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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Jhenifer Kliemchen Rodrigues
Papel dos androgênios na sobrevida, crescimento e secreção de hormônios
esteróides e anti-mülleriano por folículos de Macaca mulatta cultivados
individualmente em matrix 3-D
Ribeirão Preto/SP
2014
Jhenifer Kliemchen Rodrigues
Papel dos androgênios na sobrevida, crescimento e secreção de hormônios
esteróides e anti-mülleriano por folículos de Macaca mulatta cultivados
individualmente em matrix 3-D
Tese apresentada ao Departamento de Ginecologia e
Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, para obtenção de
título de Doutor em Ginecologia e Obstetrícia.
Área de concentração: Biologia da Reprodução
Orientação: Paula Andrea de Albuquerque Salles Navarro (MD, MSc, PhD)
Ribeirão Preto/SP
2014
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
Rodrigues, Jhenifer Kliemchen
Papel dos androgênios na sobrevida, crescimento e secreção de hormônios esteróides e anti-mülleriano por folículos de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3-D. Ribeirão Preto, 2014.
160 p.
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Biologia da Reprdução.
Orientador: Andrea de Albuquerque Salles Navarro, Paula.
1. Foliculogênese. 2. Androgênios. 3. Cultivo folicular 3D. 4. Esteróides. 5. Testosterona. 6. Dihidrotestosterona.
Jhenifer Kliemchen Rodrigues
Papel dos androgênios na sobrevida, crescimento e secreção de hormônios esteróides
e anti-mülleriano por folículos de Macaca mulatta cultivados individualmente em matrix 3-D
Tese apresentada ao Departamento de Ginecologia e
Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, para obtenção de
título de Doutor em Ginecologia e Obstetrícia, Área
de concentração: Biologia da Reprodução.
Aprovado (a) em: ___/___/___
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ____________________________
Julgamento: ___________________________ Assinatura: ___________________________
Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ____________________________
Julgamento: ___________________________ Assinatura: ___________________________
Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ____________________________
Julgamento: ___________________________ Assinatura: ___________________________
Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ____________________________
Julgamento: ___________________________ Assinatura: ___________________________
Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ____________________________
Julgamento: ___________________________ Assinatura: ___________________________
Dedicatória
Dedico este trabalho a humanidade e as pessoas que possam se beneficiar dos conhecimentos através dele desenvolvidos.
Dedico este trabalho também a minha família, meus queridos pais, irmão, marido e futuro filho.
Agradecimentos
Agradeço antes de tudo a Deus, pela inspiração e pela força, por eu ter encontrado na
ciência um caminho, por meio do qual eu posso contribuir para o desenvolvimento da
humanidade, e também ter encontrado o caminho para minha realização pessoal.
Agradeço aos meus pais, Antonio Claret Rodrigues e Sirleney Kliemchen Rodrigues, pelo
amor e apoio incondicionais desde o dia do meu nascimento, durante os dias em que eu
estava em terras distantes realizando este trabalho e até este momento.
Agradeço ao meu irmão querido, Jhonatan Kliemchen Rodrigues, pelo incentivo, e pelo
apoio e cuidado aos meus pais quando ambos mais precisaram e
eu estava distante.
Agradeço a minha tia e madrinha Leneide Kliemchen, pelo amor e carinho
imensuráveis dedicados a minha mãe quando ela precisou e
eu não podia estar perto.
Agradeço ao meu Puppy, pela alegria de todas as horas, e por ter me proporcionado
tantos momentos agradáveis em que eu precisava me tranquilizar.
Agradeço ao amor da minha vida, Nivaldo Ulisses Agostinho, pela paciência nos dias e
noites em que precisei trabalhar, pelos fins de semana que não pude ir ao clube,
pela ajuda quando precisei formatar um gráfico/tabela ou ajeitar a figura de um artigo,
pelo carinho e atenção nas horas que eu precisei e pelo amor incondicional
que eu posso sentir a cada instante em que está ao meu lado.
Agradeço especialmente ao meu futuro filho Miguel, que a quatro semanas
do dia do seu nascimento já está encarando grandes desafios.
Sem nem mesmo ter consciência de sua importância na minha vida,
já me deu muita força para enfrentar os desafios que surgiram no meu caminho.
Te amo muito meu anjo!
Agradeço a minha querida orientadora Dra. Paula Andrea de Albuqerque Salles Navarro,
pela orientação, pelos conselhos , atenção e carinho sempre prestados, e também
pela oportunidade de me permitir estar nos Estados Unidos
durante o período do meu Doutorado, com o intuito de adquirir novos
conhecimentos e novas experiências.
Paula tornou-se uma amiga muito querida, com quem sei que posso
contar sempre que eu precisar não somente em relação a
questões profissionais. Ela sempre estará em meu coração.
Agradeço a Mary Zelinski, que foi uma mentora para a realização deste trabalho,
pelo carinho com que fui recebida desde o momento em que cheguei nos Estados Unidos,
pelo cuidado em sempre mostrar-se preocupada com meu bem estar, pelos momentos únicos
vividos ao lado dela e sua família, e pelo incentivo e inspiração
para a realização deste trabalho.
Para mim, Mary foi muito mais do que uma mentora. Considero-a como parte de
minha família e sempre a terei presente no meu coração.
Agradeço a Richard Stouffer, que foi um mentor para a realização deste trabalho,
pela atenção com que fui recebeida e pelo carinho com que fui tratada
por ele, por sua esposa e integrantes de seu laboratório,
em especial Cecily Bishop e Ted Molkness.
Durante o perído em seu laboratório, pude vivenciar o que é ser um verdadeiro cientista.
Aprendi valiosas lições de vida. São amigos que sempre irei lembrar por toda a vida.
Com Dick, minha maior lição foi como fazer as perguntas certas, e que muitas vezes
um bom resultado em um trabalho científico depende esscialmente de uma boa pergunta.
Agradeço ao Conn, que foi o responsável por proporcionar minha ida aos Estados Unidos
através da aprovação do meu currículo e cartas de referência,e concessão da
bolsa Fogarty, muito importante para minha estadia fora do país.
Agradeço também a Janete Anselmo Franci, que por sua vez,
foi iluminada e guiada por forças maiores, que me fez o convite e insistiu para que eu fosse.
Sempre terei ambos como figuras muito importantes em minha vida.
Agradeço a todos os meus amigos do Oregon National Research Primate Center/
Oregon Health & Science University, pelo carinho com que fui recebida
e sempre tratada por todos, desde a equipe do laboratório
Jing Xu, Alison Ting, Dick Yeoman, Maralee Lowson, Cecily Bishop, Ted Molkness, Traci,
Jenniffer, Jay, Lee, e as equipes dos outros labratórios, que também tornaram-se amigas.
Um agradecimento muito especial a Jing Xu, que me ensinou como isolar um bom folículo, e
pela contínua ajuda até os dia de hoje com os artigos que escrevemos juntas,
e com os experimentos que desenvolvo no Brasil.
Um agradecimento especial a Francis Pau, diretor da Divisão de Estudos de
Endocrinologia, pela atenção nas horas de discussão para
interpretação de resultados e padronização de testes hormonais.
Pela paciência, que deve ter trazido dos tempos em que viveu na China, em me ouvir falar
de minha mãe e da saudade que tinha da minha terra.
Agradeço a todas as minhas queridas amigas da USP, Jacira Ribeiro Campos,
Michele da Broi, Luciana Azôr Dib, Juliana Meola e Daiane Bulgarelli,
pelo carinho, força e incentivo.
Agredeço aos membros da banca: Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani,pela oportunidade de
ingressarno Laboratório e por ter acreditado na minha capacidade;
Profa. Dra. Ana Carolina Japur de As Rosa e Silva, pela atenção sempre prestada
e pela parceria em nossa importante missão dentro da Rede Brasileira de
Oncofertilidade/Brazilian Oncofertility Consortium;
Profa. Dra. Adriana Bos Mikich, por ter aceito o convite e por
ser sempre uma inspiração para a realização de meus trabalhos;
Prof. Dr. Ricardo Mello Marinho, pelo carinho e atenção sempre prestados,
por ter me recebido na Pró-Criar de portas abertas e por sempre confiar em meu trabalho, e
pela precisa ajuda e trabalho diário para a organização da Rede Brasileira de
Oncofertilidade/Brazilian Oncofertility Consortium e em nossa missão de
contribuir para a preservação da fertilidade em pacientes com câncer.
Agradeço ao Departamento de Ginecologia e Obstetrícia/FMRP/USP, em especial
a secretária Suelen,pela disponibilidade em ajudar sempre, e também pela concessão da
bolsa institucional CAPES, tão importante para a concretização deste trabalho.
Epígrafe
“O cientista não é o homem que fornece as verdadeiras respostas,
é quem faz as verdadeiras perguntas”.
(Claude Lévi-Strauss)
RESUMO
RODRIGUES, JK. Papel dos androgênios na sobrevida, crescimento e secreção de hormônios esteróides e anti-mülleriano por folículos de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. INTRODUÇÃO: Por muito tempo, os androgênios foram considerados como prejudiciais a maturação folicular. Todavia, resultados de estudos com diferentes espécies de mamíferos e humanos tem contribuído para que este paradigma tenha sofrido mudanças consideráveis nos últimos anos. Fortes evidências sugerem que os androgênios possuem ações parácrinas e autócrinas no ovário, e que promovem crescimento folicular precoce. Contudo, a ação androgênica nos folículos pode ser estágio ou dose dependente, e muito pouco se sabe ainda sobre a ação local androgênica no folículo em desenvolvimento. OBJETIVOS: O presente estudo teve como objetivo geral avaliar os efeitos da ablação da produção de esteróides e o papel dos androgênios (testosterona e dehidrosterona) no desenvolvimento de folículos secundários de primatas não humanos (Macaca mulatta) isolados de tecido ovariano a fresco e cultivados in vitro por 40 dias em matrix 3D de alginato. METODOLOGIA: Quatorze fêmeas adultas de Macaca mulata, com ciclos menstruais regulares, foram usadas neste estudo. O córtex ovariano foi cortado em pequenos cubos e os folículos secundários foram mecanicamente isolados e cultivados individualmente durante 40 dias em matriz 3D a base de alginato em meio de cultivo contendo FSH, soro, transferrina, fetuína, insulina e selenito de sódio. Foram realizados 3 experimentos: Experimento 1: Ablação da produção de esteróides, com o uso do trilostano (TRL). Folículos de 6 animais foram distribuídos em 3 grupos – Controle (recebeu veículo), TRL (recebeu TRL desde o início do cultivo) e TRL2 (recebeu TRL após 2 semanas de cultivo); Experimento 2: Reposição de testosterona. Folículos de 4 animais foram distribuídos em 4 grupos: Controle (recebeu veículo), TRL (recebeu TRL desde o início do cultivo), Testosterona (T) baixa (recebeu TRL e testosterona 20 ng/mL), T alta (recebeu TRL e testosterona 50 ng/mL); Experimento 3: Reposição de dehidrotestosterona (DHT). Folículos de 4 animais foram distribuídos em 4 grupos: Controle (recebeu veículo), TRL (recebeu TRL desde o início do cultivo), DHT (recebeu DHT 50 ng/mL), DHT + TRL (recebeu TRL e DHT 50 ng/mL). As variáveis analisadas foram a sobrevida, o crescimento, o desenvolvimento (formação de antro e morfologia) e a produção de hormônios esteróides pelos folículos, além do grau de maturação e qualidade oocitária. RESULTADOS: A porcentagem de folículos sobreviventes em cultivo, o crescimento e a formação de antro foi menor em presença de TRL em todos os experimentos, em comparação com o grupo controle. A reposição de T e DHT, na presença de TRL, recuperaram a sobrevida, o crescimento, a formação de antro, a produção hormonal, e a qualidade e maturidade oocitária, comparáveis ao grupo controle. CONCLUSÕES: Este estudo apresentou evidências do papel local essencial dos androgênios desde o início da foliculogênese em primatas não humanos, fortalecendo a existência de mecanismos moleculares que regulam a atividade androgênica, e trazendo a perspectiva de novas possíveis interações entre os androgênios e outros hormônios esteróides. Nossos achados mostraram claramente que a T e a DHT podem recuperar a sobrevida, o crescimento, a formação de antro, a produção hormonal e a viabilidade oocitária de folículos pré-antrais cultivados in vitro em matrix 3D de alginato, expostos a ablação da produção de esteróides. Os novos conhecimentos oriundos deste estudo contribuem para o melhor entendimento da dinâmica da foliculogênse em primatas, que ainda é muito pouco compreendida, além de auxiliar na identificação das condições ótimas para o cultivo folicular in vitro, cuja melhoria é fundamental para propiciar a obtenção de oócitos maduros saudáveis após o descongelamento do tecido ovariano de pacientes oncológicas que desejam preservar sua fertilidade futura. Palavras-chave: Foliculogênese; androgênios; cultivo folicular 3D; primatas; esteróides; testosterona; dihidrotestosterona
ABSTRACT
RODRIGUES, JK. Role of androgens on survival, growth and secretion of steroid hormones and anti-mülleriano by follicles of Macaca mulata cultured indivuadually in 3D matrix. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. INTRODUCTION: For the longest, androgens have been considered detrimental to follicle maturation. However results from studies with different species of mammals and humans has contributed for this idea has being undergone considerable changes in recent years. Strong evidence suggests that androgens have autocrine and paracrine actions in the ovary, and that promote early follicular growth. However, androgen action on specific stages of follicles may be dose dependent, and very little is known about the androgen local action in the developing follicle. OBJECTIVES: The present study had as main objective to evaluate the effects of ablation of steroid production and the role of androgens (testosterone and dehydrotestosterone) in the development of secondary follicles of non-human primates (rhesus monkeys - Macaca mulatta) isolated from fresh ovarian tissue and cultivated for 5 weeks in 3D alginate matrix. MATERIAL AND METHODS: Fourteen adult female of Macaca mulatta, exhibiting regular menstrual cycles were used in this study. The ovarian cortex was cut into small cubes and secondary follicles were mechanically isolated and cultured for 5 weeks in a 3D alginate matrix and culture medium containing FSH, serum, transferrin, fetuin, insulin and sodium selenite. Experiment 1: Ablation of steroid production with use of trilostane (TRL). Follicles of 6 animals were divided into 3 groups - control (receiving vehicle), TRL (TRL received since the start of culture) and TRL2 (TRL received after 2 weeks of culture); Experiment 2: Testosterone replacement. Follicles of 4 animals were divided into 4 groups: control (receiving vehicle), TRL (TRL received since the start of culture), T Low (TRL + testosterone 20 ng/mL ), high T (TRL + testosterone 50 ng/mL ); Experiment 3: Reinstatement of dihydrotestosterone (DHT). Follicles of 4 animals were divided into 4 groups: control (receiving vehicle), TRL (TRL received since the beginning of culture), DHT (DHT 50 ng/mL), DHT + TRL (TRL + DHT 50 ng/mL). The variables analysed were: survival, growth, follicle development (antrum formation and morphology) and the steroid hormone production), and also the oocyte degree of maturation and viability. RESULTS: The percentage of surviving follicles in culture, growth and antrum formation was lower in the presence of TRL in all experiments, compared with the control group. Replacement of T and DHT in the presence of TRL, recovered the survival, growth, antrum formation, hormone production, and the oocyte quality and maturity. CONCLUSIONS: This in vitro study showed evidence of the essential role of androgens in the early follicular phase in primates, reinforcing the existence of molecular links that regulate the activity of ARs and androgenic activity and possible new interactions between androgens with other steroid hormones. Our findings clearly demonstrated that T and DHT can restore the survival, growth, antrum formation, the hormone production and oocyte viability of preantral follicles cultured in vitro in a 3D alginate matrix exposed to ablation steroid production. The new knowledge that can be obtained by this type of study can help in understanding the dynamics of follicular development process that is still poorly understood and to contribute to the improvement of this in vitro technique that can be used as an alternative for young cancer patients wish to preserve their fertility. Keywords: Folliculogenesis; androgens; 3D follicle culture; primates; steroids; testosterone; dihydrotestosterone
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Síntese e mecanismo de ação dos hormônios esteróides no folículo ovariano ... 26
Figura 2. Esquema ilustrativo das diferentes classes de desenvolvimento folicular .......... 32
Figura 3. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL sobre a sobrevida folicular e a formação de antro de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas ................................... 56
Figura 4. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL sobre a produção de progesterona e pregnenolona por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas ................................... 58
Figura 5. Efeito da reposição de T sobre a sobrevida e formação de antro de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas .......................................................................................................... ...59
Figura 6. Efeito da reposição de T sobre a produção de progesterona e estradiol por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas .................................................................................... 61
Figura 7. Efeito da reposição de T sobre a produção de AMH por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. ... 61
Figura 8. Efeito da reposição de T e DHT sobre a sobrevida de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas ...... ...64
Figura 9. Efeito da reposição de T e DHT sobre a formação de antro de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas ............................................................................................................. 65
Figura 10. Efeito da reposição de T e DHT sobre a produção de progesterona e estradiol por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas ..................................................................................... 67
Figura 11. Efeito da reposição de T e DHT sobre a produção de AMH por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas ............................................................................................................. 68
Figura 12. Folículo secundário em desenvolvimento até a obtenção de embrião................. 70
LISTA DE TABELAS
Tabela I. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL sobre as características de crescimento folicular de folículos secundários de Macaca mulata na quarta semana cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. .......... 57
Tabela II. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL nas características de oócitos coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (34 h após administração de hCG). ....................................................................................... 58
Tabela III. Efeito da reposição de T sobre as características de crescimento folicular de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas.. ................................................................................... 60
Tabela IV. Efeito da reposição de T nas características de oócitos coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (34 h após administração de hCG).). .................. 63
Tabela V. Efeito da reposição de T e DHT sobre as características de crescimento folicular de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas .................................................... 66
Tabela VI. Efeito da reposição de T e DHT nas características de oócitos coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (34 h após administração de hCG) ...... 69
LISTA DE SIGLAS
3D – Tridimencional
3-βHSD - 3-beta-hidroxiesteróide desidrogenase
AMH - Hormônio anti-Mulleriano
ARs – Receptores androgênicos
ART - Assisted Reproductive Technology
CGs – Células da granulosa
CRTL – Controle
DHEA – Dehidroepiandrosterona
DHT – Dididrotestosterona
EGF - Fator de crescimento epidérmico
ERs – Receptores estrogênicos
FIV – Fertilização in vitro
FSH – Hormônio folículo estimulante
hCG - Gonadotrofina coriônica humana
ICSI - Injeção intracitoplasmática do espermatozoide
IGF-1 - Fator semelhante a insulina
LH – Hormônio luteinizante
MAPK - kinase ativada por mitógenos
MI – Metáfase I
MII – Metáfase II
MPF - Fator promotor da maturação
ONPRC - Oregon National Primate Research Center
PRs – Receptores progestagênicos
S-DHEA - Sulfato de dehidroepiandrosterona
SOP – Síndrome dos ovários policísticos
T – Testosterona
TRL – Trilostano
TRL2 – Trilostano 2
TZPs - Projeções transzonais
VG – Vesícula germinativa
ZP – Zona pelúcida
SUMÁRIO
Introdução ............................................................................................................................... 19
Revisão da Literatura ............................................................................................................. 22
Foliculogênese .......................................................................................................................... 23
Hormônios ................................................................................................................................ 24
Estradiol .................................................................................................................................... 27
Progesterona ............................................................................................................................. 28
Androgênios ............................................................................................................................. 29
Classificação de folículos ovarianos ........................................................................................ 31
Folículos primordiais ................................................................................................................ 32
Folículos primários ................................................................................................................... 33
Folículos secundários ............................................................................................................... 34
Folículos terciários ou antrais ................................................................................................... 35
Folículo pré-ovulatório ............................................................................................................. 36
Maturação oocitária .................................................................................................................. 37
Ciclo ovariano em primatas não-humanos ............................................................................... 38
Técnicas de isolamento folicular .............................................................................................. 38
Cultivo folicular ........................................................................................................................ 40
Cultivo folicular em humanos .................................................................................................. 44
Objetivos .................................................................................................................................. 47
Objetivo Geral .......................................................................................................................... 48
Objetivos Específicos ............................................................................................................... 48
Material e Métodos ................................................................................................................. 49
Animais e coleta ovariana......................................................................................................... 50
Isolamento folicular, encapsulamento e cultivo ....................................................................... 51
Experimento 1: Ablação da esteroidogênese ............................................................................ 52
Experimento 2: Reposição de testosterona ............................................................................... 52
Experimento 3: Reposição de dihidrotestosterona ................................................................... 52
Sobrevida folicular, crescimento e formação de antro ............................................................. 53
Classificação do Crescimento folicular .................................................................................... 53
Dosagem de esteróides ovarianos e AMH ................................................................................ 53
Coleta de oócitos, maturação e fertilização .............................................................................. 54
Análise estatística ..................................................................................................................... 54
Resultados ............................................................................................................................... 55
Experimento 1 - Ablação da esteroidogênese........................................................................... 56
Experimento 2 – Reposição de testosterona ............................................................................. 59
Experimento 3 – Reposição de dihidrotestosterona ................................................................. 64
Discussão ................................................................................................................................. 71
Conclusões ............................................................................................................................... 80
Referências .............................................................................................................................. 82
Anexos .................................................................................................................................... 101
Anexo A - Manuscrito Title: Direct actions of androgen on the survival, growth and secretion of steroids and anti-mullerian hormone by individual follicles from rhesus monkeys during 3-D culture ................................................................................................... 102
Anexo B - Artigo de revisão submetido In vitro follicle maturation: potential for fertility preservation in patients with cancer ....................................................................................... 131
Introdução
Introdução | 20
Além do reconhecido papel dos androgênios como precursores do hormônio esteróide,
estradiol, e possíveis ações endócrinas no sexo feminino, evidências consideráveis sugerem
que os androgênios possuem ações parácrinas e autócrinas no ovário, particularmente no
folículo em desenvolvimento (ALBERTINI et al., 2001; KIMURA et al., 2007; LENIE,
SMITZ, 2009; WALTERS et al., 2008; 2012). Estudos recentes reportando a expressão de
receptores de androgênio (ARs) em folículos em desenvolvimento (KIMURA et al., 2007;
LENIE, SMITZ, 2009) são consistentes com o papel essencial dos androgênios na fisiologia
reprodutiva do sexo feminino (WALTERS et al., 2008; WALTERS et al., 2010; LEBBE,
WOODRUFF, 2013). Evidências da presença e atividade de ARs em todos os estágios do
crescimento folicular em diferentes espécies (WALTERS et al., 2008; 2012) incluindo
murinos (TETSUKA et al., 1995; SEM, HAMMES, 2010; XUE et al., 2012; 2013), suínos
(CAMPO et al., 1985a; CÁRDENAS, POPE, 2002), bovinos (BRAW-TAL, YOSSEFI, 1997;
HAMPTON et al., 2004; GLISTER, et al., 2010), primatas não-humanos (HILLIER et al.,
1997; WEIL et al., 1998; DUFFY et al., 1999; MCEWAN et al., 2010) e humanos (HORIE et
al., 1992; SUZUKI et al., 1994; KIM et al., 2011) sugerem que os androgênios possuem
efeitos ao longo do desenvolvimento folicular. Por meio de observações em camundongos
fêmea, foi descoberto que a inativação de ARs resulta em falência ovariana prematura (FOP),
indicando que o processo de foliculogênese normal requer ação androgênica mediada por
receptores androgênicos (KIMURA et al., 2007; SEM, HAMMES, 2010; XUE et al., 2013).
Em ovários humanos, pode ser observada a expressão proteica de ARs nas células da
granulosa, células da teca e células do estroma durante quase todos os estágios do ciclo
menstrual. Contudo, existe uma diferença entre as observações em relação a intensidade
imunohistoquímica observada nos estudos que comprovam este fato (HORIE et al., 1992), o
que pode estar relacionado a uma expressão variável destes receptores, que depende do status
do desenvolvimento folicular (DRUMMOND, 2006).
Evidências sugerem que os androgênios promovem crescimento folicular precoce
(HILLIER, DE ZWART, 1981; DURLINGER et al., 2000; YOUNG et al., 2012). Em
sistemas de cultivo in vitro de folículos de camundongo, a exposição a androgênios contribuiu
para o desenvolvimento de folículos pré-antrais (MURRAY et al., 1998); e aumentou o
diâmetro folicular (WANG et al., 2001). Outros estudos também observaram que doses
farmacológicas de testosterona promovem desenvolvimento precoce em folículos de bovinos
(YANG, FORTUNE, 2006) e macacos (HARLOW et al., 1986; 1988; VENDOLA et al.,
1999a). Estes dados reforçam os esforços clínicos em determinar se o pré-tratamento com
testosterona transdérmica contribuí para o aumento da resposta ovariana a gonadotrofinas em
Introdução | 21
pacientes má-respondedoras em ciclos de fertilização in vitro (FIV) (BALASCH et al., 2006;
FÁBREGUES et al., 2009; SONMEZER et al., 2009a; SÖNMEZER et al., 2009b; WISER et
al., 2010).
Contudo, a ação androgênica nos folículos pode ser estágio e/ou dose dependente. Por
exemplo, a ação androgênica pode se tornar prejudicial em folículos antrais, mostrando
efeitos anti-maturação e anti-crescimento neste estágio (HILLIER, DE ZWART, 1981;
DURLINGER et al., 2000; YOUNG et al., 2012). Desta forma, foi proposto que as ações dos
androgênios podem ser, dependendo do estágio folicular, promotores ou inibidores do
crescimento folicular (HILLIER, TETSUKA, 1997; VENDOLA et al., 1998). A ação
androgênica pode também depender de seus níveis intrafoliculares, com baixos níveis
exigidos para uma foliculogênese normal e níveis aumentados causando uma disfunção
folicular. Estudos com mulheres portadores da síndrome dos ovários policísticos (SOP),
frequentemente sugerem que a hiperandrogenia afeta negativamente o desenvolvimento
folicular e a maturação oocitária (DUMESIC et al., 2008; LEBBE, WOODRUFF, 2013).
Estudos mais detalhados são necessários para definir os efeitos diretos dos
androgênios nos folículos (HARLOW et al., 1988; VENDOLA et al., 1999a, YANG,
FORTUNE, 2006) e seus oócitos (VENDOLA et al., 1999b) em estágios específicos da
foliculogênese, principalmente em primatas, o que estimulou a realização do presente estudo.
O sistema de cultivo tridimensional (3D), usando folículos individuais encapsulados no
biomaterial alginato (XU et al., 2009b; XU et al., 2010), podem contribuir para estudos sobre
as ações diretas de hormônios e fatores locais na foliculogênese em primatas. Recentemente
este sistema de cultivo foi usado por nosso grupo para o desenvolvimento de folículos de
primatas (macacos rhesus) a partir do estágio pré-antral (secundário) até estágio antral de
pequeno diâmetro, com a obtenção de função esteroidogênica e maturação oocitária (XU et
al., 2009a,b; 2010). O presente estudo teve como objetivo, avaliar pela primeira vez as ações
dos androgênios no desenvolvimento folicular (sobrevida, formação de antro, produção
hormonal e maturação oocitária), em folículos pré-antrais individuais de primatas (macacos
rhesus), usando o sistema de cultivo em matrix 3D, por meio da ablação da produção de
esteróides e reposição de testosterona (T) e dihidrotestosterona (DHT).
Revisão da Literatura
Revisão da Literatura | 23
Foliculogênese
O desenvolvimento folicular ovariano consiste em um processo cíclico e contínuo,
dependente de sinais endócrinos, parácrinos e autócrinos. Apesar de diferentes fatores
envolvidos no crescimento folicular já terem sido identificados e caracterizados, permanece
desconhecido o motivo pelo qual um ou mais folículos, dependendo da espécie, chega ao
estágio dominante e o restante regride (VAN DEN HURK, ZHAO, 2005).
O ovário é uma estrutura compartimentalizada, com diferentes e variáveis
propriedades biológicas. Em resposta à secreção cíclica de Hormônio Folículo Estimulante
(FSH) e Hormônio Luteinizante (LH), os compartimentos somático e germinativo do folículo
ovariano interagem de forma altamente integrada para desempenhar duas funções principais:
uma endócrina, produção e liberação dos hormônios esteróides e outros peptídios, e a outra
gametogênica, produção de um oócito fertilizável (NAVARRO et al., 2012).
Em humanos, com aproximadamente 20 semanas de gestação, 6 a 7 milhões de células
germinativas, 70% de oócitos primários e 30% de oogônias, estão presentes nos ovários (BAKER,
1963). A perda pré-natal da maioria dos oócitos parece ser um mecanismo universal. As oogônias
que não são transformadas em oócitos primários passarão por atresia com rápido declínio durante
a vida fetal, resultando em um total de 1 a 2 milhões de folículos primordiais ao nascimento.
Como a mitose de células germinativas supostamente não ocorre após o nascimento e a atresia
folicular continua, apenas 300 a 500 mil células germinativas estão presentes nos ovários durante
a puberdade (BAKER, 1963). Esta população finita de folículos representa o capital de células
germinativas disponíveis para entrar no ciclo folicular. Apesar do conceito bem estabelecido sobre
o estoque finito e não renovável de células germinativas, estudos recentes mostram indícios da
continuidade da oogênese e foliculogênese no período pós-natal, pela diferenciação de células-
tronco (JOHNSON et al., 2004). Todavia ainda não se sabe se ela realmente ocorre naturalmente e
em quais condições (NAVARRO et al., 2012).
A foliculogênese inclui o desenvolvimento do folículo primordial em primário,
secundário, pré-antral, antral inicial e pré-ovulatório (ou De Graff). Do estágio pré-antral ao
pré-ovulatório, tem duração média estimada em 100 dias no ovário humano (GOUGEON,
1996). Tem sido demonstrado que a influência relativa do oócito na foliculogênese é maior
nos folículos primordiais e pré-antrais, enquanto o componente somático, células da granulosa
e as gonadotrofinas, exercem sua maior influência durante as últimas fases do
desenvolvimento folicular (NAVARRO et al., 2012).
Nos primeiros dias do ciclo menstrual, os níveis circulantes de FSH aumentam, e por
consequência, um grupo de folículos antrais não sofre mais o processo de apoptose, que os levariam
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à atresia folicular. Dentro deste grupo, alguns folículos começam a crescer mais rapidamente e a
produzir maiores quantidades de estrógeno e inibina. Um deles é dominante e então selecionado à
ovulação. O folículo selecionado torna-se altamente sensível ao FSH, devido à expressão aumentada
de receptores de FSH e LH, produzindo mais estrógeno do que os folículos remanescentes.
O aumento de estradiol e inibina desencadeia um mecanismo de feedback negativo,
que previne outros folículos de continuar seu desenvolvimento (MCGEE, HSUEH, 2000;
ZELEZNIK et al., 1981). As células da teca e da granulosa também apresentam um papel
importante, uma vez que são responsáveis pela produção de hormônios esteróides, necessários
para um normal crescimento folicular. Além disso, fatores de crescimento ovarianos, citocinas
e neuropeptídios, como por exemplo, os fatores fator de crescimento epidermal (EGF), fator
de crescimento transformante alpha (TGF- α), o fator ligante de heparina semelhante ao EGF
(HB-EGF), a anfiregulina, fator semelhante a insulina (IGF-I) participam como reguladores
do desenvolvimento folicular (PICTON et al., 2008; TESONE et al., 2009).
O decréscimo nos níveis de FSH gera uma diminuição da atividade da aromatase
dependente do FSH, o que limita a disponibilidade de estrógeno para os folículos menos
maduros, levando-os à atresia, enquanto no folículo dominante, a teca torna-se mais
vascularizada, gerando um maior fornecimento de FSH ao folículo, o que resulta na
estimulação da proliferação das células da granulosa (TESONE et al., 2009).
O microambiente do antro do folículo dominante facilita o acesso de FSH e LH, e com
isso, amplifica os sinais autócrinos e parácrinos do ovário. A síntese de hormônios esteróides,
androgênios, estrogênios e progestagênios, é compartimentalizada entre os folículos no ovário
(MCNATTY et al., 1979; HILLIER et al., 1980). As células da granulosa, em resposta às
gonadotrofinas, produzem progesterona, que se difunde pelas células da teca, que serve como
substrato para síntese de androgênio sob o controle do LH (MCNATTY, 1980). Os
androgênios se difundem através da membrana basal para as células da granulosa, onde são
aromatizados em estrogênios sob o controle do FSH (MOON et al., 1978).
Enquanto dentro de um mesmo folículo todas as células estão expostas a um mesmo
microambiente, existem outros folículos no ovário em diferentes estágios de crescimento e
desenvolvimento.
Hormônios
Hormônios esteróides são moléculas lipídicas que têm como precursor comum o
colesterol, sintetizados por desidrogenases e enzimas do citocromo P450. Há quatro grandes
classes de hormônios esteroidais: progestinas, androgênios, estrogênios e corticoides. Todos
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eles estão relacionados ao processo da foliculogênese. Apesar do grande número de trabalhos
relacionados com o estudo dos esteróides, alguns aspectos relativos à síntese e ao mecanismo
de ação destes hormônios ainda permanecem pouco esclarecidos.
Estudos demonstram que o estradiol pode inibir a apoptose de células foliculares e luteais
em suínos (MURDOCH, 1998) e promover o crescimento in vitro de folículos ovarianos bovinos
(HULSHOF et al., 1995). Além disso, este hormônio, em associação ao FSH, é capaz de manter a
viabilidade folicular em caprinos após sete dias de cultivo in vitro (LIMA-VERDE et al., 2010). A
progesterona, além de regular os níveis de gonadotrofinas, pode ser capaz de inibir a apoptose de
células da granulosa e da teca em camundongos (PELUSO, 2006). Alguns estudos com primatas
mostraram que os androgênios são reguladores positivos do desenvolvimento folicular,
aumentando os receptores para FSH em células da granulosa e promovendo o crescimento de
pequenos folículos (VENDOLA et al., 1998; WEIL et al., 1999).
Sob a ação do LH nas células da teca, o colesterol circulante é captado e convertido
em pregnenolona, e esta em progesterona, por meio da enzima 3β-hidroxidesidrogenase
(VALDEZ et al., 2005; MIZRACHI, AUCHUS, 2009; Fig. 1). A StAR (proteína reguladora
aguda da esteroidogênese) faz o transporte do colesterol para dentro da mitocôndria, onde se
encontra a enzima desmolase, pertencente ao complexo enzimático P450, que participa da
conversão do colesterol em pregnenolona (GIOMETTI et al., 2009). Após ser produzida, a
progesterona poderá exercer suas funções biológicas no organismo ou servir como substrato
para a produção de androstenediona, mediante a atuação da enzima 17,20-liase. Assim como a
progesterona, a androstenediona poderá atuar nas suas funções orgânicas ou ser convertida em
outro androgêno, a testosterona, sob a ação da 17β-redutase.
Este hormônio, por sua vez, poderá atuar no organismo, convertendo-se em di-
hidrotestosterona pela enzima 5α-redutase ou penetrar nas células da granulosa e ser
convertido em estradiol pela enzima aromatase, que tem sua atividade estimulada pela atuação
do FSH nas células da granulosa (DRUMMOND, FINDLAY, 1999; YARAK et al., 2005;
STOCCO, 2008). O estradiol também pode ser produzido por uma segunda via, na qual a
androstenediona sofre aromatização nas células da granulosa e é convertida em estrona, e esta
em estradiol, pela enzima 17β-redutase (YARAK et al., 2005). As altas concentrações de
estradiol antes da ovulação inibem a ação do FSH nas células da granulosa e promovem o
estímulo para a produção de mais progesterona, devido ao início do processo de luteinização,
no qual este hormônio é produzido em grandes quantidades. A figura 1 resume a síntese e o
mecanismo de ação dos hormônios esteróides no folículo ovariano.
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Figura 1. Síntese e mecanismo de ação dos hormônios esteróides no folículo ovariano.
Nota. LH: Hormônio luteinizante; FSH: Hormônio folículo estimulante; P450: Enzima responsável pela conversão de pregnenolona em 17-α-hidroxipregnenolona. (LIMA-VERDE et al., 2010).
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O IGF-1, por meio de seu receptor em CG, promove o aumento dos níveis de
gonadotrofinas e estimula a atividade da aromatase, provocando a diferenciação de células da
granulosa, e suprimindo a apoptose folicular (MCGEE, HSUEH, 2000; MINEGISHI, et al.,
2000). Dependendo do estágio de desenvolvimento folicular, a esteroidogênese nas células da
granulosa pode aumentar ou diminuir. Em folículos pré-antrais, a atividade P450 é baixa, mas
com altos níveis de expressão dos receptores de androgênios. A androstenediona se difunde a
partir das células da teca para as células da granulosa, onde é convertida em testosterona. A
testosterona ativa, então, os receptores de androgênios, levando a um aumento da expressão
de IGF-1 e, consequentemente, à estimulação da proliferação das células da granulosa e ao
aumento dos efeitos do FSH induzidos pela P450 (VENDOLA et al., 1999b).
A ação dos esteróides nas suas células-alvo se dá via receptores nucleares específicos,
presentes nos ovários de diferentes espécies, tais como ovinos (JUENGEL et al., 2006),
primatas (SAUNDERS et al., 2000), bovinos (VAN DEN BROECK et al., 2002) e suínos
(CARDENAS, POPE, 2002). Além disso, foi relatado que estes hormônios podem atuar
através de canais de cálcio na membrana celular, em regiões onde seus receptores não estão
presentes (GUTIERREZ et al., 2008). Dessa forma, os efeitos dos esteróides nas células
podem ocorrer pelo método clássico, via receptores, e pelo método não genômico, que não
envolve a modificação de atividade gênica (DODE, GRAVES, 2003).
Estradiol
Os efeitos biológicos do estradiol (E2) foram inicialmente identificados como sendo
relacionados com a reprodução e a fertilidade. As funções fisiológicas do E2 compreendem
desenvolvimento de características sexuais secundárias, regulação da secreção de
gonadotrofinas para a ovulação, síntese de lipoproteínas, preparação dos tecidos para
responder à progesterona, manutenção da massa óssea, prevenção da atrofia do trato
urogenital e manutenção das funções cognitivas (NELSON, BULUN, 2001).
A capacidade dos folículos de produzirem estrogênios aparece primeiramente em
estádios pré-antrais avançados. Apesar de ser relatada atividade aromática em pequenos
folículos pré-antrais, a produção de E2 neste estágio de desenvolvimento é limitada pela
incapacidade de produção de substratos para os androgênios necessários para a aromatização
do E2 (DRUMMOND, FINDLAY, 1999). Apesar disso, já foi demonstrada a produção de
estradiol por folículos pré-antrais durante o cultivo in vitro (BISHONGA et al., 2001; XU et
al., 2010).
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Apesar da ação do E2 ser mediada por receptores, existem evidências de que o E2
pode atuar diretamente nos oócitos produzindo mudanças nos seus mecanismos de liberação
de Ca, supostamente envolvido na maturação citoplasmática (CHIAN et al., 1999).
As ações proliferativas do E2 e do FSH foram primeiro relatadas em ratas
hipofisectomizadas, nas quais o tratamento com E2 exógeno resultou na proliferação de
células da granulosa em pequenos folículos pré-antrais e uma concomitante redução da atresia
(WILLIAMS, 1940; PAYNE, HELLBAUM, 1955), mas não na formação de antro
(GOLDENBERG et al., 1972). Também foi demonstrado que a combinação E2 e FSH ou
androgênio e FSH pode estimular a proliferação de células da granulosa in vitro, e este efeito
pode ser amplificado pela insulina ou IGF-1 (BLEY et al., 1997). Bolamba et al. (2006)
cultivaram folículos pre-antrais avançados e folículos antrais para MIV e demonstraram haver
interação entre E2, FSH, LH e fator de crescimento epidermal (EGF) na promoção e expansão
das células do cumulus. Rao et al. (2002) obtiveram altas taxas de maturação oocitária
utilizando soro de ovelha em estro, FSH, LH e E2.
Progesterona
A progesterona (P4) é um hormônio esteróide sintetizado pelo ovário, com sua
quantidade secretada dependendo dos estímulos das gonadotrofinas e do status fisiológico do
ovário. Além disso, células da granulosa, células da teca, do estroma e luteais secretam P4 em
diferentes níveis (GORE-LANGTON, ARMSTRONG, 1988; DULEBA et al., 1999). Uma
vez secretada pelo ovário, a P4 atua no eixo hipotalâmico-hipofisário regulando a secreção de
gonadotrofinas e, consequentemente, o crescimento folicular, a ovulação e a luteinização
(PELUSO, 2006).
Os efeitos da P4 no ovário são mediados indiretamente, via eixo hipotalâmico-
hipofisário, ou diretamente, via interações com os seus receptores no ovário
(SLOMCZYNSKA et al., 2000). Existem duas formas funcionais de receptores para a P4:
PRA e PRB (GAVA et al., 2004). Ovários de camundongos com deficiência do receptor PRA
contêm vários folículos anovulatórios e uma redução no número de ovulações (MULAC-
JERICEVIC et al., 2000). Comparativamente, camundongos com deficiência do PRB
desenvolvem ovários funcionais normais, os quais ovulam em resposta às gonadotrofinas e
geram crias normais (MULAC-JERICEVIC et al., 2003). Em humanos e outros primatas,
PRA e PRB são expressos igualmente nas CG de folículos pré-ovulatórios (SUZUKI et al.,
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1994; DUFFY, STOUFFER, 1995), e ambos continuam a ser expressos no corpo lúteo
durante a fase luteal do ciclo (OTTANDER et al., 2000).
Estudos in vitro mostraram que a P4 aumenta a sua própria secreção pelas células da
granulosa (SCHREIBER et al., 1980), suprime a produção de E2 (FORTUNE, VINCENT,
1983) e reduz a taxa mitótica nessas células (PELUSO, PAPPALARDO, 1998). Com relação
à maturação oocitária, já foi demonstrado que a suplementação do meio de MIV com E2 ou
P4 isolados aumentou a taxa de oócitos maduros (MII) em caninos (KIM et al., 2005). A
suplementação do meio com E2 e P4 juntos pode aumentar ou reduzir a taxa de MII,
dependendo da concentração de P4 (melhores resultados em altas concentrações). Também
em cadelas, a suplementação do meio de MIV com 20 ug/mL de P4 aumentou as taxas de
maturação oócitária na presença de co-cultivo com células do oviduto (VANNUCCHI et al.,
2006). Em primatas não humanos, a suplementação com P4 na presença ou ausência de
gonadotrofinas não melhorou a maturação nuclear oocitária, mas melhorou o
desenvolvimento embrionário após MIV-FIV (ZHENG et al., 2003).
Androgênios
Os androgênios são os esteróides sexuais circulantes mais abundantes, tanto no
homem quanto na mulher, e são precursores obrigatórios na biossíntese dos estrogênios. Na
mulher, circulam em concentrações na faixa do nanomolar enquanto os estrogênios têm
concentração na faixa do picomolar (GOETZ et al., 2010).
Durante a foliculogênese, os androgênios são sintetizados pelas células da teca de
folículos em crescimento em resposta ao LH. São secretados cinco androgênios: testosterona,
sulfato de dehidroepiandrosterona (S-DHEA), dehidroepiandrosterona (DHEA),
androstenediona e androstenediol, que possui atividade androgênica e estrogênica. S-DHEA,
DHEA e androstenediona são precursores da testosterona, sendo que apenas a testosterona e
seu metabólito ativo, a dehidrosterona (DHT), possuem atividade androgênica direta, ativando
receptores androgênicos (GOETZ et al., 2010).
Os androgênios se difundem através da membrana basal do folículo e nas células da
granulosa, atuando como substrato da aromatase, sendo precursores de estradiol; e como
hormônio, via receptores, potencializam a ação do FSH nas enzimas estrogênicas (CHENG et
al., 2002; TANIGUCHI et al., 2007). Os androgênios são os esteróides predominantes
produzidos durante o desenvolvimento folicular inicial e estão presentes em altas
concentrações no fluido folicular.
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Os receptores de androgênios (ARs) já foram localizados em célula da granulosa de
folículos em desenvolvimento de ovelhas (CAMPO et al., 1985b), galinhas (YOSHIMURA et
al., 1993), macacas (HILD-PETITO et al., 1991) e mulheres (HORIE et al., 1992), e em
folículos pré-antrais e antrais de ratas (TETSUKA et al., 1995). Esses receptores também
foram encontrados no corpo lúteo de porcas (SLOMCZYNSKA et al., 2000) e macacas
(DUFFY et al., 1999). Além disso, foi demonstrado que a presença de androgênios causou um
aparecimento rápido de Ca no citoplasma de células da granulosa luteinizadas em mulheres,
sugerindo que a ação desses hormônios pode ocorrer também via canais de cálcio na
membrana plasmática (MACHELON, NOME, TESARIK, 1998).
Algumas evidências sugerem que os ARs podem ter efeitos no citoplasma das células,
mimetizando a ação de alguns fatores de crescimento (CATO, PETERZIEL, 1998). O
tratamento de camundongos fêmea com androgênios aumentou o número de folículos
primários no ovário e a expressão do RNAm para receptores de IGF-1 (IGF-1R) em oócitos
de folículos primordiais (VENDOLA et al., 1999). Além disso, foi demonstrado que os
androgênios induzem o aparecimento de receptores para fatores de crescimento (GDF-9,
TGFβ) nas células da granulosa e no oócito (HICKEY et al., 2005).
No ovário, as células da granulosa são altamente responsivas aos androgênios,
notadamente à T e à DHT. Estes são absorvidos pelas secreções das células da teca ou são
produzidos internamente por meio da conversão enzimática de precursores de androgênios
(YARAK et al., 2005). Já a androstenediona possui baixa afinidade com os ARs, apesar de
estar em grande quantidade na circulação. Este hormônio pode mediar sua ação através de sua
conversão intrácrina a um androgênio mais potente, como a T ou a DHT, que possuem maior
afinidade aos ARs (GOYENECHE et al., 2002).
Em folículos pré-antrais, existe uma baixa atividade da aromatase e altos níveis de
expressão de AR. Conforme o desenvolvimento folicular progride, ocorre uma modificação
no ambiente de androgênio dominante para estrogênio dominante, e o folículo, então, chega
aos estágios antral e pré-ovulatório (HICKEY et al., 2004). Desta forma, a maturação folicular
do estágio pré-antral até o pré-ovulatório é marcada por uma transição no papel dos
androgênios de hormônio a substrato (COUSE, HEWITT, KORACH, 2006). Se esta transição
falha, o nível intrafolicular de andrógenos fica acima da capacidade esteroidogênica das
células da granulosa, levando a um acúmulo e, posterior atresia (GOYENECHE et al., 2002;
ZELEZNIK et al., 2004).
Alguns estudos com primatas mostraram que os androgênios são reguladores positivos
do desenvolvimento folicular, aumentando os receptores para FSH em células da granulosa e
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promovendo o crescimento de pequenos folículos (VENDOLA et al., 1998; WEIL et al.,
1999). Além disso, Yang e Fortune (2006) demonstraram que a adição de testosterona ao
meio de cultivo de folículos pré-antrais bovinos estimula o crescimento destes. No entanto, os
androgênios podem aumentar a responsividade de folículos em desenvolvimento ao FSH,
resultando em uma secreção prematura de estradiol. Tal fato pode levar à inibição da secreção
de FSH e à consequente parada do desenvolvimento desses folículos (KAIPIA, HSUEH,
1997; Pradeep et al., 2002). Ainda, os androgênios podem exercer efeitos antagonistas na
função folicular quando presentes em altas concentrações, inibindo o desenvolvimento
folicular (GOYENECHE et al., 2002; ZELEZNIK et al., 2004).
Classificação de folículos ovarianos
Os folículos ovarianos pré-antrais podem ser classificados de acordo com: o tamanho,
pela medida do diâmetro folicular; o grau de evolução, observando-se o número de camadas
de células da granulosa (CGs); e a viabilidade, como normais ou atrésicos. A classificação dos
folículos pré-antrais foi inicialmente proposta por Mandl e Zuckerman (1951), que
caracterizaram os folículos em estágios de acordo com o número de camadas de CGs ao redor
do oócito: 1, oócito rodeado por uma camada simples de CGs achatadas; 2, oócito em
crescimento rodeado por uma camada simples de CGs cuboidais; 3, oócito em crescimento
rodeado por duas camadas de CGs cuboidais; 4, oócito em crescimento rodeado por três
camadas de CGs cuboidais; 5, oócito em crescimento rodeado por quatro ou mais camadas de
CGs cuboidais, mas sem cavidade antral. Em 1994, Hulshof et al. classificaram os folículos
pré-antrais em primordiais, primários e secundários, estabelecendo que os folículos
primordiais e primários não poderiam ser distinguidos pelo diâmetro, mas sim, por diferenças
morfológicas. Segundo este estudo, os folículos primordiais apresentavam um oócito rodeado
por uma camada de 4 a 8 CGs achatadas, os primários mostravam um oócito rodeado por uma
camada de 11 a 12 CGs cuboidais e os secundários, mais de uma camada de CGs cuboidais.
Os folículos pré-antrais podem também ser classificados segundo alguns autores em
primordial inativo, primordial ativado, primário e secundário (FAIR et al., 1997). Mas em
geral, a literatura descreve os folículos primordiais com poucas CGs achatadas ao redor do
oócito, enquanto os folículos primários são caracterizados por oócitos rodeados por uma
camada completa de CGs cuboidais (VAN DEN HURK et al., 1998; PICTON, 2001). A
figura 2 ilustra as diferentes classes de desenvolvimento folicular.
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Quando classificados de acordo com seu grau de viabilidade, os folículos pré-antrais
podem ser: saudáveis, quando apresentam lâmina basal intacta, oócito com até 3 vacúolos
citoplasmáticos pequenos, vesícula germinativa e nucléolo intactos; folículos em atresia
inicial estágio I, quando possuí oócito com mais de 3 vacúolos citoplasmáticos e em início de
descondensação da cromatina; folículos em atresia moderada estágio II, quando no oócito o
nucléolo e o citoplasma apresentam-se em fragmentação e a cromatina altamente condensada;
ou folículos com atresia acentuada estágio III, quando o oócito está completamente
fragmentado ou ausente (BUTLER, 1970; WANDJI et al., 1996).
Figura 2. Esquema ilustrativo das diferentes classes de desenvolvimento folicular (LIMA−VERDE et al., 2010).
Folículos primordiais
Os gametas femininos são armazenados em estado quiescente no ovário na forma de
folículos primordiais constituídos de um oócito imaturo de aproximadamente 25 µm de
diâmetro, em estágio de vesícula germinativa (VG) ou diplóteno da Prófase I, uma única
camada de células pré-granulosas pavimentosas e a membrana basal, a qual confere limitado
acesso ao sistema endócrino (HUTT, MCLAUGHLIN, HOLLAND, 2006). No folículo
primordial, iniciam-se, dentre outros eventos, a expressão gênica para a síntese de proteínas
constituintes da zona pelúcida. Nesta fase a esteroidogênese é independe de gonadotrofinas; o
oócito e as células da granulosa ainda não expressam receptores e o controle da
esteroidogênese se dá por meio de mecanismos autócrinos e parácrinos (NAVARRO et al.,
2012).
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O folículo primordial representa o estágio a partir do qual os folículos são recrutados
para o crescimento e, cada um apresenta um oócito rodeado por uma camada de células da
granulosa (CGs) achatadas, envolvida por uma membrana basal (TELFER et al., 2000).
Nestes folículos, o núcleo do oócito ocupa uma posição central e o nucléolo é
evidente. As organelas são uniformemente distribuídas no citoplasma ou bem próximas ao
núcleo. A organela mais evidente é a mitocôndria, predominantemente redonda, o retículo
endoplasmático liso e o Complexo de Golgi são pouco desenvolvidos e várias vesículas estão
espalhadas pelo citoplasma (LUCCI et al., 2001).
Quando a população de folículos primordiais é estabelecida, grupos de folículos,
gradualmente deixam o “pool” bloqueado e entram em fase de crescimento. Os fatores que
determinam a ativação folicular ou processo pelo qual dão origem ao seu crescimento, sua
diferenciação e acúmulo de organelas citoplasmáticas, e a seleção de alguns folículos
primordiais, enquanto outros permanecem bloqueados ainda são pouco compreendidos
(FORTUNE et al., 2000). Portanto, os mecanismos envolvidos na ativação do folículo
primordial, representam uma importante linha de pesquisa da biologia ovariana
(JEWGENOW, GÖRITZ, 1995).
Folículos primários
O mecanismo de recrutamento de um folículo primordial para o pool de crescimento
ainda e desconhecido. A ativação folicular é um processo irreversível pelo qual os folículos
primordiais iniciam o crescimento e remodelamento das células granulosas de pavimentosas a
cuboidais. Este evento da foliculogênese ocorre continuamente e parece não estar associado
ao padrão cíclico de liberação das gonadotrofinas, podendo ocorrer espontaneamente in vitro
em algumas espécies (NAVARRO et al., 2012).
O desenvolvimento dos folículos pré-antrais parece estar relacionado ao aumento do
diâmetro do oócito, bem como a proliferação das células da granulosa (FIGUEIREDO et al.,
1994). A atividade de proliferação destas celulas resulta na formação de uma camada de
células cuboidais ao redor do oócito que caracterizam o folículo primário. A partir deste
momento, as células da granulosa tornam-se mais volumosas e multiplicam-se por mitoses.
A zona pelúcida (ZP) aparece primeiramente ao redor do oócito do folículo primário,
como ilhas de material fibrilar situadas em espaços entre as células da granulosa adjacentes e
a superfície do oócito. Estudos demostraram através de análise radioautográfica da biossíntese
e renovação de glicoproteínas do folículo em desenvolvimento, que a ZP resulta
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exclusivamente da atividade secretória do oócito (HADDAD, NAGAI, 1977; WOLGEMUTH
et al., 1984). A comunicação entre as células da granulosa e o oócito no folículo primordial e
primário, são mediadas por endocitose, sinalizadas pelas numerosas invaginações e vesículas
(HYTTEL et al., 1997; ALBERTINI et al., 2001).
Além das usuais organelas, os oócitos dos folículos primários também contém
numerosas mitocôndrias redondas, da mesma forma que nos folículos primordiais. Estas vão
tornando-se alongadas à medida que o folículo se desenvolve (LUCCI et al., 2001).
A partir da ativação do folículo primordial ocorre a formação do folículo primário que
é caracterizado pela mudança na conformação das células da granulosa de pavimentosas para
cuboidais e aumento no diâmetro do oócito de 25 µm para 40 µm, podendo apresentar uma
zona pelúcida (ZP) em formação (NAVARRO et al., 2012).
Folículos secundários
A transição para o estágio secundário é marcada pelo aparecimento de uma segunda
camada de células da granulosa. O diâmetro do folículo aumenta progressivamente até
aproximadamente 200 µm, e paralelamente, o oócito cresce em diâmetro alcançando 40-60
µm, e o índice mitótico das células da granulosa aumenta. Concomitante ao aumento do
metabolismo oocitário, há um acréscimo no número de junções gap entre o oócito e as células
da granulosa, estabelecendo uma via de intercâmbio metabólico e nutricional para
transferência de nucleotídeos, aminoácidos, fatores de estimulação e/ou inibição da meiose,
além de fatores de crescimento, neurotrofinas e hormônios (FORTUNE, 2003; NAVARRO et
al., 2012).
Os folículos são denominados secundários quando atingem um estágio com mais de
duas camadas de células da granulosa cuboidais. O folículo secundário atinge de 60 a 200 µm
de diâmetro em bovinos (BECKERS et al., 1996), 150 a 180 µm em camundongos (XU et al.,
2006), 125 a 225 µm em macacos (XU et al, 2010) e tamanho semelhante em humanos (XU
et al., 2009a), como descrito previamente. Durante a fase de crescimento do folículo
secundário, fibras de tecido conectivo se posicionam paralelamente à membrana basal para
formar a camada tecal. (HUANG, WELLS, 2011).
O tipo de interação entre as células da granulosa e entre as estas células e o oócito
neste estágio de desenvolvimento passa a ser realizado também por “Gap junctions”. À
medida que o oócito aumenta de diâmetro, a ZP evolui para uma fina camada que aumenta
com o crescimento folicular, tornando-se densa e com filamentos interconectados ao redor do
Revisão da Literatura | 35
oócito, separando-o das células da granulosa. A comunicação entre o oócito e as células é
mantida por projeções transzonais (TZPs), que foram caracterizadas em folículos pré-antrais
de mamíferos como extensões das células da granulosa que atravessam a ZP e terminavam
sobre a superfície do oócito (HERTING, ADAMS, 1967). Foi demonstrado que as TZPs
sofrem alterações dinâmicas durante as diferentes fases do desenvolvimento folicular
(MOTTA et al., 1994) e servem para modular informações entre o oócito e as células da
granulosa. Após a formação do antro, estas projeções se retraem e se mantêm como pequenas
conecções terminais.
Com base em diferentes estudos sobre as comunicações entre o oócito e as células da
granulosa, foi proposto um modelo explicativo, no qual o transporte de diferentes fatores de
crescimento e hormônios entre as células da granulosa e o oócito ocorre através de vesículas
de endocitose em regiões de contato entre a ZP e as células da granulosa e por junções tipo
Gap entre os microvilos do oócito e as TZPs das células da granulosa (ALBERTINI et al.,
2001). Além disso, o núcleo do oócito passa de uma posição central no oolema dos folículos
primordiais para uma região excêntrica no folículo secundário, ou seja, situado na região entre
a zona pelúcida e o centro do oócito. As organelas também se movem e no folículo secundário
se encontram mais próximas à periferia (HYTTEL et al., 1997). O retículo endoplasmático
liso aumenta de tamanho no folículo secundário e a maioria das mitocôndrias são alongadas
(LUCCI et al., 2001).
A foliculogênese pré-antral é descrita como um processo independente de
gonadotrofinas e parece ser regulada principalmente por efetores parácrinos, com participação
fundamental do oócito (Tabela 1). Contudo, receptores de FSH foram detectados em folículos
primários bovinos e aumento do crescimento de folículos pré-antrais foi observado após
adição de FSH ao meio de cultura em bovinos (XU et al., 1995) e primatas não-humanos (XU
et al. 2010), sugerindo um papel de coadjuvante do FSH no controle do estágio pré-antral (XU
et al., 1995; XU et al., 2010; NAVARRO et al., 2012).
Folículos terciários ou antrais
A partir deste estágio, o diâmetro folicular aumenta acentuadamente devido ao
crescimento do oócito, à multiplicação das células da granulosa, das células da teca e ao
aumento do fluido antral, este último importante para os mecanismos de regulação e
modulação de substâncias secretadas pelas células foliculares e da comunicação endócrina
que o folículo começa a estabelecer. A formação do antro em mamíferos é observada quando
Revisão da Literatura | 36
o folículo atinge 200 a 400 µm, contudo, pouco se sabe sobre os mecanismos de sinalização
responsáveis por este processo. Paralelamente, o aumento da vascularização do folículo
possibilita a atuação de sinais endócrinos e a sensibilidade às gonadotrofinas é configurada.
As células da teca aumentam o número de receptores de LH, iniciando a síntese de
andrógenos, convertidos em estrógenos pela enzima P450 aromatase que, por sua vez,
aumentam o número de receptores de FSH nas células da granulosa, amplificando a ação
desta gonadotrofina no folículo (BUCCIONE, SCHROEDER, EPPIG, 1990). Os grandes
folículos antrais, com diâmetro acima de 3 mm, contêm células da granulosa diferenciadas em
células do cumulus e células murais, muitas camadas de células da teca, um grande espaço
contendo fluido folicular e um oócito com diâmetro aproximado de 150 µm, meioticamente
competente, capaz de ser fertilizado e desenvolver-se em blastocistos (NAVARRO et al.,
2012).
Folículo pré-ovulatório
No folículo pré-ovulatório, as principais modificações morfológicas compreendem a
proliferação terminal seguida de diferenciação das células da granulosa e aumento no volume
do fluido folicular. Em todas as espécies de mamíferos, a formação de folículos pré-
ovulatórios ou de De Graaf ocorre geralmente a partir da puberdade e a ação proeminente de
fatores secretados pelas células da granulosa, como o estradiol e o fator de crescimento
epidérmico (EGF - epidermal growth factor), em associação com as gonadotrofinas, é
essencial para a maturação terminal do folículo pré-ovulatório. O FSH é o indutor hormonal
da foliculogênese terminal, exercendo um papel importante na expressão de seus próprios
receptores e dos receptores de LH, bem como na diferenciação das células da granulosa. O
folículo destinado a ser dominante passa a expressar maior concentração de receptores de
FSH na sua superfície através do mecanismo de autoregulação positiva, o que o torna mais
sensível a pequenas doses de FSH. Em contrapartida, há queda na produção do FSH pela
hipófise, determinada pela inibina e estradiol secretados pelo folículo dominante, e em
conseqüência, todos os demais folículos, não dominantes, iniciam o processo de atresia a
partir deste momento.
O estabelecimento da dominância folicular depende da transição da dependência
folicular do FSH para o LH. Ao final da fase folicular pode-se identificar o aparecimento de
receptores de LH na superfície das células da granulosa induzido pelo FSH. As células da
granulosa desses folículos param de se multiplicar em resposta ao LH e iniciam uma fase final
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de diferenciação, deflagrando o processo de luteinização. Dentre as funções do LH está a
reativação da meiose oocitária, a luteinização da granulosa, a expansão do cumulus e a síntese
de prostaglandinas, estas últimas apresentando papel importante na extrusão do oócito
(PELLICER et al., 2005).
O rápido aumento do antro é determinado pela síntese e/ou acúmulo de proteoglicanas
osmoticamente ativas no fluido folicular. O aumento do volume de fluido folicular, que
promove aumento da pressão intra-folicular, associado à ação de prostaglandinas locais que
levam à contração da musculatura lisa peri-folicular, promove a rotura do estigma ovulatório
e extrusão do oócito caracterizando a ovulação propriamente dita. Após a ovulação, o folículo
vazio originará o corpo lúteo também por ação do LH, com objetivo de secretar progesterona
para desenvolvimento e diferenciação endometrial a fim de promover adequada receptividade
endometrial e manutenção da gestação inicial (PELLICER et al., 2005; NAVARRO et al.,
2012).
Maturação oocitária
Desde o nascimento, os oócitos humanos têm seu núcleo detido no estagio de
dictióteno da prófase I meiótica, ou estagio de vesícula germinativa. Na puberdade, uma série
de estímulos hormonais desencadeia a saída dos oócitos desse estado de quiescência e, assim,
tem início a retomada e progressão da meiose (ZHANG, OUYANG, XIA, 2009).
A maturação nuclear inicia-se após o pico do LH, que desencadeia a ativação de
diversas moléculas reguladoras do ciclo celular, como o Fator promotor da maturação (MPF)
e a Proteína kinase ativada por mitógenos (MAPK). Tais moléculas irão coordenar desde a
dissolução do envelope nuclear, condensação cromossômica até a formação da placa
metafásica e extrusão do segundo corpúsculo polar, na segunda divisão meiótica. Ainda que
ocorra simultaneamente à maturação nuclear em alguns momentos, a maturação
citoplasmática tem seu início ainda na fase de crescimento do oócito e diversos transcritos
presentes no citoplasma foram produzidos ainda na fase de prófase I, da primeira divisão
meiótica, quando a cromatina apresentava-se descondensada (FERREIRA et al., 2009).
Diferentes marcadores de maturação nuclear e citoplasmática têm sido avaliados na
tentativa de se predizer a qualidade oocitária. Como principal indicador da maturidade nuclear
oocitária, ou seja, de que o oócito atingiu a metáfase II, utiliza-se a visualização da extrusão
do primeiro corpúsculo polar observada à microscopia óptica. Como principais marcadores de
maturação citoplasmática, destacam-se a redistribuição e remodelamento de organelas
Revisão da Literatura | 38
citoplasmáticas; e a presença de alguns transcritos e proteínas no citoplasma do oócito como a
glutationa, enzima do sistema antioxidante (FERREIRA et al., 2009).
Ciclo ovariano em primatas não-humanos
Assim como os humanos, todos os primatas não-humanos exibem um ciclo ovariano
que compreende uma fase de crescimento folicular, a ovulação e uma fase lútea. A expressão
destes eventos cíclicos, porém varia, consideravelmente de acordo com as espécies. Existem
diferenças na duração do ciclo e suas fases, sob influência ou não da sazonalidade, e na
ocorrência ou não de mestruação (HODGES, 1987).
Os macacos rhesus (Macaca mulatta) possuem menstruação, duração do ciclo e
variações dos níveis hormonais similares às apresentadas pelas mulheres em idade
reprodutiva. A duração do ciclo ovariano nesta espécie é muito semelhante a das mulheres,
durando em média 28 dias. A gestação, diferentemente dos humanos, dura em média 6 meses.
Uma diferença importante é que esta espécie apresenta sazonalidade, tendo o ciclo
reprodutivo somente durante o inverno.
Alguns aspectos da foliculogênese são semelhantes entre macacas e mulheres.
Todavia, o tamanho dos ovários e dos folículos são distintos entre as duas espécies. Enquanto
um folículo dominante em humanos atinge diâmetro próximo a 20 mm, estes folículos em
macacos rhesus atingem apenas cerca de 6 mm.
Apesar das diferenças no ciclo ovariano citadas anteriormente entre humanos e
macacos rhesus, existem diversas semelhanças, tornando este modelo animal um excelente
modelo translacional para o estudo da foliculogênese e cultivo folicular in vitro.
Técnicas de isolamento folicular
O objetivo primário das técnicas de cultivo folicular in vitro é o estabelecimento da
melhor metodologia de isolamento dos folículos de forma a se obter o maior número, com a
melhor viabilidade possível, para então se proceder as técnicas de crescimento e cultivo in
vitro (TELFER, 1996). Grandes avanços na pesquisa sobre folículos pré-antrais ocorreram em
diferentes espécies de mamíferos, na tentativa de se definir a melhor metodologia de
isolamento.
Existem basicamente três tipos de isolamento de folículos pré-antrais: isolamento
mecânico (EPPIG, SCHROEDER, 1989; EPPIG, TELFER, 1993; HULSHOF et al., 1994;
Revisão da Literatura | 39
WANDJI et al., 1996; KATSKA, RYNSKA, 1998); digestão proteolítica pelo uso de
enzimas (GREENWALD, MOOR, 1989; DURRANT et al., 1998); ou isolamento mecânico
em combinação com dissociação enzimática parcial (FIGUEIREDO et al.,1993, OKTAY et
al., 1997).
Nos procedimentos mecânicos, a fragmentação da estrutura do estroma ovariano pode
ser feita através de diferentes instrumentos para promover o isolamento de folículos pré-
antrais. Os primeiros relatos com isolamento desses folículos foram descritos utilizando
agulhas ultra-finas para dissociar ovários de camundongo (TORRANCE, TELFER,
GOSDEN, 1989) e de felinos (JEWGENOW, PITRA, 1993; JEWGENOW, 1996). Outros
autores também relataram o uso de bisturis, pinças e pipetas de Pasteur (HIRAO, MIYANO,
KATO, 1990), para promover a fragmentação do tecido ovariano.
Alguns estudos tem processado as amostras de tecido ovariano com o “Tissue
Chopper”, que consiste em um cortador de tecidos automático, seguido de sucessivas
pipetagens, em bovinos (FIGUEIREDO et al., 1993) ou uso de cortador de tecido específico
(tissue chopper) e posterior isolamento mecânico com agulhas (XU et al., 2009a; XU et al.,
2009b; XU et al., 2010; TING et al., 2011). O procedimento consiste no corte do tecido
ovariano, utilizando o cortador com intervalos entre cortes determinados, o que permite o
isolamento de folículos primários e secundários. O método mecânico utilizando este aparato
para o isolamento de folículos pré-antrais tem proporcionado a recuperação de um grande
número de folículos pré-antrais com baixa porcentagem de oócitos desnudos, devido à menor
ocorrência de ruptura dos folículos, uma vez que desta forma é possível se preservar a
membrana basal (FIGUEIREDO et al., 1993; TELFER, GOSDEN, 1987; XU et al., 2009a,b;
TING et al., 2011) Porém, apesar dos folículos parecerem normais morfologicamente após o
isolamento mecânico, a porcentagem de folículos viáveis pela coloração com “Trypan Blue” é
de somente 77% (GUPTA et al., 2002), e a sobrevida folicular é de aproxidamente 50%
quando cultivados folículos de macacos na presença de FSH (XU et al., 2010), e folículos
humanos chegam a 75% de sobrevida em até 30 dias de cultivo (XU et al., 2009a).
No que se refere ao tratamento enzimático, existem muitas considerações a respeito do
efeito de enzimas como a tripsina, pronase e colagenase, na viabilidade dos folículos isolados
no que concerne à degradação da membrana basal, podendo resultar em separação das células
da granulosa e a denudação do oócito (TELFER et al., 1999). No entanto, a colagenase tem se
mostrado mais eficiente e menos deletéria aos oócitos, apesar dos folículos ficarem
desprovidos das células da teca e constituírem um complexo de CGs-oócito sob uma
membrana basal parcialmente degradada (BUCCIONE, SCHROEDER, EPPIG, 1990).
Revisão da Literatura | 40
Apesar disso, esta técnica de dissociação enzimática pela colagenase resultou em grande
número de folículos pré-antrais a partir de ovários de camundongos (TORRANCE, TELFER,
GOSDEN, 1989) e a colagenase associada à DNAse, por 1 hora a 37ºC, não causou danos
morfológicos aos folículos pré-antrais de humanos (ROY, TREACY, 1993) e de cães
(BOLAMBA et al., 2002). Estudos afirmam que o isolamento por dissociação enzimática de
folículos compromete a sobrevivência de oócitos bovinos, e que fragmentos isolados
mecanicamente do córtex ovariano sobrevivem melhor no mesmo meio de cultivo (WANDJI
et al, 1996).
Se a integridade do folículo é comprometida, o seu potencial de desenvolvimento será
baixo. Portanto, a utilização de enzimas para obtenção de folículos deve ser questionada,
principalmente se o objetivo é a maturação de folículos in vitro. Para o cultivo, os folículos
necessitam estar íntegros e apresentar uma membrana basal intacta para que possam se
desenvolver adequadamente. Os sistemas de manipulação in vitro de folículos pré-antrais
devem ter o cuidado de tentar manter intactas as comunicações entre as células foliculares e o
oócito, no sentido de preservar sua integridade estrutural.
Cultivo folicular
O desenvolvimento folicular é um processo regulado por interações complexas entre
gonadotrofinas e fatores locais (GOUGEON, 1996) como descrito previamente. Progressos no
entendimento do desenvolvimento folicular precoce tem sido conquistados, particularmente
em camundongos em longos períodos de cultivo (ANCKAERT et al., 2009), e através de
manipulação genética (MATZUK, 2000; DRUMMOND, 2006).
O desenvolvimento de um sistema in vitro que suporte o crescimento do folículo pré-
antral em humanos é ambicioso, já que o desenvolvimento folicular em primatas ocorre em
um tempo muito mais longo (XU et al.,2010) comparando com animais de laboratório, como
ratos e camundongos (XU et al., 2009b). Além disso, enquanto um folículo de camundongo
tem que crescer em torno de 400 µm in vitro, o folículo pré-antral de primatas tem que crescer
aproximadamente 800 µm (TELFER et al., 2000; XU et al., 2009b; XU et al.,2010).
Os primeiros folículos pré-antrais a serem cultivados in vitro foram isolados a partir de
ovários de hamster. Os folículos foram cultivados em grupo sobre uma monocamada de gel de
ágar para prevenir a adesão dos folículos à superfície do plástico e foram cobertos com meio
de cultivo. A sobrevida dos folículos, bem como a aquisição de sítios de ligação para LH nas
células da granulosa parecem estar correlacionados com a presença de insulina no meio de
Revisão da Literatura | 41
cultivo. Além disso, a taxa de divisão celular aumenta em função da adição do soro sanguíneo
ao meio (ROY, GREENWALD, 1989).
Existem diversos tipos de sistema de cultivo folicular atualmente. Os sistemas de
cultivo de folículos pré-antrais de suínos são mais avançados que nas outras espécies de
grandes animais. Os oócitos de folículos pré-antrais destes animais são desenvolvidos com
uma matriz de gel de colágeno e se tornam competentes meioticamente se atingem um
diâmetro de ao menos 100 µm (HIRAO et al., 1994).
Nos sistemas de cultivo de bovinos por exemplo, ocorre um maior grau de crescimento
no começo do cultivo e esse crescimento vai diminuindo com o tempo de cultivo em todas as
classes de folículos pré-antrais (GUPTA et al., 2002). Folículos pré-antrais grandes de
bovinos tiveram um maior crescimento in vitro do que folículos pré-antrais menores
(KATSKA, RYNSKA, 1998). Telfer et al. (1999) também observaram maior crescimento em
folículos pré-antrais grandes (170 µm) que em pequenos (40-90 µm). Entretanto, em búfalos,
a classe de folículos pré-antrais que teve maior crescimento in vitro foi entre 37 e 90 µm,
folículos maiores e menores que isso, tiveram um menor desenvolvimento (GUPTA et al.,
2002).
As gonadotrofinas exógenas, como o FSH, e diversos fatores de crescimento têm
demonstrado atuar positivamente na estimulação da esteroidogênese in vitro (ROY,
TREACY, 1993; CECCONI et al., 1999), e no crescimento de folículos pré-antrais em cultivo
in vitro em diferentes espécies (WANDJI et al., 1996; GUPTA et al., 2002; XU et al., 2010).
Estudos indicam que o FSH e essencial para a sobrevida in vitro de folículos pre-
antrais de primatas (WRIGHT et al., 1999; XU et al., 2010) e que promove o crescimento de
folículos em roedores (XU et al., 2006), em primatas não-humanos (XU et al., 2010) e em
humanos (XU et al., 2009a). O FSH é conhecido por estimular o crescimento folicular e
manter a integridade das células da granulosa em suínos (HIRAO et al., 1994), ovinos
(CECCONI et al., 1999), bovinos (SAHA et al., 2000) e primatas humanos (ROY,
TREACY, 1993; XU et al., 2009a) e não humanos (XU et al., 2010).
Dados conflitantes têm sido apresentados no que se refere ao FSH no meio de cultivo
de folículos pré-antrais. Existem relatos de que o FSH não tem nenhum efeito no crescimento
de folículos bovinos in vitro (BRAW-TAL, YOSSEFI, 1997). Porém esses dados diferem de
outros pesquisadores que observaram um efeito positivo do FSH nos meios de cultivo, como
em ovelhas (CECCONI et al., 1999), búfalos (GUPTA et al., 2002), primatas não humanos
(macacos rhesus) (XU et al., 2010) e humanos (ROY, TREACY, 1993; XU et al., 2009a).
Revisão da Literatura | 42
Evidências sugerem que receptores de FSH são expressos em folículos pré-antrais
durante o seu desenvolvimento in vivo em várias espécies, incluindo primatas (GOUGEON,
1996; FINDLAY, DRUMMOND, 1999). Baseados em dados com roedores, reportados
recentemente, folículos cultivados in vitro com níveis fisiológicos de FSH (níveis baixos),
tendem a apresentar expressão gênica em oócitos e células do cumulus compatíveis com a
expressão de oócitos e células do cumulus de folículos in vivo (SANCHEZ et al., 2010). Em
contraste, níveis suprafisiológicos de FSH alteram a expressão dos genes transcritos por
oócitos e células do cumulus (SANCHEZ et al., 2010). Dessa forma, níveis fisiológicos de
FSH promovem diferenciação das células do cumulus regulada pela atividade oocitária, bem
como suporta o crescimento folicular.
Diversos estudos tem demonstrado que a adição de determinados componentes no
meio de cultivo de maturação in vitro podem ser o diferencial para uma boa taxa de sobrevida
e um bom desenvolvimento. A insulina, por exemplo, promove o crescimento das células da
granulosa (FIGUEIREDO et al., 1994; GUTIERREZ et al., 2000; GUPTA et al., 2002), e o
soro fetal bovino, adicionado ao meio, melhora a porcentagem de folículos pré-antrais em
crescimento em longos tempos de cultivo folicular de suínos (TELFER et al., 2000). A
adição de fatores como soro e fetuina também tem mostrado contribuir para um melhor
desenvolvimento folicular. Durante a maturação espontânea de oócitos murinos em meio livre
de soro, a zona pelúcida torna-se enrijecida (DE FELICI, SIRACUSA, 1962). Uma zona
pelúcida enrijecida e resistente a penetração espermática, dificulta o processo de fertilização,
sendo este fenômeno também caracterizado em oócitos de primatas não-humanos
(VANDEVOORT et al., 2007) e humanos (SCHIEWE et al., 1995). O soro, incluindo o soro
fetal bovino tem se mostrado efetivo em prevenir o enrijecimento da zona pelúcida do oocito
em roedores (SCHROEDER et al., 1986). A fetuina, a maior glicoproteína encontrada no soro
e no fluido folicular também contribui para o não enrijecimento da zona pelúcida durante a
maturação espontânea oocitária em roedores (SCHROEDER, 1990). Recentes estudos
realizados com primatas não-humanos tambem demostraram que a fetuína e imporante para o
desenvolvimento folicular in vitro (XU et al., 2010).
A concentração de oxigênio é outro importante parâmetro para determinar as
condições de cultivo dos folículos pré-antrais. Entretanto, o efeito exercido por altas ou baixas
concentrações de oxigênio (O2) é ainda controverso. Os folículos são usualmente cultivados
sob tensão de 20% de O2 (XU et al., 2010), que equivale a cerca de 140 mmHg. Contudo, a
pressão parcial de O2 na cavidade peritoneal onde os ovários estão localizados é cerca de 40
mmHg (TSAI et al., 1998), que corresponde a aproximadamente 5% de O2. A baixa tensão de
Revisão da Literatura | 43
O2 (5%) aumenta a viabilidade de células do cumulus caninas (SILVA et al., 2009) e promove
o desenvolvimento e competência de oócitos suínos durante maturação in vitro (IWAMOTO
et al., 2005). Além disso, uma tensão de O2 baixa, durante o cultivo de folículos pré-antrais
murinos beneficia a viabilidade e maturação oocitária, ativação partenogenética e fertilização
(HEISE et al., 2009). Eppig e Wiigglesworth (1995) reportaram que em 5% de O2, oócitos de
camundongo adquirem competência para se desenvolver, e Cecconi et al. (1999) também
obtiveram melhores resultados de crescimento folicular em 5% do que em 20% de O2 em
cabras. Porém, Smitz et al. (1996) observaram um menor grau de crescimento dos folículos
cultivados in vitro quando utilizando 5% de O2 em camundongos. Apesar de controverso,
hipotetiza-se que o cultivo folicular sob uma tensão de O2 a 5% teria uma influencia positiva
durante o desenvolvimento folicular in vitro.
A formação de antro em folículos pré-antrais cultivados in vitro oriundos de folículos
pré-antrais foi conseguida em suínos (HIRAO et al., 1994), ovinos (CECCONI et al., 1999),
caprinos (HUANMIN, YONG, 2000) e bovinos (GUTIERREZ et al., 2000; ITOH et al.,
2002). Além disso, a formação de antro também foi atingida em folículos de macacos (XU et
al., 2010) e de humanos cultivados in vitro a partir do estágio secundário (ROY, TREACY,
1993; Xu et al., 2009a). Em búfalos, mesmo com 40 dias de cultivo, não foi possível observar
a formação de antro (GUPTA et al., 2002).
Sistemas de cultivo para folículos pré-antrais bovinos não têm sido um sucesso no que
se refere a produzir oócitos meioticamente competentes (TELFER, 1996), mas um pequeno
número de oócitos de folículos ovinos cultivados in vitro têm atingido o estádio de metáfase II
(CECCONI et al., 1999). E em estudos realizados com macacos, esta dificuldade também está
presente, mas já foi possível a obtenção de oócitos em metáfase II, e um embrião de 2 células
24 horas após ICSI (Injeção intracitoplasmática do espermatozoide) (XU et al., 2011).
Em suínos, Wu et al. (2001) conseguiram cultivar folículos pré-antrais em meio
acrescido de soro suíno e FSH até o estágio antral de desenvolvimento, tendo sido obtidos
alguns oócitos em metáfase II que foram fertilizados, alguns atingindo o estágio de
blastocisto. O método de isolamento folicular utilizado neste experimento e no experimento
com macacos, descrito anteriormente, foi o mecânico.
Em roedores, os sistemas de cultivo de folículos pré-antrais têm tido êxito na produção
de grande número de oócitos meioticamente competentes, inclusive com a obtenção de
nascimentos (EPPIG, SCHROEDER, 1989; XU et al., 2006). O tempo requerido para o
cultivo de folículos pré-antrais de camundongos para desenvolver a folículo de Graaf é de
apenas 6 dias (BOLAND et al., 1993). No entanto, em humanos e animais domésticos, o
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desenvolvimento folicular in vivo é um processo muito lento, levando até seis meses desde o
início do crescimento folicular até formação de um folículo pré-ovulatório (LUSSIER,
MATTON, DUFOUR, 1987). Nesses casos, sistemas de cultivo vêm sendo testados a fim de
atingir um modelo de desenvolvimento folicular que mantenha a integridade do oócito e sua
capacidade de ser ovulado e fecundado in vitro. A evolução destas pesquisas requer um
completo entendimento da biologia celular na fase de desenvolvimento do folículo, como
também o estabelecimento de sistemas eficientes de isolamento e cultivo in vitro que
suportem o crescimento folicular até o estágio de maturação meiótica (GIOMETTI, 2003).
Com a obtenção de desenvolvimento embrionário a partir de folículos pré-antrais de
suínos e primatas, novas perspectivas são geradas em relação à técnica de cultivo folicular in
vitro em humanos.
Cultivo folicular em humanos
A dinâmica da regulação da foliculogênese em primatas ainda continua pouco
compreendida (CHAND et al., 2010). Recentemente, desenvolveu-se baseado em princípios
de bioengenharia de tecidos, uma matriz 3D capaz de suportar o crescimento de folículos, o
que já foi demostrado com sucesso em camundongos (XU, et al. 2006; WEST et al., 2007).
Este sistema de cultivo 3D, permite o desenvolvimento de folículos in vitro até o estágio
antral, capazes de dar origem a oócitos maduros, que quando inseminados podem ser
fertilizados, dando origem a embriões e até nascidos vivos (XU et al., 2006).
Aplicando a técnica de cultivo encapsulado em matriz 3D em primatas, é possível
propiciar o crescimento de folículos de primatas não-humanos (macacos rhesus) desde o
estágio preantral até o estágio de folículo antral de pequeno diâmetro, com produção de
apreciáveis níveis de hormônios esteróides (XU et al., 2009b; XU et al., 2010).
Acredita-se que o encapsulamento do folículo em gel de alginato é capaz de mimetizar
a matriz extracelular in vivo em termos de facilitar a troca de moléculas entre o folículo e o
meio de cultivo, além da flexibilidade do gel, que proporciona uma boa proliferação celular.
Porém, a rigidez do gel poderia inibir o crescimento folicular e reduzir a esteroidogênese, o
que já foi reportado com folículos murinos embebidos em gel de alginato a 1 e 1,5%. Mas
quando utilizado gel a 0.5% foram obtidos oócitos que apresentaram crescimento completo
(XU et al., 2009a).
Em alguns tipos de cultivo, como de bovinos, usa-se gel de colágeno, e neste caso, já
foi demonstrado a ocorrência de diferenciação folicular, e quando usado com uma
Revisão da Literatura | 45
combinação de meio de cultivo bem suplementado associado ao uso de membranas de
microporo, um bezerro foi obtido a partir do cultivo de folículos imaturos cultivados in vitro
por 14 dias (HIRAO et al, 2004).
Como mencionado anteriormente, existem evidências de que níveis adequados de
determinados hormônios são essenciais para o crescimento e saúde dos folículos cultivados in
vitro (PICTON et al., 2008). O FSH, por exemplo, é responsável por promover o crescimento
folicular in vitro, além de manter a integridade morfológica de folículos pré-antrais caprinos,
e estimular a ativação de folículos primordiais em macacos (MATOS et al., 2007). Estudos
tem demostrado que em sistemas de matriz 3D, o FSH aumenta o diâmetro de folículos de
camundongo (XU et al., 2006), macacos (XU et al., 2009b; XU et al., 2010) e humanos (XU
et al., 2009a; AMORIN et al., 2011). No cultivo de folículos de macaco, o FSH tem se
mostrado essencial para a sobrevivência de folículos secundários (125 – 225 µm de diâmetro)
no cultivo 3D com gel de alginato (XU et al., 2010).
Além disso, em estágios mais avançados durante o cultivo, folículos de macacos
cultivados em meio suplementado com LH tendem a produzir mais estradiol, o que pode ser
atribuído a presença aumentada de células da teca (XU et al., 2009b).
Sistemas de cultivo designados para o suporte do desenvolvimento de folículos
humanos individuais precisam aprimorar aspectos como: definição do estágio do folículo em
que ele deve ser coletado; tipo do material necessário para a manutenção da unidade do
folículo in vitro; o período de cultivo; e essencialmente a composição do meio de cultivo
usado.
Muitos esforços tem sido direcionados no sentido de promover o desenvolvimento
folicular in vitro de humanos, obtendo-se folículos tanto a partir de tecido fresco (TELFER et
al., 2008a,b; SMITZ et al., 2010), quanto a partir de córtex ovariano criopreservado
(HOVATTA et al., 1997; PICTON, GOSDEN, 2000; TELFER et al., 2008a, b; TING et al.,
2011). Para um completo desenvolvimento de oócitos humanos maturados in vitro, um cultivo
pautado em múltiplos passos ainda precisa ser desenvolvido. Este tipo de cultivo deve
preservar as funções do folículo, tanto endócrinas quanto a de suportar o crescimento e
amadurecimento de um oócito. Na otimização de um sistema de cultivo como este, o foco
deve ser no desenvolvimento oocitário, não requerindo necessariamente uma grande estrutura
folicular, e sim a manutenção apropriada de células somáticas diferenciadas em contato com o
oócito em amadurecimento.
Um meio de cultivo capaz de promover a ativação e crescimento folicular desde os
estágios iniciais de desenvolvimento ainda precisa ser desenvolvido. O meio de cultivo para
Revisão da Literatura | 46
maturação folicular mais usado nos dias de hoje possui dentre seus componentes, FSH,
albumina sérica humana, e uma combinação de insulina, selenito e transferrina, com a adição
de ácido ascórbico em alguns casos na intenção de minimizar a morte celular (TELFER et al.,
2000; SCOTT, ZHANG, HOVATTA, 2004), sendo usualmente o meio base utilizado o alpha-
MEM. Este meio básico parece suportar ativação e crescimento folicular in vitro, e a adição
de fatores de crescimento como insulina também parecem contribuir para uma maior ativação
(DING et al., 2010).
Estudos mostram que folículos que estão em crescimento in vitro, não sobrevivem
quando são cultivados ainda dentro do córtex, o que aparenta apresentar um efeito inibitório
sobre o desenvolvimento do folículo, que resulta em perda da integridade e impacto negativo
na sobrevida do oócito (HOVATTA et al., 1999; TELFER et al., 2008b). Portanto a remoção
do estroma ao redor do folículo e o cultivo dos mesmos individualmente seria a técnica mais
adequada (TELFER et al., 2008a; TELFER, MCLAUGHLIN, KINI, 2009; TELFER et al.,
2008b).
Esta técnica promove um valioso modelo in vitro para estudo do processo de
regulação da foliculogênese em folículos de primatas. A sua otimização é altamente desejável,
pois potencialmente permitiria a mimetização de condições patológicas in vitro para o estudo
de diversos tipos de doenças ovarianas, além de sua aplicação para a preservação da
fertilidade em pacientes com câncer. Contudo, ainda são necessários muitos avanços para o
desenvolvimento de um adequado ambiente in vitro para que o crescimento e diferenciação
folicular possam promover a competência oocitária necessária para a fertilização e posterior
desenvolvimento embrionário.
Objetivos
Objetivos | 48
Objetivo Geral
O presente estudo teve como objetivo geral avaliar os efeitos da ablação da produção
de esteróides e o papel dos androgênios (testosterona e dehidrosterona) no desenvolvimento
de folículos secundários de primatas não humanos (macaco rhesus – Macaca mulatta)
isolados de tecido ovariano a fresco e cultivados in vitro por 40 dias em matrix 3D.
Objetivos Específicos
1. Avaliar os efeitos da ablação da produção de hormônios esteróides por meio da inibição da
enzima 3-βHSD (3-beta hidroxiesteroide-desidrogrnase) pelo trilostano (TRL),
administrado durante a maturação in vitro de folículos secundários de primatas não
humanos isolados de tecido ovariano a fresco (desde o início do cultivo ou após 2 semanas
de cultivo), cultivados por 40 dias, sobre:
a) a sobrevida, o crescimento, o desenvolvimento (formação de antro e morfologia) e a
produção de hormônios esteróides pelos folículos.
b) o grau de maturação oocitária.
2. Avaliar o impacto da reposição de duas diferentes doses de testosterona (10 ng/mL e 50
ng/mL), administrada durante a maturação in vitro de folículos secundários de primatas
não humanos isolados de tecido ovariano a fresco cultivados em meio de maturação padrão
acrescido de trilostano ou veículo por 40 dias, sobre:
a) a sobrevida, o crescimento, o desenvolvimento (formação de antro e morfologia) e a
produção de hormônios esteróides pelos folículos.
b) o grau de maturação oocitária.
c) fertilização.
3. Avaliar o impacto da reposição de dihidrotestosterona (50 ng/mL) administrada durante a
maturação in vitro de folículos secundários de primatas não humanos isolados de tecido
ovariano a fresco cultivados em meio de maturação padrão acrescido de trilostano ou
veículo por 40 dias, sobre:
a) a sobrevida, o crescimento, o desenvolvimento (formação de antro e morfologia) e a
produção de hormônios esteróides pelos folículos.
b) o grau de maturação oocitária.
c) fertilização.
Material e Métodos
Material e Métodos | 50
Animais e coleta ovariana
A habitação e o cuidado com os animais, macacos rhesus, foram fornecidos pela
Divisão de Recursos Animais, no Oregon National Primate Research Center (ONPRC). Os
animais foram mantidos dentro de gaiolas, em pares, a temperatura (22oC) e luminosidade (12
horas claro/escuro) controladas. A dieta oferecida foi a ração Purina (Ralston Purina-,
Richmond, IN, EUA) ideal para alimentação de macacos, fornecida duas vezes ao dia,
acrescida de frutas frescas ou vegetais, uma vez por dia e água ad libitum. Os animais foram
tratados de acordo com o Instituto Nacional de Guia de Saúde para o Cuidado e Uso de
Animais de Laboratório, dos Estados Unidos, e os protocolos foram aprovados pelo Comite
Institucional de Cuidados aos Animais do Centro de Pesquisas com Primatas da Universidade
do Oregon (Oregon National Primate Research Center, Oregon Health and Science
University).
Quatorze fêmeas adultas de macacos rhesus (idade média 9 anos), que exibiam ciclos
menstruais regulares de 28 dias, sendo o primeiro dia de menstruação considerado o dia 1 do
ciclo, foram usadas neste estudo. Dez animais foram recrutados especificamente para este
estudo, e ovários de quatro animais adicionais foram coletados no momento de necrópsia após
o término de outros estudos ou razões não relacionadas a saúde reprodutiva. A ooforectomia
foi realizada sob anestesia, por laparoscopia, durante a fase folicular precoce do ciclo (entre
os dias 1 e 4), como previamente descrito (DUFFY, STOUFFER, 2002). Os ovários, após
removidos, foram imediatamente transferidos para meio Hepes buffered holding media
(CooperSurgical, Inc., Trumbull, CT, USA), suplementado com 0.2% de soro humano
proteico (SPS, CooperSurgical, Inc.) e 10 µg/ml de antibiótico gentamicina (Sigma-Aldrich,
St Louis, MO, USA) e mantidos a 37oC até o momento do isolamento folicular (XU et al.,
2010; 2011).
Os meios de cultivo e reagentes utilizados foram adquiridos da Sigma Aldrich
Company (St. Louis, MO, USA), exceto quando indicado, e o Trilostano (Vetoryl – trilostane
Capsules Letter), da FDA U.S. Food and Drug Administration. O Trilostano foi preparado
como uma solução estoque, em que 2.5 mg de trilostano foi diluido em 10 mL de etanol
(veículo), armazenada a 4oC, que era diluída em meio de cultivo folicular, semanalmente na
ocasião da preparação dos meios para o cultivo, de modo que sua concentração fosse 250
ng/mL.
Material e Métodos | 51
Isolamento folicular, encapsulamento e cultivo
O isolamento, encapsulamento e o cultivo in vitro dos folículos individuais foram
realizados conforme já previamente descrito (XU et al., 2010). Resumidamente, o córtex
ovariano foi cortado em pequenos cubos de 1 × 1 × 1 mm, e os folículos foram
mecanicamente isolados em meio de manipulação (Heppes buffered holding media) com o
uso de agulhas calibre 31. Folículos secundários de diâmetros entre 125-225 mm e que
apresentavam as seguintes características foram selecionados para o encapsulamento: (i)
membrana basal intacta, (ii) duas a três camadas de células da granulosa e (iii) um oócito
saudável visível que fosse arredondado e localizado centralmente no interior do folículo, sem
a presença de vacúolos ou citoplasma escuro. Os folículos obtidos individualmente de cada
um dos animais foram divididos randomicamente entre os grupos de tratamento com 12/24
folículos por grupo.
Os folículos foram transferidos individualmente para gotículas de 5 µL 0.25% (w/v) de
alginato de sódio estéril (FMC BioPolymers, Philadelphia, PA, USA) e solução tamponada
PBS (phosphate-buffered saline - 137 mM NaCl, 10 M phosphate, 2.7 mM KCl, Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA). As gotas foram colocadas sobre uma tela de polipropileno (0,1 mm de
abertura; McMaster-Carr, Atlanta, GA), que foi então invertida e gentilmente batida sobre
uma solução cross-linking (50 mM CaCl2, 140 mM NaCl e 10 nM HEPES solution - pH 7.2),
fazendo com que as gotas caíssem na solução, sendo mantidas nela por 30 segundos. Cada
folículo encapsulado em alginato foi transferido para poços individuais em uma placa de 48
poços contendo 300 µL do meio αMEM (alpha minimum essential médium - Invitrogen)
suplementado com 0.3% (v/v) de soro sintético substituto (SSS), 0.5 mg/ml de fetuína bovina
purificada, 5 µg/ml de insulina, 5 µg/ml de transferrina e 5 ng/ml de selenito de sódio (Sigma-
Aldrich).
Os folículos foram cultivados a 37oC e 5% de oxigênio (em 6% CO2/89% N2), com
FSH recombinante humano (rh) (NV Organon, Oss, Netherlands) a uma dose de 3ng/mL
durante os primeiros 20 dias de cultivo, e 0.3 ng/mL pelo período de cultivo restante.
Folículos que atingiram o estágio antral foram tratados com gonadotrofina coriónica humana
recombinante (hCG) (Merck Serono, Geneva, Switzerland) (100 ng/ml) por 34 h para iniciar a
maturação meiótica do oócito. Após este período, os oócitos foram coletados com a finalidade
de se determinar o grau de maturação e competência oocitária. Amostras de meios de cultivo
(150 µL) foram coletadas, repostas a cada 2 dias e armazenadas a – 20oC para posterior
análise de hormônios esteroides ovarianos e hormônio anti-Mulleriano (AMH).
Material e Métodos | 52
Experimento 1: Ablação da esteroidogênese
Com a finalidade de avaliar o papel dos esteróides na foliculogênese de primatas in
vitro, foi utilizado um inibidor da síntese de esteróides (trilostano, TRL) que atua no bloqueio
da ação da enzima 3-beta-hidroxiesteróide desidrogenase (3-βHSD), responsável pela
conversão de pregnenolona em progesterona, 17-hidroxipregnenolona em 17-hidroxi-
progesterona e dehidroepiandrosterona em androstenediona. O TRL foi acrescido ao meio de
cultivo folicular na dose de 250 ng/mL, que efetivamente bloqueia a produção de
progesterona por células foliculares de primatas in vitro (DUFFY et al., 1996).
Folículos secundários obtidos de 6 animais (4 advindos de necrópsia, 2 de
laparoscopia) foram divididos em três grupos: (1) grupo controle: folículos (n = 174)
cultivados em meio padrão acrescido do veículo do TRL (etanol) até o final do cultivo (40
dias); (2) grupo TRL: folículos (n = 173) cultivados em presença de TRL do início ao fim do
cultivo (40 dias); (3) grupo TRL2: folículos (n = 169) cultivados em meio onde TRL foi
adicionado após 2 semanas e mantido até o fim do cultivo.
Experimento 2: Reposição de testosterona
Para avaliar o papel da testosterona na foliculogênese, foi realizado um segundo
experimento, por meio da reposição de duas diferentes doses de testosterona (T; 10 ou 50
ng/mL, grupos T baixa e T alta) em meio de cultivo com TRL, TRL utilizado desde o início
do cultivo até o final (40 dias), grupos controle (veículo) e TRL, TRL utilizado desde o início
do cultivo até o final (40 dias).
Folículos secundários obtidos de 4 animais foram cultivados em meio padrão
contendo: (1) veículo por 40 dias (grupo controle; n = 85); (2) TRL na dose de 250 ng/mL
desde o início do cultivo até o final (40 dias) (grupo TRL; n = 82); (3) TRL e 10 ng/mL de
testosterona por 40 dias (grupo T baixa; n = 84); (4) TRL e 50 ng/mL de testosterona por 40
dias (grupo T alta; n = 86).
Experimento 3: Reposição de dihidrotestosterona
Com o intuito de confirmar o papel androgênicona foliculogênese de primatas,
independentemente de uma possível conversão a estrógeno, um terceiro experimento foi
Material e Métodos | 53
realizado, por meio da adição de dihidrotestoserona (DHT) (50 ng/mL) ao meio de cultivo
com TRL ou DHT isoladamente, e grupos controle (veículo) e TRL.
Folículos secundários de 4 animais foram cultivados em meio padrão contendo: (1)
veículo (grupo controle; n = 72); (2) TRL na dose de 250 ng/mL desde o início até o fim do
cultivo (40 dias) (grupo TRL; n = 66); (3) DHT isoladamente (50 ng/mL) (grupo DHT; n =
69); (4) DHT acrescido de TRL (grupo TRL + DHT; n = 66).
Sobrevida folicular, crescimento e formação de antro
A sobrevida folicular, o diâmetro e a formação de antro foram avaliados por meio de
um microscópio invertido Olympus CK40 (Tóquio, Japão) com luz transmitida e objetivas de
fase, e uma câmera digital Olympus DP11 anexada (Olympus Imaging America Inc., Center
Valley, PA, USA) e software de imagem ImageJ 1.44 p (National Institutes of Health,
Bethesda, MD, USA) (XU et al., 2010, 2011). Os folículos foram medidos a partir da camada
externa de células, e as medidas incluíram uma medida no maior diâmetro do folículo e uma
segunda medição perpendicular à primeira. A média destes valores foi calculada e
considerada como o diâmetro do folículo. Os folículos foram considerados degenerados e em
processo de atresia quando o oócito estava escuro ou não estava cercado por células da
granulosa, as células da granulosa se tornaram escuras e fragmentadas, ou o diâmetro do
folículo estava diminuído (XU et al., 2009b; XU et al., 2010).
Classificação do Crescimento folicular
Os folículos foram divididos em três categorias de acordo com o seu padrão de
crescimento até a quinta semana de cultivo (XU et al., 2010; 2011): (1) crescimento rápido:
aqueles que atingiram um diâmetro de 500 µm ou mais; (2) crescimento lento: aqueles que
atingiram entre 230 e 500 µm de diâmetro; (3) sem crescimento: aqueles que não excederam
um diâmetro de 230 µm ao final da quinta semana de cultivo.
Dosagem de esteróides ovarianos e AMH
Amostras de meio coletadas semanalmente durante todo o período de cultivo foram
analisadas para a determinação das concentrações de estradiol (E2), progesterona (P4) e
pregnenolona (P5) para o Experimento 1, e E2, P4 e AMH para os Experimentos 2 e 3. As
Material e Métodos | 54
análises das concentrações de E2, P4 e P5 foram realizadas pelo laboratório de ensaios
hormonais do ONPRC, Endocrine Technology Support Core (XU et al., 2010; 2011), por
meio do método de quimioluminescencia, usando um Immulite 2000, com técnica
previamente validada para meios de cultivo folicular de macacos, reportados previamente
(XU et al., 2009b). O AMH foi analisado pelo método de ELISA, por meio do Kit DSL-10-
14400 (Diagnostic Systems Laboratories, Inc.) baseado nas instruções do fabricante e
validado previamente para meio de cultivo de folículos de macacos (XU et al., 2010).
Coleta de oócitos, maturação e fertilização
Os oócitos coletados foram fotografados e classificados de acordo com o estágio de
maturação nuclear (XU et al., 2011). Foi realizada coleta de sêmen e fertilização in vitro
convencional nos oócitos em metáfase II (MII) dos experimentos de Reposição de T e DHT,
pelo Laboratório de Reprodução Assistida (Assisted Reproductive Technology
(ART)/Embryonic Stem Cell Support Core) no ONPRC (XU et al., 2011). A fertilização in
vitro convencional foi realizada nos oócitos MII como previamente descrito (XU et al., 2011;
2013). O zigoto resultante foi transferido para 500 µL de meio de cultura embrionária
hamster-9 com 5% de FBS e cultivados a 37 º C a 6% CO2, 5% O2 e 89% de N2 (SCHRAMM,
PAPROCKI, 2000). O embrião foi fotografado diariamente durante seu desenvolvimento.
Reagentes e protocolos para a cultura de embriões foram fornecidos pelo núcleo ART/
ONPRC (MENG, WOLF, 1997a, b).
Análise estatística
A significância estatística foi analisada por meio do software R 2.15.3, usando uma
regressão binomial logística para as análises de sobrevida e formação de antro, e regressão
marginal log-linear para a análise de hormônios esteroides e AMH. Diferenças foram
consideradas significativas quando p < 0.05 e valores foram representados como média ± erro
padrão. A sobrevida folicular e a formação de antro representaram 6 (Experimento 1) ou 4
(Experimentos 2 e 3) animais individualmente para cada grupo de tratamento. O crescimento
folicular, a produção de esteroides e AMH, e a maturação oocitária foram analisados para
cada folículo individualmente.
Resultados
Resultados | 56
Experimento 1 - Ablação da esteroidogênese
A) Efeito sobre a sobrevida folicular e a formação de antro
A porcentagem de folículos sobreviventes em cultivo (Fig. 3A) foi menor em presença
de TRL (p < 0.05) comparado com a porcentagem obtida no grupo controle (folículos tratados
com veículo). A porcentagem de folículos que atingiram a formação de antro (Fig. 3B)
também foi menor do que no grupo controle quando TRL foi adicionado no início do cultivo
(p < 0.05), mas não quando foi adicionado após 2 semanas de cultivo.
Figura 3. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL sobre a sobrevida folicular e a formação de antro de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A. Sobrevida; B. Formação de antro; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL de TRL desde o inicio do cultivo); TRL2: trilostano 2 (250 ng/mL de TRL a partir da segunda semana até o final do cultivo). Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).
B) Efeito sobre o crescimento folicular
Porcentagens similares de folículos sem crescimento e com crescimento lento foram
observadas nos grupos controle e TRL2 (TRL adicionado na semana 2). Contudo foi
observada uma diferença significativa na porcentagem de folículos que apresentou
crescimento rápido entre estes grupos, sendo que no grupo Controle houve maior
porcentagem de folículos que cresceu mais rapidamente (Controle: 28%; TRL2: 19% - Tabela
I). Em contraste, folículos de crescimento rápido não foram observados no grupo TRL, e a
porcentagem de folículos sem crescimento foi maior neste grupo em relação aos grupos
CTRL TRL TRL20
20
40
60
80
100
A
B
Su
rviv
al (
%)
B
CTRL TRL TRL20
20
40
60
80
100
A A,BA
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um
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(%
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B
A. B.
So
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a (%
)
Fo
rmaç
ão d
e an
tro
(%)
TRL2CTRL TRL TRL2CTRL TRL
Resultados | 57
Controle e TRL2, atingindo 27% (Tabela I). Além disso, apesar de todos os folículos que
apresentaram crescimento lento iniciarem o cultivo com um diâmetro equivalente em todos os
grupos, os folículos que apresentaram este padrão de crescimento, atingiram apenas um
diâmetro de 235 ± 17 µm ao final da quinta semana durante o tratamento com TRL, mas eram
maiores (p < 0.05) e possuíam tamanhos equivalentes nos grupos controle e TRL2 (330 ± 11
vs. 283 ± 17 µm).
Tabela I. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL sobre as características de crescimento folicular de folículos secundários de Macaca mulata na quarta semana cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas.
Cultivo folicular Total Sem Crescimento N (%)
Crescimento lento N (%)
Crescimento rápido N (%)
CTRL
TRL
TRL2
98
26
49
11 (11%)a
7 (27%)b
7 (14%)a
60 (61%)a
19 (73%)b
33 (67%)a,b
27 (28%)a
0 (0%)b
9 (19%)c
Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo; N: número; %: porcentagem; Diferentes letras (a, b, c) dentro da mesma coluna indicam diferença significativa (p < 0,05).
C) Efeito sobre a produção de esteróides ovarianos
As concentrações de P4 no meio de cultivo coletado após a formação de antro foram
maiores nos folículos que apresentaram crescimento lento do grupo controle (Fig. 4A),
quando comparado aos dois grupos expostos ao TRL. Achados similares ocorreram quando
comparamos níveis de P4 de folículos de crescimento rápido entre os grupos controle e TRL2
(6.3 ± 1.0 vs. 0.2 ± 0.1 ng/ml, p < 0.05). Ressaltamos novamente que o grupo TRL não
apresentou folículos de crescimento rápido. Notavelmente, a exposição ao TRL também
reduziu os níveis de E2 em relação ao grupo controle, principalmente por folículos de
crescimento lento (dados não mostrados; ver Exp. 2 e 3).
Por outro lado, os níveis de P5 foram baixos para os folículos de crescimento lento
(Fig. 4B), porém marcadamente aumentados nos grupos TRL e TRL2. Da mesma maneira, os
níveis de P5 para folículos de crescimento rápido foram 29 vezes mais altos no grupo TRL2,
quando comparados com os níveis encontrados no grupo controle (1.17 ± 0.42 vs. 0.04 ± 0.04
ng/ml, p < 0.05).
Resultados | 58
Figura 4. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL sobre a produção de progesterona e pregnenolona por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A. Progesterona; B. Pregnenolona; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL de TRL desde o inicio do cultivo); TRL2: trilostano 2 (250 ng/mL de TRL a partir da segunda semana até o final do cultivo). Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).
D) Efeitos sobre o grau de maturação e qualidade oocitária
No grupo controle, folículos antrais deram origem tipicamente a oócitos saudáveis (12
em 13 folículos), porém eles raramente reiniciaram a maturação meiótica em resposta ao hCG
para atingir o estágio MII (1 em 12). O diâmetro do oócito MII obtido foi maior do que o
diâmetro encontrado nos oócitos VGs. Apenas um oócito foi coletado do grupo TRL e
encontrava-se degenerado. Quatro de sete oócitos coletados do grupo TRL2 estavam
saudáveis, mas não atingiram o estágio MII (Tabela II).
Tabela II. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL nas características de oócitos coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (34 h após administração de hCG).
Cultivo folicular
Número (n) de Diâmetro (µm)* Folículos analisados
Oócitos coletados
Oócitos degenerados
Oócitos saudáveis Oócitos VG
Oócitos MII VG MII
CTRL 13 13 1 11 1 111 ± 2a 117
TRL 2 1 1 0 0 - -
TRL2 10 7 3 4 0 92 ± 18a - Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); VG: vesícula germinativa, MII: metáfase II. * Valores expressos em média ± erro padrão, com cada diâmetro oocitário como um dado individual; Diferentes letras (a, b, c) dentro da mesma coluna indicam diferença significativa (p < 0,05). O número de folículos analisados corresponde ao número de folículos que atingiram o diâmetro médio de 1 mm, e receberam hCG.
Resultados | 59
Experimento 2 – Reposição de testosterona
A) Efeito sobre a sobrevida folicular e a formação de antro
A adição de dose alta de T ao TRL aumentou a sobrevida comparado com o grupo
TRL (Fig. 5A). Diferentemente do que foi observado no Exp. 1, alguns folículos atingiram a
formação de antro no grupo TRL (Fig. 5B), porém a porcentagem de folículos antrais no
grupo T alta + TRL (83 ± 8%) foi maior em relação ao grupo que recebeu TRL isoladamente
(65 ± 22%, p < 0.05). Além disso, a porcentagem de folículos antrais no grupo T baixa + TRL
(92 ± 8%) também foi maior do que no grupo TRL.
Figura 5. Efeito da reposição de T sobre a sobrevida e formação de antro de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A. Sobrevida; B. Formação de antro; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).
B) Efeito sobre o crescimento folicular
Como observado no Exp. 1, a porcentagem de folículos sem crescimento foi maior no
grupo TRL, em relação aos grupos TRL + T baixa e TRL + T alta (Tabela III, Reposição de
T). Contudo, também foi evidente a observação de folículos de crescimento rápido neste
grupo, o que não foi observado no Exp. 1. Notavelmente, folículos sem crescimento não
foram observados nos grupos de reposição de baixa ou alta dose de T, e a porcentagem de
folículos que apresentam crescimento rápido atingiu, pela primeira vez, mais do que 30% da
população folicular total em ambos os grupos com reposição de T, e apresentou diferença
significativa (p < 0,05) entre os grupos TRL (21%) e TRL + T baixa (38%). O diâmetro
folicular dos folículos de crescimento lento, tanto no grupo de reposição de baixa e alta dose
Resultados | 60
de T (350 ± 15 or 361 ± 14 µm) foi maior em relação ao grupo TRL (260 ± 12 µm, p < 0.05),
e comparável a média do diâmetro encontrado no grupo controle (318 ± 14 µm). Em
contraste, a alta dose de T diminuiu (p < 0.05) o diâmetro de folículos de crescimento rápido
(572 ± 42 µm) comparado ao diâmetro no grupo controle (773 ± 56 µm).
Tabela III. Efeito da reposição de T sobre as características de crescimento folicular de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas.
Cultivo folicular
Total Sem
Crescimento N (%)
Crescimento lento N (%)
Crescimento rápido N (%)
Reposição de T CTRL 47 3 (6%)a,b 31 (66%)a,b 13 (28%)a,b
TRL 23 5 (22%)b 13 (57%)b 5 (21%)a TRL + T baixa 47 0 (0%)a 29 (62%)a,b 18 (38%)b
TRL + T alta 53 0 (0%)a 37 (70%)a 16 (30%)a,b Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); Diferentes letras (a, b, c) dentro da mesma coluna indicam diferença significativa (p < 0,05).
C) Efeito sobre a produção de esteróides ovarianos e AMH
Como esperado no Exp. 1, o TRL adicionado isoladamente diminuiu os níveis de P4
produzidos por folículos de crescimento lento (dados não mostrados) e rápido (Fig. 6A).
Inesperadamente, a adição de baixa dose de T, reestabeleceu os níveis de P4 para níveis
semelhantes aos do grupo controle, especialmente para folículos de crescimento rápido. Em
contraste, os níveis de P4 apresentaram-se diminuídos (p < 0.05) no grupo T alta em relação
ao grupo controle, a concentrações que se assemelham as encontradas no grupo TRL.
Quando E2 foi mensurado como um marcador de função folicular esteroidogênica,
observou-se que o TRL administrado isoladamente reduziu a concentração de E2 em relação
ao grupo controle (63 ± 13 vs. 247 ± 47 pg/mL, p < 0.05) em folículos de crescimento lento.
Mas a exposição a doses baixa ou alta de T na presença de TRL marcadamente elevaram os
níveis de E2 (2734 ± 338 e 18723 ± 1758 pg/mL) respectivamente. Os resultados para
folículos de crescimento rápido exibiram uma tendência similar (Fig. 6B), exceto que o TRL
adicionado isoladamente não diminuiu os níveis de E2, aumentados em 14 vezes em
comparação com os folículos de crescimento lento. Apesar disso, observou-se um aumento
dependente da dose (p < 0.05) nos níveis de E2, com a adição de T, em relação ao grupo TRL.
Resultados | 61
Figura 6. Efeito da reposição de T sobre a produção de progesterona e estradiol por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).
Quando o AMH foi mensurado como um marcador de função folicular parácrina, não
foi observada nenhuma diferença nos níveis entre os grupos para folículos de crescimento
lento (dados não mostrados). Contudo, para folículos de crescimento rápido (Fig. 7), o TRL
isolado não alterou os níveis de AMH, mas a adição de alta dose de T reduziu (p < 0.05) os
níveis de AMH produzido por folículos antrais em relação aos grupos controle e TRL + T
baixa na quinta semana de cultivo.
Figura 7. Efeito da reposição de T sobre a produção de AMH por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).
Resultados | 62
D) Efeitos sobre o grau de maturação, qualidade oocitária e fertilização
Como observado no Exp. 1, poucos folículos antrais e seus oócitos foram analisados
após exposição ao hCG durante a exposição ao TRL (Tabela IV; Reposição de T). Porém, a
exposição a T durante o tratamento com TRL recuperou a formação de folículos antrais, que
de forma consistente deram origem a oócitos saudáveis, embora sua maioria se encontrasse no
estágio de vesícula germinativa (GV). Ambos os grupos T baixa e controle apresentaram
folículos que deram origem a 1 oócito MI, e os grupos T alta e controle apresentaram
folículos que deram origem a oócitos MII após a exposição ao hCG. Os diâmetros de ambos
os oócitos MII obtidos eram superiores a 130 µm. Após FIV, a fertilização foi confirmada
pela presença de 2 corpúsculos polares e 2 pro-núcleos (dados não mostrados). Entretanto, os
zigotos mantiveram-se sem apresentar divisão celular.
Resultados | 63
Tabela IV. Efeito da reposição de T nas características de oócitos coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (34 h após administração de hCG).
Cultivo folicular Número (n) de Diâmetro (µm)*
Folículos analisados
Oócitos coletados
Oócitos degenerados
Oócitos saudáveis Oócitos VG
Oócitos MI
Oócitos MII VG MI MII
Reposição de T CTRL 15 15 2 12 1 1 119 ± 5a 143 131
TRL 4 4 2 2 0 0 117 ± 2a - -
TRL + T baixa 16 16 1 13 1 0 119 ± 14a 131 -
TRL + T alta 13 13 0 12 0 1 102 ± 14a - 147 Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); VG: vesícula germinativa; MI: metáfase I; MII: metáfase II. * Valores expressos em média ± erro padrão, com cada diâmetro oocitário como um dado individual; Diferentes letras (a, b, c) dentro da mesma coluna indicam diferença significativa (p < 0,05); O número de folículos analisados corresponde ao número de folículos que atingiram o diâmetro médio de 1 mm, e receberam hCG.
Resultados | 64
Experimento 3 – Reposição de dihidrotestosterona
A) Efeito sobre a sobrevida folicular e a formação de antro
A adição de DHT em presença do TRL recuperou a porcentagem de folículos
sobreviventes para os níveis encontrados no grupo controle (Fig. 8B); a resposta foi similar ao
observado após adição de T (Fig. 8A). Notavelmente, a administração de DHT isoladamente
contribuiu para o aumento da porcentagem de folículos que sobreviveram para mais do que
80%, acima (p < 0.05) do que foi observado para o grupo controle.
Figura 8. Efeito da reposição de T e DHT sobre a sobrevida de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A. Reposição de T; B. Reposição de DHT; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); DHT: 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; TRL + DHT: 250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).
Além disso, a porcentagem de folículos antrais no grupo que recebeu DHT
isoladamente (grupo DHT) (93 ± 3%) foi superior (p < 0.05) a porcentagem encontrada no
grupo controle (82 ± 4%) (Fig. 9B).
A. B.
CTRL TRL TRLTL TRLTH0
20
40
60
80
100
B
A,B
A
A,B
Su
rviv
al (
%)
CTRL TRL DHT DT0
20
40
60
80
100
AA,C
CS
urv
ival
(%
)
B
So
bre
vid
a (%
)
So
bre
vid
a (%
)
TRL+T baixa TRL+T alta CTRL TRL DHT TRL+DHTCTRL TRL
Resultados | 65
Figura 9. Efeito da reposição de T e DHT sobre a formação de antro de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A. Reposição de T; B. Reposição de DHT; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); DHT: 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; TRL + DHT: 250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).
B) Efeito sobre o crescimento folicular
Diferentemente do que foi observado nos Exp. 1 e 2, a exposição ao TRL
isoladamente não alterou as porcentagens de folículos sem crescimento ou que apresentam
crescimento lento ou rápido, e a reposição de DHT não apresentou um efeito positivo aparente
(Tabela V; Reposição de DHT). Entretanto, a adição isolada de DHT reduziu o
número/porcentagem (7%) de folículos sem crescimento, comparado com os grupos controle,
TRL e TRL + DHT. O TRL novamente diminuiu o diâmetro de folículos de crescimento lento
em relação aos folículos controle (315 ± 13 vs. 357 ± 16 µm, p < 0.05), porém essa diferença
desapareceu quando o tratamento com TRL foi combinado com a adição de DHT (373 ± 14
µm). DHT administrada isoladamente não apresentou efeito no diâmetro de folículos de
crescimento lento (dados não mostrados), mas contribuiu para a diminuição do tamanho de
folículos de crescimento rápido comparado aos controles (607 ± 29 vs. 726 ± 50 µm, p <
0.05).
Resultados | 66
Tabela V. Efeito da reposição de T e DHT sobre as características de crescimento folicular de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas.
Cultivo folicular Total Sem
crescimentoCrescimento
lento Crescimento
rápido Reposição de T
CTRL 47 3 (6%)a,b 31 (66%)a,b 13 (28%)a,b TRL 23 5 (22%)b 13 (57%)b 5 (21%)a
TRL + T baixa 47 0 (0%)a 29 (62%)a,b 18 (38%)b TRL + T alta 53 0 (0%)a 37 (70%)a 16 (30%)a,b
Reposição de DHT CTRL 51 9 (18%)a 22 (43%)a 20 (39%)a
TRL 30 5 (17%)a,b 16 (53%)b 9 (30%)b,c DHT 58 4 (7%)c 35 (60%)c 19 (33%)b
TRL + DHT 51 11 (22%)d 26 (51%)b,d 14 (27%)c Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); DHT: 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; TRL + DHT: 250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; Diferentes letras (a, b, c) dentro da mesma coluna indicam diferença significativa (p < 0,05).
C) Efeito sobre a produção de esteróides ovarianos e AMH
Como no Exp. 2, TRL diminuiu (p < 0.05) os níveis de P4 produzidos por folículos de
crescimento lento e a reposição com DHT recuperou os níveis produzidos, tornando-os
similares aos níveis encontrados no grupo controle (dados não mostrados). Da mesma forma,
nem a adição de DHT (Fig. 10C) ou T (Fig. 10A) alteraram a produção de P4 quando
combinados com o TRL. Contudo, a adição de DHT isoladamente aumentou os níveis de P4
produzidos por folículos de crescimento lento (dados não mostrados), e de crescimento rápido
(Fig. 10C). Diferente da adição de T (Fig. 10B), a adição de DHT + TRL reduziu
significativamente o E2 produzido por folículos de crescimento lento (dados não mostrados) e
de crescimento rápido (Fig. 10D) quando comparados ao grupo controle. Além disso, DHT
administrado de forma isolada replicou este mesmo efeito, também quando comparado ao
grupo controle.
Resultados | 67
Figura 10. Efeito da reposição de T e DHT sobre a produção de progesterona e estradiol por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A e B. Reposição de T; C e D. Reposição de DHT; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); DHT: 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; TRL + DHT: 250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).
Os níveis de AMH produzidos por folículos de crescimento rápido e crescimento lento
(dados não mostrados), foram marcadamente reduzidos quando DHT foi administrada
isoladamente (Fig. 11B), quando comparado com controles. A adição de DHT em presença de
TRL diminuiu (p < 0.05) os níveis de AMH em relação ao grupo TRL.
Resultados | 68
Figura 11. Efeito da reposição de T e DHT sobre a produção de AMH por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A. Reposição de T; B. Reposição de DHT; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); DHT: 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; TRL + DHT: 250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).
D) Efeitos sobre o grau de maturação, qualidade oocitária e fertilização
Como notado para os primeiros experimentos, poucos oócitos saudáveis foram
coletados a partir de folículos antrais no grupo TRL, comparado ao grupo controle (Tabela
VI; Reposição de DHT). Em contraste, o grupo de reposição de DHT apresentou folículos que
deram origem tipicamente a oócitos saudáveis (10 de 13), incluindo um oócito em estágio
MII. Notavelmente, o diâmetro dos oócitos VG obtidos a partir do grupo de reposição de
DHT (grupo TRL + DHT) foi maior (p < 0.05) do que os obtidos no grupo controle. A
exposição a DHT isoladamente (grupo DHT) deu origem a oócitos com características
semelhantes aqueles obtidos no grupo controle ou de reposição de DHT, exceto que nenhum
oócito MII foi observado. A Figura 12 ilustra um folículo secundário (Fig. 12A)
desenvolvendo-se em cultivo até o estágio antral semana 3 (Fig. 12B). Oócitos foram
coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (Fig. 12C). Após FIV em 3 oócitos MII
(Fig. 12D; 2 obtidos do grupo controle e 1 do grupo TRL + DHT), a fertilização foi
confirmada pela presença de 2 corpúsculos polares e 2 pro-núcleos (dados não mostrados).
Um dos oócitos fertilizados do grupo controle sofreu clivagem e o embrião desenvolve-se até
o estágio de mórula no dia 5 de cultivo após a FIV (Fig. 12E).
Resultados | 69
Tabela VI. Efeito da reposição de T e DHT nas características de oócitos coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (34 h após administração de hCG).
Cultivo folicular Número (n) de Diâmetro (µm)*
Folículos analisados
Oócitos coletados
Oócitos degenerados
Oócitos saudáveis Oócitos VG
Oócitos MI
Oócitos MII VG MI MII
Reposição de T CTRL 15 15 2 12 1 1 119 ± 5a 143 131
TRL 4 4 2 2 0 0 117 ± 2a - -
TRL + T baixa 16 16 1 13 1 0 119 ± 14a 131 -
TRL + T alta 13 13 0 12 0 1 102 ± 14a - 147
Reposição de DHT CTRL 21 21 6 13 0 2 110 ± 2a - 123 ± 3
TRL 8 8 6 2 0 0 112 ± 2a,b - -
DHT 10 10 4 6 0 0 116 ± 4a,b - -
TRL + DHT 13 13 3 9 0 1 118 ± 2b - 117 Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); VG: vesícula germinativa; MI: metáfase I; MII: metáfase II. * Valores expressos em média ± erro padrão, com cada diâmetro oocitário como um dado individual; Diferentes letras (a, b, c) dentro da mesma coluna indicam diferença significativa (p < 0,05); O número de folículos analisados corresponde ao número de folículos que atingiram o diâmetro médio de 1 mm, e receberam hCG.
Resultados | 70
Figura 12. Folículo secundário em desenvolvimento até a obtenção de embrião. Nota. A: dia 1; B: semana 3 de cultivo; C: semana 5 de cultivo; D: oócito MII; E: embrião em estágio de mórula no dia 5 de desenvolvimento Experimento 3.
Discussão
Discussão | 72
Muitos estudos (ZELINSKI et al., 1993; HILLIER, TETSUKA, 1997; VENDOLA et
al., 1998; GOERLICH et al., 2010; GLEICHER et al., 2011) suportam o conceito de que os
androgênios são detrimentais para a maturação gamética e folicular. Contudo, estudos
recentes com roedores (TETSUKA et al., 1995; SEM, HAMMES, 2010; XUE et al., 2012;
2013), e outras espécies de mamíferos (CAMPO et al., 1985a,b; HILLIER et al., 1997; WEIL
et al., 1998; DUFFY et al., 1999; CÁRDENAS, POPE, 2002; HAMPTON et al., 2004;
MCEWAN et al., 2010; GLISTER et al., 2010) incluindo humanos (HORIE et al., 1992;
SUZUKI et al., 1994; KIM et al., 2011), ampliaram esta visão no sentido de considerar que os
androgênios possuem ações positivas durante o desenvolvimento folicular. Estes estudos
estabeleceram que ARs são expressos nos folículos desde os estágios iniciais de crescimento
(KIMURA et al., 2007; LENIE, SMITZ, 2009) e desempenham um papel essencial na
foliculogênese (WALTERS et al., 2008; 2010; LEBBE, WOODRUFF, 2013). Entretanto,
estudos adicionais são necessários para se definir os efeitos diretos dos androgênios nos
folículos de mamíferos, (HARLOW et al., 1988; VENDOLA et al., 1999a, YANG,
FORTUNE, 2006) e seus oócitos (VENDOLA et al., 1999b) em estágios específicos da
foliculogênese, incluindo primatas. Um sistema de cultivo folicular 3D, onde folículos são
encapsulados individualmente usando biomateriais a base de alginato (KREEGER et al.,
2006; XU et al., 2006; WEST et al., 2007; SHIKANOV et al., 2009), foi aplicado
recentemente por nosso grupo para o cultivo de folículos de primatas (XU et al., 2009b; XU et
al., 2010), e poderia ser um sistema valioso para estudos relacionados com ação androgênica
local. Este sistema 3D é capaz de suportar o crescimento dos folículos, permitindo o
desenvolvimento folicular in vitro desde os estágios iniciais (folículos secundários) até o
estágio antral de pequeno diâmetro (1 mm), com produção de hormônios esteróides em
humanos (XU et al., 2009a) e primatas não humanos (macacos rhesus) (XU et al., 2009b; XU
et al., 2010; XU et al., 2011a) e em alguns casos oócitos maduros, que quando inseminados
são fertilizados, dando origem a embriões em estágio de clivagem (macacos; XU et al.,
2011a) e mesmo a nascidos vivos (camundongos; XU et al., 2006; WEST et al., 2007).
A proposta do presente estudo foi investigar pela primeiravez, o papel dos androgênios
no desenvolvimento folicular (sobrevida, formação de antro, produção hormonal e maturidade
oocitária), de folículos pré-antrais frescos de primatas não-humanos cultivados
individualmente, em sistema de cultivo in vitro em matrix 3D por meio da ablação da
produção de esteróides e reposição de T e DHT.
A ablação da produção de esteróides pode ser atingida pela administração de TRL, que
é uma droga que inibe a ação da enzima 3β-hidroxidesidrogenase nas células da teca
Discussão | 73
(SCHANE et al., 1979). Com o bloqueio desta enzima, a formação de progesterona, 17-
hidroxi-progesterona, androstenediona e testosterona pode ser diretamente suprimida. Desta
forma, a formação dos substratos que dão origem ao E2 e DHT nas células da granulosa pode
ser comprometida (KIMURA et al., 2007). Com base em experiências prévias positivas com o
uso desta droga em estudos in vitro (DUFFY et al., 1996) e in vivo (HIBBERT et al., 1996), o
TRL foi usado no presente estudo com o objetivo de induzir a ablação de esteróides em
folículos cultivados individualmente in vitro. As concentrações suprimidas de P4 e E2 no
Exp. 1, demonstraram que o uso do TRL foi efetivo no bloqueio da conversão de
pregnenolona, cujos níveis encontrados foram elevados, em progesterona e outros esteróides
como a androstenediona (dados não mostrados) e estradiol, afetando diretamente a cascata
esteroidogênica. Após a formação de antro, folículos de crescimento lento e rápido
produziram apreciáveis níveis de P4 no grupo controle, enquanto que os níveis foram
marcadamente reduzidos pela exposição ao TRL. Ao mesmo tempo, folículos de crescimento
lento e rápido que receberam TRL desde o início e após 2 semanas de cultivo, apresentaram
concentrações de pregnenolona bastante aumentadas. Notavelmente, a exposição ao TRL
também reduziu as concentrações de E2. Os resultados deste estudo são consistentes com
achados obtidos em estudos in vivo com macacas, que mostraram que um dos efeitos da ação
do TRL parece ser a inibição da produção/ação da progesterona, uma vez que a administração
do TRL conjunta com o hCG, bloqueou a ovulação, enquanto que a administração
concomitante de progestina (R5020) preveniu a ação anti-ovulatória. Estudos prévios in vitro
também mostraram que a administração do TRL efetivamente inibiu a produção de P4 e
reduziu o número de células positivas para receptores de progesterona (PRs) (DUFFY et al.,
1996).
Estes efeitos são consistentes com a atividade conhecida do TRL como inibidor do
sistema enzimático 3β-hidroxiesteroide desidrogenase (POTTS et al., 1978). A exposição ao
TRL desde o início do cultivo para a sustentação de um ambiente pobre em esteróides,
realmente afeta a sobrevida, o crescimento e a formação de antro dos folículos. A
porcentagem dos folículos sobreviventes em cultivo e que atingiram a formação de antro foi
menor na presença de TRL quando o mesmo foi adicionado no início do cultivo e quando
comparado com o grupo controle. Além disso, quando a droga foi adicionada, não houve a
formação de folículos de crescimento rápido, os folículos de crescimento lento não cresceram
o esperado e a porcentagem de folículos que não cresceram foi alta. Os efeitos do bloqueio da
esteroidogênese também puderam ser observados na qualidade oocitária e grau de maturação.
No grupo controle, apesar dos oócitos obtidos terem reiniciado a maturação meiótica
Discussão | 74
raramente em resposta ao hCG, eles eram tipicamente saudáveis. Em contrante, poucos
folículos desenvolveram-se ao estágio antral durante a exposição ao TRL e apenas um oócito
foi coletado neste grupo, e cerca de metade dos oócitos coletados no grupo TRL2 não eram
saudáveis. Estes achados são consistentes com o conceito de que os esteróides ovarianos
possuem um papel local crítico no crescimento e desenvolvimento dos folículos de primatas
desde o início da foliculogênese. Notavelmente, os efeitos da ablação da produção de
esteróides podem dever-se a perda da ação local dos progestagênios, androgênios ou
estrogênios, individualmente ou em conjunto. Além dos ARs (CAMPO et al., 1985b; HILD-
PETITO et al., 1991; HORIE et al., 1992; DUFFY et al., 1999), há evidências da presença de
PRs (PELUSO et al., 1998; GAVA et al., 2004; PELUSO, 2006), e ERs (CHIAN et al., 1999;
BISHONGA et al., 2001) em folículos de primatas com possíveis ações locais
(progestagênios - DULEBA et al., 1999; SLOMCZYNSKA et al., 2000; PELUSO, 2006;
estrogênios – DRUMMOND, FINDLAY, 1999; NELSON, BULUN, 2001). Neste estudo
inicial, optamos por focar nos possíveis papéis dos androgênios, por meio da reposição de T e
DHT.
A adição de testosterona ao meio de cultivo desprovido de esteróides, contribuiu
marcadamente para o aumento da sobrevida e formação de antro de folículos pré-antrais
individuais de primatas não-humanos cultivados in vitro. A adição de testosterona em
presença de TRL também deu origem a oócitos maduros e saudáveis. Um maior número de
folículos antrais foi formado tanto quando uma dose baixa (remanescente aos níveis
circulantes em primatas) ou uma dose alta (como encontrado no fluido folicular de folículos
maduros de primatas) de testosterona foi adicionada no meio de cultivo, em relação ao
número de folículos antrais formados no grupo TRL. O crescimento também foi recuperado
para o padrão observado no grupo controle tanto para folículos de crescimento lento como
rápido, que apresentaram diâmetros superiores aos encontrados para o grupo TRL em
comparação com os controles, e além disso, evidenciado pela ausência de folículos sem
crescimento tanto no grupo T baixa como T alta e pelo fato de que os folículos de crescimento
rápido constituíram pela primeira vez mais de 30% da população total de folículos. Oócitos
saudáveis foram produzidos após exposição a T durante o tratamento com TRL, nos estágios
VG, MI e MII e dois embriões foram formados. Estes dados sugerem que a reposição de
androgênios pode promover a maturação e viabilidade oocitária, e que a ação androgênica no
folículo pode estar relacionada a interações entre o oócito e células somáticas via fatores
secretados pelo oócito (DRUMMOND, 2006).
Discussão | 75
Da mesma forma que o TRL reduziu de forma efetiva os níveis de esteróides em
relação ao grupo controle, o E2 apresentou-se marcadamente aumentado na exposição a doses
baixa e alta de T em presença de TRL. Concentrações elevadas de E2 foram observadas tanto
para folículos de crescimento lento quanto crescimento rápido, presumidamente devido a
aromatização de T por células da granulosa de folículos antrais (XING et al., 2012). Efeitos
locais do E2 nos folículos tem sido reportados e parecem ser espécie dependentes. O E2
parece ser importante em eventos envolvidos na foliculogênese, especialmente em roedores
(DRUMMOND, FINDLAY, 1999; BISHONGA et al., 2001; BOLAMBA et al., 2006; XU et
al., 2010), porém seu papel em folículos de primatas ainda está pouco claro (CHIAN et al.,
1999; BOLAMBA et al., 2006). A recuperação da sobrevida, formação de antro e crescimento
nos grupos com reposição de T, podem ser devido em parte pela possível conversão de T em
E2 pela aromatase P450, e sinalização estrogênio-receptor no folículo. Experimentos
anteriores, nos quais altas doses de T foram administradas (HILLIER, ROSS, 1979;
NANDEDKAR, MUNSHI, 1981), permitiram que fosse proposto que os efeitos
“androgênicos” eram mediados por estrogênios que foram convertidos por meio de ERs e não
por meio de ARs. Contudo, os androgênios também podem ser produzidos pelo ovário, e a
testosterona reposta poderia ser convertida em dihidrotestosterona pela enzima 5α-redutase
nas células da granulosa ou ter efeitos diretos sobre os folículos, sendo responsáveis em parte
pela restauração da sobrevida, formação de antro e crescimento observados em nosso
experimento in vitro. Com o intuito de testar esta hipóstese, a DHT, um androgênio não-
aromatizável, foi adicionado ao cultivo dos folículos, conforme descrito no Experimento 3.
Assim como para a exposição a T, a DHT em conjunto com TRL recuperou a
habilidade dos folículos em se desenvolver e a produzir oócitos maduros. A adição de DHT
com TRL recuperou a porcentagem de folículos sobreviventes aos níveis encontrados no
grupo controle. Como esperado, o diâmetro de folículos com crescimento lento foi reduzido
na presença de TRL administrado isoladamente, comparado aos controles, mas a diferença
desapareceu quando DHT foi adicionada ao cultivo, como aconteceu quando T foi adicionada.
Para folículos que cresceram rápido, a DHT (isoladamente) diminuiu o tamanho dos folículos
comparado com controles, o que foi similarmente observado quando uma dose alta de T foi
administrada em presença de TRL. Os níveis de P4 foram encontrados reduzidos em folículos
de crescimento lento quando TRL foi adicionado isoladamente, e os níveis foram restaurados
aqueles encontrados no grupo controle quando DHT foi reposta, de forma similar como o que
foi observado quando uma dose baixa de T foi adicionda ao cultivo para folículos de
crescimento rápido. Da mesma forma, foi observado um efeito positivo em relação a
Discussão | 76
qualidade oocitária quando os folículos foram expostos a DHT. De forma consistente com a
reposição de T, a maioria dos oócitos coletados de folículos antrais quando DHT foi reposta
foi saudável, incluindo um oócito MII. É importante ressaltar que o diâmetro dos oócitos VG
saudáveis foi superior no grupo DHT comparado com os controles, e a exposição a DHT
isoladamente deu origem a oócitos com características similares as observadas no grupo
controle ou de reposição de DHT, exceto que oócitos MII não foram observados. Estes
reultados suportam fortemente a idéia de que as ações dos androgênios promovem
crescimento folicular precoce, esteroidogênese e desenvolvimento oocitário em folículos de
primatas desde o início da foliculogênese.
Diferentemente da adição de T, a combinação de DHT com TRL, não contribuiu para
o aumento da produção de E2 por folículos de crescimento lento e rápido comparados com os
grupos controle e TRL (isoladamente), dando suporte a conclusão de que a T, e não a DHT, é
aromatizada no folículo. Como notado, muitas mudanças causadas por T, foram mimetizadas
por DHT. Desta forma, muitos dos efeitos positivos no desenvolvimento folicular encontrados
após a reposição de T, provavelmente não são devidos a ação estrogênica. Sendo assim, é
possível inferir que os androgênios apresentam um papel local essencial durante o
desenvolvimento e maturação folicular em primatas não humanos. Corroborando nossos
resultados em folículos de primatas, o tratamento de folículos de camundongo com
hidroxiflutamida ou bicalutamida, dois componentes anti-androgênicos, reduziu o
crescimento folicular durante o estágio pré-antral, alterou a função esteroidogênica, e impediu
a maturação meiótica de oócitos em resposta ao hCG (LENIE, SMITZ, 2009).
Alguns dos efeitos androgênicos observados podem ser inibitórios a funções
foliculares. Em relação ao Hormônio Anti-Mulleriano (AMH), uma glicoproteína produzida
pelas células da granulosa no ovário e que está relacionada com a regulação do crescimento e
desenvolvimento dos folículos (ILIODROMITI, NELSON, 2013; DEWAILLY et al., 2014),
a adição de uma dose alta de T contribuiu para a redução dos níveis de AMH produzidos por
folículos antrais quando comparados com controles na semana 5 de cultivo. Resultados
similares foram observados após a adição de DHT ao TRL, que também reduziu os níveis de
AMH comparado com o grupo TRL. Além disso, os níveis de AMH também foram reduzidos
em folículos de crescimento lento e rápido quando DHT foi adicionado isoladamente. Estes
dados demonstram o efeito dose dependente dos androgênios, mostrando níveis baixos de
AMH em presença de altas doses de T e DHT, mas não dose baixa de T, comparado com
controles. Este efeito dependente da dose pode significar que concentrações altas de
androgênios apresentam ações adicionais negativas nos folículos, reforçando o conceito de
Discussão | 77
que altos níveis de androgênios no estágio antral devem estar associados com efeitos
negativos para o desenvolvimento folicular, e concentrações apropriadas de AMH seriam um
sinal de um adequado desenvolvimento folicular (NARDO et al., 2009). Em contraste, isto
também poderia significar que os androgênios podem ser reguladores de uma excessiva
síntese de AMH pelas células da granulosa, responsável por causar paralização do
desenvovimento folicular, baseado em estudos com pacientes com SOP.
Nossos resultados suportam a evidência de que ação dos androgênios no folículo pode
ser estágio e/ou de dose-dependente. Estudos tem evidenciado o papel dos androgênios no
estágio folicular pré-antral (KIMURA et al., 2007; LENIE, SMITZ, 2009). Contudo, como
frequentemente observado em estudos in vivo com pacientes com SOP (DUMESIC et al.,
2008; LEBBE, WOODRUFF, 2013), os androgênios podem apresentar efeitos negativos
sobre os folículos dependendo de seus níveis intrafoliculares, especialemente se eles são altos,
afetando o desenvolvimento folicular e a maturação oocitária (HILLIER, TETSUKA, 1997;
VENDOLA et al., 1998). Além disso, existem estudos reportando que a apoptose pode ser
induzida por androgênios em células da granulosa em ratas (BILLIG et al., 1993),
evidenciando também um efeito prejudicial de níveis de T excessivos. Particularmente
perplexo neste experimento, é a evidência de que uma dose baixa de T (e DHT), mas não uma
dose alta de T, restaurou os níveis de P4 aos níveis encontrados no grupo controle, apesar da
presença de TRL. Neste caso, a T demonstra um efeito dose dependente, onde uma baixa dose
de T contribuí para a manutenção de níveis adequados de P4, e uma dose alta afeta
negativamente a produção de P4. Entretanto, os possíveis mecanismos envolvidos na
conversão ativa de androgênios em progesterona, ou na sinalização de receptores
androgênicos que promovem a produção de 3-β-HSD independente da progesterona não são
claros.
Notavelmente, a administração isolada de DHT replicou muitos dos efeitos observados
quando T ou DHT foi adicionado em conjunto com TRL. A porcentagem de folículos
sobreviventes e a porcentagem de formação de folículos antrais foi maior do que o observado
no grupo controle. Em relação aos efeitos no crescimento de folículos de crescimento rápido,
DHT administrada isoladamente, diminuiu o tamanho dos mesmos, o que também foi
observado quando uma dose alta de T foi adicionada em presença de TRL. A adição isolada
de DHT também reduziu a porcentagem de folículos sem crescimento, comparado com
controles ou quando DHT estava presente em conjunto com TRL. Em contraste ao observado
quando DHT e T foram adicionados com TRL, a adição de DHT isoladamente aumentou os
níveis de P4 produzidos por folículos de crescimento lento e rápido. Estes resultados também
Discussão | 78
são consistentes com a idéia de que os androgênios são essenciais na foliculogênese, e que
androgênios endógenos não provocam um efeito máximo durante a cultura de folículos. A
adição de DHT no meio de cultivo padrão, com a função de contribuir para o crescimento
folicular, poderia ser sugerido como uma tentativa de melhoramento nas condições de cultivo.
Um estudo que examinou in vitro o efeito da DHT na síntese e secreção de progesterona por
células foliculares em resposta ao FSH e IGF-I, mostrou que a DHT contribuiu
significativamente para a proliferação de células da granulosa estimulada por IGF-I, e teve
uma influência variável na secreção de progesterona. Os autores concluíram que a atividade
mediada por androgênio-receptor nas células da granulosa de folículos antrais é dependente
do tamanho do folículo, e influenciada pela proximidade das células e do oócito, e
possivelmente envolve tanto mecanismos de ação esteroidogênica clássicos como não-
clássicos (HICKEY et al., 2005).
Apesar de outros androgênios estarem presentes no ovário, apenas a T e seu
metabólito DHT, possuem atividade androgênica direta por meio de ARs (KIRILOVAS et al.,
2003; HICKEY et al., 2005). Diversos estudos documentam a expressão de ARs em ovários
de mamíferos (TETSUKA et al., 1995; SEM, HAMMES, 2010; XUE et al., 2012; 2013;
CAMPO et al., 1985a, b; HILLIER et al., 1997; WEIL et al., 1998; DUFFY et al., 1999;
CÁRDENAS, POPE, 2002; HAMPTON et al., 2004; MCEWAN et al., 2010; GLISTER et
al., 2010; HORIE et al., 1992; SUZUKI et al., 1994; KIM et al., 2011), e a ação dos
androgênios durante a foliculogênese ovariana, mostrando que são indispensáveis para um
processo de foliculogênese normal (HU et al., 2004; SHIINA et al., 2006). Contudo, a
conexão molecular entre os reguladores da foliculogênese ovariana e as reações sob controle
de ARs ainda permacecem pouco conhecidas. Existem muitos genes alvo de AR nos ovários,
porém não existem muitos estudos que os testaram ainda. Entretamento, a regulação
androgênica positiva destes genes que codificam o receptor de FSH (WEIL et al., 1999), fator
semelhante a insulina (IGF-1) e o receptor IGF-1 (VENDOLA et al., 1999a, b; WEIL et al.,
1999) é evidente ao nível de mRNA nas células foliculares de primatas e outras espécies
(HICKEY et al., 2005).
Este estudo in vitro apresentou novas evidências do papel local essencial dos
androgênios desde os estágios inicias da foliculogênese de primatas não humanos,
fortalecendo a existência de mecanismos moleculares que regulam a atividade de ARs, a
atividade androgênica (KIRILOVAS et al., 2003; LENIE, SMITZ, 2008), e novas possíveis
interações entre androgênios com outros hormônios esteróides. Nossos achados mostraram
claramente que a T e a DHT podem recuperar a sobrevida, o crescimento, a formação de
Discussão | 79
antro, a produção hormonal e a viabilidade oocitária de folículos pré-antrais cultivados in
vitro em matrix 3D de alginato, expostos a ablação da produção de esteróides. Novos
conhecimentos obtidos através deste estudo, podem ajudar no entendimento da dinâmica do
processo do desenvolvimento folicular, que ainda é muito pouco compreendida,
principalmente em primatas (CHAND et al., 2010). O melhor entendimento da foliculogênese
em primatas não humanos, pode desempenhar um papel crucial no entendimento da
etiopatogênese de distúrbios ovulatórios humanos, com destaque para a SOP, além de
favorecer a identificação das condições ótimas para o crescimento de folículos de primatas in
vitro, com inúmeras aplicabilidades clínicas, com destaque para a obtenção de oócitos
maduros saudáveis após o descongelamento do tecido ovariano em pacientes oncológicas
(WOODRUFF, 2007; SHEA et al., 2008; WEST et al., 2009; ZELINSKI, 2010; DONNEZ,
DOLMANS, 2011; SILBER, 2012; TELFER, ZELINSKI, 2013).
Conclusões
Conclusões | 81
A exposição ao TRL durante o cultivo de folículos secundários de primatas não humanos
cultivados individualmente em matrix 3D afeta negativamente a sobrevida, o crescimento e a
formação do antro folicular, assim como a qualidade e o grau de maturação oocitário. O bloqueio
mais precoce da 3-βHSD pelo TRL, administrado desde o início do cultivo interfere de modo
expressivamente mais negativo sobre estas variáveis. Estes achados são consistentes com o
conceito de que os esteróides ovarianos possuem um papel local crítico no crescimento e
desenvolvimento dos folículos de primatas não humanos desde o início da foliculogênese e que
quanto mais precoce o bloqueio, mais significativo seu impacto deletério.
A adição de T em dose baixa ou alta ao meio de cultivo na presença de TRL,
contribuiu expressivamente para o aumento da sobrevida, crescimento e formação de antro
folicular, comparáveis ao grupo controle. Além disto, deu origem a oócitos maduros e
saudáveis, e interferiu positivamente na produção hormonal, reestabelecendo as concentrações
de E2 e P4 a valores encontrados no grupo controle, com efeito dose-dependente. Estes dados
sugerem que a reposição de testosterona ao meio de cultivo desprovido de esteróides,
favorece a sobrevida, o crescimento e a formação de antro folicular, assim como a produção
de hormônios esteróides, e a maturação e viabilidade oocitária. Estes achados reforçam o
papel crítico dos esteróides ovarianos na foliculogênese precoce de primatas não humanos,
sem permitir, todavia, a definição do papel da testosterona ou seus metabólitos.
A adição de DHT promoveu a recuperação da sobrevida folicular, formação de antro,
produção hormonal e maturação oocitária. A adição de DHT ao meio de cultivo com TRL
recuperou a porcentagem de folículos sobreviventes aos níveis encontrados no grupo controle,
assim como a recuperação do crescimento, formação de antro, produção hormonal e
maturação oocitária. Contudo, a concentração de E2 não foi tão elevada como após a
reposição de T, dando suporte a conclusão de que a T, e não a DHT, é aromatizada no
folículo. Estes resultados suportam fortemente a idéia de que os androgênios promovem
crescimento folicular desde os estágios iniciais da foliculogênese, esteroidogênese e
participam na maturação oocitária.
Nossos achados demonstram que a T e a DHT podem reestabelecer a sobrevida, o
crescimento, a formação de antro, a produção hormonal e a viabilidade oocitária de folículos
pré-antrais cultivados in vitro em matrix 3D de alginato, expostos a ablação da produção de
esteróides. Estes achados são essenciais para o entendimento do processo da foliculogênese e
podem auxiliar na otimização da técnica de cultivo folicular in vitro em matrix 3D para
aplicação em diferentes tipos de estudo e futuramente para obteção de oócitos saudáveis para
pacientes com câncer que desejam preservar seus gametas.
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Anexos
Anexos | 102
ANEXO A
Title: Direct actions of androgen on the survival, growth and secretion of steroids and
anti-mullerian hormone by individual follicles from rhesus monkeys during 3-D culture
Authors: Jhenifer Kliemchen Rodrigues (BSc, MSc)1,2,3, Paula Andrea Navarro (MD, MSc,
PhD)2, Richard Yeoman (PhD)1, Mary Beth Zelinski (PhD)1, Richard L Stouffer (PhD)1, Jing
Xu (PhD)1
1 Oregon National Primate Research Center, Oregon Health and Science University,
Beaverton, Oregon, USA 2 Department of Gynecology and Obstetrics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto,
University of São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil 3 Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento, Pró-Criar Medicina Reprodutiva, Belo
Horizonte, Minas Gerais, Brazil
Address for correspondence:
Pró-Criar Medicina Reprodutiva
Rua Bernardo Guimarães, 2063, Lourdes.
Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil
Zip code: 30140-082
Anexos | 103
Introduction
In addition to androgen’s role as a precursor for the steroid hormone, estradiol, and
possible endocrine actions in the female, considerable evidence suggests that androgen has
local, paracrine/autocrine actions in the ovary, particularly in the developing follicle. Recent
studies reporting androgen receptor (AR) expression in developing follicles (Kimura et al.,
2007; Lenie and Smitz, 2009) are consistent with an essential role for androgen in female
reproductive physiology (Walters et al., 2008; Walters et al., 2010; Lebbe and Woodruff,
2013). Evidence for ARs in all stages of growing follicles from several species (Walters et al.,
2008; 2012) including murine (Tetsuka et al., 1995; Sen and Hammes, 2010; Xue et al., 2012;
2013), porcine (Campo et al., 1985; Cárdenas and Pope, 2002), bovine (Hampton et al.,
2004; Glister, Satchell and Knight, 2010), nonhuman primate (Hillier et al., 1997; Weil et al.,
1998; Duffy et al., 1999; McEwan et al., 2010) and human (Horie et al., 1992; Suzuki et al.,
1994; Kim et al., 2011) suggest that the androgen has effects throughout follicular
development. Observations in female mice discovered that inactivation of ARs results in
premature ovarian failure (POF), indicating that normal folliculogenesis requires AR-
mediated androgen action (Kimura et al., 2007; Sen and Hammes, 2010; Xue et al., 2013). In
human ovaries, AR protein expression can be observed in granulosa cells, theca cells and
stromal cells of follicles during almost all stages of the menstrual cycle. However there is a
difference among observations regarding immunohistochemical staining intensity (Horie et a.,
1992), what can be related to the fluctuating expression levels that depends on the
developmental status of the follicle (Drummond, 2006).
Considerable evidence suggests that androgens promote early follicular growth (Hillier
and De Zwart, 1981; Durlinger et al., 2000; Young et al., 2012). In culture systems of mouse
follicles, androgen exposure contributed to the development of the preantral follicles (Murray et
al., 1998); androgen treatment increased the diameter of mouse follicles during in vitro culture
(Wang et al., 2001). Other studies also observed that pharmacological doses of testosterone
promote early development in bovine (Yang and Fortune, 2006) and macaque (Harlow, Hillier e
Hodges, 1986; Harlow et al., 1988 Vendola et al., 1999a) follicles. These data support the clinical
effort to determine if pretreatment with transdermal testosterone improves ovarian response to
gonadotrophins in “poor-responder” IVF patients (Balasch et al., 2006; Fábregues et al., 2009;
Sonmezer et al., 2009; Sönmezer Cil and Oktay, 2009; Wiser et al., 2010).
However, androgen action in the follicle may be stage- or dose- dependent. For
example, androgen action may become detrimental in antral follicles, showing anti-maturation
Anexos | 104
and anti-growth effects at this stage (Hillier and De Zwart, 1981; Durlinger et al., 2000; 2002;
Young et al., 2012). Thus, it is proposed that the actions of androgens can be, depending on
the follicular stage, promoters or inhibitors of the follicular growth (Hillier and Tetsuka, 1997;
Vendola et al., 1998). Androgen action may also depend on its intrafollicular levels, with
lower levels required for a normal folliculogenesis and increased levels causing follicular
dysfunction. Notably, studies of women with polycystic ovary syndrome (PCOS) often
suggest that hyperandrogenemia adversely affects follicular development and oocyte
maturation (Dumesic et al., 2008; Lebbe and Woodruff, 2013).
More detailed studies are needed to define the direct effects of androgen in follicles
(Harlow et al., 1988; Vendola et al., 1999a, Yang and Fortune, 2006) and their oocytes
(Vendola et al., 1999b) at specific stages of folliculogenesis especially in primates. The 3D
culture system, using individual follicles encapsulated in alginate biomaterials (Xu et al.,
2009b; Xu et al., 2010), may contribute to studies on the direct actions of hormones and local
factors on folliculogenesis in primates. We recently used this culture system to develop
primate (macaque) follicles from the early (secondary) preantral to small antral stage, with
achievement of steroidogenic function and oocyte maturation (Xu et al., 2009a). The present
study was to assess for the first time, the actions of androgen on follicular development
(survival, antrum formation, hormone production and oocyte maturity), in individual primate
(macaque) preantral follicles, using the 3D matrix culture system, through steroid ablation and
replacement of testosterone (T) and dihydrotestosterone (DHT).
Materials and Methods
Animals and ovary collection
The general care and housing of rhesus macaque monkeys was provided by the
Division of Comparative Medicine at the Oregon National Primate Research Center
(ONPRC). Animals were pair caged in a temperature controlled (22Co) light-regulated 12
L:12 D room. Diet consisted of Purina monkey chow (Ralston-Purina, Richmond, IN, USA)
provided twice a day, supplemented with fresh fruit or vegetables once a day and water ad
libitum. Animals were treated according to the National Institutes of Health Guide for the
Care and Use of Laboratory Animals, and protocols were approved by the ONPRC
Institutional Animal Care and Use Committee.
Anexos | 105
Fourteen adult, female rhesus monkeys, exhibiting regular menstrual cycles (the first
day of menstruation considered day 1 of the cycle) were used in the study. Ten animals were
assigned specifically to the study; ovariectomies were conducted on anesthetized monkeys by
laparoscopy at early follicular phase, day 1– 4 of the cycle, as previously described (Duffy
and Stouffer, 2002). Ovaries were also collected from 4 additional animals at necropsy
following termination for other studies or reasons unrelated to reproductive health. Ovaries
were immediately transferred into Hepes buffered holding media (CooperSurgical, Inc.,
Trumbull, CT, USA) supplemented with 0.2% (v/v) human serum protein supplement (SPS,
CooperSurgical, Inc.) and 10 µg/ml gentamicin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), and
kept at 37oC upon to follicle isolation (Xu et al., 2010; 2011).
Follicle isolation, encapsulation and culture
Isolation, encapsulation and in vitro culture of individual follicles as performed as
previously described (Xu et al., 2010). Briefly, ovarian cortex was cut into 1 × 1 × 1 mm
cortical cubes. Follicles were mechanically isolated in the holding media using 31- gauge
needles and secondary follicles with diameters of 125–225 mm that displayed the following
characteristics were selected for encapsulation: (i) an intact basement membrane, (ii) two to
three layers of granulosa cells and (iii) a visible, healthy oocyte that was round and centrally
located within the follicle, without vacuoles or dark cytoplasm. Follicles from individual
monkeys were divided among the treatment groups with 12–24/monkey follicles per group.
Follicles were transferred individually into 5 µL 0.25% (w/v) sterile sodium alginate
(FMC BioPolymers, Philadelphia, PA, USA)-phosphate-buffered saline (PBS) (137 mM
NaCl, 10 M phosphate, 2.7 mM KCl, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and the droplets were
cross-linked in 50 mM CaCl2, 140 mM NaCl, 10 mM HEPES solution (pH 7.2) for 1 min.
Each alginate-encapsulated follicle was transferred into individual wells of 48-well plates
containing 300 µL alpha minimum essential medium (αMEM, Invitrogen) supplemented with
0.3% (v/v) SPS, 0.5 mg/ml purified bovine fetuin, 5 µg/ml insulin, 5 µg/ml transferrin and 5
ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich).
Follicles were cultured at 37 oC in a 5 % oxygen environment (in 6% CO2/89% N2)
with recombinant human (rh) FSH (NV Organon, Oss, Netherlands) at 3ng/mL during the
first 20 days, and then decreased to 0.3 ng/mL for the remainder of the culture interval.
Follicles that reached the antral stage were treated with human chorionic gonadotrophin
(hCG) (Serono, Geneva, Switzerland) (100 ng/mL) to initiate meiotic maturation of the
Anexos | 106
oocyte. After 34 h, the oocytes were collected to determine the stage of oocyte meiotic
maturation. Samples of the culture media (150 µL) were collected and replaced every other
day and stored at – 20oC until analyzed for ovarian steroid hormones and AMH.
Experiment 1: Steroid ablation
In order to evaluate the role of steroids in primate folliculogenesis in vitro, we used a
steroid synthesis inhibitor (trilostane, TRL) that acts by blocking the action of the enzyme 3
beta-hydroxysteroid dehydrogenase (3bHSD), which is responsible for converting
pregnenolone to progesterone. TRL was added to the follicle culture medium at a dose of 250
ng/ml that effectively blocks progesterone production by primate follicular cells in vitro
(Duffy et al., 1996).
Secondary follicles obtained from ovaries of 6 animals (4 at necropsy; 2 at surgery)
were divided into three groups: (1) control group: follicles (n = 174) grown in control medium
plus the TRL vehicle (ethanol) until the end of culture (40 days); (2) TRL group: follicles (n =
173) grown in presence of TRL from the beginning to the end of culture (40 days); (3) TRL2
group: follicles (n = 169) grown in TRL added to the medium after two weeks of culture and
maintained until the end of culture.
Experiment 2: Testosterone replacement
To evaluate the role of testosterone in folliculogenesis, the second experiment was
performed by adding back two different doses of testosterone (T; 10 or 50 ng/mL, groups T
low and T high) in the culture media with TRL, plus control (vehicle) and TRL alone.
Secondary follicles obtained from 4 animals were cultured in control medium
containing: (1) vehicle (control group; n = 85) for 40 days; (2) TRL at a dose of 250 ng/mL
from the beginning until the end of culture (40 days) (TRL group; n = 82); (3) TRL and 10
ng/mL testosterone for 40 days (T low group; n = 84); (4) TRL and 50 ng/mL testosterone (T
high group; n = 86) for 40 days.
Experiment 3: Dihydrotestosterone replacement
To confirm the role of androgen, independent of possible conversion to estrogen, in
primate folliculogenesis, the third experiment was performed, adding dihydrotestosterone
Anexos | 107
(DHT) (50 ng/mL) to the culture media with TRL, or DHT by itself, plus control (vehicle)
and TRL alone.
Secondary follicles from ovaries of 4 animals were grown in control medium
containing: (1) vehicle (control group; n = 72); (2) TRL at a dose of 250 ng/mL from the
beginning of the culture until the end (40 days) (TRL group; n = 66); (3) DHT (50 ng/mL) by
itself (DHT group; n = 69); (4) TRL and DHT (TRL+DHT group; n = 66).
Follicle survival, growth and antrum formation
Follicle survival, diameter and antrum formation were assessed weekly using an
Olympus CK40 inverted microscope, an Olympus DP11 digital camera (Olympus Imaging
America Inc., Center Valley, PA, USA) and ImageJ 1.44 p software (National Institutes of
Health, Bethesda, MD, USA) (Xu et al., 2010, 2011). Follicles were measured from the outer
layer of cells which included a measurement at the widest diameter of the follicle and a
second measurement perpendicular to the first. The mean of the values was calculated and
reported as the follicle diameter. Follicles were considered to undergo atresia if the oocyte
was dark or not surrounded by a layer of granulosa cells, the granulosa cells became dark and
fragmented, or the diameter of the follicle decreased (Xu et al., 2009b; Xu et al., 2010).
Classification of follicular growth
Follicles were divided into three categories according to their growth at the fifth week
of culture (Xu et al., 2010, 2011): (1) fast-grow: those reaching 500 µm diameter or more; (2)
slow-grow: those reaching between 230 and 500 µm in diameter; (3) no-grow: those not
exceeding the diameter of 230 µm by the fifth week of culture.
Ovarian steroid and AMH measurements
One media sample collected weekly during culture weeks 1–5 was analyzed for
estradiol (E2), progesterone (P4) and pregnenolone (P5) concentrations for Experiment 1, and
E2, P4 and AMH for Experiment 2 and 3, by the Endocrine Technology Support Core at
ONPRC (Xu et al., 2010, 2011). An Immulite 2000 chemiluminescence based automatic
clinical platform (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, USA) was used for steroid
assays which was validated for macaque follicle culture media as reported previously (Xu et
Anexos | 108
al., 2009b). AMH was analyzed by ELISA using a DSL-10-14400 kit (Diagnostic Systems
Laboratories, Inc.) based on the manufacturers’ instructions and validated for macaque follicle
culture media (Xu et al., 2010).
Oocyte retrieval, maturation and fertilization
Retrieved oocytes were photographed and classified according to their meiotic
maturation stage (Xu et al., 2011). Semen were collected by the Assisted Reproductive
Technology (ART) Support Core at ONPRC (Xu et al., 2011).Conventional IVF were
performed for MII oocytes as previously described (Xu et al., 2011; 2013). The resulting
zygote was transferred to 500 µL hamster embryo culture medium-9 with 5% FBS and
cultured at 37oC in 6%CO2, 5%O2 and 89% N2 (Schramm and Paprocki, 2000). The embryo
was photographed daily to document development. Reagents and protocols for embryo culture
were provided by the ART Core (Meng and Wolf, 1997).
Statistical analysis
Statistical significance was analyzed by R 2.15.3 software using binomial logistic
regression to analyze survival and antrum formation data between groups, and marginal log-
linear regressions to analyze steroid hormone and AMH data. Differences were considered
significant at p < 0.05 and values were presented as mean ± SEM. Follicle survival and
antrum formation represent 6 (Experiment 1) or 4 (Experiment 2 and 3) individual animals in
each treatment group. Follicle growth, steroid and AMH production, and oocyte maturation
were analyzed for each individual follicle.
Results
Experiment 1: steroid ablation
The percentage of follicles surviving in culture (Fig. 1A) was less in the presence of
TRL (p < 0.05) compared to vehicle-treated controls. The percentage of follicles achieving
antrum formation (Fig. 1B) was less than controls when TRL was added at time 0 (p < 0.05)
but not after 2 weeks of culture.
Anexos | 109
Similar percentages of slow- and fast-grow follicles were noted in the control and
TRL2 (added at week 2) groups (Table I). In contrast, fast-grow follicles were absent in the
TRL group (added at time 0), with the percentage of no-grow follicles reaching 27%.
Moreover, though starting at equivalent sizes at time 0, the slow-grow follicles only reached
235 ± 17 µm diameter during TRL treatment, but were larger (p < 0.05) and comparable size
in control and TRL2 groups (330 ± 11 vs. 283 ± 17 µm).
Levels of P4 in culture media after antrum formation were appreciable in control
cultures of slow-grow follicles (Fig. 2A), and markedly reduced by TRL exposure. Similar
findings occured when comparing P4 levels from fast-grow follicles between control and
TRL2 groups (6.3 ± 1.0 vs. 0.2 ± 0.1 ng/ml, p < 0.05). Recall fast-grow follicles were absent
from the TRL group. Notably, TRL exposure also reduced E2 levels compared controls,
especially by slow-grow follicles (data not shown; see Exp. 2 and 3).
Conversely, P5 levels were low in slow-grow follicles after antrum formation (Fig.
2B), but markedly increased in the TRL and TRL2 groups. Likewise, P5 concentrations in
fast-grow follicles were 29-fold higher in the TRL2 group, compared to controls (1.17 ± 0.42
vs. 0.04 ± 0.04 ng/ml, p < 0.05).
In the control group, antral follicles typically provided healthy oocytes (12 of 13
follicles; Table II), although they rarely reinitiated meiotic maturation in response to hCG to
achieve MII stage (1 of 12). One oocyte was retrieved from the TRL group and was
degenerating. Four of 7 oocytes retrieved from the TRL2 group were healthy and none
achieved the MII stage.
Experiment 2: Testosterone replacement
Addition of high T dose with TRL, increased follicle survival compared to TRL only
group (Fig. 3A). Unlike in Exp. 1, a number of follicles achieved antrum formation with TRL
alone but the percentage of antral follicles in the high T + TRL group (83 ± 8%) was greater
than with TRL alone (65 ± 22%, p < 0.05). Moreover, the percentage of antral follicles in the
low T + TRL group (92 ± 8%) was also greater than TRL.
As in Exp. 1, the percentage of no-grow follicles was greatest in the TRL alone group
(Table III, T replacement), although some fast-grow follicles (correlating with antrum
formation) were evident. Remarkably, no-grow follicles were absent from both the low and
high dose T replacement groups, and the percentage of fast-grow follicles reached, for the
first time, more than 30% of the total population. For slow-grow follicles, their diameters in
Anexos | 110
low or high T replacement (350 ± 15 or 361 ± 14 µm) were greater than in TRL alone (260 ±
12 µm, p < 0.05), and comparable to controls (318 ± 14 µm). In contrast, high T levels
decreased (p < 0.05) the diameter of fast-grow follicles (572 ± 42 µm) compared to other
groups (e.g., controls, 773 ± 56 µm).
As expected from Exp. 1, TRL alone decreased P4 levels generated by slow-grow (not
shown) and fast-grow follicles (Fig. 4A). Unexpectedly, addition of low-dose T restored P4
levels to that of controls, especially in fast-grow follicles. In contrast, P4 levels were
diminished (p < 0.05) in high-dose T group compared to controls to concentrations
reminiscent of TRL alone.
When measuring E2 as a marker of follicular steroidogenic function, TRL alone reduced
media E2 concentration compared to controls (63 ± 13 vs. 247 ± 47 pg/ml, p < 0.05) in slow-grow
follicles. But exposure to low or high dose T markedly increased E2 levels (2734 ± 338 or 18723
± 1758 pg/ml, respectively) in the presence of TRL. Results from fast-grow follicles displayed a
similar trend (Fig. 4B) except TRL alone did not decrease the 14-fold higher E2 levels compared
to slow grow follicles. Nevertheless, there was a dose-dependent increase (p < 0.05) in E2 levels,
compared to TRL alone, following the addition of T.
When measuring AMH as a marker of follicular paracrine function, no differences
were noted in AMH levels between groups for slow-grow follicles (data not shown).
However, for fast-grow follicles (Fig. 5A), TRL alone did not alter AMH levels, but addition
of high-dose T reduced (p < 0.05) AMH levels produced by antral follicles compared to
controls at week 5 of culture.
As in Exp. 1, few antral follicles and hence oocytes were anlayzed after hCG exposure
during TRL exposure (Table IV; T replacement). However, T exposure during TRL treatment
restored antral follicles that consistently provided healthy oocytes, albeit at the GV-intact
stage. Both the low-dose T and control groups generated follicles that yielded two and one MI
oocytes respectively, and the high-dose T and control groups generated a follicle that yielded
a MII stage oocyte after hCG exposure. Notably, the diameters of these two MII oocytes were
greater than 130 µm. Following IVF, fertilization was confirmed by the presence of 2 polar
bodies and 2 pronuclei (data not shown). However, the zygotes arrested without cell division.
Experiment 3: DHT replacement
Addition of DHT with TRL returned the percent survival of follicles to control levels
(Fig. 3B); the response was similar to that by T exposure (Fig. 3A). Notably, the addition of
Anexos | 111
DHT alone increased the percent surviving follicle to over 80%, above (p < 0.05) the control
group. Moreover, the percentage of antral follicles in the DHT alone group (93 ± 3%) was
greater (p < 0.05) than in the controls (82 ± 4%).
Unlike in Exp. 1 and 2, TRL alone did not alter the no-grow, slow-grow or fast-grow
follicles, and replacing androgen with DHT had no apparent effect (Table III; DHT
replacement). However, addition of DHT alone reduced the number/percent (7%) of no-grow
follicles, compared to controls or TRL ± DHT. TRL again reduced the diameter of slow-grow
follicles compared to controls (315 ± 13 vs. 357 ± 16 µm, p < 0.05), but this difference
disappeared with combined TRL and DHT treatment (373 ± 14 µm). Notably, DHT alone had
no effect on the diameter of slow-grow follicles (data not shown), but decreased the size of
fast-grow follicles compared to controls (607 ± 29 vs. 726 ± 50 µm, p < 0.05).
As in Exp. 2, TRL alone decreased (p < 0.05) P4 levels produced by slow-grow
follicles and DHT replacement restored levels to those of controls (data not shown). Likewise
neither DHT (Fig. 4C) or T (Fig. 4A) altered P4 levels when combined with TRL. However,
the addition of DHT alone increased P4 levels produced by slow-grow (data not shown), or
fast-grow (Fig. 4C) follicles. Unlike T addition (Fig. 4B), the combination of DHT + TRL
significantly reduced E2 produced by slow-grow (data not shown) or fast-grow (Fig. 4D)
follicles compared to controls. Moreover DHT alone replicated this effect compared to
control.
Notably, DHT alone (Fig. 5B) markedly reduced AMH levels produced by fast-grow,
as well as slow-grow (data not shown), follicles compared to controls. Addition of DHT to
TRL also decreased (p < 0.05) AMH levels compared to the TRL alone group.
As noted in prior experiments, few healthy oocytes were derived from antral follicles
in the TRL group, compared to controls (Table IV; DHT replacement). In contrast, DHT
replacement yielded follicles with typically (10 of 13) healthy follicles, including one MII-
stage oocyte. Notably, the diameter of healthy GV-intact oocytes from the DHT replacement
group was greater (p < 0.05) than controls. Exposure to DHT alone yielded oocytes with
similar characteristics to those of controls or DHT replacement, except no MII oocyte was
observed. Figure 6 illustrates a secondary follicle (Fig. 6A) developing to the antral stage at
culture week 3 (Fig. 6B). Oocytes were harvested from antral follicles at week 5 (Fig. 6C).
After IVF for 3 MII oocytes (Fig. 6D; 2 from control group and 1 from TRL + DHT group),
fertilization was confirmed by the presence of 2 polar bodies and 2 pronuclei (data not
shown). One of the fertilized oocyte from the control group cleaved and the embryo
developed to the morula stage at day 5 post-IVF (Fig. 6E).
Anexos | 112
Discussion
For the longest, androgens have been considered detrimental to follicle maturation.
Due to observations in rodents (Tetsuka et al., 1995; Sen and Hammes, 2010; Xue et al.,
2012; 2013), other mammalian species (Campo et al., 1985; Hillier et al., 1997; Weil et al.,
1998; Duffy et al., 1999; Cárdenas and Pope, 2002; Hampton et al., 2004; McEwan et al.,
2010; Glister et al., 2010;) and humans (Horie et al., 1992; Suzuki et al., 1994; Kim et al.,
2011), this view has, however, in recent years undergone considerable change. It is known
that androgens participates on folliculogenesis and recent studies have shown that ARs are
expressed in developing follicles (Kimura et al., 2007; Lenie and Smitz, 2009) and has an
essential role in female reproductive physiology (Walters et al., 2008; Walters et al., 2010;
Lebbe and Woodruff, 2013). However, more detailed studies are needed to define the direct
effects of androgens in the follicles of primates (Harlow et al., 1988; Vendola et al., 1999a,
Yang and Fortune, 2006) and their oocytes (Vendola et al., 1999b) in specific stages of
folliculogenesis.
The 3D follicular culture system, follicle encapsulated using alginate biomaterials,
recently developed based in tissue bioengineering principles and previously reported by our
group in primates (Xu et al., 2009b; Xu et al., 2010), may contribute to studies related to this
issue. This 3D matrix is capable of supporting the growth of follicles, allowing in vitro follicle
development from early stages (secondary follicles) up to the small diameter antral stage, with
production of good levels of steroid hormones in humans (Xu et al., 2009a) and non-human
primates (rhesus monkeys) (Xu et al., 2009b; Xu et al., 2010; Xu et al., 2011a) and capable of
originating mature oocytes in monkeys, that when inseminated may be fertilized, giving
origin to embryos (Xu et al., 2011a) and even live born in mice (Xu et al., 2006; West et al.,
2007).
The proposal of the present study was to access for the first time, the role of the
androgens on follicular development (survival, antrum formation, hormone production and
oocyte maturity), in individual fresh non-human primate preantral follicles, using the 3D
matrix in vitro culture system, thought the steroid ablation and replacement of testosterone (T)
and dihydrotestosterone (DHT).
Steroid ablation can be reached by the administration of trilostane (TRL), which is a
drug that inhibits the enzyme 3β-hydrodydesidrogenase in the theca cells (Schane et al.,
1979). Blocking this enzyme, the formation of progesterone, 17-hydroxy-progesterone,
androstenedione and testosterone could be directly affected (Fig x). Then, the formation of the
Anexos | 113
substrates which give rise to estradiol (E2) and dihydrotestosterone (DHT) in the granulosa
cells may be compromised (Kimura et al., 2007). Based on this, we decided to use this drug
for our study with the goal of steroid ablation in the individual follicles cultured in vitro. In
this study, the steroid ablation could be observed after TRL addition, since production of E2,
P4 and P5 was dramatically affected. The survival, growth and antrum formation were also
markedly reduced, and the oocytes quality showed clearly the negative effects of the steroid
ablation.
The detected levels of P4, P5 and E2 in the first experiment clearly show that the drug
was effective on block the conversion of pregnenolone into progesterone and the other
reactions previously mentioned, directly affecting the steroidogenic cascade. After antrum
formation, slow and fast-grow follicles have produced P4 in appreciable levels in control
group while were markedly reduced by TRL exposure. At the same time, slow and fast-grow
follicles that received TRL at time 0 and after 2 weeks of culture show P5 levels markedly
increased, and notably, TRL exposure also reduced E2 levels. Our results are consistent with
findings obtained from in vivo studies with pregnant monkeys that showed that the
mechanism of the action of trilostane appears to be inhibition of progestin production since
the administration of trilostane together with hCG blocked the gonadotropic effect of the hCG
and induced menstruation. Also they have found that concurrent administration of
progesterone prevented the interceptive action of the drug (Schane et al., 1979). Also, as
showed by our results (increased levels of pregnenolone on TRL and TRL2 groups), this in
vivo study showed that trilostane caused a significant increase in circulating pregnenolone
levels. Studies in vitro also showed that the administration of TRL effectively inhibited P4
production and reduced the number of progesterone receptors (PRs) positive cells (Duffy et
al., 1996). These effects are consistent with the known activity of trilostane as an inhibitor of
the 3β-hydroxysteroid dehydrogenase system (Potts et al., 1978). Also being consistent with
the fact that steroid hormones have an essential local role on follicle development, the results
from the Exp. 1 show that the addition of trilostane to the beginning of the culture really
affects the survival, growth and antrum formation. The percentage of follicles surviving in
culture and of follicles achieving antrum formation was less in the presence of TRL when
added at beginning of culture compared to vehicle-treated controls. Also when the drug was
added fast-grow follicles were absent, slow-grow follicles didn`t grow much and the
percentage of no-grow follicles were high. The effects of the steroidogenesis blockade could
be also observed on oocytes quality and degree of maturation as mentioned previously. In the
control group, despite oocytes obtained rarely reinitiated meiotic maturation in response to
Anexos | 114
hCG, they were typically healthy, while only one degenerating oocyte was retrieved from the
TRL group and about half of the oocytes from TRL2 were unhealthy. Notably , the effects of
steroid ablation could be due to loss of local actions of progestins, androgens or estrogens,
alone or in concert, since there is evidence for the presence of PR (Peluso et al., 1998; Gava et
al., 2004; Peluso, 2006), AR (Hild-Petito et al., 1991; Horie et al., 1992; Duffy et al., 1999)
and ER (Chian et al., 1999; Bishonga et al., 2001) in follicles and possible local actions.
Testosterone addition to the follicle culture media proved in our hands to be important
to the survival and antrum formation of nonhuman primate individual preantral follicles
cultured in vitro. Moreover, addition of testosterone in presence of TRL have restored
hormonal production and gave rise to mature and healthy oocytes. The replacement of high
dose T showed us that the survival and antrum formation can be restored in the media that has
trilostane. Also, a greater number of antral follicles can be formed when a low dose of T was
added to media with TRL related to the number of antral follicles formed in the control group.
The growth was also recovered to the pattern observed in control group both for slow and
fast-grow follicles that had the diameters greater than TRL and comparable to controls, and
also evidenced by the absence from both low and high T replacement groups of no-grow
follicles and by the fact that fast-grow follicles constituted for the first time more than 30% of
the total population. Healthy oocytes were provided by T exposure during TRL treatment at
GV, MI and MII stages and an embryo, proving that androgen replacement can be related also
to oocyte maturity and viability, and that the androgen action in the follicle could be possibly
related to oocyte-secreted factors (Drummond, 2006).
In the Exp. 2 the drug was effective as for Exp. 1 in reduce E2 levels in TRL group
compared to controls, but E2 presented markedly increased on the exposure to low or high
dose T in presence of TRL both for slow and fast-grow follicles, observing a dose-dependent
increase in the levels according the addition of T, compared to TRL alone. It is well known
about the local effects of E2 on the follicles. The recovery of the survival rate, antrum
formation and growth in the groups with replacement of T, could be derived in part from the
possible conversion of testosterone in estradiol by P450 aromatase in the granulosa cells. In
animal experiments conducted in the 1980s, in which high doses of T were administered
(Hillier and Ross, 1979; Nandedkar and Munshi, 1981), it was thought that the androgenic
effects were mediated by the androgenic activity of converted estrogens through ERs and not
through ARs. However androgens can also be produced by the ovary, and the testosterone
replaced could be converted on dihydrotestosterone by the enzyme 5α-reductase in the
granulosa cells or have a direct effect on the follicles, being responsible in part for the
Anexos | 115
restoration of survival, antrum formation and growth that was found in our in vitro
experiment. E2 is proven to be important for all those events involved in folliculogenesis
(Drummond e Findlay, 1999; Bishonga et al., 2001; Bolamba et al., 2006; Xu et al., 2010), but
T and/or DHT might have an important parcel to contribute for the complete follicle
development.
In contrast and as evidenced by our results that showed decrease on the diameter of
fast-grow follicles from T high group, androgen action in the follicle may be stage- or dose-
dependent. As frequently observed in in vivo studies with PCOS woman (Dumesic et al.,
2008; Lebbe and Woodruff, 2013), androgens can have negative effects in the follicles
depending on its intrafollicular levels especially if they are high, affecting follicular
development and oocyte maturation (Hillier and Tetsuka, 1997; Vendola et al., 1998). Also
there are studies reporting that apoptosis can be inducible by androgens in granulosa cells in
rats (Billig et al., 1993), also evidencing a detrimental effect of the excessive levels of T. The
high dose T was still showing a negative effect for the follicle development when hormone
production was analysed. The levels of P4 were diminished compared to controls to
concentrations reminiscent of TRL alone in high T group, and unexpectedly, addition of low-
dose T restored P4 levels to that of controls, especially in fast-grow follicles. In this case,
testosterone is showing a dose-dependent effect, where a low dose contribute to the
maintenance of the appropriate levels of P4 and a high dose negatively affect P4 production.
However any route of conversion of testosterone into progesterone was reported yet. Then our
study is reporting for the first time a possible existence of a not known route of conversion of
androgens to progesterone, or a route of activation of ARs that can induce the production of
progesterone.
The effects of androgens on folliculogenesis in several species were inferred by
observing AR expression in the ovary. Many studies in different animal models have shown
an essential role for androgen in female reproductive physiology (Walters et al., 2008;
Walters et al., 2010; Lebbe and Woodruff, 2013), particularly in the early stages of
folliculogenesis (Vendola et al., 1998; Cardenas et al., 1997; 2002). However, to make sure
that the effects of restoration of survival, growth, antrum formation, hormone production and
oocyte recovery it was really in part from androgen (testosterone) action mediated by AR
signal and not just from testosterone as a substrate for its conversion into estradiol and
resulted in estrogen/ER signaling, DHT, which is a biologically active metabolite of the
testosterone hormone, was replaced to the culture of follicles that received TRL in Exp. 3.
Anexos | 116
As for T exposure, DHT in combination with TRL restored the ability of the follicles
in to develop and to produce mature oocytes. Addition of DHT with TRL returned the percent
survival of follicles to control levels. As expected, the diameter of slow-grow follicles were
reduced in presence of TRL alone compared to controls, but this difference disappeared when
DHT was added to the culture, as happened when T was added. For follicles that grow faster,
DHT (alone) decrease the size compared to controls, what is a similar effect of what was
observed on Exp. 2 when high dose T was added in presence of TRL. P4 levels were found
reduced in slow-grow follicles when TRL alone was added, as was also observed in Exp. 2,
and the levels were restored to those of controls when DHT was replaced, similarly of what
was observed when low dose T was added to the culture for fast-grow follicles. Again, this
result could be interpreted as a sign of possible existence of a route of ARs activation by
androgens responsible to induce P4 production.
Regarding the Anti-Mullerian hormone (AMH), a glycoprotein produced in the
granulosa cells of the ovary and having regard to the regulation of growth and development of
follicles, no differences were noted in the levels between groups for slow-grow follicles in
Exp.2.. However for fast-grow follicles, while TRL alone did not alter the levels, addition of
high-dose T reduced AMH levels produced by antral follicles compared to controls at week 5
of culture. The same was noted with the addition of DHT to TRL, that also decreased AMH
levels compared to the TRL alone group. And AMH levels were found reduced by slow and
fast-grow follicles when DHT alone was added. Those data is also consistent with the
mentioned about the dose dependent effect of androgens, showing lower levels of AMH in
presence of high T compared to controls and the same in presence of DHT. Those events
could mean that a high dose of androgens could be not good for the follicle, reinforcing the
concept that high levels of androgens at antral stage may be associated with detrimental
effects to the follicle development, and appropriate levels of AMH is a sign of follicle
development (Nardo et al., 2009). In contrast this also could mean that androgens can be
regulators of the excessive synthesis of AMH by granulose cells responsible for causing
follicular arrest, based in studies with PCOS woman and the results founded in our
experiment. We found that in the presence of TRL and addition of low and high doses of T or
DHT, follicle survival, antrum formation, growth and oocyte maturity could be resettled. And
studies examining the connection between AMH and PCOS, considered them having
significantly higher levels of AMH as compared with healthy woman (Broekmans et al.,
2008; Nardo et al., 2009; Parahuleva et al., 2012; 2013). The higher levels of AMH present in
those patients could be related to the great number of antral follicles that can not go further in
Anexos | 117
their development, and the high serum levels of T also usually founded in PCOS could be a
reflection of an attempt to reestablish the development of these follicles by granulose cells,
since an excessive granulosa cell activity may be implicated in the abnormal follicular
dynamic of the syndrome (Nardo et al., 2009).
A positive effect on oocyte quality was observed when the follicles were exposed to DHT.
Being consistent with T replacement in Exp. 2, mostly healthy oocytes were collected from antral
follicles when DHT was replaced, including one MII oocyte. It is important note that the diameter
of the healthy GV oocytes collected was greater in the DHT group than controls, and the exposure
to DHT alone yielded oocytes with similar characteristics to those of controls or DHT
replacement, except MII oocytes were not observed. A detrimental effect on oocyte quality was
still showing in Exp. 3 when TRL was added to the culture. Only few healthy oocytes were
derived from antral follicles in the TRL group, as also noted in Exp. 1 and 2.
Unlike T addition, the combination of DHT with TRL significantly reduced E2
produced by slow or fast-grow follicles compared to controls. According to those
observations, we could conclude that in Exp. 2, part of the added T was being converted in
E2, since the levels of it were founded markedly elevated compared to controls for both slow
and fast-grow follicles. Thus, the positive effects of T replacement for follicle development
was probably derived in part of estrogen action. However, those positive effects were also
present in Exp. 3, when DHT was replaced or added alone and E2 levels were lower. Then, it
was possible to infer that androgens have also an essential local role on the follicle.
DHT administrated alone replicated many of the effects observed when T or DHT was
added with TRL. AMH levels were low in slow and fast-grow follicles culture and the
exposure to DHT gave rise to GV healthy oocytes. Moreover the percent surviving follicles
was over 80%, above the control group, and the percentage of antral follicles was greater than
in the controls. Regarding effects on growth and as already mentioned, for fast-grow follicles,
DHT (alone) decrease the size of them, what was also observed on Exp. 2 when high dose T
was added in presence of TRL. Addition of DHT alone reduced the percent of no-grow
follicles, compared to controls or when DHT was present with TRL. In contrast of what
happened when DHT and T were added with TRL, the addition of DHT alone increased P4
levels produced by slow or fast-grow follicles. The androgen replacement have recovered the
P4 levels to similar levels found in controls, maybe by activation of ARs or possible not
known route of conversion of androgen in progestin as already discussed previously. It is
believed that the same could be happening when DHT alone was added. However in this case,
the levels were higher since TRL is not present, what reinforce our suggestion of the existence
Anexos | 118
of a route of conversion of androgen in progestin. Those results are also consistent with the
idea that androgens are important for early folliculogenesis, and that endogenous androgen
does not elicit a maximal effect during follicle culture, and DHT addition to the standard
culture media could be suggested as an attempt to improve the culture conditions.
Corroborating our findings in all three experiments, studies with treatment of follicles with
hydroxyflutamide or bicalutamide, two model antiandrogenic compounds, resulted in reduced
follicular growth during the preantral phase, altered steroidogenic environment, and arrest in
oocyte meiotic maturation in response to hCG (Lenie and Smitz, 2008).
Despite other androgens are present in the ovary, only T and its active metabolite DHT
have direct androgenic activity connecting to androgen receptors. Several studies document
AR expression in mammalian ovaries (Tetsuka et al., 1995; Sen and Hammes, 2010; Xue et
al., 2012; 2013; Campo et al., 1985; Hillier et al., 1997; Weil et al., 1998; Duffy et al., 1999;
Cárdenas and Pope, 2002; Hampton et al., 2004; McEwan et al., 2010; Glister et al., 2010;
Horie et al., 1992; Suzuki et al., 1994; Kim et al., 2011), and the actions of androgens during
ovarian folliculogenesis, showing that they are indispensable for a normal folliculogenesis
process (Hu et al., 2004; Shiina et al., 2006). The molecular link between the regulators of
ovarian folliculogenesis and the reactions controlled by ARs remains largely unknown. There
are many AR target genes in the ovaries, although there are not many studies that have tested
them yet. However, upregulation of the genes encoding granulosa FSH receptor (Weil et al.,
1999), insulin-like growth factor (IGF-1) and IGF-1 receptor (Vendola et al., 1999; Weil et
al., 1999) by activated AR is evident at the mRNA level in primate follicles and oocytes.
This in vitro study presents evidence of the essential local role of androgens on early
folliculogenesis in primates, strengthening the existence of molecular links that regulate ARs
activity and androgen action (Lenie and Smitz, 2008), and new possible interactions between
androgens with other steroid hormones. Our findings showed clearly that T or DHT could restore
the survival, growth, antrum formation, hormone production and oocyte viability of preantral
follicles cultured in vitro in the 3D alginate matrix that were exposed to steroid ablation.
The new knowledge that can be obtained from this kind of study could help the
understanding of the dynamic process of follicle development, what is still little
comprehended (Chand et al., 2010). This would be crucial for the studies about PCOS and to
identify the optimal conditions for in vitro growth of follicles of primates, prior to application
in humans with the goal on assist cancer patients as an excellent alternative to be offered to
them after the thawing of the tissue (Woodruff, 2007; Shea et al., 2008; West et al., 2009;
Telfer and Zelinski, 2013).
Anexos | 119
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Anexos | 124
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Anexos | 125
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Anexos | 126
Anexos | 127
Anexos | 128
Anexos | 129
Table I. Growth characteristics of follicles at week 4.
Follicle culture Total No-grow Slow-grow Fast-grow
Control
TRL
TRL2
98
26
49
11 (11%)a
7 (27%)b
7 (14%)a
60 (61%)a
19 (73%)b
33 (67%)a,b
27 (28%)a
0 (0%)b
9 (19%)c
Note: a, b Different letters indicate significant differences within the column (P < 0.05).
Table II. Characteristics of oocytes retrieved from antral follicles at week 5 (34 hrs after addition of hCG).
Follicle culture Number (n) of Diameter (µm)*
Follicles harvested
Oocytes retrieved
Degenerate oocytes
Healthy oocytes GV oocytes
MII oocytesGV MII
Control 13 13 1 11 1 111 ± 2a 117
TRL 2 1 1 0 0 - -
TRL2 10 7 3 4 0 92 ± 18a -
* Values are the mean ± SEM with each oocyte diameter as an individual data point.
Table III. Follicle characteristics at week 5. Follicle culture Total No-grow Slow-grow Fast-grow
T replacement Control 47 3 (6%)a,b 31 (66%)a,b 13 (28%)a,b
TRL 23 5 (22%)b 13 (57%)b 5 (21%)a TRL + T Low 47 0 (0%)a 29 (62%)a,b 18 (38%)a,b TRL + T High 53 0 (0%)a 37 (70%)a 16 (30%)a,b
DHT replacement Control 51 9 (18%)a 22 (43%)a 20 (39%)a
TRL 30 5 (17%)a,b 16 (53%)b 9 (30%)b,c DHT 58 4 (7%)c 35 (60%)c 19 (33%)b
TRL + DHT 51 11 (22%)d 26 (51%)b,d 14 (27%)c Note: a, b Different letters indicate significant differences within the column (P < 0.05).
Anexos | 130
Table IV. Characteristics of oocytes retrieved from antral follicles at week 5 (34 hrs after addition of hCG).
Follicle culture Number (n) of Diameter (µm)*
Follicles harvested
Oocytes retrieved
Degenerate oocytes
Healthy oocytes GV oocytes
MI oocytes
MII oocytesGV MI MII
T replacement Control 15 15 2 12 1 1 119 ± 5a 143 131
TRL 4 4 2 2 0 0 117 ± 2a - -
TRL + T Low 16 16 1 13 1 0 119 ± 14a 131 -
TRL + T High 13 13 0 12 0 1 102 ± 14a - 147
DHT replacement Control 21 21 6 13 0 2 110 ± 2a - 123 ± 3
TRL 8 8 6 2 0 0 112 ± 2a,b - -
DHT 10 10 4 6 0 0 116 ± 4a,b - -
TRL + DHT 13 13 3 9 0 1 118 ± 2b - 117
* Values are the mean ± SEM with each oocyte diameter as an individual data point. a, b Different letters indicate significant differences within the column (P < 0.05).
Anexos | 131
ANEXO B
IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY
PRESERVATION IN PATIENTS WITH CANCER
Jhenifer Kliemchen Rodrigues (BSc, MSc)1,2,3, Jing Xu (PhD)2, Ricardo Mello Marinho (MD,
MSc, PhD)3,4, João Pedro Junqueira Caetano (MD, MSc, PhD)3,4, Mary B Zelinski (PhD)2,
Richard L Stouffer (PhD)2, Paula Andrea Navarro (MD, MSc, PhD)1
1 Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto/SP, Brazil 2 Oregon National Primate Research Center/ Oregon Health & Science University,
Beaverton/OR, United States of America 3 Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento, Pró-Criar Medicina Reprodutiva, Belo
Horizonte/MG, Brazil 4 Instituto de Pós-graduação – Faculdade de Ciências Médicas de Minas Gerais, Belo
Horizonte/MG, Brazil
Address for correspondence:
Pró-Criar Medicina Reprodutiva
Rua Bernardo Guimarães, 2063, Lourdes.
Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil, Zip code: 30140-082
Phone number: (55 – 31) 8325 – 7959/ (55 – 31) 2533 – 3815 / (55 – 31) 3292 – 5299
Fax number: (55 – 31) 3292 – 5299
[email protected] or [email protected]
There is no conflict of interest for any of the submitting authors to the submitted material.
Submission to: Journal of Assisted Reproduction and Genetics
Anexos | 132
IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY
PRESERVATION IN PATIENTS WITH CANCER
Abstract
The cryostorage of ovarian cortical biopsies may be offered as a fertility preservation option
for young women who will receive potentially sterilizing treatments, such as anti-cancer
therapy. Currently, the only available option to restore fertility using this cryostored/thawed
tissue is by transplantation, which involves the theoretical risk of cancer recurrence since
tumor cells may be reintroduced into the patient’s body. In contrast, in vitro maturation of
cryopreserved follicles, followed by in vitro fertilization of their oocytes and embryo transfer,
excludes this risk, and may provide a larger number of mature oocytes. However, meiotically
competent human oocytes with the ability to fully develop have yet to be obtained following
the culture of preantral follicles. Thus, many challenges remain to develop a complete culture
system that supports human oocyte development. This review outlines the major advances in
cryopreservation of ovarian tissue and the recent research on in vitro follicle maturation (IFM)
in nonhuman primates and women, with emphasis on the remaining challenges before IFM
can be applied to fertility preservation in patients with cancer.
Keywords: Follicle culture; fertility preservation; human oocyte; IFM; ovarian
cryopreservation; primordial follicle
Anexos | 133
Introduction
An earlier diagnosis, plus advances in cancer treatment, has increased the likelihood for
restoration of patient health and a consequent increased chance for long survival. However,
the cytotoxicity and cell damage caused by chemotherapeutic drugs and radiotherapy can
impair the ovarian reserve and normal function of the ovary, possibly leading to premature
ovarian failure and infertility [75, 90, 105]. After cancer treatment, many women express the
wish to become mothers [128], but may not fulfill this dream because of impairment of their
ovaries caused by cancer therapy. Consequently, investigators are pursuing methods to either
protect the ovaries from the cytotoxic effects of cancer therapies [76, 140] or to restore
ovarian function by promoting the development and function of follicles, and thus maintain or
restore fertility [45, 107, 123].
The current accepted approaches for the preservation of female fertility in clinical practice are
limited to protection of the ovaries against radiation (oophoropexy) [31, 74] or ovarian
stimulation for oocyte collection followed by oocyte and/or embryo cryopreservation [13, 20,
26, 27, 41, 95, 110]. Other approaches for fertility preservation in cancer patients are being
extensively discussed and investigated in animal models and to a lesser extent in primates [12,
20, 63]. No “gold standard” technique is currently available to be applied to all types of
patients desiring this care. Some women are candidates for ovarian stimulation and
oocyte/embryo freezing before cancer treatment [26]. For this procedure, however, a patient
must have no urgent need to begin cancer treatment which allows enough time for the ovarian
stimulation protocol. A patient with a hormone (steroid)-dependent cancer may face a higher
theoretical risk of tumor growth during ovarian stimulation [14, 17, 89]. Moreover, a patient
must have a partner as a sperm donor in order to produce embryos [40]. There is an ongoing
debate on whether to cryopreserve mature oocytes and/or embryos following “emergency”
ovarian stimulation or alternatively cryopreserve ovarian tissue [24]/immature oocytes [23,
28, 60, 139] for future ART procedures to restore fertility.
For prepubertal girls and women who require immediate treatment or have a hormone-
dependent cancer, the ideal approach may be to freeze immature oocytes, isolated follicles or
ovarian tissue [9, 12, 62, 75, 79]. Cryopreserved ovarian tissue could be transplanted back to
the patient after cancer treatment to promote timely puberty and fertility. Although this
procedure is considered experimental, the results are promising with 24 reported cases of live
Anexos | 134
births obtained following transplantation of cryopreserved/thawed ovarian tissue [18, 35, 38,
41, 43, 61, 64, 83, 96]. However, tissue transplantation raises the theoretical risk of cancer
recurrence since untreated cells are reintroduced into the patient [34], though thus far disease
recurrence after transplantation has not been reported [33]. Alternatively, in vitro follicle
maturation (IFM), followed by in vitro fertilization and embryo transfer, would eliminate this
risk. In addition, this approach could be advantageous by being associated with a greater
possibility of achieving successful pregnancy, since a large number of oocytes could be
obtained from a small ovarian sample [117, 127, 130]. As such, cryopreservation of ovarian
tissue samples followed by IFM is an emerging option for the reestablishment of fertility,
especially for patients undergoing cancer treatment who are not suitable for ovarian
stimulation (or it is contraindicated) or cryopreservation of oocytes and/or embryos [63, 109].
IFM could be an excellent alternative to transplantation for patients after ovarian tissue
thawing. However, it is still considered to be an experimental technique. There are studies
showing excellent results from nonprimate species such as mice [46, 87], with reports of live
births generated from oocytes originated from in vitro matured follicles of mice [77, 137],
cows [51, 111], sheep [114], pigs [115, 118] and goats [22, 45, 101] (Table 1). However,
there is a still limited success in producing early-stage embryos in the studies on nonhuman
primates, such as rhesus monkeys [119, 120, 121, 131, 132, 133, 138] and baboons [136].
Also, there are few reports to date describing human preantral follicle growth in vitro [9, 16,
135], with no studies (y) yielding meiotically competent human oocytes (Table 1). Reasons
for limited success include: (1) the difficulty in obtaining nonhuman primate and human
tissue for experiments, (2) apparent species differences in the regulation of early
folliculogenesis, and (3) the larger size of antral follicle needed to generate a competent
oocyte. Moreover, most studies to date have used follicles from fresh, as opposed to
cryopreserved/thawed, ovarian tissue.
The present paper reports the recent advances in the cryopreservation of ovarian tissue and the
first extensive efforts to perform research on IFM in nonhuman primates and humans, with
emphasis on the challenges on applying this emerging technique to fertility preservation in
cancer patients.
Anexos | 135
Cryopreservation of ovarian tissue
The cryopreservation of ovarian tissue and the subsequent thawing following cancer treatment
for fertility preservation is an evolving technique which requires additional evaluation,
including characterization of the structure-function of cryo-thawed ovarian cortex. Based on
extensive animal studies, the technique was first applied to humans in 1996, with cryo-thawed
ovarian tissue transplanted into a patient who had received chemotherapy [41, 68]. Since then,
clinical researchers have published case reports and small experimental trials, including
reimplantation of cryopreserved/thawed ovarian tissue to the original site (orthotopic) and
ectopic (heterotopic) sites such as the abdominal wall or the forearm [10, 36, 37, 44, 67, 88].
Successful return of ovarian function after reimplantation, albeit for a finite interval of time,
was reported. In some cases, oocyte aspiration was possible following stimulation of
heterotopic ovary implants [10, 36, 37, 44]. In 2004, the first spontaneous pregnancy resulting
from orthotopic transplantation was reported in Belgium [106]. To date, 24 live births have
been reported using the technique of ovarian tissue cryopreservation and subsequent thawing
for transplantation [18, 38, 42,43, 61, 64, 96, 99]. As a result, various medical centers
routinely perform ovarian tissue cryopreservation for cancer patients around the world, with
the subsequent plan to offer transplantation or other ARTs for fertility improvement after
treatment [50]. Currently, many patients are awaiting results from their oncologists that
validate reimplantation of ovarian tissue for improvement of endocrine and reproductive
function.
To date, the majority of livebirths in women originated from ovarian tissue cryopreserved by
the slow freezing technique [38]. The main characteristic of slow freezing is that the
temperature is reduced gradually. A freezing curve of 0.3°C per minute is usually applied to
tissue samples such as ovarian cortex [65, 100]. In order to obtain equilibrium among various
cell types, low concentrations of cryoprotectants are used in the attempt to prevent the
formation of intracellular ice crystals [80]. However, the protocol may not completely
eliminate water inside the ovarian sample, with the consequent formation of ice crystals that
generate cell damage.
Although slow freezing for ovarian tissue cryopreservation was initially used, the vitrification
technique recently gained attention because of encouraging results in oocyte and embryo
Anexos | 136
cryopreservation [1, 25, 26, 27, 70]. However, vitrification requires high concentrations of
cryoprotectant agents that may induce cytotoxicity and osmotic trauma [47]. High freezing
velocity, necessary for oocyte and embryo vitrification, is not required for ovarian tissue
vitrification, in which slower cooling rates are needed to prevent fracturing [48, 84, 119].
Successful ovarian tissue vitrification was reported using nonhuman primates. Heterotopic
transplants of vitrified ovarian tissue resulted in ovarian development in baboons [8], as well
as recovery of MII oocytes, and formation of early cleavage embryos in cynomolgus [112]
and rhesus [71, 119, 120, 121] monkeys. Ongoing studies with human ovarian tissue are
showing promising results with the use of vitrification technique [55]. Notably, the first
human live birth derived from ovarian tissue vitrification and ART was recently reported [64].
Cryopreservation issues. Nevertheless, many parameters regarding cryoprocedures remain
poorly understood such as the ideal quantity of tissue sample to be cryopreserved, the choice
of cryoprotectants for executing the procedure and the time of tissue exposure, the choice of
cryopreservation protocol, and the use of open or closed system. Thus, studies, combined with
rigorous analyses comparing ovarian tissue structure-function before and after thawing, are
needed to establish the ideal technique and protocol of ovarian tissue cryopreservation.
There are ongoing studies defining the optimal conditions to vitrify macaque ovarian cortex
by testing different kind of cryoprotectants, cryoprotectant exposure times and systems (open
or closed) [119, 121]. Recently, a study reported that dense stroma and preantral follicles were
preserved using a vitrification solution containing 27% glycerol, 27% ethyleneglycol and
0.8% polymers with cooling in liquid nitrogen vapor and a two-step warming. BrdU uptake
was evident in granulosa cells of growing follicles in fresh and vitrified tissues, showing
viability in both tissue types [119]. Higher cooling and warming rates led to fracturing, i.e.,
evidence that the temperature curve is a critical part of the whole process. The use of
polymers in the vitrification solution [53, 119], combined with advances on the concentration
of cryoprotectants and the use of a closed system to avoid contamination, has improved the
ovarian tissue vitrification technique, as demonstrated for the first time by the development of
antral follicles during three-dimensional (3D) culture using primate vitrified-thawed ovarian
cortex [119].
Transplant issues. Transplant of ovarian tissue is also a technique that still needs detailed
investigation. There are few studies evaluating the consequences of tissue transplantation on
ovarian structure-function in humans or even following xenografting [7, 55]. The possible
Anexos | 137
presence of malignant cells in the grafted tissue, the use of specific components (e.g., matrix
or growth factors) or procedures that might reduce tissue ischemia and improve ovarian
function, the definition and standardization of the best transplant site, and the duration of
resumed ovarian endocrine and gametogenic function are some of the important points which
require further studies.
Although transplantion of ovarian cortex using fresh monkey tissue [72], as well as fresh and
cryopreserved human tissue [32, 35, 64, 104], culminated in the birth of healthy offspring,
only IFM has the advantage of eliminating the reintroduction of cancer cells into the patients.
Although studies have not reported disease recurrence in transplant cases [33, 34, 38, 79], a
theoretical risk could not be ruled out or minimized without further long term investigations
[107].
IFM
Investigators have tried for several years [2, 3, 4, 30, 69, 102, 108, 117] to grow follicles in
vitro to examine follicular/oocyte development and function with some success. Two-
dimensional (2D) culture supports the complete growth of murine preantral follicles to the
preovulatory stage which provide meiotically competent oocytes [30, 46]. However,
comparable results have not been achieved in other mammals such as cattle [51], sheep [114],
and humans [3]. Only in experiments with goats early embryos were produced [102] (Table
1). One of the main reasons is that 2D culture does not maintain the natural architecture of the
antral follicle of large mammals [78]. During culture, granulosa cells become disconnected
from each other and from the oocyte because they spread on the bottom of the culture dish
[78].
Based on principles of tissue bioengineering, a 3D matrix capable of supporting follicle
growth was developed and demonstrated success in mice [54, 126, 137]. In mice, the 3D
culture system permitted the in vitro development of preantral follicles up to the preovulatory
stage with the ability of producing mature oocytes which, once inseminated, progressed to
embryos and live births [137] (Table 1). Follicle encapsulation in alginate gel is able to mimic
the characteristics of the extracellular matrix in vivo, that facilitates the exchange of
molecules between the follicle and culture medium. In addition, the flexibility of gel favors
Anexos | 138
cell proliferation, which is essential for follicle survival and development [126, 134].
However, the stiffness of the gel may inhibit follicular growth and reduce steroidogenesis, as
reported for murine follicles embedded in 1 and 1.5% alginate gel. When 0.5% gel was used,
oocytes showing full growth were obtained [138].
In addition, this 3D matrix permits culture, and hence study, of individual follicles. Research
indicates that larger (secondary) preantral follicles do not survive when they are cultured in
ovarian cortical slices, despite their 3D architecture; as such, neighboring stroma or follicles
may have an inhibitory effect on follicular development. Added to this is the fact that oxygen
diffusion becomes limiting in isolated tissue slices that are placed in the incubator, so that
only follicles on the edges of the thinner slices can survive, resulting in loss of integrity and a
negative impact on oocyte survival [59, 116]. Thus, culturing individual follicles without
large portions of surrounding stroma may be a better baseline of study [82, 116, 132]. This
IFM approach allows studies to directly determine the effects of co-culture using multiple
follicles at known developmental stages or stromal cells.
Investigators are also testing the value of various matrix components in 3D follicle culture.
For example, collagen gel was used during cattle IFM and follicular differentiation was
demonstrated. When this method was applied with a combination of defined supplemented
culture medium and micropore membranes, a calf was obtained from immature follicles
cultured for 14 days [56]. When a 3D alginate-based matrix was applied to nonhuman primate
(rhesus monkey) IFM, it was possible to grow individual preantral (secondary) follicles
collected from both the fresh and cryopreserved tissue, to the small (~1 mm diameter) antral
stage, with the production of appreciable levels of steroid hormones [119, 120, 121, 131, 133,
138]. Typically, the small antral follicles did not respond to a gonadotropin bolus by
reinitiating oocyte meiosis, but in rare (10%) instances a large, fast-grow follicle could
provide a metaphase II (MII)-stage oocyte that was fertilized in vitro [132, 133] (Table 1).
The dynamics and regulation of folliculogenesis in primates is still poorly understood [21],
which challenges the rapid refinement and translation of the IFM technique for human
follicles and their oocytes. This technique of 3D follicle encapsulation is currently being used
to test potential endocrine and paracrine factors that may promote follicle development and
oocyte maturation in primates. For example, recent evidence supports the concept that
appropriate levels of certain hormones are essential for the growth and health of preantral
follicles during culture [92, 97, 131, 133, 136].
Anexos | 139
Gonadotropic Hormones. The presence of exogenous follicle-stimulating hormone (FSH)
promotes preantral follicular growth in vitro, in addition to maintaining the morphological
integrity of preantral follicles in goats [80], and stimulating the activation of primordial
follicles in monkeys [4, 5]. Studies demonstrated that FSH exposure increases the diameter of
follicles in mice [137], monkeys [131, 138] and humans [135] during 3D culture. In rhesus
monkey, FSH was essential for the survival of secondary follicles (125–225 µm in diameter)
during 3D culture with alginate gel [131]. In contrast, FSH did not show beneficial effects on
baboon follicle growth in 3D culture [136]. This may be due to the inclusion of matrigel in the
matrix that contains unknown growth factors which could contribute to follicle growth. These
data indicate that 3D encapsulated follicles offer a valuable model for examining FSH actions,
including the expression and signaling of FSH receptors, during early follicle development.
Luteinizing hormone (LH) may play a role during follicle development in vitro particularly
for steroidogenesis in mammalian species such as mouse [15, 29], cattle [111], goats [10] and
primates, but the effects differed between slow- and fast-grow antral follicles from monkeys
[131, 133]. The addition of LH at day 30 of culture increased progesterone (P4),
androstenedione (A4) and estradiol (E2) production by slow-grow follicles between pre-LH
(week 4) and post-LH (week 5) exposure in the presence of high-dose FSH. In contrast, with
low-dose FSH exposure, LH treatment increases P4 and A4, but not E2, at week 5 compared
to FSH alone. LH supplementation at day 30 has no effect on the patterns or levels of steroids
produced by fast-grow follicles during week 5 regardless of culture conditions [131, 133].
This may be due to their high steroid production prior to the LH addition which prevents
further stimulation. Also, continuous LH exposure during monkey follicle culture decreased
P4, without having effect on A4 and E2 production [138]. This may result from the
desensitizing of LH receptors by continuous LH exposure or not distinguishing slow- from
fast-grow follicles. The LH responsiveness suggests the presence of theca cells in in vitro-
developed primate antral follicles, which was recently demonstrated using
immunocytochemical detection of steroidogenic enzymes in theca versus granulosa cells
[132]. Further studies of the stage-specific actions of LH on primate follicles in vitro during
growth and maturation are warranted.
Steroid Hormones. It is also apparent that encapsulated follicles produce a number of
endocrine and local factors during culture, that may be vital to follicular growth and
maturation. For example, individually cultured macaque follicles differed in the ability to
produce ovarian steroids, such as P4, A4, and E2, which are detectable in the culture media.
Anexos | 140
Steroid production correlated positively with follicle growth rate and was promoted by
exogenous gonadotropins [131, 133, 138]. Therefore, studies were initiated to test whether
these steroid hormones have local actions to mediate or modulate gonadotropin actions in
primate follicles.
Notably, addition of a 3β-hydroxysteroid dehydrogenase inhibitor (Trilostane, TRL) to
prevent the conversion of pregnenolone to P4, as well as downstream production of androgens
and estrogens, reduced survival and growth of macaque secondary follicles during 3D culture.
Co-administration of low (10 ng/mL) or high (50 ng/mL) doses of testosterone increased
follicle survival to control level. Follicles that received testosterone reached similar sizes and
percentage of antrum formation, as well as oocyte meiotic maturation (MII stage), as control
follicles [97]. Studies with rodents also showed that androgens have distinct physiological
functions within the growing follicle [73, 85, 98]. Immunohistochemical analysis revealed
that cytoplasmic androgen receptor (AR) protein translocated to the nucleus of granulosa and
theca cells in mouse follicles in response to endogenous androgen production by theca cells
during preantral follicular development and during the antral stage in vitro [73]. AR was also
differentially expressed in mural versus cumulus cells, implying an oocyte-mediated
regulation [73].
Studies are ongoing to determine if P4 and/or estrogen have critical roles during
folliculogenesis in primates [86, 94] and other mammalian species, e.g., cow [11, 103, 124].
Dynamic changes were observed in the protein expression of P4 receptors following in vitro
maturation or in response to supplementation with LH, FSH, or P4 suggesting an important
role during bovine oocyte maturation [11]. Detailed experiments using encapsulated macaque
follicles should better define the role(s) of each steroid hormone at various stages of follicle
development and maturation in primates.
Recent studies also observed the stage-specific production of other local factors, e.g., the
angiogenic factors VEGF-A and ANGPTs [49, 131, 132] and AMH [131, 132, 133] by
encapsulated monkey follicles, plus the correlation of their production with follicle growth
and oocyte maturation. Further studies on these and other local factors will increase our
understanding of the regulation and function of folliculogenesis in primates and optimize
conditions for IFM for clinical application.
IFM in humans. Efforts are addressing the promotion of IFM after obtaining human follicles
from both fresh [16, 107, 116] and cryopreserved [58, 91, 116] ovarian cortex or
Anexos | 141
cryopreserved follicles [16]. To date, only four studies have evaluated the applicability of the
alginate matrix and 3D system to human preantral follicle culture [9, 16, 122, 135]. Three
experiments cultured primordial-stage follicles for seven days, and the follicles [9, 122] and
their oocytes [16] doubled in size. Follicle culture from secondary stage permitted
development up to the small antral stage and production of steroid hormones [135]. These
results are promising, but culture systems that support development of individual human
preantral follicles still need refinement in many aspects, such as definition of the
developmental stage of harvested follicles, the culture media and hormones/local factors
necessary for the maintenance and growth of the follicle in vitro, and the interval of culture
needed to produce antral follicles with meiotically competent oocytes. Due to the large (>10
mm diameter) size of the dominant, preovulatory follicle in women, it remains unclear if IFM
can generate an antral follicle of sufficient maturation to yield a fertilizable oocyte or
subsequent developing embryo. However, live infants have been derived from oocytes
contained within follicles < 6 mm following IVM and ICSI [52], demonstrating that the
diameter of the human follicle capable of producing a competent oocyte is considerably
smaller than the preovulatory follicle.
Tests growing primate primordial and primary follicles are valuable since they are the most
abundant cohorts in the ovary, and are very resistant to damage by cryopreservation and
chemotherapeutics [57]. It was found that primate ovarian tissue can be maintained for up to
24 h at 4°C without compromising tissue or follicle health. Also, follicle survival and
morphology were more optimal when isolated primordial follicles were cultured in 2%
alginate compared with 0.5% alginate; apparently primordial follicles require a rigid physical
environment to survive and grow in vitro [57, 129]. Moreover, primary follicle culture yielded
MII oocyte in rhesus monkeys [132]. Primordial and primary human follicles, either fresh or
after being cryopreserved, which were isolated and embedded in alginate can survive and
grow for seven days in culture [19, 122], indicating that human preantral follicles can be
successfully cryopreserved without impairing their ability to survive and grow in vitro.
Other groups are focusing on developing primordial follicles to preantral stage from vitrified
tissue using cortical strips. A high proportion of viable follicles in vitrified ovarian strips were
obtained after culture for seven days, showing an increase on (in?Jing) the percentage of
secondary and primary follicles, and a decrease on (in) the number of primordial and
transitory follicles [66], however the proportions of the different classes of follicles prior to in
vitro culture is unknown. This could be an alternative, valuable three-step approach which
Anexos | 142
first uses culture of ovarian strips to obtain primary from primordial follicles, followed by
culture of isolated primary and secondary follicles, and then aspiration of the cumulus-oocyte
complex for final in vitro oocyte maturation. A culture system based on multiple steps (e.g.,
further in vitro maturation of oocytes obtained from follicle culture [82, 116, 117]) may be
necessary for full development of human oocytes capable of normal fertilization and
embryogenesis. The culture system is expected to preserve the endocrine and paracrine
functions of the follicles (which may be critical for oocyte development), as well as their
ability to support the growth and both the nuclear and cytoplasmic maturation of an oocyte.
For the optimization of culture systems, further focus on cumulus-oocyte development, which
may not necessarily require a large follicular structure, is warranted rather than simply
appropriate maintenance of differentiated somatic cells in the follicle wall.
The IFM of cryopreserved human follicle, followed by ARTs, would be an alternative for the
restoration of fertility in cancer patients when tissue transplantation or other techniques
cannot be applied, i.e., young girls for which ovarian tissue cryopreservation is their only
option. In addition, IFM provides a valuable in vitro model to study the processes and
regulation of primate folliculogenesis and permits the mimicking of pathological conditions in
vitro for the study of various types of ovarian diseases.
Conclusion
The current data support the applicability of ovarian tissue cryopreservation and possible
future use of the IFM technique for fertility preservation in cancer patients.
Ovarian tissue cryopreservation is a particularly important technique for children and
prepubertal adolescents who are not candidates for oocyte and/or embryo cryopreservation,
which are well established techniques [26, 39, 79, 93, 113, 125]. An additional advantage of
ovarian tissue cryopreservation is that it avoids certain religious, ethical or legal issues, such
as the fate of cryopreserved embryos in case of divorce, serious diseases or death of one of the
spouses [6].
In view of the growing number of studies on possible alternatives for fertility preservation in
cancer patients, ovarian tissue cryopreservation could be considered by oncologists, for later
Anexos | 143
transplantation or possible IFM. Thus, the real concern provoked by the possibility that
patients may not be able to have children would be considerably minimized, and the patients
would have better opportunities to be mothers in the future after the cancer treatment. Before
cancer treatment (gonadotoxic or radiation therapy, gonadectomy), patients could be provided
with counseling regarding available and future options for fertility preservation. Fertility
preservation may be offered by programs in reproductive medicine clinics in partnership with
oncological care centers designed to support cancer patients [6, 90].
Although IFM offers promise, further advances are needed to understand and develop an in
vitro environment that promotes appropriate follicular growth and differentiation, plus the
oocyte competence necessary for fertilization and subsequent embryonic development. Thus,
continued investigations on nonprimate, primate and human folliculogenesis are critical for
translation to improvement in fertility treatment for women, including female cancer patients.
Acknowledgments
Acknowledgments to the support received from National Institute of Health (NIH) U54
RR024347, RL1HD058294, PL1EB008542 (The Oncofertility Consortium), NIH-NICHD
through cooperative agreement as part of the Specialized Cooperative Center Program in
Reproduction and Infertility Research U54HD018185, NIH ORWH/NICHD 2K12HD043488
(Building Interdisciplinary Research Careers in Women's Health), NIH Fogarty International
Center TW/HD-00668 (to P. Michael Conn) and Oregon National Primate Research Center
8P51OD011092.
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Anexos | 152
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Anexos | 153
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82. McLaughlin M, Patrizio P, Kayisli U, Luk J, Thomson TC, Anderson RA, Telfer EE,
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Collins J, Cedars M, Vernon M, Davis O, Dumesic D, Gracia C, Catherino W, Odem R,
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Anexos | 154
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aromatase inhibitors in womenwith breast cancer. Fertil Steril. 2012;98(6):1363–9. doi:
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Anexos | 155
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10.1007/s10815-012-9917-5.
101. Saraiva MV, Celestino JJ, Araújo VR, Chaves RN, Almeida AP, Lima-Verde IB,
Duarte AB, Silva GM, Martins FS, Bruno JB, Matos MH, Campello CC, Silva JR, Figueiredo
JR. Expression of follicle-stimulating hormone receptor (FSHR) in goat ovarian follicles and
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Journal of Assisted Reproduction and Genetics
IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATIONIN PATIENTS WITH CANCER
--Manuscript Draft--
Manuscript Number:
Full Title: IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATIONIN PATIENTS WITH CANCER
Article Type: Review Article
Keywords: follicle culture; fertility preservation; human oocyte; in vitro follicle maturation;ovarian cryopreservation; primordial follicle
Corresponding Author: Jhenifer Kliemchen Rodrigues, B.Sc., M.Sc.Pró-Criar Medicina Reprodutiva and FMRP/Universidade de São PauloBRAZIL
Corresponding Author SecondaryInformation:
Corresponding Author's Institution: Pró-Criar Medicina Reprodutiva and FMRP/Universidade de São Paulo
Corresponding Author's SecondaryInstitution:
First Author: Jhenifer Kliemchen Rodrigues, B.Sc., M.Sc.
First Author Secondary Information:
Order of Authors: Jhenifer Kliemchen Rodrigues, B.Sc., M.Sc.
Jing Xu, Ph.D.
Ricardo Mello Marinho, M.D., M.Sc., Ph.D.
João Pedro Junqueira Caetano, M.D., M.Sc., Ph.D.
Mary Beth Zelinski, Ph.D.
Richard Lee Stouffer, Ph.D.
Paula Andrea Navarro, M.D., M.Sc, Ph.D.
Order of Authors Secondary Information:
Abstract: The cryostorage of ovarian cortical biopsies may be offered as a fertility preservationoption for young women who will receive potentially sterilizing treatments, such as anti-cancer therapy. Currently, the only available option to restore fertility using thiscryostored/thawed tissue is transplantation, which involves the theoretical risk ofcancer recurrence since tumor cells may be reintroduced into the patient's body. Incontrast, in vitro maturation of cryopreserved follicles, followed by in vitro fertilization oftheir oocytes and embryo transfer, excludes this risk, and may provide a larger numberof mature oocytes. However, meiotically competent human oocytes with the ability tofully develop have yet to be obtained following the culture of preantral follicles. Thus,many challenges remain to develop a complete culture system that supports humanoocyte development. This review outlines the major advances in cryopreservation ofovarian tissue and the recent research on in vitro follicle maturation (IFM) in nonhumanprimates and women, with emphasis on the remaining challenges before IFM can beapplied to fertility preservation in patients with cancer.
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1
IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATION IN
PATIENTS WITH CANCER
Abstract
The cryostorage of ovarian cortical biopsies may be offered as a fertility preservation option for young
women who will receive potentially sterilizing treatments, such as anti-cancer therapy. Currently, the only
available option to restore fertility using this cryostored/thawed tissue is transplantation, which involves
the theoretical risk of cancer recurrence since tumor cells may be reintroduced into the patient’s body. In
contrast, in vitro maturation of cryopreserved follicles, followed by in vitro fertilization of their oocytes
and embryo transfer, excludes this risk, and may provide a larger number of mature oocytes. However,
meiotically competent human oocytes with the ability to fully develop have yet to be obtained following
the culture of preantral follicles. Thus, many challenges remain to develop a complete culture system that
supports human oocyte development. This review outlines the major advances in cryopreservation of
ovarian tissue and the recent research on in vitro follicle maturation (IFM) in nonhuman primates and
women, with emphasis on the remaining challenges before IFM can be applied to fertility preservation in
patients with cancer.
Keywords: follicle culture; fertility preservation; human oocyte; in vitro follicle maturation; ovarian
cryopreservation; primordial follicle
Abstract
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
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IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATION IN
PATIENTS WITH CANCER
Abstract
The cryostorage of ovarian cortical biopsies may be offered as a fertility preservation option for young
women who will receive potentially sterilizing treatments, such as anti-cancer therapy. Currently, the only
available option to restore fertility using this cryostored/thawed tissue is transplantation, which involves
the theoretical risk of cancer recurrence since tumor cells may be reintroduced into the patient’s body. In
contrast, in vitro maturation of cryopreserved follicles, followed by in vitro fertilization of their oocytes
and embryo transfer, excludes this risk, and may provide a larger number of mature oocytes. However,
meiotically competent human oocytes with the ability to fully develop have yet to be obtained following
the culture of preantral follicles. Thus, many challenges remain to develop a complete culture system that
supports human oocyte development. This review outlines the major advances in cryopreservation of
ovarian tissue and the recent research on in vitro follicle maturation (IFM) in nonhuman primates and
women, with emphasis on the remaining challenges before IFM can be applied to fertility preservation in
patients with cancer.
Keywords: follicle culture; fertility preservation; human oocyte; in vitro follicle maturation; ovarian
cryopreservation; primordial follicle
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Introduction
An early diagnosis, plus advances in cancer treatment, has increased the likelihood for
restoration of patient health and a consequent increased chance for long survival. However, the
cytotoxicity and cell damage caused by chemotherapeutic drugs and radiotherapy can impair the ovarian
reserve and normal function of the ovary, possibly leading to premature ovarian failure and infertility [75,
90, 105]. After cancer treatment, many women express the wish to become mothers [128], but may not
fulfill this dream because of impairment of their ovaries caused by cancer therapy. Consequently,
investigators are pursuing methods to either protect the ovaries from the cytotoxic effects of cancer
therapies [76, 140] or to restore ovarian function by promoting the development and function of follicles,
and thus maintain or restore fertility [45, 107, 123].
The current accepted approaches for the preservation of female fertility in clinical practice are
limited to protection of the ovaries against radiation (oophoropexy) [31, 74] or ovarian stimulation for
oocyte collection followed by oocyte and/or embryo cryopreservation [13, 20, 26, 27, 41, 95, 110]. Other
approaches for fertility preservation in cancer patients are being extensively discussed and investigated in
animal models and to a lesser extent in primates [12, 20, 63]. No “gold standard” technique is currently
available to be applied to all types of patients desiring this care. Some women are candidates for ovarian
stimulation and oocyte/embryo freezing before cancer treatment [26]. For this procedure, however, a
patient must have no urgent need to begin cancer treatment which allows enough time for the ovarian
stimulation protocol. A patient with a hormone (steroid)-dependent cancer may face a higher theoretical
risk of tumor growth during ovarian stimulation [14, 17, 89]. Moreover, a patient must have a partner as a
sperm donor in order to produce embryos [40]. There is an ongoing debate on whether to cryopreserve
mature oocytes and/or embryos following “emergency” ovarian stimulation or alternatively cryopreserve
ovarian tissue [24]/immature oocytes [23, 28, 60, 139] for future ART procedures to restore fertility.
For prepubertal girls and women who require immediate treatment or have a hormone-dependent
cancer, the ideal approach may be to freeze immature oocytes, isolated follicles or ovarian tissue [9, 12,
62, 75, 79]. Cryopreserved ovarian tissue could be transplanted back to the patient after cancer treatment
to promote timely puberty and fertility. Although this procedure is considered experimental, the results
are promising with 24 reported cases of human live births obtained following transplantation of
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cryopreserved/thawed ovarian tissue [18, 35, 38, 41, 43, 61, 64, 83, 96]. However, tissue transplantation
raises the theoretical risk of cancer recurrence since untreated cells are reintroduced into the patient [34],
though thus far disease recurrence after transplantation has not been reported in humans [33].
Alternatively, in vitro follicle maturation (IFM), followed by in vitro fertilization and embryo transfer,
would eliminate this risk. In addition, this approach could be advantageous by being associated with a
greater possibility of achieving successful pregnancy, since a large number of oocytes could be obtained
from a small ovarian sample [117, 127, 130]. As such, cryopreservation of ovarian tissue samples
followed by IFM is an emerging option for the reestablishment of fertility, especially for patients
undergoing cancer treatment who are not suitable for ovarian stimulation (or it is contraindicated) or
cryopreservation of oocytes and/or embryos [63, 109].
IFM could be an excellent alternative to transplantation for patients after ovarian tissue thawing.
However, it is still considered to be an experimental technique. There are studies showing excellent
results from nonprimate species such as mice [46, 87], cows [51, 111], sheep [114], pigs [115, 118] and
goats [22, 45, 101], with reports of live births generated from oocytes originated from in vitro matured
follicles of mice [77, 137] (Table 1). However, there is a still limited success in producing early-stage
embryos in the studies on nonhuman primates, such as rhesus monkeys [119, 120, 121, 131, 132, 133,
138] and baboons [136]. Also, there are few reports to date describing human preantral follicle growth in
vitro [9, 16, 135], with no study yielding meiotically competent human oocytes (Table 1). Reasons for
limited success include: (1) the difficulty in obtaining nonhuman primate and human tissue for
experiments, (2) apparent species differences in the regulation of early folliculogenesis, and (3) the larger
size of antral follicle needed to generate a competent oocyte. Moreover, most studies to date have used
follicles from fresh, as opposed to cryopreserved/thawed, ovarian tissue.
The present paper reports the recent advances in the cryopreservation of ovarian tissue and the
first extensive efforts to perform research on IFM in nonhuman primates and humans, with emphasis on
the challenges on applying this emerging technique to fertility preservation in cancer patients.
Cryopreservation of ovarian tissue
The cryopreservation of ovarian tissue and the subsequent thawing following cancer treatment
for fertility preservation is an evolving technique which requires additional evaluation, including
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characterization of the structure-function of cryo-thawed ovarian cortex. Based on extensive animal
studies, the technique was first applied to humans in 1996, with cryo-thawed ovarian tissue transplanted
into a patient who had received chemotherapy [41, 68]. Since then, clinical researchers have published
case reports and small experimental trials, including reimplantation of cryopreserved/thawed ovarian
tissue to the original site (orthotopic) and ectopic (heterotopic) sites such as the abdominal wall or the
forearm [10, 36, 37, 44, 67, 88]. Figure 1 illustrates fertility preservation options after the process of
ovarian tissue cryopreservation.
Successful return of ovarian function after reimplantation, albeit for a finite interval of time, was
reported. In some cases, oocyte aspiration was possible following stimulation of heterotopic ovary
implants [10, 36, 37, 44]. In 2004, the first spontaneous pregnancy resulting from orthotopic
transplantation was reported in Belgium [106]. To date, 24 live births have been reported using the
technique of ovarian tissue cryopreservation and subsequent thawing for transplantation [18, 38, 42,43,
61, 64, 96, 99]. As a result, various medical centers routinely perform ovarian tissue cryopreservation for
cancer patients around the world, with the subsequent plan to offer transplantation or other ARTs for
fertility improvement after treatment [50]. Currently, many patients are awaiting results from their
oncologists that validate reimplantation of ovarian tissue for improvement of endocrine and reproductive
function.
To date, the majority of livebirths in women originated from ovarian tissue cryopreserved by the
slow freezing technique [38]. The main characteristic of slow freezing is that the temperature is reduced
gradually. A freezing curve of 0.3°C per minute is usually applied to tissue samples such as ovarian
cortex [65, 100]. In order to obtain equilibrium among various cell types, low concentrations of
cryoprotectants are used in the attempt to prevent the formation of intracellular ice crystals [80].
However, the protocol may not completely eliminate water inside the ovarian cells, with the consequent
formation of ice crystals that generate cell damage.
Although slow freezing for ovarian tissue cryopreservation was initially used, the vitrification
technique recently gained attention because of encouraging results in oocyte and embryo cryopreservation
[1, 25, 26, 27, 70]. However, vitrification requires high concentrations of cryoprotectant agents that may
induce cytotoxicity and osmotic trauma [47]. High freezing velocity, necessary for oocyte and embryo
vitrification, is not required for ovarian tissue vitrification, in which slower cooling rates are needed to
prevent fracturing [48, 84, 119].
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Successful ovarian tissue vitrification was reported using nonhuman primates. Heterotopic
transplants of vitrified/thawed ovarian tissue resulted in ovarian development in baboons [8], as well as
recovery of MII oocytes, and formation of early cleavage embryos in cynomolgus [112] and rhesus [71,
119, 120, 121] monkeys. Ongoing studies with human ovarian tissue are showing promising results with
the use of vitrification technique [55]. Notably, the first human live birth derived from ovarian tissue
vitrification and ART was recently reported [64].
Cryopreservation issues. Nevertheless, many parameters regarding cryoprocedures remain
poorly understood such as the ideal quantity of tissue sample to be cryopreserved, the choice of
cryoprotectants for executing the procedure and the time of tissue exposure, the choice of
cryopreservation protocol, and the use of open or closed system. Thus, studies, combined with rigorous
analyses comparing ovarian tissue structure-function before and after thawing, are needed to establish the
ideal technique and protocol of ovarian tissue cryopreservation.
There are ongoing studies defining the optimal conditions to vitrify macaque ovarian cortex by
testing different kind of cryoprotectants, cryoprotectant exposure times and systems (open or closed)
[119, 121]. Recently, a study reported that dense stroma and preantral follicles were preserved using a
vitrification solution containing 27% glycerol, 27% ethyleneglycol and 0.8% polymers with cooling in
liquid nitrogen vapor and a two-step warming. BrdU uptake was evident in granulosa cells of growing
follicles in fresh and vitrified tissues, showing viability in both tissue types [119]. Higher cooling and
warming rates led to fracturing, i.e., evidence that the temperature curve is a critical part of the whole
process. The use of polymers in the vitrification solution [53, 119], combined with advances on the
concentration of cryoprotectants and the use of a closed system to avoid contamination, has improved the
ovarian tissue vitrification technique, as demonstrated for the first time by the development of antral
follicles during three-dimensional (3D) culture using primate vitrified-thawed ovarian cortex [119].
Transplant issues. Transplant of ovarian tissue is also a technique that still needs detailed
investigation. There are few studies evaluating the consequences of tissue transplantation on ovarian
structure-function in humans or even following xenografting [7, 55]. The possible presence of malignant
cells in the grafted tissue, the use of specific components (e.g., matrix or growth factors) or procedures
that might reduce tissue ischemia and improve ovarian function, the definition and standardization of the
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best transplant site, and the duration of resumed ovarian endocrine and gametogenic function are some of
the important points which require further studies.
Although transplantion of ovarian cortex using fresh monkey tissue [72], as well as fresh and
cryopreserved human tissue [32, 35, 64, 104], culminated in the birth of healthy offspring, only IFM has
the advantage of eliminating the reintroduction of cancer cells into the patients. Although studies have not
reported disease recurrence in transplant cases in humans [33, 34, 38, 79], a theoretical risk could not be
ruled out or minimized without further long term investigations [107].
IFM
Investigators have tried for several years [2, 3, 4, 30, 69, 102, 108, 117] to grow follicles in vitro
to examine follicular/oocyte development and function with some success. Two-dimensional (2D) culture
supports the complete growth of murine preantral follicles to the preovulatory stage which provide
meiotically competent oocytes [30, 46]. However, comparable results have not been achieved in other
mammals such as cattle [51], sheep [114], and humans [3]. Only in experiments with goats early embryos
were produced [102] (Table 1). One of the main reasons is that 2D culture does not maintain the natural
architecture of the antral follicle of large mammals [78]. During culture, granulosa cells become
disconnected from each other and from the oocyte because they spread on the bottom of the culture dish
[78].
Based on principles of tissue bioengineering, a 3D matrix capable of supporting follicle growth
was developed and demonstrated success in mice [54, 126, 137]. In mice, the 3D culture system permitted
the in vitro development of preantral follicles up to the preovulatory stage with the ability of producing
mature oocytes which, once inseminated, progressed to embryos and live births [137] (Table 1; Figure 2
A). Follicle encapsulation in alginate gel is able to mimic the characteristics of the extracellular matrix in
vivo, that facilitates the exchange of substances between the follicle and culture medium. In addition, the
flexibility of gel favors cell proliferation, which is essential for follicle survival and development [126,
134]. However, the stiffness of the gel may inhibit follicular growth and reduce steroidogenesis, as
reported for murine follicles embedded in 1 and 1.5% alginate gel. When 0.5% gel was used, oocytes
showing full growth were obtained [138].
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In addition, this 3D matrix permits culture, and hence study, of individual follicles. Research
indicates that larger (secondary) preantral follicles do not survive when they are cultured in ovarian
cortical slices, despite their 3D architecture; as such, neighboring stroma or follicles may have an
inhibitory effect on follicular development. Added to this is the fact that oxygen diffusion becomes
limiting in isolated tissue slices that are placed in the incubator, so that only follicles on the edges of the
thinner slices can survive, resulting in loss of integrity and a negative impact on oocyte survival [59, 116].
Thus, culturing individual follicles without large portions of surrounding stroma may be a better baseline
of study [82, 116, 132]. This IFM approach allows studies to directly determine the effects of co-culture
using multiple follicles at known developmental stages or stromal cells.
Investigators are also testing the value of various matrix components in 3D follicle culture. For
example, collagen gel was used during cattle IFM and follicular differentiation was demonstrated. When
this method was applied with a combination of defined supplemented culture medium and micropore
membranes, a calf was obtained from immature follicles cultured for 14 days [56]. When a 3D alginate-
based matrix was applied to nonhuman primate (rhesus monkey) IFM, it was possible to grow individual
preantral (secondary) follicles collected from both the fresh and cryopreserved tissue, to the small antral
(~1 mm diameter) stage, with the production of appreciable levels of steroid hormones [119, 120, 121,
131, 133, 138]. Typically, the small antral follicles did not respond to a gonadotropin bolus by reinitiating
oocyte meiosis, but in rare (10%) instances a large, fast-grow follicle could provide a metaphase II (MII)-
stage oocyte that was fertilized in vitro [132, 133] (Table 1; Figure 2B).
The dynamics and regulation of folliculogenesis in primates is still poorly understood [21],
which challenges the rapid refinement and translation of the IFM technique for human follicles and their
oocytes. This technique of 3D follicle encapsulation is currently being used to test potential endocrine and
paracrine factors that may promote follicle development and oocyte maturation in primates. For example,
recent evidence supports the concept that appropriate levels of certain hormones are essential for the
growth and health of preantral follicles during culture [92, 97, 131, 133, 136].
Gonadotropic Hormones. The presence of exogenous follicle-stimulating hormone (FSH)
promotes preantral follicular growth in vitro, in addition to maintaining the morphological integrity of
preantral follicles in goats [80], and stimulating the activation of primordial follicles in monkeys [4, 5].
Studies demonstrated that FSH exposure increases the diameter of follicles in mice [137], monkeys [131,
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138] and humans [135] during 3D culture. In rhesus monkey, FSH was essential for the survival of
secondary follicles (125–225 µm in diameter) during 3D culture with alginate gel [131]. In contrast, FSH
did not show beneficial effects on baboon follicle growth in 3D culture [136]. This may be due to the
inclusion of matrigel in the matrix that contains unknown growth factors which could contribute to
follicle growth. These data indicate that 3D encapsulated follicles offer a valuable model for examining
FSH actions, including the expression and signaling of FSH receptors, during early follicle development.
Luteinizing hormone (LH) may play a role during follicle development in vitro particularly for
steroidogenesis in mammalian species such as mouse [15, 29], cattle [111], goats [10] and primates, but
the effects differed between slow- and fast-grow follicles from monkeys [131, 133]. The addition of LH
at day 30 of culture increased progesterone (P4), androstenedione (A4) and estradiol (E2) production by
slow-grow follicles between pre-LH (week 4) and post-LH (week 5) exposure in the presence of high-
dose FSH. In contrast, with low-dose FSH exposure, LH treatment increases P4 and A4, but not E2, at
week 5 compared to FSH alone. LH supplementation at day 30 has no effect on the patterns or levels of
steroids produced by fast-grow follicles during week 5 regardless of culture conditions [131, 133]. This
may be due to their high steroid production prior to the LH addition which prevents further stimulation.
Also, continuous LH exposure during monkey follicle culture decreased P4, without having effect on A4
and E2 production [138]. This may result from the desensitizing of LH receptors by continuous LH
exposure or not distinguishing slow- from fast-grow follicles. The LH responsiveness suggests the
presence of theca cells in in vitro-developed primate antral follicles, which was recently demonstrated
using immunocytochemical detection of steroidogenic enzymes in theca versus granulosa cells [132].
Further studies of the stage-specific actions of LH on primate follicles in vitro during growth and
maturation are warranted.
Steroid Hormones. It is also apparent that encapsulated follicles produce a number of endocrine
and local factors during culture, that may be vital to follicular growth and maturation. For example,
individually cultured macaque follicles differed in the ability to produce ovarian steroids, such as P4, A4,
and E2, which are detectable in the culture media. Steroid production correlated positively with follicle
growth rate and was promoted by exogenous gonadotropins [131, 133, 138]. Therefore, studies were
initiated to test whether these steroid hormones have local actions to mediate or modulate gonadotropin
actions in primate follicles.
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Notably, addition of a 3β-hydroxysteroid dehydrogenase inhibitor (Trilostane, TRL) to prevent
the conversion of pregnenolone to P4, as well as downstream production of androgens and estrogens,
reduced survival and growth of macaque secondary follicles during 3D culture. Co-administration of low
(10 ng/mL) or high (50 ng/mL) doses of testosterone increased follicle survival to control level. Follicles
that received testosterone reached similar sizes and percentage of antrum formation, as well as oocyte
meiotic maturation (MII stage), as control follicles [97]. Studies with rodents also showed that androgens
have distinct physiological functions within the growing follicle [73, 85, 98]. Immunohistochemical
analysis revealed that cytoplasmic androgen receptor (AR) protein translocated to the nucleus of
granulosa and theca cells in mouse follicles in response to endogenous androgen production by theca cells
during preantral follicular development and during the antral stage in vitro [73]. AR was also
differentially expressed in mural versus cumulus cells, implying an oocyte-mediated regulation [73].
Studies are ongoing to determine if P4 and/or estrogen have critical roles during folliculogenesis
in primates [86, 94] and other mammalian species, e.g., cow [11, 103, 124]. Dynamic changes were
observed in the protein expression of P4 receptors following in vitro maturation or in response to
supplementation with LH, FSH, or P4 suggesting an important role of P4 during bovine oocyte
maturation [11]. Detailed experiments using encapsulated macaque follicles should better define the
role(s) of each steroid hormone at various stages of follicle development and maturation in primates.
Recent studies also observed the stage-specific production of other local factors, e.g., the
angiogenic factors VEGF-A and ANGPTs [49, 131, 132] and AMH [131, 132, 133] by encapsulated
monkey follicles, plus the correlation of their production with follicle growth and oocyte maturation.
Further studies on these and other local factors will increase our understanding of the regulation and
function of folliculogenesis in primates and optimize conditions for IFM for clinical application.
IFM in humans. Efforts are addressing the promotion of IFM after obtaining human follicles
from both fresh [16, 107, 116] and cryopreserved [58, 91, 116] ovarian cortex or cryopreserved follicles
[16]. To date, only four studies have evaluated the applicability of the alginate matrix and 3D system to
human preantral follicle culture [9, 16, 122, 135]. Three experiments cultured primordial-stage follicles
for seven days, and the follicles [9, 122] and their oocytes [16] doubled in size. Follicle culture from
secondary stage permitted development up to the small antral stage and production of steroid hormones
[135] (Table 1; Figure 2C). These results are promising, but culture systems that support development of
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individual human preantral follicles still need refinement in many aspects, such as definition of the
developmental stage of harvested follicles, the culture media and hormones/local factors necessary for the
maintenance and growth of the follicle in vitro, and the interval of culture needed to produce antral
follicles with meiotically competent oocytes. Due to the large size (>10 mm diameter) of the dominant,
preovulatory follicle in women, it remains unclear if IFM can generate an antral follicle of sufficient
maturation to yield a fertilizable oocyte or subsequent developing embryo. However, live infants have
been derived from oocytes contained within follicles < 6 mm following IVM and ICSI [52],
demonstrating that the diameter of the human follicle capable of producing a competent oocyte is
considerably smaller than the preovulatory follicle.
Tests growing primate primordial and primary follicles are valuable since they are the most
abundant cohorts in the ovary, and are very resistant to damage by cryopreservation and
chemotherapeutics [57]. It was found that primate ovarian tissue can be maintained for up to 24 h at 4°C
without compromising tissue or follicle health. Also, follicle survival and morphology were more optimal
when isolated primordial follicles were cultured in 2% alginate compared with 0.5% alginate; apparently
primordial follicles require a rigid physical environment to survive and grow in vitro [57, 129]. Moreover,
primary follicle culture yielded a MII oocyte in rhesus monkeys [132]. Primordial and primary human
follicles, either fresh or after being cryopreserved, which were isolated and embedded in alginate can
survive and grow for seven days in culture [19, 122], indicating that human preantral follicles can be
successfully cryopreserved without impairing their ability to survive and grow in vitro.
Other groups are focusing on developing primordial follicles to the preantral stage from vitrified
tissue using cortical strips. A high proportion of viable follicles in vitrified ovarian strips were obtained
after culture for seven days, showing an increase in the percentage of secondary and primary follicles, and
a decrease in the number of primordial and transitory follicles [66]; however the proportions of the
different classes of follicles prior to in vitro culture are unknown. This could be an alternative, valuable
three-step approach which first uses culture of ovarian strips to obtain primary from primordial follicles,
followed by culture of isolated primary and secondary follicles, and then aspiration of the cumulus-oocyte
complex for final in vitro oocyte maturation. A culture system based on multiple steps (e.g., further in
vitro maturation of oocytes obtained from follicle culture [82, 116, 117]) may be necessary for full
development of human oocytes capable of normal fertilization and embryogenesis. The culture system is
expected to preserve the endocrine and paracrine functions of the follicles (which may be critical for
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oocyte development), as well as their ability to support the growth and both the nuclear and cytoplasmic
maturation of an oocyte. For the optimization of culture systems, further focus on cumulus-oocyte
development, which may not necessarily require a large follicular structure, is warranted rather than
simply appropriate maintenance of differentiated somatic cells in the follicle wall.
The IFM of cryopreserved human follicles, followed by ARTs, would be an alternative for the
restoration of fertility in cancer patients when tissue transplantation or other techniques cannot be applied,
i.e., young girls for which ovarian tissue cryopreservation is their only option. In addition, IFM provides a
valuable in vitro model to study the processes and regulation of primate folliculogenesis and permits the
mimicking of pathological conditions in vitro for the study of various types of ovarian diseases.
Conclusion
The current data support the applicability of ovarian tissue cryopreservation and possible future
use of the IFM technique for fertility preservation in cancer patients. Ovarian tissue cryopreservation is a
particularly important technique for children and prepubertal adolescents who are not candidates for
oocyte and/or embryo cryopreservation, which are well established techniques [26, 39, 79, 93, 113, 125].
An additional advantage of ovarian tissue cryopreservation is that it avoids certain religious, ethical or
legal issues, such as the fate of cryopreserved embryos in case of divorce, serious diseases or death of one
of the spouses [6].
In view of the growing number of studies on possible alternatives for fertility preservation in
cancer patients, ovarian tissue cryopreservation could be considered by oncologists, for later
transplantation or possible IFM. Thus, the real concern provoked by the possibility that patients may not
be able to have children would be considerably minimized, and the patients would have better
opportunities to be mothers in the future after the cancer treatment. Before cancer treatment (gonadotoxic
or radiation therapy, gonadectomy), patients could be provided with counseling regarding available and
future options for fertility preservation. Fertility preservation may be offered by programs in reproductive
medicine clinics in partnership with oncological care centers designed to support cancer patients [6, 90].
Although IFM offers promise, further advances are needed to understand and develop an in vitro
environment that promotes appropriate follicular growth and differentiation, plus the oocyte competence
necessary for fertilization and subsequent embryonic development. Thus, continued investigations on
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
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nonprimate, primate and human folliculogenesis are critical for translation to improvement in fertility
treatment for women, including female cancer patients.
Acknowledgments
Acknowledgments to the support received from National Institute of Health (NIH) U54
RR024347, RL1HD058294, PL1EB008542 (The Oncofertility Consortium), NIH-NICHD through
cooperative agreement as part of the Specialized Cooperative Center Program in Reproduction and
Infertility Research U54HD018185, NIH ORWH/NICHD 2K12HD043488 (Building Interdisciplinary
Research Careers in Women's Health), NIH Fogarty International Center TW/HD-00668 (to P. Michael
Conn) and Oregon National Primate Research Center 8P51OD011092.
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
27
138. Xu M, West-Farrell ER, Stouffer RL, Shea LD, Woodruff TK, Zelinski MB. Encapsulated three-
dimensional culture supports development of nonhuman primate secondary follicles. Biol
Reprod. 2009;81(3):587–94. doi: 10.1095/biolreprod.
139. Yazdanpanah F, Khalili MA, Eftekhar M, Karimi H. The effect of vitrification on maturation
and viability capacities of immature human oocytes. Arch Gynecol Obstet. 2013;288(2):439–44.
doi: 10.1007/s00404-013-2777-0.
140. Zelinski MB, Murphy MK, Lawson MS, Jurisicova A, Pau KY, Toscano NP, Jacob DS, Fanton
JK, Casper RF, Dertinger SD, Tilly JL. In vivo delivery of FTY720 prevents radiation-induced
ovarian failure and infertility in adult female nonhuman primates. Fertil Steril. 2011;95(4):1443–
5;e1-7. doi: 10.1016/j.fertnstert.2011.01.012.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATION IN PATIENTS
WITH CANCER
Jhenifer Kliemchen Rodrigues (BSc, MSc)1,2,3, Jing Xu (PhD)2, Ricardo Mello Marinho (MD, MSc, PhD)3,4, João
Pedro Junqueira Caetano (MD, MSc, PhD)3,4, Mary B Zelinski (PhD)2, Richard L Stouffer (PhD)2, Paula Andrea
Navarro (MD, MSc, PhD)1
1 Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/Universidade de São Paulo,
Ribeirão Preto/SP, Brazil
2 Division of Reproductive and Developmental Sciences, Oregon National Primate Research Center/ Oregon Health
& Science University, Beaverton/OR, United States of America
3 Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento, Pró-Criar Medicina Reprodutiva, Belo Horizonte/MG, Brazil
4 Instituto de Pós-graduação – Faculdade de Ciências Médicas de Minas Gerais, Belo Horizonte/MG, Brazil
Address for correspondence:
Pró-Criar Medicina Reprodutiva
Rua Bernardo Guimarães, 2063, Lourdes.
Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil, Zip code: 30140-082
Phone number: (55 – 31) 8325 – 7959/ (55 – 31) 2533 – 3815 / (55 – 31) 3292 – 5299
Fax number: (55 – 31) 3292 – 5299
[email protected] or [email protected]
There is no conflict of interest for any of the authors to the submitted material.
Title Page (with ALL authors information)
Figure 1. Fertility preservation for young girls and women.
Note: Parts of this figure have been re-printed with permission from The Oncofertility Consortium.
Colour Figure
Figure 2. IFM success in producing liveborn mice, nonhuman primate embryos and human antral follicles following 3D alginate culture of encapsulated secondary follicles.
Note: A: Mice at birth following preantral follicle development in vitro in 3D alginate matrix [137]; B: A morula stage embryo obtained from a macaque preantral follicle cultured in vitro in the 3D culture system [133]; C: A small antral follicle obtained from a human preantral follicle matured in a 3D system in vitro culture [135]. Figures are reproduced with permissions from the respective journals.
Table 1. Summary of progress in IFM using tissue from various species.
Animal model Culture type Result References
Mouse 2D Preovulatory follicles, MII Cortvrindt et al., 1998; Cortvrindt and Smitz, 2001
Mouse 2D Preovulatory follicles, MII, Live birth Eppig and O'Brien, 1996; Liu et al., 2001; O’Brien et al., 2003
Mouse 3D Preovulatory follicles Heise et al., 2005
Mouse 3D Preovulatory follicles, MII, Live birth Xu et al., 2006
Bovine (cows) 2D Antral follicles Gutierrez et al., 2000; Sun and Li, 2013
Bovine (cows) 2D Antral follicles, MII, Live birth Hirao et al., 2004
Ovine (sheep) 2D Antral follicles, steroidogenesis Tambe and Nandedkar, 1993
Porcine (pigs) 2D Antral follicles, MII Telfer et al., 2000
Caprine (goats) 2D Antral follicles, MII, Early embryo Saraiva et al., 2010; 2011; Chaves et al., 2012; Duarte et al., 2013
Nonhuman primate 3D Antral follicles Xu et al., 2009; Xu et al., 2010
Nonhuman primate 3D Antral follicles, MII Xu et al., 2011
Nonhuman primate 3D Antral follicles, MII, Early embryo Xu et al., 2011; 2013
Human 2D Antral follicles Abir et al., 1997
Human 3D Antral follicles Amorim et al., 2009; Bian et al., 2013
Human 3D Antral follicles, GV oocytes Xu et al., 2009 Legend: MII = metaphase II oocytes
Table
OXFORD UNIVERSITY PRESS LICENSE TERMS AND CONDITIONS
Feb 05, 2014
This is a License Agreement between Jing Xu ("You") and Oxford University Press ("Oxford University Press") provided by Copyright Clearance Center ("CCC"). The license consists of your order details, the terms and conditions provided by Oxford University Press, and the payment terms and conditions.
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License Number 3322640416281
License date Feb 05, 2014
Licensed content publisher Oxford University Press
Licensed content publication Human Reproduction
Licensed content title Fibrin promotes development and function of macaque primary follicles during encapsulated three-dimensional culture:
Licensed content author J. Xu, M.S. Lawson, R.R. Yeoman, T.A. Molskness, A.Y. Ting, R.L. Stouffer, M.B. Zelinski
Licensed content date 08/01/2013
Type of Use Journal/Magazine
Requestor type Academic/Educational institute
Format Print and electronic
Portion Figure/table
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Title of new article IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATION IN PATIENTS WITH CANCER
Publication the new article is in
Journal of Assisted Reproduction and Genetics
Publisher of new article Springer
Author of new article Jhenifer Kliemchen Rodrigues, Jing Xu, Ricardo Mello Marinho, João Pedro Junqueira Caetano, Mary B Zelinski, Richard L Stouffer, Paula Andrea Navarro
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3. This permission is limited to the particular use authorized in (1) above and does not allow you to sanction its use elsewhere in any other format other than specified above, nor does it apply to quotations, images, artistic works etc that have been reproduced from other sources which may be part of the material to be used.
4. No alteration, omission or addition is made to the material without our written consent. Permission must be re-cleared with Oxford University Press if/when you decide to reprint.
5. The following credit line appears wherever the material is used: author, title, journal, year, volume, issue number, pagination, by permission of Oxford University Press or the sponsoring society if the journal is a society journal. Where a journal is being published on behalf of a learned society, the details of that society must be included in the credit line.
6. For the reproduction of a full article from an Oxford University Press journal for whatever purpose, the corresponding author of the material concerned should be informed of the proposed use. Contact details for the corresponding authors of all Oxford University Press journal contact can be found alongside either the abstract or full text of the article concerned, accessible from www.oxfordjournals.org Should there be a problem clearing these rights, please contact [email protected]
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9. This license is personal to you and may not be sublicensed, assigned or transferred by you to any other person without Oxford University Press’s written permission.
10. Oxford University Press reserves all rights not specifically granted in the combination of (i) the license details provided by you and accepted in the course of this licensing transaction, (ii) these terms and conditions and (iii) CCC’s Billing and Payment terms and conditions.
11. You hereby indemnify and agree to hold harmless Oxford University Press and CCC, and their respective officers, directors, employs and agents, from and against any and all claims arising out of your use of the licensed material other than as specifically authorized pursuant to this license.
12. Other Terms and Conditions:
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If you would like to pay for this license now, please remit this license along with your payment made payable to "COPYRIGHT CLEARANCE CENTER" otherwise you will be invoiced within 48 hours of the license date. Payment should be in the form of a check or money order referencing your account number and this invoice number RLNK501219201. Once you receive your invoice for this order, you may pay your invoice by credit card. Please follow instructions provided at that time. Make Payment To: Copyright Clearance Center Dept 001 P.O. Box 843006 Boston, MA 02284-3006 For suggestions or comments regarding this order, contact RightsLink Customer Support: [email protected] or +1-877-622-5543 (toll free in the US) or +1-978-646-2777.
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OXFORD UNIVERSITY PRESS LICENSE TERMS AND CONDITIONS Feb 18, 2014
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License date Feb 18, 2014
Licensed content publisher
Oxford University Press
Licensed content publication
Human Reproduction
Licensed content title In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth:
Licensed content author Min Xu, Susan L. Barrett, Erin West-Farrell, Laxmi A. Kondapalli, Sarah E. Kiesewetter, Lonnie D. Shea, Teresa K. Woodruff
Licensed content date 10/01/2009
Type of Use Journal/Magazine
Requestor type Academic/Educational institute Format Print and electronic
Portion Figure/table
Number of figures/tables 1
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Order reference number None
Title of new article IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATION IN PATIENTS WITH CANCER
Publication the new article is in
Journal of Assisted Reproduction and Genetics
Publisher of new article Springer
Author of new article Jhenifer Kliemchen Rodrigues, Jing Xu, Ricardo Mello Marinho, João Pedro Junqueira Caetano, Mary B Zelinski, Richard L Stouffer, Paula Andrea Navarro
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2. This permission covers the use of the material in the English language in the following territory: world. If you have requested additional permission to translate this material, the terms and conditions of this reuse will be set out in clause 12.
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MARY ANN LIEBERT, INC. LICENSE TERMS AND CONDITIONS Feb 18, 2014
This is a License Agreement between Jing Xu ("You") and Mary Ann Liebert, Inc. ("Mary Ann Liebert, Inc.") provided by Copyright Clearance Center ("CCC"). The license consists of your order details, the terms and conditions provided by Mary Ann Liebert, Inc., and the payment terms and conditions. All payments must be made in full to CCC. For payment instructions, please see information listed at the bottom of this form. License Number 3332090053898 License date Feb 18, 2014 Licensed content publisher Mary Ann Liebert, Inc. Licensed content publication Tissue Engineering Part A
Licensed content title Tissue-Engineered Follicles Produce Live, Fertile Offspring
Licensed content author Min Xu, Pamela K. Kreeger, Lonnie D. Shea et al.
Licensed content date Oct 1, 2006 Volume number 12 Issue number 10 Type of Use Journal/Magazine Requestor type academic Format print and electronic Portion charts/graphs/tables Number of charts/graphs/tables 1 Translating... no Distribution quantity 1000 Order reference number
Title of the article
IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATION IN PATIENTS WITH CANCER
Publication the article is in Journal of Assisted Reproduction and Genetics
Publisher of the article Springer
Author of the article Jhenifer Kliemchen Rodrigues, Jing Xu, Ricardo Mello Marinho, João Pedro Junqueira Caetano, Mary B Zelinski,
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Richard L Stouffer, Paula Andrea Navarro
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6. Reservation of Rights
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8. Copyright Notice: Disclaimer
You must include the following copyright and permission notice in connection with any reproduction of the licensed material:" The publisher for this copyrighted material is Mary Ann Liebert, Inc. publishers."
9. Warranties: None
Publisher makes no representations or warranties with respect to the licensed material and adopts on its own behalf the limitations and disclaimers established by CCC on its behalf in its Billing and Payment terms and conditions for this licensing transaction.
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12. No Amendment Except in Writing
This license may not be amended except in writing signed by both parties (or, in the case of publisher, by CCC on publisher's behalf).
13. Objection to Contrary Terms
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February 17, 2014
The Oncofertility Consortium gives permission to Jhenifer Kliemchen Rodrigues and co-workers to use the figures attached, or part of them, to represent the process of fertility preservation for cancer patients. These were previously printed and distributed by the Oncofertility Consortium for use in educational folders and handouts for researchers, medical professionals, and patients.
Sincerely,
Teresa K. Woodruff, Ph.D. Director, Oncofertility Consortium Thomas J. Watkins Professor of Obstetrics and Gynecology Northwestern University
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FERTLINE866-708-FERT (3378)[email protected]
FERTLINE866-708-FERT (3378)[email protected]