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ISSN 2238-1589

RESU

MO

BREVE COMUNICAÇÃO

DEtECçãO DE MyCOPLASMA PULMOniS nO tRAtO RESPiRAtóRiO SUPERiOR EM ROEDORES AtRAvéS DA téCniCA DE PCR

Milena Coutinho da Motta1, Jussimara Félix Sartorelli1, Marilda Osti Spinelli1, Cyntia Marques dos Santos Corrêa de Godoy1, Mara de Souza Junqueira1, Robison José da Cruz1,

Flávio Martins Ferreira1, Selmo Vicente Bernardino da Silva1, Leandro Iannuzzi1, Juliana Bortolatto1

Objetivo: apresentar a técnica de PCR para a detecção de Mycoplasma pulmonis das colônias convencionais de camundongos das linhagens isogênicas C57BL/6, BALB/c e heterogênica Swiss, e ratos Wistar. Material e Métodos: A extração do DNA foi realizada a partir de fragmento de traqueia, utilizando para a reação de PCR os oligonucleotí-deos iniciadores F: 5’- CA TGT TCT TGG CCA CCTAT - 3’ e R:5’ - ATC CCT CAA TGA

separados por eletroforese em gel de agarose. A visualização e fotodocumentação Resultados e conclusão

de Mycoplasma pulmonis º

Palavras-chave: Camundongos. Ratos. PCR. Mycoplasma pulmonis.

1 Diretoria Técnica de Apoio ao Ensino e à Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

Autor para correspondência: Milena Coutinho da Motta E-mail: milena@biot.fm.usp.br

Recebido para publicação: 09/08/2011Aceito para publicação: 18/12/2011

1 intRODUçãO

Os micoplasmas fazem parte de um grande grupo de microorganismos procariotos com mais de 190 espécies1, distinguindo-se dos demais por ser a menor bactéria autoreplicante2, apresentar diminuto genoma3 e ausência de parede celular. Devido a sua limitada capacidade de biossíntese, algumas espécies são parasitas de hospedeiros e

2.Permanece ainda a dúvida se micoplasmas

aderem à superfície das células ou as invadem2. A falta de parede celular permite um contato íntimo entre a membrana do micoplasma e a membrana da célula hospedeira e, em condições apropriadas, pode ocorrer fusão celular1. Durante o processo

de fusão, os componentes do micoplasma são liberados dentro da célula hospedeira e afetam as funções normais da célula, devido à ação de enzimas bacterianas, dentre as quais as nucleases4, que podem degradar o DNA da célula hospedeira.

Os micoplasmas interagem com os fagócitos mononucleares, estimulando a síntese de citocinas

5, excretam peróxido de hidrogê-nio e radicais superóxidos, possibilitando lesões na membrana das células hospedeiras onde se aderem

nos resultados experimentais quando presente nos animais de laboratório6.

Por serem ubíquos no reino animal, poten-cialmente os mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes podem ser portadores de espécies de

2. Os biotérios conven-

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cionais apresentam alta prevalência desse agente infeccioso7,8 usualmente na forma subclínica, porém quando os animais encontram condições ambientais desfavoráveis, tais como aumento

do hospedeiro, estresse experimental, por exem-plo, podem desenvolver sintomas clínicos, como pneumonia e otite8.

O diagnóstico da infecção por Mycoplasma pul-monis pode ser realizado utilizando métodos so-rológicos como teste imunoenzimático (ELISA) e

in vitro é um processo demorado e esses métodos sorológicos frequentemente dão resultados incor-retos devido às reações cruzadas entre diferentes espécies de micoplasmas. São exames de baixa sensibilidade, pois, no início da infecção ou em

a sua detecção. A reação em cadeia de polimerase

o resultado não será comprometido se a infecção estiver em um estágio precoce ou se o animal for

6. Com o intuito de ampliar as informações no

contexto do monitoramento sanitário de animais de laboratório, o Laboratório de Biologia Mole-

Medicina da Universidade de São Paulo implantou a técnica de PCR para a detecção do Mycoplasma pulmonis, devido a sua alta sensibilidade e espe-

9.Dessa forma, o objetivo deste trabalho é apre-

sentar a técnica de PCR para a detecção do Myco-plasma pulmonis das colônias convencionais de camundongos das linhagens isogênicas C57BL/6, BALB/c e heterogênica Swiss e de ratos Wistar.

2 MAtERiAL E MétODOS

2.1 Animais

sexos, com idade entre 10 e 11 semanas, das

linhagens isogênicas C57BL/6, BALB/c e da linhagem heterogênica Swiss e de ratos Wistar,

-de de Medicina da Universidade de São Paulo, criados em condições convencionais, protegidos com barreiras sanitárias, no período de janeiro de 2008 a dezembro de 2010, dentro do programa de Controle Sanitário da unidade. Todos os procedi-mentos foram realizados de acordo com princí-pios internacionais de ética e bem-estar animal e aprovados pelo Comitê de Ética do complexo HC/

º 251/11.

2.2 Coleta de Amostras

Os animais foram eutanasiados em câmara de CO2 e, após a assepsia com etanol 70%, em ca-

a retirada de um fragmento de aproximadamente 0,5 mm. O material coletado foi colocado em um microtubo e mantido a -80ºC até o momento do uso.

2.3 Extração de DnA

A extração do DNA foi realizada como descrito por Ausubel10 -sumidamente, a solução de lise é preparada com os seguintes reagentes Tris-HCL 0,5M; NaCl 5M; SDS 10%; EDTA 0,5M; Proteinase K, diferen-ciando da original que utiliza fenol/clorofórmio/álcool isoamílico.

2.4 Reações em cadeia da polimerase (PCR)

Para a reação de PCR, foram utilizados 100 ng de DNA; 0,2 mMdNTPsmix (desoxiribonu-cleotídeos trifosfato); 1X tampão da Taq DNA polimerase; 2,0 mM MgCl2; 1U (unidade) de AmpliTaq DNA polimerase Platinum; água milli-

1 reação de 20 mL e 0,5 µmol/L de cada oligo-

152 pb. Os primers foram desenhados utilizando

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o Primer 3 Software frodo.wi.mit.edu/primer3 e

www.ncbi.nlm.nih.gov/blast, sendo que a região do genoma bacteriano inicia-se em 96732 e ter-mina em 96883.

minutos; 35 ciclos de 95ºC por 1 minuto, 58ºC por

4ºC. Os produtos obtidos pela PCR foram separa-dos por eletroforese em gel de agarose (Invitrogen ultrapura) 1,5% contendo brometo de etídio. O marcador de peso molecular utilizado foi 50 pb DNA Ladder (Invitrogen).

A visualização e fotodocumentação foi reali-zada sob luz ultravioleta no BioDoc-It Imaging System - UVP.

de animais positivos para Mycoplasma pulmonis detectados por meio da utilização da técnica de

La-boratório de Controle de Qualidade Sanitária do CEMIB/UNICAMP, bem como controles negati-vos (água e reagentes).

3 RESULtADOS

Os resultados obtidos pela PCR espécie-especí-Mycoplasma pulmonis em

camundongos e ratos mantidos em sistema con-vencional podem ser observados na tabela 1. Os produtos da PCR para Mycoplasma pulmonis estão

uma amostra por espécie/linhagem por canaleta.O M.pulmonis foi detectado em camundongos

isogênicos C57BL/6, BALB/c e heterogênicos Swiss, nas percentagens de 38, 24 e 14, respec-tivamente, e em ratos Wistar, na percentagem de 52 (Tabela 1).

4 DiSCUSSãO

A infecção por M. pulmonis afeta de maneira distinta as espécies de roedores de laboratório.

Tabela 1 -

Espécie Camundongos Rato

Linhagem C57BL/6 BALB/c Swiss WistarPositivos/Total de animais% positivos 38

Figura 1 - Mycoplasma pulmonis em diferentes linhagens de camundongos e rato, analisados

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Penetrando pelas vias respiratórias, inicia a colo nização pela cavidade nasal, com provável progressão para ouvido médio, laringe, traqueia e pulmões. A evolução depende de fatores do hospedeiro (idade, linhagem e estado sanitário) e do ambiente, como altas concentrações de amô-

bacteriana. Algumas linhagens de camundongos são altamente resistentes, sendo geralmente as-sintomática. Quando se manifesta clinicamente, pode provocar a doença crônica respiratória, com broncopneumonia aguda em combinação com outras infecções pneumotrópicas ou fatores ex-trínsecos. Em jovens, geralmente é inaparente. Em

ranger os dentes, dispneia, perda de peso, letargia, pelos arrepiados, movimentos giratórios quando suspensos pela cauda, cabeça inclinada, perda de

redor dos orifícios nasais e dos olhos. Pode ainda provocar infecção no trato genital com redução da fertilidade11.

Neste estudo, a pesquisa de Mycoplasma pul-monis possibilitou a detecção de camundongos positivos, sendo 38% da linhagem C57BL/6, 24% da linhagem BALB/c e 14% do heterogênico Swiss; 52% de ratos Wistar.

Pesquisas sorológicas realizadas em outros países registraram uma prevalência de 69% de M. pulmonis em camundongos de diferentes biotérios na Coreia, em levantamento feito de 1999 a 200312. Em Taiwan, mais que 20% das colônias de camundongos estavam contaminadas em 200713.

controlado no Brasil, 57% de positividade M. pulmonis em camundongos, isolados por cultu-ra. Enquanto que o diagnóstico sorológico, por ELISA, constatou 92% de positividade da mesma colônia, mostrando que a sensibilidade do ELISA foi maior do que a do isolamento por cultura14.

Em ratos, houve a constatação de 75% infec-tados em biotérios da Coreia e 40% em biotérios de Taiwan12,13. Na Europa Ocidental, M .pulmonis foi o agente infeccioso mais prevalente em mais de 100 colônias analisadas entre 2007 e 200815,16.

17, foram detec-tadas 64,58% de amostras positivas de 240 ratos Wistar convencionais, provenientes de 8 biotérios diferentes.

18,19 recomenda a triagem periódica dessa bactéria nas colônias de camundongos e ratos. O diagnóstico de infecção por micoplasma é geralmente realizada por de-terminação sorológica ou isolamento por cultura. Porém, no diagnóstico sorológico pode ocorrer frequentemente reações cruzadas entre espécies, enquanto, no cultivo, é muito demorado para al-guns micoplasmas exigentes15. Sendo assim, no

foi implantada como rotina do programa de con-trole sanitário a técnica de PCR para a detecção de Mycoplasma pulmonis, por tratar-se de um

-ção desse agente etiológico, além de apresentar uma economia nos custos de aproximadamente 40%, quando comparado aos custos do teste de ELISA, segundo a avaliação realizada em nosso laboratório.

As diferentes taxas de contaminação encon-tradas pelos diversos autores, provavelmente, deve-se ao fato de as colônias convencionais terem origens e manejo diversos, além de terem sido detectados por diferentes métodos. Os re-sultados apresentados neste artigo referem-se a animais de laboratório mantidos há mais de 30 anos em condições convencionais, data do início

de Medicina da USP, com as barreiras sanitárias sendo introduzidas ao longo dos anos.

5 COnCLUSãO

Os resultados deste estudo sugerem que o emprego da técnica de PCR constitui uma ferra-

infecções por Mycoplasma pulmonis em colônias de camundongos e ratos.

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MyCOPLASMA PULMOniS DEtECtiOn in thE RODEntS RESPiRAtORy tRACt By PCR

Objective: To introduce the PCR technique for detection of Mycoplasma pulmonis in

rats. Methods: DNA extraction was made from a fragment of the trachea, using the PCR primers F: 5’-CA TCT TGG TGT CCA CCTAT - 3’ and R:5’ - ATC CCT CAA TGA GCT GGT

electrophoresis. The viewing and photo documentation were performed under ultravioleta light. Results and Conclusion: The PCR allowed the detection of positive mice, 38% of

that the use of PCR technique was effective for the diagnosis of Mycoplasma pulmonis

Keywords: Mycoplasma pulmonis.

1. Rottem S. Interaction of mycoplasmas with host cells. Physiol

2. Razin S, Yogev D, Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiol Molec Biol

“on being the right size”. Proc Natl Acad

4. Paddenberg R, Wulf S, Weber A,

Internucleosomal DNA fragmentation in cultured cells under conditions reported to induce apoptosis may be caused by mycoplasma endonucleases. Eur J Cell

mycoplasmas and the immune system.

Mycoplasmal and rickettsial diseases.

SH, editors. The laboratory rat. New

7. Timenetsky J, De Lucca RR. Detection of Mycoplasma pulmonis from rats and mice of São Paulo/SP/Brazil. Lab Anim

8. Pinson DM, Schoeb TR, Lin SL. Promotion of Mycoplasma pulmonis

ABSt

RACt

growth in rat tracheal organ cultures by ammonium chloride. Lab Anim Sci.

9. Veilleux C, Razin S, May LH. Detection of Mycoplasma infection

procedures in mycoplamology.

Academic Press; 1996. p. 431-8.

Wiley; 1994. p. 221-3.

Press; 2000. p. 99-132.

12. Won YS, Jeong ES, Park HJ, Lee CH, Nam KH, Kim HC, et al. Microbiological contamination of laboratory mice and rats in Korea from 1999 to 2003. Exp Anim. 2006

13. Liang CT, Shih A, Chang YH, Liu CW, Lee YT, Hsieh WC, et al. Microbial contaminations of laboratory mice and rats in Taiwan from 2004 to 2007. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2009

14. Barreto ML, Nascimento ER,

of Mycoplasma pulmonis in laboratory

rats. Braz J Microbiol. 2002

15.Kim DJ, Park JH, Seok, SH, Cho, SA, Baek, MW, Lee, KH,

of Mycoplasma pulmonis and M.

16. Mahler M, Kohl W. A sorological survey to evaluate contemporary prevalence of viral agents and Mycoplasma pulmonis in laboratory mice and rats in western Europe. Lab

LM, Oliveira RC, Neto RL, Buzinhani M, et al. Detection of Mycoplasma pulmonis in laboratory rats and technicians. Zoonoses Public Health.

18. Nicklas W. Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 2002

Van Herck H, Nicklas W, Rugaya Z, et

on Animal Health. Recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, gerbil, guineapig and rabbit experimental units. Lab Anim. 1996

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