bioconversão (CHEN et al., 2010). Na

Figura 2.2 é possível observar vários resíduos agrícolas lignocelulósicos e culturas que tem

sido estudados para a produção de etanol.

10

Figura 2.2 Vários resíduos agrícolas lignocelulósicos e cultura para a produção de etanol (adaptado de SINGH et al., 2014.)

A conversão da biomassa em energia pode ser realizada através de processos

termoquímicos, nos quais estão inclusos combustão, pirólise ou gaseificação, ou ainda, a

conversão microbiológica da biomassa a gases e líquidos combustíveis através de métodos

fermentativos (MCKENDRY, 2002)

O aproveitamento de biomassa para a produção de energia ganhou grande interesse

com o possível esgotamento dos combustíveis fósseis convencionais, ou mesmo a elevação

de seus preços, o que exigiria um aumento da utilização de fontes de energia renováveis

(SUKUMARAN & PANDEY, 2009; SHABANGU et al., 2014). Associado a tal fato, tem-

se a pressão da população por políticas governamentais que atendam a idéia de maior

sustentabilidade ambiental nos processos de geração de energia (DERMIBAS, 2001).

A biomassa lignocelulósica para fins de bioconversão caracteriza um potencial

avanço econômico e tecnológico sobre as fontes tradicionais de combustíveis (SINDHU,

2010). As biomassas ricas em material lignocelúlósico (MLC) recebem uma atenção maior

do ponto de vista tecnológico, pois são promissoras fontes de hexoses e pentoses utilizadas

11

para a produção de etanol e outros componentes químicos de interesse industrial

(CHERUBINI, 2010).

Associado a este cenário, há ainda o adicional fator de abundância deste material em

função do grande número de fontes disponíveis (resíduos agrícolas, resíduos industriais da

fruticultura, além dos dejetos urbanos, entre outros) (SÁNCHEZ, 2009), além de ser uma

forma de incentivar a geração de empregos e a economia local.

Há uma tendência observada de acordo com as últimas pesquisas para o

aproveitamento de resíduos urbanos como aqueles provenientes das podas das árvores ou

ainda de resto de alimentos consumidos nas zonas urbanas, serragem ou folhas caídas, para

a sua conversão em combustíveis líquidos (HAHN-HÄGERDAL et al., 2006), com a

vantagem de que a utilização dessa biomassa lignocelulósica evitaria a concorrência com a

produção de alimentos e ração além de sua abundância e sustentabilidade como já

mencionado (CAROLINA et al., 2012).

Os principais benefícios de tecnologias de conversão de biomassas residuais ou

resíduos lignocelulósicos, através de rotas biotecnológicas e/ou químicas para o Brasil, de

acordo com Pereira Jr. (2007), são:

• Fontes abundantes e baratas de recursos renováveis;

• Oportunidade para o desenvolvimento industrial com base no conceito de

Biorrefinaria;

• Redução nas emissões gasosas que causam o “efeito estufa”;

• São tecnologias mais limpas;

• Promovem benefícios macroeconômicos para as comunidades rurais e para a

sociedade como um todo;

• Estão inseridas no contexto de Desenvolvimento Sustentável.

Na Figura 2.3, é possível observar o fluxograma de fracionamento da biomassa

lignocelulósica para a produção de biocombustíveis.

12

Figura 2.3 Fracionamento da Biomassa lignocelulósica para a produção de bioconbustíveis (adaptado de SINGH et al., 2014)

2.3. PAREDE CELULAR E COMPOSIÇÃO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

A parede celular é um componente próprio da célula vegetal presente na maioria dos

vegetais e é constituída basicamente por compostos lignocelulósicos que representam mais

de 90% do peso seco de uma célula vegetal e outros compostos minoritários

(BUCKERIDGE & TINÉ, 2001). A parede celular é composta principalmente pelos

polímeros: celulose (30-60%), hemicelulose (20-40%) e lignina (12-25%), que se

encontram unidos fortemente entre si por forças não covalentes e ligações covalentes

(BALAT, 2011).

13

As propriedades estruturais e funcionais da parede celular são controladas pela

composição e organização de cada um de seus componentes individuais (BALAT, 2011).

Considera-se que a ligação entre os componentes da parede tem uma importante influência

em numerosas propriedades como a acessibilidade, extensibilidade, diferenciação,

plasticidade, digestibilidade e aderência, cujas aplicações são de considerável interesse nos

campos da nutrição e tecnologia de alimentos humana e animal, além da produção de

biocombustíveis (BARROS-RIOS et al., 2011) e de produtos químicos.

A função mais importante atribuída à parede celular é a de determinar a forma e

tamanho das células o que auxilia na manutenção do tecido em condições ótimas de

funcionamento fisiológico e o fornecimento de maior resistência à pressão e ao ataque de

agentes externos como agentes patogênicos, entre outros agentes biológicos capazes de

danificar a célula vegetal (LAGAERT et al., 2009).

Os polímeros celulose e hemicelulose representam os mais abundantes polímeros

naturais existentes na terra, seguidos pela lignina (BUCKERIDGE & TINÉ, 2001). De

maneira geral, esses componentes estão presentes na parede celular dos tecidos de plantas

superiores e a configuração mais freqüente é aquela em que as fibrilas de celulose

encontram-se localizadas em uma matriz amorfa de lignina e hemicelulose (PAULY &

KEEGSTRA, 2010).

A quantidade de cada um dos polímeros presentes em diferentes biomassas varia

com a espécie e a idade da planta, bem como entre as partes da mesma (SANTIAGO et al.,

2013). Essas diferenças na composição podem ocorrer também de maneira qualitativa

(FARINAS et al., 2010; PAULY & KEEGSTRA, 2010). Quando o material avaliado trata-

se de uma biomassa, ambos os aspectos anteriores são ainda influenciados por condições

ambientais e outros aspectos que incluem desde o método de colheita e armazenamento até

os processos químicos, físicos ou biológicos, aos quais estes materiais foram submetidos

(FARINAS et al., 2010; PAULY & KEEGSTRA, 2010).

Os vegetais de tecido vascular possuem quantidades significativas de lignina no

talo, tronco e folhas (SANTANA, 2005). Já nos vegetais de rápido crescimento, os tecidos

jovens são ricos em hemicelulose e pectina (GLAZER & NIKAIDO, 1995).

Na Figura 2.4, observa-se uma parede celular esquemática e alguns dos seus

constituintes.

14

Figura 2.4 Estrutura e componentes da parede celular vegetal (DE WILD et al., 2011)

2.3.1. Celulose

A celulose é o mais abundante material orgânico renovável produzido na biosfera

(1,5 x 1012 toneladas), encontrando-se amplamente distribuído em plantas (corresponde a

aproximadamente 35-50% do peso da mesma), em vários animais marinhos, e em menor

grau em algas, fungos, bactérias, invertebrados e até mesmo ameba (KLEMM et al., 2005;

HABIBI, LUCIA, & ROJAS, 2010).

A fórmula química da celulose é C6nH10n+2O5n+1 onde n representa o grau de

polimerização (SJOSTROM, 1993). A celulose é formada por longas cadeias lineares de

moléculas de glicose, que são ligadas na forma de unidades de D-anidroglucopiranose, com

15

pontes ésteres α -1→4 e β -1,4 -D-glicosídicas (LYND et al., 2002). A natureza desta

ligação faz com que as unidades de glicose fiquem alinhadas num ângulo de 180º,

formando uma cadeia plana, o que permite um elevado grau de empacotamento das fibras

(BURANOV & MAZZA, 2010). As moléculas de glicose encontram-se ligadas entre si por

forças intermoleculares formadas por pontes de hidrogênio e o número de unidades de

glicose numa única molécula de celulose pode variar de 500 a 5000, dependendo do tipo de

biomassa (GUPTA & DEMIRBAS, 2010).

Na Figura 2.5, é mostrada a estrutura química da celulose.

Figura 2.5 Estrutura molecular da celulose (KLEMM et al., 2005)

De acordo com Fengel & Wegener (1989), as pontes de hidrogênio originam as

microfibrilas de celulose que formam um conjunto de agregados insolúveis em água

(FENGEL & WEGENER, 1989). Cada uma das fibrilas que compõe a estrutura da celulose

é formada pela agregação de cerca de 250 microfibrilas, sendo que cada microfibrila é

formada por um pequeno número de feixes de molécula de celulose (fibrilas elementares),

onde cada molécula de celulose é formada por mais de mil unidades de glicose, que se

interligam por pontes de hidrogênio (KLEMM et al., 2005).

Os grupos hidroxilas (OH) presentes são responsáveis pelo comportamento físico e

químico da celulose, sendo capazes de assumir dois comportamentos, em função do seu

posicionamento na unidade glicosídica (KLEMM et al., 2005; GIL, 2008; OGEDA &

PETRI, 2010). Dessa forma, existem pontes de hidrogênio entre grupos OH de unidades

glicosídicas adjacentes da mesma molécula de celulose, que são ligações intramoleculares,

responsáveis pela rigidez das cadeias unitárias (KLEMM et al., 2005). Ocorre também

ligações entre grupos OH de moléculas adjacentes de celulose, constituindo as chamadas

ligações intermoleculares (FENGEL; WEGENER, 1989). A estrutura molecular observada

16

na celulose confere à mesma as características de hidrofilicidade, quiralidade,

degradabilidade e ampla variabilidade química que é gerada pela alta reatividade dos

grupos hidroxila (OH) (KLEMM et al., 2005).

Na Figura 2.6, é mostrado um esquema da estrutura da fibra celulósica.

Figura 2.6 Celulose e sua estrutura adaptada de Lavoine et al. (2012).

A resistência da celulose a processos de hidrólise é devida principalmente à sua

estrutura cristalina, região da cadeia que apresenta uma estrutura altamente ordenada e

rígida (LYND et al., 2002). A associação da zona cristalina com algumas regiões menos

ordenadas (amorfas), que são mais sensíveis à hidrólise, confere à celulose uma reatividade

heterogênea (GIL, 2008; OGEDA & PETRI, 2010). A cristalinidade da celulose é resultado

da ação combinada da biopolimerização e cristalinização e é normalmente expressa em

porcentagem (índice de cristalinidade ou CrI) e depende da origem e processo de obtenção

da celulose (SAMIR et al., 2005; EICHHONR et al., 2001; HABBIB et al., 2007;

PITARELO, 2007). Por outro lado, as regiões amorfas são resultado da má formação da

estrutura devido a alterações no processo de cristalinização (SAMIR et al., 2005;

EICHHONR et al., 2001; HABBIB et al., 2007).

17

A proporção entre regiões cristalinas e amorfas é o que se chama de grau de

cristalinidade e é variável na celulose de acordo com sua origem (SAMIR et al., 2005;

EICHHONR et al., 2001; HABBIB et al., 2007).

A estrutura celulósica pode ser quebrada pela ação de agentes químicos como os

ácidos ou bases ou biológicos, como as enzimas. A degradação da celulose é chamada de

homogênea, quando a celulose é solúvel no meio e heterogênea, quando ela é insolúvel,

como é o caso da quebra por ácidos, como o ácido sulfúrico (KLOCK et al., 2005;

LAPOINT, 2000). Neste tipo de hidrólise, as zonas amorfas são rapidamentes hidrolisadas.

Em seguida há uma redução na velocidade de hidrólise, correspondente a hidrólise da

região cristalina (KLOCK et al., 2005; LAPOINT, 2000). A fração mais facilmente

hidrolisável representa geralmente de 10 a 12% da celulose (KLOCK et al., 2005;

LAPOINT, 2000).

A hidrólise com agente alcalino pode ser realizada com a utilização de reagentes

como NaOH e NH3 no qual ocorre as chamadas reações de peeling dos grupos terminais

redutores dos polissacarídeos e a hidrólise alcalina das ligações ß-glucosídicas e dos grupos

acetílicos (FENGEL & WEGENER, 1984; KLOCK et al., 2005).

A biodegradação de celulose ocorre pela ação de três grupos de enzimas que atuam

sinergicamente e sequencialmente. Estes grupos compreendem as endo-1,4-ß-glucanases

(rompe a cadeia de celulose aleatoriamente nas regiões amorfas gerando fragmentos

menores), as exo-1,4-ß-glucanases ou celobiohidrolases (atacam as extremidades da cadeia

de celulose gerando dímeros de glicose) e as 1,4-ß-glucosidases (hidrolisam a celobiose à

glicose) (ERICKSON et al., 1990). Na Figura 2.7, é possível observar a quebra por via

enzimática da celulose.

18

Figura 2.7 Estrutura da celulose e quebra enzimática (GUO et al., 2012)

2.3.2. Hemicelulose

A hemicelulose ou polioses são polissacarídeos de baixo peso molecular, não

celulósicos e não amiláceos, associados com o material lignocelulósico nas células das

plantas e que é constituída por um polímero de pentoses com 100 a 200 moléculas de

monômeros (principalmente xilose e arabinose), valor este bem inferior ao da celulose

nativa (PITARELO, 2007; GUPTA & DEMIRBAS, 2010).

Estes polissacarídeos pertencem a uma classe de polímeros bastante heterogêneos

que diferem da celulose por serem compostas por diferentes açúcares (pelo menos dois

tipos de unidades de açúcares) com cadeias estruturais menores e mais ramificadas que

representam, em geral, de 15 a 35% da biomassa da planta (FENGEL & WEGENER, 1984;

19

SUN, 2010) e que podem ser constituídas de pentoses (β-d-xilose, α-L-arabinose) , hexoses

(β-d-manose, β- d-glicose, α-d-galactose) e/ou ácidos urônicos (d-glucorónico-α, α-d-4-O-

metilgalacturônico e ácidos d- galacturônico-α) (GÍRIO et al., 2010; BARROS-RÍOS et al.,

2011). É também possível observar a presença de outros açúcares, como a α-l-ramnose e α-

l-fucose que podem estar presentes em pequenas quantidades e os grupos hidroxila dos

açúcares pode ser parcialmente substituídos por grupos acetil (GÍRIO et al., 2010).

Homopolímeros de xilose, chamados homoxilanas só ocorrem em algas (algas vermelhas e

verdes) (GÍRIO et al., 2010).

Os açúcares constituintes da matriz hemicelulósica estão ligados entre si, por

ligações glicosídicas β-1,4, formando uma estrutura principal composta por um tipo

específico de resíduo, a partir da qual surgem ramificações laterais de cadeias curtas de

outros açúcares (BIELY, 1985). A função principal das hemiceluloses é a de agir como um

material aglomerante que se liga firmemente entre si e à superfície das microfibrilas de

celulose, mantendo-as unidas (DERMIBAS, 2008).

As hemiceluloses podem receber diferentes denominações, como por exemplo,

xilanas, mananas, arabinanas de acordo com o açúcar predominante na cadeia principal e na

ramificação lateral (BIELY, 1985; PEREIRA JR., 2007; MARTINS, 2005). Assim, xilanas,

galactomananas, arabino-xilanas, arabinoglucurono-xilanas, arabino-4-metil-glucurono-

xilana, 4-metil-glucurono-xilanas, galactosanas e galacto-arabino-glucurono-xilana são

diferentes denominações das hemiceluloses em função da estrutura química que as

compõem (BIELY, 1985; BUCKERIDGE, 2010).

As principais hemiceluloses encontradas em plantas são os xiloglucanos (XyG), os

glucuronoarabinoxilanos (GAX) e os mananos (MN), nos quais sempre estará presente uma

cadeia principal de monossacarídeos de glicose, xilose e manose, respectivamente, que

pode ser ramificada com diferentes monossacarídeos (BUCKERIDGE, 2010).

As cadeias de xilanas são as principais representantes das hemiceluloses e são

heteropolíssacarídeos compostos por unidades de xilose que se encontram ligadas entre si

através de ligações glicosídicas ß-1,4 e ramificadas por ligações glicosídicas a-1,2 com

ácido 4-O-metilglucurónico (LARSSON et al., 1999; BUCKERIDGE, 2010; GUPTA &

DEMIRBAS, 2010).

20

Na Figura 2.8 podemos observar a representação de hemiceluloses mais comumente

encontradas.

Figura 2.8 Hemiceluloses: (A) glucuronoarabinoxilanas (GAX), principais polissacarídeos hemicelulósicos, consistem em uma cadeia de xilanas, com sustituções de arabinose, ácido D-glucurônico e ácido ferúlico e (B) β-glucanas com ligações mistas, consistem em unidades de celotriose e celotetraose unidas por ligações β(1-4) que se entrelaçam por ligações β(1-3) (Adaptado de BARROS-RÍOS et al., 2011).

A xilana representa a hemicelulose mais abundante (SAHA, 2003). Desta forma,

sua desconstrução para os açúcares constituintes, principalmente xilose e arabinose, para

posterior fermentação por microrganismos, é fundamental para o uso eficiente da biomassa

vegetal para a produção de biocombustíveis (DODD & CANN, 2009).

De acordo com Kumar et at. (2009), as hemiceluloses são mais facilmente

hidrolisáveis quando comparadas com a celulose e não se agregam, mesmo quando co-

cristalizam com a celulose e são muito solúveis em soluções alcalinas. Sua biodegradação

pode ocorrer de forma semelhante à da celulose e as enzimas envolvidas na biodegradação

são hidrolases específicas que clivam determinados tipos de ligações existentes no polímero

21

(GOODELL, 2003). Tendo em vista que as hemiceluloses são constituídas de vários

polímeros, formados por diferentes resíduos de açúcares, a sua degradação completa

também necessita de enzimas específicas como, por exemplo, as β-1,4 xilanases (EC

3.2.1.8) que formam o principal grupo de enzimas envolvidas na degradação da xilana

(HALTRICH et al., 1996 ; KULKARNI et al., 1999).

2.3.3. Lignina

A lignina é um dos constituintes da parede celular das plantas vasculares, sendo um

composto heterogêneo, de alto peso molecular e estrutura irregular (HOFRICHTER, 2002;

ONNERUD, 2002) que apresenta natureza hidrofóbica, não polissacarídica e que interage

com a celulose e a hemicelulose conferindo rigidez à parede celular das plantas, oferecendo

à planta um mecanismo de resistência contra estresses bióticos e abióticos (SANTIAGO et

al., 2013; HENRIKSSON, 2009). Apresenta-se como uma macromolécula constituída de

unidades de fenilpropano, com uma conformação tridimensional e amorfa, representando

de 20 a 30% do total dos lignicelulósicos (AZEVEDO, 2004). Dessa forma, pode ser

caracterizada como um derivado dos grupos fenilpropanóides que têm sua origem na

polimerização desidrogenativa dos álcoois cumarílico, coniferílico e sinapílico

(BUDZIAK, 2004).

É o segundo polímero em maior abundância na biosfera e constitui a maior fração

não-polissacarídica dos materiais lignocelulósicos (JØRGENSEN et al., 2007) não podendo

ser isolada sem que a sua estrutura seja alterada, o que representa o principal motivo que

impede a completa elucidação de sua estrutura (HWANG et al., 1989; SANTIAGO et al.,

2013). As ligninas podem ser divididas de acordo com os constituintes da unidade

estrutural básica, ou seja, as ligninas G (possuem unidades de guaiacil – grupo metóxi no

carbono de posição 3 do esqueleto fenilpropanóide); as ligninas S (que possuem unidades

siringil – o grupo metóxi está localizado nos carbonos três e cinco) e as ligninas GSH, que

possuem unidades guaiacil, siringil e unidades de compostos fenilpropanóides não

metoxilados (PALMQVIST & HAHN-HÃGERDAL, 2000; SUN et al., 2001).

Em sua estrutura, as unidades de fenilpropano encontram-se interconectadas por

uma variedade de ligações carbono-carbono e ligações éter (RAMACHANDRA et al.,

22

1987). Dessa forma, a lignina é um produto final da via fenilpropanóide e/ou um

heteropolímero de três monômeros de álcool hidroxicinamil ou monolignóis: álcool p-

cumarílico, álcool coniferílico e o álcool sinapílico (BOERJAN et al., 2003).

Os produtos intermediários da via biossintética dos monolignóis servem como

precursores de hidroxicinâmicos e outros compostos fenólicos (SANTIAGO et al., 2013).

Tanto os monolignóis como os seus precursores são sintetizados no citoplasma (retículo

endoplasmático), e depois transportado para a parede celular onde a lignina é depositada

(SANTIAGO et al., 2013). Devido ao fato de os monolignóis serem relativamente tóxicos

para as células, foi sugerido que estes são exportados e armazenados na forma de

monolignóis-glucosídeos (SANTIAGO et al., 2013).

De acordo com Lewis et al. (1990), o mecanismo de polimerização da lignina não

ocorre totalmente ao acaso, porém, ainda não foi totalmente elucidado e acredita-se que

ocorra via radicais livres em presença de peróxido de hidrogênio/peroxidase.

Na Figura 2.9, é possível observar as estruturas dos fenilpropanóides precursores

típicos utilizados na biossíntese de lignina da biomassa vegetal.

Figura 2.9 Precursores típicos, fenilpropanóides, utilizados na biossíntese de lignina da biomassa vegetal (PU et al., 2013)

O acoplamento dos precursores da lignina em diferentes formas dá origem a vários

tipos de ligações entre as unidades de fenilpropanos. As mais comumente observadas são:

β-O-4 e α-O-4 (50 a 65%), β-5 (6 a 15%), β-1 (2 a 9%) e β-β (2 a 5%) (KANTELINEN,

1992; BOERJAN et al., 2003).

As ligações covalentes que unem os monômeros que as contituem são ligações do

tipo éter e resistem a vários agentes hidrolíticos e diversos sistemas enzimáticos

degradativos (FUKUSHIMA & HATFIELD, 2003; ZIEGLER et al., 2004). De acordo com

23

Azuma (1985), as ligações que unem a lignina aos polissacarídeos são do tipo éter ou

estéres benzílicos, tal como é mostrado na Figura 2.10.

Figura 2.10 Tipos de ligações propostas entre lignina e os polissacarídeos; a) Ligações éter benzílicas; b) ligações ester benzílica (AZUMA, 1985).

A lignina é o componente mais recalcitrante da parede celular e quanto maior for o

seu teor no material lignocelulósico, maior será a resistência do material à degradação

química e enzimática (TAHERZADEH & KARIMI, 2007). Dessa forma, sua presença tem

sido apresentada como uma das desvantagens da utilização de materiais lignocelulósicos

para a fermentação, uma vez que torna a lignocelulose resistente à degradação química e

biológica (TAHERZADEH & KARIMI, 2007).

A degradação da lignina pode ser realizada através da utilização de agentes

químicos ou ainda através de enzimas. De acordo com Ferraz (2004), um vasto grupo de

enzimas poderiam realizar a biodegradação da lignina e estas podem ser divididas em pelo

menos duas classes distintas: as fenoloxidases e as enzimas que produzem peróxido de

hidrogênio.

24

Na Figura 2.11, é possível observar uma estrutura hipotética da lignina e os tipos de

ligações possíveis entre suas unidades estruturais.

Figura 2.11 Estrutura hipotética da lignina e os tipos de ligações possíveis entre suas unidades estruturais (CARVALHO et al., 2009).

2.3.4. Substâncias pécticas

A pectina é um biopolímero de ocorrência natural que tem sido encontrado com

cada vez mais aplicações na indústria farmacêutica e de biotecnologia, sendo composto por

macromoléculas glicosídicas de alto peso molecular que constituem o maior componente da

lamela média (ALMEIDA et al., 2005; SUNDAR RAJ et al., 2012). A pectina é um

polissacárideo essencialmente linear e como a maioria dos outros polissacarídeos de

plantas, que é ao mesmo tempo polidispersa e polimolecular, a composição irá variar de

25

acordo com a fonte e as condições aplicadas durante o isolamento (SUNDAR RAJ et al.,

2012).

A composição e estrutura de pectina ainda não são completamente compreendidas,

embora a pectina tenha sido descoberta a mais de 200 anos (NOVOSEL'SKAYA et al.,

2000). A estrutura da pectina é muito difícil de determinar pois pode se alterar durante o

isolamento a partir de plantas, armazenamento e processamento de material vegetal

(NOVOSEL'SKAYA et al., 2000).

A pectina é caracterizada como uma mistura complexa de polissacarídeos ácidos

(KERTESZ, 1951), composto de unidades de ácido D-galacturônico (GalA)

(MUKHIDDINOV et al., 2000) unidos por meio de ligações glicosídicas α-1,4,

parcialmente esterificados por grupos metil éster (GUMMADI; PANDA, 2003) e parcial ou

completamente neutralizadas por uma ou mais bases (íons sódio, potássio ou amônio)

(GUMMADI; PANDA, 2003).

Na Figura 2.12, é possível observar um segmento de repetição da molécula de

pectina e seus grupos funcionais: (b) carboxilo; (c) éster; (d) amida na cadeia de pectina.

Figura 2.12 Um segmento de repetição da molécula de pectina e grupos funcionais: (b) carboxilo; (c) éster; (d) amida na cadeia de pectina (SUNDAR RAJ et al., 2012).

Ao contrário das proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos, e por serem polissacarídeos,

as substâncias pécticas não possuem massa molecular definida (SAKAI et al., 1993)

podendo conter algumas centenas até cerca de 1000 unidades de sacarídeos, numa

26

configuração de cadeia semelhantes isto corresponde a pesos moleculares médios de cerca

de 50.000 a 150.000 daltons (SUNDAR RAJ et al., 2012). De acordo com Alkorta (1998), a

Sociedade Americana de Química (American Chemical Society) classifica as substâncias

pécticas em: protopectina, ácido pectínico, ácido péctico e pectina, sendo os três últimos

total ou parcialmente solúveis em água.

A protopectina é insolúvel em água e constitui a forma nativa unida com outros

constituintes das células vegetais e, em condições de hidrólise restrita, produzem ácidos

pectínicos ou pectina (ALKORTA et al., 1998; GUMMADI; PANDA, 2003). Ácido

péctico é uma designação aplicada à substâncias pécticas compostas de ácido

poligalacturônico coloidal, onde os grupos carboxilas estão essencialmente livres de grupos

metil éster e seus sais são pectatos neutros ou ácidos, dependendo do função do pH da

matriz (SAKAI et al., 1993). Ácido pectínico é um grupo de compostos contendo ácido

poligalacturônico coloidal com baixo grau de metoxilação (SAKAI et al., 1993;

WHITAKER, 1994).

Pectinas com alto teor de metoxilas (acima de 50%) são freqüentemente

denominadas apenas de “pectinas” e têm poder de geleificação na presença de açúcares e

ácidos, enquanto que a geleificação de pectinas com baixo teor de metoxilação é possível

na ausência de açúcares e na presença de alguns íons metálicos (GUMMADI & PANDA,

2003; ALKORTA et al., 1998).

2.3.5. Extrativos

Os extrativos dos materiais lignocelulósicos são compostos inorgânicos ou

orgânicos (terpenóides, ácidos graxos, flavonóides, esteróides e outros compostos

aromáticos) que ocorrem no material vegetal sem fazer parte dos elementos estruturais da

parede celular e que são, em geral, responsáveis pela cor, cheiro e resistência do material

sendo agrupados de acordo com a sua polaridade e estrutura química (LEWIN &

GOLDENSTEIN, 1991; HARTLEY & CLIVE, 1989; FENGEL & WEGENER, 1989;

GIL, 2008). Assim, de acordo com a sua polaridade, estes podem ser divididos em duas

frações. Uma fração lipofílica, na qual se encontram os terpenos e terpenóides, mas também

os lípidos, e uma fração hidrofílica da qual fazem parte os compostos fenólicos (FENGEL

27

& WEGENER, 1984; GIL, 2008). A presença dos extrativos ocorrerá em diferentes tipos e

concentrações de acordo com a parte da planta que está sendo analisada e que podem

incluir: cascas, folhas, frutos e sementes (FENGEL & WEGENER, 1989; ROWEL et al.,

2000).

De acordo com Baudel (1999), os extrativos interagem com reagentes utilizados nos

processos de hidrólise e delignificação da biomassa, bem como na quantificação da lignina

presente na mesma, acarretando resultados errôneos na caracterização do material. Segundo

Sluiter et al., (2010), estes componentes são facilmente extraídos com água ou solventes e

na biomassa podem contribuir de forma significativa, em até 30% ou mais, para o

fechamento do balanço de massa, o que poderá interferir com a subsequente caracterização

dos carboidratos e da lignina.

2.3.6. Outros constituintes

Muitas outras substâncias orgânicas e inorgânicas ocorrem nas paredes celulares,

em quantidades variáveis, dependendo do tipo de célula. Entre as orgânicas, destacam-se as

de natureza protéica e as de natureza lipídica, como cutina, suberina e ceras sendo que estas

últimas se encontram nos tecidos protetores superficiais da planta (FRANCO, 1997;

BUCKERIDGE & TINÉ, 2001).

2.4. PRÉ-TRATAMENTOS

A fermentação de açúcares fermentescíveis a etanol, ainda é seriamente restrita em

função do fato de a digestibilidade da celulose presente nos materiais lignocelulósicos ser

dificultada por sua físico-química, estrutura e composição, mas pode ser facilitada com

etapas prévias de pré-tratamentos (ALVIRA et al., 2010; WANG et al., 2014).

Apesar dos materiais lignocelulósicos constituírem uma excelente fonte de açúcares

hexoses (C6) e pentoses (C5), eles são considerados substratos complexos constituídos

basicamente de celulose e hemiceluloses recobertas por uma macromolécula aromática

complexa (lignina), formando a microfibrila celulósica, além de uma fração menor

remanescente representada por minerais e extrativos (ADEN et al., 2002; RABELO, 2008;

GÍRIO et al., 2010). Essa estrutura complexa caracteriza a recalcitrância do material

28

lignocelulósico, e torna difícil a sua despolimerização em açúcares fermentescíveis por

restringir a acessibilidade do material ao ataque enzimático (ADEN et al., 2002; PU et al.,

2013).

Menos de 20% da biomassa pode ser hidrolisada enzimaticamente sem um efetivo

pré-tratamento (HIMMEL et al., 2007; WALDRON et al., 2010). Dessa forma, a obtenção

do etanol de segunda geração inclui e necessita de três principais etapas: pré-tratamento,

hidrólise enzimática e fermentação (RUIZ et al., 2012). Assim, o pré-tratamento tem como

objetivo favorecer os processos seguintes de obtenção do etanol combustível,

principalmente a hidrólise enzimática (CARDONA et al., 2014).

Cada pré-tratamento deverá ser adequado ao tipo de material, e apresentará

vantagens e desvantagem sem a existência de um considerado “ideal” (GÍRIO et al., 2010).

Do ponto de vista econômico, os pré-tratamentos devem: melhorar a produtividade de

açúcares fermentescíveis, manter o conteúdo de carboidratos presentes, minimizar a

formação de produtos de degradação que são inibidores dos processos de fermentação e

serem rentáveis (SUN & CHENG, 2002).

Vários são os desafios envolvidos na eficiente despolimerização do material

lignocelulósico à açúcares fermentescíveis e dentre os principais está a cristalinidade da

celulose, que se apresenta em duas diferentes formas: amorfa e cristalina (COHEN et al.,

2005; KUMAR et al., 2008). Esta última é aquela que apresenta maior resistência aos

processos de degradação enzimática e microbianos (KUMAR et al., 2008).

O pré-tratamento é essencial para a obtenção de resultados viáveis do ponto de vista

econômico e tecnológico na produção de etanol (ROCHA et al., 2014). Os métodos de pré-

tratamentos utilizados devem ser adequados a cada tipo de biomassa, em função das suas

diferentes características físico-químicas (KARAGÖZ et al., 2012).

Os métodos de pré-tratamentos incluem, métodos físicos (mecânicos ou térmicos),

métodos químicos, métodos biológicos e, quando possível, a combinação de um ou mais

métodos (TALEBNIA et al., 2010). Sendo cada vez mais comuns estudos que se

concentram em investigar os chamados métodos híbridos que incorporam as vantagens de

diferentes pré-tratamentos (TAKARA & KHANAL, 2012).

O tratamento físico é representado principalmente pelas diversas formas de moagem

do material físico e age de maneira a aumentar a área de superfície acessível e diminuir a

29

cristalinidade da lignocelulose por lascar, moer ou irradiar o material (MARGEOT et al.,

2009; SAHA et al., 2013) o que facilitaria inclusive o efeito dos pré-tratamentos posteriores

(SUN & CHENG, 2002). Entretanto, a quebra física pode representar em muitos casos um

gasto mais intensivo de energia tornando o processo caro e dispendioso (Alvira et al.,

2010).

Os métodos térmicos incluem: a explosão à vapor, extração com água quente

(LHW), explosão de fibra com amônia (AFEX). Enquanto que os métodos químicos são

representados principalmente pela hidrólise alcalina, extração por solventes e hidrólise

ácida (SUN & CHENG, 2002). Os pré-tratamentos causam efeitos como: alteração das

características estruturais da celulose (cristalinidade e grau de polimerização); dissociação

do revestimento formado pela hemicelulose e lignina em torno da celulose, o que

proporciona maior adesão das enzimas à mesma; aumento da área superficial do material e

ainda a solubilização ou redistribuição da lignina (DOMINGUEZ, 2003; PEJÓ, 2010,

SAHA et al., 2013).

Na Tabela 2.2, é possível verificar as principais características dos pré-tratamentos

aplicados à biomassa. Na Figura 2.13, são mostrados os diferentes tipos de pré-tratamentos

utilizados para a produção de etanol de segunda geração.

Figura 2.13 Diferentes pré-tratamentos (adaptado de SINGH et al., 2014).

30

De acordo com Dominguez (2003), um pré-tratamento deve possuir baixo custo

energético e baixo investimento, utilizar reagentes baratos e facilmente recuperáveis e ser

aplicável a diversos substratos. Dentre aqueles que têm mostrado vantagens do ponto de

vista técnico-econômico, estão aqueles realizados com água quente que são considerados

ambientalmente limpos desde que não utilizem químicos, o que evitaria processos de

corrosão e a liberação de componentes tóxicos (ROCHA et al., 2014). Entretanto, a

associação desses métodos a ácidos diluídos tem sido observada com atenção em função

dos bons resultados de hidrólises enzimáticas posteriores, apesar liberação de substâncias

inibidoras da fermentação (CAO et al., 2012).

Quando a biomassa é submetida a condições extremas de temperatura, pressão ou

ainda na presença de ácidos são liberados componentes tóxicos que dividem-se em três

grupos (LARSSON, 2000): derivados do furano, ácidos alifáticos de baixo peso molecular

e derivados fenólicos (DOMINGUEZ, 2003).

31

Tabela 2-2 Características dos principais pré-tratamentos aplicados a biomassa (Adaptado de ZHU, 2005).

Pré-tratamento Mudanças na composição da biomassa

Vantagens Desvantagens Referência Celulose Hemicelulose Lignina

Moinhos de bolas Diminuição do grau

de cristalinidade Não houve Não houve

Redução da cristalinidade

Alto consumo de energia

CHANG & HOLTZAPPLE, 2000; KOULLAS et al., 1990

Explosão à vapor Pouca

despolimerização 80-100% de

remoção

Pouca remoção Maior

redistribuição

Eficiente energeticamente

Degradação das xilanas com produto

inibitório

GRETHLEIN & CONVERSE, 1991

Ácido diluído Pouca

despolimerização 80-100% de

remoção

Pouca remoção Maior

redistribuição

Obtenção de alto rendimento em xilose

Difícil recuperação do ácido, corrosivo e de custo relativamente

elevado

TORGET, 1991; GRETHLEIN &

CONVERSE, 1991

AFEX Diminuição do grau

de cristalinidade >60% de

solubilização 10-20% de

solubilização

Menor perda de xilanas, sem formação de inibidores

Recuperação de amônia

DALE & MOREIRA, 1982; HOLTZAPPLE et

al., 1991

Hidróxido de sódio

Inchaço significativo Considerável solubilização

>50% de solubilização

Remoção efetiva de ésteres

Reagente caro, recuperação alcalina

MILLETT et al., 1976

Ozonólise Quase nenhuma

despolimerização Pequena

solubilização Solubilização acima de 70%

Deslignificação em condições suaveis

Custo alto, requer grande quantidade de

ozônio

VIDAL & MOLINIER, 1988

Organosolv Considerável inchaço Solubilização

quase completa Solubilização

quase completa

Elevada redução de xilose e efetiva deslignificação

Elevado custo para recuperação do

solvente CHUM et al., 1988

Biológico 20-30% de

despolimerização >80% de

solubilização ~ 40% de

solubilização Baixo uso de energia

Perda de celulose e baixa traxa de

hidrólise

KIRK & FARREL, 1987; DATTA, 1981

32

2.4.1. Pré-tratamento com ácidos diluídos

Existem vários métodos para pré-tratamentos, mas o realizado com ácido diluído

ganhou uma importância considerável ao longo dos últimos 20 anos e é considerado um

dos mais eficientes e com custos relativamente reduzidos (SANNIGRAHI et al., 2011). Pu

et al. (2008) e Yang & Wyman, ( 2008) afirmam que este tipo de pré-tratamento é capaz de

solubilizar as hemiceluloses e, mesmo não dissolvendo a lignina presente, a torna inativa o

que permite uma ação mais efetiva das enzimas sobre a celulose.

O pré-tratamento com ácido diluído é um método aplicado a uma ampla variedade

de biomassas (folhosas e resinosas de gramíneas, resíduos agrícolas e resíduos sólidos

urbanos) (ZENG et al., 2009). Neste tipo de tratamento são empregadas temperaturas

elevadas acima de 100ºC e concentrações de ácidos menores que 2% (m/v) (ZENG et al.,

2009). Por ter efetivo resultado para diferentes materiais apresenta alto potencial para

aplicação industrial (ROCHA et al., 2011).

Este método permite uma alta taxa de recuperação da hemicelulose (80-90%) na

forma de xilose principalmente e uma alta taxa de conversão da celulose pela hidrólise

enzimática (em torno de 90%). O ácido mais comumente utilizado é o ácido sulfúrico

(H2SO4), devido ao seu menor preço e poucos problemas com corrosão quando comparado,

por exemplo, ao ácido clorídrico (HENDRIKS & ZEEMAN, 2009). Dessa forma, o ácido

sulfúrico pode ser aplicado em baixas concentrações (HARUN & DANQUAH, 2011). O

pré-tratamento com ácido têm se mostrado preferido por proporcionar uma maior eficiência

na conversão de materiais lignocelulósicos (RABELO et al., 2009). Durante o pré-

tratamento com ácidos, vários fatores influenciarão significativamente a quantidade total de

açúcares fermentescíveis liberados como: tempo de processamento, temperatura, carga de

sólidos e concentração de ácido (SAHA et al., 2013).

Na maioria dos estudos envolvendo o pré-tratamento com ácido diluído, a eficiência

do pré-tratamento é medido pela digestibilidade da biomassa pré-tratada, e pouca atenção é

dada para os outros atributos de um bom processo de pré-tratamento, tal como a limitação

da formação de compostos inibidores da hidrólise enzimática ou da fermentação

subsequente (DJIOLEU et al., 2012). Além disso, durante muito tempo o açúcar de

interesse foi apenas a glicose (CHUNG et al, 2005;. SAHA et al, 2005). Entretanto para

33

melhorar os custos globais de operação em se tratando de biorrefinaria, é necessário

considerar também os açúcares de hemicelulose, especialmente a xilose, que também pode

ser convertida à etanol por microrganismos apropriados (CHUNG et al, 2005;. SAHA et al,

2005).

A formação de compostos inibidores durante o pré-tratamento com ácidos diluídos à

altas temperaturas é tida como uma das principais desvantagens deste método, pois tais

produtos como o furfural e hidroximetil furfural (HMF) são tóxicos para a hidrólise

enzimática e para os microrganismos fermentativos (AVCI et al., 2013; SAHA et al., 2013).

Esses compostos são, em sua maioria provenientes da desidratação dos açúcares

pentoses (xilose e arabinose) e hexoses (glucose e galactose), respectivamente (RIANSA-

NGAWONG & PRASERTSAN, 2011). A taxa de desidratação dos açúcares e consequente

liberação de inibidores está diretamente relacionada com a temperatura, concentração de

ácido e duração do pré-tratamento (RIANSA-NGAWONG & PRASERTSAN, 2011;

SAHA et al., 2013). Após o pré-tratamento com ácido, o pH deve ser ajustado para a

atividade ótima das enzimas hidrolíticas, o que leva à presença de sais que poderão ser

prejudiciais para a fermentação (SAHA et al., 2013).

Segundo OLSSON & HAHN-HÃGERDAL (1996), os inibidores da fermentação

presentes em um hidrolisado lignocelulósico provenientes da hidrólise ou pré-hidrólise

podem estar divididos em:

- Grupo 1) Substâncias liberadas durante a pré-hidrólise e hidrólise: ácido acético,

que é liberado pela degradação da hemicelulose e os extrativos, como os terpenos, álcoois e

compostos aromáticos, como os taninos;

- Grupo 2) Subprodutos da degradação dos açúcares durante a pré-hidrólise e

hidrólise: furfural, 5-Hidroximetilfurfural, ácido levulínico, ácido fórmico e substâncias

húmicas;

- Grupo 3) Produtos de degradação da lignina: incluem compostos aromáticos e

poliaromáticos com uma variedade de constituintes;

- Gurpo 4) Produtos da fermentação: etanol, ácido acético, glicerol e ácido lático;

- Grupo 5) Metais liberados dos equipamentos usados na hidrólise e os aditivos,

como o SO2.

34

A Figura 2.14 apresenta os produtos de degradação passíveis de serem gerados em pré-tratamentos ácidos.

Figura 2.14 Liberação de produtos de degradação a partir dos carboidratos da biomassa durante o pré-tratamento com ácidos (Adaptado de SHUAI et al., 2010).

Os diferentes inibidores que são gerados podem afetar severamente a fermentação,

assim, um processo de detoxificação adicional é necessário para a obtenção de um elevado

rendimento, o qual é acompanhado com alguma perda de açúcar (QURESHI et al. , 2010).

A detoxificação pode ser realizada por meios físicos, químicos ou biológicos

(PALMQVIST e HAHNHÄGERDAL, 2000). De acordo com Chandel et al. (2011), a

remoção poderia ser realizada através de métodos físicos como a evaporação que remove

compostos voláteis, tais como ácido acético, furfural e vanilina ou ainda pelo uso de

membranas que ajudam na redução do tempo de separação. Para os métodos químicos, são

citadas estratégias, como neutralização, supercalagem com hidróxido de cálcio, utilização

de resinas de troca iônica, carvão ativado e extração com acetato de etila.

Um ponto importante a ser considerado durante o pré-tratamento com ácidos

diluídos são as reações que ocorrem com cada um dos principais componentes da biomassa

em meio ácido. De acordo com Holtzapple (1985), a Figura 2.15 mostra como a celulose

(a) é hidrolisada de maneira aleatória dentro do polímero para formar glicose solúvel (b).

Na mesma figura, é possível verificar a perda de três moléculas de água para a

transformação da glicose em 5-hidroximetilfurfural (c). Assim para Holtzapple (1985), são

35

observadas três vias de degradação do 5-hidroximetilfurfural; na primeira, o componente se

polimeriza e forma uma resina de cor marrom de estrutura desconhecida; na segunda, o

componente se divide para formar ácido levulínico (d) e ácido fórmico (e). Existe uma

terceira via para a degradação do hidroximetilfurfural, mas ocorre só a concentrações

ácidas fortes (~15M H2SO4) no qual o formaldeído (f) é clivado ao 5-hidroximetilfurfural e

em seguida resulta em furfural (g).

Figura 2.15 Degradação da celulose (HOLTZAPPLE, 1985).

A degradação ácida das hemiceluloses é discutida, em geral, com base na

degradação da xilana, que é o principal representante da classe. De acordo com Holtzapple

(1985), durante este processo, a xilana (a) é hidrolisada a xilose (b). Em seguida ocorre a

perda de três moléculas de água o que gera a degradação da xilose em furfural (c). Em

condições extremas de hidrólise, o furfural forma uma resina. Na Figura 2.16, é possível

observar as etapas de degradação da xilana.

36

Figura 2.16 Degradação da xilana (HOLTZAPPLE, 1985)

De acordo com Holtzapple (1985), a degradação da lignina em meio ácido tem

como tem como principal reação a quebra das ligações α e β. Na Figura 2.17, é possível

observar o efeito do ácido na quebra de ligações da lignina durante o tratamento com

ácidos.

Figura 2.17 Mecanismo de degradação em meio ácido – quebra da ligação β-O-4 (FENGEL E WEGNER, 1989).

37

Na Figura 2.18, é mostrado um modelo que representa as reações de hidrólise e as

prováveis alterações observadas no estrutura supramolecular do material lignocelulósico

durante a hidrólise com ácidos diluídos.

Figura 2.18 Modelo que representa as reações de hidrólise e as prováveis alterações observadas na estrutura supramolecular do material lignocelulósico durante a hidrólise com ácidos diluídos (Adaptado de HU, 1980).

Um importante aspecto do tratamento com ácido diluído é o chamado fator de

severidade (R0) que foi introduzido a partir do processo de polpação e que era usado como

um indicador do nível de severidade do pré-tratamento aplicado na indústria de papel e

celulose e que foi trazido para avaliar os pré-tratamentos realizados para a biomassa. Este

termo foi definido como uma função do tempo de reação (t, min) e temperatura (T, °C)

(OVEREND et al., 1987), como mostra a Equação 2.2.

−=

75,14exp.log)log( refTT

tRo (2.2)

38

Se o efeito do pH for incorporado no caso de condições ácidas de pré-tratamento,

passa a ser denominado como grau de severidade combinado (CHUM et al., 1990) e é

calculado pela Equação 2.3:

pHRoCS −= )log( (2.3)

Sendo para as equações 2.2 e 2.3:

Log (Ro) = Fator de severidade

t = tempo de reação (minutos)

T= Temperatura (°C)

Tref = 100°C

2.5. DESLIGNIFICAÇÃO ALCALINA COM NaOH

O pré-tratamento alcalino pode ser realizado como uma etapa complementar à pré-

tratamentos ácidos, em um processo similar à polpação sódica realizada na indústria de

papel, porém em condições menos severas (no máximo 4% de soda a 70°C) (SILVA, 2009;

REZENDE et al., 2011).

O pré-tratamento alcalino tem sua ação na remoção da lignina e foi usado

inicialmente para melhorar a digestibilidade de biomassas usadas como ração animal

(REZENDE et al., 2011). Este pré-tratamento utiliza diversas bases incluindo hidróxido de

sódio, hidróxido de cálcio, hidróxido de potássio e amônia e permite um maior acesso das

enzimas à celulose e hemiceluloses presentes na biomassa (ZHENG et al., 2009).

O NaOH quando comparado com outros agentes alcalinos como carbonato de sódio,

hidróxido de amônia, hidróxido de cálcio e peróxido de hidrogênio é aquele que permite

maiores índices de degradação e subseqüente fermentação (RODRÍGUEZ-VÁZQUEZ et

al., 1992; RODRÍGUEZ-VÁZQUEZ et al., 1994).

Durante o pré-tratamento com hidróxido de sódio (NaOH), as ligações éster entre

hemiceluloses e lignina são rompidas o que leva a um aumento na porosidade do material,

além de outros efeitos como a intumescência da biomassa, aumento da área superficial

39

interna, diminuição do grau de polimerização da celulose, redução da cristalinidade da

celulose e ruptura da estrutura da lignina ocasionada pela quebra das ligações α-aril-éter

dos monômeros polifenólicos (JACKSON, 1977; SUN & CHENG, 2002; SUN et al.,

2004). A dissolução da hemicelulose e inchamento da celulose são também conseqüências

do enfraquecimento e quebra das ligações de hidrogênio (JACKSON, 1977; SUN &

CHENG, 2002; SUN et al., 2004). Quando comparados com os pré-tratamentos ácidos, os

métodos alcalinos apresentam a vantagem de utilizarem condições moderadas de operação,

em termos de temperatura e pressão, com a possibilidade de ser realizado em temperatura

ambiente (ZHENG et al., 2009; KUMAR et al., 2009).

A deslignificação realizada com a utilização de NaOH, mostra excelentes resultados

quando associada ao peróxido de hidrogênio, o que proporciona uma eficiente remoção da

lignina e ainda permite a solubilização da hemicelulose. Essa associação ocorre em função

da ação do ânion hidroperóxido (HOO.) que é formado em pH alcalino, que corresponde à

principal espécie ativa no peróxido. Em meio alcalino, também ocorre a decomposição do

peróxido em radicais hidroxila (OH.) e superóxido (OO.) que são os responsáveis pela

oxidação da estrutura da lignina (RABELO, 2007).

Durante a deslignificação da biomassa com NaOH ocorre o processo denominado

de hidrogenólise que, de acordo com Pandey et al. (2011), é o processo no qual ocorre a

clivagem de ligações carbono-carbono pela reação com o hidrogênio. De acordo com os

mesmos autores, a associação do tratamento térmico na presença do hidrogênio parece ser

muito promissor para o favorecimento da produção de combustíveis líquidos e produtos

químicos como fenóis (PANDEY et al. 2011). Neste processo ocorrem reações que

envolvem a remoção da ampla funcionalidade das subunidades de lignina para formar

compostos monoméricos simples, tais como fenóis, benzeno, tolueno, ou xileno

(ZAKZESKY et al. 2011).

Gurgel (2007) observou que o tratamento de bagaço de cana-de-açúcar com

soluções de NaOH provocaram a hidrólise e a degradação de ligninas e hemiceluloses.

Observou que concentrações de 20% de NaOH não atuam somente como um reagente de

degradação destes materiais, mas também podem atuar como um solvente de decomposição

destes tipos de materiais, o que facilita a eliminação da lignina e da hemicelulose presente.

40

Miller et al. (2002) observaram que o excesso molar de uma base forte como NaOH

mostra bons resultados quando utilizada sozinha, mas que também pode ser eficiente

quando utilizada em pequena quantidade em associação com uma quantidade maior de um

agente menos dispendioso como o CaO (óxido de cálcio).

2.6. HIDRÓLISES

O efetivo aproveitamento dos carboidratos presentes em biomassas só ocorre nas

suas formas monoméricas, que são os materiais mais importantes que podem ser utilizados

diretamente como matéria-prima para a produção de produtos químicos de base biológica

(SROKOL et al., 2004). Vários métodos foram propostos para hidrólise do material

celulósico, com o ponto em comum de que este material deve ser preliminarmente

quebrado mecanicamente para aumentar sua área superficial (LJUNGDAHL &

ERIKSSON, 1985; OGEDA & PETRI, 2010). Duas vias catalíticas para a conversão da

biomassa, principalmente celulose, estão sendo estudadas de forma mais ampla, a primeira

é o uso de hidrólise química e a segunda é a hidrólise enzimática do material pré-tratado

(TAHERZADEH & KARIMI, 2007; GUO et al., 2012). Ambas permitirão a obtenção dos

açúcares simples para a produção do etanol de segunda geração (SUN & CHENG, 2002;

KUMAR & WYMAN, 2009). Em ambos os casos, vários modos de operação poderão ser

utilizados. A escolha será baseada em várias considerações como: o produto bruto que será

usado, o microrganismo usado para a fermentação dos açúcares liberados e a conveniência

econômica do mesmo (OGEDA & PETRI, 2010). No presente trabalho, a ênfase será dada

à hidrólise enzimática, visto ter sido o processo utilizado no decorrer do mesmo.

2.6.1. Hidrólise ácida

Hidrólise direta de biomassa lignocelulósica com ácido inorgânico remonta ao

início do século 19 e sua comercialização no início do século 20 (NANJING FORESTRY

INSTITUTE, 1961). Assim, a hidrólise ácida é considerada um método antigo e que foi

operado primeiramente em países como Alemanha, Japão e Estados Unidos (GALBE &

ZACCHI, 2002).

41

A hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos, e a subseqüente fermentação do

hidrolisado para obter etanol, tem sido considerada uma alternativa importante para

produzir etanol em larga escala (RODRIGUES, 2007). Este método pode ser realizado de

duas maneiras: (a) hidrólise com ácido concentrado e (b) hidrólise com ácido diluído

(BALAT, 2011), sendo que, o ácido sulfúrico têm sido o mais investigado e utilizado

industrialmente, embora outros ácidos, tais como o HCl, também tenham sido utilizados

(TAHERZADEH & KARIMI, 2007).

De acordo com Parisi (1989), os ácidos minerais atuam de maneira simples e

rápida, nas frações de polissacarídeo da matriz vegetal. Durante a hidrólise ácida, o agente

químico entra em contato com a estrutura da celulose, a qual é levada a um inchamento e

quebra das suas ligações glicosídicas (GUO et al., 2012). Em temperaturas relativamente

baixas, em torno de 50°C, e pressão atmosférica, a celulose incha quando a concentração de

ácido sulfúrico é superior a 50% (GUO et al., 2012).

Camacho et al. (1996) estudaram o efeito da concentração de H2SO4 [31 a 70%

(m/v)] na taxa de solubilização da celulose microcristalina e observaram solubilização total

da celulose quando a sua concentração era superior a 62% (m/v). Durante a hidrólise ácida,

as ligações glicosídicas presentes na celulose são rompidas e podem sofrer hidratação, o

que leva a formação no hidrolisado de muitos intermediários, tais como celuloses

hidrolisadas, que se assemelham a amidos, dextrina, oligossacarídeos e D-glicose (GUO et

al., 2012). Em seguida, os intermediários são convertidos em ésteres de açúcar ou produtos

de degradação, tais como aldeídos e furfurais (GUO et al., 2012).

O uso de ácido concentrado permite baixo consumo de energia em função do uso de

condições amenas de temperatura e pressão (30 a 50°C). No entanto, necesssita de atenção

rigorosa ao teor de umidade da matéria-prima que será utilizada (SAEMAN et al., 1945).

As principais desvantagens da hidrólise ácida são: formação de produtos de

degradação dos açúcares, que apresentam efeitos inibitórios à fermentação; necessidade de

recuperação do ácido utilizado, neutralização do hidrolisado e utilização de equipamentos

caros que resistam ao processo de corrosão durante o processo (KLINKE et al., 2003;

MARTÌN et al., 2007).

A hidrólise ácida tem início com a protonação do oxigênio glicosídico (Figura 2.19)

com posterior quebra da ligação C1–O (MENDGEN & DEISING, 1993; DANIEL, 1994).

42

O carbocátion gerado na etapa b é estabilizado pela deslocalização do par de elétrons

existente sobre o oxigênio do anel glicosídico, adjacente a C1 (MENDGEN & DEISING,

1993; DANIEL, 1994). O ataque nucleofílico da água sobre C1 (Figura 2.19) com

regeneração do ácido encerra a etapa de despolimerização (se esta ocorrer no interior da

cadeia da celulose, gerando novos terminais) ou de produção de glicose (quando ocorre

hidrólise diretamente nos terminais) (MENDGEN & DEISING, 1993; DANIEL, 1994).

Figura 2.19 Mecanismo de hidrólise da celulose catalisada por ácido. (Adaptada de Daniel, 1994).

2.6.2. Hidrólise enzimática ou sacarificação

Em função da produção de etanol de segunda geração, têm-se dado maior atenção à

eficiência e ao custo do processo de hidrólise enzimática, o qual é utilizado para conversão

de materiais lignocelulósicos em açúcares monoméricos ou fermentescíveis (LARABI et

al., 2013; AMIRI et al., 2014). No processo de sacarificação, são obtidos açúcares simples a

43

partir de carboidratos complexos como amido, celulose, hemicelulose, pectina, entre outros

(KARIMI et al., 2006).

A hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos têm sido amplamente estudada

em função das vantagens que ela apresenta como processo: alta especificidade de reação,

não apresenta reações secundárias, que poderiam levar a perdas de rendimento, não há

formação de inibidores da fermentação alcoólica e pode ser realizada em condições de

processo mais amenas (pH de 4,8 e temperatura entre 46 e 51°C) e sem condições

corrosivas para os equipamentos (BASTOS, 2007; ALVIRA et al., 2010) o que pode levar

a custos de operação menores quando comparada com a hidrólise química (ALVIRA et al.,

2010). No entanto, o custo das enzimas é ainda relativamente alto para obtenção de

produtos com valor agregado como os biocombustíveis o que requer pesquisas no sentido

de seu barateamento, assim como, no desenvolvimento dos processos de hidrólise para

diminuir a quantidade de enzima utilizada (ALVIRA et al., 2010).

Em geral, no processo de obtenção do etanol de segunda geração a hidrólise

enzimática encontra-se associada a métodos de pré-tratamentos, que alteram a estrutura da

parede celular do material e reduzem a recalcitrância da estrutura dos materiais

lignocelulósicos com o objetivo de tornar a hidrólise eficiente (KARIMI et al. , 2013).

Quando realizada para materiais lignocelulósicos pode ser um processo lento, por

ser prejudicada pelas características estruturais do substrato, tais como o conteúdo de

lignina e hemicelulose, a área de superfície e a cristalinidade da celulose (ALVIRA et al.,

2010). Em geral encontra-se associada a métodos de pré-tratamentos, que “abrem” o

material e reduzem a recalcitrância da estrutura dos materiais lignocelulósicos com o

objetivo de tornar a hidrólise eficiente (KARIMI et al. , 2013).

De acordo com Abels et al. (2013), durante o processo de hidrólise, a remoção dos

açúcares simples produzidos pela degradação da celulose e hemicelulose seria uma etapa

fundamental para minimizar os efeitos de inibição enzimática pela presença do excesso de

produto o que melhoraria a atividade das enzimas utilizadas.

O processo de hidrólise enzimática ainda não é totalmente esclarecido e ainda

experimenta, como comentado acima, o entrave do relativo alto custo das enzimas

utilizadas. Porém, já em 2008 (TAYLOR, 2008) se mostrava promissor para a produção de

etanol de segunda geração.

44

Segundo Maki et al. (2009) para que um complexo celulolítico seja considerado

ideal deve apresentar as seguintes condições: operação em temperatura e pH brandos; ajuste

correto na quantidade das diferentes enzimas componentes, o que garantiria uma ação

sinérgica entre elas; elevada especificidade; tolerância ao produto de hidrólise; alta

estabilidade a pH e temperaturas ótimos e alta atividade em substratos insolúveis. De

acordo com Van Dyk & Pletschke (2012) as principais enzimas envolvidas na degradação de

materiais lignocelulósicos a monômeros podem ser observados na Tabela 2.3.

Tabela 2-3 Algumas das principais enzimas envolvidas na degradação de materiais lignocelulósicos a monômeros (VAN DYK & PLETSCHKE, 2012). Lignina Lacase, Manganase peroxidase, Lignina

peroxidase

Pectina Pectina metill esterase, pectato liase, poligalacturonase, ramnogalacturona liase

Hemicelulose

Endo-xilanase, acetil xylana esterase, β-xilosidase, endo-mannanase, β-mannosidase, αL-arabinofuranosidase, αglucuronidase, acido ferulico esterase, α-galactosidase, acido p-coumarico esterase

Cellulose Celobiohidrolase (exoglucanase), endoglucanase, β-glucosidase

Nesta revisão serão, consideradas apenas para as enzimas degradadoras da

celulose, pois foram aquelas que foram utilizadas neste trabalho. As glicosidases são o

principal grupo de enzimas que realiza a degradação da celulose através da clivagem das

ligações glicosídicas, processo do qual provém sua energia livre. Esse grupo de enzimas

apresenta uma complexa estrutura molecular constituída por uma seqüência de aminoácidos

hidrofóbicos não-catalíticos – carhohydrate- binding modules (CBM) – que se ligam aos

terminais redutores dos polissacarídeos. Os CBM são capazes de aumentar a taxa de

hidrólise do módulo catalítico das glicosidases (VIEGAS, 2008; MCCARTNEY et al.,

2006); esses grupos envolvem as microfibrilas amorfas e cristalinas de celulose, o que

leva a uma facilitação da hidrólise enzimática (PINTO et al., 2008 e MCCARTNEY et al.,

45

2006). A degradação da celulose já foi mencionada no item 2.3.1 e de acordo com Peterson

et al. (1978) pode ser descrita em três etapas (Figura 2.20):

Figura 2.20 Degradação esquemática da celulose por celulases

Os fatores que afetam a atividade da celulase são a concentração do substrato,

inibição pela presença dos produtos finais, temperatura de reação e pH (KIM & DALE,

2004). Outro ponto importante é que a presença de celobiose pode inibir a atividade da

celulase, o que torna sua remoção um importante fator para maior efetividade da hidrólise

(ZHANG et al., 2010; GUO et al., 2012). Na Figura 2.21, é observado o modo de ação das

celulases.

Figura 2.21 Modo de ação das glicosidases (JIMENÉZ, 2013).

46

A hidrólise enzimática pode ser realizada em processo simultâneo com a

fermentação. Todavia, a diferença de temperatura entre os processos é um dos principais

fatores que limitam a obtenção eficiente de produtos quando realizados em um mesmo

processo (MARQUES et al., 2008). Segundo Krishna (2000) a hidrólise enzimática é

superior à hidrólise ácida, em vários aspectos, como mostra a Tabela 2.4.

Tabela 2-4 Comparação entre hidrólise enzimática e hidrólise ácida (KRISHNA et al., 2000).

Parâmetro Hidrólise ácida Hidrólise enzimática

Pré-tratamento Pode ser necessário Necessário

Taxa de hidrólise Rápida (min.) Lenta (h)

Temperatura Alta (200°C) Baixa (45°C)

Pressão Alta Atmosférica

Rendimento Depende do material e dos

detalhes do processo

Depende do material e dos

detalhes do processo

Formação de subprodutos Provável formação Não há formação

2.7. FERMENTAÇÃO

O processo de fermentação apresenta um grande potencial do ponto de vista

industrial para a produção de importantes compostos ligados a indústria química e de

energia, tais como ácido lático (REDDY et al., 2008), etanol combustível (HAHN-

HA¨GERDAL et al., 2006) e hidrogênio (GUO et al., 2010).

A fermentação alcoólica é um processo biológico que ocorre no citoplasma no qual

açúcares são convertidos em álcool. Neste processo as leveduras principalmente,

descarboxilam o ácido pirúvido à CO2 + acetaldeído pela ação da enzima piruvato

descarboxilase. Em seguida, o acetaldeído formado é reduzido pela álcool-desidrogenase à

etanol, enquanto o NADH (nicotinamida adenina dinucleótido - forma reduzida) é oxidado

a NAD+ (CAMPOS, 2002). Na Figura 2.22, é mostrado um esquema simplificado da

fermentação alcoólica.

47

Figura 2.22 Esquema simplificado da fermentação alcoolica (adaptado de CAMPOS, 2002).

As leveduras de maior interesse industrial são as espécies Saccharomyces

cerevisiae, Saccharomyces uvarum (carlsbergensis), Schizosaccharomyces pombe, e

Kluyveromyces. Uma ótima conversão de açúcares a etanol requer das cepas de leveduras

capacidade para tolerar altas concentrações de etanol, dado que o etanol inibe o crescimento

e a fermentação (MELO, 2008).

A Saccharomyces cerevisiae é a mais utilizada em função de sua robustez, sendo

considerada para a fermentação dos hidrolisados lignocelulósicos. Esta levedura é capaz de

fermentar a glicose, manose e frutose bem como os dissacarídeos sacarose e maltose,

porém é incapaz de fermentar a xilose em função de sua inabilidade de produzir enzimas

que convertam a xilose em xilulose, a qual é passível de ser fermentada pelo S. cerevisiae

(BALAT, 2011). Este microrganismo é caracterizado como aeróbio facultativo, o que faz

com que o mesmo apresente a habilidade de se adaptar às condições ambientais. Durante o

processo de fermentação alcoólica, parte do açúcar é transformada em biomassa (CO2 e

H2O) em ambiente de aerobiose e a maior parte é convertida em etanol em anaerobiose, o

que dependerá das condições empregadas (AQUARONE, 2001).

48

A produção do etanol de segunda geração a partir de materiais lignocelulósicos tem

como etapa essencial a fermentação, na qual os açúcares, principalmente glicose e xilose,

serão convertidos em álcool por microrganismo por bactérias, leveduras ou fungos

filamentosos (MUSSATO & ROBERTO, 2004; HAHN-HA¨GERDAL et al., 2006).

Todavia a realização eficiente e economicamente viável deste processo enfrenta alguns

obstáculos como a presença dos chamados inibidores da fermentação provenientes dos

processos de pré-tratamentos aplicados à biomassa, e das limitações da fermentação das

pentoses, principalmente da xilose (LIN & TANAKA, 2006).

De acordo com Mussato & Roberto, 2004 os compostos tóxicos da fermentação

podem estressar os microrganismos, o que reduziria o eficiente aproveitamento dos

açúcares causando a conseqüente redução nos níveis de produtos formados. Os tipos de

compostos tóxicos formados e sua concentração nos hidrolisados lignocelulósicos irão

depender da matéria-prima utilizada e das condições operacionais empregadas na hidrólise

(MUSSATO & ROBERTO, 2004). Além disso algumas variáveis da fermentação - tais

como as condições fisiológicas da célula, concentração de oxigênio dissolvido e pH do

meio – também estão em muitos casos associados com a toxicidade desses compostos,

muitas vezes acentuando seu efeito tóxico (TAHERZADEH et al., 2000).

Na tentativa de reduzir os problemas observados pela presença dos inibidores

gerados, são cada vez maiores as aplicações dos métodos de detoxificação, incluindo

biológicos, físicos e mecânicos para converter os inibidores em compostos menos tóxicos e

reduzir suas concentrações nos hidrolisados (MUSSATO & ROBERTO, 2004).

Outro importante ponto a ser considerado no processo de fermentação dos açúcares

obtidos a partir da hidrólise dos materiais lignocelulósicos é aquele relacionado com a das

pentoses. O desenvolvimento de microrganismos robustos e capazes de realizar uma

eficiente fermentação das pentoses (C5) e hexoses (C6), como a Pichia stipitis, Candida

shehatae e Pachysolan tannophilus, associada a melhoria genética do Saccharomyces

cerevisiae, ao qual foi introduzida a xilose redutase e a xilitol desidrogenase, permitiu

ultrapassar algumas das limitações apresentadas ao processo de fermentação dos

hidrolisados para a obtenção do etanol de segunda geração (VAN ZYL et al., 1998;

CHANDEL et al., 2007; TOMÁS-PEJÓ et al., 2008; LIMAYEM et al., 2012).

49

As características necessárias para um microrganismo industrialmente adequado

resumem-se na Tabela 2.5.

Tabela 2-5 Características importantes para o processo de fermentação de bioetanol (DIEN et al., 2003).

Característica Requisitos

Produção de bioetanol > 90% do valor teórico

Tolerância ao bioetanol > 40 g L-1

Produtividade de bioetanol > 1 g L-1h-1

Crescimento robusto e requisitos de crescimento simples Formulação de meios de cultura pouco dispendiosa

Capacidade de crescimento em hidrolisado não diluído Resistência a inibidores

Condições que minimizem a produção de Contaminantes

pH ácido ou temperaturas mais elevadas

De acordo com Hamelinck et al. (2005), a produção máxima teórica de etanol é de

0,51 kg de etanol e de 0,49 kg de dióxido de carbono por kg de açúcar fermentado de

acordo como segue:

Fermentação de pentoses em etanol:

3 C5H10O5 → 5 C2H5OH + 5 CO (2.4)

1 kg 0,51 kg 0,49 kg

Fermentação de hexoses em etanol:

C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO (2.5)

1 kg 0,51 kg 0,49 kg

Os microorganismos fermentadores de xilose são encontrados entre bactérias,

leveduras e fungos filamentosos (SKOOG & HAHN-HA¨GERDAL, 1988). Porém, as

bactérias fermentadoras da xilose têm demonstrado o problema de sofrerem inibição na

presença de baixas concentrações de etanol (TAHERZADEH et al., 2000). Além disso, a

fermentação alcoólica ocorre com a formação de alguns compostos secundários, tais como:

50

ácidos carboxílicos, metanol, ésteres, aldeídos e álcoois superiores, que também reduzem a

produção de etanol (NOVAES, 1994; DESAI et al., 2004).

2.8. CONCLUSÕES PARCIAIS

Neste capítulo foi mostrado o grande potencial das biomassas lignocelulósicas para

a produção de etanol combustível, em função da grande quantidade de carboidratos

passíveis de conversão em açúcares fermentescíveis. Além de ser uma fonte renovável, de

baixo custo e que em sua maioria são resíduos de processos industriais. Dentre as

biomassas pode-se destacar o caroço de açaí, resíduo comumente encontrado na região

Norte do Brasil, como um incoveniente poluidor urbano, mas que tem demonstrado

potencial de aproveitamento para construção civil e queima. Todavia, nenhum relato de sua

aplicação na produção de etanol foi encontrado na literatura consultada. Nesse sentido, o

grande conhecimento do processo de obtenção do etanol de segunda geração, o qual inclui

as etapas de pré-tratamentos, hidrólises e fermentação, permite que o caroço de açaí possa

ser utilizado como matéria-prima alternativa às biomassas convencionais e ainda com o seu

aproveitamento econômico-ambiental.

51

CAPÍTULO 3 – MATERIAIS E MÉTODOS

Neste capítulo 3, são apresentados os materiais e metodologias experimentais

utilizados nesta Tese. Inicialmente são descritas as etapas de caracterização química da

matéria-prima “in natura“ e pré-tratada. São descritos os procedimentos dos pré-

tratamentos realizados com H2SO4 diluído e hidróxido de sódio. Em seguida, a metodologia

de atividade enzimática realizadas para as enzimas utilizadas na hidrólise enzimática do

caroço de açaí são descritas. Os planejamentos experimentais para a investigação das etapas

de pré-tratamentos, hidrólises enzimáticas e avaliação da variação de carga de sólidos e

agitação durante a hidrólise enzimática, também são mostrados neste mesmo capítulo. Por

fim, são descritas as etapas do processo de fermentação.

3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

3.1. REAGENTES

Na Tabela 3.1 são apresentados os reagentes utilizados nos experimentos realizados

para esta Tese.

Tabela 3-1 Reagentes utilizados nos experimentos. Reagentes Fabricante Pureza (%) Lote

Ácido acético CHEMCO 99,37 19519

Ácido cítrico monoidratado ECIBRA 99,8 17.159

Ácido dinitro-3,5-salicílico VETEC ≥99 0707406

Ácido fosfórico SYNTH 85 123920

Ácido sulfúrico SYNTH 98,0 124289

Azida de sódio VETEC 100 0800840

Álcool etílico NUCLEAR 99,5 10030276

Ciclohexano SYNTH 99 100409

Carbonato de cálcio ECIBRA 98,00 18.167

Carbonato de sódio NUCLEAR 99,00 10040361

Corante Comassie Brilliant Blue SIGMA ALDRICH ---- 03396BJ

D-(+)-celobiose CHEM SERVICE ≥99,0 37-47C

52

D-arabinose CHEM SERVICE >98,0 299-14C

D-glicose SYNTH ≥99,0 125844

D-manose CHEM SERVICE ≥99,0 55-219H

D-xilose FLUKA ≥99,0 012508/1

5-(hidroximetil) furfural CHEM SERVICE 98,50 431-121B

Furfural CHEM SERVICE 99,3 ----

Fenol NUCLEAR 99 10040404

Filtro de papel nº1 WHATMAN ---- FC000102

Hidróxido de Sódio SYNTH 97 133817

Kit Glicose GOD-PAP LABORLAB --- 161029

Meta-bissulfito de sódio ECIBRA 97 16.638

Reagente de Folin-Ciocalteu 2N SIGMA ALDRICH --- 33496KK

Sulfato de cobre NUCLEAR 98 10020199

Tartarato de sódio e potássio

tetrahidratado

VETEC 99 0702652

Celulase de Trichoderma reesei SIGMA 080M1599V

Β-glicosidase de Aspergillus niger SIGMA 011M2020

3.2. MATÉRIA-PRIMA

Os caroços do açaí foram coletados nas barracas de venda de açaí existentes na

cidade de Belém do Pará (01º27'21"S e 48º30'16"W). A coleta foi realizada no período da

manhã, logo após o beneficiamento dos frutos (despolpamento para obtenção de suco),

garantindo matéria prima de qualidade. Na Figura 3.1 é possível observar a área de coleta.

53

Figura 3.1 Vista de satélite da região metropolitana de Belém-PA (Fonte: GOOGLE MAPS, 2013).

3.2.1. Preparação da matéria-prima

O material foi lavado com água corrente para a remoção de resíduos como terra e

outros componentes indesejados. Em seguida, foi imerso em água quente a 80°C durante 15

minutos e mais 15 minutos em banho refrigerado a 0°C. O material foi seco durante 48h a

temperatura de 50°C em estufa com circulação de ar e mais 24h em temperatura ambiente

até que se conseguisse umidade menor que 10%, condição recomendada pelo NREL

(National Renewable Energy Laboratory) para a secagem biomassas com fins de produção

de etanol.

O material foi triturado em moinho de facas da marca Willye modelo TE-650 –

Tecnal – Brasil e peneirado. O material utilizado foi aquele que passou na peneira de 9

mesh (2,0 mm) e que ficou retido na peneira de 35 mesh (0,43 mm). Este material foi

acondicionado em sacos plásticos e mantido sobre refrigeração (- 20°C) até o momento da

utilização.

A Figura 3.2 mostra o fluxograma de processamento do caroço de açaí utilizado nos

experimentos.

54

Figura 3.2 Fluxograma de processamento do caroço de açaí utilizado nos experimentos.

A Figura 3.3. e 3.4 mostram o material recém coletado, após a lavagem com água

corrente e o material seco e triturado.

Figura 3.3 Açaí antes e depois da lavagem (da esquerda para a direita)

55

Figura 3.4 Caroço de açaí após seco e triturado

3.3. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO CAROÇO DE AÇAÍ

A caracterização química do caroço de açaí foi realizada em triplicatas nos

Laboratórios: Bioen (Programa Fapesp de Pesquisa em Bioenergia) e LEPFE (Laboratório

de processos fermentativos e enzimáticos) localizados nas instalações da Faculdade de

Engenharia Química da Unicamp.

Para a caracterização química do caroço de açaí, foram realizadas as seguintes

análises químicas: teor de umidade, teor de extrativos, teor de carboidratos (celulose e

hemicelulose), lignina (solúvel e insolúvel e total), extrativos totais, descritos nos itens de

3.3.1 a 3.3.3.

3.3.1. Determinação do teor de umidade

A secagem do material e a determinação de umidade visaram garantir baixas

concentrações de água no material a ser utilizado visto que, de acordo com NREL (2009)

elevados teores de água no material podem alterar a concentração efetiva de ácido na etapa

de hidrólise ácida. Tal fato poderia provocar uma diminuição no conteúdo de carbono

ocasionada pela hidrólise incompleta dos polímeros. A determinação de umidade foi

determinada de acordo com os itens 3.3.1.1 e 3.3.1.2.

56

3.3.1.1. Em estufa

Após a trituração e secagem do material a ser utilizado como substrato para os

experimentos, foi realizada a determinação de umidade de acordo Sluiter et al. (2005).

Dessa forma o material foi submetido à secagem em estufa (105 °C ± 5°C), para a remoção

da água por aquecimento. Para isso, foram pesados 3g de amostra em béqueres de vidro os

quais foram levados à estufa para a secagem a 105°C até peso constante (aproximadamente

6h). Após a secagem, as amostras foram retiradas da estufa e acomodadas em dessecador

até atingir temperatura ambiente e, em seguida, foram pesadas. O teor de umidade foi

calculado de acordo com a equação 3.1:

(3.1)

onde:

M1= massa da placa vazio (g)

M2= massa da amostra úmida com béquer (g)

M3= amostra absolutamente seca com béquer (g)

3.3.1.2. Em infravermelho por radiação (usado para controle e verificação)

A determinação do teor de umidade foi realizada por meio de um analisador de

umidade por Infravermelho IV 2000. Este método foi utilizado por ser rápido, o que

possibilitou uma verificação quase que imediata do teor de umidade no material

armazenado (controle e verificação).

Para essa determinação, aproximadamente 5g de amostra eram depositadas sobre

um prato de alumínio removível que era acoplado ao equipamento de infravermelho

durante a análise. Após aproximadamente 5 minutos, o equipamento fornecia o teor de

umidade da amostra, o qual foi anotado para as análises seguintes.

57

3.3.2. Teor de extrativos totais

A determinação de extrativos foi realizada de acordo com SLUITER et al. (2005) e

visou eliminar os extrativos para as análises posteriores do material lignocelulósico. Nessa

metodologia, o experimento se subdivide em duas etapas, sendo que ambas foram

realizadas em extrator Soxhlet (modelo MA – 188 da marca Marconi). Para tanto, foram

utilizados cartuchos confeccionados com papéis de filtro qualitativos previamente tarados

cada um com 8g de material seco e triturado.

A primeira extração foi realizada com 190 mL de solução de álcool etílico a 99%

de pureza, até completa descoloração do solvente (aproximadamente 48h). Ao final da

extração com etanol, foi realizada uma segunda extração na qual se utilizou 190 mL de

água destilada em cada balão do extrator, juntamente com uma quantidade de pérolas de

vidro. A água, em cada balão do extrator, foi trocada à medida que esta ainda apresentava

coloração escura. Em seguida, as amostras foram secas em estufa com circulação de ar

(Estufa de secagem especial modelo MA-035/2 da marca Marconi) a 105 °C até massa

constante. As análises foram realizadas em triplicata e a quantificação do conteúdo de

extrativos foi calculada pela equação 3.2.

100%1

21 xM

MMExtrativos

−= (3.2)

M1= massa do caroço seco (g)

M2= massa do caroço livre de extrativos (g)

3.3.3. Determinação dos componentes lignocelulósicos do caroço de açaí

3.3.3.1. Hidrólise ácida para caracterização química do caroço de açaí

Após a remoção dos extrativos da biomassa, o material foi submetido a uma

hidrólise ácida com H2SO4 a 72%. De acordo com a metodologia utilizada (SLUITER et al.,

2008a), é necessário que o material apresente umidade menor que 10% e esteja livre de

extrativos.

58

Para a hidrólise, foram pesados 0,3 g caroço de açaí moído e peneirado em tubos de

ensaio, aos quais foram adicionados 3 mL de H2SO4 72% (m/m) e imediatamente

depositados em banho maria a 30 °C. Os tubos permaneceram no banho por um período de

1h. Durante o banho-maria, o conteúdo dos tubos foi agitado a cada 10 minutos com o

auxílio de um bastão de vidro por um período de 1h a fim de garantir uma mistura mais

homogênea da amostra. Ao final do período, a amostra foi resfriada para a interrupção da

reação em banho de gelo.

A cada tubo de ensaio foram adicionados 84 mL de água destilada e seu conteúdo

foi transferido quantitativamente para frascos Schott de 250mL os quais foram fechados e

autoclavados (Autoclave vertical modelo AV 50 da marca Phoenix) a 121 °C e 1,1 bar

durante 1 h, para a total hidrólise dos oligômeros presentes na amostra. Um “branco” (3mL

de ácido + 84mL de água destilada) foi preparado com H2SO4 a 72%, constituindo uma

solução com concentração de 4% que foi posteriormente utilizada na determinação de

lignina solúvel. Após a descompressão, os frascos Schott foram retirados, resfriados e o seu

conteúdo foi filtrado em um funil com papel filtro previamente tarado. A fase líquida foi

transferida para um balão volumétrico de 100 mL (sem aferir). Desse material, foi retirada

uma alíquota de 1mL para quantificar a lignina solúvel (item 3.3.3.2) e a outra parte do

volume foi analisada para carboidratos, inibidores (Hidroximetilfurfural e Furfural) e ácido

acético em HPLC.

3.3.3.2. Determinação do teor de lignina

• Determinação de lignina insolúvel (Lignina de Klason)

O material proveniente da hidrólise ácida, o qual ficou retido no papel de filtro

conforme descrito no item 3.3.3.1, foi lavado com aproximadamente 2L de água destilada

(até a água de lavagem ficar com pH neutro - isto é feito para evitar a queima do papel de

filtro durante a secagem a 105°C pela presença de ácido residual). Em seguida foi colocado

para secar em estufa a 105°C até massa constante (Mkla). Uma parte do material insolúvel

presente é constituída de cinzas, visto que estas não são solúveis em ácido. Para não haver

59

uma superestimação dos valores de lignina insolúvel as cinzas foram determinadas como

descrito no item 3.3.3.3. O teor de lignina Klason foi calculado pela equação 3.3.

cinzas%xM

MMKlasonlignina%

b

pkla −

−= 100

(3.3)

onde:

Mb= massa do bagaço absolutamente seco, (g)

Mp= massa do papel filtro tarado, (g)

Mkla= massa do papel filtro + lignina insolúvel seca, (g)

• Lignina solúvel

A determinação do teor de lignina solúvel foi realizada de acordo com foram

transferidos 1,0 mL do hidrolisado ácido para balões volumétricos de 25 mL. Os balões

foram completados com água destilada e seu conteúdo foi analisado em espectrofotômetro

UV-Visível a 280 nm. O cálculo da concentração da lignina solúvel é realizado pela

equação 3.4

−−−=

B

AC.AC FurfHMFHMFnm

lig

εε280

(3.4)

onde:

Clig= Concentração de lignina no hidrolisado (g/L)

A = absorbância da amostra a 280 nm

εHMF = absortividade do hidroximetilfurfural (114 L.g-1)

εFurfural= absortividade do hidroximetilfurfural (146,85 L.g-1)

CHMF= Concentração de hidroximetilfurfural no hidrolisado (g/L)

CFurfural= Concentração de furfural no hidrolisado (g/L)

B= Absortividade da lignina

60

• Determinação de Lignina precipitada no material deslignificado

A metodologia utilizada para a determinação do teor de lignina presente no licor

proveniente da deslignificação foi realizada de acordo com o método descrito por Kim et al.

(1987). De acordo com a literatura, este apresenta alta eficiência em precipitar a lignina

presente no licor (75 a 85%).

Para a realização da análise o licor foi filtrado em papel de filtro para um béquer de

200mL do qual retirou-se uma alíquota de 50mL a qual foi transferida para outro béquer de

100mL. Em seguida, foi realizada a precipitação da lignina através da acidificação do licor

filtrado com solução de H2SO4 1N até se atingir um pH próximo de 2. Nesse ponto,

observa-se a precipitação da lignina. O material precipitado foi lavado com água deionizada

e o volume adicionado foi coletado com uma pipeta pasteur. A lavagem prosseguiu até pH

neutro, em seguida o material resultante foi transferido para uma placa de Petri e seguiu

para secagem em temperatura ambiente. Determinou-se a concentração da lignina no licor

negro dividindo-se a massa da lignina precipitada pela massa da amostra de licor negro

seco utilizada na etapa de precipitação.

Concentração da Lignina precipitada = (MLP / MALNS) x 100 (3.5)

onde:

MLP = massa de lignina precipitada;

MALNS = Massa da amostra de licor negro seco

3.3.3.3. Determinação do teor de Cinzas

As cinzas, em geral, mostram a presença de resíduos inorgânicos remanescentes

após a queima da matéria orgânica de uma amostra. A cinza é constituída principalmente de

grandes quantidades de K, Na, Ca e Mg; pequenas quantidades de Al, Fe, Cu, Mn e Zn e

traços de Ar, I, F e outros elementos.

A determinação do teor de cinzas na biomassa seguiu a metodologia descrita por

NREL “Determination of Ash in Biomass” (SLUITER et al., 2005). Dessa forma, cadinhos

de porcelana foram identificados e incinerados em mufla (modelo Q-318D24 da marca

Quimis) a 800°C por 2 horas. Em seguida, amostras de 1g de caroço de açaí moído e

61

peneirado (descontando-se a umidade do material) foram incineradas em mufla à

temperatura de 300°C durante 10 minutos e, em seguida, a temperatura foi elevada para

800°C para mais 2h de calcinação. A diferença entre as amostras iniciais e finais forneceu o

teor de cinzas.

Ao final da calcinação os cadinhos foram depositados em dessecador até

temperatura ambiente para em seguida serem pesados. As análises foram realizadas em

triplicata. O cálculo do teor de cinzas da biomassa é dado pela Equação 3.6.

100×

=

+ cadinhoBC

cadinhocinza

M-M

M-McinzasdeTeor% (3.6)

MC+B = massa do cadinho + massa do bagaço seco (g)

Mcadinho = massa do cadinho calcinado vazio (g)

Mcinza= massa do cadinho com cinzas, (g)

3.3.3.4. Determinação de açúcares e produtos de decomposição por HPLC (Cromatografia líquida de alta eficiência)

• Preparação da Curva de calibração dos carboidratos e produtos de decomposição

A determinação dos açúcares e produtos de degradação seguiu a metodologia

descrita na norma NREL/TP-510-42618 – “Determination of structural carbohydrates and

lignin in biomass” (SLUITER et al., 2008a), a qual foi realizada em um aparelho de

cromatografia líquida de alta eficiência (High-Performance Liquid Cromatography –

HPLC). A quantificação dos teores de carboidratos e produtos de degradação foi realizada

com base em uma curva de calibração previamente preparada com os padrões de arabinose,

celobiose, xilose, glicose, ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural os quais

encontravam-se nas faixas de concentração descritas na Tabela 3.2.

62

Tabela 3-2 Faixa de concentração dos padrões usados na curva de calibração. Padrões Faixas de concentração g/L

Arabinose 0,01 – 4

Celobiose 0,01 – 4

Xilose 0,01 – 4

Glicose 0,01 – 4

Ácido acético 0,1 – 2,0

Furfural 0,005 – 0,01

Hidroximetilfurfural 0,0005 – 0,1

• Determinação dos carboidratos

O hidrolisado proveniente da hidrólise ácida foi filtrado (filtros de membrana GS

em éster de celulose com poros de 0,22 µm - Milipore) diretamente em “vials” de 1,5 mL.

As amostras contidas nos vials foram injetadas no HPLC nas condições: coluna BIORAD

Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) com temperatura da coluna de 30°C, fluxo do eluente de

0,6 mL.min -1. O eluente utilizado foi uma solução de H2SO4 0,01 mol/L com pH de 2,6, a

qual foi preparada com água ultra-pura (Milli-Q). Esta solução foi filtrada com o auxílio de

bomba a vácuo em membrana HAWP 0,45µm (Millipore) e degaseificada em banho ultra-

som (Microsonic SX-50) por 40 minutos. O volume da amostra injetada foi de 30µL

através de um detector IR (índice de refração) a 35°C, por um tempo de execução de 25

min.

As concentrações dos componentes analisados foram obtidas pelas áreas dos

cromatogramas que foram correlacionadas com as curvas padrão (previamente

determinadas para os padrões de celobiose, glicose, xilose e arabinose).

As massas de celobiose e glicose foram convertidas em celulose com os fatores de

0,95 e 0,90, respectivamente. As massas de xilose e arabinose foram convertidas para

hemiceluloses com o fator de 0,88. O cálculo do teor de carboidratos é mostrado na

equação 3.7.

1001

×

⋅⋅=

M

VFCCAçúcares% filtradoHPLC (3.7)

63

onde:

CHPLC: concentração do açúcar quantificado por HPLC, em g/L

FC: fator de correção para o cálculo da concentração polimérica dos açúcares dada a

concentração monomérica dos açúcares (celobiose= 0,95; glicose= 0,9; xilose= 0,88 e

arabinose = 0,88).

Vfiltrado: volume do hidrolisado filtrado, 0,087 L

M1: massa do caroço utilizado na hidrólise (g)

• Determinação dos grupos acetil

O teor de grupos acetil foi analisado durante a análise de açúcares. Dessa forma,

foram utilizadas as mesmas condições descritas no item anterior (Determinação dos

carboidratos). As massas obtidas para ácido acético a partir dos cromatogramas foram

utilizadas para calcular a concentração dos grupos acetil no qual se utilizou o fator de

conversão do ácido acético para acetato de 0,717. O cálculo do teor de acetato é mostrado

na equação 3.8.

1001

×

⋅⋅=

M

VFCCAcetato% filtradoHPLCA

(3.8)

CA HPLC: concentração de ácido acético quantificado por HPLC, em g/L

FC: fator de conversão do ácido acético em acetato = 0,717


M1: massa do caroço utilizada na hidrólise (g)

• Determinação de furfural e hidroximetilfurfural

A quantificação dos compostos chamados inibidores (furfural e

hidroximetilfurfural) foi realizada em HPLC na qual se utilizou uma coluna Nova-Pak C18

(Waters Co., Milford, MA) a 30°C. O eluente utilizado foi uma solução de acetonitrila/água

64

(1:8 com 1% de ácido acético). O eluente antes de ser utlizado foi filtrado com o auxílio de

bomba a vácuo em membrana HAWP 0,45µm (Millipore) e degaseificada em banho

ultrassom (Microsonic SX-50) por 60 minutos e o fluxo de injeção foi de 0,8 mL.min-1. Os

componentes foram analisados com a utilização de um detector UV-VIS a 27°C com o

comprimento de onda de 280 nm e tempo de execução de 20 min. Para o cálculo das

massas de furfural e hidroximetilfurfural foram utilizados os fatores de conversão de 1,375

e 1,286, respectivamente. O cálculo do teor de furfural foi calculado pela equação 3.9.

1001

×

⋅⋅=

M

VFCCFurfural% filtradoHPLCF

(3.9)

CF HPLC: concentração de furfural quantificado por HPLC, em g/L

FC: fator de conversão do furfural, 1,375


M1: massa do caroço utilizada na hidrólise em g (gramas)

O cálculo do teor de hidrometilfurfural foi calculado pela equação 3.10.

1001

×

⋅⋅=

M

VFCCilfurfuralHidroximet% filtradoHPLCH

(3.10)

CH HPLC: concentração de ácido acético quantificado por HPLC, em g/L

FC: fator de conversão do hidroximetilfurfural, 1,286


M1: massa do caroço utilizada na hidrólise em g (gramas)

• Análise da composição química da fase líquida do material após o pré-tratamento

com ácido diluído e/ou deslignificação

Para a composição química da fração líquida (licor), foi retirada uma alíquota de

5mL do licor (fase líquida) resultante do pré-tratamento e/ou deslignificação, a qual foi

transferida para tubos Schott de 250mL. Em seguida, foram adicionados os volumes de

H2SO4 a 72% de acordo com a Tabela 3.3 que foi baseada na metodologia descrita pelo

65

NREL “Determination of Sugars, Byproducts, and Degradation Products in Liquid Fraction

Process Samples” (SLUITER et al., 2008b). Em seguida, os tubos foram levados para o

autoclave a 121°C durante 1h. Após a descompressão, foram removidos e resfriados em

banho de água fria. O conteúdo dos tubos foi diluído quando necessário e filtrado com o

auxílio de um filtro (filtros de membrana GS em éster de celulose com poros de 0,22 µm -

Milipore) diretamente em “vials” de 1,5 mL os quais seguiram para a leitura em HPLC.

Tabela 3-3 pH e volume de H2SO4 a 72% adicionado para a hidrólise ácida do licor, para posterior quantificação de carboidratos e inibidores presentes.

Ponto pH do licor Volume de ácido adicionado (µL)

1 1,90 172 2 1,90 172 3 1,90 172 4 1,90 172 5 1,30 164 6 1,30 164 7 1,30 164 8 1,30 164 9 2,30 173 10 1,20 161 11 1,65 170 12 1,65 170 13 1,65 170 14 1,65 170

PC* 1,65 170 *PC – Ponto central

3.3.3.5. Determinação do teor de proteínas

O teor de proteína foi determinado de acordo com o método nº 920.152 da AOAC

(1997) pela técnica micro-Kjeldahl, no qual as amostras foram submetidas a digestão com

adição de H2SO4 concentrado até o ponto de ebulição do ácido utilizando bloco digestor da

marca TECNAL modelo TE 040/25, controlador de temperatura da TECNAL modelo TE

007. Em uma segunda etapa, o material digerido foi destilado em destilador de nitrogênio

da TECNAL modelo TE-036/1 e, em seguida, foi realizada uma titulação com ácido

clorídrico 0,1N. Para conversão da porcentagem de nitrogênio em proteínas, utilizou-se o

fator 6,25. Os cálculos para obtenção das porcentagens de proteína são mostrados nas

equações 3.11 e 3.12:

66

%N (% de nitrogênio) = mLHCl x NR HCl x 0,014 x 100 (3.11)

g

%P (porcentagem de proteína) = %N x fator de correção (6,25) (3.12)

onde : NR = normalidade real do HCl; g = peso da amostra

3.3.4. Técnicas espectroscópicas e de imagem aplicadas para a caracterização do caroço de açaí.

De acordo com Farinãs (2010), a avaliação das características estruturais e

morfológicas de biomassas é uma etapa essencial, pois favorece a definição de processos

operacionais mais adequados ao material em questão. Várias técnicas têm sido utilizadas

no sentido de esclarecer de maneira mais profunda a estrutura e a composição química da

biomassa analisada. O caroço de açaí “in natura”, pré-tratado com H2SO4 diluído e

deslignificado foram analisados pelas metodologias de microscopia eletrônica de varredura

(MEV), Espectroscopia de difração de Raios-X (DRX) e infravermelho com Transformada

de Fourier (FTRI).

As análises contidas neste item foram todas realizadas no Laboratório de Recursos

Analíticos e de Calibração (LRAC), na Faculdade de Engenharia Química da UNICAMP.

3.3.4.1. Análise dos materiais lignocelulósicos por microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Para a análise em questão, foi necessária a fixação das amostras de caroço de açaí

com fita de carbono em suporte de alumínio “stubs”. Em seguida, as amostras foram

submetidas a um recobrimento metálico de 10 nm de ouro em um metalizador Sputter

Coater POLARON Modelo SC7620 da Marca VG Microtech (Uckfield, Inglaterra).

Para o cálculo da estimativa da espessura da camada de Au (ouro) as seguintes

condições foram utilizadas: Espessura = K.i.V.t. Onde: K=0,17 Aº/mA.Volt.s; i=3 mA;

V=1 Volt e t=180 s. Portanto: Espessura=92 Aº.

As micrografias foram obtidas em um Microscópio Eletrônico de Varredura com

Detector de Energia Dispersiva de raios X, modelo- Leo 440i; Modelo EDS: 6070; Marca

67

MEV/EDS: LEO Electron Microscopy/Oxford (Cambridge, Inglaterra). Utilizou-se tensão

de aceleração igual a 20 kV e corrente do feixe igual a 100 pA.

As amostras foram dispostas de forma que fosse possível observar as modificações

superficiais resultantes dos tratamentos aplicados.

3.3.4.2. Espectroscopia de difração de Raios-X (DRX)

O índice de cristalindade da celulose foi determinado através da Espectroscopia de

difração de Raios-X (DRX) para as amostras de caroço de açaí pré-tratadas com H2SO4

diluído, deslignificado e hidrolisado enzimaticamente, no sentido de observar as possíveis

diferenças na cristalinidade das celuloses remanescentes.

Após serem devidamente moídas e secas, as amostras foram analisadas pela

difratometria de raios X, com um difratômetro de raios X da marca Philips Analytical X

Ray - Modelo: X'Pert-MPD (Almelo, Holanda), Radiação: Cu (Ka) lambda = 1.54060

Angstron, que continha um tubo de cobre gerador de raios X com filamento de tungstênio

(λ = 1,5418Å) e monocromador de grafite no intervalo angular de 5° a 70° (ângulo de

Bragg-2θ), passo angular de 0,02° e velocidade de 0,016 °.seg-1.

O índice de cristalinidade da biomassa (CrI) é definido como a porcentagem de

material cristalino na biomassa e é calculado de acordo com a Equação 3.13 (SEGAL et al.,

1959).

100002

002 ×−

=I

IICrI am

(3.13)

onde:

CrI é o índice de cristalinidade

I002 é o máximo de intensidade do pico 2θ = 16º

Iam é a intensidade na fase amorfa a 2θ que foi de 18º

3.3.4.3. Infravermelho com Transformada de Fourier (FTRI)

68

A análise em questão foi utilizada para a identificação das estruturas químicas e

grupos funcionais presentes nas amostras avaliadas e foi baseada na metodologia descrita

por Silva (2009). Para a análise foram preparadas manualmente pastilhas compactadas a

partir de 250mg de KBr e 1,5 mg de amostra seca a 60°C em estufa e resfriada em

dessecador durante 30 min. Foi preparada uma amostra utilizada, como referência,

contendo apenas KBr. A transmitância foi medida na região de 4000 a 400 cm-1 em um

espectrofotômetro NICOLET IR 100 FT-IR da marca THERMO. As amostras avaliadas

foram: o caroço de açaí “in natura”, hidrolisado enzimaticamente, “in natura”

deslignificado, pré-tratado com ácido diluído e pré-tratado e deslignificado.

3.4. PRÉ-TRATAMENTO COM H 2SO4 DILUÍDO

Foi realizada a pesagem da quantidade de biomassa estabelecida em cada um dos

pontos do planejamento em frascos de borosilicato de 250 mL, nos quais foi adicionada a

solução de H2SO4 de acordo com as concentrações (m/v) propostas nos ensaios. Os

volumes de H2SO4 adicionados foram calculados descontando-se a umidade do material

analisado (~8%). Em seguida, os frascos foram depositados no autoclave a 121°C

(aquecido à taxa de 2,6 e 3,0°C.min-1). Quando a temperatura do autoclave atingiu a

temperatura de estudo, a contagem do tempo de tratamento foi iniciada. Ao término da

reação, retiraram-se os frascos da autoclave e os mesmos foram submetidos a um banho

com água destilada a 20°C, para resfriar os frascos e garantir a interrupção da reação. O

material foi retirado dos frascos e filtrado com auxílio de bomba a vácuo e papel de filtro.

A fase sólida foi lavada com aproximadamente 3L de água destilada até a água de lavagem

atingir pH neutro. O material sólido foi seco em temperatura ambiente até atingir umidade

de aproximadamente 10%. Em seguida, foi realizada a pesagem para o cálculo da perda de

massa e analisada por HPLC para os teores de carboidratos, grupos acetil e lignina.

A fase líquida foi coletada antes do início da lavagem da fase sólida e analisada

para carboidratos, ácido acético, furfural e HMF determinados também via HPLC. As

metodologias de caracterização realizadas para as fases líquida e sólida encontram-se

descritas no item 3.2. Na Figura 3.5 é mostrada a biomassa nos tudos Schott, antes de

seguirem para o autoclave.

69

Figura 3.5 Biomassa nos tubos Schott antes de seguirem para o autoclave.

Os rendimentos mássicos foram calculados pela equação 3.14:

R = (m final/m inicial) x 100 onde: (3.14)

m inicial: massa inicial seca de material lignocelulósico

m final: massa final seca de material lignocelulósico

R: Rendimento mássico da etapa

A solubilização ou perda dos componentes celulose, hemicelulose e lignina,

proteínas, cinzas e grupos acetil foi calculada pela equação 3.15:

−=

−=

i

f

i

fi

Y

YR

Ymi

YRmiYmiP 1100

.

...100

(3.15)

onde:

P: perda do componente (%)

mi: massa inicial de material lignocelulósico

Y i: teor do componente no material lignocelulósico “in natura”;

Yf: teor do componente no material lignocelulósico pré-tratado;

R: Rendimento mássico da etapa de pré-tratamento

70

3.4.1. Planejamento experimental e fator de severidade aplicado para o estudo do

pré-tratamento com H2SO4 diluído

A determinação das variáveis e condições utilizadas no estudo do pré-tratamento

com H2SO4 diluído foi baseada na literatura relatada para outros materiais lignocelulósicos

(LU et al., 2009; FERREIRA et al., 2011; GIL et al., 2012). Dessa maneira, foi realizado

um planejamento central composto rotacional 23 com as variáveis independentes:

Concentração de ácido (0,5-1,5% m/v), tempo de tratamento (30-90 min) e concentração de

sólidos (5-15 %m/m). O software estatístico Statistica 7.0 foi utilizado para auxiliar na

análise dos dados experimentais obtidos definidos de acordo com as faixas das variáveis

experimentais mostradas na Tabela 3.4.

Na Tabela 3.5 é apresentado o planejamento utilizado que foi constituído de 17

ensaios incluindo 3 repetições no ponto central. O efeito do fator de severidade combinado

(FSC) do pré-tratamento com ácido diluído foi calculado de acordo com a equação 3.16

descrita por Overend & Chornet, (1987). O FSC é um índice que integra as variáveis de

mudanças na temperatura, tempo e acidez em um único valor, o que facilitaria a

comparação de diferentes combinações de processos (LEE & JEFFRIES, 2011, GUO et al.,

2008; LLOYD & WYMAN, 2005).

pHTT

tFSC RH −

−=

75,14exp.log

(3.16)

onde:

t - é o tempo de reação em minutos;

TH - temperatura de reação em °C;

TR - a temperatura de referência (foi utilzada a TR=100°C);

pH ácido da solução aquosa

A faixa de valores estudados no planejamento 23 realizado para o estudo do pré-

tratamento com H2SO4 diluído é mostrado na Tabela 3.4.

71

Tabela 3-4 Faixa das variáveis estudadas no planejamento 23 do pré-tratamento com H2SO4.

Na Tabela 3.5 é mostrado planejamento realizado para o estudo do pré-tratamento

com H2SO4 diluído.

Tabela 3-5 Planejamento experimental do pré tratamento com H2SO4

Ponto

Concentração de

ácido (% m/v)

Tempo de tratamento

(min)

Concentração de Sólidos (% m/v)

Fator de Severidade

1 0,5 30 5 0,195 2 0,5 30 15 0,195 3 0,5 90 5 0,673 4 0,5 90 15 0,673 5 1,5 30 5 0,795 6 1,5 30 15 0,795 7 1,5 90 5 1,273 8 1,5 90 15 1,273 9 0,2 60 10 0,096 10 1,84 60 10 1,196 11 1 9.5 10 - 12 1 111 10 1,014 13 1 60 1,6 0,746 14 1 60 18 0,746 15 1 60 10 0,746 16 1 60 10 0,746 17 1 60 10 0,746

3.5. DESLIGNIFICAÇÃO COM HIDRÓXIDO DE SÓDIO (NAOH)

A deslignificação foi realizada baseada em dados da literatura (PAN et al., 2005,

GUPTA, 2008; LEHTO & ALÉN, 2013). Para a deslignificação, foram pesadas massas do

caroço de açaí pré-tratado de acordo com o planejamento aplicado no qual foi descontado o

teor de umidade do material.

No experimento, a massa de caroço foi pesada em frascos Schott de 250 mL e em

seguida foi adicionado o volume de aproxidamente 100mL (descontando a umidade do

material) da solução de NaOH a 1% (m/v). Os frascos foram fechados para que não

Variáveis Níveis

-1,68 -1 0 1 +1,68

Concentração de ácido (%m/v) 0,2 0,5 1,0 1,5 1,84 Tempo de tratamento (min) 9,5 30 60 90 111 Concentração de Sólidos (%) 1,6 5 10 15 18

72

houvesse alteração considerável do volume reacional e foram colocados nas temperaturas

de estudo de acordo com o planejamento durante o tempo fixo de 60 minutos. Após o

tempo de deslignificação com o auxílio de uma peneira de 400 mesh o licor foi recolhido

para posteriores análises e o material sólido resultante foi lavado com água corrente sob a

peneira até que a água de lavagem apresentasse pH neutro (sem coloração amarelada).

O pré-tratamento teve que ser realizado duas vezes pois a secagem do material a ser

caracterizado necessitou ser realizada de maneira diferente daquela realizada para o

material a ser hidrolisado enzimaticamente. Dessa maneira, o material que foi caracterizado

quimicamente passou por secagem em estufa a 105°C até massa constante com o objetivo

de minimizar possíveis erros experimentais. Enquanto que o material que seguiria para a

hidrólise enzimática foi submetido à secagem a temperatura ambiente. Este procedimento

foi necessário uma vez que, a secagem promove colapso nos poros do material o que

promove redução no rendimento da hidrólise enzimática, além do gasto energético

(HENDRIKS & ZEEMAN, 2009; ZHANG et al., 2004).

Após a deslignificação o licor recolhido foi analisado para os teores de carboidratos

e inibidores (Grupos acetil, HMF e furfural), lignina (lignina precipitada) e proteínas

conforme os itens 3.3.3.4; 3.3.3.2 e 3.3.3.5. Enquanto que a fração sólida foi analisada para

o teores de carboidratos, grupos acetil, lignina (solúvel e insolúvel), cinzas e proteínas de

acordo com os itens 3.3.3.4; 3.3.3.2, 3.4.3.3 e 3.5.3.5, respectivamente.

O planejamento aplicado é mostrado na Tabela 3.6. E os rendimentos mássicos e

solubilização foram calculados de maneira semelhante conforme descrito no item 3.4.

Tabela 3-6 Planejamento 22 realizado para o estudo da deslignificação do caroço de açaí.

Ponto Temperatura Carga de sólidos % (m/v)

1 50,00 10,00 2 50,00 40,00 3 100,00 10,00 4 100,00 40,00 5 40,00 25,00 6 110,00 25,00 7 75,00 3,79 8 75,00 46,21 9 75,00 25,00 10 75,00 25,00 11 75,00 25,00

73

3.6. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E SUAS ETAPAS 3.6.1. Enzimas utilizadas

As enzimas utilizadas para as hidrólises dos materiais foram as enzimas celulase de

Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich) e β-glicosidase de Aspergillus niger (Sigma-Aldrich).

3.6.2. Preparo do Tampão citrato utilizado

Para o preparo do tampão citrato, 0,05 mol/L de pH 4,5 foram pesados em um

Béquer, 9,60 g de ácido cítrico anidro com 99,5% de pureza, o qual foi dissolvido em

50mL de água destilada com o auxílio de um bastão de vidro. Em seguida, foram

adicionados 450mL de água destilada e 0,07% de Azida sódica. O pH foi medido e ajustado

com aproximadamente 2g de hidróxido de sódio, para atingir o pH de 4,5. O volume foi

transferido para um balão volumétrico de 1L e aferido.

3.6.3. Preparação do DNS e Tartarato

O reagente DNS foi preparado de acordo com BAZÁN (1993). Para a preparação do

DNS (ácido dinitro-3,5-salicílico) dissolveu-se 10,6 g do reagente em 1416 mL de água.

Em seguida adicionou-se 7,6 mL de fenol fundido a 50°C e 8,3 g de meta-bissulfito de

sódio e 19,8g de NaOH. O reagente preparado foi guardado em um frasco âmbar para

protegê-lo da luz e evitar possíveis degradações. Paralelamente, foi preparada uma solução

estabilizante da cor formada do DNS, adicionando 15,1 g de tartarato de sódio e potássio

tetrahidratado em 1L de água destilada, que foi filtrada e guardada em frasco âmbar.

3.6.4. Determinação da atividade enzimática da celulase

A determinação da atividade enzimática da celulase foi adaptada e realizada de

acordo com Ghose (1987), onde a atividade da enzima foi calculada em termos de unidades

de filtro de papel por mL de solução enzimática (UFP/mL). A análise baseia-se na

capacidade da solução analisada reduzir o reagente DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico). Essa

medida ocorreu através da medida da absorbância a 540 nm da glicose liberada. Para a

74

determinação foi preparada uma solução de celulase (Solução mãe) 1:20, sendo realizadas

cinco diluições a partir da mesma. A determinação foi realizada nas seguintes etapas:

1ª etapa: Em sete diferentes tubos de ensaio foram pesados 0,05g de papel de filtro

whatman n°1 previamente picado.

2ª etapa - Preparo de cinco soluções com diferentes diluições: em sete diferentes

tubos, foram preparadas, a partir da solução mãe, cinco diferente soluções, retirando-se um

volume X da solução mãe e adicionando-se um volume Y de tampão.

3° etapa: Aos tubos que continham apenas o papel de filtro pesado foi adicionado

1mL de tampão sem enzima. Estes tubos foram levados para o banho termostático a 50°C,

durante 10 minutos. Após o tempo decorrido, foi adicionado a cada tubo 0,5 mL retirado

dos tubos que continham as diferentes diluições enzimáticas.

4ª Etapa: Os tubos da 3° etapa ficaram 60 minutos sob incubação. Em seguida, a

reação foi interrompida com a adição de 1,5 mL de reagente DNS. Esses tubos foram

fechados e depositados em banho termostático a 95°C durante 5 minutos e em seguida

imersos em banho de gelo por 5 minutos.

5ª Etapa: Após os 5 minutos em banho de gelo, foi adicionado 10,5 mL da solução

estabilizante de tartarado de sódio e potássio diretamente nos tubos de ensaio, em seguida

tampou-se os mesmos homogeneizando a solução, após esta etapa os tubos permaneceram

em repouso até a decantação total do papel. Em seguida foram transferidos

aproximadamente 1,5mL das soluções para as cubetas e em seguida, mediu-se a

absorbância em espectrofotômetro a 540nm.

6ª Etapa: Durante o andamento foram preparados tubos controles, uma vez que parte

da glicose analisada pode vir ou do substrato ou da própria enzima utilizada (RABELO,

2007). Dessa forma, foram preparados tubos que continham: 1 - a enzima sem substrato e

(2 - o substrato sem enzima. A leitura obtida a partir destes tubos foi subtratídas da leitura

dos demais tubos reacionais analisados.

7ª Etapa: Preparação do branco reacional – Um tubo denominado branco reacional

para zerar o equipamento foi preparado com um tubo contendo 1,5mL do tampão citrato.

8ª Etapa: Preparação de um tubo para o controle da enzima – foi preparado

paralelamente sete tubos, nos quais adicionaram-se 1,0mL do tampão citrato e 0,5mL de

cada uma das diluições da enzima.

75

9ª etapa: Os tubos das etapa 7 e 8 (branco e controle da enzima) foram incubados a

95ºC por 60 min, e submetidos à análise de DNS, conforme já descrito.

10ª Etapa: Após as leituras das absorbâncias, uma reta foi traçada relacionando-se o

logaritmo da concentração da enzima em cada uma das diluições em função da massa de

glicose liberada por 0,5mL da enzima diluída, obtendo-se então a atividade enzimática da

celulase.

Uma unidade enzimática (FPU) é a quantidade de enzima que libera 2,0mg de

açúcar redutor como a glicose a partir de 50 mg de papel de filtro nas condições do ensaio.

A atividade específica (AE) da celulase, expressa em termos de FPU por mililitro de

proteína, foi calculada a partir da equação 3.17 e 3.18:

)(

)37,0()/(

CmLFPU =

(3.17)

onde:

- C - é a concentração de enzima (mg/mL) necessária para transformar 50mg de substrato

em 2 mg de glicose, ou seja, a concentração enzimática necessária para realizar 4% de

conversão do substrato;

- O numerador 0,37 é derivado do fator de conversão de 2,0mg de glicose gerados no

ensaio por mmol de glicose, a partir do volume de enzima utilizado e do tempo requerido

para geração dos açúcares redutores.

11*min*)*60*5,0*18016,0(

0,2/ −−= mLmol

CmLFPU µ (3.18)

Apesar da constante 0,37 ter seu cálculo baseado nas unidades internacionais de

atividade do Sistema Internacional de medidas (S.I.), a celulase não tem sua atividade

determinada nestas unidades, devido ao fato de que as mesmas são baseadas nas taxas

iniciais de reação, portanto, esta enzima deve ter sua atividade expressa simplesmente como

FPU.

76

3.6.5. Determinação da atividade enzimática da β-glicosidase

A determinação da atividade enzimática da β-glicosidase foi realizada de acordo

com o método recomendado pela IUPAC (WOOD e BHAT, 1988). Dessa forma, foi

preparada uma solução de celobiose 15 mmol/L e expressa em unidades de celobiose

(CBU) por volume de enzima original. Foi preparada também uma solução enzimática da

enzima β-glicosidase de diluição 1:1000. A partir da qual foram feitas 4 novas diluições em

tampão citrato 0,05 mol/L pH 4,8.

Em tubos de ensaios, foram adicionados 1,0 mL de cada uma das diluições da

enzima e estes seguiram para o banho termostático a 50°C durante 10 minutos. Após

decorridos os 10 minutos, 1mL da solução de celobiose preparada inicialmente foi

adicionada aos tubos que seguiram para a incubação a 50°C pelo período de 30 minutos.

Em seguida, os tubos foram imersos em um banho de água fervente durante 5 minutos e

logo de imediado seguiram para um banho de gelo. A determinação quantidade de glicose

liberada por cada uma das soluções nos diferentes tubos foi realizada com o auxílio do kit

de quantificação Glicose GOD-PAP. Após o final da reação de quantificação, foram

adicionados 0,2 mL de uma solução de H2SO4 72% em cada tubo de ensaio para garantir

que a reação tivesse sido terminada.

Foram preparados 4 tubos denominados controle da enzima. Em cada um dos tubos,

foram adicionados 1,0 mL de cada uma das diluições da enzima e 1,0 mL do tampão

citrato. Decorrido o tempo de reação, foi utilizado o método enzimático Glicose GOD-

PAP. Para o tubo controle do substrato,yhh adicionou-se 1,0 mL do substrato celobiose e

1,0 mL do tampão citrato que ao final de 30 minutos de reação também foi analisado pelo

método enzimático Glicose GOD-PAP. A partir das absorbâncias medidas foi traçada uma

reta, que relacionou a concentração da enzima em cada uma das diluições em função da

massa de glicose liberada por 1,0 mL dessa enzima diluída. Dessa forma foi determinada a

atividade enzimática da β-glicosidase. Cada unidade da atividade da β-glicosidase (CBU)

baseia-se na liberação de exatamente 1,0 mg de glicose, isto é, 0,5/0,18016 µmol de

celobiose convertida por 1,0 mL de enzima diluída em 30 minutos de reação. A Equação

3.19 e 3.20 mostram o cálculo da atividade da β-glicosidase.

77

11*min*)*30*0,1*18016,0(

5,0/ −−= mLmol

CmLCBU µ (3.19)

11*min*0926,0

/ −−= mLmolC

mLCBU µ (3.20)

Onde C: Concentração de enzima diluída

O método enzimático Glicose GOD-PAP é um kit enzimático pronto para o uso. A

metodologia de uso é descrita por HENRY et al. (1974) e baseia-se na capacidade da

oxidação enzimática da glicose através da enzima glicose oxidase (GOD) o que resulta em

peróxido de hidrogênio, o qual é, em seguida, usado na formação da coloração rosada pela

peroxidase (PAP). A aplicação do método para a quantificação da glicose foi realizada

adicionando-se 10 µL de cada uma das amostra em tubos de ensaio previamente

identificados e 1,0 mL do mono-reagente contido no Kit. Em seguida, os tubos foram

mantidos em banho termostático a 37°C por 10 minutos para o desenvolvimento da

coloração rosada. Ao final do tempo de reação, foram adicionados aos tubos 3,0 mL de

água destilada. Os tubos foram homogeneizados e a absorbância foi medida.

Em paralelo aos tubos das amostras, foram realizados os tubos do branco e do

padrão de glicose. Dessa forma, para o tubo do branco foi adicionado 1mL do reagente

enzimático e para o tubo padrão adicionou-se 10 µL da solução padrão de glicose (100

mg/dL) e 1,0mL do mono-reagente enzimático. Foram realizadas diluições, quando

necessário, as quais foram realizadas para possibilitar a leitura, visto que a reação é linear

até 500 mg/dL (recomendações do fabricante). Outra observação feita pelo fabricante diz

respeito ao fato de que, quando a leitura do branco apresentar absorbância acima de 0,250,

o mono-reagente deve ser descartado, pois indicaria deterioração do reativo de trabalho. A

cor final da reação é estável por 60 minutos. Para determinar a concentração de glicose,

utilizou-se a equação da reta obtida pela curva padrão de glicose 10mg/mL, com valor de

R² próximo de 1.

78

3.6.6. Hidrólise enzimática do caroço de açaí pré-tratado e deslignificado para

obtenção de dados cinéticos

A hidrólise enzimática do material pré-tratado com ácido diluído e deslignificado

para a obtenção dos dados referentes à observância do efeito do pré-tratamento e

deslignificação nos resultados de conversão foi realizada com a utilização do tampão de

citrato de sódio a pH 4,8 a 50 mM contendo 0,07% de azida sódica. O experimento teve

início com a prévia suspensão de 3g de caroço de açaí pré-tratado ou deslignificado em 100

mL de tampão dentro de tubos erlemeyers de 250 mL e que foram acondicionados em

“shaker” a 50°C, pelo período de 60 minutos para estabilização da temperatura sob agitação

de 150 rpm.

Após o decorrido o período, foram adicionados aos tubos os volumes de enzimas

nas cargas enzimáticas de 15FPU/g de caroço e 25CBU/g de caroço. A liberação dos

açúcares redutores e da glicose foi medida nos períodos de (0,5, 2, 4, 6, 12, 24, 30, 48, 60 e

72h) com a coleta de alíquotas de 2 mL, as quais foram analisadas por Cromatografia

líquida de alta eficiência (HPLC). A carga enzimática utilizada foi baseada no estudo de

Gomez-Rueda, (2010), e a conversão enzimática da celulose foi calculada pela Equação

3.21:

100.Y.m

f.mCC

iinicial

hecosgli= (3.21)

onde:

CC: conversão enzimática da celulose;

mglicose: massa de glicose presente no hidrolisado (g);

minicial: massa seca de material lignocelulósico, antes da etapa de hidrólise enzimática (g);

Yi: teor de celulose no material lignocelulósico;

fh: fator de hidrólise da celulose (correspondente a 0,9)

79

3.6.7. Estudo da variação da carga de sólidos e agitação na etapa de hidrólise

enzimática

Baseado no estudo de RABELO (2010), foi realizado um estudo da influência da

variação da carga de sólidos e da agitação na hidrólise enzimática do caroço apenas pré-

tratado com H2SO4 diluído e, também, com aquele que foi sequencialmente deslignificado

(ambos nas condições que foram consideradas ótimas).

As massas de sólidos descritas (descontando-se a umidade do material) no

planejamento foram pesadas em reator encamisado de vidro borosilicato com capacidade de

500mL para o qual foram adicionados 100 mL de tampão citrato 4,8 (pH ótimo da enzima)

quando necessário foi ajustado). A temperatura utilizada foi de 50ºC e as cargas

enzimáticas utilizadas para celulase e β-glicosidase foram de 15 FPU/g de caroço e 25

CBU/g caroço, respectivamente. O planejamento aplicado possuiu 3 níveis com 9 ensaios e

3 repetições no ponto central, os quais são mostrados na Tabela 3.8.

Tabela 3-7 Planejamento experimental aplicado para a variação da carga de sólidos e agitação.

Ensaio Concentração de sólidos (%)

Agitação (rpm)

1 5 100 2 5 150 3 5 200 4 10 100 5 10 150 6 10 200 7 15 100 8 15 150 9 15 200 10 10 150 11 10 150 12 10 150

80

3.7. FERMENTAÇÃO

As etapas da fermentação foram baseadas no estudo de Andrade (2012) e foram

realizadas como descritas nos itens de 3.7.1 a 3.7.8.

3.7.1. Preparação do padrão glicose

Foram preparados 100mL de uma solução de glicose pura na concentração de (X

g/L) que foi a mesma observada nos hidrolisados a serem fermentados. Esta etapa foi

realizada com o objetivo de se observar possíveis diferenças de fermentabilidade entre a

solução padrão e o hidrolisado. O preparo da solução padrão foi basicamente realizado pela

diluição de glicose em tampão citrato de sódio a pH 4,8.

3.7.2. Preparo do hidrolisado

O caroço de açaí pré-tratado apenas com H2SO4 diluído (item 3.3) e que também foi

sequencialmente deslignificado (item 3.4) foi hidrolisado de acordo com o item 3.5 com a

utilização das cargas de sólidos de 15% para o apenas pré-tratado e de 10% para o que foi

sequencialmente deslignificado na melhor condição de agitação observada no item 3.5.7,

que foi 200rpm. Não foram adicionados azida sódica na preparação do tampão utilizado na

produção dos hidrolisados a serem fermentados.

3.7.3. Esterelização dos hidrolisados

A metodologia de esterelização dos hidrolisados foi baseada no estudo de Andrade,

(2012). Os hidrolisados enzimáticos foram esterelizados a frio na Faculdade de Engenharia

de Alimentos – FEA/UNICAMP. O hidrolisado foi previamente centrifugado a 5000 rpm

por 20 minutos para obtenção de uma fração líquida que, posteriormente, seguiu para a

esterelização, no qual o hidrolisado passou por um sistema de filtração estéril por

menbranas modelo Minikap HF Filter MK2M-512-V6S (Spectrum Laboratories, Inc., FL,

USA). A membrana de filtração utilizada é constituída de éster de celulose, com diâmetro

de poro de 0,2 µm, e área de filtração de 500 cm2. O material filtrado estéril foi coletado em

frascos “Erlenmeyers” fechados e previamente esterilizados em autoclave.

81

3.7.4. Microrganismo

O microrganismo utilizado foi o Sacchamomyces cerevisiae, o qual foi mantido sob

refrigeração em meio de ativação contendo ágar. A manipulação do microrganismo foi

realizada em câmara de fluxo laminar, nas devidas condições de esterelização. Todo o

material utilizado foi autoclavado previamente, e quando necessário, foi utilizado álcool

etílico 70°GL para a esterelização de superfícies e posterior à radiação ultravioleta por 30

minutos. Antes da fermentação no “shaker”, foram realizadas propagações do

microrganismo a cada 24 horas. Neste procedimento, com o auxílio de uma alça platina,

foram realizados repiques para novos tubos que continham o meio semi-sólido YM

composto por Extrato de levedura (3kg/m3), Extrato de malte (3 kg/m3), Peptona (5 kg/m3),

Glicose (10 kg/m3) e de ágar-ágar (20 kg/m3).

3.7.5. Ativação do microrganismo

Após o período de 24h, o microrganismo crescido e contido dentro dos tubos com o

meio semi sólido, foi transferido com o auxílio de uma alça de inoculação para novos tubos

contendo o meio de ativação YM (preparado da maneira anteriormente mencionada, porém

sem a adição do ágar). Em seguida, o inóculo foi novamente levado para o shaker na

temperatura de 30°C durante 24h.

3.7.6. Crescimento do microrganismo

Após decorrido o período de 24h, os inóculos contidos nos tubos de ativação foram

transferidos para um erlemmeyers de 250mL que já continha 100mL do meio de

crescimento sintético que foi preparado contendo: sacarose (20 kg/m3), Extrato de levedura

(5 kg/m3), K2HPO4 (5 kg/m3), NH4Cl (1,5 kg/m3), KCl (1,15 kg/m3) e MgSO4.7H2O (0,65

kg/m3). Em seguida, o erlemeryer contendo o meio de crescimento e os inóculos foram

levados para incubadora do tipo “shaker”, onde ficou sob incubação durante 24h a 30°C e

agitação de 150rpm. Após este período, o conteúdo do erlemeyer foi distribuído em tubos

de centrifugação, os quais foram centrifugados a 3000rpm durante 20 minutos.

82

3.7.7. Fermentação dos hidrolisados

A fração líquida, contida nos tubos de centrifugação foi desprezada e a fração sólida

dos tubos foi transferida para novos erlemeyers de 250mL, os quais continham 100mL de

hidrolisados esterelizados. Em seguida, os erlemeyers foram deixados sob incubação

durante 24h na temperatura de 34°C e, a cada 2h, foram coletadas alíquotas de 2mL. A

alíquota coletada foi centrifugada durante 15 minutos a 4000 rpm. A fração líquida foi,

então, coletada e analisada em HPLC para os teores de carboidratos e inibidores

determinados de acordo com o item 3.3.3.4 e o teor de etanol e glicerol de acordo com o

item 3.7.8.2. A fração sólida foi utilizada para a determinação da concentração de células

totais realizada conforme o item 3.7.8.1.

3.7.8. Métodos analíticos utilizados para avaliar a fermentação

3.7.8.1. Concentração de Células Totais

Após a mistura do meio de crescimento contendo o inóculo com o hidrolisado, foi

coletada uma alíquota de 2mL a cada 2h durante 24h, incluindo o ponto de uma coleta no

ponto zero. O volume de 2mL foi coletado em eppendorff e centrifugado durante 15

minutos a 4000 rpm. Em seguida, a fração líquida foi coletada para as análises já descritas e

o precipitado formado foi lavado por 3 vezes com água destilada. Essa lavagem foi

realizada colocando-se água destilada dentro do eppendorff, o qual foi centrifugado e a

fração líquida descartada (procedimento repetido por 3 vezes). Ao final das lavagens, o

material sólido foi transferido para placas de petri e seco em estufa com circulação de ar a

60°C até massa constante e a massa final foi usada para determinar por método

gravimétrico a concentração de células totais (ANDRADE, 2012).

3.7.8.2. Análise do teor de glicerol e etanol

A fração sobrenadante resultante da centrifugação do material fermentado foi e

diluída e filtrada, com seringas acopladas a filtros contendo membrana microporo de éster

83

de celulose (diâmetro de poro de 0,22 µm) e analisadas para os teores de glicerol de etanol.

Parra isso foi utilizado o cromatógrafo líquido modelo 1260 Infinity HPLC Agilent

Technologies com detector de índice de refração IR e DAD UV-vis, sendo a fase móvel

utilizada uma solução de H2SO4 0,05M; preparada com água ultra-pura (Milli-Q) e fluxo de

eluente de 0,6 mL min-1. Utilizou-se uma coluna Aminex HPX-87H de 300 mm x 7,8 mm a

30°C e o volume de amostra injetado foi de 15 µL e o tempo total de análise foi fixado em

30 min. Os tempos médios de retenção de cada composto foram: etanol (21,1 min) e

glicerol (13 min). Os padrões foram soluções de glicerol e etanol preparadas na faixa de

concentração de 0,01 a 4 %.

3.7.8.3. Parâmetros de avaliação da fermentabilidade (rendimento de produtividade

de etanol)

A fermentação foi avaliada para os hidrolisado obtidos com 15% de caroço de açaí

apenas pré-tratado com H2SO4 diluído e para o hidrolisado obtido com 10% de caroço de

açaí pré-tratado e deslignificado. Os parâmetros para a avaliação da fermentação foram:

rendimento de fermentação e a produtividade volumétrica de etanol. Os valores de

produtividade volumétrica de etanol foram calculados pela Equação 3.22:

PV = (PF – Pi)/ t (3.22)

onde:

PF é a concentração de etanol (g.L-1) no final da fermentação, Pi é a concentração

de etanol (g.L-1) no início da Fermentação e t é o tempo em horas.

Enquanto que o rendimento de fermentação (RF) foi calculado pela Equação 3.23 :

( ) 100511,0

××−

−=

fi

if

GG

EERF

(3.23)

onde:

Ef = concentração de etanol no final da fermentação;

84

Ei = concentração de etanol no inicial da fementação;

Gi = concentração de glicose no início da fermentação;

Gf = concentração de glicose no final da fermentação;

0,511 é o fator estequiométrico


No capítulo 3, foram mostrados, detalhadamente, os materiais e metodologias

utilizadas para o desenvolvimento desta Tese. Foi possível perceber que as metodologias

aplicadas a este trabalho foram capazes de propocionar a obtenção de dados comparáveis

aos consultados na literatura. Além disso, foi observada boa repetibilidade para os dados

obtidos com as metodologias utilizadas.

85

CAPÍTULO 4 - CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO CAROÇO DE AÇ AÍ ”IN

NATURA”

No Capítulo 4, foi caracterizado o caroço de açaí “in natura”. Por se tratar de uma

matéria-prima ainda pouco explorada e com reduzidos dados científicos relacionados à sua

composição, esta foi uma etapa essencial para se conhecer melhor os componentes deste

material e obter dados para a escolha dos melhores tratamentos a serem aplicados ao

mesmo no decorrer deste trabalho.

4. RESULTADOS DA CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO CAROÇO DE A ÇAÍ “IN NATURA”

Na Tabela 4.1, é possível observar a caracterização química da biomassa do caroço

de açaí utilizada nos experimentos desta Tese.

Tabela 4-1 Composição química da biomassa do caroço de açaí “in natura” em base seca.

(*) Desvio padrão para média de três repetições

A caracterização química da biomassa do caroço de açaí e os desvios médios de

cada componente estão apresentados na Tabela 4.1. Os dados obtidos foram comparados

com outros trabalhos que relatam a composição deste mesmo material e com outras

biomassas atualmente estudadas para a potencial produção de etanol de segunda geração.

Componentes (%)*

Celulose 45,3 ± 1,30

Hemicelulose 18,2 ± 0,80

Lignina Total 20,37 ± 0,50

Cinzas 3,5 ±0,10

Extrativos 9,5 ± 0,20

Grupos acetila 3,01 ± 0,80

Proteína 4,3± 1,10

Total 98,52

86

Para a caracterização da biomassa do caroço de açaí, foi realizada previamente a

determinação do teor de umidade e de cinzas do material, os quais foram de 8,1% e 3,5%

respectivamente. Este último foi ligeiramente maior que aquele obtido por Teixeira et al.

(2004) que obteve 2,60%. Não foi realizada a análise de metais nas cinzas mas a literatura

revela que estes tipos de materiais freqüentemente apresentam um elevado teor de sílica

(CALDAS et al., 2000; SEYE et al., 2000). Em relação ao percentual de carboidratos totais,

foi observado o teor de 63,5%, semelhante ao relatado por Rodriguez-Zúñinga et al. (2008)

(65,46%) e superiores aos encontrados por Altman et al. (1956) (54,02%), porém bem

inferior ao obtido por Kabacznik e Rogez (1998) (81,29%). Quando comparado com outros

resíduos este material apresentou valor maior que aqueles relatados para palha de trigo

(59%) (BALLESTEROS et al., 2008), biomassa de cardo (52%) (KOOTSTRA et al., 2009)

ou materiais semelhantes como sementes de Jatropha curcas (42,9%) (MARASABESSY

et al., 2012). Porém, ficou dentro do intervalo relatado para o bagaço-de-cana (59,3%)

(RABELO, 2007) e (63,1%) (LI-QUN JIANG et al., 2013). De acordo com Kim et al.,

(2005), o elevado teor de carboidratos como o que foi obtido para o caroço de açaí

justificaria a sua utilização na produção de etanol.

O principal componente da biomassa do caroço de açaí foi a celulose com o teor de

45,3%, seguido pela hemicelulose com 18,2% e lignina 20,37%. Foram encontradas poucas

informações na literatura quanto à composição química desta biomassa. Rodriguez-Zúñinga

et al. (2008) caracterizaram o caroço de açaí e obtiveram valores maiores que os obtidos

neste trabalho para os teores de celulose (53,20%) e lignina (22,30%) porém com teores

menores de hemicelulose (12,26%). Já Altman (1956) obteve teores um pouco diferentes

que foram de 34,41% de celulose, 12,26% de hemicelulose e 7,72% de lignina e que são

apresentados na Tabela 4.2 juntamente com dados de outros materiais lignocelulósicos.

O teor de hemicelulose foi praticamente todo obtido na forma de xilana (~95%).

Este comportamento é observado também para madeiras de folhosas como a oliveira, no

qual a xilose e a arabinose são normalmente os açúcares mais representativos na

constituição da hemicelulose presente, verificando-se um predomínio da xilose nessa

constituição (LYND et al., 1999).

Para o teor de lignina, foi observado um valor relativamente elevado quando

comparado àquele obtido para o caroço de açaí por Altman (1956) e do intervalo relatado

87

por Kim et al. (2005) para a palha de milho que variou de 17 a 19%. De acordo com

Boussarsar et al. (2009), a lignina tem importante papel no fortalecimento da estrutura do

material lignocelulósico, influencia na suspensão do material na água e por possuir caráter

hidrofóbico reduz a facilidade de hidratação do material. Segundo Saha et al. (1999)

elevados teores de cinzas e lignina podem dificultar a bioconversão de materiais

lignocelulosicos a etanol. Além disso, a partir da lignina também são gerados compostos

fenólicos tóxicos inibidores da fermentação (PALMQVIST & HAHN-HÃGERDAL, 2000;

ALMEIDA et al., 2007).

O teor de proteína encontrado (4,3%) para o material foi menor que aqueles

relatados na literatura para materiais lignocelulósicos como pedúnculo de trigo (17,01%) e

de algodão (14,97%) ambos relatados por Dundar et al. (2009) e ainda frutos de jatropha

curcas (semente da indonésia utilizada para produção de biodiesel) com 4,9%

(MARASABESSY et al.,2012) e bagaço de beterraba 11.42% (ZHENG et al.,2013).

O teor de extrativos obtido (9,5%) esteve dentro de um intervalo relatado para uma

ampla variedade de materiais lignocelulósicos como: frutos de jatropha curcas (30%)

(MARASABESSY et al.,2012), bagaço-de-cana não peneirado (2,3%) (RABELO, 2007);

resíduos de podas de oliveiras (15,87%) (PEDRO, 2013) os quais podem incluir

componentes não-estruturais como componentes estruturais de casca de frutos, tais como

ceras, gorduras, taninos, algumas resinas e pectinas solúveis (CARA et al., 2006;

WINKLER et al., 1997).

Apesar do balanço de massa não ter fechado em 100%, Ruzene (2005) explica que

este tipo de comportamento pode ocorrer em função da provável presença de outros

compostos de baixo peso molar e extrativos (a presença de extrativos poderia levar a

formação de grumos que não podem ser hidrolisados ou quantificados).

De maneira geral, os teores de celulose, hemicelulose e lignina encontraram-se em

concordância com análises efetuadas para a mesma matéria-prima por outros autores, como

pode ser verificado na Tabela 4.2, na qual também são mostradas as composições químicas

de vários outros resíduos lignocelulósicos.

88

Tabela 4-2 Composição química de alguns materiais lignocelulósicos.

Resíduo lignocelulósico Celulose (%)

Hemicelulose (%)

Lignina (%)

Referência Bibliográfica

Caroço de açaí 53,2 12,26 22,3 (RODRIGUEZ-ZUÑINGA et al., 2008)

39,83 14,19 8,93 (ALTMAN, 1956)

Bagaço de cana-de-açúcar 40,9 20,8 24,9 (QIU et al., 2012)

38,1 29,2 24,2 (SILVA, 2009)

Podas de olival 33,8 16,6 24,7 (REQUEJO et al., 2011)

Palha de colza 36,59 24,11 17,03 (DIAS et al., 2010)

Palha de trigo 54,1 4,4 27,4 (PIHLAJANIEMI., 2014)

Eucalipto 44,4 17,5 27,7 (ROMANÍ et al., 2010)

Palha de milho 37.0 31.3 17.8 (SAHA et al., 2013)

Bagaço de caju 20,9 16,3 33,6 (ROCHA et al., 2014)

Capim-elefante 22.6 20.9 19.4 (ELIANA et al., 20014)

Bagaço de beterraba 22,7 36,64 - (ZHENG et al., 2013)

Cachos de dênde 39,2 24,4 31,8 (JUNG et al., 2013)

Acácia 43,4 18,7 20,7 (FERREIRA et al., 2011)

Pinheiro 41,4 5,2 28,5 (YU et al., 2011)

Casca de soja 38 10 3 (MIELENZ et al., 2009)

Casca de arroz 31 26 9,1 (CASSALES et al., 2011)

Micro-alga 15,22 17,3 - (HARUN & DANQUAH, 2011)


Neste capítulo, foi observado o elevado valor de 63,5% para o teor de carboidratos

totais presente no caroço de açaí. O maior carboidrato presente no material foi a celulose

seguida pela hemicelulose. Os teores de lignina foram considerados ligeiramente elevados,

porém muito semelhantes aos obsevados para a maioria das matérias-primas comumente

utilizadas para a produção do etanol de segunda geração. A caracterização do caroço de

açaí revelou que o caroço de açaí apresenta grande potencial para a produção do etanol de

segunda geração porém com a necessidade de pré-tratamentos.

89

CAPÍTULO 5 - PRÉ-TRATAMENTO COM H 2SO4 DILUÍDO DO CAROÇO

DE AÇAÍ

No Capítulo 5, foi estudado o pré-tratamento com H2SO4 diluído para a remoção da

fração hemicelulósica presente no caroço de açaí. Foram avaliadas as duas frações obtidas

após o pré-tratamento. A fração sólida foi caracterizada quimicamente dando-se destaque

para os teores de carboidratos, principalmente a celulose. E a fração líquida também foi

caracterizada quimicamente, com atenção aos níveis de xilose e inibidores. Os níveis de

solubilização do caroço de açaí após o pré-tratamento foram analisados e em seguida foram

verificados os efeitos do pré-tratamento na conversão enzimática da fração sólida

recuperada. Os dados obtidos para a conversão enzimática (valores de g de glicose liberada)

foram analisados estatisticamente. Por fim foram realizadas as cinéticas de hidrólise

enzimática para cada um dos ensaios delimitados pelo planejamento experimental utilizado.

5. RESULTADOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM H 2SO4 DILUÍDO DO

CAROÇO DE AÇAÍ

5.1. RESULTADOS OBTIDOS PARA A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA

FRAÇÃO SÓLIDA RECUPERADA APÓS O PRÉ-TRATAMENTO

Na Tabela 5.1 são apresentados os resultados obtidos para a composição química da

biomassa pré-tratada. Após o pré-tratamento, o material resultante denominado “slurry” foi

separado em fase líquida (hidrolisado) e fase sólida e tiveram sua composição química

realizada. As alterações na composição da fase sólida e a composição em açúcares e outros

compostos da fase líquida foram comparados com a composição da matéria-prima “in

natura”, para se observar melhor os resultados do pré-tratamento, os quais foram exibidos

em tabelas.

Com base na Tabela 5.2, é possível verificar que a recuperação de material após o

pré-tratamento variou de 58,32% (na condição de 121°C; 1,5% de ácido; 30 minutos e 5%

de sólidos) a 79,85% (na condição de 121°C; 0,5% de ácido; 30 minutos e 5% de sólidos) e

foi menor que os valores obtidos por por Jung et al. (2013), o qual obteve em condições

90

ótimas (190°C; 1% de H2SO4; 3 segundos e 10% de sólidos) o valor de 51,1% de sólidos

recuperados, para o pré-tratamento de cachos de dendê.

Lu et al. (2009) pré-tratou com H2SO4 palha de canola e obteve taxas de

recuperação de material sólido que variaram de 52,6 a 88,7% com concentrações de ácido

entre de 0,5 e 2%; tempo de 5 a 20 minutos e concentração de sólidos de 5 a 20% na

temperatura de 180°C. Diaz et al. (2010) verificaram uma taxa de recuperação que variou

de 51 a 71% para o tratamento de palha de canola com água aquecida entre 210 a 220°C.

91

Tabela 5-1 Composição química da fração sólida obtida do pré tratamento com H2SO4 (sem a correção)

Ponto de

ensaio

Sólidos recuperados

g/100g de

material não-tratado

Ácido (% m/v)

Tempo de

tratamento (min)

Concentração de

Sólidos (%)

Celulose (%)

Hemicelulose (%)

Grupos Acetil (%)

Cinzas (%)

Lignina total (%)

Proteínas (%)

Total

1 79,85 0,5 30 5 49,67±0,04 14,40±0,13 0,78±0,12 4,30±0,01 23,13±1,03 4,12±0,23 96,50 2 75,4 0,5 30 15 52,30±0,15 14,78±0,03 0,88±0,13 4,40±0,02 23,30±0,63 4,52±0,43 100,27 3 77,5 0,5 90 5 50,12±0,03 14,40±0,03 0,56±0,12 4,49±0,01 23,40±0,43 4,52±0,07 97,49 4 75,55 0,5 90 15 52,10±0,10 14,75±0,04 0,63±0,13 4,56±0,02 22,10±1,13 4,53±0,10 98,67 5 57,45 1,5 30 5 60,83±0,13 4,33±0,04 0,65±0,11 5,88±0,03 18,30±1,04 5,98±1,03 95,97 6 59,53 1,5 30 15 58,56±0,04 4,32±0,06 0,65±0,09 5,65±0,03 23,40±1,21 4,02±1,06 96,60 7 56,5 1,5 90 5 57,40±0,03 4,20±0,07 0,45±0,05 4,89±0,03 25,43±0,73 3,45±0,75 95,82 8 58,32 1,5 90 15 63,34±0,03 5,54±0,11 0,64±0,03 5,80±0,01 19,40±0,53 3,12±0,45 97,84 9 78,4 0,2 60 10 50,30±0,06 16,10±0,14 0,70±0,08 4,30±0,01 21,50±0,55 5,17±0,40 98,07 10 58,3 1,84 60 10 53,40±0,05 2,55±0,03 0,48±0,08 5,80±0,01 31,40±0,45 3,83±0,27 97,46 11 78,2 1 9.5 10 51,40±0,05 14,56±0,01 0,98±0,06 4,28±0,02 22,90±0,50 4,14±1,03 98,26 12 66,9 1 111 10 57,32±0,02 2,50±0,01 0,40±0,05 5,12±0,04 28,30±1,22 2,41±1,09 96,05 13 63,75 1 60 1.6 57,20±0,02 1,20±0,11 0,20±0,11 5,28±0,05 30,10±0,34 2,31±0,97 96,29 14 77,33 1 60 18 54,12±0,01 10,80±0,13 0,69±0,11 4,48±0,03 24,23±0,53 4,10±0,65 98,42 15 65 1 60 10 57,67±0,03 4,34±0,04 0,50±0,06 5,20±0,01 26,80±0,54 3,11±0,45 97,62 16 65,5 1 60 10 57,33±0,11 4,47±0,03 0,45±0,05 5,15±0,01 26,70±0,58 3,46±0,24 97,56 17 64,9 1 60 10 57,20±0,03 4,43±0,03 0,46±0,03 5,25±0,01 26,05±1,16 3,71±0,36 97,55

*médias de três replicatas;

92

Rocha et al. (2014) estudou o pré-tratamento com ácido diluído de bagaço de caju e

verificaram taxas de recuperação de sólidos que variaram de 61,2 a 86,7%.

Os percentuais de sólidos recuperados após o pré-tratamento foram utilizados para

os cálculos dos teores de celulose, hemicelulose e demais componentes observados na

Tabela 5.2 e também foram utilizados nos cálculos dos balanços de massas na etapa de

hidrólise enzimática.

De acordo com a Tabela 5.1, é possível verificar um aumento nos teores de

celulose, o que é uma falsa impressão pois os valores não estão convertidos para a base do

rendimento. De acordo com esta tabela, é possível verificar, para o material caracterizado,

teores de celulose que variaram de 49,67-63,34% de celulose; 1,2-16,1% de hemicelulose e

18,3-26,8% de lignina. Quando corrigidos para a base do rendimento (Tabela 5.2) é

possível perceber o real efeito do pré-tratamento na composição química do material “in

natura”.

93

Tabela 5-2 Composição química da fração sólida obtida do pré-tratamento com H2SO4 da biomassa do caroço de açaí (com a correção do rendimento do pré-tratamento)

Ponto de

ensaio

Sólidos recuperados

g/100g de

material não-tratado

Concentração de

ácido (% m/v)

Tempo de

tratamento (min)

Concentração de

Sólidos (%)

Celulose (g/100g)

Hemicelulose (g/100g)

Lignina (g/100g)

Proteínas (g/100g)

Cinzas (g/100g)

Grupos acetil

(g/100g)

Total

1 79,85 0,5 30 5 39,66±0,01 11,50±0,03 18,47±1,03 3,29±0,13 3,51±0,03 0,62±0,03 77,06 2 75,4 0,5 30 15 39,43±0,11 11,14±0,03 17,57±1,13 3,41±0,45 3,39±0,01 0,66±0,05 75,60 3 77,5 0,5 90 5 38,84±0,03 11,16±0,01 18,14±0,15 3,50±1,06 3,48±0,01 0,43±0,05 75,55 4 75,55 0,5 90 15 39,36±0,09 11,14±0,01 16,70±0,12 3,42±0,77 3,45±0,02 0,48±0,07 74,55 5 57,45 1,5 30 5 34,95±0,02 2,49±0,09 10,51±0,19 3,44±0,75 3,38±0,01 0,37±0,09 55,13 6 59,53 1,5 30 15 34,86±0,5 2,57±0,09 13,93±1,12 2,39±0,03 3,36±0,02 0,39±0,03 57,51 7 68 1,5 90 5 32,43±0,5 2,37±0,01 14,37±1,09 1,95±0,93 2,76±0,03 0,25±0,11 54,14 8 58,32 1,5 90 15 36,94±0,02 3,23±0,11 11,31±0,17 1,82±0,24 3,38±0,02 0,37±0,12 57,06 9 78,4 0,2 60 10 39,44±0,03 12,62±0,09 16,86±0,43 4,05±0,22 3,37±0,05 0,55±0,12 76,89 10 58,3 1,84 60 10 31,13±0,07 1,49±0,02 18,31±0,23 2,23±1,02 3,38±0,03 0,28±0,11 56,82 11 78,2 1 9,5 10 40,19±0,07 11,39±0,01 17,91±0,19 3,24±0,83 3,35±0,03 0,77±0,05 76,84 12 66,9 1 111 10 38,35±0,03 1,67±0,01 18,93±0,11 1,61±0,63 3,43±0,01 0,27±0,07 64,26 13 63,75 1 60 1,6 36,47±0,01 0,77±0,10 19,19±0,09 1,47±0,05 3,37±0,01 0,13±0,07 61,38 14 77,33 1 60 18 41,85±0,02 8,35±0,01 18,74±0,65 3,17±0,03 3,46±0,03 0,53±0,09 76,11 15 65 1 60 10 37,49±0,03 2,82±0,01 17,42±0,63 2,02±0,03 3,38±0,5 0,33±0,11 63,45 16 65,5 1 60 10 37,55±0,05 2,93±0,11 17,49±0,73 2,27±1,04 3,37±0,01 0,29±0,12 63,90 17 64,9 1 60 10 37,12±0,05 2,88±0,03 17,20±0,77 2,41±1,02 3,41±0,01 0,30±0,11 63,31


94

Após o pré-tratamento, é possível verificar que na base do rendimento, os níveis de

celulose no material pré-tratado variaram de 31,13 a 41,85g/100g. De maneira geral, esse

teor mostrou uma redução quando comparado com o material “in natura” (45,3%). Este

comportamento já era esperado uma vez que uma parte da celulose é solubilizada a

monômeros como, por exemplo, a glicose. Ainda para o teor de celulose, verifica-se que o

material tratado nas condições do ponto 10 (1,84% de ácido; 60 minutos e 10% de sólidos)

promoveu a permanência do menor teor de celulose (31,13g/100g) e conseqüentemente

também, foi aquele responsável pelo maior índice de solubilização observado (31,28%)

(Figura 5.1) o que ocorreu claramente em função da elevada concentração de ácido

utilizada e da elevada quebra das cadeia de celulose. Zhang et al. (2009) obteve taxa

máxima de solubilização da celulose de 42,3% em reator Par de 1L com H2SO4 diluído. É

importante ressaltar que a degradação excessiva da celulose não é um aspecto desejável

para o pré-tratamento nesta etapa.

Quando se compara os teores de celulose obtidos para os pontos médios (15, 16 e

17) (1% de H2SO4 /60 min/10% de sólidos) no qual se obteve uma média de 37,38g/100g

de celulose com os resultados obtidos para o ponto 10 (aumento da concentração de ácido

para 1,84%) verificou-se uma redução no teor de celulose em 17% o que gerou um aumento

nas concentrações de glicose e celobiose nos licores (Figura 5.1) obtidos para este último

ponto em relação aos pontos 15, 16 e 17. Porém, quando o teor de ácido utilizado caiu para

0,2% (Ponto 9) nas mesmas condições dos pontos médios, foi verificado um aumento no

teor de celulose de 5,5% e uma menor taxa de solubilização para os índices de celulose

(12,95%) deste ponto em comparação com os obtidos para os pontos médios (17,47%) o

que evidencia a efetiva influência da concentração de ácido no pré-tratamento.

É possível verificar a influência do tempo no teor de celulose no material

caracterizado quando se observa que um acréscimo no tempo de pré-tratamento de 30 para

90 minutos (ponto 5 para o ponto 7) promoveu uma redução no teor de celulose de

34,95g/g100g para 32,43 g/g100g, o que representou um aumento na taxa de solubilização

de 24%. A menor taxa de solubilização da celulose obtida para o pré-tratamento aplicado

foi de 7,61% observada para o ponto 14 (1% de ácido; 60 min; 18% de sólidos)

provavelmente pelo alto teor de sólidos utilizados neste ensaio. Nesses casos é comum

95

ocorrer uma redução na penetração do solvente no material tratado em função do aumento

da concentração de sólidos (CONTRERAS & SMYRL, 1981).

De acordo com a literatura, o pré-tratamento ácido da maioria dos materiais

lignocelulósicos resulta na quase completa solubilização de hemicelulose e de uma digestão

parcial da celulose (em torno de 10%) o que leva ao fornecimento de açúcares

monoméricos ou oligoméricos (KIM et al., 2005; LU et al. , 2007; ELANDER et al., 2009).

O pré-tratamento do caroço de açaí com ácido diluído apresentou maior influência na

remoção da fração de hemicelulose. Os teores de hemicelulose no material pré-tratado

variaram de 0,77 a 12,62 g/100g e as taxas de solubilização para este componente variaram

de 30,65% a 95,80%. Rocha et al. (2014) encontraram teores de hemicelulose no bagaço de

caju pré-tratado com H2SO4 que variaram de 1,62 a 3,24 g/100g. De acordo com o mesmo

autor, esses teores reduzidos de hemicelulose são esperados uma vez que o pré-tratamento

com ácidos diluídos é direcionado à solubilização da hemicelulose visando reduzir o custo

associado com a compra de enzimas hemicelulases.

O ponto 13 (1% de ácido/60 minutos/1,6% de sólidos) foi aquele que demonstrou

menor teor de hemicelulose (0,77g/100g) e maior taxa de solubilização (95,80%) após ser

pré-tratado, esse comportamento pode ser explicado pela baixa carga de sólidos utilizada

neste ponto. De acordo com Contreras & Smyrl (1981), o coeficiente de difusividade da

água depende do conteúdo de sólidos dissolvidos, ou seja, a difusividade cresce com a

diminuição de sólidos o que consequentemente permitiria uma penetração maior da solução

ácida e consequente solubilização da biomassa.

Quando houve um aumento na concentração de ácido de 1% (pontos 15, 16 e 17)

para 1,84% foi verificado um aumento de apenas 9% na solubilização da hemicelulose. Por

outro lado, o aumento na concentração de ácido de 0,2% para 1% promoveu um aumento

na taxa de solubilização de 174%.

De acordo com a Figura 5.1, a taxa de solubilização da lignina variou de 5,08% a

48,39%. De maneira geral, houve uma redução nos teores de lignina observados para o

material pré-tratado (10,51 a 19,19%) em comparação com o material “in natura”

(20,37g/100g) quando considerado o rendimento. Rocha et al. (2014), observaram

conteúdos constantes para a lignina durante o pré-tratamento de bagaço de caju com H2SO4

96

dilúído. Apesar da solubilização de uma parte da lignina, grande parte deste componente

permanece no material sólido remanescente (TAHERZADEH & KARIMI, 2008).

O teor de proteínas, cinzas e grupos acetil variaram de 1,47 a 3,50%; 2,76 a 3,51 e

0,27 a 0,78% respectivamente.

Na Figura 5.1, pode-se observar as taxas de solubilização encontradas após o pré-

tratamento com H2SO4 diluído. Estes valores foram encontrados a partir da relação entre a

quantidade do componente no caroço pré-tratado e no caroço “in natura”.

De acordo com a Figura 5.1, o principal componente lignocelulósico solubilizado no

pré-tratamento com ácido diluído foi a hemicelulose (30,65 a 91,83%) seguida pela

celulose (11,27 a 31,28%) e lignina (5,80 a 48,39%). O teor de proteína demonstrou um

intervalo de solubilização que variou de 5,74 a 65,75%. De acordo com Diaz et al. (2010),

aumentos na severidade do pré-tratamento diminuem as taxas de sólidos recuperados, como

uma consequência da solubilização dos extrativos e da fração de hemicelulose.

97

Figura 5.1. Solubilização dos componentes da biomassa após o pré-tratamento com H2SO4 diluído.

98

Oliveira (2010) encontrou para o pré-tratamento de palha de cana-de-açúcar taxas

máximas de solubilização de 95,3% e 46,1% para a hemicelulose e lignina,

respectivamente, em temperaturas que variavam de 180 a 195°C. Silva (2009) obteve

rendimentos menores que aqueles citados pelo último autor e foram de 66,9% e 31,9%

para a hemicelulose e lignina, respectivamente.

Zhang et al. (2011) obtiveram altas taxas de solubilização da hemicelulose (74,5%)

menores que as obtidas neste trabalho (máxima de 91,83%) a uma temperatura de 180°C

em uma concentração de H2SO4 de 1% durante 15 minutos. O mesmo autor utilizou

concentrações que variaram de 0,5% a 1% de H2SO4 e obtiveram taxas máximas de

solubilização da celulose (2% a 55%) maiores que as observadas neste trabalho.

Nas Tabelas 5.3 e 5.4 são apresentados os resultados obtidos para a análise

estatística realizada para os principais componentes recuperados na fase sólida: Celulose,

hemicelulose e grupos acetil. Na Tabela 5.3 é possível verificar as variáveis que foram

significativas a um nível de confiança de 90% e o efeito de cada uma delas nos teores dos

componentes analisados (Variáveis-respostas).

De acordo com a Tabela 5.3, a variável de maior influência na concentração de

celulose recuperada em fase sólida foi a concentração de ácido (L) a qual mostrou-se

significativa (p = 0,000729) a um nível de 90% de confiança. A mesma variável demonstra

valor negativo o que significa que aumentos na concentração de ácido reduziriam os teores

de celulose recuperada em fase sólida.

Tanto para a concentração de hemicelulose como também para a concentração de

grupos acetil, a variável significativa de maior influência também foi a concentração de

ácido (L) ambas com valores negativos o que demonstraria o mesmo comportamento que

foi observado para os teores de celulose. As variáveis: tempo (L) e a Carga de sólidos (Q)

foram consideradas estatisticamente significativas para todas as repostas analisadas.

99

Tabela 5-3 Resultados estatísticos obtidos para os principais componentes da fração sólida obtida após o pré tratamento com H2SO4 diluído.

Fatores

Celulose Hemicelulose Grupos Acetil

Efeitos Significância

estatística

(p)


estatística

(p)


estatística

(p)

Média 37,51346 0,000012 2,88732 0,000113 0,308270 0,001501

(X1)Concentração de ácido (L) -4,67506 0,000729 -7,97149 0,000013 -0,190258 0,003567

(X1) Concentração de ácido (Q) -1,96803 0,005187 3,48999 0,000089 0,089193 0,020100

(X2) Tempo (L) -0,65412 0,034399 -2,38454 0,000146 -0,198680 0,003185

(X2) Tempo (Q) 0,89711 0,021984 2,75142 0,000130 0,153715 0,006245

(X3) Carga de sólidos (L) 2,04549 0,003789 1,99424 0,000215 0,133180 0,007239

(X3) Carga de sólidos (Q) 0,84016 0,027508 1,43765 0,000525 0,021286 0,239205

(X1)(X2) 0,11250 0,565016 0,22089 0,028027 0,057500 0,059722

(X1)(X3) 1,03289 0,024048 0,32817 0,012994 0,012500 0,485201

(X2)(X3) 1,33520 0,014601 0,27793 0,017979 0,027500 0,202675

(*)Resultados analisados a um nível de confiança de 90%, logo p<0,1 = significativo;

**Variáveis significativas em negrito

De acordo com BARROS NETO et al. (2003), para que um modelo estatístico seja

considerado bom deve atender o requisito de passar em dois testes, os chamados testes F. O

Teste F1 representa a significância da regressão e permite dizer se o modelo é significativo

desde que o Fcalculado da regressão seja maior que o Ftabelado da regressão (5 a 10 vezes

maior). No caso do segundo teste, a condição de validade é inversa, ou seja, o Fcalculado

da falta de ajuste tem que ser no mínimo 5 (cinco) vezes menor que o Ftabelado para se

verificar se há falta de ajuste do modelo.

É importante ressaltar que na fração sólida o principal componente de interesse seria

o teor de celulose, que posteriormente seria hidrolisado enzimaticamente a

monossacarídeos. Dessa forma após a eliminação dos fatores considerados não-

significativos foi realizada a ANOVA apenas para o teor de celulose com o objetivo de

gerar um modelo que pudesse prever tais concentrações deste componente na fração sólida

no pós pré-tratamento.

100

Na Tabela 5.4 é possível observar os resultados da ANOVA realizada para os teores

de celulose presentes na fração sólida.

Tabela 5-4 Resultados da ANOVA realizada para os teores de celulose recuperada na fração sólida após o pré tratamento ácido no nível de 90% de confiança.

Fonte de variação Soma Quadrática

Graus de

Liberdade

Média Quadrática

F calculado

F tabelado

Regressão (R) 116,521 8 14,56517 13,01 2,58 Resíduos (r) 8,953 8 1,119126 Falta de ajuste (faj) 8,8466 6 1,47443 27,70 9,32 Erro puro (ep) 0,1064 2 0,05322 Total (T) 125,4744 16

% de variação explicada (R²) 92,86% % máxima de variação explicável 99,92%

Teste F1 calculado para verificar a significância estatística da regressão Teste F2 calculado para verificar a falta de ajuste do modelo

De acordo com a análise estatística, o modelo que poderia ser gerado a partir dos

resultados de celulose obtidos apresentou regressão significativa, mas o modelo não pode

ser considerado preditivo, pois a falta de ajuste também foi significativa (F calculado

superior ao F tabelado). Dessa maneira, nem o modelo nem as superfícies de respostas

puderam ser geradas.

O coeficiente de determinação (R2) obtido foi de 0,92, indicando que o modelo

explicou 92,86% da variação dos dados experimentais.

5.2. RESULTADOS OBTIDOS PARA A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA

FRAÇÃO LÍQUIDA APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM H 2SO4 DILUÍDO

As condições ácidas permitem uma maior decomposição do material

lignocelulósico, porém são gerados os chamados produtos de degradação dos

monossacarídeos (CHEUNG & ANDERSON, 1996). Estes compostos incluem o Furfural

que é resultante da desidratação das pentoses e o Hidroximetilfurfural (HMF) resultante da

decomposição das hexoses. Juntamente com o ácido acético formado a partir da ruptura das

ligações dos grupos acetil aos açúcares contribuirão para a inibição da posterior

101

fermentação, o que ocasionará a redução nas taxas de produção de etanol (ROMERO et al.,

2007).

A análise dos licores obtidos após o pré-tratamento foi realizada com o objetivo de

se verificar a viabilidade do processo com um visão mais completa uma vez que vários

trabalhos da literatura relatam a fermentação dos licores obtidos (principalmente a xilose)

para a produção de biohidrogênio num processo chamado fermentação negra (HAWKES et

al., 2008; CHEN et al., 2008) ou para a produção de etanol com a utilização de

microorganicos fermentadores de pentoses (QIAN et al., 2006; CHANDEL et al., 2007). ´

Dessa forma, a avaliação dos teores de inibidores produzidos durante o pré-

tratamento é de extrema importância e são obtidos a partir da análise dos licores após o pré-

tratamento os quais são mostrados na Tabela 5.5.

De acordo com a Tabela 5.5, a concentração de celulose presente no licor variou de

3,45 a 14,17g/100g . Mais de 90% da celulose foi recuperada na forma de glicose. O

aumento do tempo de 30 para 90 minutos nas condições de 1,5% de ácido e 5% de sólidos

promoveu uma redução no teor de celulose recuperada de 10,37% para 6,27%. Enquanto

que o aumento na concentração de ácido de 0,2% (condições do ponto 9) para 1%

(condições dos pontos 15, 16 e 17) aumentaram os teores de celulose recuperada de 5,86

para 7,91g/100g o que mostra o efeito do ácido na solubilização da celulose na fração

sólida e consequente passagem do mesmo para a fração líquida (licor) na forma de

monômeros e oligômeros.

102

Tabela 5-5 Balanço de massa da fração líquida proveniente do pré tratamento com H2SO4

Ponto de ensaio

Concentração de

ácido (% m/v)

Tempo de

tratamento (min)

Concentração de

Sólidos (%)

Celulose (g/100g)

Hemicelulose (g/100g)

Grupos acetil

(g/100g)

Proteínas (g/100g) Total

1 0,5 30 5 5,69±0,05 6,61±0,05 2,03±0,05 1,01±0,11 15,34 2 0,5 30 15 6,22±0,09 6,63±0,05 2,0±0,03 0,89±0,13 15,77 3 0,5 90 5 6,20±0,12 6,89±0,05 2,04±0,03 0,80±0,13 15,92 4 0,5 90 15 6,33±0,09 6,98±0,05 2,23±0,05 0,88±0,15 16,42 5 1,5 30 5 10,87±0,09 15,58±0,05 2,36±0,05 0,86±0,17 29,67 6 1,5 30 15 9,18±0,11 14,67±0,05 2,36±0,05 1,91±0,09 28,11 7 1,5 90 5 13,49±0,11 16,02±0,05 2,35±0,09 1,95±0,09 34,20 8 1,5 90 15 9,05±0,12 14,88±0,05 2,37±0,11 2,48±0,09 28,78 9 0,2 60 10 6,00±0,20 5,56±0,05 2,38±0,03 0,25±0,03 14,18 10 1,84 60 10 15,26±0,02 16,54±0,05 1,99±0,01 2,07±0,03 35,86 11 1 9.5 10 5,26±0,21 6,77±0,05 2,67±0,03 1,06±0,05 15,77 12 1 111 10 7,19±0,23 16,32±0,05 2,16±0,02 2,69±0,05 28,36 13 1 60 1,6 8,29±0,15 17,35±0,05 2,13±0,01 2,83±0,05 30,60 14 1 60 18 3,65±0,15 9,81±0,05 2,13±0,03 1,13±0,15 16,73 15 1 60 10 8,30±0,17 15,34±0,05 2,13±0,03 2,28±0,09 28,05 16 1 60 10 8,15±0,11 15,24±0,05 2,12±0,05 2,03±0,08 27,54 17 1 60 10 8,73±0,11 15,29±0,05 2,12±0,05 1,89±0,08 28,03


103

De acordo com os resultados mostrados na Tabela 5.5, é possível perceber que o

maior constituinte presente nos licores foi a hemicelulose com taxas que variaram de

5,56 a 17,35 g/100g. É possivel verificar que o aumento na concentração de ácido de

1% para 1,84% (comparação da média dos pontos 15, 16 e 17 com o ponto 10) elevou

os níveis desse componente no licor, que passaram de 15,29g/100g (média) para

16,54g/100g. Esse comportamento foi verificado também por Rocha et al. (2014)

quando foi variada a concentração de H2SO4 com uma concentração de sólido de 15%

de bagaço de caju. Em geral, o licor proveniente do tratamento com H2SO4 diluído

apresenta um elevado teor de hemiceluloses. Dependendo do substrato e das condições

utilizadas, entre 80% a 95% dos açúcares hemicelulósicos podem ser recuperados com o

prétratamento com ácido diluído (BALAT, 2011).

Em relação ao teor de celulose, foi verificado um intervalo que variou de 3,65 a

15,26g/100g. Enquanto que o teor de proteína variou de 0,25 a 2,83% e também

aumentou quando houve aumento no tempo e na concentração de H2SO4. O que

também foi observado para os grupos acetil recuperados nos licores.

Na Figura 5.2, é possível verificar que a maior parte da celulose foi recuperada

na forma de glicose (mais de 90%) e a hemicelulose na forma de xilose (mais de 90%)

que, foi por sua vez, o principal componente presente no licor, com valores que

variaram entre 2,90 a 25,38 g/L (Tabela 5.6).

Figura 5.1 Concentração de açucares na fração líquida do pré-tratamento (licor)

104

O principal açúcar presente no licor é a xilose, de tal forma que qualquer pré-

tratamento realizado deve ser realizado tendo-se em mente a possibilidade de fermentar

a fração líquida (principalmente xilose). Dessa forma, a condição ótima seria aquela que

possibilitasse a presença de uma grande quantidade de xilose no liquor e baixa

quantidade de inibidores. O ponto 8 (1,5% de ácido; 90 minutos e 15% de sólidos) foi

aquele que melhor atendeu a primeira condição.

O teor de glicose recuperado no hidrolisado variou de 1,2 a 14,9 g/L sendo o

ponto 10 ( Figura 5.2) a condição (1,84% de ácido; 60 minutos e 10% de sólidos) que

permitiu uma maior recuperação de glicose. Já para a recuperação de xilose a melhor

condição foi aquela observada para o ponto 8 (1,5% de ácido, 90 minutos e 15% de

sólidos). Não foram detectados índices de arabinose nos licores analisados.

A possibilidade de fermentar os licores provenientes do pré-tratamento ácido

enfrenta o obstáculo da presença dos chamados inibidores da fermentação que também

foram quantificados e tem seus teores apresentados jutamente com os teores de xilose e

glicose recuperada na Tabela 5.6.

Tabela 5-6 Resultados dos teores de xilose e inibidores recuperados no licor. Ponto

De ensaio

Fator de

Severidade

Xilose (g/L)

Glicose (g/L) Furfural

(g/L) HMF (g/L)

Ácido Acético (g/L)

1 0,19 3,3800 2,3000 0,0070 0,0370 1,2551 2 0,19 10,9400 9,2200 0,0060 0,0530 4,1561 3 0,673 3,2800 2,9800 0,0060 0,0710 1,4085 4 0,673 11,3800 9,2000 0,0008 0,1110 4,6791 5 0,795 8,4500 5,2000 0,0010 0,0600 1,3457 6 0,795 25,3800 13,5000 0,0020 0,1340 4,6372 7 1,273 8,4500 6,4000 0,0050 0,0740 1,4852 8 1,273 24,8800 13,2000 0,0010 0,1320 4,6582 9 0,096 6,0900 5,9900 0,0010 0,0100 2,9218 10 1,196 17,3800 14,9000 0,0010 0,1830 3,2286 11 - 7,1100 5,2100 0,0020 0,0310 2,5312 12 1,014 17,7800 7,1300 0,0009 0,2210 3,3402 13 0,746 2,9000 1,1200 0,0091 0,0010 0,3271 14 0,746 19,3000 6,3200 0,0020 0,0570 5,5243 15 0,746 17,1900 8,1200 0,0009 0,0270 3,2007 16 0,746 17,0900 8,1000 0,0010 0,0240 3,2704 17 0,746 17,0500 8,5400 0,0010 0,0260 3,2565

De acordo com os resultados obtidos, verifica-se que o aumento no fator de

severidade do pré-tratamento gerou maiores taxas de xilose recuperada e inibidores. O

105

maior teor de xilose recuperada foi obtido para o ponto 6 que apresentou o valor de

0,795 de fator de severidade.

Os níveis de inibidores Furfural e HMF observados encontraram-se entre

0,0008 a 0,0091 g/L e 0,0010 a 0,221 g/L, respectivamente. De acordo com Felipe et al.

(1993), apenas concentrações acima de 1g/L de HMF, são reportadas como inibitórias

ao metabolismo microbiano. Já Taherzadeh et al. (2000) reportaram que o crescimento

de Saccharomyces cerevisiae em meio sintético foi inibido em 70% com a presença de

4g/L de HMF, e em 89% com 4g/L de furfural. Foi observado pelos mesmos autores

que na presença de furfural (2g/L) e HMF (2g/L), que o crescimento deste

microrganismo foi inibido completamente o que poderia sugerir um efeito sinergístico

de inibição destes dois compostos. De maneira geral, os teores de furfural e HMF

encontrados seriam menores que aqueles relatados como inibitórios.

Os teores de acido acético mostraram valores que variaram entre 0,3271 a

5,5243g/L em sua maioria acima do limite de 0,3 g/L, considerado inibitório para a

maioria dos microrganismo até o momento estudados (HELLE et al., 2003) o que

exigiria uma etapa de detoxificação para uma maior viabilidade de fermentação dos

licores obtidos. Todavia, Delgenes et al. (1996) observou que concentrações de 10 g/L

de ácido acético levaram a uma redução de apenas 27% na produção de etanol pela

S.cerevisiae. Djioleu et al. (2012) realizou o pré-tratamento com H2SO4 diluído e

observou a produção de compostos inibitórios tais como furfural, HMF, ácido fórmico e

ácido acético em um intervalo que variou 0,1 to 32,3 g/L. De maneira geral, o pré-

tratamento com ácido diluído produz menos produtos de degradação do que o pré-

tratamento com ácido concentrado (ALVIRA et al., 2010).

É possível observar que aumentos no fator de severidade de maneira geral

levaram a aumentos nos teores de inibidores. Este fato fica evidenciado quando se

comparam os pontos 9, 10 e 15.

A análise estatística do planejamento experimental mostrado na Tabela 5.5 foi

realizada para os teores de xilose, furfural e HMF e os resultados são apresentados na

Tabela 5.7. A análise estatística revelou que a variável carga de sólidos (L) foi aquela

que mais influenciou no teor de xilose presente no licor analisado, seguida pela

concentração de ácido (L). A variável concentração de ácido (L) apresentou o valor do

efeito positivo (Efeito = 8,59252), e foi significativa em um limite de confiança de 90%

(p < 0,1 = 0,000012). O valor positivo indica que aumentos na concentração de ácido

106

levariam a aumentos dos teores de xilose no licor. Entretanto, a variável concentração

de ácido (Q) também foi significativa (p<0,1 = 0,000086) e apresentou valor negativo o

que indica que a concavidade da superfície de resposta estaria voltada para baixo o que

mostra a presença de um ponto de máximo (condição ótima), a partir do qual se observa

uma redução dos teores de xilose a partir de novos aumentos na concentração de ácido.

Este comportamento também foi verificado no trabalho de Lu et al. (2009), que variou a

concentração de ácido de 0,5 a 2% a 180°C e por Sun & Cheng (2005) que utilizaram as

concentrações de ácido de 0,6 a 1,5% a 120°C.

Tabela 5-7 Resultados dos efeitos estimados e significância das respostas: xilose, HMF e Furfural obtidos para o pré-tratamento com H2SO4 diluído.

Fatores Xilose HMF Furfural Efeitos Significância

estatística (p)

Efeitos Significância estatística

(p)

Efeitos Significância estatística

(p) Média 17,01614 0,000003 0,000829 0,001598 0,024564 28,0006 (X1)Concentração de ácido (L)

8,59252 0,000012 -0,001636 0,000373 0,059899 71,6455

(X1) Concentração de ácido (Q)

-3,78294 0,000086 0,000501 0,005008 0,051656 54,8260

(X2) Tempo (L) 2,62639 0,000119 -0,000748 0,001731 0,061524 74,5997

(X2) Tempo (Q) -2,90523 0,000120 0,000697 0,002349 0,069102 77,1618

(X3) Carga de sólidos (L) 11,22954 0,000007 -0,002988 0,000112 0,041865 50,0751

(X3) Carga de sólidos (Q) -3,87273 0,000077 0,003797 0,000088 0,001998 2,1206

(X1)(X2) -0,21000 0,054208

0,002300 0,000315 -0,020000 -18,5164

(X1)(X3) 4,42500 0,000087 0,000800 0,002594 0,019000 17,5906

(X2)(X3) 0,01000 0,072791 -0,002300 0,000315 0,002000 1,8516

De acordo com a Tabela 5.7, todas as variáveis analisadas foram consideradas

significativas a 90% de significância para os teores de HMF. E as variáveis de maior

efeito nos teores de HMF foram as variáveis carga de sólidos (L) e carga de sólido (Q).

A primeira apresentou valor negativo o que demonstra que aumentos na concentração

dos sólidos diminuiríam os teores de HMF. Com relação à segunda variável, observou-

se um valor positivo, o que significa que a superfície de resposta apresenta concavidade

voltada para cima e que aumentos na carga de sólidos reduziriam os teores de HMF até

um ponto mínimo, a partir do qual, novos aumentos gerariam elevações nos teores de

HMF.

Em relação aos teores de furfural, as variáveis que tiveram maiores efeitos

foram: tempo (L) e (Q), ambas com valores positivos, o que indica que aumentos no

107

tempo levariam a aumentos nos teores dessa resposta e que existiria a presença de um

ponto máximo, a partir do qual, novos aumentos de tempo levariam a reduções nos

teores de furfural.

Na Figura 5.3, é possível observar o gráfico de Pareto no qual se verifica como

cada variável do processo contribuiu para os teores de xilose recuperada nos licores

obtidos a partir do pré-tratamento com H2SO4 diluído em um nível de significância de

90% (p=0,1).

Gráfico de pareto para o teor de Xilose (licor)

,0055303

-,116136

1,902279

-1,93782

-2,39837

2,44715

-2,4553

6,139141

8,023223

p=,1

2Lby3L

1Lby2L

(2)Tempo (minutos)(L)

Tempo (minutos)(Q)

concentração de ácido (%)(Q)

1Lby3L

Carga de sólidos (%)(Q)

(1)concentração de ácido (%)(L)

(3)Carga de sólidos (%)(L)

1,902279

-1,93782

-2,39837

2,44715

-2,4553

6,139141

8,023223

Figura 5.2 Gráfico de Pareto para os teores de xilose nos licores obtidos a partir do pré-tratamento com H2SO4 diluído.

Como o principal interesse no licor proveniente do pré-tratamento com H2SO4

diluído é a xilose foi realizada a análise de variância para verificar a possibilidade de

gerar um modelo que pudesse prever esses teores. Os resultados da análise de variância

realizada para os teores de xilose (Tabela 5.6) estão apresentados na Tabela 5.8.

108

Tabela 5-8 Resultados da ANOVA para o teor de xilose presente no licor (hidrolisado)

Fonte de variação Soma

Quadrática

Graus de

Liberdade

Média Quadrática

F calculado

F tabelado

Regressão (R) 800,260 8,000 100,0325 17,48 2,59 Resíduos (r) 45,776 8,000 5,721965 Falta de ajuste (faj) 45,7653 6 7,6276 1466,83 9,32 Erro puro (ep) 0,0104 2 0,0052 Total (T) 846,0354 16 % de variação explicada (R²) 94,59% % máxima de variação explicável 100,00%

De acordo com a Tabela 5.8, o modelo foi considerado significativo pois o

Fcalculado da regressão foi maior que o Ftabelado. No entanto, o modelo não pode ser

considerado preditivo, pois a falta de ajuste também foi significativa (F calculado

superior ao F tabelado). Dessa forma, não foi possível gerar superfícies de repostas e

nem modelo a partir dos resultados obtidos. O alto valor de F calculado para a falta de

ajuste é devido ao fato de que à média quadrática (MQ) do erro puro apresenta um valor

muito inferior a média quadrática da falta de ajuste (devido à boa repetição dos ensaios

nos pontos centrais); isso faz com que a razão entre eles resulte num valor muito alto. O

coeficiente de determinação (R2) obtido foi de 0,94 o que indica que o modelo explicou

94% da variação dos dados experimentais.

5.3. RESULTADOS OBTIDOS PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DO

CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM H 2SO4 DILUÍDO

Na Tabela 5.9, são mostrados resultados obtidos com a hidrólise enzimática da

biomassa do caroço de açaí pré-tratado.

109

Tabela 5-9 Resultados obtidos para os teores de glicose (g/g de biomassa crua), conversão enzimática e rendimento global.

Ensaio

Concentração de

ácido (% m/v)

Tempo de

tratamento (min)

Concentração de

Sólidos (%)

Fator de

Severidade

g glicose/

g caroço

cru

Conversão (%)

Rendimento

Global (%)

1 0,5 30 5 0,195 0,20 44,91 39,51 2 0,5 30 15 0,195 0,15 34,88 30,51 3 0,5 90 5 0,673 0,22 51,92 44,74 4 0,5 90 15 0,673 0,20 44,84 39,16 5 1,5 30 5 0,795 0,28 72,63 56,30 6 1,5 30 15 0,795 0,28 71,99 55,67 7 1,5 90 5 1,273 0,17 46,94 33,77 8 1,5 90 15 1,273 0,28 68,43 56,08 9 0,2 60 10 0,096 0,16 35,52 31,07 10 1,84 60 10 1,196 0,25 73,17 50,53 11 1 9.5 10 - 0,15 34,69 30,93 12 1 111 10 1,014 0,31 72,93 62,04 13 1 60 1,6 0,746 0,31 76,11 61,57 14 1 60 18 0,746 0,26 56,77 52,70 15 1 60 10 0,746 0,27 65,80 54,72 16 1 60 10 0,746 0,28 67,42 56,16 17 1 60 10 0,746 0,27 66,23 54,54

Nesta etapa do trabalho, uma determinada massa do material pré-tratado foi

hidrolisada enzimaticamente com o objetivo de se avaliar o efeito do pré-tratamento

com H2SO4 diluído na conversão de celulose em glicose e os resultados são mostrados

na Tabela 5.9.

De acordo com a Tabela 5.9, é possível observar que a conversão variou de

34,69 a 76,11%. O ponto 13 (1% de ácido; 60 minutos e 1,6% de sólidos) foi aquele que

permitiu a maior taxa de conversão. Na comparação entre os pontos 9 (0,2% de ácido,

60 minutos e 10% de solidos) e 15, 16 e 17 (1% de ácido, 60 minutos e 10% de solidos)

é possível observar que houve um aumento na conversão de 35,52% para 66,48%

(média). Esse comportamento é novamente observado quando é realizado um novo

aumento na concentração de ácido no ponto 10 (1,84% de ácido, 60 minutos e 10% de

sólidos) o que resultou em uma taxa de conversão de 73,17%. Pode-se afirmar que a

concentração de ácido promoveu maior remoção da hemicelulose e consequentemente,

houve maior efetividade no ataque enzimático, observado na forma de maiores

resultados de conversão enzimática. De acordo com Marasabessy et al. (2012), o

110

aumento na concentração de H2SO4 aumenta a solubilização das pentoses o que

proporciona um aumento na acessibilidade enzimática a biomassa.

É possível verificar que o ponto 13 (fator de severidade = 0,746) que mostrou

maior valor de conversão enzimática (76,11%). Este comportamento está diretamente

relacionado ao fato de que houve, para este ponto uma alta taxa de solubilização da

hemicelulose e da lignina o que contribuiu para o aumento da efetividade do ataque

enzimático. Na Figura 5.4, pode-se verificar o gráfico que mostra os valores de

conversão enzimática e rendimento global obtidos para os ensaios realizados.

Figura 5.3 Resultados obtidos para conversão e rendimento global obtidos para o material pré-tratado.

De maneira geral, o pré-tratamento com ácidos diluídos tem um efeito pouco

efetivo na remoção da lignina e na modificação da estrutura cristalina da celulose, o que

leva a atribuir o aumento na conversão enzimática pelo aumento da acessibilidade das

enzimas a celulose devido à remoção da hemicelulose (DJIOLEU et at., 2012).

A partir da Tabela 5.9, também é possível observar que o rendimento global

variou de 30,51 a 62,04%. Na mesma tabela, são mostrados os resultados obtidos para

os teores de glicose (g de glicose/ g de bagaço cru) que variaram de 0,15 a 0,31. A título

de facilitar a comparação com dados encontrados na literatura para a hidrólise

enzimática, escolheu-se realizar o tratamento estatístico para os resultados de glicose (g

111

de glicose/ g de bagaço cru). A análise estatística dos resultados obtidos para glicose (g

de glicose/ g de bagaço cru) foi realizada utilizando o erro puro e o software Statistica

(Statsoft, v. 7.0) e é mostrada na Tabela 5.10.

Tabela 5-10 Análise dos efeitos principais e de interação das variáveis do pré-tratamento com H2SO4.

Fatores Efeito estimado

Erro puro

t(2) Significância estatística (p)

Efeitos principais Média 0,276321 0,002555 108,1651 0,000085 (X1) Concentração de ácido (%)(L) 0,061755 0,002435 25,3658 0,001551 (X1) Concentração de ácido (%)(Q) -0,061006 0,002744 -22,2355 0,002016 (X2) Tempo (min)(L) 0,032619 0,002402 13,5822 0,005377 (X2) Tempo (min)(Q) -0,036081 0,002608 -13,8355 0,005183 (X3) Carga de sólidos (L) -0,005626 0,002435 -2,3110 0,147038 (X3)Carga de sólidos (Q) 0,001117 0,002744 0,4071 0,723362

Efeitos de interação

X1 X2 -0,045038 0,003145 -14,3190 0,004842 X1 X3 0,045346 0,003145 14,4170 0,004777 X2 X3 0,032962 0,003145 10,4796 0,008983

*Valores estatisticamente significativos a 90% de confiança (p < 0,10); **Valores em negrito: valores significativos a 90% de confiança.

De acordo com a Tabela 5.10, é possível verificar que, com exceção das

variáveis carga de sólidos (L) e (Q), todas as outras variaveis e suas interações foram

consideradas significativas a 90% de confiança. A variável concentração de ácido (L)

foi aquela que mostrou maior efeito (efeito = 0,061755) nos resultados de glicose (g de

glicose/ g de bagaço cru). A mesma variável demonstrou valor positivo o que significa

que aumentos nos teores de ácido promoveriam aumentos nos valores de glicose (g de

glicose/ g de bagaço cru) obtidos pela hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada. A

concentração de ácido (Q) foi a segunda variável com maior efeito considerada

significativa a qual demonstrou valor (-0,061006) negativo o que indica que a superfície

de resposta apresentaria concavidade voltada para baixo com a presença de um ponto

máximo da resposta analisada.

Na Figura 5.5, é mostrado o gráfico de Pareto no qual se verifica o quanto cada

uma das variáveis influenciou nos teores de g de glicose/g de bagaço cru obtidos após a

hidrólise enzimática. É possível verificar que as variáveis concentração de ácido (L)

seguidas pela variável tempo (Q), foram as que mais mostraram influência nos teores de

glicose liberada/ g de caroço cru.

112

Gráfico de Pareto para o teor de g de glicose/ g de caroço cru

10,47962

13,58296

-14,319

14,41702

-14,5563

-23,2535

25,3696

p=,1

2Lby3L

(2)Tempo (minutos)(L)

1Lby2L

1Lby3L

Tempo (minutos)(Q)

concentração de ácido (%)(Q)

(1)concentração de ácido (%)(L)

Figura 5.4 Gráfico de Pareto para o Teor de g de glicose/ g de caroço cru.

Na Tabela 5.11, são observados os resultados obtidos para a ANOVA realizada

para os resultados dos teores de glicose liberada após a hidrólise enzimática do bagaço

pré-tratado com H2SO4.

É possível verficar que o modelo foi signifcativo uma vez que passou no teste F

da regressão (Fcalculado > Ftabelado). Porém, o modelo e as superfícies de respostas

não puderam ser gerados em virtude da falta de ajuste significativa observada para o

planejamento, pois não passou no teste F da falta de ajuste (Fcalculado > Ftabelado). De

acordo com Tabela 5.11, o R2 apresentou valor de 0,7626 o que demonstra que o

modelo explicou 76,26% da variação dos dados experimentais.

113

Tabela 5-11 Análise da variância (ANOVA) para a concentração de glicose liberada após a hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com H2SO4.


Quadrática

Graus de

Liberdade

Média Quadrática

F calculado

F tabelado

Regressão (R) 0,038 7,000 0,005459 17,48 2,50 Resíduos (r) 0,012 9,000 0,001322 Falta de ajuste (faj) 0,011859 7 0,001694 85,62 9,35 Erro puro (ep) 0,000040 2 0,000020 Total (T) 0,050115 16


*Valores calculados pelo software STATISTICA 7.0. 5.4. RESULTADOS OBTIDOS PARA AS CINÉTICAS DE HIDRÓLISE

ENZIMÁTICAS DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉTRATADO COM H 2SO4

DILUÍDO

Os resultados obtidos pelas cinéticas da hidrólise enzimática realizada para os

pontos do planejamento experimental do estudo do pré-tratamento com H2SO4 são

mostrados nas Figuras 5.6 a 5.13. É possível verificar pelos gráficos que a glicose é o

açúcar que aparece em maior quantidade e que demonstra maior crescimento nos

primeiros 30 minutos de hidrólise a partir do qual tem seu conteúdo em níveis

constantes ou com ligeiros decréscimos ou acréscimos. De maneira geral, a celobiose

apresentou níveis constantes e reduzidos durante todos os ensaios.

Figura 5.5 Gráfico das Cinéticas enzimáticas dos ensaios 1e 2.

114

Figura 5.6 Gráfico das Cinéticas enzimáticas dos ensaios 3 e 4.

Figura 5.7 - Gráfico das Cinéticas enzimáticas dos ensaios 5 e 6.


115




116

Figura 5.12 Gráfico das Cinéticas enzimáticas dos ensaios 15, 16 e 17.


De acordo com o Capítulo 5, foram observados que o pré-tratamento com H2SO4

permitiu um percentual de recuperação de sólidos que variou de 58,32% a 79,85%.

O pré-tratamento reduziu em até 45,3% os níveis de celulose para a condição

considerada mais severa, que foi a de 1,84% de ácido; 60 minutos e 10% de sólidos.

Para esta mesma condição foram observados os menores teores de celulose residual

(31,13g/100g), e maior índice de solubilização (31,28%), sendo considerado indesejável

para posterior hidrólise enzimática.

Foi verificado que o aumento na severidade do pré-tratamento, principalmente

como resultado do aumento na concentração de ácido promoveu maior remoção da

fração celulósica e hemicelulósica. Grande parte da fração celulósica que foi recuperada

no licor apresentou-se na forma de glicose, já o principal carboidrato removido pelo pré-

tratamento com H2SO4 diluído foi a hemicelulose, recuperada em mais de 90% na forma

de xilose no licor.

Após o tratamento estatístico, foi observado que a variável mais significativa

para os teores de celulose, hemicelulose e grupos acetil foi a variável concentração de

ácido (%) (L).

Para a fração líquida, foi observada que a concentração de ácido (%)(L) também

foi aquela que mais influenciou nos níveis finais de xilose recuperada no licor obtido

após o pré-tratamento.

Em relação a conversão enzimática, foi possível verificar que a condição do

ensaio 8 (1,5% de ácido; 90 minutos e 15% de sólidos) foi a que permitiu maior valor

de conversão (68,43%). Todavia para este trabalho o ensaio 16 (1%, 60 minutos e 10%

de sólidos) foi considerado como o de melhor condição, em função do menor tempo de

117

processo e menor concentração de ácido, apresentando o valor de conversão de

67,42%).

As cinéticas enzimáticas revelaram um comportamento padrão para os teores de

glicose e celobiose. A glicose foi o açúcar que apareceu em maior quantidade e

demonstrou maior crescimento nos primeiros 30 minutos de hidrólise. De maneira geral

a celobiose apresentou níveis constantes e reduzidos durante todos os ensaios

realizados.

118

CAPÍTULO 6 - DESLIGNIFICAÇÃO ALCALINA COM NaOH DO C AROÇO

DE AÇAÍ PRÉ-TRATAMENTO COM H 2SO4 DILUÍDO

No Capítulo 6, através da aplicação da técnica estatística de planejamento

experimental é avaliada a remoção da lignina (deslignificação com NaOH 1%) ainda

presente no caroço de açaí pré-tratado no Capítulo 5 com H2SO4 diluído. As frações

sólidas e líquidas obtidas após a deslignificação foram caracterizadas quimicamente.

Para a fração líquida, avaliou-se o teor de lignina residual e para a demonstração do

correto balanço de bassa também foi realizada a caracterização química para os teores

de celulose e hemicelulose. A fração sólida, após ser quimicamente caracterizada, foi

utilizada para os estudos de conversão enzimática. São ainda mostradas as cinéticas de

hidrólise enzimática obtidas para cada um dos ensaios do planejamento experimnetal

aplicando a deslignificação.

6. RESULTADOS DA DESLIGNIFICAÇÃO DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ -TRATADO COM H 2SO4 DILUÍDO

6.1. RESULTADOS DA CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA FRAÇÃO SÓLIDA APÓS A DESLIGNIFICAÇÃO.

As Tabelas 6.1 e 6.2 mostram os resultados da composição química do caroço de

açaí pré-tratado e deslignificado considerando o rendimento em relação ao caroço pré-

tratado com H2SO4 diluído. De acordo com a Tabela 6.1, após a deslignificação, os

sólidos recuperados variaram de 32,48% a 78,33% nas condições de 3,79% de sólidos,

1% de NaOH a 75°C durante 60 minutos (Ensaio 7) e 46,21% de sólidos, 1% NaOH a

75°C durante 60 minutos (Ensaio 8), respectivamente. Oliveira (2010) deslignificou

palha de cana-de-açúcar pré-tratada com H2SO4 diluído a 10% de sólidos com uma

solução de NaOH a 1,5% e obteve, a 190°C após 60 minutos, o rendimento máximo de

76%. Esse rendimento é próximo do rendimento máximo que foi obtido neste trabalho

no ensaio 8 (46,21% de sólidos a 75°C) que foi de 78%. O maior rendimento observado

pode ser resultado das menores concentração de NaOH e temperatura de tratamento e

maiores concentrações de sólidos.

É possível observar, que os balanços de massas de maneira geral fecharam em

no mínimo 97,55% indicando que os procedimentos de análise foram bem executados.

119

De acordo com a Tabela 6.1, são verificados elevados teores de celulose

remanescente para o ensaio 6 (condição: 110,36°C e 25% de sólidos) que foi de

80,10%. O menor teor de hemicelulose foi encontrado para o ensaio 7 (condição

mencionada acima) e foi de 0,75%. Já o menor valor de lignina encontrado foi

verificado para a condição do ensaio 7 e foi de 9,7%.

Ainda de acordo com a Tabela 6.1, pode-se comparar os valores de celulose após

a deslignificação com os valores de celulose do material “in natura” e que foi pré-

tratado apenas com ácido e verificar que o teor de celulose remanescente aumenta para a

maioria dos pontos. Já para os teores de hemicelulose e lignina, verifica-se um

decréscimo para a maioria dos ensaios quando estes são comparados.

Entretanto, só é possível fazer um análise mais profunda com base na Tabela 6.2

na qual são mostrados os resultados do planejamento de deslignificação na base do

rendimento. A Tabela 6.2 considerou para o seu cálculo o rendimento apenas da

deslignificação em relação ao material pré-tratado.

De acordo com a Tabela 6.2, pode ser verificar que o conteúdo de celulose

variou em um intervalo de 24,91 a 49,66% e que a condição do ensaio 8 (46,21% de

sólidos a 75°C) foi aquela que permitiu maior manutenção do conteúdo de celulose após

a deslignificação do material pré-tratado com H2SO4 diluído. O ensaio 7 (3,79% de

sólidos a 75°C) foi aquele que mostrou maior redução (62%) do conteúdo de celulose

em relação ao material pré-tratado com H2SO4 diluído.

Ainda de acordo com a Tabela 6.2, quando o teor de sólidos aumentou de 3,79%

(Ensaio 7) para 46,21% (Ensaios 8) na condição de temperatura de 75°C, foi observada

uma elevação no teor de celulose remanescente de 99,31%. Quando os sólidos foram

aumentados para 25% (Ensaios 9, 10 e 11) a elevação foi de 91%. O aumento da

temperatura de deslignificação de 75°C para 110°C com 25% de sólidos levou a uma

diminuição nos teores de celulose de aproximadamente 10%. Esse comportamento náo é

desejável uma vez que a manutenção da fração celúlósica é de grande interesse para as

etapas posteriores de hidrólise enzimática e fermentação envolvidas na produção de

etanol.

Para os teores de hemicelulose do material deslignificado, é possível verificar a

partir da Tabela 6.2 teores que variaram de 0,24 a 3,29%. A condição que proporcionou

menor teor de hemicelulose foi mais uma vez a do ensaio 7, que foi aquela que utilizou

a menor carga de sólidos (3,79%). Quando comparado com o material “in natura” e

120

com aquele pré-tratado apenas com ácido, a deslignificação causou uma redução nos

teores de hemicelulose de 98% e 75,5% respectivamente.

A condição do ensaio 7 (3,79% de sólidos) mostrou menor teor de lignina

(3,15%) após a deslignificação. A redução na concentração de sólidos de 40% para 10%

na temperatura de 50°C reduziu os teores de lignina em aproximadamente 46%,

enquanto que o aumento na temperatura de 39,64°C (ensaio 5) para 110,36°C (ensaio 6)

na carga de sólidos de 25% promoveu uma redução de aproximadamente 64% nos

teores de lignina. Os teores dos demais componentes variaram de 0,03 a 0,13%, 3,74 a

4,72% e 0,76 a 3,74% para os grupos acetil, cinzas e proteínas, respectivamente.

121

Tabela 0-1 Tabela da composição da fração sólida do material deslignificado (Sem correção para a base do rendimento). Ensaios Sólido

recuperado (%)

Celulose (%)

Hemicelulose (%)

Grupos acetil (%) Lignina (%) Cinzas (%)

Proteínas (%)

Extrativos (%)

Total (%)

In natura - 45,3 18,2 3,01 20,37 3,5 4,3 9,5 98,52 Pré-tratado ácido 65,5 57,33 4,47 0,45 26,7 5,15 3,45 - 97,55

1 65,70 73,1±0,65 1,5±0,43 0,11±0,13 14,33±0,22 7,2±0,15 4,67±0,21 - 101,02 2 76,25 64,8±0,34 3,8±0,33 0,10±0,22 22,8±0,35 5,4±-,25 3,88±0,13 - 100,78 3 60,80 78,7±0,33 1,12±0,56 0,12±0,21 10,8±0,12 7,5±0,33 2,9±0,41 - 101,14 4 70,50 69±0,22 2,23±0,43 0,11±0,32 18,2±0,22 6,7±0,34 3,83±0,22 - 100,07 5 69,60 67,2±0,55 2,2±0,23 0,18±0,34 20,3±0,16 6,4±0,35 3,67±0,31 - 99,95 6 52,48 80,1±0,43 0,98±0,23 0,09±0,23 9,8±0,16 8,1±0,36 2,02±0,24 - 101,09 7 32,48 76,7±0,21 0,75±0,22 0,10±0,22 9,7±0,12 11,5±0,22 2,35±0,21 - 101,1 8 78,33 63,4±0,31 4,2±0,45 0,22±0,43 22,7±0,22 5,9±0,25 3,86±0,17 - 100,28 9 62,00 75,2±0,18 2,1±0,40 0,13±0,34 13,2±0,33 6,8±0,38 2,81±0,15 - 100,24 10 63,20 75,1±0,21 1,9±0,39 0,13±0,55 13,1±0,24 6,7±0,41 3,23±0,23 - 100,16 11 62,40 75,5±0,19 2±0,25 0,13±0,44 13,2±0,22 6,9±0,38 3,4±0,30 - 101,13

122

Tabela 0-2 Tabela da composição da fração sólida do material deslignificado (na base do rendimento) em relação ao material pré-tratado com ácido diluído.

Ensaios Celulose* Hemicelulose* Lignina* Grupos acetil* Cinzas* Proteínas* Total *

1 48,03±0,35 0,99±0,21 9,41±0,33 0,07±0,21 4,73±0,15 3,07±0,12 66,23 2 49,41±0,34 2,90±0,15 17,39±0,22 0,08±0,32 4,12±0,13 2,96±0,21 76,78 3 47,85±0,23 0,68±0,20 6,57±0,21 0,07±0,19 4,56±0,11 1,76±0,12 61,42 4 48,65±0,12 1,57±0,22 12,83±0,12 0,08±0,12 4,72±0,19 2,70±0,13 70,47 5 46,77±0,21 1,53±0,15 14,13±0,23 0,13±0,11 4,45±0,20 2,55±0,20 69,43 6 42,04±0,23 0,51±0,13 5,14±0,24 0,05±0,10 4,25±0,17 1,06±0,12 53,01 7 24,91±0,18 0,24±0,51 3,15±0,33 0,03±0,14 3,74±0,16 0,76±0,14 32,8 8 49,66±0,15 3,29±0,22 17,78±0,22 0,17±0,12 4,62±0,12 3,02±0,13 78,37 9 46,62±0,20 1,30±0,34 8,18±0,12 0,08±0,20 4,22±0,10 1,74±0,15 62,06 10 47,46±0,21 1,20±0,33 8,28±0,21 0,08±0,21 4,23±0,11 2,04±0,22 63,21 11 47,11±0,16 1,25±0,22 8,24±0,20 0,08±0,22 4,31±0,14 2,12±0,12 63,03

Memória do cálculo para base do rendimento: celulose (ensaio 1) 73,1 (Teor de celulose obtido sem correção x 0,6570 (Rendimento da deslignificação) = 48,03

* g/100g de biomassa in natura.

123

É possível verificar na literatura que, ao realizar processos sequenciais alguns

autores mostram os resultados da composição química do material tratado, levando em

consideração o efeito somatório das etapas realizadas sobre o material utilizado. Essa

forma de análise permite ter uma visão mais ampla do processo completo.

Dessa forma, na Tabela 6.3, pode-se observar os resultados da caracterização

química do caroço de açaí após o pré-tratamento ácido e posterior deslignificação, no

qual é considerado para seu cálculo os rendimentos de ambas as etapas em relação ao

material “in natura”.

Assim, pode-se observar que o rendimento variou de 21,28 a 51,31%. A

condição do ensaio 7 foi a que demonstrou menores valores de hemicelulose (0,16 de

g/100g de biomassa in natura) e lignina (2,06 g/100g de biomassa “in natura”)

respectivamente, o que indica uma maior remoção destes componentes para tal

condição, no entanto para esta mesma condição foi verificado também a menor

concentração de celulose (16,32%).

Para os demais componentes, foi possível verificar intervalos de 0,07 a 0,17%;

2,45 a 3,5% e 0,29 a 4,3% para os teores de grupos acetil, cinzas e proteínas.

Na Figura 6.1, são mostrados os resultados da solubilização dos principais

componentes de interesse após a deslignificação com base no material pré-tratado,

enquanto que, na Figura 6.2 são mostrados os resultados de solubilização considerando

como material de entrada o material “in natura”, a partir do qual podemos novamente

visualisar o efeitos do pré-tratamento e deslignificação sobre o material “ in natura".

124

Tabela 0-3 Balanço de massa para a composição do caroço de açaí pré-tratado e deslignificado em relação ao material “in natura”

Ensaios Rendimento %

Celulose * Hemicelulose* Lignina* Grupos acetil* Cinzas* Proteínas* Total*

In natura - 45,3 18,2 3,01 20,37 3,5 4,3 98,52 1 43,03 31,46±0,29 0,65±0,19 6,17±0,33 0,15±0,3 3,10±0,15 1,67±0,10 43,2 2 49,94 32,36±0,25 1,90±0,19 11,39±0,35 0,17±0,29 2,70±0,11 1,60±0,13 50,12 3 39,82 31,34±0,35 0,45±0,21 4,30±0,29 0,13±0,21 2,99±0,19 0,75±0,22 39,96 4 46,18 31,86±0,32 1,03±0,21 8,40±0,3 0,16±0,2 3,09±0,12 1,79±0,19 46,33 5 45,59 30,64±0,33 1,00±0,2 9,25±0,33 0,12±0,22 2,92±0,15 1,78±0,11 45,71 6 34,37 27,53±0,24 0,34±0,17 3,37±0,33 0,12±0,23 2,78±0,2 0,35±0,15 34,49 7 21,28 16,32±0,35 0,16±0,17 2,06±0,25 0,07±0,23 2,45±0,12 0,29±0,15 21,35 8 51,31 32,53±0,24 2,15±0,23 11,65±0,23 0,12±0,31 3,03±0,1 1,95±0,19 51,43 9 40,61 30,54±0,31 0,85±0,23 5,36±0,31 0,13±0,32 2,76±0,15 1,10±0,12 40,74 10 41,40 31,09±0,24 0,79±0,21 5,42±0,32 0,13±0,29 2,77±0,11 1,32±0,11 41,52 11 40,87 30,86±0,25 0,82±0,22 5,40±0,27 0,13±0,28 2,82±0,13 0,98±0,19 41,01

Memória do cálculo para base do rendimento: celulose (ensaio 1) 73,1 (Teor de celulose obtido sem correção x 0,655 (Rendimento do pré-tratamento

com H2SO4 diluído) x 0,6570 (rendimento da deslignificação) = 31,46%;

* g/100g de biomassa “in natura”.

125

De acordo com a Figura 6.1, a solubilização da celulose levando em

consideração como material de entrada o material pré-tratado variou de 13,37 a 56,54%

(ensaios 8 e 7). No entanto como já foi mencionado é possível avaliar o efeito das duas

etapas (pré-tratamento e deslignificação) sobre o material “in natura” e dessa forma ter

uma visão mais completa do processo. Dessa forma verifica-se a partir da Figura 6.2 um

intervalo de solubilização de 28,19 a 63,98% para os ensaios 8 e 7, respectivamente.

A maior solubilização observada para o ensaio 7 foi resultante da baixa carga de

sólidos utilizada. Oliveira (2010) verificou que após a deslignificação e pré-tratamento

com ácido diluído da palha de cana-de-açúcar a 10% de sólidos e realizada em reator,

ocorreram perdas médias de 35% de celulose e máximas de 45%. Enquanto Silva (2009)

realizou o pré-tratamento com ácido diluído e posterior deslignificação em condições

semelhantes às realizadas neste trabalho e observou perdas de celulose em torno de 30%

para a palha da cana. É possível verificar que o caroço de açaí apresentou valores de

solubilização semelhantes as que foram encontradas na literatura, conforme observado

na Figura 5.2.

16,23 13,81 16,54 15,15 18,42 26,6856,54

13,37 18,67 17,21 17,82

77,95

35,18

84,7764,83 65,74

88,49

94,55

26,40

70,87 73,14 72,08

64,74

34,89

75,41

51,94 47,08

80,74

88,20

33,40

69,35 68,99 69,15

0

50

100

150

200

250

300

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

So

lub

iliz

açã

o

do

s c

om

po

ne

ne

ts (

%)

Ensaios

Celulose Hemicelulose Lignina

Figura 0.1 Solubilização dos componentes lignocelulósicos calculados em relação ao material pré-tratado com ácido diluído.

126

30,56 28,56 30,81 29,66 32,37 39,2263,98

28,19 32,59 31,37 31,88

96,45 89,5797,55 94,34 94,49

98,15

99,12

88,1695,31 95,68 95,51

11,47 22,9414,66

11,60 16,6420,45

30,10

13,51

21,10 20,76 19,42

0

50

100

150

200

250

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

So

lub

iliz

açã

o

do

s c

om

po

ne

nte

s (

%)

Ensaios

Celulose Hemicelulose Lignina

Figura 0.2 Solubilização dos componentes lignocelulósicos calculados em relação ao material “in natura”.

De acordo com a Figura 6.1, é possível verificar que o componente que sofreu

maior solubilização foi a hemicelulose com intervalo de 26,40 a 94,55% quando

considerado como material de entrada, o caroço de açaí pré-tratado com ácido diluído.

Em seguida, foi a lignina que mostrou intervalo de 33,40 a 88,20%. É possível verificar,

o quão efetivo os pré-tratamentos foram quando observados seus efeitos em conjunto

sobre o material “in natura” (Figura 6.2).

De acordo com a Figura 6.2, no caso da hemicelulose, o intervalo de

solubilização mais uma vez, foi o que apresentou maiores resultados e variaram de

88,16 a 99,12%. Enquanto que a lignina apresentou um intervalo que variou de 44,10 a

89,87%. Silva (2009) observou 88,8% e 77,9% de solubilização para a hemicelulose e

lignina, respectivamente, para a palha de cana. Oliveira (2010) observou mais de 90%

da remoção da hemicelulose e valores próximos a 80% para a remoção da lignina após a

utilização das duas etapas de pré-tratamento e deslignificação. Esse valores, são

semelhantes aos que foram obtidos pelas condições de pré-tratamento e deslignificação

aplicadas ao caroço de açaí. A alta solubilidade de lignina e hemicelulose, foi sem

dúvida, devido à clivagem das ligações α-éter entre a lignina e as hemiceluloses, durante

o tratamento alcalino (XIAO et al., 2001).

Quando as fibras são sujeitas ao tratamento alcalino com NaOH, a hemicelulose

é parcialmente hidrolisada e a lignina é despolimerizada, o que leva à formação de

127

açúcares e compostos fenólicos que são solúveis em água (FERNFINDEZ et al., 1999)

e que serão transferidos, em sua maioria, para a fração líquida obtida após os pré-

tratamento aplicados a biomassa. A composição química da fração líquida obtida após a

deslignificação, em geral, costuma ser rica em lignina, a qual seria o principal

componente de interesse na mesma. Dessa forma, optou-se por quantificar apenas a

lignina precipitada na fração líquida. A Tabela 6.4 mostra os valores de lignina

precipitada obtidos na fração líquida após a deslignificação do caroço pré-tratado com

hidróxido de sódio (NaOH) do material pré-tratado com H2SO4 diluído.

6.2. RESULTADOS OBTIDOS PARA A LIGNINA PRECIPITADA

RECUPERADA NA FRAÇÃO LÍQUIDA APÓS A DESLIGNIFICAÇÃO DO

CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM H 2SO4 DILUÍDO

A fração líquida obtida após a deslignificação realizada conforme o

planejamento mostrado na Tabela 3.6 (planejamento de deslignificação) foi

caracterizada apenas para o ponto considerado ótimo (ensaio 9) para fins de

demonstração do correto fechamento de balanço de massa. O único componente

caracterizado no licor para todos os ensaios foi a lignina recuperada, visto que seria o

componente de interesse existente nessa fração. Na Figura 6.3 são mostrados os valores

de lignina recuperada na fração líquida após a deslignificação do caroço de açaí pré-

tratado com NaOH.

Figura 0.3 Lignina recuperada no licor obtido após a deslignificação do caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído.

128

De acordo com a Figura 6.3 foram encontrados elevados valores de lignina

recuperada na fração líquida, o que indica uma elevada eficiência da etapa de

deslignificação. Os valores observados variaram de 19,15 a 83,46%. A condição do

ensaio 7 (3,79% de sólidos, 1% de NaOH a 75°C durante 60 minutos) foi aquela que

demonstrou maior teor de lignina recuperada, provavelmente como resultado direto da

efetiva deslignificação da fração sólida observada nesta condição.

6.3. RESULTADOS OBTIDOS PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DO

CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM H 2SO4 DILUÍDO E

DESLIGNIFICADO

Na Tabela 6.4, são mostrados resultados obtidos com a hidrólise enzimática da

biomassa do caroço de açaí pré-tratado (na condição considerada ótima) e

deslignificado.

Tabela 0-4 Resultados obtidos com a hidrólise enzimática da biomassa do caroço de açaí pré-tratado (na condição considerada ótima) e deslignificado.

Ensaio Temperatura °C

Concentração de

Sólidos (%)

g glicose/g caroço pré-

tratado

Conversão (%)

Rendimento Global (%)

1 50 10 0,42 79,62 66,62 2 50 40 0,36 64,86 55,84 3 100 10 0,47 87,75 73,15 4 100 40 0,38 70,69 59,91 5 39,64 25 0,40 76,21 62,10 6 110,36 25 0,36 77,41 56,69 7 75 3,79 0,26 94,76 41,13 8 75 46,21 0,34 62,40 53,99 9 75 25 0,42 80,41 65,32 10 75 25 0,40 75,78 62,67 11 75 25 0,41 78,38 64,34

Os valores obtidos para a concentração de glicose variaram de 0,26 a 0,47 g de

glicose/g de caroço pré-tratado com ácido diluído. Enquanto que os valores da

conversão variaram de 62,40 a 94,76%. A condição do ensaio 7 (3,79% de sólidos a

75°C) foi a que permitiu maior conversão. O valor médio de conversão ótima obtido

para o material que foi apenas pré-tratado com ácido diluído foi de 66,48%. Após a

deslignificação foi possível obter um aumento máximo para essa conversão de até

129

42,53%, no ensaio 7, o qual demonstrou o valor de conversão já mencionado de

94,76%.

Os resultados da análise estatistica obtida para os valores g de glicose/ g de

caroço pré-tratado com H2SO4 diluído são mostrados na Tabela 6.5.

Tabela 0-5 Análise dos efeitos principais e de interação das variáveis de deslignificação do caroço pré-tratado com H2SO4 diluído.

Fatores Efeito estimado

Erro puro


Efeitos principais Média 0,408338 0,004931 82,8102 0,000146 (X1) Temperatura °C (L) 0,004707 0,006039 0,7794 0,517338 (X1) Temperatura °C (Q) 0,003100 0,007187 0,4314 0,708252 (X2) Concentração de sólidos (%)(L) -0,009301 0,006040 -1,5400 0,263450 (X2) Concentração de sólidos (%)(Q) -0,072274 0,007190 -10,0522 0,009752

Efeitos de interação

(X1) (X2) -0,007824 0,008541 -0,9161 0,456320

De acordo com a Tabela 6.6, pode-se verificar que a única variável considerada

significativa e também de maior influência no processo de deslignificação do caroço

pré-tratado foi a concentração de sólidos (Q) com valor negativo de 0,072274 o que

indica que a superfície de resposta apresentaria concavidade voltada para baixo com a

presença de um ponto de máximo da resposta analisada.

Na Tabela 6.7 são observados os resultados obtidos para a ANOVA realizada

para os resultados dos teores de glicose liberada após a hidrólise enzimática do bagaço

pré-tratado com H2SO4 e deslignificado.

Tabela 0-6 Resultados da ANOVA realizada os teores de glicose liberada após a hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com H2SO4 e deslignificado.

Fonte de variação Soma Quadrática

Graus de

Liberdade

Média Quadrática

F calculado

F tabelado

Regressão (R) 0,008 1 0,008274 3,73 3,36 Resíduos (r) 0,020 9 0,002216 Falta de ajuste (faj) 0,019798 7 0,002828 38,77 9,35 Erro puro (ep) 0,000146 2 0,000073 Total (T) 0,028218 10


É possível verficar que o modelo não foi signifcativo, uma vez que o valor do

Fcalculado não foi no mínimo 5 vezes maior que o valor do Ftabelado (Teste F da

130

Regressão). Além disso nem o modelo ou as de respostas puderam ser gerados em

virtude da falta de ajuste significativa observada para o planejamento, pois não passou

no teste F da falta de ajuste (Fcalculado > Ftabelado). De acordo com tabela da

ANOVA (Tabela 6.6) o R2 apresentou valor de 0,2932 o que demonstra que o modelo

explicou 29,32%% da variação dos dados experimentais.

6.4. RESULTADOS OBTIDOS PARA OS PERFIS DE HIDRÓLISES

ENZIMÁTICAS DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM H 2SO4

DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO

Nas Figuras 6.4 a 6.8 são mostrados os perfis de hidrólise enzimática realizadas

para o caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído e sequencialmente deslignifcado.

O comportamento observado foi semelhante aqueles verificados no Capítulo 5 para as

cinéticas de hidrólise do caroço de açaí pré-tratado apenas com H2SO4 diluído.

De maneira geral, é possível verificar que os níveis de glicose (g/L) aumentam

com o tempo até niveis de estabilidade em função do consumo do substrato. Esse

comportamento se repete para todos os demais ensaios inclusive para os ensaios 9, 10 e

11 que foram realizados para o ponto central e apresentam as barras de erros verificados

para a repetição dos mesmos. Em relação ao teor de celobiose, foram verificados níveis

estáveis para todos os ensaios.

Figura 0.4 Cinéticas de hidrólise enzimática realizada para os ensaios 1 e 2.

131




132

Figura 0.8 Cinética enzimática realizada para os pontos centrais 9.

6.5. BALANÇO DE MASSA PARA A ETAPA DE DESLIGNIFICAÇÃO DO

MATERIAL PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO E POSTERIORMENTE

DESLIGNIFICADO

Nas Figuras 6.9 e 6.10 são mostrados os balanços de massa obtidos para a

melhor condição do pré-tratamento com H2SO4 diluído (ensaios 15, 16 e 7 - 1% de

ácido, 60 min e 10% de sólidos) e do caroço após deslignificação seqüencial (ensaio 9,

10 e 11 – 75°C e 25% de sólidos). A caracterização destes pontos foi realizada para a

demonstração do correto fechamento do balanço de massa.

133

Figura 0.9 Balanço de massa para o pré-tratamento com H2SO4 diluído do caroço de açaí.

134

Figura 0.10 Balanço de massa para o pré-tratamento com H2SO4 diluído e deslignificação sequencial do caroço de açaí.

135


De acordo com o Capítulo 6, os sólidos recuperados variaram de 32,48% a

78,33% nas condições de 3,79% de sólidos, 1% de NaOH a 75°C durante 60 minutos

(Ensaio 7) e 46,21% de sólidos, 1% NaOH a 75°C durante 60 minutos (Ensaio 8),

respectivamente. Quando comparado com o material “in natura” e com aquele pré-

tratado apenas com ácido, a deslignificação causou uma redução nos teores de

hemicelulose de 98% e 75,5% respectivamente.

A condição do ensaio 7 (3,79% de sólidos) foi a que mostrou menor teor de

lignina (3,15%) após a deslignificação. O aumento da temperatura de deslignificação

levou a uma diminuição nos teores de celulose e a condição que proporcionou menor

teor de hemicelulose foi mais uma vez a do ensaio 7. A baixa carga de sólidos do ensaio

7, foi aquela que permitiu a maior solubilização observada durante a deslignificação.

O componente que sofreu maior solubilização foi a hemicelulose com intervalo

de 26,40 a 94,55%%, seguida pela lignina que mostrou intervalo de 33,40 a 88,20%.

Foram encontrados elevados valores de lignina recuperada na fração líquida o que

indica uma elevada eficiência da etapa de deslignificação.

A única variável considerada significativa e também de maior influência no

processo de deslignificação do caroço pré-tratado foi a concentração de sólidos (Q).

A condição do ensaio 7 (3,79% de sólidos a 75°C) foi a que permitiu maior

conversão enzimática do caroço deslignificado. Entretanto, para este trabalho foi

considerada como condição ótima aquela observada para o ensaio 9 (75°C e 25% de

sólidos) em função do ótimo valor de 80,41%, obtido para conversão enzimática e

possibilidade de se trabalhar com maiores cargas de sólidos.

As cinéticas de hidrólise enzimática do material deslignificado mostraram um

comportamento semelhante àqueles verificados para o Capítulo 5.

136

CAPÍTULO 7 - MUDANÇAS ESTRUTURAIS E VISUAIS NO CARO ÇO DE

AÇAÍ APÓS OS TRATAMENTOS APLICADOS

Neste capítulo 7, serão apresentados os efeitos resultantes dos tratamentos

aplicados ao caroço de açaí (pré-tratamento com H2SO4 diluído, deslignificação com

NaOH e hidrólise enzimática) observados visualmente e através das análises de

microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de difração de raio-X

(DRX) e espectroscopia no infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR).

7. MUDANÇAS ESTRUTURAIS E VISUAIS NO CAROÇO DE AÇAÍ E PODER CALORÍFICO APÓS TRATAMENTOS

7.1. ANÁLISE VISUAL DO CAROÇO DE AÇAÍ

Nas Figuras 7.1, 7.2 e 7.3, é possível verificar a biomassa do caroço de açaí

acondicionada antes do pré-tratamento e o efeito desta etapa na mudança de coloração

do material.

Figura 7.1 Biomassa do caroço de açaí “in natura” (A) e pré-tratada (B).

137

Figura 7.2 Caroço de açaí pré-tratado com 0,2% (A); 1,0% (B) e 1,84%(C) de H2SO4.

Figura 7.3 Caroço de açaí pré-tratado com 1,84% e deslignificado.

De acordo com as figuras 7.1 e 7.2, é possível observar um escurecimento do

material pré-tratado em função da concentração de ácido utilizada no pré-tratamento, o

que fica mais evidente quando comparado com o material “in natura”. Curreli et al.

(2002) afirma que este comportamento está relacionado com a catálise ácida das

ligações do complexo lignina-carboidrato e com a formação de compostos de

degradação dos carboidratos uma vez que tanto a lignina como tais produtos apresentam

a coloração marrom escura que se intensifica a medida que a concentração de ácido

aumenta. É possível verificar ainda uma maior cominuição do material pré-tratado em

relação ao material “ in natura” como se o material tivesse sido triturado novamente e

reduzido a sua granulometria. Este comportamento é novamente resultado da ação do

ácido nas estruturas do material. Quando comparado com o material pré-tratado com

ácido, observou-se que após a sua deslignificação (Figura 7.3) houve uma descoloração

138

em relação ao material “in natura” e ao material pré-tratado (verificação de pontos

brancos na Figura 7.3). De acordo com Mussato et al. (2006), este comportamento é

observado em função da remoção da lignina.

7.2. ANÁLISE DE MICROSCOPIA ELETRÕNICA DE VARREDURA (MEV )

DO CAROÇO DE AÇAÍ “IN NATURA”, APÓS PRÉ-TRATAMENTO,

DESLIGNIFICAÇÃO E HIDRÓLISE ENZIMÁTICA

Nas Figuras 7.4 (a e b) são apresentadas as fotomicrografias obtidas do caroço

de açaí “in natura” após o pré-tratamento com H2SO4 diluído.

Figura 7.4 a e b Fotomicrografias do caroço de açaí “in natura” (a e b da esquerda pra direita). Os aumentos e barras de comparação estão apresentadas em cada figura.

É possível verificar que o material encontra-se parcialmente íntegro com

pequenos pontos de cortes e rompimentos resultantes da moagem a qual o material foi

submetido. Quando comparado com a Figura 7.5 (a e b), verifica-se que o tratamento

ácido provoca uma parcial desorganização na estrutura do material com rompimentos e

fissuras provocadas ao material como resultado da quebra de ligações entre carboidratos

e lignina (HENDRIKS & ZEEMAN, 2009).

Nas Figuras 7.5 (a e b) são apresentadas as fotomicrografias obtidas após o pré-

tratamento com H2SO4 diluído.

139

Figura 7.5 a e b Fotomicrografias após o pré-tratamento com H2SO4 diluído (a e b da esquerda pra direita). Os aumentos e barras de comparação de estão apresentadas em cada figura.

Na Figura 7.6 (a e b) são mostrados as fotomicrografias obtidas após o pré-

tratamento com H2SO4 diluído e deslignificação alcalina com NaOH.

Quando se observa as Figuras 7.6 (a e b) é claramente verficada uma grande

desorganização da estrutura da biomassa. Após a deslignificação o material torna-se

muito mais poroso e amorfo se comparado com o material “in natura” ou com aquele

tratado apenas com o H2SO4. Semelhante ao que foi verificado por Zúñiga (2010) a alta

heterogeneidade do material foi um fator que dificultou a avaliação mais eficiente da

estrutura da biomassa pela técnica do MEV.

Figura 7.6 a e b Fotomicrografias após o pré-tratamento com H2SO4 diluído e deslignificado com NaOH (a e b da esquerda pra direita). Os aumentos e barras de comparação de estão apresentadas em cada figura.

140

O material pré-tratado com H2SO4 diluído e deslignificado o qual foi submetido

à hidrólise enzimática também foi analisado e mostrou uma estrutura mais densa e

compacta provavelmente pelo fato de as enzimas atacarem as áreas mais superficiais do

material, que foram expostas durante os pré-tratamentos aplicados. Dessa forma, o

material resultante seria aquele que não foi possível hidrolisar e, consequentemente,

mais compacto e cristalino, conforme é possível verificar na Figura 7.7.

Figura 7.7 Fotomicrografias após o pré-tratamento com H2SO4 diluído e deslignificado e posterior hidrólise enzimática.

7.3. RESULTADOS DA ANÁLISE DE CRISTALINIDADE POR DIFRAÇÃ O

DE RAIO X (DRX)

O grau de cristalinidade (IC%) é determinado de forma rápida e sem necessidade

de padrões pela espectroscopia de difração de raio-X (DRX) que pode ser usado como

um indicativo da natureza e da reatividade de materiais lignocelulósicos. Segundo

Krassig (1993) o (IC%) pode ser definido como a razão entre as intensidades dos picos

correspondentes à região cristalina e à região amorfa.

Os resultados das análises de DRX mostrados na Figura 7.8 e os resultados dos

índices de cristalinidade (Tabela 7.1) foram obtidos a partir do caroço de açaí “in

natura”; do caroço pré-tratado com H2SO4 (10% de sólido, 1% de ácido por 60 minutos

a 121°C) e também do material pré-tratado nas condições anteriores e deslignificado

sequencialmente na condição de 25% de sólidos, 1% de peróxido a 75°C. As condições

mencionadas foram aquelas consideradas como ótimas para a avaliação de ambos os

pré-tratamentos.

141

Na Figura 7.8, são mostradas as curvas de difração raio-X a partir das quais

foram calculados os índices de cristalinidade observados na Tabela 7.1.

O índice de cristalinidade apresenta grande influência na hidrólise enzimática de

materiais lignocelulósicos, principalmente quando este material é pouco conhecido e há

o interesse na sua utilização como matéria-prima para a produção de etanol. Tem sido

usado extensivamente como uma medida da proporção de celulose cristalina em relação

ao total de celulose do material analisado. Além disso, tem sido utilizado como uma

ferramenta de avaliação do efeito dos pré-tratamentos existentes em reduzir a

cristalinidade do material em questão.

A partir da análise dos materiais estudados, foi verificado que o índice de

cristalinidade do caroço de açaí foi de 47,05% e foi menor que os valores citados por

Rodriguez-zuñiga (2010) para o bagaço de cana (58,18%) e por Ayala (2012) para a

palha da cana-de-açúcar (49,01%). O índice de cristalinidade após o pré-tratamento

ácido (na condição analisada) reduziu em apenas 11% seu valor em comparação com o

material “in natura”. Este resultado foi bem semelhante ao citado por Samuel et al.

(2012) que observou que pré-tratamento com H2SO4 diluído promoveu uma redução de

12% na cristalinidade da biomassa de “switchgrass”. Para o material pré-tratado e

sequencialmente deslignificado a redução foi de 64% em comparação ao material “in

Figura 7.8 Curvas de difração obtidas para o caroço de açaí.

142

natura”. Conforme mostrado na Tabela 7.1, os índices de cristalinidade corrigidos para a

base do rendimento foram de 41,64% para o material pré-tratado apenas com ácido e de

17,01% quando realizada a deslignificação.

Dessa forma, é possível afirmar que a deslignificação foi altamente eficaz em

reduzir a cristalinidade do caroço de açaí, o que pode ter ocorrido muito mais pela

remoção da lignina e hemicelulose do que pela conversão da celulose I em celulose II.

Isto pode ser evidenciado pelo fato de que os picos observados para os difratogramas do

material “in natura” assim como também aqueles obtidos para os pré-tratados e

deslignificados mostraram picos à 2θ graus que permaneceram na faixa de 16° (plano

002) e 18° (101) e que correspondem a picos típicos da celulose I (ASS et al., 2006;

TERINTE et al., 2011). Não é possível afirmar que a redução da cristalinidade foi

gerada por uma significativa conversão da celulose I em celulose II.

Ben Sghaier et al. (2012) tratou fibras de Agave americana e observou que

concentrações a partir de 5% de NaOH causaram decréscimo na cristalinidade das fibras

de celulose em torno de 15% por levar a um fenômeno de inchamento das fibras após a

penetração do agente alcalino. Os mesmos autores afirmam que, durante esse pré-

tratamento, as fibras de celulose são rearranjadas de celulose I (cadeias alinhadas em

paralelo) para celulose II (anti-paralelas). Este último comportamento não foi verificado

para a mercerização do caroço de açaí provavelmente em função da baixa concentração

de agente alcalino utilizado. Pesquisas anteriores relataram que a transformação de

celulose I em celulose II ocorre em concentrações de NaOH acima de 6% (BORYSIAK

& GARBARCZYK, 2003; MOIGNE & NAVARD, 2010).

Tabela 7-1 Índices de cristalinidade (CrI) obtidos para o caroço de açaí “in natura”, pré-tratado com H2SO4 diluído e para o caroço pré-tratado com ácido e sequencialmente deslignificado.

Caroço de açaí Índice

de cristalinidade

Rendimento no

pré-tratamento (%)

Corrigido pelo pré-tratamento

(%)

In natura 47,05 - - Pré-tratado com ácido diluído 64,07 65 41,64 Pré-tratado e deslignificado 71,35 23,85 17,01

143

7.4. RESULTADOS DA ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM

TRASFORMADA DE FOURIER (FTIR)

A espectrofotometria na região do infravermelho refere-se a radiação de

excitação a números de onda entre 4000 e 400 cm-1. De acordo com Regiane (2000) a

diferença de intensidade entre o feixe de referência e o feixe transmitido mede a

quantidade de radiação absorvida; os números de onda de absorção referem-se ao modo

de vibração e a diferença do momento dipolar na mesma ligação. Assim, é possível

determinar a função química do componente presente.

O FTIR foi usado para demonstrar a estrutura física e os grupos funcionais do

caroço de açaí analisado. Dessa forma, na Figura 7.10, é possível verificar os espectros

de FTIR na região de 4000 a 400 cm-1 para os materiais:”in natura”, pré-tratado com

H2SO4 (10% de sólido, 1% de ácido por 60 minutos a 121°C) e também do material pré-

tratado nas condições anteriores e deslignificado sequencialmente na condição de 25%

de sólidos, 1% de peróxido a 75°C.

144

Figura 7-10 Espectro de FTIR para o caroço de açaí “in natura”, apenas pré-tratado e pré-tratado e sequencialmente deslignificado. Cada um dos números a seguir apresenta os picos identificados e discutidos: (1) 3411; (2) 2921; (3) 2875; (4) 2852; (5) 1743 (6) 1629 (7)1517 (8)1445 (9)1378 (10) 1321; (11)1245; (12) 1160; (13) 128; (14)1099; (15) 1010; (16)1060; (17) 937; (18)871; (19) 804.

145

É possível verificar que as principais características desses espectros são

atribuídas à presença de lignina, hemicelulose e celulose componentes típicos de fibras

naturais. Nesse tipo de material, modificado ou não, é comum o aparecimento na faixa

de 3100-3500cm-1, uma banda larga, associada à deformação axial do grupo O-H. Dessa

forma o espectro das fibras do caroço de açaí “in natura” foi caracterizado por uma

banda em 3411 cm-1, referente ao estiramento vibracional dos grupos OH presentes na

celulose (MERLINI, 2011). Quando esta banda é observada para os materiais que foram

tratados ou deslignificados percebemos que elas apresentaram uma drástica diminuição

em termos de absortividade exatamente pela remoção da celulose pelos tratamentos

aplicados.

A faixa entre 2894-2950 cm-1 pode ser atribuída ao alongamento de C-H

semelhante ao que foi observado por Khalil et al. (2001). Nessa faixa foram, observados

as bandas com picos em 2921 e 2875 e 2852 cm-1 que estão relacionadas ao estiramento

C-H alifático dos grupos metila (CH3) e metileno (CH2) (SINHA & ROUT, 2008).

Importante ressaltar que os dois últimos picos se tornam mais evidentes para os dois

materiais que sofreram tratamentos.

Assim como observado por Kim et al. (2003), foi possível verificar que a

intensidade das bandas de uma grande número de picos característicos da lignina

(intervalo de 1502–1600 cm-1) foi maior para o material pré-tratado apenas com ácido e

muito maior para o pré-tratado e sequencialmente deslignificado. Isso comprova o efeito

dos tratamentos aplicados para a remoção da lignina presente no material.

O pico da banda 1743 cm-1 no material “in natura” é característico do

estiramento da banda carbonila (C=O), atribuído a hemicelulose (OWEN & THOMAS,

1989) presente no caroço de açaí e que apresentou menor intensidade para os materiais

submetidos ao pré-tratamento e deslignificação, o que evidenciou a remoção desse

componente. O pico da banda em 1629 cm-1 representa para todos os espectros de água

residual (NACOS et al., 2006; TROEDEC et al., 2008).

A diferença de intensidade entre as bandas 1510 e 1600 cm-1 pode ser utilizada

para diferenciar as ligninas de coníferas (alto teor de grupos guaiacila) das ligninas de

folhosas (teor de siringila maior que na conífera) (OWEN & THOMAS, 1989; COLOM

et al., 2003; FENGEL; WEGENER, 2003; MARABEZI, 2009). Comparando as bandas

existentes no caroço de açaí, é possível observar que a intensidade na banda de 1600

146

cm-1 é maior, o que indica que as ligninas do material analisado possuem maiores

quantidades de unidades siringila.

De acordo com a literatura, pode-se atribuir os picos de 1517, 1445, 1378 e 1321

cm-1, ao estiramento da ligação C-C no anel aromático, deformação assimétrica do

grupo metila, alongamento C-H nos polissacarídeos e a deformação angular da hidroxila

(-OH) presente no anel aromático da lignina (NACOS et al., 2006; TROEDEC et al.,

2008). Já a banda ilustrada no pico de 1245cm-1 está relacionada com estiramento dos

grupos acetil da hemicelulose, porém a lignina também contribui para a formação dessa

banda. A banda dos picos 1160, 1128 e 1099 cm-1 indicaria um C-O-C alongamento

assimétrico em celulose e hemicelulose.

Os picos de 1010, 1060 e 1164 cm-1 (não identificados na Figura 7.10) são

característicos do alongamento dos grupos C-O; C=C e C-C-O alongamento

característico da celulose, hemicelulose e lignina (SILLS et al.,2012). Os valores de

absortividade para esses picos no material pré-tratado apenas com o ácido mostrou

valores mais elevados que aqueles observados para o material “in natura” e

sequencialmente deslignificado. Isso ocorreu pelo fato de que após a remoção da

hemicelulose durante o pré-tratamento com ácido, a lignina tem sua estrutura

evidenciada pela ausência do componente hemicelulose. É possível, verificar que após a

deslignificação as absortividades nesses picos são drasticamente reduzidas, as quais

mostraram valores menores que aquelas observadas tanto para o material “in natura”

como também para aquele que foi apenas pré-tratado com H2SO4.

Finalmente os picos de 937 e 871 e 804cm-1, observados para todos os

materiais, poderiam ser atribuídos ao estiramento C-O-C presente nas ligações β-

glucosídicas (SINDHU et al., 2010; CIOLACU et al., 2011; YOON et al. (2012).


Foi possível concluir que visualmente ocorreram modificações na coloração do

material após os pré-tratamentos aplicados. Para o caroço de açaí tratado apenas com

H2SO4 diluído, foi observado um escurecimento do material em relação ao material “in

natura” e para o caroço deslignificado houve a descoloração do material com a presença

de pontos brancos.

147

Os resultados do MEV mostraram que após o pré-tratamento ácido houve uma

desorganização morfológico-estrutural em relação ao caroço “in natura”. Para a etapa de

deslignificação, foi observado o acentuamento desta desorganização. Entretanto, o

material pré-tratado e posteriormente hidrolisado enzimaticamente mostrou uma

estrutura novamente organizada e compacta. Em relação ao índice de cristalinidade, foi

verificado que os tratamentos aplicados ao caroço de açaí foram eficazes em reduzir a

cristalinidade do mesmo. A técnica por FTIR permitiu confirmar a presença dos

principais constituintes do caroço de açaí e as mudanças causadas pelos tratamentos

aplicados ao caroço de açaí.

148

CAPÍTULO 8 - VARIAÇÃO DA CARGA DE SÓLIDOS E AGITAÇÃ O NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAÍ

Neste capítulo, é realizada a análise e tratamento estatístico dos resultados

obtidos para o planejamento experimental realizado para verificar o efeito da variação

da carga de sólidos e agitação na hidrólise enzimática do caroço de açaí que foi apenas

pré-tratado com H2SO4 diluído e também para aquele que foi sequencialmente

deslignificado.

8. RESULTADOS DA VARIAÇÃO DA CARGA DE SÓLIDOS E

AGITAÇÃO NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAÍ

8.1. ANÁLISE E TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS RESULTADOS

OBTIDOS PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇ AÍ PRÉ-

TRATADO APENAS COM H 2SO4 DILUÍDO

Neste capítulo, as cargas de sólidos e agitação durante a hidrólise enzimática do

caroço de açaí obtido nas melhores condições do pré-tratamento com H2SO4 diluído

(1% de ácido; 10% de sólidos a 121°C durante 60 minutos e 150 rpm) e que também foi

sequencialmente deslignificado na melhor condição (1% de NaOH; 25% de sólidos a

75°C durante 60 minutos e 150rpm) foram submetidas a um estudo de variação das

cargas de sólidos e influência da agitação.

Na Tabela 8.1, são mostrados os resultados obtidos para os valores de gramas de

glicose liberados após a hidrólise enzimática do caroço de açaí que foi apenas pré-

tratado com ácido diluído (g de glicose/ g de caroço “in natura”) e do caroço que foi

pré-tratado e deslignificado (g de glicose/ g de caroço pré-tratado).

149

Tabela 8-1 Resultados obtidos para o planejamento experimental utilizado para avaliar o efeito da agitação e da concentração de sólidos na liberação de glicose após a hidrólise enzimática do caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído e/ou pré-tratado e deslignificado.

Ensaio Agitação (rpm)

Concentração de sólidos

(%)

g glicose/g de

caroço “in

natura”

g glicose/g caroço pré-

tratado

1 100 5 0,21 0,34 2 150 5 0,21 0,33 3 200 5 0,23 0,35 4 100 10 0,18 0,33 5 150 10 0,19 0,34 6 200 10 0,20 0,34 7 100 15 0,16 0,26 8 150 15 0,19 0,28 9 200 15 0,19 0,29 10 150 10 0,19 0,33 11 150 10 0,19 0,33 12 150 10 0,18 0,34

De acordo com a Tabela 8.1, foi possível observar que os maiores valores

obtidos para os teores de g de glicose / g de material foram observados para o ensaio 3

que corresponde as condições de 200 rpm de agitação e 5% de sólidos e os valores

foram de 0,23g de glicose/ g de caroço “in natura”, para o material que foi pré-tratado

com H2SO4 diluído e de 0,35 g de glicose/ g de caroço pré-tratado para o material que

foi pré-tratado com ácido e também deslignificado.

De maneira geral, os valores variaram entre 0,18 a 0,23 g de glicose/g de caroço

“in natura” e de 0,26 a 0,35 g de glicose/ g de caroço pré-tratado. É possível verificar

que a deslignificação proporcionou maiores valores de gramas de glicose quando

comparados com os valores que foram obtidos para o material que foi apenas pré-

tratado com H2SO4 diluído.

Com os valores obtidos e mostrados na Tabela 8.1, foi realizada uma análise

estatística para verificar as variáveis de influência significativa no processo. Estes

resultados são verificados na Tabela 8.2.

150

Tabela 8-2 Análise dos efeitos principais das variáveis de hidrólise enzimática do caroço pré-tratado com H2SO4 diluído (g de glicose/ g de caroço “in natura”) para um intervalo de 95% de confiança.

Fatores Efeito

estimado Erro puro


Média 0,194519 0,001416 137,3950 0,000001 (X1) Agitação (rpm) (L) 0,021700 0,003707 5,8534 0,009940 (X1) Agitação (rpm) (Q) 0,001674 0,002781 0,6021 0,589566 (X2) Concentração de sólidos (%)(L) -0,040070 0,003707 -10,8082 0,001694 (X2) Concentração de sólidos (%)(Q) -0,010455 0,002781 -3,7600 0,032891

É possível verificar que as variáveis consideradas significativas no valor de (g de

glicose/ g de caroço “in natura”) após a hidrólise enzimática foram: Agitação (L),

Concentração de sólidos (L) e Concentração de sólidos (Q). A variável que se mostrou

mais significativa foi a concentração de sólidos (L) (-0,040070) a qual demonstrou valor

negativo, o que teoricamente nos leva a afirmar que aumentos na concentração de

sólidos promoveriam reduções nos valores da resposta analisada.

Sindihu et al., (2011) verificaram que o aumento na carga de sólidos até

concentrações em torno de 11% promoveram aumentos nos valores de glicose

produzida. Entretanto, o mesmo autor afirma que acima daquele valor, novos aumentos

não foram significativos para a obtenção de maiores índices de glicose. Qi et al. (2009)

afirmam que a carga de sólidos pode ser considerada como um dos fatores de maior

impacto na conversão enzimática.

A segunda variável mais significativa foi a agitação (L) com valor positivo

(0,021700), o que significaria que aumentos nos valores de agitação promoveriam

elevações nos valores de g de glicose/ g de caroço “in natura”. Este fato é confirmado

por Palmqvist et al. (2011) que relata uma relação quase linear entre o aumento nos

valores de agitação e os valores de conversão enzimática. Segundo os mesmos autores,

este comportamento pode se reproduz para diferentes cargas enzimáticas e não se altera

com o tempo. Todavia, deve-se também considerar que a agitação excessiva pode

desativar as enzimas e reduzir a eficiência de conversão eficiência (INGESSON et al.,

2001) o que não foi observado para o presente trabalho.

Com auxílio de programa estatístico foi realizada a análise de variância

(ANOVA) para os valores de g de glicose/ g de caroço “in natura” obtidos para a

hidrólise enzimática do caroço pré-tratado com H2SO4 diluído os quais são mostrados na

Tabela 8.3.

151

Tabela 8-3 Análise de Variância (ANOVA) realizada para os valores de g de glicose/ g de caroço “in natura” obtidos para a hidrólise enzimática do caroço pré-tratado com H2SO4 diluído para um intervalo de 95% de confiança.


Quadrática

Graus de

Liberdade

Média Quadrática

F calculado

F tabelado



A análise da Tabela 8.3 permite verificar que o modelo obtido a partir dos dados

analisados foi considerado significativo ao nível de 95% de confiança, visto que passou

no teste F da regressão (F calculado > F tabelado). Além disso, o modelo e as

superfícies de respostas puderam ser geradas visto que a análise revelou que o modelo

também passou para o segundo teste F (F da falta de ajuste) o que revela que o modelo

pode ser utilizado para predizer os valores para a faixa utilizada nos experimentos desse

planejamento. O segundo teste F também atendeu a exigência de que o F calculado da

falta de ajuste fosse de 4 a 5 vezes menor que o F tabelado da falta de ajuste. O R2

obtido foi de 0,9448 o que indica que o modelo explica 94,48% da variância dados

analisados. Este valor é considerado muito bom para a obtenção de um modelo válido e

útil para fins preditivos, segundo Box et al. (1978).

A Figura 8.1 mostra os valores observados vs. os valores preditos obtidos a

partir do planejamento e revela um bom ajuste dos dados e a boa repetibilidade dos

mesmos.

152

0,15 0,16 0,17 0,18 0,19 0,20 0,21 0,22 0,23 0,24

Valores observados

0,16

0,17

0,18

0,19

0,20

0,21

0,22

0,23

0,24

Val

ores

pre

dito

s

Figura 8.1 Valores observados vs. valores preditos obtidos para os valores de g de glicose/ g de caroço “in natura” a 95% de confiança

Na Figura 8.2 é possível ter uma melhor visualização dos efeitos considerados

avaliados no planejamento experimental aplicado.

,6021093

-3,75996

5,853369

-10,8082

p=,05

Efeitos Estimados

Agitação (rpm)(Q)


(1)Agitação (rpm)(L)


,6021093

-3,75996

Figura 8.2 Gráfico de Pareto obtido para os efeitos estimados dos valores de g de glicose/ g de caroço “in natura” em um intervalo de 95% de confiança

De acordo com a Tabela 8.3, a análise de variância obtida para o planejamento

realizado revelou a possibilidade de se gerar o modelo estatístico que foi considerado

significativo e preditivo a 95% de nível de confiança para a variável resposta g de

glicose/ g de caroço “in natura” (caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído). Este

153

fato também permitiu que a superfície que descreve o comportamentos dos dados

pudesse ser gerada e mostrada na Figura 8.3.

Figura 8.3 Superfície de resposta gerada para os valores de g de glicose / g de caroço “in natura”.

De acordo com a Figura 8.3, é possível verificar dentro das condições

experimentais estudadas as condições ótimas obtidas para os valores de g de glicose / g

de caroço “in natura” foi a realizada a 200 rpm de agitação e 5% de com cargas de

sólidos. Após a analise dos coeficientes de regressão e os fatores não significativos

(p<0,05) serem ignorados, foi gerado o modelo com as variáveis codificadas o qual é

mostrado na equação 8.1 .

g de glicose/ g de caroço in natura (Y) 2221 0,004X-0,020X - 0,010X+0,194 = (8.1)

onde: X1 é agitação e X2 é a concentração de sólidos

154

8.2. ANÁLISE E TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS RESULTADOS

OBTIDOS PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇ AÍ PRÉ-

TRATADO COM H 2SO4 DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE

DESLIGNIFICADO

A análise estatística também foi realizada para os dados obtidos para os valores

de g glicose/g caroço pré-tratado referente a hidrólise do material pré-tratado com ácido

e sequencialmente deslignificado os quais estão apresentados na Tabela 8.1. Dessa os

dados foram analisados para verificar as variáveis de influência significativa no

processo. Estes resultados são apresentados na Tabela 8.4

Tabela 8-4 Análise dos efeitos principais das variáveis de hidrólise enzimática do caroço pré-tratado com H2SO4 diluído e sequencialmente deslignificado (g de glicose/ g de caroço pré-tratado com H2SO4 diluído) para um intervalo de 99% de confiança.

Fatores Efeito

estimado Erro puro


Média 0,317086 0,000729 435,1889 0,000000 (X1) Agitação (rpm) (L) 0,018590 0,001908 9,7435 0,002297 (X1) Agitação (rpm) (Q) -0,000690 0,001431 -0,4822 0,662644 (X2) Concentração de sólidos (%)(L) -0,067242 0,001908 -35,2425 0,000050 (X2) Concentração de sólidos (%)(Q) 0,025549 0,001431 17,8543 0,000383

É possivel observar que as variáveis consideradas significativas ao nível de 99%

de confiança para a variável resposta analisada (g de glicose/ g de caroço pré-tratado

com H2SO4 diluído) foram: concentração de sólidos (L); concentração de sólidos (Q) e

agitação (L). De acordo com a mesma tabela, a variável concentração de sólidos (L) foi

aquela que se mostrou mais influente no processo com o valor de efeito de - 0,067242.

O valor negativo desta variável indica que aumentos na concentração de sólidos

levariam a redução nos valores da variável resposta analisada (g de glicose/ g de caroço

pré-tratado com H2SO4 diluído). A variável concentração de sólidos (Q) foi a segunda

mais significatica com o valor de 0,025549 seguida pela agitação (L) com o valor de

0,018590, o seu valor positivo demonstraria que aumentos na agitação proporcionariam

aumentos nos valores da resposta analisada.

Na Tabela 8.5, é mostrada a análise de variância (ANOVA) obtida para os dados

obtidos pelo planejamento experimental realizado.

155

Tabela 8-5 Análise dos efeitos principais das variáveis de hidrólise enzimática do caroço pré-tratado com H2SO4 diluído e sequencialmente deslignificado (g de glicose/ g de caroço pré-tratado com H2SO4 diluído) para um intervalo de 99% de confiança.


Quadrática

Graus de

Liberdade

Média Quadrática

F calculado

F tabelado



De acordo com os resultados da Tabela 8.5, a análise de variância realizada para

os dados mostrou que o modelo pode ser considerado significativo a um intervalo de

significância de 99% , uma vez que o modelo cumpriu o requisito para o Teste F da

regressão (Fcalculado>Ftabelado). Para este trabalho, foi encontrado que o Fcalculado

foi 11,91 vezes maior que o F tabelado da regressão. Já para o segundo teste F,

calculado para a Falta de ajuste mostrou mais um vez cumprir a condição no qual o

Fcalculado deve ser menor que o Ftabelado. Diante das duas condições mencionadas, é

possível afirmar que o modelo é significativo e preditivo para as condições

experimentais estudadas.

O valor encontrado para o R2 foi de 0,9714, o que indica que o modelo consegue

explicar em até 97,14% da variabilidade dos dados obtidos.

A Figura 8.4 mostra os valores observados vs. os valores preditos obtidos a

partir do planejamento e revela um bom ajuste dos dados e a boa repetibilidade dos

mesmo a 99% de significnância.

156

0,24 0,25 0,26 0,27 0,28 0,29 0,30 0,31 0,32 0,33 0,34 0,35 0,36 0,37

Valores observ ados

0,25

0,26

0,27

0,28

0,29

0,30

0,31

0,32

0,33

0,34

0,35

0,36

0,37

Val

ores

pre

dito

s

Figura 8.4 Valores observados vs. valores preditos obtidos para os valores de g de glicose/ g de caroço pré-tratado com H2SO4 diluído para um intervalo de 99% de confiança (caroço pré-tratado e sequencialmente deslignificado)

Na figura 8.5 é possível ter uma melhor visualização dos efeitos considerados

avaliados no planejamento experimental aplicado através do gráfico de Pareto.

-,482222

9,743537

17,85427

-35,2425

p=,01

Agitação (rpm)(Q)

(1)Agitação (rpm)(L)



-,482222

Figura 8.5 Gráfico de Pareto obtidos dos efeitos estimados para os valores de g de glicose/ g de caroço pré-tratado com H2SO4 diluído em intervalo de 99% de confiança.

De acordo com a Tabela 8.5, a análise de variância obtida para o planejamento

realizado revelou a possibilidade de se gerar o modelo estatístico que foi considerado

significativo e preditivo a um intervalo de 99% de confiança para a resposta g de

glicose/ g de caroço pré-tratado (caroço pré-tratado com ácido e sequencialmente

157

deslignificado). Este fato também permitiu que a superfície que descreve o

comportamento dos dados pudesse ser gerada e mostrada na Figura 8.6.

Figura 8.6 Superfície de resposta obtida para os valores de g de glicose/ g de bagaço pré-tratado com H2SO4 diluído

A análise da superfície de resposta obtida para os valores de g de glicose/ g de

bagaço pré-tratado com H2SO4 diluído permite afirmar que valores de cargas de sólidos

reduzidos associados a uma ampla faixa de agitação permitiu a obtenção de elevados

valores da resposta analisada. De acordo com a análise dos dados, a melhor condição

para as condições estudadas foi de 10% de sólidos e 200 rpm de agitação. Após a

análise dos coeficientes de regressão e os fatores não significativos (p<0,01) serem

ignorados, foi gerado o modelo em variáveis codificadas, o qual é mostrado na Equação

8.2

g de glicose/ g de caroço pré-tratado (Y) 2221 0,012X+0,033X - 0,009X+0,317 =

(8.2),

onde X1 é a agitaçãoe X2 é a carga de sólidos em variáveis codificadas

158

8.3. RESULTADOS OBTIDOS PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DA

CELULOSE APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM H 2SO4 E

DESLIGNIFICAÇÃO

De acordo com a Figura 8.7, os valores da conversão enzimática obtidos após a

variação da carga de sólidos e agitação variaram de 41,05 a 58,87% para o material

que foi apenas pré-tratado com H2SO4 diluído e de 49,33 a 67,77% para o material

tratrado com ácido e sequencialmente deslignificado. O ensaio 3 (200 rpm e 5% de

sólidos) foi aquele que permitiu os maiores valores de conversão para os dois materiais

hidrolisados. A condição do ensaio 7 (100 rpm e 15% de sólidos) foi aquela que

mostrou os menores resultados de conversão para os dois tipos de material hidrolisado

(apenas pré-tratado com H2SO4 diluído e o que também foi sequencialmente

deslignificado).

O aumento na carga de sólidos de 5% para 10% a 100 rpm durante a hidrólise

enzimática, promoveu uma redução no valor da conversão em 15,74% e 0,58%, para o

caroço de açaí apenas pré-tratado com ácido e aquele para aquele que foi

sequencialmente deslignificado, respectivamente. De acordo com Gregg and Saddler,

(1996) altas cargas de sólidos durante a hidrólise enzimática reduzem as taxas de

conversão devido a inibição enzimática por produto, inativação enzimática ou redução

na reatividade do substrato celulósico.

Após o material pré-tratado com H2SO4 ser deslignificado verificou-se um

aumento médio no valor da conversão enzimática de 23,86%. O ensaio 12 (150rpm e

10% de sólidos) foi aquele no qual se verificou maior aumento no valor da conversão

após o material pré-tratado com ácido ser deslignificado (37,39%). Para o ensaio 3 (200

rpm, 5% de sólidos), o qual mostrou os melhores resultados de conversão, a

deslignificação proporcionou um aumento de 15,11% na conversão enzimática do

material.

159

Figura 8.7 Resultados da conversão da celulose obtidos para o caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído e pré-tratado com H2SO4 diluído e sequencialmente deslignificado.

Na Figura 8.8 são mostrados os valores de conversão enzimática obtidos nas

condições de 200 rpm (melhor condição de agitação) e com os materiais provenientes

das melhores condições de pré-tratamento e deslignificação nas melhores condições

observadas nos planejamentos aplicados. É possível observar que a carga de sólidos de

3% quando hidrolisada na melhor conversão de agitação (200rpm) foi aquela que

mostrou maiores valores de conversão com o valor de 78,97% para o caroço pré-tratado

e sequencialmente deslignificado.

Foi possível verificar que o aumento na concentração de sólidos para todos os 3

diferentes tipos de material convertido (apenas pré-tratado com H2SO4 diluído, pré-

tratado e deslignificado e “in natura”) promoveu redução nos valores de conversão

enzimática, semelhante ao que foi observado por Sindhu et al. (2010). Carvalho et al.

(2013) afirmaram que o aumento na carga de sólidos promove a redução nos níveis de

conversão e que isso se repete para uma ampla variedade de materiais lignocelulósicos.

Apesar da concentração de 3% de sólidos ter mostrado os melhores resultados de

conversão, é necessário considerar que os valores de conversão obtidos para 10 e 15%

de sólidos também foram bons e foram de 64,60 e 54,69%, respectivamente. Segundo

Kootstra et al. (2009) a utilização de cargas de sólidos elevadas reduzem os custos de

energia.

160

Os resultados mostrados na Figura 8.8 mostraram ainda que o pré-tratamento

realizado apenas com o H2SO4 diluído promoveu conversões 2,07 a 3,27 vezes maiores

se comparadas com o material “in natura” ou não-tratado. Quando o material pré-tratado

com ácido foi sequencialmente deslignificado esses valores foram ainda maiores e

atingiram valores de 2,4 a 3,76 vezes maior que os observados para o material “in

natura”. Esses valores foram menores que os obtidos por Sindihu et al. (2011) que

obteve valores de conversão de até 4 vezes maiores para bagaço de cana tratado apenas

com H2SO4 diluído.

Entretanto os valores de conversão obtidos neste trabalho são considerados bons

e maiores (conforme a Figura 8.7) se comparados com aqueles encontrados por Silva

(2009) que obteve valores de conversão de 32 e 61 % para o pseudocaule de bananaeira

pré-tratado com H2SO4 diluído e apenas deslignificado com NaOH. Já Martin et al.

(2007) relata que para cascas de amendoim, talos de mandioca e cascas de arroz o pré-

tratamento com H2SO4 diluído não foi eficiente em melhorar a hidrólise enzimática.

Figura 8.8 Resultados da conversão enzimática obtida para a celulose do caroço de açaí apenas pré-tratado com H2SO4 diluído, pré-tratado e deslignificado sequencialmente e “in natura” a 200 rpm.

A Figura 8.9 mostra o gráfico das cinéticas de hidrólise enzimática obtidas nas

concentrações de sólidos de 3, 5, 10 e 15% para o material pré-tratado com H2SO4

diluído (na melhor condição obtida durante o estudo do pré-tratamento com ácido –

item 3.3) e para o material “in natura” ou bruto após 96 horas de cinética a 200 rpm. É

possível verificar que os valores de glicose/L para o material pré-tratado atingem

161

valores máximos próximos a 45 g/L. Já quando se observa a cinética obtida para o

material “in natura” verificam-se valores máximos próximos de 11,5g/L. A maior

concentração de glicose /L foi obtida para a carga de sólidos de 15% seguida pela carga

de 10% para ambos os materiais. Na concentração de 15% de sólidos o pré-tratamento

com H2SO4 diluído permitiu um aumento de 297% no índice de g de glicose/L em

relação ao material “in natura” /bruto hidrolisado na mesma condição. Para a

concentração de sólidos de 10% esse aumento doi de 282%.

Figura 8.9 Cinéticas de hidrólise enzimática realizadas para o caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído (1° da esquerda para direita) e caroço de açaí “in natura”/bruto (2° da esquerda para direita) durante 96 horas a 200rpm.

Na Figura 8.10, é mostrado o gráfico com a cinética de hidrólise enzimática,

também realizada nas 4 diferentes concentrações de sólidos citadas anteriormente para

o caroço de açaí pré-tratado e deslignificado sequencialmente nas mesmas condições

citadas para a Figura 8.9. O material que foi pré-tratado com ácido e sequencialmente

deslignificado mostrou valores de g de glicose/L superiores aqueles que foram

mostrados para os materiais da Figura 8.9. De acordo com a Figura 8.10 foi mais uma

vez observado que as concentrações de sólidos de 15 e 10% foram aquelas que

permitiram os maiores índices de g de glicose/L. Os valores obtidos foram de 68,73 e

54,12 g de glicose/L para as concentrações de 15 e 10%, respectivamente. Após o pré-

tratamento e deslignificação sequencial foi possível observar um aumento máximo no

valor de g de glicose/L de 527% em relação ao material “in natura”/bruto na mesmas

condições de hidrólise (15% de sólidos). Isso representa um valor quase 6 vezes maior

na quantidade de g de glicose/L no hidrolisado.

162

Figura 8.10 Cinéticas de hidrólise enzimática realizadas para o caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído e deslignificado sequencialmente durante 96 horas a 200rpm.

Na Figura 8.11, são mostradas as cinéticas de hidrólise enzimáticas obtidas para

as melhores condições do planejamento realizado neste capítulo: 5% de sólidos para o

caroço apenas pré-tratado com H2SO4 diluído; 10% para o caroço sequencialmente

deslignificado; ainda é mostrada a cinética nestas mesmas condições para o material “in

natura”/bruto. De maneira geral, o pré-tratamento seguido de deslignificação foi o

material que apresentou um maior valor de g de glicose/L (54,12).

Figura 8.11 Cinéticas de hidrólise enzimática realizadas para o caroço de açaí pré-tratado apenas com H2SO4; pré-tratado e sequencialmente deslignificado e caroço “in natura”/bruto durante 96 horas a 200rpm.

Como as hidrólises enzimáticas iniciais observadas durante os estudos de pré-

tratamento e deslignificação foram realizadas nas cargas de sólidos de 3%, e foram

163

realizadas cinéticas de hidrólise enzimática para esta concentração com a condição

ótima de agitação e tempo mais elevado.

Os resultados mostrados na Figura 8.12. apontam que mais uma vez o material

pré-tratado e sequencialmente deslignificado foi aquele que mostrou maiores valores de

g de glicose/L (19,85) seguidos pelo material apenas pré-tratado com H2SO4 com o

valor de 14,09 g de glicose/L e “in natura” com o valor de 4,95. Esses resultados

confirmam a eficiência dos pré-tratamentos em melhorar os valores de açúcares para

posterior fermentação.

Figura 8.12 Cinéticas de hidrólise enzimática realizadas para o caroço de açaí pré-tratado apenas com H2SO4; pré-tratado e sequencialmente deslignificado e caroço “in natura”/bruto durante 96 horas a 200rpm a 3% de sólidos.


De acordo com o planejamento experimental, foi possível observar que os

maiores valores obtidos para os teores de g de glicose / g de material foram observados

para o ensaio 3 (de 200 rpm de agitação e 5%) com os valores de 0,23g de glicose/ g de

caroço “in natura,” para o material pré-tratado com H2SO4 diluído e de 0,35 g de

glicose/ g de caroço pré-tratado, para o material pré-tratado com ácido e também

deslignificado.

Os ensaios realizados na melhor condição de agitação mostrou que a

concentração de 3% de sólidos foi aquela que permitiu a obtenção dos maiores valores

de conversão enzimática, para todos os materiais avaliados. Entretanto, a concentração

de 15% de sólidos foi aquela que permitiu a liberação dos maiores valores de g de

glicose/L.

164

Após o pré-tratamento e deslignificação seqüencial, foi possível observar um

aumento máximo no valor de g de glicose/L de 527% em relação ao material “in

natura”/bruto nas mesmas condições de hidrólise (15% de sólidos), o que representou

um valor quase 6 vezes maior na quantidade de g de glicose/L no hidrolisado.

A variável que se mostrou mais significativa no valor de (g de glicose/ g de

caroço “in natura” – apenas pré-tratado com H2SO4 diluído) hidrólise do caroço pré-

tratado foi a concentração de sólidos (L). Dentro das condições experimentais estudadas

as condições ótimas obtidas para os valores de g de glicose / g de caroço “in natura”

(resultado obtido para o caroço pré-tratado apenas com H2SO4 diluído) foi a realizada a

200 rpm de agitação e 5% de cargas de sólidos.

A variável concentração de sólidos (L) foi considerada como a mais significativa

ao nível de 99% de confiança para a variável resposta analisada (g de glicose/ g de

caroço pré-tratado com H2SO4 diluído – material pré-tratado com ácido e

deslignificado). De acordo com a análise dos dados, a melhor condição para as

condições estudadas foi de 10% de sólidos e 200 rpm de agitação (resultado obtido para

o caroço pré-tratado com H2SO4 diluído e seqüencialmente deslignificado).

165

CAPÍTULO 9 - FERMENTAÇÃO DOS HIDROLISADOS

No Capítulo 9 foi realizada a fermentação dos hidrolisados obtidos nas

condições consideradas ótimas para este trabalho. Para o mesmo capítulo, foram

estudados os principais parâmetros de avaliação do processo de fermentação como os

índices de etanol, glicose consumida e glicerol. Além disso foram observados os

rendimentos da fermentação realizada e os inibidores presentes no hidrolisado.

9. FERMENTAÇÃO

9.1. RESULTADOS OBTIDOS PARA A FERMENTAÇÃO DOS

HIDROLISADOS

A fermentação foi realizada com o hidrolisado obtidos com 15% de caroço de

açaí pré-tratado apenas com H2SO4 diluído e com o que foi obtido com 10% do caroço

pré-tratado e deslignificado. A utilização dessas condições se baseou no fato de terem

sido aquelas que mostraram valores bons e semelhantes para o índice de glicose (g/L).

Os valores de xilose foram praticamente nulos em função do pré-tratamento observado,

não sendo considerada a necessidade de quantificá-la.

A Tabela 9.1 mostra a cinética obtida para os valores de celobiose, glicose,

etanol, massa seca, HMF, ácido acético e furfural obtidos para o hidrolisado proveniente

da carga de sólidos de 15% de caroço que foi apenas pré-tratado com H2SO4 diluído.

166

Tabela 9-1 Cinética dos valores de celobiose, glicose, etanol, massa seca, HMF, ácido acético e furfural obtidos para o hidrolisado proveniente da carga de sólidos de 15% de caroço apenas pré-tratado com H2SO4 diluído (Fermentação de 24h).

Tempo (h)

Concentração (g/L)

Celobiose Glicose Glicerol Etanol Massa Seca

HMF Ácido acético

Fufural

0 3,23 43,50 0,00 0,00 1,02 0,02 2,15 0,00 1 3,22 40,10 0,00 0,53 1,89 0,02 2,33 0,00 2 3,21 37,47 0,78 3,24 2,34 0,02 2,21 0,00 4 3,22 18,36 1,20 5,66 3,39 0,02 2,43 0,00 6 3,45 12,90 1,30 7,12 3,67 0,03 2,12 0,00 8 3,44 7,53 2,28 9,35 4,15 0,02 2,12 0,00 10 3,22 6,07 3,33 10,11 4,67 0,02 2,44 0,00 12 3,55 5,34 3,48 13,56 5,15 0,02 2,33 0,00 14 3,56 4,23 4,12 14,50 5,34 0,02 2,14 0,00 16 3,45 3,22 4,21 15,67 5,67 0,02 2,13 0,00 18 3,45 3,12 5,12 15,50 5,45 0,02 2,14 0,00 22 3,53 3,21 5,08 15,20 5,66 0,02 2,13 0,00 24 3,44 3,11 5,02 15,23 5,34 0,02 2,15 0,00

Já na Tabela 9.2, são mostrados a cinética dos valores de celobiose, glicose,

etanol, massa seca, HMF, ácido acético e furfural obtidos para o hidrolisado proveniente

da carga de sólidos de 10% de caroço que foi pré-tratado com H2SO4 diluído e

sequencialmente deslignificado.

Tabela 9-2 Cinética dos valores de celobiose, glicose, etanol, massa seca, HMF, ácido acético e furfural obtidos para o hidrolisado proveniente da carga de sólidos de 10% de caroço pré-tratado com H2SO4 diluído e sequencialmente deslignificado (fermentação de 24h)

Tempo (h)

Concentração (g/L) Celobiose Glicose Glicerol Etanol Massa

Seca HMF Ácido

acético fufural

0 2,14 53,04 0,00 0,05 0,78 0,01 1,15 0,01 1 2,45 46,81 0,00 1,12 1,13 0,01 1,09 0,01 2 2,45 38,28 0,98 3,40 2,14 0,01 1,20 0,01 4 2,55 19,17 1,40 10,10 3,22 0,01 1,24 0,01 6 2,34 13,71 1,50 12,20 3,47 0,01 1,20 0,01 8 2,45 8,34 2,48 16,70 3,88 0,01 1,16 0,01 10 2,33 6,88 3,20 19,40 4,12 0,01 1,10 0,01 12 2,45 4,06 4,00 20,10 4,25 0,01 1,15 0,01 14 2,44 3,45 3,83 21,30 4,67 0,02 1,20 0,01 16 2,33 2,34 4,52 21,12 5,12 0,02 1,21 0,01 18 2,33 2,12 4,57 21,34 5,88 0,02 1,18 0,01 22 2,12 1,20 5,01 21,14 6,08 0,02 1,24 0,01 24 2,12 0,00 4,99 21,65 6,12 0,02 1,23 0,01

167

Os valores de glicose iniciais foram de 45,50 e 53,04 g de glicose/L para o

hidrolisado proveniente do caroço pré-tratado apenas com H2SO4 diluído e para o

caroço pré-tratado e sequencialmente deslignificado. Após as primeiras 8 horas, foi

possível verificar redução no teor de glicose dos hidrolisados nos valores de 82,68 e

84,27%.

Após as 24 de fermentação, foi possível verificar o consumo quase que completo

da glicose presente no hidrolisado proveniente do material deslignificado. Esse

comportamento não foi verificado para o hidrolisado proveniente do caroço apenas pré-

tratado com ácido. Umas das possíveis explicações seria a presença de teores de lignina

mais elevados para o hidrolisado que não foi submetido a deslignificação.

Na Tabela 9.3, é mostrado o comportamento cinético da fermentação de uma

solução padrão de glicose que possuía 55g de glicose/L. Verificou-se o mesmo

comportamento da cinética obtida com o material deslignificado, ou seja o consumo

quase total da glicose presente.

Tabela 9-3 Cinética de fermentação obtida para solução padrão de glicose

Tempo (h) Concentração (g/L)

Glicose Glicerol Etanol Massa Seca

0 55,00 0,00 0,00 1,02 1 40,12 0,10 0,53 1,89 2 38,14 0,55 3,24 2,34 4 34,12 2,30 5,66 3,39 6 20,12 2,44 10,22 3,67 8 15,66 2,28 14,55 4,15 10 12,34 3,33 16,70 4,67 12 6,36 3,48 20,12 5,15 14 4,23 4,34 21,30 5,34 16 2,44 4,56 23,40 5,67 18 0,00 4,67 24,50 5,45 22 0,00 5,13 24,20 5,66 24 0,00 5,12 25,10 5,34

Os valores dos rendimentos de fermentação obtidos para os hidrolisados foram

de 89,31% (glicose padrão), 79,69% (pré-tratado e deslignificado) deslignificado e

73,79% (apenas pré-tratado com H2SO4 diluído). Os valores de glicerol atingem os

níveis máximos de 5,12 e 4,99% após as 24h de fermentação para os hidrolisados

obtidos com o caroço pré-tratado apenas com ácido e aquele que foi obtido com o

caroço sequencialmente deslignificado.

168

Após 24h de fermentação foram observados os teores máximos de etanol de

21,65 e 15,23 g de etanol/L para o hidrolisado obtido com o caroço deslignificado e

para aquele obtido com o caroço apenas pré-tratado com H2SO4. O teor de etanol obtido

após a deslignificação é 42% maior que aquele obtido para o hidrolisado com caroço

apenas pré-tratado com H2SO4 diluído. O teor de etanol obtido para a fermentação da

glicose padrão foi o que mostrou maior valor (25,10g/L), provavelmente por não ter a

presença de lignina residual e ou inibidores da fermentação. Além disso, o hidrolisado

obtido do material que foi apenas pré-tratado com H2SO4 mostra valores de ácido

acético maiores que observados para aquele verificados para o hidrolisado obtido com

caroço de açaí pré-tratado e deslignificado.

Os valores mostrados nas Tabelas 9.1, 9.2 e 9.3 podem ser melhor visualizados

em forma de gráficos na Figuras 9.1. De maneira geral, é observada a redução no nível

de glicose em função do consumo da mesma pelo microrganismo de fermentação. De

acordo com Lima et al. (2001), durante a fermentação uma parte dos açúcares presentes

no meio é consumido em reações paralelas que são necessárias a síntese do etanol. Em

função desse aspecto os rendimentos da fermentação alcoólica industrial têm seu

rendimento em torno de 90%.

Neste trabalho, foi verificado que após as primeiras 14h de fermentação 90% da

glicose já havia sido consumida para ambos os hidrolisados avaliados. A produtividade

volumétrica de etanol obtida foi de 0,9 e 0,63 g de etanol.L-1.h-1 para o hidrolisado

obtido com o caroço apenas pré-tratado com H2SO4 diluído e para o hidrolisado obtido

com o caroço pré-tratado e deslignificado, respectivamente.

Nascimento (2011) cita valores de rendimento de 80 a 90% para a produção de

etanol a partir de hidrolisados de bagaço de cana- de-açúcar pré-tratados com NaOH.

Esses valores são ligeiramente maiores, porém muito próximos aos que foram obtidos

neste trabalho. Toscan (2013) cita o valor máximo de conversão de 76,72% para o

hidrolisado obtido a partir de capim elefante pré-tratado hidrotermicamente, enquanto

que Sipos et al. (2009) realizaram a fermentação do bagaço de sorgo de milho pré-

tratado com explosão a vapor e obtiveram novamente os valores de rendimento em

torno de 80 a 90%.

169

Figura 9.1 Gráficos das cinéticas de fermentação dos hidrolisados padrão (glicose padrão), hidrolisado obtidos com o caroço de açaí apenas pré-tratado com H2SO4 diluído e hidrolisado obtido com o caroço de açaí pré-tratado e sequencialmente deslignificado (da esquerda para direita).

170


Após as 24 de fermentação, foi possível verificar o consumo quase completo da

glicose presente no hidrolisado proveniente do material deslignificado.

Durante as primeiras 14h de fermentação, 90% da glicose foi consumida para

ambos os hidrolisados avaliados. A produtividade volumétrica de etanol obtida foi de

0,9 e 0,63 g de etanol.L-1.h-1 para o hidrolisado obtido com o caroço apenas pré-tratado

com H2SO4 diluído e para o hidrolisado obtido com o caroço pré-tratado e

deslignificado, respectivamente.

Os valores dos rendimentos de fermentação obtidos para os hidrolisados foram

de 89,31% (glicose padrão), 79,69% (pré-tratado e deslignificado) deslignificado e

73,79% (apenas pré-tratado com H2SO4 diluído). Os valores de glicerol atingiram os

níveis máximos de 5,12 e 4,99% após as 24h de fermentação para os hidrolisados

obtidos com o caroço pré-tratado apenas com ácido e para aquele que foi obtido com o

caroço seqüencialmente deslignificado.

Após 24h de fermentação, foram observados os teores máximos de etanol de

21,65 e 15,23 g de etanol/L para o hidrolisado obtido com o caroço deslignificado e

para aquele obtido com o caroço apenas pré-tratado com H2SO4.

O teor de etanol obtido após a deslignificação foi 42% maior que aquele obtido

para o hidrolisado com caroço apenas pré-tratado com H2SO4 diluído.

CAPÍTULO 10

10. CONCLUSÕES

Foi possível concluir que o caroço de açaí “in natura” mostrou valores de

carboidratos superiores a 60% o que justificaria a utilização desta biomassa para a

produção de etanol.

O pré-tratamento do caroço de açaí com H2SO4 diluído mostrou-se eficiente na

remoção de até 95,80% da fração hemicelulose e 48% da lignina presentes na biomassa

tratada. A hemicelulose solubilizada foi recuperada na forma de xilose na fração líquida,

a qual demonstrou baixos níveis de inibidores. A conversão enzimática do caroço de

açaí pré-tratado com H2SO4 diluído atingiu o valor máximo de 68,43%. A análise

estatistica realizada para os valores de g de glicose obtidos para o material pré-tratado

revelou que as variáveis concentração de ácido (L) e (Q) foram as variáveis mais

significativas para tal resposta.

A deslignificação sequencial foi capaz de remover em até 88,20% da lignina do

material que foi apenas pré-tratado com H2SO4 diluído. A conversão enzimática do

material pré-tratado e sequencialmente deslignificado mostrou o valor máximo de

94,76%. A variável concentração de sólidos (Q) foi aquela que se mostrou mais

significativa para os valores de g de glicose liberadas na hidrólise do material

deslignificado.

No estudo de variação da carga de sólidos, realizada em reator encamisado, foi

possível verificar que a carga de 3% de sólidos com agitação de 200rpm com o material

sequencialmente deslignificado foi a condição que mostrou maiores valores de

conversão enzimática (78,97%) e que as concentrações de 10 e 15% de sólidos do

mesmo material foram as que permitiram os maiores valores de glicose liberada para o

mesmo material. Foi também que a deslignificação foi essencial para a melhoria da

conversão enzimática e dos níveis de glicose liberado no hidrolisado a ser fermentado.

As análises da estrutura morfológica revelaram importantes mudanças na

estrutura do material que foi apenas pré-tratado com H2SO4 diluído e/ou também

deslignificado.

Os hidrolisados obtidos permitiram fermentações com rendimentos de 89,31%

(glicose padrão), 79,69% (pré-tratado e deslignificado) e 73,79% (apenas pré-tratado

com H2SO4 diluído), o que mostra o potencial de se produzir etanol a partir do caroço

de açaí.

172

173

SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Como sugestões para trabalhos futuros são sugeridos estudos mais aprofundados sobre

aqueles desenvolvidos neste Tese, como:

• Realizar estudo aprofundado sobre a variação da carga enzimática durante a

hidrólise do caroço de açaí;

• Avaliar o efeito de outros pré-tratamentos sobre a biomassa do caroço de açaí;

• Estudar possíveis aumentos na carga de NaOH na deslignificação da biomassa;

• Avaliar o aumento da carga de H2SO4 e seus efeitos

• Realizar um estudo técnico-econômico da produção de etanol a partir do caroço

de açaí;

• Estudar a fermentação de hidrolisados obtidos em fermentador;

174

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