KARINE LOUIZE VINCENZI

EFEITO IN VITRO DE METABÓLITOS ACUMULADOS NA CITRULINEMIA TIPO I

SOBRE PARÂMETROS DE METABOLISMO ENERGÉTICO EM CÉREBRO DE

RATOS: PAPEL PROTETOR DO RESVERATROL

JOINVILLE

2019

KARINE LOUIZE VINCENZI

EFEITO IN VITRO DE METABÓLITOS ACUMULADOS NA CITRULINEMIA TIPO I

SOBRE PARÂMETROS DE METABOLISMO ENERGÉTICO EM CÉREBRO DE

RATOS: PAPEL PROTETOR DO RESVERATROL

Dissertação de mestrado apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Saúde e Meio Ambiente, na Universidade da Região de Joinville-UNIVILLE. Orientadora: Profª. Drª. Daniela Delwing de Lima. Coorientadora: Profª. Drª. Débora Delwing Dal Magro

JOINVILLE

2019

Catalogação na publicação pela Biblioteca Universitária da Univille

Vincenzi, Karine Louize

V775e Efeito in vitro de metabólitos acumulados na citrulinemia tipo I sobre parâmetros de metabolismo energético em cérebro de ratos: papel protetor do resveratrol/ Karine Louize Vincenzi; orientadora Dra. Daniela Delwing de Lima; coorientadora Dra. Débora Delwing Dal Magro. – Joinville: UNIVILLE, 2019.

85 p.: il. ; 30 cm

Dissertação (Mestrado em Saúde e Meio Ambiente – Universidade da Região de Joinville)

1. Citrulinemia. 2. Metabolismo energético. 3. Resveratrol. I. Lima, Daniela

Delwing de (orient.). II. Magro, Débora Delwing Dal. (Coorient.). III. Título.

CDD 616.6

Elaborada por Rafaela Ghacham Desiderato – CRB-14/1437

Dedico este trabalho primeiramente a

Deus por ter me abençoado com a capacidade

de seguir com meu sonho.

A meu pai, sendo um exemplo pra mim

e me incentivando sempre.

A minha mãe, sua constante

compreensão foi suporte para minha

conquista.

Este trabalho dedico a vocês!

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus, por me guiar e conceder forças nos meus

períodos mais difíceis e por não deixar minha fé ser abalada nessa jornada. Toda

honra e toda glória sejam dadas a ti Senhor.

A minha mãe, Maria Janete, pelas suas orações e sempre estar de braços

abertos e palavras prontas para me confortar. A meu pai, Volney, por me incentivar a

ser uma profissional diferenciada com seu exemplo e pelos sermões que me

ensinaram a lutar sempre pelos meus objetivos.

Aos meus irmãos, Bianca, Daniel, Rafael e Julia, que sempre depositaram

muita fé em mim, com apoio e compreensão em minhas metas e meu futuro. E toda

minha família por estarem sempre na arquibancada torcendo pelo meu sucesso.

Agradeço a minha orientadora Profª Drª Daniela Delwing de Lima, que além

de minha orientadora esteve sempre disposta a me aconselhar, por acreditar em

meu potencial e ser um profissional inspirador, a você minha eterna gratidão pelos

ensinamentos, paciência e amizade. À minha Coorientadora Profª. Drª Débora

Delwing Dal Magro pelas contribuições na construção do trabalho e parceria em toda

pesquisa.

Aos meus amigos, que me apoiaram e compreenderam minha ausência

durante a elaboração desse trabalho.

Ao meu grupo de pesquisa, me incentivando e sempre apoiando no meu

crescimento. Principalmente Thayná, Larissa e Aline que foram além de tudo,

amigas.

A todos os professores e funcionários do mestrado que de alguma forma

contribuíram para a esta conquista.

Aos meus colegas de sala, turma XVI, pelo constante aprendizado durante o

nosso convívio.

Aos membros da banca, pelas contribuições.

A UNIVILLE, CAPES e a FURB.

A todos que de alguma forma ajudaram a concluir mais essa etapa da minha

vida.

“Não se pode criar experiência. É preciso passar por ela.”

Albert Camus

https://www.pensador.com/autor/albert_camus/

RESUMO

Introdução: A Citrulinemia tipo I é uma doença autossômica recessiva do ciclo da

ureia causada pela deficiência na atividade da enzima argininosuccinato sintetase, a

qual catalisa a formação de argininosuccinato a partir de citrulina e aspartato,

causando um aumento nos níveis de citrulina e amônia. Indivíduos afetados podem

apresentar déficits neurológicos significativos. Objetivo: Investigar os efeitos in vitro

de citrulina, amônia e a influência do antioxidante resveratrol sobre a atividade da

piruvato quinase, citrato sintase, succinato desidrogenase (SDH), complexo II e

citocromo c oxidase no córtex cerebral, cerebelo e hipocampo de ratos Wistar

machos com 60 dias. Metodologia: Para os estudos in vitro, os animais foram

sacrificados por decapitação, sem anestesia, o cérebro foi removido e as estruturas

cerebrais (hipocampo, córtex cerebral e cerebelo) separadas, homogeneizadas em

tampão adequado e armazenadas. A citrulina, amônia e resveratrol foram

adicionados aos ensaios para obtenção das concentrações finais de citrulina (0.1;

2.5 e 5.0 mM), amônia (0.01; 0.1 e 1.0 mM) e resveratrol ( 0.01 mM, 0.1 mM e 0.5

mM) para verificar a atividade sobre os parâmetros de metabolismo energético

avaliados. Os dados foram analisados por ANOVA, seguido pelo teste post-hoc de

Duncan, quando o teste F foi significativo (p

energético causadas pela citrulina e amônia são provavelmente mediadas pela

geração de radicais livres, que por sua vez podem ser eliminados pela ação do

antioxidante resveratrol.

Palavras-chave: Citrulinemia tipo I; citrulina; amônia; metabolismo energético;

resveratrol.

ABSTRAT

Introduction: Citrullinemia Type I is an autosomal recessive disease caused by

deficiency of argininosuccinate synthetase, which catalyzes the formation of

argininosuccinate from citrulline and aspartate, as part of the urea cycle, causing an

increase in citrulline and ammonia levels. Affected individuals may have significant

neurological deficits. Objective: To evaluate the in vitro effects of citrulline, ammonia

and the influence of the antioxidant resveratrol on the activity of pyruvate kinase,

citrate synthase, succinate dehydrogenase (SDH), complex II and cytochrome c

oxidase in the cerebral cortex, cerebellum and hippocampus of 60-day-old male

Wistar rats. Methodology: For in vitro studies, the animals were sacrificed by

decapitation, without anesthesia, the brain was removed and the structures

separated (hippocampus, cerebral cortex and cerebellum), then homogenized in

suitable buffer and stored. Citrulline, ammonia and resveratrol were added to the

assays to obtain final concentrations of citrulline (0.1, 2.5 and 5.0 mM), ammonia

(0.01, 0.1 and 1.0 mM) and resveratrol (0.01 mM, 0.1 mM and 0.5 mM) to verify the

activity on the energy metabolism parameters evaluated. Data were analyzed by

ANOVA, followed by Duncan's post-hoc test, when the F-test was significant

(p

generation of free radicals, which in turn can be eliminated by the action of the

antioxidant resveratrol.

Keywords: Citrulinemia type I; citrulline; ammonia; energy metabolism; resveratrol.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática do ciclo da ureia. ......................................... 27

Figura 2: Hidrólise da ATP: ATP - Adenosina trifosfato; ADP - Adenosina difosfato; Pi

- Fósfato inorgânico. ................................................................................................ 34

Figura 3: Hidrólise da fosfocreatina para geração de ATP. PCr – Fosfocreatina; ADP

– Adenosina Difosfato; ATP – Adenosina trifosfato; Cr – Creatina. .......................... 35

Figura 4: Via Glicolítica. ........................................................................................... 36

Figura 5: Ciclo do Ácido Cítrico. ............................................................................... 37

Figura 6: Representação de transporte de elétrons. ................................................ 39

Figura 7: Reação do Complexo I. ............................................................................. 40

Figura 8: Reação do Complexo II. ............................................................................ 41

Figura 9: Reação do Complexo III. ........................................................................... 41

Figura 10: Cadeia de Transporte de elétrons. .......................................................... 43

Figura 11: Protocolo do experimento in vitro. ........................................................... 47

Figura 12: Fluxograma de preparação do tecido. ..................................................... 48

Figura 13: Fluxograma da atividade da Piruvato Quinase. ....................................... 49

Figura 14: Fluxograma da Atividade da Citrato Sintase. ........................................... 49

Figura 15: Fluxograma da atividade da citocromo c oxidase. ................................... 50

Figura 16: Fluxograma da atividade do Complexo II e Succinato Desidrogenase. ... 51

Figura 17: Fluxograma da Dosagem de Proteínas. .................................................. 51

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Classificação clínica dos Erros Inatos do Metabolismo. .......................... 26

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Acetil-Coa Acetilcoenzima A

ADP Difosfato de Adenosina

ASS Argininosuccinato Sintetase

ASL Argininosuccinato Liase

ATP Trifosfato de Adenosina

ATP PCr Sistema Fosfogênico

ATPase Adenosina-Trifosfatase

CAT Catalase

CAC Ciclo do Ácido Cítrico

CO2 Dióxido de Carbono

CPS-I Carbamil Fosfato Sintetase-I

CTLN1 Citrulinemia Tipo I

CTLN2 Citrulinemia Tipo II

DCU Distúrbios do Ciclo da Ureia

EIM Erros Inatos do Metabolismo

EROs Espécies Reativas de Oxigênio

FAD Flavina-Adenina Dinucleotídeo

GR Glutationa Redutase

GSH-Px Glutationa Peroxidase

GTP Trifosfato de Guanadina

HCO3- Bicarbonato

H2O2 Peróxido de hidrogênio

NAD Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo

NH4+ Íon amônio

OTC Ornitina Transcarbamilase

O2 Oxigênio

O2o- Radical superóxido

PCr Fosfocreatina

Pi Íon fosfato

Q Ubiquinona

QH2 Ubiquinol

SDH Succinato-Desidrogenase

SOD Superóxido Dismutase

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 22

2 OBJETIVOS .................................................................................................. 24

2.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 24

2.2 Objetivos Específicos ............................................................................... 24

3 REVISÃO ....................................................................................................... 25

3.1 Erros Inatos do Metabolismo ................................................................... 25

3.2 Ciclo da ureia ............................................................................................ 26

3.3 Citrulinemia ............................................................................................... 27

3.3.1 Citrulinemia Tipo I .................................................................................. 27

3.3.1.1 Descrição Clínica ................................................................................ 28

3.3.1.2 Diagnóstico ......................................................................................... 30

3.3.1.3 Tratamento .......................................................................................... 31

3.4 Antioxidantes ............................................................................................ 31

3.4.1 Resveratrol ............................................................................................. 32

3.5 Metabolismo energético ........................................................................... 33

3.5.1 Sistema ATP-PCr .................................................................................... 34

3.5.2 Glicólise .................................................................................................. 35

3.5.3 Ciclo do Ácido Cítrico (Ciclo de Krebs) ................................................ 37

3.5.4 Cadeia de Transporte de Elétrons ........................................................ 38

3.5.5 Fosforilação Oxidativa ........................................................................... 43

4 INTERDISCIPLINALIDADE ........................................................................... 45

5 METODOLOGIA ............................................................................................ 46

5.1 Animais ...................................................................................................... 46

5.2 Protocolo experimental ............................................................................ 46

5.2.1 Estudos in vitro ...................................................................................... 46

5.2.2 Prevenção com resveratrol ................................................................... 47

5.3 Estudos bioquímicos ................................................................................ 47

5.3.1 Preparação do tecido ............................................................................. 47

5.3.2 Atividade da Piruvato Quinase .............................................................. 48

5.3.3 Atividade da Citrato Sintase .................................................................. 49

5.3.4 Atividade do Citocromo c oxidase ........................................................ 49

5.3.5 Atividade do Complexo II e Succinato Desidrogenase ....................... 50

5.3.6 Dosagem de Proteínas ........................................................................... 51

5.4. Análise estatística .................................................................................... 51

6 RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................... 52

6.1 Artigo ......................................................................................................... 52

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................... 79

8 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 80

22

1 INTRODUÇÃO

O vasto número de deficiências genéticas existentes resulta em quadros

clínicos extremamente diversos; enquanto alguns EIM são absolutamente

assintomáticos, outros são tão graves que resultam em morte neonatal. A

diversidade envolvida nessas patologias e a ausência, na maioria dos casos, de

sinais e sintomas específicos contribuem para dificultar o diagnóstico dessas

doenças (MAESTRI; CLISSOLD; BRUSILOW, 1995).

Erros Inatos do Metabolismo (EIM) são alterações genéticas que se

manifestam pela ausência da síntese de uma proteína, geralmente uma enzima,

ocasionando bloqueio de rotas metabólicas, correspondendo cerca de 10% de todas

as doenças genéticas (ARAÚJO, 2004; BICKEL, 1987).

Distúrbios do Ciclo da Ureia (DCU) são doenças genéticas raras que afetam o

catabolismo proteico através da deficiência de enzimas envolvidas no processo de

excreção da amônia. Os DCU podem se apresentar tardiamente, com manifestações

pleiotrópicas que variam desde o desenvolvimento normal com descompensação

metabólica aguda, até doença psiquiátrica (MIAN; LEE, 2002)

De acordo com os estudos de Raimann et al. (1994) e Summara et al.

(2013), as alterações metabólicas do ciclo da ureia apresentam uma ocorrência

global de 1:30.000 - 46.000 nascidos vivos, inclusa dentre elas a Citrulinemia,

considerada uma patologia rara.

A Citrulinemia Tipo I (CTLN1) é uma alteração genética do ciclo da ureia

causada pela deficiência na atividade da enzima Argininosuccinato Sintetase (ASS),

impedindo a atividade das rotas metabólicas do ciclo da ureia (BICKEL, 1987). É

caracterizada por início neonatal ou intermitente de hiperamonemia, níveis séricos

reduzidos de arginina e elevados de citrulina e glutamina (HÄBERLE et al., 2002).

A forma mais grave da doença ocorre no período neonatal, conhecida como

forma clássica (QUINONEZ; THOENE, 2004; RAIMANN et al., 1994). Nessa

classificação, o recém-nascido torna-se progressivamente mais letárgico, apresenta

dificuldade respiratória e quadros de vômito, desenvolve sinais de aumento da

pressão intracraniana podendo evoluir para convulsões, perda de consciência e

23

morte (CLANCY; CHUNG, 1991; MAESTRI; CLISSOLD; BRUSILOW, 1995;

QUINONEZ; THOENE, 2004).

A doença também pode se manifestar mais tarde na infância, forma não

clássica, caracterizada com sintomas mais sutis, incluindo dor de cabeça intensa,

escotomas, episódios tipo enxaqueca, ataxia, fala arrastada, letargia e sonolência,

sem intervenção ocorre aumento da pressão intracraniana, e também pode levar a

morte (MAESTRI; CLISSOLD; BRUSILOW, 1995; QUINONEZ; THOENE, 2004).

As crianças tratadas imediatamente após diagnóstico de CTLN1, que

apresentam a forma clássica, considerada a mais grave, podem sobreviver por um

período indeterminado de tempo, mas geralmente com déficits neurológicos

significativos (QUINONEZ; THOENE, 2004).

Visto que a amônia é um metabólito acumulado da CTLN1, dados da literatura

apontam que a amônia em excesso é uma toxina com efeito potente sobre o sistema

nervoso central, requerendo diagnóstico e terapia emergente (BRENINGSTALL,

1986). Com relação aos danos irreversíveis causados por essa toxina, pode-se citar:

atrofia cortical, aumento ventricular e desmielinização, os quais levam a

comprometimento cognitivo, convulsões e paralisia cerebral (BRAISSANT; MCLIN;

CUDALBU, 2013).

Considerando que a CTLN1 pode causar disfunção neurológica significativa e

encefalopatia hiperamonêmica, este trabalho tem por objetivo investigar os efeitos in

vitro da citrulina e da amônia sobre alguns parâmetros de metabolismo energético,

bem como verificar os efeitos in vitro do resveratrol sobre as alterações causadas

pela citrulina e a amônia nos parâmetros estudados.

24

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Estudar os efeitos in vitro da citrulina e da amônia e a influência do

antioxidante resveratrol sobre parâmetros de metabolismo energético em cérebro de

ratos.

2.2 Objetivos Específicos

1) Verificar os efeitos in vitro de diferentes concentrações de citrulina (0,1, 2,5

e 5,0 mM) e de amônia (0,01, 0,1 e 1,0 mM) sobre a atividade da piruvato quinase,

citrato sintase, complexo II / sucinato desidrogenase e citocromo C oxidase em

hipocampo, córtex cerebral e cerebelo de ratos de 60 dias de idade;

2) Investigar a influência do antioxidante resveratrol (0,01, 0,1 e 0,5 mM)

sobre os efeitos in vitro da citrulina e da amônia sobre os parâmetros de

metabolismo energético analisados em hipocampo, córtex cerebral e cerebelo de

ratos de 60 dias de idade.

25

3 REVISÃO

3.1 Erros Inatos do Metabolismo

Os Erros Inatos do Metabolismo (EIM) são distúrbios de natureza genética,

geralmente se manifestam devido um defeito enzimático (EL HUSNY; CALDATO,

2006; ZANETTI; ALIBERTI, 2008). Essa ausência enzimática é capaz de acarretar a

interrupção de uma via metabólica, desencadeando alguma falha de síntese,

degradação, armazenamento ou transporte de moléculas no organismo (EL HUSNY;

CALDATO, 2006).

Tratando-se de alterações metabólicas, os EIM possuem duas classificações,

dentre elas: Categoria 1, compreende as doenças que afetam apenas um órgão ou

um sistema anatômico, como o sistema endócrino, sistema imune, coagulação;

Categoria 2, engloba doenças em que a base bioquímica afeta uma via metabólica

comum a um grande número de células ou órgãos, como hiperamonemia em

defeitos do ciclo da ureia ou hipoglicemia em Glicogenose (EL HUSNY; CALDATO,

2006; MARTINS, 1999).

Alterações da Categoria 2, são divididas em três diferentes grupos conforme

suas características fisiopatológicas e fenótipo clínico: Grupo I: Distúrbios de síntese

ou catabolismo de moléculas complexas e incluem as doenças que afetam um

sistema funcional ou anatômico ou mesmo um órgão; Grupo II: Erros inatos do

metabolismo intermediário que levam à intoxicação aguda e recorrente ou crônica e

progressiva; Grupo III: Deficiência na produção ou utilização de energia no fígado,

miocárdio, músculo ou cérebro (EL HUSNY; CALDATO, 2006; ZANETTI; ALIBERTI,

2008). Para um maior entendimento, veja descrição no Quadro 1.

A classificação do presente trabalho se engloba na categoria 2, no Grupo II,

onde as características principais nesse grupo são a existência de intervalos livres

de sintomas, a relação evidente com o aporte alimentar; ou seja, o aumento da taxa

de metabolismo basal e a entrada no organismo de um substrato nocivo, podem

desencadear uma intoxicação aguda e recorrente ou crônica e progressiva (EL

HUSNY; CALDATO, 2006; ZANETTI; ALIBERTI, 2008).

26

Quadro 1: Classificação clínica dos Erros Inatos do Metabolismo.

Classificação Descrição

Categoria 1 Envolve um sistema funcional.

Categoria 2 Afeta vias metabólicas, grande número de células ou órgãos.

Grupo I Defeitos na síntese ou catabolismo.

Grupo II Defeito no metabolismo intermediário.

Grupo III Defeito na produção de energia ou utilização.

Fonte: Adaptado de Martins (1999).

Incorporado no Grupo II encontra-se Distúrbios do Ciclo da Ureia (DCU),

caracterizado como doenças genéticas raras que afetam o catabolismo proteico por

deficiência em uma das enzimas envolvidas no processo de excreção celular

(PEREZ et al., 2010). A patologia dos DCUs é caracterizada principalmente por

hiperamonemia e encefalopatia, com sintomas variando de risco de vida a retardo

mental em sobreviventes (PEREZ et al., 2010).

3.2 Ciclo da ureia

O ciclo da ureia ocorre em cinco etapas enzimáticas, sendo que a enzima

ornitina transcarbamilase (OTC) está localizada na matriz mitocondrial e as enzimas

carbamil fosfato sintetase-I (CPS-I), argininosuccinato sintetase (ASS),

argininosuccinato liase (ASL) e arginase no citosol (MORRIS JR, 2002).

Conforme observado na Figura 1, o ciclo tem início no interior da

mitocôndria, quando o íon amônio (NH4+) presente na mitocôndria hepática se

condensa com o bicarbonato (HCO3-), sob ação da enzima carbamil-fosfato sintetase

(1), formando carbamil-fosfato na matriz, o qual entra no ciclo da ureia, dando início

as quatro etapas que correspondem o ciclo (MORRIS JR, 2002; NELSON; COX,

2011). O produto formado na primeira reação (carbamil-fosfato), sob ação da enzima

ornitina-transcarbamilase (2), condensa-se com ornitina e forma o aminoácido

citrulina, que é transportado para o citosol (NELSON; COX, 2011; VIEIRA, 2014). No

citosol, a citrulina reage com aspartato pela ação da enzima argininosuccinato

sintetase (3) e forma o arginino-succinato, o qual é clivado pela enzima

27

argininosuccinato liase (4) para formar arginina e fumarato. Por fim, a enzima

arginase (5) hidrolisa a arginina, produzindo ureia e ornitina (NELSON; COX, 2011).

Figura 1: Representação esquemática do ciclo da ureia.

Fonte: Adaptado Esper; Noriega; García (2008).

3.3 Citrulinemia

A Citrulinemia é decorrente do acúmulo de citrulina no fluido corporal,

causado por uma deficiência na atividade da enzima argininosuccinato sintetase

(ASS), enzima 3 na figura 1, responsável por catalisar a formação de

argininosuccinato a partir de citrulina e aspartato. Classificada em duas formas de

acordo com a patogênese (GAO et al., 2003): Citrulinemia Tipo I (CTLN1) com

deficiência da enzima ASS (CTLN1 anormalidade no gene ASS em cromossomo

9q34.1) e outra de Citrulinemia Tipo II (CTLN2) caracterizada por mutações de

citrina codificadas por SLC25A13 no cromossoma 7q21.3 (GAO et al., 2003).

3.3.1 Citrulinemia Tipo I

A Citrulinemia Tipo I (CTLN1) foi descrita pela primeira vez por McMurray et

al. (1963), é um raro distúrbio metabólico caracterizado por morbidade neurológica

grave associada à hiperamonemia (PEREZ et al., 2010).

28

A CTLN1 é descrita como um distúrbio hereditário do ciclo da ureia associado

com a deficiência da enzima ASS (KENNAWAY et al., 1975; QUINONEZ; THOENE,

2004). Esta deficiência enzimática resulta em níveis elevados de citrulina no plasma,

e também aumento nos níveis de amônia e glutamina e depleção de arginina

(MAESTRI; CLISSOLD; BRUSILOW, 1995).

As alterações metabólicas do ciclo da ureia ocorrem em 1:30.000 - 46.000

nascidos vivos, dentre elas está a citrulinemia, sendo considerada uma patologia

rara, com incidência estimada de 1:57.000 nascidos vivos (QUINONEZ; THOENE,

2004; RAIMANN et al., 1994; SUMMARA et al., 2013).

A CTNL1 é herdada de maneira autossômica recessiva, é desenvolvida nos

primeiros dias de vida e ocasiona em alta mortalidade infantil (QUINONEZ;

THOENE, 2004; SUGAWARA et al., 2018). A morbidade dos pacientes com DCU

tem sido associada à duração do coma hiperamonêmico e não à deficiência

enzimática específica que causa a hiperamonemia (BRENINGSTALL, 1986).

A amônia é um constituinte normal do nosso organismo, porém em excesso

é uma toxina metabólica com efeito potente sobre a função do sistema nervoso

central (BRENINGSTALL, 1986). A disfunção do sistema nervoso central causada

por este transtorno pode ser intensa, dessa forma, o diagnóstico precoce, bem como

o conhecimento de ciclo metabólico e mecanismos fisiopatológicos são

indispensáveis para estabelecer um tratamento apropriado ao paciente

(BRENINGSTALL, 1986; ESPER; NORIEGA; GARCÍA, 2008).

3.3.1.1 Descrição Clínica

A distinção entre as formas clínicas da CTLN1 é baseada em achados

clínicos, onde uma delas se apresenta como a forma aguda neonatal (conhecida

como a forma "clássica"). A outra classificação dessa patologia é caracterizada na

idade mais avançada, onde os indivíduos apresentam sintomas iniciais mais leves,

podendo agravar posteriormente. Por último, foi encontrado na literatura outra forma

clínica, em que as mulheres têm início dos sintomas durante a gravidez ou após o

parto (QUINONEZ; THOENE, 2004).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/n/gene/glossary/def-item/autosomal-recessive/

29

Neonatal (Forma “clássica”):

O bebê nasce com características aparentemente normais ao nascimento,

porém após 12 a 48 horas, a criança torna-se progressivamente mais letárgica, se

alimenta mal, pode vomitar, desenvolver sinais de aumento da pressão

intracraniana, apresentar convulsões, dificuldade respiratória e deterioração

progressiva da consciência que pode evoluir para o coma (QUINONEZ; THOENE,

2004; RAIMANN et al., 1994). De acordo com a literatura, as crianças que

apresentaram comprometimento cognitivo tinham um pico de concentração

plasmática de amônia superior a 480 µmol / L ou uma concentração inicial de

amônia plasmática superior a 300 µmol / L (QUINONEZ; THOENE, 2004).

A hiperamonemia e o acúmulo de outros metabólitos tóxicos, como a

glutamina, acarretam em aumento da pressão intracraniana, aumento do tônus

neuromuscular, espasticidade, convulsões, perda de consciência e morte, quando

não ocorre intervenção imediata (BRENINGSTALL, 1986; QUINONEZ; THOENE,

2004). Na citrulinemia clássica tipo I a maior sobrevida de uma criança não tratada é

de 17 dias (QUINONEZ; THOENE, 2004).

As anormalidades metabólicas cerebrais observadas no cenário clínico da

fase neonatal incluem distúrbios no metabolismo energético cerebral, como na via

da glicose, ciclo do ácido cítrico, metabolismo dos aminoácidos e estado redox

mitocondrial (CLANCY; CHUNG, 1991).

Forma não clássica:

A forma não clássica ocorre numa idade mais avançada em comparação a

forma clássica, e apresenta variantes patogênicos específicos da ASS. Os sintomas

nessa forma são mais sutis, incluindo dor de cabeça, escotomas, episódios tipo

enxaqueca, ataxia, fala arrastada, letargia e sonolência, e sem intervenção imediata

ocorre aumento da pressão intracraniana, com aumento do tônus neuromuscular,

espasticidade, convulsões e pode levar a morte (QUINONEZ; THOENE, 2004).

Indivíduos assintomáticos ou com citrulinemia leve também foram detectados

através de programas de triagem neonatal e estudos envolvendo familiares

(HÄBERLE et al., 2002; ISSA; YADAV; TEEBI, 1988; SANDER et al., 2003).

No caso relatado por Issa; Yadav; Teebi (1988), o indivíduo nos primeiros 18

meses de vida apresentou atraso no desenvolvimento psicomotor, onde letargia e os

30

episódios de confusão eram muito frequentes. Depois desenvolveu episódios breves

de coma, irritabilidade extrema e ataques breves de convulsões generalizadas

(ISSA; YADAV; TEEBI, 1988).

De acordo com um relato descrito por Brunetti-Pierri et al. (2012), um

indivíduo com citrulinemia clássica de início neonatal desenvolveu cardiomiopatia

hipertrófica progressiva e cataratas. Apesar do tratamento com dieta com restrição

proteica, suplementação de arginina e benzoato de sódio, ele experimentou

episódios repetidos de hiperamonemia devido a intercorrências da doença ou má

alimentação na dieta (BRUNETTI-PIERRI et al., 2012; QUINONEZ; THOENE, 2004).

De acordo com Quinonez; Thoene (2004), nenhum indivíduo diagnosticado com

CTLN1 clássica foi identificado com achados semelhantes, onde a necessidade de

vigilância permanece controversa até que mais indivíduos diagnosticados tenham

sido estudados.

Por fim, a mulher diagnosticada com CTLN1 também pode ter o início dos

sintomas da doença durante a gestação ou após o parto. De acordo com Potter et al.

(2004), uma mulher que foi identificada com CTLN1 através da triagem neonatal,

permaneceu assintomática por toda a vida, submetida a duas gestações bem-

sucedidas. De forma controversa, conforme relatado por Ito et al. (2004), uma

paciente com CTLN1 desenvolveu insuficiência hepática fulminante durante a

gravidez. A paciente havia experimentado ocasionalmente dor de cabeça, tontura e

distúrbios da consciência, posteriormente apresentou disfunção hepática grave, com

hiperamonemia. Sua condição permaneceu estável por um tempo; no entanto, sua

insuficiência hepática piorou gradualmente, e ela faleceu oito meses depois (ITO et

al., 2004).

3.3.1.2 Diagnóstico

O diagnóstico da CTLN1 nos dados laboratoriais é estabelecido pela análise

quantitativa de aminoácidos no plasma, revelando a ausência de argininossuccinato,

concentração plasmática de citrulina geralmente superior a 1.000 umol / L (normal:

31

A atividade da enzima ASS pode ser medida em fibroblastos, fígado e em

todos os demais tecidos em que a enzima está expressa, sendo que na citrulinemia

esta estará reduzida (QUINONEZ; THOENE, 2004). Mesmo a atividade enzimática

podendo ser detectada em muitos tecidos, é mais alta no fígado (HÄBERLE et al.,

2002). O ensaio da ASS através de método indireto em fibroblastos de pele cultivada

é um método sensível e conveniente opção para confirmar a deficiência dessa

enzima na citrulinemia clássica e, também para casos leves e assintomáticos de

citrulinemia (HÄBERLE et al., 2002).

3.3.1.3 Tratamento

Com relação ao tratamento, a CTLN1 exige uma vigilância a longo prazo com

diligente manejo nutricional e farmacológico, incluindo restrição proteica,

suplementação com L-arginina e de benzoato de sódio e/ou fenilbutirato para

aumentar a excreção de nitrogênio (BATSHAW; MACARTHUR; TUCHMAN, 2001;

HÄBERLE et al., 2012; QUINONEZ; THOENE, 2004).

Quando a hiperamonemia é identificada ou suspeita, deve-se suspender a

ingestão de proteínas por um período máximo de 24 a 48 horas (QUINONEZ;

THOENE, 2004). Esse período de restrição permite que a concentração de amônia

no plasma seja reduzida por meio de terapia de eliminação de nitrogênio e / ou

diálise, evitando um estado catabólico (QUINONEZ; THOENE, 2004).

A única terapia curativa conhecida é o transplante hepático, onde elimina a

necessidade de restrição proteica na dieta, porém não reverte qualquer sequela

neurológica que os indivíduos afetados possam ter no momento do transplante

(QUINONEZ; THOENE, 2004). O transplante hepático, que visa salvar a vida do

paciente, é recorrido quando o distúrbio progride para falência de órgãos e para

curar o defeito metabólico subjacente (KAYLER et al., 2002).

Em um estudo de Bindia; Eiroa (2017) foi relatado um caso de insuficiência

hepática recorrente em um lactente diagnosticado com CTNL1, sem a presença de

comprometimento neurológico grave.

3.4 Antioxidantes

A produção imoderada de radicais livres durante os processos metabólicos no

organismo levou ao desenvolvimento de muitos mecanismos de defesa antioxidante

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/n/gene/glossary/def-item/affected/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/n/gene/glossary/def-item/affected/

32

para limitar os níveis intracelulares e impedir a indução de danos. O sistema de

defesa antioxidante tem a função de inibir e/ou reduzir os danos causados pela ação

deletéria dos radicais livres (BARBOSA et al., 2010; BIANCHI; ANTUNES, 1999).

Os antioxidantes são substâncias que neutralizam os radicais livres, evitando,

assim, o dano oxidativo. Dois grupos principais de antioxidantes são reconhecidos:

enzimáticos e não enzimáticos (NDHLALA; MOYO; STADEN, 2010). Os

antioxidantes produzidos pelo corpo agem enzimaticamente, a exemplo da

Superóxido Dismutase (SOD), Glutationa Peroxidase (GSH-Px), Catalase (CAT),

Glutationa redutase (GR); ou, não enzimaticamente, como a glutationa, ubiquinona

(Coenzima Q10) e ácido úrico. Como antioxidantes também ressalta-se compostos

obtidos diretamente da dieta, tais como -tocoferol (Vitamina E), β-caroteno (pro-

vitamina-A), ácido ascórbico (vitamina C), e compostos fenólicos onde se destacam

os flavonoides e poliflavonoides (BARREIROS; DAVID, 2006; VASCONCELOS et

al., 2007).

Os polifenóis são do grupo dos flavonoides e constituem um grupo

heterogêneo, composto de várias classes de substâncias com propriedade

antioxidante. Essas substâncias estão presentes em vários alimentos e bebidas

(FRANKEL; WATERHOUSE; TEISSEDRESPT, 1995). Dentre os polifenóis destaca-

se o resveratrol que é produzido por várias plantas, principalmente uva e seus

derivados (FRÉMONT, 2000).

3.4.1 Resveratrol

O resveratrol (3,4',5-tri-hidroxiestilbeno) encontra-se nas formas cis e trans

isomérica (FRÉMONT, 2000; GAMBINI et al., 2015). Os isômeros cis e trans

coexistem nas plantas e no vinho, porém o cis-resveratrol nunca foi encontrado no

extrato de uva, sendo o trans a forma mais predominante e mais natural (GAMBINI

et al., 2015).

O resveratrol é uma fitoalexina do grupo dos polifenóis produzida

principalmente nos vegetais, em especial, em uva e seus derivados (FRÉMONT,

2000). Essa fitoalexina tem atraído interesse devido sua ação para o tratamento da

hiperlipemia (ARICHI et al., 1980). Esse antioxidante tem sido identificado em 72

33

espécies de plantas distribuídas em 31 gêneros e 12 famílias, muitas incluídas na

dieta humana como amoras, amendoins e uvas (ACQUAVIVA et al., 2002).

Estudos mostram que o resveratrol pode prevenir ou diminuir o avanço

patológico de diversas doenças, como: cardiovasculares (BRADAMANTE;

BARENGHI; VILLA, 2004), neurodegenerativas (ZAMIN et al., 2006), cancerígenas

(ATHAR et al., 2007; JANG et al., 1997), e que possui propriedades anti-

inflamatórias e antioxidantes (FILIP et al., 2003; KIRIMLIOGLU et al., 2007).

O resveratrol demonstrou modular o metabolismo dos lípidos e inibir a

oxidação de lipoproteínas, além de fornecer proteção cardiovascular, e também

possuir propriedades anti-inflamatórias e anticancerígenas (FRÉMONT, 2000). O

papel do resveratrol como fitoalexina é razão suficiente para se interessar por seu

estudo, e os recentes experimentos de transferência de genes já descritos apontam

para uma importante via de aplicações futura (SOLEAS; DIAMANDIS; GOLDBERG,

1997).

3.5 Metabolismo energético

O metabolismo energético é a soma de todas as reações químicas que

ocorrem em nível celular ou no organismo (NELSON; COX, 2011). Ele pode ser

divido em reações catabólicas, reações que produzem energia através da quebra de

biomoléculas, e em anabólicas, reações que utilizam energia e convertem em

biomoléculas maiores (SILVERTHORN, 2003).

Para produção de energia, o metabolismo utiliza três vias metabólicas, são

elas: sistema fosfogênico; glicólise e sistema oxidativo, sendo principal substância

intracelular usada como fonte de energia o trifosfato de adenosina, conhecido como

ATP (GUYTON, 2011; TIRAPEGUI, 2012).

A energia utilizada para a síntese de ATP é proveniente da degradação da

glicose, dos ácidos graxos e dos aminoácidos de fontes alimentares. Essas

substâncias alimentares reagem quimicamente com o oxigênio, sob influências

enzimáticas que controlam a intensidade e a velocidade das reações, liberando

energia (GUYTON, 2011).

A ATP é formada a partir de uma molécula de adenina e de ribose,

denominada adenosina, unida a três fosfatos. O difosfato de adenosina (ADP) é

34

formado quando a ATP liga-se à água, catabolizada pela enzima adenosina

trifosfatase (ATPase), clivando a ligação fosfato para liberar o fosfato inorgânico (Pi)

+ energia, como mostra a Figura 2 (MCARDLE; KATCH; KATCH, 2013).

Figura 2: Hidrólise da ATP: ATP - Adenosina trifosfato; ADP - Adenosina difosfato; Pi - Fósfato inorgânico.

Fonte: Adaptado de Nelson; Cox, (2011).

Essa reação gera uma quantidade significativa de energia, o que faz a ATP

ser um composto de fosfato de alta energia, porém as células contém uma

quantidade limita de ATP e, portanto, terão que ressintetizá-la continuamente,

conforme sua necessidade de utilização (MCARDLE; KATCH; KATCH, 2013;

POWERS; HOWLEY, 2005).

3.5.1 Sistema ATP-PCr

Essa fonte de energia é encontrada no estoque intramuscular na forma de

ATP e fosfocreatina (PCr), que juntos são denominados como sistema fosfogênico

(Sistema ATP-PCr). Tem como característica principal a energia imediatamente

disponível para o músculo, graças a ação altamente energética da PCr (MAUGHAN;

GLEESON; GREENHAFF, 2000; TIRAPEGUI, 2012).

O sistema ATP-PCr é o primeiro a ser ativado para reposição de ATP,

entretanto os estoques celulares de PCr são limitados, suprindo as células com

energia somente nos primeiros segundos de uma atividade física, onde não há

formação de ácido lático (TIRAPEGUI, 2012).

A utilização de energia das ligações fosfato na ATP e na PCr são

responsáveis em proporcionar fontes anaeróbicas de energia. A Figura 3 ilustra

esquematicamente o sistema ATP-PCr, onde a PCr doa, via hidrólise catalisada pela

enzima creatina-quinase, um grupo fosfato para a ADP, transformando-o em ATP e

35

se tornando uma molécula de creatina (GUYTON, 2011; MCARDLE; KATCH;

KATCH, 2013).

Figura 3: Hidrólise da fosfocreatina para geração de ATP. PCr – Fosfocreatina; ADP – Adenosina Difosfato; ATP – Adenosina trifosfato; Cr – Creatina.

Fonte: Adaptado de Mcardle; Katch; Katch, (2013).

Dados mostram que as células armazenam 4 a 6 vezes mais PCr do que

ATP, que a reação não necessita de oxigênio e alcança uma produção máxima de

energia em cerca de 10 segundos (MCARDLE; KATCH; KATCH, 2013).

3.5.2 Glicólise

A via catabólica central é ligada a uma série de reações que converte a

molécula de glicose (C6H12O6), sob ações enzimáticas, em piruvato, e esse conjunto

de processos é denominado Glicólise, via independente de oxigênio, que por esse

fato garante a síntese rápida de ATP (SILVERTHORN, 2003; TIRAPEGUI, 2012). A

Glicólise ocorre no meio aquoso da célula, fora da mitocôndria (MCARDLE; KATCH;

KATCH, 2013).

Essa via representa a segunda fonte energética predominante a ser

utilizada após o inicio de uma atividade física (TIRAPEGUI, 2012). Como

mencionado anteriormente, o ponto final da glicólise é o piruvato, que representa um

metabólito de cruzamento que pode ser reduzido para formar lactato ou oxidado a

CO2 e H2O, dependendo do nível de energia e condições da célula (CABRERA;

SAIDEL; KALHAN, SATISH, 1999).

Essa via metabólica é divida em duas fases, conforme Figura 4, fase de

preparação (investimento energético) e fase de pagamento (geração de energia). Na

primeira fase é gasto duas moléculas de ATP onde a glicose é convertida através de

cinco passos enzimáticos, em duas moléculas de glicerol-3-fosfato. Na fase seguinte

são geradas quatro moléculas de ATP e duas nicotinamida adenina dinucleotídeo

(NADH), através de cinco passos enzimáticos (TIRAPEGUI, 2012).

36

Figura 4: Via Glicolítica.

Fonte: Adaptado de Tirapegui, (2012).

De acordo com a Figura 4, a via Glicolítica é regulada por reações

enzimáticas, que são responsáveis em regular o fluxo de substratos, são elas:

hexoquinase (1) , fosfofrutoquinase-1 (2) e piruvato quinase (3) (TIRAPEGUI, 2012).

A enzima hexoquinase é responsável pela ativação da glicose para reações

subsequentes, formando glicose-6-fosfato, uma reação irreversível em meio

intracelular. A enzima fosfofrutoquinase-1 forma frutose-1,6-bifosfato por catalisar a

transferência de um grupo fosforil do ATP para a frutose-6-fosfato. A última etapa

reguladora da glicólise é catalisada pela enzima piruvato quinase que transfere o

grupo fosforil do fosfoenolpiruvato ao ADP, com a formação de ATP e de piruvato

(MAUGHAN; GLEESON; GREENHAFF, 2000; NELSON; COX, 2011).

A via Glicolítica, como dito anteriormente, é considerada uma via

independente de oxigênio (O2), visto como uma reação anaeróbica, liberando cerca

de 5% apenas de energia existente dentro da molécula de glicose (MCARDLE;

KATCH; KATCH, 2013).

37

3.5.3 Ciclo do Ácido Cítrico (Ciclo de Krebs)

Proposto por Hans Adolf Krebs em 1937 (AKRAM, 2014), o Ciclo do Ácido

Cítrico (CAC) é a principal via metabólica e a via final para oxidação de carboidratos,

gorduras e aminoácidos. O ciclo consiste em oito reações enzimáticas, conforme

visto na Figura 5, resultando na formação de dióxido de carbono (CO2), trifosfato de

guanosina (GTP) e equivalentes redutores na forma de nicotinamida adenina

dinucleotídeo (NADH) e flavina adenina dinucleotídeo (FADH2) (BOWTELL et al.,

2007). A extração de energia da via Glicolítica para o ciclo de Krebs ocorre quando o

piruvato é transformado irreversivelmente em acetilcoenzima A (acetil-CoA), onde

esse composto é responsável pelo inicio do segundo estágio do fracionamento de

glicose (MCARDLE; KATCH; KATCH, 2013).

Figura 5: Ciclo do Ácido Cítrico.

Fonte: Adaptado de Tirapegui, (2012).

O inicio das reações do CAC (ver Figura 5) é através da condensação do

acetil-CoA e oxaloacetato para formação de citrato, através da enzima citrato-sintase

(1). Em seguida a enzima aconitase (2) catalisa a isomerização do citrato em

isocitrato. A terceira etapa do ciclo é catalisada pela enzima isocitrato-desidrogenase

(3), a qual é responsável pela descarboxilação oxidativa do citrato para formar -

cetoglutarato e NADH. Em seguida é realizado outra descarboxilação oxidativa,

38

onde o composto -cetoglutarato é convertida em succinil-CoA e CO2 pela ação do

complexo -cetoglutarato-desidrogenase (4), sendo formado outro NADH. A quinta

etapa do ciclo é a clivagem de succinil-CoA em succinato, realizada pela enzima

succinil-CoA-sintetase (5) ou succinato-tiocinase (5). Após a formação do succinato,

ocorre sua oxidação à fumarato sob ação da flavoproteína succinato-desidrogenase

(6), formando também flavina-adenina dinucleotído reduzida (FADH2). Na penúltima

etapa do ciclo, a fumarase (7) catalisa a hidratação reversível do fumarato à malato.

Finalizando o CAC, a L-malato-desidrogenase (8), ligada ao NAD, catalisa a

oxidação de malato à oxalacetato, formando também NADH (AKRAM, 2014;

NELSON; COX, 2011).

Durante cada volta completa do ciclo formam-se três moléculas de NADH e

uma de FADH2 (MAUGHAN; GLEESON; GREENHAFF, 2000; POWERS; HOWLEY,

2005). O CAC é também responsável pela formação de um composto rico em

energia, a trifosfato de guanosina (GTP) (POWERS; HOWLEY, 2005).

A GTP é um composto que tem a permissão de transferir um fosfato para o

ADP e por consequência formar ATP. A formação direta dessa energia é

denominada fosforilação do substrato, porém é responsável pela menor parte de

formação de energia, uma vez que a parte principal de produção de energia é

decorrente da formação de NADH e FADH2 (POWERS; HOWLEY, 2005).

Como observado anteriormente na descrição do CAC, o oxigênio molecular

não participa ativamente desse processo, sendo o principal objetivo do CAC gerar

carreadores de elétrons como o NADH e FADH2, que posteriormente serão oxidados

para transferir elétrons para a cadeia de transporte de elétrons para formação de

ATP (MAUGHAN; GLEESON; GREENHAFF, 2000; POWERS; HOWLEY, 2005).

3.5.4 Cadeia de Transporte de Elétrons

Na Via Glicolítica, a presença de O2 determina o destino do produto final :

ácido pirúvico ou piruvato. Com o oxigênio, esse ácido é convertido em Acetil-CoA.

O Acetil-CoA entra no CAC, onde passa por uma série complexa de reações

químicas que permite a oxidação desse composto, sendo degradado em dióxido de

carbono (CO2) e hidrogênio (H+). Após, no final da cadeia, o H+ proveniente da

oxidação do NADH e FADH2 combina-se com o O2 para formar H2O e, dessa forma

39

impede a oxidação. Os elétrons que foram separados do H passam por uma série de

reações denominada cadeia de transporte de elétrons (WILMORE; COSTILL, 2001).

Na mitocôndria, com a presença de oxigênio, ocorre a produção de ATP,

denominada Fosforilação Oxidativa, que ocorre atrelada à cadeia de transporte de

elétrons, através da geração de um gradiente de prótons e de pH (ver representação

na Figura 6). A produção de ATP ocorre graças a um mecanismo que usa energia

disponível dos transportadores de hidrogênio reduzidos, como NADH e FADH2. Os

elétrons removidos dos átomos de hidrogênio são transportados pela cadeia de

transporte de elétrons, e durante essa processo é gerado energia suficiente para

refosforilar ADP em ATP (POWERS; HOWLEY, 2005).

Figura 6: Representação de transporte de elétrons.

Fonte: Adaptado de Wilmore; Costill, (2001).

Como mostra na Figura 6, a produção final de energia proveniente de uma

molécula de glicose, incluindo glicólise, CAC e cadeia respiratória é de 30 ou 32

moléculas de ATP. A quantidade de ATP produzida depende do tipo do sistema de

lançadeira que transfere equivalente redutores na mitocôndria, sendo de 32

moléculas de ATP, quando é utilizada a lançadeira malato-aspartato, é de 30

moléculas de ATP, ao utilizar a lançadeira glicerol fosfato (POWERS; HOWLEY,

2005).

40

Os carregadores de elétrons são oxidados e transferem elétrons para

complexos supramoleculares inseridos na membrana mitocondrial interna. Esse

processo compreende quatro complexos proteicos, todos responsáveis de catalisar

a transferência de elétrons, são eles: complexos proteicos (I, II, III, IV), que

trabalham uns com os outros através da ubiquinona (Q) e da proteína citocromo c

(MILLAR et al., 2011; NELSON; COX, 2011).

Complexo I

O Complexo I é também conhecido como NADH ubiquinona oxidorredutase,

tem a função de transferir quatro prótons da matriz para o espaço intermembrana e

também de transferir energia química para a Q (NELSON; COX, 2011). É

considerada a maior proteína do complexo, representa um local de entrada para

elétrons na cadeia de transporte de elétrons (KLODMANN et al., 2010).

Figura 7: Reação do Complexo I.

Fonte: Adaptado de Nelson; Cox, (2011).

A Figura 7 resume a expressão do Complexo I, ilustra NADH sendo oxidado

para formar Ubiquinol (QH2), através da utilização da energia da transferência de

elétrons, onde a reação que ele catalisa é vetorial: movendo prótons da matriz

(tornando negativamente carregada com a saída de prótons) ao espaço

intermembrana (tornando positivamente carregado) (NELSON; COX, 2011).

Complexo II

A succinato-desidrogenase (SDH) é a única enzima do CAC ligada à

membrana. A SDH é uma das enzimas que compõem o CAC, responsável pela

oxidação do succinato à fumarato (HEAZLEWOOD; HOWELL; MILLAR, 2003;

NELSON; COX, 2011).

41

A ação da SDH resulta na formação de FADH2 no Complexo II, os dois

elétrons do FADH2 são transferidos diretamente para a Q, formando nesse processo,

o QH2, de acordo com a Figura 8 (EUBEL; JÄNSCH; BRAUN, 2003; NELSON;

COX, 2011).

Figura 8: Reação do Complexo II.

Fonte: Adaptado de Nelson; Cox, (2011).

O Complexo II é formado por subunidades A e B, que contém três centros

2Fe-2S (2 ferros - 2 enxofres), FAD ligado e um sítio de ligação para o substrato, o

succinato. Também pelas subunidades C e D, contendo um grupo heme, heme b, e

um sítio de ligação para ubiquinona. O grupo heme b do Complexo II serve para

reduzir a frequência com que os elétrons migram para fora do sistema, reduzindo

assim a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), como o H2O2, e o O2o-

(NELSON; COX, 2011).

Complexo III

O Complexo III é também chamado de ubiquinona ou citocromo c

oxidorredutase e é responsável pela transferência de elétrons do ubiquinol (QH2)

para o citocromo c, com o transporte vetorial de prótons da matriz para o espaço

intermembrana (NELSON; COX, 2011). No total esse complexo transporta quatro

elétrons provenientes de duas moléculas de QH2 (SWEETLOVE et al., 2010).

Com base na estrutura e funcionalidade do Complexo III foi proposto para a

passagem de elétrons e prótons o ciclo Q, onde a equação resultante para as

reações redox é representada pela Figura 9 abaixo (NELSON; COX, 2011).

Figura 9: Reação do Complexo III.

Fonte: Adaptado de Nelson; Cox, (2011).

42

O ciclo Q é responsável por acomodar a troca entre carregador de dois

elétrons ubiquinona e os carregadores de um elétron, citocromo c1 e c, onde o efeito

resultante de transferência é que QH2 é oxidado a Q, e duas moléculas de citocromo

c são reduzidas (NELSON; COX, 2011).

O citocromo c é uma proteína solúvel do espaço intermembrana. Sua principal

função é transferir os elétrons do Complexo III para o complexo IV, ou seja, não faz

parte de nenhum complexo da cadeia respiratória em particular (NELSON; COX,

2011; SWEETLOVE et al., 2010).

Complexo IV

O Complexo IV é designado também por citocromo-oxidase ou citocromo c

oxidase, representa a etapa final da cadeia respiratória. É uma enzima grande (13

subunidades) da membrana mitocondrial interna, traduzida por dois citocromos com

grupos heme (citocromos a e a3), e dois centros contendo cobre (CuA e CuB)

(NELSON; COX, 2011).

O Complexo IV inicia com o citocromo c, onde duas moléculas desse

citocromo reduzido doam um elétron para o centro CuA. O oxigênio liga-se ao heme

a3 e é reduzido a seu derivado peróxido. A chegada de mais dois elétrons a partir do

citocromo c converte em duas moléculas de água com o consumo de quatro prótons

da matriz (NELSON; COX, 2011).

Simplificando, a função do complexo IV é transferir os elétrons do citocromo

c para o oxigênio molecular, reduzindo-o à água, criando um gradiente eletroquímico

que é utilizado para sintetizar o ATP (MILLAR et al., 2004; PEIFFER; INGLE;

FERGUSON-MILLER, 1990).

O resumo do fluxo de elétrons e prótons através dos quatro complexos se

inicia com os elétrons chegando a Q através dos Complexos I e II, em seguida a Q

reduzida (QH2) transfere elétrons para o Complexo III que transfere ao citocromo c.

O Complexo IV reduz o O2 em H2O através da transferência de elétrons do

citocromo c. O fluxo de elétrons através dos Complexos I, III e IV é acompanhada

pela cadeia de prótons da matriz ao espaço intermembrana (NELSON; COX, 2011).

43

Figura 10: Cadeia de Transporte de elétrons.

Fonte: Adaptado de Nelson; Cox, (2011).

Na Figura 10, pode-se observar a representação esquemática da cadeia

transportadora de elétrons, onde mostra os Complexos I, III e IV, responsáveis por

bombear os H+ para o espaço intermembrana; o Complexo II (proteína de

membrana) e Q (Coenzima Q ou Ubiquinona), responsável por transportar elétrons

dos Complexos I e II ao Complexo III; Cit c (Citocromo c), responsável por

transportar os elétrons do Complexo III ao Complexo IV e, por último, a enzima ATP

sintetase, responsável por fosforilar o ADP em ATP (POWERS; HOWLEY, 2005).

3.5.5 Fosforilação Oxidativa

O sistema oxidativo, conhecido também como fosforilação oxidativa, é a via

metabólica mais duradoura e eficiente, podendo utilizar diferentes substratos

energéticos como, glicose, ácidos graxos e aminoácidos. Única via dependente de

oxigênio, por esse fato se torna um processo relativamente lento e o último a ser

requisitado para geração de energia (TIRAPEGUI, 2012).

Esse sistema de produção de energia celular é muito mais eficiente que o

sistema independente de oxigênio. A energia liberada na glicólise é rápida e não

requer oxigênio, porém relativamente pouco ATP é ressintetizado por esse

mecanismo. Consequentemente, as reações dependentes de oxigênio proporcionam

maior produção de energia apesar do ciclo para essa produção ser mais lento

(WILMORE; COSTILL, 2001).

44

Quando falamos de sistema oxidativo, logo pensamos em oxidação celular,

onde as reações de oxidação significam remoção de elétron e redução quando

aceitam elétrons. A formação de ATP ocorre durante as reações de oxidação e

redução (MCARDLE; KATCH; KATCH, 2013).

A fosforilação oxidativa sintetiza ATP pela transferência de elétrons de NADH

e FADH2, bombardeando os prótons através da membrana mitocondrial interna para

dentro do espaço intermembrana, tornando possível o mecanismo de acoplamento

que une ADP e um Pi para sintetizar ATP, e assim liberando energia (MCARDLE;

KATCH; KATCH, 2013).

45

4 INTERDISCIPLINALIDADE

Ao estudar a Citrulinemia, verifica-se a relação dessa doença com a saúde e

o meio ambiente, e o quanto esse pode ser afetado, seja direta ou indiretamente. O

presente estudo de Erro Inato do Metabolismo, abordando a patologia Citrulinemia,

relata uma doença genética hereditária (BICKEL, 1987; QUINONEZ; THOENE,

2004), que pode acometer membros de uma mesma família. Essa patologia pode

causar alterações cerebrais (CLANCY; CHUNG, 1991; MAESTRI; CLISSOLD;

BRUSILOW, 1995; QUINONEZ; THOENE, 2004) que acabam interferindo na relação

do indivíduo com membros da sociedade e com o ambiente de trabalho,

minimizando suas possibilidades de renda. Apresenta também risco de morte ao

nascer (BRENINGSTALL, 1986; CLANCY; CHUNG, 1991; QUINONEZ; THOENE,

2004), afetando a estrutura emocional da família.

Para trabalhar no tratamento dessa patologia, a presente pesquisa envolve o

estudo com o resveratrol, nesse sentido atrelada à diminuição do consumo de

fármacos usados até o momento para o tratamento da Citrulinemia, onde também

agridem o meio ambiente e causam efeitos indesejados aos pacientes. Esse

tratamento farmacológico usado atualmente, por consequência, tem gerado um

aumento de lixo industrial e tempo hospitalar, acarretando em uma crescente na

produção de lixo hospitalar. Além disso, o resveratrol poderá minimizar efeitos

indesejados da doença (ARICHI et al., 1980; FILIP et al., 2003; JANG et al., 1997;

KIRIMLIOGLU et al., 2007; ZAMIN et al., 2006) e melhorar a qualidade de vida do

indivíduo.

Com relação à economia, está relacionado ao aumento no consumo de fontes

de resveratrol (ACQUAVIVA et al., 2002), encontrada atualmente grande produção

de sua fonte no país, desencadeando uma melhora na economia do mesmo. Dessa

forma, o custo do tratamento da Citrulinemia seria mais acessível; além de poder

contribuir para uma diminuição no uso de serviços de saúde.

46

5 METODOLOGIA

5.1 Animais

Foram utilizados ratos machos Wistar de 60 dias de idade provenientes da

Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Antes do processo de

experimentação, os animais foram acomodados e aclimatados por sete dias, para

adaptação em um novo ambiente. Foram mantidos em salas com ciclo de 12h

claro/escuro à temperatura mantida entre 20-22°C com livre acesso à comida

(ração) e água. Os animais foram mantidos em número máximo de quatro por gaiola

contendo maravalha. A frequência de troca de caixas foi a cada 2 dias. Os cuidados

com os animais seguiram o disposto na Lei nº11.794, de 8 de outubro de 2008, e

nas demais normas aplicáveis à utilização de animais em ensino e/ou pesquisa,

especialmente as Resoluções Normativas do Conselho Nacional de Controle de

Experimentação Animal – CONCEA (BRASIL, 2008; MINISTÉRIO DA CIÊNCIA,

TECNOLOGIA).

As condições de ambiente, iluminação, acomodação e nutrição seguiram as

recomendações exigidas pelo “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,

1996”. A ração fornecida aos animais continha: proteína, 20%; carboidrato, 70%;

lipídeo, 10%; - (Nuvital Nutrientes, Curitiba-PR-Brazil).

5.2 Protocolo experimental

5.2.1 Estudos in vitro

Para estudos in vitro, estruturas cerebrais (córtex cerebral, cerebelo e

hipocampo) foram pré-incubadas por 1 hora a 37°C na presença de citrulina ou

amônia nas concentrações finais de 0.1, 2.5 e 5.0mM e 0.01, 0.1 e 1.0mM,

respectivamente, de acordo com o protocolo experimental de Prestes et al. (2006),

observe esquema na Figura 11. Experimentos de controle foram realizados com

solução salina. Neste estudo, as concentrações de L-citrulina foram utilizadas em

comparação com os valores observados em pacientes citrulinêmicos (ACHKAR et

al., 2013).

47

5.2.2 Prevenção com resveratrol

Para os experimentos in vitro, os ratos foram divididos em grupos: grupo 1

(controle-salina), grupo 2 (citrulina), grupo 3 (amônia), grupo 4 (controle-resveratrol

0.01 mM), grupo 5 (controle- resveratrol 0.1 mM), grupo 6 (controle- resveratrol 0.5

mM), grupo 7 (citrulina + resveratrol 0.01 mM), grupo 8 (citrulina + resveratrol 0.1

mM) e grupo 9 (citrulina + resveratrol 0.5 mM), grupo 10 (amônia + resveratrol 0.01

mM), grupo 11 (amônia + resveratrol 0,1 mM) e grupo 12 (amônia + resveratrol 0.5

mM), conforme ilustra da Figura 11. Após a adição dos compostos descritos acima,

os tubos de ensaio foram incubados por 1 hora a temperatura de 37C. Os

experimentos in vitro foram realizados com a utilização de hipocampo, córtex

cerebral e cerebelo de ratos.

As concentrações de resveratrol seguiram o protocolo descrito por Dos

Santos et al. (2006).

Figura 11: Protocolo do experimento in vitro.

Fonte: Dos Santos et al., (2006) e Prestes et al., (2006).

5.3 Estudos bioquímicos

5.3.1 Preparação do tecido

Os animais foram sacrificados por decaptação, o cérebro foi removido e o

córtex cerebral, o cerebelo e o hipocampo foram dissecados e mantidos em uma

placa de vidro gelada. As estruturas cerebrais foram homogeneizadas com tampão

adequado, de acordo com a técnica empregada. Homogeneizados foram preparados

48

usando um homogeneizador Potter-Elvehejem (Remi motores, Mumbai, Índia)

passando 5 pulsos, seguido de centrifugação a 3.000 x g por 15min a 4C antes de

descartar núcleos e restos celulares. O pellet foi descartado e o sobrenadante foi

guardado em alíquotas e armazenado a −80C para análise dos parâmetros do

metabolismo energético, conforme mostra o fluxograma na Figura 12.

Figura 12: Fluxograma de preparação do tecido.

Fonte: Elaborada pelo autor.

5.3.2 Atividade da Piruvato Quinase

A atividade da piruvato quinase foi determinada pelo método descrito por

Leong et al. (1981), conforme ilustra na Figura 13. O meio de incubação consistiu

em 0.1m de tampão Tris-HCl, pH 7.5, MgCl2 10.0 mM, NADH 0.16 mM, KCl 75 mM,

ADP 5.0 mM, 7,0 unidades de L-lactato desidrogenase, Triton X-100 a 0.1% (v / v) e

10 μL do sobrenadante, isento de mitocôndria, num volume final de 0.5 mL. A reação

foi iniciada após 30 min de pré-incubação pela adição de fosfoenolpiruvato 1.0 mM

(PEP). Os ensaios foram realizados à temperatura de 25ºC. Os resultados foram

expressos em μmol de piruvato formado por por minuto por miligrama de proteína.

49

Figura 13: Fluxograma da atividade da Piruvato Quinase.

Fonte: Leong et al., (1981).

5.3.3 Atividade da Citrato Sintase

A atividade da citrato sintase foi determinada pelo método descrito por Srere

(1969). De acordo com a metodologia ilustrada na Figura 14, adicionou-se 800 L

de tampão, 100 L de DTNB 1 mM, 40 L de acetil-CoA 2.5 mM, 10 L de triton 10%

e 10 L de amostra homogeneizada. Após aguardou-se dois minutos à temperatura

ambiente, adicionou-se 50 L de oxaloacetato 4 mM, homogeneizou-se e lêu-se em

espectrofotômetro durante três minutos no comprimento de onda de 412 nm.

Figura 14: Fluxograma da Atividade da Citrato Sintase.

Fonte: Srere (1969).

5.3.4 Atividade do Citocromo c oxidase

A atividade da citocromo c oxidase foi determinada pelo método descrito por

Rustin et al. (1994). De acordo com a ilustração da Figura 15, a atividade enzimática

50

foi medida observando a diminuição da absorvância devido à oxidação do citocromo

c previamente reduzido a 550 nm com 580 nm como comprimento de onda de

referência ( = 19,1 mM-1x cm-1). O tampão de reação continha 10.0 mM de fosfato

de potássio, pH 7.0, n-dodecil-β-D-maltosido 0.6 mM, 2-4 g de proteína

homogeneizada e a reação foi iniciada pela adição de 0.7 g de citocromo c

reduzido. A atividade da citocromo c oxidase foi medida a 25°C durante 10 min.

Figura 15: Fluxograma da atividade da citocromo c oxidase.

Fonte: Rustin et al. (1994).

5.3.5 Atividade do Complexo II e Succinato Desidrogenase

A atividade do Complexo II e da Succinato Desidrogenase (SDH) foram

determinadas pelo método descrito por Fischer et al. (1985), conforme Figura 16. As

dosagens foram realizadas em homogeneizados de cerebelo, córtex cerebral e

hipocampo, seguindo a diminuição da absorvância devido à redução de 2.6-

dicloroindofenol (DCIP) a 600 nm com 700 nm como comprimento de onda de

referência (= 19,1 mM-1 cm-1) na presença de metasulfato de fenazina (PMS). A

mistura da reação foi constituída por fosfato de potássio 40. 0 mM, pH 7.4, succinato

16.0 mM e DCIP 8 μM, foi pré-incubada com 40-80 g de proteína homogeneizada a

30°C durante 20 min. Posteriormente, para a atividade do complexo II, foi adicionado

azida sódica .,0 mM, rotenona a 7 μM e a reação foi iniciada pela adição de DCIP 40

μM e monitorizada durante 5 min. A atividade de SDH foi determinada no mesmo

meio de incubação por adição de PMS 1.0 mM e monitorizada durante 5 min.

51

Figura 16: Fluxograma da atividade do Complexo II e Succinato Desidrogenase.

.

Fonte: Fischer et al. (1985).

5.3.6 Dosagem de Proteínas

A determinação das proteínas foi realizada pelo método de Lowry et al. (1951)

conforme ilustração da Figura 17, utilizando-se albumina sérica bovina como

padrão.

Figura 17: Fluxograma da Dosagem de Proteínas.

Fonte: Lowry et al. (1951).

5.4. Análise estatística

A análise estatística dos resultados foi realizada por análise de variância

(ANOVA), uma via utilizando o programa IBM Statistical Package for the Social

Sciences (SPSS) for Windows version 20.0 in a PC compatible computer (IBM Corp.

Armonk, NY, USA).Foram considerados significativos valores de p

52

6 RESULTADOS E DISCUSSÕES

6.1 Artigo:

RESVERATROL EFFECTS ON CEREBRUM ENERGY METABOLISM

ALTERATIONS CAUSED BY METABOLITS ACUMULATTED IN TYPE I

CITRULLINEMIA IN RATS

Karine Louize Vincenzi1, Larissa Delmônego1, Aline Lima1; Thayná Patachini Maia2,

Luana Carla Pscheidt3, Débora Delwing-Dal Magro4, Daniela Delwing-de Lima1,2*

1 Programa de Pós-Graduação em Saúde e Meio Ambiente, Universidade da Região

de Joinville– UNIVILLE, Rua Paulo Malschitzki,10- Zona Industrial Norte, CEP

89201-972, Joinville, SC, Brazil.

2Departamento de Medicina, Universidade da Região de Joinville– UNIVILLE, Rua

Paulo Malschitzki, 10- Zona Industrial Norte, CEP 89201-972, Joinville, SC, Brazil.

3Departamento de Farmácia, Universidade da Região de Joinville– UNIVILLE, Rua

Paulo Malschitzki, 10- Zona Industrial Norte, CEP 89201-972, Joinville, SC, Brazil.

4Departamento de Ciências Naturais, Centro de Ciências Exatas e Naturais,

Universidade Regional de Blumenau, Rua Antônio daVeiga,140,CEP 89012-900,

Blumenau, SC, Brazil.

*Address for correspondence: Dr. Daniela Delwing de Lima, Departamento de

Medicina, Universidade da Região de Joinville, Rua Paulo Malschitzki, 10 - Zona

Industrial Norte, CEP 89201-972, Joinville, SC, Brazil, Phone 55 47 3461 9112,

E-mail addresses daniela.delwing@univille.br; danidelwing@hotmail.com.

mailto:danidelwing@hotmail.com

53

ABSTRACT

We investigated the in vitro effects of citrulline (0.1, 2.5 and 5.0 mM), ammonia (0.01,

0.1 and 1.0 mM) and the influence of resveratrol (0.01 mM, 0.1 mM and 0.5 mM) on

pyruvate kinase, citrate synthase, succinate dehydrogenase (SDH), complex II and

cytochrome c oxidase in the cerebral cortex, cerebellum and hippocampus of 60 day-

old male Wistar rats. Results showed that 2.5 and 5.0 mM citrulline decreased

pyruvate kinase activity in the cerebral cortex and, at a concentration of 5.0 mM,

increased pyruvate kinase in the hippocampus. Additionally, 5.0 mM citrulline

increased citrate synthase in the cerebellum of rats. Citrulline (5.0 mM) reduced

complex II and cytochrome c oxidase in the cerebral cortex and hippocampus, but

did not alter SDH activity in any of the structures studied. With regard to ammonia, at

0.1 and 1.0 mM, ammonia decreased complex II activity in the cerebral cortex and

1.0 mM ammonia decreased this activity in the cerebellum and hippocampus.

Ammonia (1.0 mM) also decreased cytochrome c oxidase in the cerebral cortex and

cerebellum of rats, but did not alter pyruvate kinase, citrate synthase or SDH activity

in the cerebrum of rats. Resveratrol was able to prevent most of the alterations,

caused by these metabolites, in the biomarkers of energy metabolism measured in

the cerebrum of rats. Data suggest that these alterations in energy metabolism,

caused by citrulline and ammonia, are probably mediated by the generation of free

radicals, which can in turn be scavenged by resveratrol.

Keywords: Citrullinemia Type I; Citrulline; Ammonia; Energy metabolism;

Resveratrol.

54

1 INTRODUCTION

Citrullinemia Type I (CTLN1) is a rare hereditary urea cycle disorder,

characterized by deficiency in the activity of the enzyme, argininosuccinate

synthetase (ASS), which is responsible for catalyzing the formation of

argininosuccinate from citrulline and aspartate.1 This enzymatic deficiency results in

elevated plasma citrulline levels, as well as increased levels of ammonia and

glutamine and arginine depletion.2 Metabolic alterations of the urea cycle occur in 1:

30,000 live births and, among these, citrulinemia is considered a rare pathology with

an estimated incidence of 1: 57,000 live births.3,4 The most severe form of the

disease occurs in the neonatal period, with rapidly progressive encephalopathy and

death.5 The disease may also manifest later in childhood, with episodic

hyperammonemic encephalopathy and developmental delay.2,6 The accumulation of

ammonia in the blood and cerebrospinal fluid (CSF) can result in lethargy, vomiting,

irritability, decreased muscle tone, respiratory distress, cerebral edema,

hepatomegaly and seizures. If left untreated, CTLN1 may progress to coma, and

neurological abnormalities, and intellectual disability may also occur.7

According to Clancy and Chung,8 CTLN1 can lead to metabolic abnormalities in

the brain, including disturbances of cerebral energy metabolism, mitochondrial redox

state and amino acid metabolism. Furthermore, Prestres et al.9 reported that citrulline

and ammonia alter antioxidant capacity in the cerebral cortex of young rats, which

may reflect an involvement of oxidative stress in the neuropathology of citrullinemia.

However, the relationship between citrulline and the accumulation of ammonia in the

disease, and alterations in energy metabolism, are not well established. On the other

hand, studies have described reductions in brain ATP in adult animals exposed to

lethal doses of ammonium salts;10 furthermore, intoxication with high doses of

ammonia decreases concentrations of energy phosphates in the brain tissue of

mice11 and progressively decreases the activity of complex IV in the mitochondrial

respiratory chain.12

Resveratrol (3,5,4´ trihydroxystilbene) is a phytoalexin from the group of

polyphenols, and is produced mainly in plants, especially grapes and their

derivatives.13

Many studies have shown that resveratrol promotes mitochondrial

biogenesis, making cells more efficient in terms of energy production, and also

providing neuroprotective effects.14 Energy management may be affected by

55

mitochondrial imbalances caused by pathophysiological processes, such as oxidative

stress and/or inflammation. In this context, resveratrol, as a polyphenol, may exert

exogenous antioxidant/anti-inflammatory effects, modulating energy expenditure via

its action on AMP-activated protein kinase, therefore acting as an epigenetic

regulator or via regulation of the production of anti-inflammatory cytokines.15

Considering the rarity of urea cycle disturbances and the lack of scientific

studies of the pathogenesis of CTLN1, this study aimed to investigate the in vitro

effects of citrulline and ammonia and the influence of the antioxidant, resveratrol on

some parameters of energy metabolism in the cerebrum of 60-days-old Wistar rats.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1 Animals and Reagents

Adult male Wistar rats (60-days-old) obtained from the Federal University of

Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, Santa Catarina, Brazil, were used in the

experiments. Before the experiments, animals were accommodated and acclimatized

for 7 days, to adapt to their new environment. The animals were maintained on a 12

h light/12 h dark cycle at constant temperature (22 ± 1 °C), with free access to water

and commercial protein chow. The conditions of room lighting, accommodation and

nutrition followed the recommendations of the Guide for the Care and Use of

Laboratory Animals, 2011.16 Animal care followed the provisions of Law no. 11794

(October 8, 2008) and other regulations applicable to the use of animals in teaching

and/or research, especially the Normative Resolutions of the National Council for the

Control of Animal Experimentation – CONCEA.8

All chemicals were purchased from Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA.

The experimental protocol was approved by the Ethics Committee for Animal

Research of the University of Joinville Region, Joinville, Brazil, under the protocol

number 010/2016 – PRPPG/CEP.

2.2 Experimental Protocols

2.2.1 In vitro Studies

56

For in vitro studies, cerebral structures (cerebral cortex, cerebellum and

hippocampus) were pre-incubated for 1 h at 37°C in the presence of citrulline or

ammonia at final concentrations of 0.1, 2.5 and 5.0 mM and 0.01, 0.1 and 1.0 mM,

respectively, according to the experimental protocol of Prestes et al.9 Control

experiments were performed with saline. In this study, concentrations of L-citrulline

were physiologically comparable to values observed in citrullinemic patients.17

2.2.2 Resveratrol Treatment

The assays were divided into 12 groups: Group 1 (control-saline), group 2

(citrulline), L-citrulline added at the concentrations of 0.1, 2.5 and 5.0 mM; group 3

(ammonia), ammonia added at concentrations of 0.01, 0.1 and 1.0 mM; group 4

(control-0.01 mM resveratrol); group 5 (control-0.1 mM resveratrol); group 6 (control-

0.5 mM resveratrol); group 7 (citrulline + 0.01 mM resveratrol), in which L-citrulline

was added at concentrations of 0.1, 2.5 or 5.0 mM with 0.01 mM resveratrol; group 8

(citrulline + 0.1 mM resveratrol), in which L-citrulline was added at the concentrations

of 0.1, 2.5 or 5.0 mM with 0.1 mM resveratrol; group 9 (citrulline + 0.5 mM

resveratrol), in which L-citrulline was added at the concentrations of 0.1, 2.5 or 5.0

mM with 0.5 mM resveratrol; group 10 (ammonia + resveratrol 0.01 mM), in which

ammonia was added at concentrations of 0.01, 0.1 or 1.0 mM with 0.01 mM

resveratrol; group 11 (ammonia + resveratrol 0.1 mM), in which ammonia was added

at concentrations of 0.01, 0.1 or 1.0 mM with 0.1 mM resveratrol; and group 12

(ammonia + 0.5 mM resveratrol), in which ammonia was added at concentrations of

0.01, 0.1 or 1.0 mM with 0.5 mM resveratrol.

Following the addition of the compounds, as described above, test tubes were

incubated for 1 hour at 37°C. In vitro experiments were performed using the

hippocampus, cerebral cortex and cerebellum of rats. Concentrations of resveratrol

followed the protocol described by Dos Santos et al.18, Fig. 1.

2.3 Biochemical studies

2.3.1 Tissue preparation

After decapitation of rats, the cerebrum was removed, and the cerebral cortex,

cerebellum and hippocampus were dissected and kept on an ice-cooled glass plates.

57

The cerebral structures were homogenized with appropriate buffer, according to the

technique employed. Homogenates were prepared using a Potter-Elvehejem

homogenizer (Remi motors, Mumbai, India) by passing 5 pulses, followed by

centrifugation at 800 x g for 10min at 4C, before discarding nuclei and cell debris.

The pellet was discarded and the supernatant was stored in aliquots at −80C for

assaying parameters of energy metabolism.

2.3.2 Pyruvate kinase activity

Pyruvate kinase activity was assayed, essentially as described by Leong et al.19

The incubation medium consisted of 0.1 M Tris–HCl buffer, pH 7.5, 10.0 mM MgCl2,

0.16 mM NADH, 75 mM KCl, 5.0 mM ADP, 7.0 units of L-lactate dehydrogenase,

0.1% (v/v) Triton X-100, and 10 µL of mitochondria-free supernatant in a final volume

of 0.5 mL. After a pre-incubation 30 min of 37°C, the reaction was started by the

addition of 1.0 mM phosphoenolpyruvate (PEP). Results are expressed as

micromoles of pyruvate per minute per milligram of protein.

2.3.3 Citrate synthase activity

The activity of citrate synthase was determined by the method described by

Srere.20 Accordingly, 800 µL buffer (1M Tris-HCL, pH 8), 100 µL 1mM DTNB, 40 µL

2.5 mM acetyl-COA, 10 µL 10% Triton and 10 µL of homogenized sample were

added. After 2 minutes at room temperature, 50µL of oxaloacetate (4 mM) were

added and changes in absorbance were observed during 3 minutes at a wavelength

of 412 nm. Results are expressed as nanomoles of citrate per minute per milligram of

protein.

2.3.4 Respiratory chain enzyme activities

SDH and complex II activities: The activities of succinate: phenazine

oxyreductase (soluble SDH) and complex II (succinate: DCIP oxyredutase) were

determined, according to methodology described by Fischer et al.,21 in homogenates

of cerebrum structures by measuring the decrease in absorbance due to the

reduction of 2,6-dichloroindophenol (DCIP) at 600 nm, with 700 nm as the reference

wavelength (=19.1 mM-1 cm-1), in the presence of phenazine methasulphate (PMS).

The reaction solution containing 40.0 mM potassium phosphate, pH 7.4, 16.0 mM

58

succinate and 8 M DCIP was preincubated with 40-80 g homogenated protein at

30C for 20 min. Subsequently, 4.0 mM sodium azide, 7 M rotenone and 40 M

DCIP were added. The reaction was initiated by the addition of 1.0 mM PMS and was

accompanied for 5 min. Results for complex II and SDH activity are expressed as

nanomoles of DCIP reduction per minute per milligram of protein.

Cytochrome c oxidase activity: The activity of cytochrome c oxidase was

determined according to Rustin et al.22 Enzymatic activity was measured by following

the decrease in absorbance due to oxidation of previously reduced cytochrome c at

550 nm, with 580 nm as the reference wavelength ( = 19.1 mM-1x cm-1). The

reaction buffer contained 10.0 mM potassium phosphate, pH 7.0, 0.6 mM n-dodecyl-

β-D-maltoside, and 2-4 g homogenate protein. The reaction was initiated by the

addition of 0.7 g reduced cytochrome c and monitored for 10 min. Results are

expressed as nanomoles of cytochrome c oxidized per minute per milligram of

protein.

2.3.5 Protein determination

Protein concentrations were determined by the method of Lowry et al.,23 using

bovine serum albumin as standard.

2.4 Statistical analysis

Statistical analyses were performed using the IBM Statistical Package for Social

Sciences (SPSS) for Windows, version 20.0, using a PC compatible computer (IBM

Corp. Armonk, NY, USA). The Kolmogorov-Smirnov normality test was performed,

demonstrating a parametric distribution. Subsequently, data were analyzed by

ANOVA, followed by the Duncan multiple range test, when the F-test was significant.

Values of p

59

at concentrations of 2.5 and 5.0 mM, significantly decreases pyruvate kinase activity

in the cerebral cortex [F(3,20)=5.757; p0.05] or hippocampus [F(3,20)=0.594; p>0.05] of rats, as

compared to the control groups. With regard to the respiratory chain, Fig. 1(D) and

Fig. 1 (E) show that citrulline (5.0 mM) reduced the activities of complex II and

cytochrome c oxidase in the cerebral cortex [F(3,20)=20.395; p0.05],

hippocampus [F(3,20)=1.528; p>0.05 and F(3,20)=0.178; p>0.05]; or cerebellum

[F(3,20)=0.595; p>0.05 and F(3,20)=0.157; p>0.05] of rats, respectively. With regard

to the respiratory chain, Fig. 2 (D) shows that 1.0 mM ammonia decreased complex II

in the cerebellum [F(3,20)=8.327; p

60

cerebral cortex [F(3,20)=23.616; p

61

Fig. 4 (A) and Fig. 4 (B) show that 0.01 mM resveratrol did not prevent the reduction

in complex II activity, while at concentrations of 0.1 and 0.5 mM, resveratrol partially

prevented the reduction in complex II activity caused by 1.0 mM ammonia in the

hippocampus [F(7,40)=13.222; p

62

structures analyzed. Pyruvate kinase (PK) is a thiol-enzyme that is fundamental for

the glycolytic pathway and energy production in the brain.27 This enzyme produces

pyruvate, which is irreversibly converted into acetyl-CoA, in turn initiating the

tricarboxylic-acid cycle (TCA).28 In the cerebral cortex, the reduction of this enzyme’s

activity impairs the glycolytic pathway and energy production, contributing to brain

damage. In the hippocampus, the increase in pyruvate kinase activity, caused by

citrulline, may be associated with activation of anaerobic pathways, with the aim of

contributing to cellular homeostasis.

The tricarboxylic-acid cycle (TCA) and the electron transport chain are

fundamental routes for the aerobic generation of cellular energy. According to Beal,29

the susceptibility to the impairment of energy metabolism may increase in tissues

with high-energy demands, such as the brain, which contains a large number of

mitochondria. This study statistically demonstrated that citrulline, at the concentration

of 5.0mM, increased citrate synthase activity in the cerebellum, but did not alter this

enzyme’s activity in the cerebral cortex and hippocampus of rats. However,

ammonia, at all concentrations used, did not alter this parameter in the rat cerebrum.

Citrate synthase, the first enzyme of the TCA, is inhibited by high concentrations of

ATP, acetyl CoA and NADH, when the cell energy supply is high.30 Therefore, the

increase in the activity of citrate synthase in the cerebellum may be associated with

an increase in ADP/ATP ratio, stimulating pathways of fuel oxidation, such as the

TCA cycle, in order to supply more NADH and FADH2 to the electron transport chain

to increase ATP levels.31

The enzyme, succinate dehydrogenase (SDH), is the only membrane-bound

TCA enzyme, and is located on the inner mitochondrial membrane, with the function

of transferring electrons directly into the electron transport chain, aiding the

production of energy.31,32 In this study, results showed that, in vitro, citrulline and

ammonia, at any of the concentrations used, altered the activity of this enzyme in the

rat cerebrum.

With regard to the respiratory chain, citrulline at a concentration of 5.0 mM

(the highest concentration used) reduced the activity of complex II and cytochrome c

oxidase in the cerebral cortex and hippocampus, but did not alter this enzyme’s

activity in the cerebellum. Ammonia, at a concentration of 1.0 mM, decreased the

activity of complex II in the cerebellum and in the hippocampus and, at

63

concentrations of 0.1 and 1.0 mM, decreased complex II activity in the cerebral

cortex. With regard to cytochrome c oxidase, ammonia (1.0 mM) decreased this

enzyme’s activity in the cerebral cortex and cerebellum, but did not alter this activity