OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA DA PRODUÇÃO DE GLUTATIONA POR ...repositorio.bc.ufg.br/tede/bitstream/tede/6204/5/Dissertação - Késia... · amizade e lanchinhos no decorrer da última

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA DA PRODUÇÃO DE GLUTATIONA POR

Saccharomyces cerevisiae UTILIZANDO SUBPRODUTOS

INDUSTRIAIS

KÉSIA DE SOUZA CRUZ

ORIENTADOR: Prof.º Dr.º Gabriel Luis Castiglioni

COORIENTADOR: Prof.º Dr.º Robson Maia Geraldine

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

GOIÂNIA – 2016



PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA DA PRODUÇÃO DE GLUTATIONA POR

Saccharomyces cerevisiae UTILIZANDO SUBPRODUTOS

INDUSTRIAIS

KÉSIA DE SOUZA CRUZ

ORIENTADOR: Prof.º Dr.º Gabriel Luis Castiglioni

COORIENTADOR: Prof.º Dr.º Robson Maia Geraldine

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química do Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para a obtenção do título de mestre em Engenharia Química. Área de concentração: Desenvolvimento de processos.

GOIÂNIA – 2016



PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA

QUÍMICA

-

“Mudam-se os tempos, mudam-se

as vontades, Muda-se o ser, muda-

se a confiança; Todo o mundo é

composto de mudança, Tomando

sempre novas qualidades”.

(Luís de Camões)

Dedico ao Criador pela bênção

concedida;

E a todos que contribuíram para a

realização deste trabalho. Não pelo

documento, mas sim pela

importância associada à dissertação.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço-te meu Senhor por colocar pessoas maravilhosas

na minha vida, por abençoar-me com a vida delas e por fazer delas

instrumentos em Suas mãos para colaborarem com a conclusão desse

trabalho.

Obrigada também Senhor por colocar amor e companheirismo nos meus

pais Elias Cruz e Maria Cruz que não mediram esforços para realizar meus

sonhos que financiaram meus estudos desde sempre e que estiveram

comigo nos momentos de desânimo e euforia. Porque quando eu precisava

eles deixavam os problemas deles de lado para se importaram com os

meus, prestando solidariedade e colo.

Ao Professor Gabriel por tudo que fez por mim nesse período do mestrado,

sua orientação, suas dicas, observações foram cruciais para o trabalho.

Agradeço também pelo incentivo, confiança e amizade. Que Deus te dê em

dobro tudo que fez por mim, você para mim será referência no meio

acadêmico.

Ao Professor Robson, por todo suporte ofertado quando dá ausência física

do Gabriel no Campus. O qual com cordialidade ajudou a resolver todas as

dificuldades que surgiram.

Ao André Dias, meu esposo exemplar, obrigada por ser porto seguro para

mim e para a Geovana, nossa bênção. Todo apoio e carinho que destes nos

momentos de angústia foram fundamentais para nosso relacionamento e

evidenciou o sentido do cordão de três dobras.

A Geovana que é tão pequena de estatura, mas de coração enorme de

alegria. Obrigada minha princesa porque nos teus pequenos braços me

envolve na hora de dormir, com voz doce ora por nós e diz que me ama.

Você trouxe alegria e força para meus dias, te amo Geovaninha.

A UFG pela estrutura e recursos oferecidos para a realização deste trabalho,

e a CAPES pelo auxílio financeiro.

Aos meus tios Derly, Domingos, Bento, Luiz, Batista, Sinésio, Reis e Antenor

que incentivaram sempre e desejam que venha o Doutorado.

Aos professores Dr.ª Fernanda Ferreira (UFG) e Dr.º Fernando Ferrari

(UNESP) que sugeriram contribuições valiosas para a conclusão do

trabalho.

Aos professores Dr.º Flávio Colmati (UFG), Dr.ª Andreia Anshau e Drª.

Lucielen Santos pela parceria no trabalho. E aos professores dos seminários

Dr.º Flávio (UFG), Dr.º Cláudio (UFG) e Dr.ª Caridad (UFG) pelas

orientações durante os seminários que aprimoraram o trabalho.

As minhas irmãs Andressa Cruz e Jéssica Cruz pelo apoio, carinho,

incentivo e parceria durante o curso. E a graciosa Maria Heloisa que mesmo

com a distância e o cansaço físico e mental gerado pelo mestrado, sempre

relembrava minhas raízes, incentivando a dar valor na amizade, no carinho e

principalmente na família.

Aos colegas do mestrado Vitor, Danielle, Rodrigo, Carolina, Rowander,

Lorena, Camila, Henrique e Hannah que lutaram junto comigo pela

conclusão do curso, sempre ofertando apoio uns aos outros. Aos colegas de

laboratório Jéssica, André, Camila, Carol, Pablo, Maria Carolina, Monah e

Leandro pelas manhãs que choraram e sorriram junto comigo nesses últimos

meses. Sucesso na carreira de vocês.

A minha amiga Mayara que colaborou muito com seus conhecimentos,

amizade e lanchinhos no decorrer da última etapa do curso, obrigada pela

pessoa divertida e insubstituível que você se tornou na minha vida.

Aos técnicos Bruno, Deives, Ana, Jussara, Hugo, Rangel e Gustavo que

auxiliaram na pesquisa e partilharam experiências e conhecimentos

técnicos, levarei para sempre comigo tudo que aprendi.

As minhas tias Marlene, Célia e Sandra que apoiaram e incentivaram esse

sonho. E porque acima de tudo posso contar com amor de vocês sempre. E

a Fati, por estar tão longe e tão perto zelando da minha família.

As colegas de viagem Dayane, Luana e Stephane, no percurso Anápolis-

Goiânia por serem companhia e amigas no decorrer do mestrado.

Essa vitória é nossa!

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .................................................................................... xii

LISTA DE TABELAS ................................................................................... xiv

LISTA DE QUADROS ................................................................................ xvii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................... xviii

LISTA DE SÍMBOLOS ................................................................................. xx

NOMENCLATURAS .................................................................................... xxi

RESUMO .................................................................................................... xxii

ABSTRACT ............................................................................................... xxiii

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................... 24

2. OBJETIVOS .......................................................................................... 27

2.1. OBJETIVO GERAL ...................................................................... 27

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................ 27

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................. 28

3.1. DEFINIÇÃO, FUNÇÃO E APLICAÇÃO DA GLUTATIONA .......... 28

3.2. BIOSSÍNTESE DA GLUTATIONA ................................................ 31

3.3. PRODUÇÃO BIOTECNOLÓGICA DA GLUTATIONA .................. 34

3.4. DETERMINAÇÃO DA GLUTATIONA ........................................... 45

3.4.1. Metodologia eletroquímica..................................................45

3.4.2. Cromatográficos...................................................................47

3.4.3. Espectrofotomético..............................................................48

3.5. MODELAGEM EM PROCESSOS FERMENTATIVOS ................. 50

3.6. CONCLUSÕES SOBRE A REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............. 55

4. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................... 57

4.1. MICRORGANISMO E SUA MANUTENÇÃO ................................ 57

4.2. POLIMORFISMO NO COMPRIMENTO DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO DNA MITOCONDRIAL............................................... 58

4.2.1. Extração do DNA...................................................................58

4.2.2. Digestão enzimática do DNA mitocondrial.........................59

4.3. OBTENÇÃO DE DADOS PARA MODELAGEM MATEMÁTICA .. 60

4.4. INÓCULO E PROCESSO FERMENTATIVO ................................ 60

4.5. PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ............................................ 61

4.6. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR .................. 61

4.7. EXTRAÇÃO E DETERMINAÇÃO DA GLUTATIONA ................... 62

4.8. DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL HIDROGÊNIÔNICO (pH) .... 63

4.9. DESENVOLVIMENTO DO MODELO MATEMÁTICO .................. 63

4.9.1. Modelo mecanicista (Caixa Branca)...................................63

4.9.2. Modelo Empírico (Caixa Peta).............................................64

4.9.3. Modelo Híbrido (Caixa Cinza)..............................................64

4.10. OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA ........................................................... 66

4.11. VALIDAÇÃO DO MODELO .......................................................... 66

4.11.1. Cálculos e fórmulas utilizados durante as análises da etapa de validação........................................................................67

4.12. ALTERNATIVA DE MEIO DE CULTIVO PARA MINIMIZAÇÃO DE CUSTOS DA PRODUÇÃO DE GLUTATIONA. ..................................... 68

4.12.1. Processo fermentativo.......................................................68

4.12.2. Determinação da concentração celular............................69

4.12.3. Determinação da glutationa total......................................70

4.12.4. Determinação do consumo de açúcares e produtos do metabolismo celular.....................................................................71

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES .......................................................... 73

5.1. POLIMORFISMO NO COMPRIMENTO DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO DNA MITOCONDRIAL..............................................73

5.2. DESENVOLVIMENTO DO MODELO.............................................74

5.2.1. Modelo mecanicista..............................................................74

5.2.2. Modelo empírico...................................................................77

5.2.3. Modelo híbrido......................................................................78

5.3. OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA..............................................................86

5.4. VALIDAÇÃO DO MODELO.............................................................87

5.5. ALTERNATIVA DE MEIO DE CULTIVO PARA MINIMIZAÇÃO DE CUSTOS DA PRODUÇÃO DE GLUTATIONA.....................................92

6. CONCLUSÕES ................................................................................... 104

7. SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS ....................................... 105

8. REFERÊNCIAS ................................................................................... 106

APÊNDICES ............................................................................................... 117

ANEXOS ..................................................................................................... 135

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Estrutura da Glutationa (GSH), Tripeptídeo Composto de Ácido Glutâmico, L-Cistéina e Glicina (ANDERSON, 1998). .......................... 29

Figura 2 – Interconversão de Glutationa nas suas Formas Reduzida (GSH) e Oxidada (GSSG) Pela Ação das Enzimas Glutationa Peroxidase (GSH-Px), Glutationa Oxidase (GO) e Glutationa Redutase (GR) (MEISTER; ANDERSON , 1983). ............................................................................ 29

Figura 3 – Biossíntese da Glutationa e Enzimas Envolvidas: (a) γ-glutamilcisteína sintetase, (b) glutationa sintetase, (c) γ-glutamilciclotransferase e butioninasulfoximina, inibidor da síntese de glutationa (HUBER et al., 2008). ........................................................... 33

Figura 4 – Representação Esquemática do Ciclo Catalítico da Glutationa (HUBER et al., 2008). ........................................................................... 34

Figura 5 – Via Metabólica Da Glutationa Nas Leveduras (SHIMIZU et al.,1991). ............................................................................................... 38

Figura 6 - Reação Entre Glutationa Reduzida e DTNB (Reagente De Ellman) Para a Determinação de Hidroperóxidos Empregando a Enzima Glutationa Peroxidase (Rover Junior et al., 2011). ............................... 49

Figura 7 - Reação Entre Glutationa Reduzida e TPNH Para a Determinação De GSH (MARZAL, 2005)..................................................................... 49

Figura 8 – Fluxograma De Obtenção Do Modelo Hibrido ............................ 65

Figura 9 - Perfis Moleculares De S. Cerevisiae ATCC 7754 Isoladas A Partir De Placas Com Meio GPY, Obtidos Através Da Análise De Polimorfismo No Comprimento De Fragmentos De Restrição Do DNA Mitocondrial. Na Pista M: Marcador De Peso Molecular E Nas Pistas De 1 A 4 Perfis Moleculares Referentes À Cepa ATCC 7754. ...................................... 73

Figura 10 - Velocidade Específica De Formação De Produto Obtida A Partir Do DCCR 2². ......................................................................................... 75

Figura 11 - Esquema Onde Moléculas De Piruvato Formadas Na Glicólise São Convertidas Em Moléculas De Etanol Durante A Fermentação Alcóolica ............................................................................................... 76

Figura 12 - Ajuste Polinomial De Segunda Ordem Adotado Para Representar O Modelo Matemático Do Processo Fermentativo De Produção De GSH Para Os 165 Valores De Glutationa Obtidos De Acordo Com O DCCR 2². As Barras De Erro Indicam O Desvio Padrão Da Média De 4 Repetições (n = 11). ............................................................................. 77

Figura 13 - Resultados Experimentais e Preditos Encontrados Durante 96 Horas De Fermentação Para os Ensaios 1, 2 e 3 ................................. 84

Figura 14 – Resultados Experimentais e Preditos Encontrados Durante 96 Horas De Fermentação Para os Ensaios 4, 5 e 6 ................................. 84

Figura 15 – Resultados Experimentais E Preditos Encontrados Durante 96 Horas De Fermentação Para Os Ensaios 7, 8, 9, 10 e 11 .................... 85

xiii

Figura 16 - Resultado Dos Valores Estimados Pelo Modelo De Otimização Numérica, Usando 70 g L-1 De Melaço De Cana-De-Açúcar e 40 g L-1 De Glicerol. ........................................................................................... 86

Figura 17 - Acompanhamento Dos Resultados Das Concentrações De Biomassa (g L-1), Obtidos Pelo Delineamento Fatorial Completo 2² Para Validação Do Modelo ............................................................................ 88

Figura 18 - Resultados Da Concentração De GSH (mg L-1) Obtidos Pelo Delineamento Fatorial Completo 2² Para Validação Do Modelo. .......... 89

Figura 19 – Acompanhamento Da Concentração Celular (g L-1), Obtidos Pelo Delineamento Composto Central Rotacional 2² Para Minimização De Custos Na Produção De GSH, Durante 117 Horas De Fermentação ... 94

Figura 20 - Acompanhamento Do Consumo De Glicose (g L-1), Durante 117 h De Processo Fermentativo. ............................................................... 95

Figura 21 - Acompanhamento Do Consumo De Frutose (g L-1), Durante 117 h De Processo Fermentativo. ............................................................... 95

Figura 22 - Acompanhamento Da Concentração De Etanol Obtido Pelo Delineamento Composto Central Rotacional 2² Para Minimização Dos Custos Da Produção De Glutationa. ..................................................... 96

Figura 23 – Acompanhamento Da Concentração De Glicerol Adicionada Ao Meio De Fermentação De Acordo Com O Delineamento Composto Central Rotacional 2² Para Minimização Dos Custos Da Produção De Glutationa. ............................................................................................ 98

Figura 24 - Acompanhamento Da Concentração De Ácido Acético Obtido Pelo Delineamento Composto Central Rotacional 2² Para Minimização Dos Custos Da Produção De Glutationa. ............................................. 99

Figura 25 – Resultados Da Concentração De GSH (mg L-1) Obtidas Pelo Delineamento Composto Central Rotacional 2², Durante 117 h De Processo Fermentativo ....................................................................... 102

Figura 26 – Perfil Da Curva De Calibração De Biomassa .......................... 117

Figura 27 – Perfil Da Curva De Calibração De Glutationa ......................... 118

Figura 28 – Perfil Da Curva De Calibração De Biomassa .......................... 126

Figura 29 - Perfil Da Curva De Calibração De Glutationa .......................... 128

xiv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Composição média do melaço de cana-de-açúcar .................... 40

Tabela 2 – Matriz dos ensaios do DCCR 2² com níveis codificados e reais das variáveis estudadas. ...................................................................... 61

Tabela 3 – Matriz dos ensaios do Delineamento Fatorial Completo 2² com níveis de variação codificados e reais para as variáveis estudadas. .... 67

Tabela 4 – Matriz dos ensaios do Delineamento Composto Central Rotacional 2² com os níveis codificados e descodificados ................... 69

Tabela 5 – Condições utilizadas para obtenção da curva padrão de glutationa. ............................................................................................. 71

Tabela 6 – Mistura (Mix) de reagentes utilizados para determinação de glutationa total. ..................................................................................... 71

Tabela 7 - Resultados das velocidades específicas de formação de produto (h-1) para os ensaios realizados de acordo com o DCCR 2² nos tempos de 24 a 96 horas de fermentação. ........................................................ 74

Tabela 8 – Coeficientes A1, A2 e A3, referentes a Equação 9, obtidos pelo ajuste polinomial de segunda ordem dos resultados experimentais da produção de glutationa a partir do DCCR 2². ........................................ 79

Tabela 9 – Resultados dos coeficientes Bi e Bj, dos parâmetros g1 e g2 e dos coeficientes de determinação. ....................................................... 80

Tabela 10 – Resultado comparativo da produção de GSH entre os dados experimentais e os dados preditos pelo modelo no tempo de 72 horas. .............................................................................................................. 81

Tabela 11 - Resultado ANOVA para os dados preditos e os dados experimentais no tempo de 24 horas .................................................... 82




Tabela 15 – Resultado do índice de concordância de Willmontt (d), o qual relaciona os dados preditos e os dados experimentais para cada ensaio realizado de acordo com o Delineamento Composto Central Rotacional 2² .......................................................................................................... 83

Tabela 16 – Resultados do estudo comparativo entre os ensaios do Delineamento Fatorial Completo 2² em 72 horas de fermentação. ....... 91

Tabela 17 – Resultados de crescimento celular, consumo de açúcares, concentração de glicerol adicionada ao meio e produtos do metabolismo celular da S. cerevisiae ATCC 7754, em 40 horas de fermentação,

xv

obtidos de acordo com Delineamento Composto Central Rotacional 2². .............................................................................................................. 93

Tabela 18 – Resultados das concentrações de glutationa, em g L-1, obtidos pelo Delineamento Composto Central Rotacional 2² durante as 117 horas de fermentação. ........................................................................ 101

Tabela 19 – Resultados médios das absorbâncias e concentração celular (g L-1), referente a curva padrão. ............................................................ 117

Tabela 20 – Resultados médios das absorbâncias e concentração de glutationa (mg L-1), referente a curva padrão. ..................................... 118

Tabela 21 – Quantidade dos componentes pertencentes a solução de oligoelementos empregadas no meio sintético, mosto de uva............ 124

Tabela 22 – Quantidade dos componentes pertencentes a solução de minerais empregado no meio sintético, mosto de uva. ....................... 125

Tabela 23 – Quantidade dos componentes pertencentes a solução de minerais empregado no meio sintético, mosto de uva. ....................... 125

Tabela 24 – Resultados médios das absorbâncias e concentração celular (g L-1), referente a curva padrão ............................................................. 126

Tabela 25 – Resultados médios das absorbâncias e concentração de GSH (µM) referente à curva padrão ............................................................ 128

Tabela 26 – Resultado das concentrações de GSH (mg L-1) preditas pelo modelo híbrido para os 11 ensaios do DCCR 2² nos tempos de fermentação de 0,24, 48, 72 e 96 horas. ............................................ 129

Tabela 27 – Resultado da concentração de GSH (mg L-1) para ensaio utilizado para expressar a otimização numérica. ................................ 129

Tabela 28 – Resultados da concentração de glutationa (mg L-1) obtidas no Delineamento Fatorial Completo 2². ................................................... 130

Tabela 29 - Resultados da concentração de biomassa (g L-1) obtida no Delineamento Fatorial Completo 2². ................................................... 130

Tabela 30 – Resultado da etapa de validação para os valores da concentração intracelular de GSH (%) para os tempos de 0, 24, 48 e 72 horas. .................................................................................................. 131

Tabela 31 – Resultado da etapa de validação para os valores da Produtividade celular (g L-1 h-1) para os tempos de 0, 24, 48 e 72 horas. ............................................................................................................ 131

Tabela 32 - Resultado da etapa de validação para os valores da Produtividade de GSH (mg L-1 h-1) para os tempos de 0, 24, 48 e 72 horas. .................................................................................................. 131

Tabela 33 - Resultados da concentração de biomassa (g L-1) obtida no Delineamento Composto Rotacional 2² durante 117 h de fermentação. ............................................................................................................ 132

xvi

Tabela 34 - Resultados da concentração de ácido acético (mg L-1) obtida no Delineamento Composto Rotacional 2² durante 117 h de fermentação. ............................................................................................................ 132

Tabela 35 - Resultados da concentração de glicerol (g L-1) adicionada ao meio de fermentação de acordo com o Delineamento Composto Rotacional 2². ...................................................................................... 133

Tabela 36 – Resultados da porcentagem de etanol formado durante as 117 h de fermentação. .................................................................................. 133

Tabela 37 – Resultados do consumo de glicose adicionado ao meio de fermentação em g L-1. ......................................................................... 134

Tabela 38 - Resultados do consumo de frutose adicionado ao meio de fermentação em g L-1. ......................................................................... 134

Tabela 39 – Resultados de concentração de GSH (mg L-1) obtidos no DCCR 2². ....................................................................................................... 135

Tabela 40 – Resultados da concentração de biomassa (mg L-1) obtidos no DCCR 2². ............................................................................................ 135

Tabela 41 – Composição da água de maceração de milho (AMM) utilizada como substrato para o meio de fermentação...................................... 136

xvii

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 – Evolução das pesquisas para a produção de glutationa............33

Quadro 2 – Meio de cultura para manutenção da cepa Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754............................................................................54

Quadro 3 – Composição do meio GPY.........................................................55

xviii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Acetil-CoA Acetilcoenzima A

AD Doença de Alzheimer

ADN Ácido desoxirribonucleico

ALS Esclerose lateral amiotrófica

AMM Água de maceração de milho

ATP Adenosina trifosfato

BSO Butioninasulfoximina

CO2 Dióxido de Carbono

CuSO4 Sulfato de Cobre

CFP Chicken Feather Peptone

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

DCCR Delineamento composto central rotacional

DNA Ácido desoxirribonucléico

DTNB Ácido 5’,5’-ditio-bis-(2- nitrobenzóico)

E. Coli Echerichia coli

EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético

ERO Espécies reativas de oxigênio

FeSO4 Sulfato de Ferro

GO Glutationa oxidase

GR Glutationa redutase

GS Glutationa sintetase

GSH Glutationa ou ᵞ-L-glutamil-L-cistenilglicina

GSH-Px Enzima glutationa peroxidase

GSSG Glutationa dissulfeto

GPY Glucose, peptone, yeast extract

HCl Ácido Clorídrico

H2O Água

HD Doença de Huntington

HPLC High Performance Liquid Chromatography

IGF-1 Insulin Growth Factor 1

K2HPO4 Fosfato de Potássio Dibásico

KH2PO4 Fosfato de Potássio Monobásico

m-BBr Mono-bromobimano

xix

Min Minuto(s)

Mod. Modelo

MS Esclerose múltipla

MtDNA DNA - Mitocondrial

MgSO4 Sulfato de Magnésio

MnSO4 Sulfato de Manganês

NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

Na2HPO4 Fosfato Dissódico

NaH2PO4 Fosfato Monossódico

NaHCO3 Carbonato de Cálcio

NaOH Hidróxido de Sódio

NEM N-etilmaleiimida

OPA o-ftaldialdeído

PD Doença de Parkinson

pH Potencial Hidrogênionico

PSP Paralisia supranuclear progressiva

Pm Peso Molecular

RNAase Enzima ácido ribonucleico

RSM Metodologia de superfície de resposta

S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

SDS Sódio dodecil sulfato

SH Grupo sulfidrila

TCA Ácido tricarboxílico

UV Raios UltraVioleta

VIH Vírus da imunodeficiência humana.

YM Yeast Extract- Malt Extract

γ-GS γ-glutamilcisteínasintetase (glutamato-cisteína ligase)

ZnSO4 Sulfato de Zinco

xx

LISTA DE SÍMBOLOS

% Porcentagem

ºC Graus Celsius

f() Funcão

+ Soma

/ Razão

- Subtração

= Igualdade

µP Velocidade específica de formação de produto

Ca Cálcio

Cd Cádmio

D Derivada

Fe Ferro

h Horas

K Potássio

Mg+2 Íon Magnésio

Mg Magnésio

Na Sódio

O2 Gás Oxigênio

P Fósforo

Se Selênio

S Enxofre

xxi

NOMENCLATURAS

µGSH Velocidade específica de formação de produto [h-1]

A1 Coeficiente da equação polinomial [h-1]



t Tempo de fermentação [h]

D Função trigonométrica parametrizada [g L-1]

C Equação linear parametrizada em função de D [g L-1]

B1 Coeficiente da equação linear [h-1]

B2 Coeficiente da equação linear [h-1 g L-1]

B3 Coeficiente da equação linear [h-1]

g1 Parâmetro da função trigonométrica [adimensional]

g2 Parâmetro da função trigonométrica [adimensional]

R² Coeficiente de determinação [adimensional]

xxii

Otimização numérica da produção de glutationa por Saccharomyces cerevisiae utilizando subprodutos industriais

RESUMO

Estudos recentes mostram que as patologias mediadas por espécies reativas de oxigênio (ERO) estão frequentes. As EROs associam-se ao estresse oxidativo nas células, e para o corpo defender-se das consequências advindas desse processo, utiliza os antioxidantes. Um exemplo de antioxidante com variadas funções no organismo é a glutationa (GSH). Trata-se de um tiol celular de baixa massa molecular, que pode ser sintetizada por via química, enzimática e fermentativa. Devido sua viabilidade ambiental e econômica, o uso de processos fermentativos tem ganhado visibilidade científica. O emprego de modelos matemáticos é uma alternativa que auxilia na predição deste antioxidante. Tendo em vista estas observações o presente trabalho teve como objetivo elaborar um modelo matemático de predição da produção de GSH por S. cerevisiae, bem como validar experimentalmente sua otimização numérica. Para a confecção do modelo matemático utilizou-se um Delineamento Composto Central Rotacional 2², tendo como resposta os valores de GSH e biomassa em função das concentrações de melaço e glicerol durante 96 horas de fermentação. A partir desses resultados foi confeccionado um modelo híbrido, tendo como resposta a velocidade específica de formação de GSH. O modelo final foi ajustado a uma função polinomial utilizando metodologia dos Mínimos Quadrados. Experimentalmente a máxima produção de GSH foi encontrada em 72 horas (119,6 mg L-1) utilizando 76,9 g L-1 de melaço e glicerol, respectivamente. Aplicando o modelo para as mesmas condições estimou-se 118,6 mg L-1. Os resultados experimentais e preditos foram analisados estatisticamente para verificar a similaridade dos mesmos. A otimização numérica foi feita fixando o tempo em 72 horas. Nessa etapa variaram-se as concentrações de melaço e glicerol até obter a melhor condição para produzir GSH. A otimização estimou que 70 g L-1de melaço de cana-de-açúcar e 40 g L-1 de glicerol podem garantir uma produção de 126 mg L-1 de GSH. Tendo em conta esta constatação, essas condições foram utilizadas como ponto central de um Delineamento Fatorial Completo 2² para validação do modelo. O resultado encontrado nas mesmas condições do ponto central do delineamento proposto para validação foi de 127,3 mg L-1 de GSH em 72 horas. A validação do modelo matemático por meio de otimização numérica comprovou que o uso da modelagem foi eficaz para a predição da produção de glutationa por Saccharomyces cerevisiae utilizando subprodutos industriais.

Palavras-chave: modelagem matemática, resíduos, GSH, S.cerevisiae, modelo híbrido.

xxiii

Numerical optimization of glutathione production by Saccharomyces cerevisiae using industrial by-products

ABSTRACT Recent studies show that often, pathologies are caused by Reactive oxygen species (ROS). The ROS are associated with the oxidative stress in the cells. The body uses the antioxidants to defend itself from the consequences of this process. An example of an antioxidant with different functions in an organism is the Glutathione (GSH). It is a cellular thiol with low molecular mass, that’s synthesized by chemical, enzymatic and fermentative methods. Since it is environmentally and economically viable, the use of the fermentative process has gained scientific visibility. The use of mathematical models is an alternative that helps in the production of Glutathione. Considering these observations, the present study's aimed to elaborate a mathematical model for production and prediction of GSH for Saccharomyces cerevisiae, as well as to validate its numerical optimization experimentally. For the mathematical model in this process, was used the Central Composite Rotational Design 2², having as an answer, the GSH and biomass values in function with the concentration of molasses and glycerol during a period of 96 hours of fermentation. Based on these results, a hybrid model was made, having as a result, the specific rate of GSH formation. The final model was adjusted to a polynomial function using the method of least squares. Experimentally, the maximum production of GSH was found to be, in 72 hours (119,6 mg L-1) using 76,9 g L-1of molasses and glycerol, respectively. Applying the model for similar conditions, it was estimated to a 118,6mg L-1. The experimental results were then statistically analyzed to verify their similarity. The numerical optimization was made by setting the clock for 72 hours. At this step, the concentration of molasses and glycerol were varied until the best conditions to produce GSH were met. The optimization helped to derive an estimate that 70 g L-1of sugar cane molasses and 40 g L-1of glycerol can guarantee the production of 126 mg L-1of GSH. Based on the accuracy of the observations, the same conditions were used as a central point for the validation of the model - Factorial Design2². The results obtained under these conditions helped establish that the central point of the proposed design for the validation of the model, is 127,3mg L-1of GSH in 72 hours. The validation of this mathematical model by the numerical optimization proved that it was effective for the production and prediction of Glutathione by Saccharomyces cerevisiae, using industrial by-products. Keywords: mathematical modeling, waste, GSH, S.cerevisiae, hybrid model.

24

1. INTRODUÇÃO

A partir da segunda metade do século XX, o conhecimento científico

proporcionou o desenvolvimento de novas tecnologias consideradas

capazes de impactar radicalmente a ciência, a produção e,

consequentemente, a sociedade (REIS et al., 2009), influenciando nos

padrões socioeconômicos e gerado melhorias para a qualidade de vida

(PEREIRA; DUQUE-ESTRADA, 2014).

Uma melhor qualidade de vida remete à atenção privilegiada para a

saúde, entretanto quando as doenças surgem há uma preocupação para as

suas causas e seus processos fisiológicos, neste aspecto tem-se verificado

que a incidência de patologias mediadas por espécies reativas de oxigênio

(ERO) é frequente e notória para que se desenvolvam estudos na área

(NETO, 2010).

As ERO são em sua maioria mais associadas a danos oxidativos do

que à modulação de fenômenos biológicos, os danos oxidativos

caracterizam uma intoxicação por radicais livres, ou seja, estresse oxidativo.

Para combater esse estresse e as consequências advindas desse processo,

o corpo utiliza os antioxidantes (CARDOSO et al., 2006)

Um exemplo de antioxidante é a glutationa ou GSH (ᵞ-L-glutamil-L-

cistenilglicina) esta biomolécula é um tripeptídeo composto por ácido

glutâmico, L-cisteína e glicina, caracterizado provavelmente como o mais

abundante tiol de baixa massa molecular encontrado nos sistemas

biológicos (WEN et al., 2005). A GSH possui várias funções metabólicas nas

células, sendo que a principal está relacionada ao seu alto poder

antioxidante (PIEDRAHÍTA-AGUIRRE, 2008), além de estar envolvida em

reações de biorredução, processos de transporte e destoxitificação de

diferentes xenobióticos (WEN et al., 2005).

A GSH no organismo é sintetizada em duas etapas enzimáticas

consecutivas dependentes de Adenosina trifosfato (ATP) (HUBER et al.,

25

2008). Segundo Navarro et al. (1999) baixas concentrações de glutationa

nos seres humanos podem ser associadas a várias patologias, tais como a

cirrose do fígado, diabetes, doenças pulmonares, degenerativas,

inflamações gastrointestinais, pancreáticas e envelhecimento e outras.

Porém, a existência de patologias associadas a radicais livres

demonstra que este tipo de espécie não apresenta nenhum componente

etiológico na globalidade das doenças, mas sim uma responsabilidade direta

na alteração fisiopatológica dos mecanismos que determinam a proliferação

da anomalia (NETO, 2010).

A produção sintética de GSH pode ser realizada por três formas:

enzimática, química e fermentativa. Por fermentação as

leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida utilis são empregadas para

produzir a GSH em escala industrial (NAVARRO et al., 1999). A

Saccharomycess sp é um microrganismo aeróbio facultativo, isto é, tem a

habilidade de se adaptar metabolicamente, tanto em condições aeróbias

quanto anaeróbias (LIMA et al., 2001). Segundo Wen et al., (2005) a

fermentação com leveduras é um método eficiente comercialmente e de fácil

aplicação prática do processo.

De acordo com Silva et al. (2009) em escala industrial com uma

relação custo-benefício satisfatória por fermentação de levedura, as fontes

de carbono e nitrogênio mais econômicos devem ser investigadas, desta

maneira o glicerol e o melaço de cana (1,2,3 propanodiol) surge como uma

promissora fonte de carbono já que são oriundas de substratos industriais.

Uma alternativa que pode garantir a predição da glutationa e

minimizar tempo e custos com a sua obtenção é o uso das técnicas de

modelagem matemática. A modelagem esta associada a processos reais

sujeitos a experimentações, processo no qual as informações obtidas

experimentalmente podem ser transformadas em modelos preditivos

(FAHOR, 2009).

26

Vale ressaltar que um dos objetivos da engenharia bioquímica é o

desenvolvimento de metodologias para maximizar a capacidade metabólica

de microrganismos de interesse industrial. A fim de alcançar esses objetivos

o uso de processos de manipulação genética do metabolismo celular e

também programar as condições de operação dos processos são fatores

essenciais (WEICHERT, 2002).

Sies (1999) enfatiza que esta biomolécula é vista como a esperança

de transmitir uma ideia de onde os desenvolvimentos futuros podem ir, em

virtude das diversas funções inerentes a glutationa. E segundo Li et al.,

(2004) as indústrias se interessaram pelas funções e propriedades da

glutationa e agora está é sendo alvo de estudos.

Levando em consideração todas essas informações, a abordagem

deste tema torna-se justificável. Dessa maneira este trabalho teve por

objetivo elaborar um modelo matemático de predição da biomolécula

glutationa oriunda de processo fermentativo utilizando subprodutos

industriais.

A organização desta dissertação apresenta-se da seguinte forma:

Na primeira seção realizou-se uma introdução sobre o tema abordado na

pesquisa, as etapas seguintes referem-se ao desenvolvimento do trabalho.

Na seção dois abordam-se os objetivos da pesquisa, na seção três trata-se

de uma revisão bibliográfica. Na etapa quatro são descritas as metodologias

de caracterização da cepa, condução do processo fermentativo, modelagem,

simulação, otimização numérica e validação do modelo híbrido desenvolvido

e uma metodologia para minimizar os custos de produção de GSH. Na

seção cinco apresentam-se os resultados encontrados e discutidos. E por

fim as considerações finais sobre a pesquisa e sugestões de trabalhos

futuros.

27

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Modelar matematicamente o processo de produção de glutationa

utilizando Saccharomyces cerevisiae e subprodutos industriais.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Estudo de verificação da pureza da cepa Saccharomyces cerevisiae

ATCC 7754.

Modelagem matemática dos dados obtidos para a produção de

glutationa;

Otimizar numericamente a produção de glutationa por Saccharomyces

cerevisiae;

Validar o modelo matemático de predição da produção de glutationa por

Saccharomyces cerevisiae;

Iniciar estudos para minimização de custos da produção de glutationa por

Saccharomyces cerevisiae;

28

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. DEFINIÇÃO, FUNÇÃO E APLICAÇÃO DA GLUTATIONA

A glutationa recebe as seguintes denominações: GHS - abreviação

em inglês - ou ʟ-γ-glutamil-ʟ-cisteinilglicina (PENNINCKX, 2002) sua massa

molar é de 307 g mol-1 (C10H17N3O6S). É definida como um tripeptídeo linear,

hidrossolúvel, sendo composto dos seguintes aminoácidos: ácido glutâmico,

L-cisteína e glicina (WEN et al., 2005).

Segundo Li et al. (2004) o grupo tiol da cisteína é o local ativo

responsável por suas propriedades bioquímicas. E de acordo com Shan

(1990) a GHS possui duas características indispensáveis para a sua

participação em diversas funções: a ligação γ-glutamil e o grupo sulfidrila.

Em 2016, completa-se 128 anos (1888 – 2016) que J. de Rey-

Pailhade descobriu a glutationa. Ele observou que as células continham uma

substância responsável pela formação de sulfetos na presença de enxofre e

que essa substância estava presente em quase todas as células animais.

Em virtude da alta afinidade em reagir com o enxofre, Rey-Pailhade nomeou

esta substância de “philothion” (philo=atração; thion=enxofre) (MEISTER,

1988).

Em 1921, Hopkins observou que a substância denominada

“philothion” era constituída por glutamato e L-cisteína, sendo um dipeptídeo

denominado glutationa. Mais tarde, um grupo de pesquisadores descobriu

que a GSH é um tripeptídeo composto por três aminoácidos: glutâmico, L-

cisteína e glicina e que seu sítio ativo era representado por um grupo tiol,

sulfidrila ou SH de um resíduo de cisteína (MEISTER, 1988). A Figura 1

apresenta a composição da glutationa.

29

Figura 1 – Estrutura da Glutationa (GSH), Tripeptídeo Composto de Ácido

Glutâmico, L-Cistéina e Glicina (ANDERSON, 1998).

Nas células, a glutationa pode ser encontrada sob a forma de

glutationa reduzida (também denominada de monomérica) e na forma

oxidada (também designada de dimérica – GSSG) (NETO, 2010) e

diferentes mistos dissulfetos como, por exemplo, GS-S-CoA e GS-S-Cys

(PENNINCKX; ELSKENS, 1993). A Figura 2 ilustra a interconversão da

glutationa nas formas GSH e GSSG.

Figura 2 – Interconversão de Glutationa nas suas Formas Reduzida (GSH) e

Oxidada (GSSG) Pela Ação das Enzimas Glutationa Peroxidase (GSH-Px),

Glutationa Oxidase (GO) e Glutationa Redutase (GR) (MEISTER;

ANDERSON , 1983).

30

A GSH possui várias funções metabólicas nas células, sendo que a

principal está relacionada ao seu alto poder antioxidante (PIEDRAHÍTA-

AGUIRRE, 2008), além de estar envolvida em reações de biorredução,

processos de transporte, proteção contra radicais livres e destoxitificação de

xenobióticos e de metabólitos tóxicos endógenos além de estar relacionado

com atividade de enzimas, enxofre e metabolismo do nitrogênio

(PENNINCKX, 2002). Atua como um intensificador imunológico (PASTORE

et al., 2003) por meio da produção de glóbulos brancos (WU et al., 2004).

Gharieb; Gadd (2004) citaram que a GSH desempenha função de

proteção da célula contra biocidas e certos íons metálicos. Portanto um

tripeptídeo fundamental no acúmulo e na desintoxicação de Cd (cádmio) e

Se (selênio).

A glutationa é uma biomolécula determinante em diversos processos

celulares por desempenhar múltiplas funções, fato que dificulta atribuir uma

causa direta para determinada patologia por alterações dos níveis de GSH

ou do estado redox, somente se pode inferir que existe uma participação da

GSH para a manifestação e progressão de doenças (BALLATORI et al.,

2009; BONNEFOY et al., 2002).

A resistência de muitas células contra o estresse oxidativo está

associada com elevados níveis intracelular de glutationa em sua forma

reduzida. O estresse oxidativo pode causar mudanças no estado redox da

glutationa aumentando a liberação de glutationa oxidada (dissulfeto) no

organismo. Assim, alguns estudos têm direcionado o interesse no

monitoramento de glutationa em amostras biológicas com o propósito de

estudar se algumas doenças estão relacionadas ao estresse oxidativo

(ROVER JUNIOR et al., 2001).

Doenças como: cirrose hepática, pulmonares, gastrintestinais,

inflamações no pâncreas, diabetes, envelhecimento (WU et al., 2004) câncer

(TOWNSEND et al., 2003), fibrose cística (ROUM et al., 1993; TOWNSEND

et al., 2003), VIH - Vírus da imunodeficiência humana (BUHL et al., 1989),

doenças cardiovasculares (PARK et al., 2013) são alvos de estudos.

31

Aoyama; Nakaki (2013) em um estudo sobre a síntese debilitada da

glutationa em neurodegradação afirmam que estudos recentes indicam que

o transtorno da função GSH está implicado na etiologia de algumas doenças

neurodegenerativas tais como a doença de Alzheimer (AD), doença de

Parkinson (PD), esclerose lateral amiotrófica (ALS), paralisia supranuclear

progressiva (PSP), a doença de Huntington (HD), e esclerose múltipla (MS).

Sgarbiere (2004) afirma que a relação entre o vírus da Aids e a GSH

(glutationa) é antagônica, ou seja, quando os níveis de GSH celular

diminuem o vírus se multiplica; já quando os níveis de GSH estão altos,

ocorre um decrescimento na propagação do vírus. Assim, quanto mais

elevada a taxa de GSH nos linfócitos (células de defesa do sistema

imunológico) dos pacientes com Aids, maiores serão suas chances de

sobreviver.

A GSH possui inúmeras aplicações em diversos segmentos

industriais para tais como: ambiental, farmacêutico, alimentício e desportivo,

seja atuando como parâmetro de avaliação na contaminação ambiental,

como aditivo alimentar, estendendo o tempo de prateleira de carnes e frutos,

na estabilização de pigmentos, na formulação de reagentes químicos,

biológicos, e em forma de cápsulas como suplemento alimentar (LI, et al.,

2004; GONÇALVES, 2012).

E atualmente a GSH destaca-se na área ambiental como importante

parâmetro biológico, sendo um dos mais importantes indicadores do

estresse oxidativo, atuando como biomarcador de protocolo no

monitoramento ambiental na contaminação aquática por metais pesados,

dentre eles cádmio e chumbo (GARG; AGGARWAL, 2011).

3.2. BIOSSÍNTESE DA GLUTATIONA

A GHS (1) é sintetizada intracelularmente pela ação sequencial de

duas enzimas dependentes de ATP, a γ-glutamilcisteína sintetase (γ-GS

32

também conhecida como glutamato-cisteína ligase, EC 6.3.2.2,GSHI) e

Glutationa sintetase (GS, EC 6.3.2.3, GSHII) (MEISTER; ANDERSON 1983).

Os primeiros passos para a formação deste tripeptídeo é a utilização dos

aminoácidos glutâmico (2) e cisteína (3) em uma reação catalisada pela

enzima γ-glutamilcisteína sintetase formando o dipeptídeo γ-L-glutamil-L-

cisteína (4). O segundo passo é a adição de uma molécula de glicina ao

dipeptídeo γ-L-glutamil-L-cisteína, reação esta catalisada pela GS formando

a glutationa no fim do processo (SHAN, 1990).

Estas etapas requerem ATP e Mg+2. A γ-glutamilcisteína sintetase

sofre regulação pela GSH por meio de um feedback negativo, o que previne

a produção excessiva desta ou o acúmulo do intermediário γ-

glutamilcisteína. Caso a conversão da γ-glutamilcisteína em GSH seja

insuficiente, uma reação alternativa predomina: a conversão à 5-oxoprolina

(5), catalisada pela γ-glutamilciclotransferase. A produção excessiva de 5-

oxoprolina ocorre em casos de deficiência hereditária da glutationa sintetase

e é caracterizada por 5-oxoprolinúria, acidose metabólica crônica e

distúrbios neurológicos. A biossíntese da GSH pode ser inibida pela

butionina sulfoximina (BSO) (6), um inibidor com estrutura similar a um

intermediário ativado na reação catalisada pela γ-glutamilcisteína sintetase

(HUBER et al., 2008). A Figura 3 ilustra o esquema da biossíntese.

Este antioxidante hidrófilo apresenta duas características em sua

estrutura: um grupo sulfidrila e uma ligação glutamil (WANG et al., 2012). E

pela forte capacidade da glutationa em doar elétrons e pela relativa alta

concentração celular – em torno de 0,1 a 10 mM em células procarióticas e

eucarióticas (MEISTER; ANDERSON, 1983) - a GSH torna-se importante

para a proteção do ADN – ácido desoxirribonucleico, proteínas, e outras

biomoléculas contra danos oxidativos gerados, por exemplo, por espécies

reativas de oxigênio (EROS) (LI et al., 2004).

33

Figura 3 – Biossíntese da Glutationa e Enzimas Envolvidas: (a) γ-

glutamilcisteína sintetase, (b) glutationa sintetase, (c) γ-

glutamilciclotransferase e butioninasulfoximina, inibidor da síntese de

glutationa (HUBER et al., 2008).

Nos seres humanos a GSH ocorre em todos os tipos de células,

porém o órgão responsável pela produção e exportação da GSH é o fígado

(WU et al., 2004). Embora mais de 90% da glutationa esteja normalmente

presente na forma de GSH reduzida, várias formas adicionais de glutationa

estão presentes em células microbianas, tecidos e plasma (LI et al., 2004).

A síntese da glutationa é limitada pelo aminoácido L-cistéina em

seres humanos, ratos, porcos e frangos (WU et al., 2004). Principalmente

em microrganismos eucarióticos, bactérias gram-negativas e raramente em

bactérias gram-positivas encontra-se o aminoácido L-cisteína (PENNINCKX,

2002, LI et al., 2005).

E para que a atividade protetora da glutationa expressa pela redução

de espécies oxidantes, e consequente oxidação da GSH à glutationa

dissulfeto (GSSG), ou seja, ligação dupla de enxofre em duas moléculas de

GSH (CHEN et al., 2006) seja mantida, a GSH precisa ser regenerada

através do ciclo catalítico, representado na Figura 4. Nela podemos

identificar a atividade de três grupos de enzimas: a glutationa oxidase (GO),

34

a glutationa peroxidase (GSH-Px) e a glutationa redutase (GR) (HUBER et

al., 2008).

Figura 4 – Representação Esquemática do Ciclo Catalítico da Glutationa

(HUBER et al., 2008).

As duas primeiras enzimas, GO e GSH-Px, catalisam a oxidação de

GSH à GSSG e a última, GR, é responsável pela regeneração de GSH, a

partir de GSSG, na presença de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

(NADPH). A glutationa redutase não age diretamente na remoção de

espécies radicalares, porém é responsável pela regeneração da glutationa à

sua forma reduzida (GSH) na presença de NADPH, tendo como objetivo

impedir a paralisação do ciclo metabólico da glutationa (MEISTER;

ANDERSON, 1983).

3.3. PRODUÇÃO BIOTECNOLÓGICA DA GLUTATIONA

A produção sintética de GSH pode ser realizada por três métodos:

enzimático, químico e fermentativo (NAVARRO et al., 1999). Estudos

relacionados à produção enzimática apresentavam alguns obstáculos

impossibilitando o seu avanço, visto que a exigência de ATP na fermentação

35

enzimática torna este processo difícil em grande escala, uma vez que é

impraticável economicamente adicionar ATP diretamente em escala

industrial, portanto seria de interesse a construção de um sistema de

regeneração de ATP altamente eficiente (LI et al., 2004).

Douglas (1989) afirma que a introdução e a remoção de protetores

sulfidricos de resíduo de cisteína foram passos cruciais na síntese química

de GSH, fazendo o produto ser inicialmente comercializado em 1950.

Entretanto Gotoh (2004) afirma que o grupo sulfidrila envolvido na síntese

química é altamente suscetível a oxidação e que a adição do peptídeo γ-

glutamil torna complexa a síntese.

Assim no Japão, no final da década de 70, início dos nos 80

iniciaram as etapas de produção e comercialização da GSH por fermentação

com leveduras. Segundo Wen et al. (2005) a fermentação com leveduras é

um método eficiente comercialmente e de fácil aplicação prática do

processo.

As leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida utilis são

empregadas para produzir a GSH em escala industrial em processos

fermentativos (NAVARRO et al., 1999). Observando-se que a

Saccharomyces spp é um microrganismo aeróbio facultativo, isto é, tem a

habilidade de se adaptar metabolicamente, tanto em condições aeróbias

quanto anaeróbias (LIMA, et al., 2001).

O Quadro 1 apresenta a evolução das pesquisas para a produção de

glutationa.

36

Quadro 4 – Evolução das pesquisas para a produção de glutationa (LI et al., 2004).

Desenvolvimento na produção de GSH Período

Identificação de sistemas regenerativos em plantas 1888

Descoberta e identificação de sua fórmula estrutural 1920

Métodos fermentativo-enzimáticos utilizando leveduras (S. cerevisiaee Candida)

1976-1985 1998 até presente data

Purificação da GSH em sistemas biológicos 1976-1985

Produção enzimática utilizando bactéria 1976-1987/1993-1998

Sistemas de regeneração de ATP para aumentar produção

1978-1982

Biologia molecular através da biossíntese e construção de genes recombinantes em E. Coli

1982-1990

Construção de genes recombinantes de S. Cerevisiae 1986-1990/1996-1998

Otimização e controle de processo 1991-1994/1997 até

presente data

Produção por bactérias lácticas 2001 até presente data

A Saccharomyces cerevisiae está amplamente estudada, sendo o

primeiro eucarioto a ter seu genoma totalmente sequenciado. Possui 16

cromossomos, com um genoma de 13,389 Kb com média de um gene para

cada 2.000 pares de bases, sendo que diversos genes estão envolvidos com

reparação de danos ao DNA. Seu genoma foi desvendado através do projeto

de sequenciamento do genoma da levedura, iniciado pela comunidade

européia de leveduras em 1989 e concluído em 1996 (GOFFEAU et al.,

1996).

Para todos os processos industriais em que participa a

Saccharomyces cerevisiae, os meios de cultura devem conter

necessariamente uma fonte de nitrogênio, além de uma fonte de carbono,

sais e vitaminas (COOPER, 1982; HORÁK, 1997). Os principais compostos

utilizados como fonte de carbono pela levedura são os monossacarídeos

(frutose, glicose e galactose) e os dissacarídeos (maltose e sacarose)

(FLORES et al., 2000).

O outro elemento essencial para os organismos vivos é o nitrogênio

sendo que as células de leveduras podem utilizar uma ampla variedade de

compostos nitrogenados como fontes de nitrogênio, inclusive amônio,

aminoácidos e peptídeos (ter SCHURE et al., 1995). Entretanto, nem todas

as fontes de nitrogênio propiciam crescimento igualmente eficiente: por

exemplo, foi observado que amônia, glutamato, glutamina, e aspargina são

37

preferencialmente utilizadas por leveduras e induzem altas taxas de

crescimento (MAGASANIK, 1992).

A membrana celular da levedura S. cerevisiae é constituídas por

duas camadas de fosfolipídios, e somente pequenas moléculas (por

exemplo: O2, CO2 e H2O) conseguem atravessar pela membrana livremente.

Portanto, a GSH não pode ser excretada no meio a partir de células vivas. A

excreção somente pode ser provocada através da ruptura da membrana

celular (WEI et al., 2003).

O processo de produção de GSH por meio de técnicas fermentativas

pode ser subdividido em três fases analisando um processo fermentativo de

24 h: Na primeira fase correspondente ao tempo de 0 a 8 h, ocorre o

consumo de glicose (substrato) e a produção de etanol. Nesta fase os níveis

de glicose decrescem gradualmente e a de etanol e GSH aumentam. Na

segunda fase (8-14 h) ocorre a assimilação do etanol: o crescimento celular

ocorre de forma mais lenta e o etanol é utilizado como fonte de carbono para

crescimento celular e para síntese de GSH. Nestas duas fases ocorre o

acúmulo de GSH, ou seja, na fase exponencial de crescimento e, por fim na

fase III entre 14 e 24 h, ocorre à fase estacionária onde a glicose e o etanol

são consumidos completamente e as células param de crescer (WEN et al.,

2005).

No caminho metabólico da GSH dentro das leveduras a glicose

inicialmente é transformada em piruvato (Via glicólise), que é transformado

em acetil-CoA, participando assim do ciclo dos Ácidos tricarboxílicos (TCA) –

Ciclo de Krebs – com liberação de energia. Para a formação da GSH, o

ácido glutâmico provém do α-cetoglutarato, que é um composto do ciclo do

TCA. Quando há excesso de glicose no meio ocorre à produção de etanol

através do efeito Crabtree e quando a quantidade de glicose no meio torna-

se insuficiente, o etanol pode ser assimilado como fonte de carbono para a

levedura e a GSH produzida (SHIMIZU et al., 1991), conforme ilustra a

Figura 5.

38

Figura 5 – Via Metabólica Da Glutationa Nas Leveduras (SHIMIZU et

al.,1991).

Através de estresse como, redução de nutrientes, choque osmótico

e elevação da temperatura, as leveduras aumentam o consumo de energia

isto induz mudanças no metabolismo do microrganismo e acúmulo de

algumas moléculas protetoras. A trealose e a GSH são exemplos destas

moléculas produzidas pela S. cerevisiae (DONG et al., 2007).

O aumento da produção de GSH nas leveduras pode ocorrer de

duas maneiras: aumentando amplamente a concentração celular obtida ou

promovendo o aumento do conteúdo intracelular. Porém percebe-se que é

mais fácil aumentar a concentração celular através das tecnologias de

fermentação desenvolvidas do que aumentar o conteúdo intracelular de

GSH. Contudo, a segunda opção é mais atrativa, pelo fato de aumentar a

concentração de GSH e facilitar as etapas de “downstream” (WEN et al.,

2004)

Anshau (2010) estudou qual o microrganismo que melhor produz

GSH em frasco erlenmeyer, utilizando Saccharomyces cerevisiae ATCC

7754, Candida tropicallis CCT 5846, Candida utilis CCT 3469, Pichia

anômala CCT 4373 e Pichia anômala CCT 2648. Para a extração da GSH a

39

temperatura foi de 30ºC sendo testadas diferentes concentrações de etanol

(20, 40 e 60%), tempos (2, 4, 6, e 16 h) e extrações em banho ultra

termostatizado, homogeneizador e banho ultrassom (somente 2 h). O melhor

resultado foi obtido com S. cerevisiae ATCC 7754 em banho ultra

termostatizado, em 16 h de extração, com 40% de etanol (131,24 mg L-1 de

GSH).

De acordo com Silva et al. (2009) em escala industrial as fontes de

carbono e nitrogênio mais econômicos devem ser investigadas, desta

maneira o glicerol e o melaço de cana-de-açúcar surgem como promissoras

fontes de carbono já que são oriundos de resíduos industriais.

O que faz um material ser um “resíduo” ou um “subproduto” ou uma

matéria-prima é o seu uso em um novo processamento, consequência direta

das suas características. Os resíduos agroindustriais são importantes pela

sua composição físico-química e basicamente atuam como insumo

alternativo e de baixo custo para desenvolver e multiplicar células a fim de

gerar compostos de interesse como produto do metabolismo celular.

Estratégia concebida da tecnologia limpa a qual atua como solução

ambiental para o despejo de poluentes (WOICIECHOWSKI et al., 2012).

A aplicação desses resíduos em meios de cultivo caracteriza-o como

um meio complexo em relação aos constituintes do mosto, porém é menos

oneroso. Motivo pela qual são utilizados em processos fermentativos de

grande escala como exemplo pode-se citar: a água de maceração de milho

(AMM), caldo de cana-de-açúcar, melaços, farinhas e etc. (SCHIMEDELL,

2001) empregam-se também resíduos dos processamentos da mandioca, da

soja, do arroz, do café, de oleaginosas, do camarrão, do tomate, da indústria

sucroalcooleira e o soro de queijo (WOICIECHOWSKI et al., 2012).

Algumas desvantagens estão presentes no emprego desses meios

complexos, por exemplo, dificuldade nas etapas de separação e purificação

do produto final, problemas nos tratamentos de águas residuarias, o

desconhecimento da composição química das matérias primas em relação

ao teor de sais minerais o que faz com que esses meios complexos sejam

40

completados com alguns sais (SCHIMEDELL, 2001). Outra desvantagem é a

baixa homogeneidade e garantia de padronização dos lotes de resíduos os

quais podem variar de acordo com as condições de processamento,

climáticas ou sazonais (WOICIECHOWSKI et al., 2012).

O melaço de cana é um subproduto da fabricação do açúcar de cana

cujas características são: líquido viscoso, não cristalizável e apresenta uma

alta concentração de sacarose (Tabela 1), além de outras substâncias

importantes para processos fermentativos. É um subproduto de baixo custo,

alta disponibilidade e com elevado teor de açúcares fermentáveis, razões

pelas quais vem sendo empregada como substrato em processos

fermentativos (WOICIECHOWSKI et al., 2012).

Tabela 1 – Composição média do melaço de cana-de-açúcar

Elementos Faixa de concentração

(%,p/p)

Água 17 - 25 Sacarose 30 - 40 Glicose 4 - 9

Frutose 4 - 12 Gomas, amidos, pentosanas, traços de hexitóis e ácidos urônicos

2 - 5

Cinzas 7 - 15

Compostos nitrogenados 2,5 - 4,5

Proteínas 0,5 - 4,5 Aminoácidos 0,3 - 0,5 Ácidos não nitrogenados (ex.: cítrico, málico, oxálico)

1,5 - 6,0

Ceras, Esteroídes e fosfatídeos 0,1 - 1,0 Vitaminas:A,biotina,niacina,ácido pantotênico,riboflavina, timina

Quantidades variáveis

Fonte: Chen; Chou (1993).

Vários produtos de interesse comercial, econômica e industrial são

obtidos via processo fermentativo: etanol, ácidos orgânicos (acético, cítrico,

lático, glutâmico, fumárico entre outros), aromas, pigmentos, enzimas,

espessantes, conservantes, antimicrobianos, peptídeos bioativos,

antitumorais e antioxidantes (WOICIECHOWSKI et al., 2012).

Wen et al. (2006) maximizaram a produção de glutationa pela

modulação de aminoácidos e alta densidade celular em fermentação de

batelada alimentada. A cepa empregada no estudo foi a de S. cerevisiae T65

41

o pH foi mantido a 5,5 e a temperatura a 30oC. O meio para obter inóculo

continha 20 g L-1 de glicose, 5 g L-1 de extrato de levedura, 3 g L-1 de

(NH4)2HPO4, 0,8 g L-1 MgSO4, 1 g L-1 de K2HPO4 e 1 g L-1 de KH2PO4.

Foram realizadas três fermentações para estudar os efeitos da concentração

de etanol no crescimento celular e síntese de glutationa, controlando os

níveis de etanol no meio e uma solução de glicose 80% foi adicionada de

acordo com estes níveis. Na primeira, os níveis foram mantidos até 7,7% em

20h, na segunda entre 1,16 e 2,2% e na terceira entre 0,08 e 0,65%. Foi

verificado que os níveis mais baixos favoreceram a produção de GSH, sendo

por isso, feita mais uma fermentação otimizada mantendo os níveis de

etanol baixos e com a adição dos aminoácidos precursores nos tempos de

24, 44 e 56 h. O melhor resultado foi de 2190 mg L-1 de GSH após 60 h de

fermentação.

Zhang et al. (2007) otimizaram o meio de cultivo para a produção de

GSH utilizando S. cerevisiae T65. As condições de cultivo foram 30oC, 180

rpm, 24 h e 20% de inoculo (v/v). O meio otimizado continha: glicose

(70 g L-1), extrato de levedura (3 g L-1), peptona (5 g L-1), extrato de malte

(70 g L-1), melaço (20 g L-1), MgSO4 (5,6 g L-1), ZnSO4 (16 g L-1), (NH4)2HPO4

(7 g L-1) e tiamina (0,2 g L-1). A concentração de GSH chegou a 74,6 mg L-1,

sendo 1,81 vezes maior que o ensaio controle (30 g L-1 de glicose, 5 g L-1 de

extrato de levedura, 3 g L-1de (NH4)2HPO4, 1 g L-1 de K2HPO4, 1 g L-1 de

KH2PO4 e 0,8 g L-1 de MgSO4).

Santos et al. (2007) estudaram a produção de GSH em frascos

Erlenmeyer a partir de S. cerevisiae através de planejamento fatorial

fracionário 25-2 e Delineamento Composto Central Rotacional 2² estudando

as variáveis: temperatura (20-30oC), agitação (100-300 rpm), pHinicial (5-7),

concentração de inoculo (5-15%) e concentração de glicose (20-70 g L-1). Os

resultados mostraram que as condições ótimas de cultivo foram: 54 g L-1 de

glicose, 5% de inóculo, 300 rpm, 20oC e pHinicial 5. A maior concentração de

GSH (154,5 mg L-1) foi obtida após 72 h de fermentação. O meio de

fermentação continha glicose, extrato de levedura e sulfato de magnésio

heptahidrato.

42

Wang et al. (2007) utilizando uma cepa de S. cerevisiae G14,

avaliaram a produção de GSH em frascos Erlenmeyer (250 mL) e em

fermentador de 5 L. O meio de fermentação era constituído de 70 g L-1 de

glicose; 15 g L-1 de extrato de levedura, 60 g L-1 de licor de malte, 10 g L-1 de

(NH4)2HPO4, 5 g L-1 de MgSO4 , 28 g L-1 de melaço de cana-de-açúcar, 16 g

L-1 de água de maceração de milho, 1 g L-1 de KH2PO4, 1 g L-1 de K2HPO4,

10 g L-1 de ZnSO4; 6 mg L-1 de FeSO4, 6 mg L-1 de CuSO4 e 6 mg L-1 de

MnSO4. Nos frascos avaliaram as quantidades adicionadas de aminoácidos

precursores, sendo que a maior concentração de GSH foi de 530 mg L-1 na

fermentação feita com 4 mM de cada um dos três aminoácidos. No

fermentador foi estudado o controle da alimentação do fermentador com

glicose de acordo com a concentração de etanol e os resultados do

quociente de respiração e também o efeito da adição dos aminoácidos nos

tempos (0, 16, 32, 48 h). A adição de glicose iniciou após 10 h de

fermentação e no ensaio sem adição de aminoácidos foram obtidas 1620 mg

L-1 de GSH e 140 g L-1 de biomassa seca após 52 h de cultivo. No ensaio

com adição dos aminoácidos no tempo de 32 h de fermentação, a

concentração máxima foi de 2020 mg L-1 em 38 h de cultivo.

Piedrahíta-Aguirre (2008) avaliou a produção de GSH com S.

cerevisiae ATCC 7754, em frascos Erlenmeyer a partir de fontes proteicas

de baixo custo, tais como: carbono, nitrogênio e aminoácidos. As condições

de cultivo nas três etapas foram: pH 5,0, 20ºC, 300 rpm, durante 96 h. Na

primeira etapa foi realizado um planejamento fatorial fracionado 25-1 , no qual

obteve-se 264,49 mg L-1 de GSH. Na segunda etapa foi realizado

planejamento Plackett Burman (PB-12), no qual se diminuiu a quantidade do

extrato de levedura, devido a elevados custos e se adicionou MgSO4,

obtendo-se excelente rendimento com 23,33 g L-1 de crescimento celular e

278,42 mg L-1 de GSH. Na terceira etapa realizou-se outro PB-12,

conseguindo uma produção de 166,84 mg L-1 de GSH e 18,75 g L-1 de

concentração celular.

Segundo Fei et al. (2009), a produção de GSH foi estimulada através

de mecanismos enzimáticos ligados a expressão gênica de proteínas

43

heterólogas utilizando como vetor, a levedura Pichia pastoris D18. A

metodologia baseava-se na adição de dois genes responsáveis pela síntese

de GSH, a gsh 1 e a gsh 2, presente em cepas selvagens de S. cerevisiae.

O cultivo foi conduzido através de batelada alimentada após 16 h com 2,9

mg L-1 de glicose, em fermentador de 5 L, a 30°C, com adição de cisteína,

glicina e ácido glutâmico após 44 h de fermentação, ambos em

concentrações de 15 mmol/L. A glicose foi escolhida como principal fonte de

carbono e extrato de levedura como principal fonte de nitrogênio. O processo

indicou que a levedura recombinante apresentou eficiência na síntese de

GSH, através da conversão dos três aminoácidos precursores, e é capaz de

aumentar a produtividade de GSH em cultivos com elevadas densidades

celulares, obtendo altos rendimentos por processo a baixo custo sendo que

a melhor produção de GSH foi a 50 h de processo com 217 mg L-1 e 4,15 g

L-1 de biomassa.

Taskin (2012) investigou a aplicabilidade do hidrolisado de proteína

de pena de frango (Chicken Feather Peptone, CFP) como um substrato para

a produção de GSH de Saccharomyces cerevisiae e consequentemente

atuar como uma solução ambiental para o despejo desse resíduo. No CFP

foi encontrado cinzas (36,7 g por 100 g), proteína (61,1 g por 100 g) e

minerais (S, P, K, Ca, Fe, Na e Mg). Também teve um elevado teor de

cisteína e glicina. CFP aumentou a biomassa e a produção de GSH de 53 e

115%, respectivamente em comparação com o meio de controle (continha

glicose 60 g L-1 e extrato de levedura 4 g L-1). As maiores concentrações de

biomassa (17,4 g L-1) e de GSH (271 mg L-1) foram alcançadas em meio

CFP. A segunda mais elevada concentração de biomassa (16,8 g L-1) e GSH

(255 mg L-1) foram obtidos em meio de peptona de peixe. Supõe-se que o

conteúdo elevado de minerais, cisteína e glicina de CFP foram relacionados

com o crescimento celular e a síntese de GSH em S. cerevisiae.

O principal resíduo da produção de queijo é o soro, cujo potencial

poluidor é imenso. Exemplificando uma pequena indústria que produza

1.000 kg dia-1 de soro gera 10 m³ de soro, com uma demanda bioquímica de

oxigênio semelhante a um esgoto municipal gerado por cinco mil habitantes.

44

No entanto, um metro cúbico de soro poderia ser vendido in natura para uso

em ração animal, por cerca de R$ 1,00/m³; transformado em biogás,

gerando 250 kWh m-³ de soro; seco (forncendo 80 kg de soro em pó,

vendido de R$ 1 a 2,50/kg) ou fracionado a 20 kg de proteína e 45 kg de

lactose bruta e também ser usado como substrato em processo fermentativo

(WOICIECHOWSKI et al., 2012).

Bowon et al. (2015) avaliou as concentrações de extrato de levedura

e soro de leite líquido para produção de GSH a partir da Saccharomyces

cerevisiae ATCC 7754. Para tal, foi realizado um Delineamento Composto

Central, tendo-se como resposta a concentração de GSH produzida. As

fermentações foram realizadas em agitador rotativo (New Brunswick, mod.

INNOVA 44), utilizando frascos Erlenmeyer (250 mL) contendo 50 mL de

meio de fermentação (meio + inóculo) as condições de fermentação foram

20ºC, 300 rpm, 5% de inóculo (v/v), pHinicial 5, durante 96 h. A maior

concentração de GSH e biomassa obtidos foram 352,03 mg L-1 e 17,29 g L-1

respectivamente quando utilizado 44 g L-1 de extrato de levedura e 18% de

soro de leite líquido, o que torna viável o uso de soro de leite líquido como

substrato em bioprocessos, minimizando o impacto ambiental causado por

esse subproduto de industrias leiteiras, além de reduzir o custo de produção

de GSH por processo fermentativo.

Portanto, aprimorar as metodologias de produção de GSH,

minimizando os custos do processo é uma excelente ação para reduzir o

preço da GSH. Por isto, estudos e patentes estão focadas principalmente na

melhoria de processos e na otimização por diversas linhas como a

engenharia genética e metabólica (WEN et al., 2005).

45

3.4. DETERMINAÇÃO DA GLUTATIONA

3.4.1. Metodologia Eletroquímica

Ao selecionarmos um método analítico com propósito de determinar

quantativamente e/ou qualitativamente uma amostra, ele deve ser específico

para diferenciar a GSH de outros tióis presentes nas células e em produtos

de biotransformação, além de separar GSH e GSSG de moléculas

interferentes, presentes em matrizes complexas. Desta forma, o desejo de

quantificar GSH fez com que elevasse o desenvolvimento de métodos para a

análise de compostos bioativos em diferentes tipos de amostras

(GONÇALES, 2010).

Desta forma, as técnicas eletroquímicas apresentam um elevado

potencial na caracterização detalhada dos antioxidantes presentes nas

amostras, pois fornecem parâmetros físico-químicos capazes de demonstrar

não apenas o potencial de redução destes, mas também o número de

elétrons envolvidos, a influência dos prótons e as constantes destas reações

(BORGES et al., 2011).

Segundo Oliveira (2011), se tratando de sensores químicos, estes

são constituídos de camada química seletiva (interage apenas com o analito

de interesse) e gera um sinal que pode ser usado para sua qualificação e/ou

quantificação. A resposta gerada pelo analito é originada na camada

quimicamente seletiva e são caracterizadas em termos de estabilidade,

repetibilidade, linearidade, histerese, tempo para saturação, seletividade e

sensibilidade, sendo os dois últimos os principais parâmetros que influência

na aplicabilidade do sensor químico.

Caso o analito não interage com o eletrodo, este é passível de

modificações na superfície eletródica pela imobilização de grupos funcionais,

incorporação de catalisadores inorgânicos e biológicos (enzimas e

anticorpos), deposição de filmes poliméricos, modificação com sílica e

deposição de membranas biológicas (GALLI et al., 2006). Moses et al.

(1975) define tais eletrodos como quimicamente modificado (EQMs) na qual

46

são mais seletivos e mais sensíveis, pois a modificação possibilita controlar

a natureza físico-química da interface eletrodo-solução como uma forma de

alterar a reatividade e seletividade do eletrodo base favorecendo, assim, o

desenvolvimento de eletrodos para diferentes aplicações analíticas.

Tratando-se de técnica eletroquímicas, a voltametria é uma técnica

que estuda a relação entre a corrente e o potencial durante a eletrólise

(decomposição de um composto por uma corrente elétrica) de uma espécie

química de interesse. Os primeiros estudos sobre curvas corrente versus

potencial, com aplicação na identificação e quantificação de espécies

eletroativas, foram realizados pelo químico Jaroslav Heyrovský em 1922,

que empregou como microeletrodo de trabalho, não polarizável, o eletrodo

gotejante de mercúrio e denominou a técnica de polarografia (HEYROVSKÝ,

1956).

Em condições experimentais definidas, as substâncias eletroativas

apresentam um potencial característico, no qual ocorre a transferência de

carga analito/superfície do eletrodo, gerando uma corrente proporcional à

concentração do analito em solução. A incomplexibilidade de redução ou

oxidação difere de substância para substância e é refletida pela posição da

onda em relação ao eixo do potencial e expressa pelo potencial de meia

onda. Portanto, além de conferir informações qualitativas sobre o analito, a

polarografia pode ser empregada para fins quantitativos, onde a relação

entre a corrente de difusão (corrente faradaíca) em função da concentração

da espécie eletroativa em solução é mensurada pela equação de Ilkovic.

A principal vantagem dessa técnica eletroanalítica é a possibilidade

da medida voltamétrica ser realizada diretamente na amostra em solução

sem prévio tratamento de extração, o que torna possível a determinação de

uma grande variedade de compostos. Aliada a essa vantagem, têm-se

também o curto tempo na realização das análises e a seletividade

combinada com a confiabilidade e baixo custo (CORREIA, 2008). A partir

dessas vantagens, a polorografia destaca-se como importante método

eletroanalítico para a investigação de compostos orgânicos, pois muitos

47

grupos funcionais são passiveis de oxidação e redução no eletrodo de

trabalho (SKOOG, 2007).

3.4.2. Cromatográficos

Os procedimentos para análise química são de modo geral, seletivos

e alguns são específicos. Por conseguinte, a separação do analito que pode

interferir na resposta é, na maioria dos casos, uma etapa decisiva nos

procedimentos analíticos. A cromatografia é um importante método de

separação que encontra aplicação em muitas partes do conhecimento.

Este método compreende um grupo variado e formidável de

métodos que permitem ao pesquisador separar componentes muito

análogos de misturas complexas. Em todas as separações cromatográficas,

a amostra é conduzida por uma fase móvel, que pode ser um gás, um

líquido ou um fluido supercrítico. Essa fase móvel é então forçada através de

uma fase estacionária imiscível fixa colocada na coluna ou numa superfície

sólida. Ambas as fases são eleitas de modo que os constituintes da amostra

se distribuam entre as fases móvel e estacionária em vários graus. Os

constituintes que são mais intensamente retidos na fase estacionária

movem-se muito vagarosamente no fluxo da fase móvel. De outro modo, os

componentes que se ligam mais fracamente à fase estacionária movem-se

mais ligeiramente. Como consequência dessa diferença na locomobilidade,

os componentes da amostra separam-se em bandas ou zonas discretas que

podem ser analisadas qualitativa em/ou quantitativamente (SKOOG et al.,

2002).

Ao longo da evolução técnica cientifica, vários métodos analíticos

foram desenvolvidos para a determinação de tióis, tais como: a

cromatografia líquida (CL), cromatografia de gás, cromatografia de permuta

iônica, eletroforese capilar e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

com várias técnicas de detecção, tais como raios ultravioletas, de

fluorescência (FL), eletroquímica e espectrometria de massa, sendo a ultima

a mais relatada (FERIN et al., 2012).

48

Quanto a CLAE, esta é um tipo de cromatografia líquida que utiliza

colunas pequenas, preenchidas de materiais especialmente preparados e

uma fase móvel que é eluída sob altas pressões. Ela tem a capacidade de

realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de

compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de

poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade (VALENTE et

al., 1983).

Se tratando de determinação da glutationa, a CLAE se destaca com

detecção variada. Na grande parte destes métodos cromatográficos,

envolve-se a derivatização da glutationa com agentes seletivos para tióis

entre os quais os mais usados são o o-ftaldialdeído (OPA) e o mono-

bromobimano (m-BBr) (ROVER JUNIOR et al., 2001). Entretanto, a reação

dos tióis com ambos reagentes não são seletivas sendo necessário

aplicarem-se técnicas de separação para evitar ou minimizar possíveis

interferências. Como alternativa, recentemente têm-se aumentado o

interesse em eletroforese capilar para análise de tióis com detecção feita por

espectrofotometria UV a baixos comprimentos de onda (PICOLLI et al.,

1994) e por fluorescência induzida por laser após derivatização da

amostra (ORWAR et al., 1995).

3.4.3. Espectrofotométrico

Em material de origem biológica, o método mais empregado para a

detecção de tióis como a glutationa é o espectrofotométrico. O ácido 5’,5’-

ditio-bis-(2-nitrobenzóico), ou simplesmente, DTNB, ou reagente de Elmann

é frequentemente utilizado nas determinações de GSH. O grupo sulfidrila da

glutationa quebra a ligação dissulfeto do DTNB, gerando o aduto GSTN

liberando o ácido 5-mercapto-2- nitrobenzóico, na qual desenvolve uma

coloração amarela sendo detectada no comprimento de onda de 412 nm

(ELMANN, 1959). A Figura 6 ilustra esse processo.

49

Figura 6 - Reação Entre Glutationa Reduzida e DTNB (Reagente De Ellman)

Para a Determinação de Hidroperóxidos Empregando a Enzima Glutationa

Peroxidase (Rover Junior et al., 2011).

Outras determinações espectrofotométricas também são relatadas,

como no caso na reação de ciclagem enzimática descoberta por Owens e

Belcher (1965) e desenvolvido por Tietze (1969), na qual a glutationa

oxidada (GSSG) reage com o nucleotídeo trifosfopiridina (TPNH) e a

glutationa (GSH) é gerada, e reage com o DTNB como detalhada na Figura

7.

Figura 7 - Reação Entre Glutationa Reduzida e TPNH Para a Determinação

De GSH (MARZAL, 2005).

50

3.5. MODELAGEM EM PROCESSOS FERMENTATIVOS

Os processos fermentativos envolvem altos custos de execução o

que torna indispensável ter um modelo que consiga descrever

quantitativamente as variáveis relevantes do processo. Porque em muitos

casos, o modelo pode minimizar os altos gastos e complexidade dos

experimentos (VOLESKY; VOTRUBA, 1992).

Na elaboração de modelos matemáticos de bioprocessos alguns

itens necessitam ser especificados para melhorar a precisão e qualidade dos

modelos, sendo eles compreensão estrutural, simulação, análise do sistema,

predição e projeto e otimização. Compreensão estrutural: Modelos

matemáticos devem fornecer as informações para que se possa conhecer o

comportamento do processo. Simulação: A maior aplicação dos modelos é

a exploração do possível comportamento do sistema. A simulação do

processo pode levar ao correto entendimento do comportamento do

processo, eliminando hipotéses que possam reproduzir resultados ruins.

Análise do sistema: Baseado num dado modelo matemático é possível

obter informações da estrutura do sistema e seu comportamento qualitativo.

Predição e Projeto: Baseado em um modelo validado, experimentos futuros

podem ser previstos sem a realização dos mesmos. O objetivo desta

ferramenta é fornecer embasamento para um projeto racional e eficiente do

bioprocesso. Otimização: Uma vez que os resultados são preditivos e estão

disponiveis, o último objetivo da engenharia bioquímica é o cálculo de um

projeto metabólico ótimo (WEICHERT, 2002).

O desenvolvimento de um modelo matemático relacionado a

fermentações normalmente inicia por um simplificado esquema de reações

advindas do conhecimento das rotas metabólicas envolvidas. Cada etapa da

reação metabólica é caracterizada pela reação estequiométrica ou pelo fluxo

de componentes (VOLESKY; VOTRUBA, 1992).

Assim verifica-se que a modelagem matemática consiste em

transformar problemas reais em problemas matemáticos, oportunizando

interpretar soluções, de modo a compreender o processo em estudo a cerca

51

de meios para agir sobre ele, como é o caso da produção de glutationa

(FAHOR, 2008).

Alfafara et al. (1993) desenvolveu um controle com lógica fuzzy para

controlar a concentração de etanol em processo batelada alimentada por S.

cerevisiae com o objetivo de maximizar a produção de GSH. Constatando

que quando para as células na fase de produção de GSH foi ajustado para

manter a velocidade específica de produção de GSH para 6,2 mg g-1 h-1 o

total de concentração de GSH aumentou 56% a mais que o meio controle.

Liu et al. (1999) trabalhou com um delineamento Box Behken e RSM

(Resposta de superfície de resposta) seguida de análise canônica para

otimizar a concentração de glicose, pepona e MgSO4 na produção de GSH

por S. cerevisiae ATCC 7754 e comparou os dados com um modelo

proposto por rede neural. O modelo gerado pela rede neural predizeu o

crescimento celular e produção de GSH mais precisamente que o modelo de

superfície de resposta de segunda ordem.

Wei et al. (2003a) aplicaram um modelo cinético modificado com

sucesso para estimar a cinética de crescimento de células. A taxa máxima

de crescimento específico e a inibição constante pelo substrato foram

calculadas a partir desta equação, foram ambas aumentadas, juntamente

com a temperatura. Além disso, a fermentação da glutationa por C. utilis

WSH 02-08 sob várias temperaturas foi provado ser um processo associado

ao crescimento parcial através da estimativa do processo com a equação

Luedeking-Piret. Com base na estimativa dos parâmetros, o efeito da

temperatura na cinética de crescimento de células foi ainda estudado. Uma

equação foi desenvolvida e aplicada para interligar a relação entre a

concentração de biomassa e da temperatura, bem como a concentração de

substrato na fermentação. Os resultados da experiência mostraram que este

modelo poderia prever o padrão de crescimento muito bem.

Liang et al. (2009) estudou os efeitos dos valores de pH sobre o

crescimento celular e produção de glutationa (GSH) em fermentador de 7 L

utilizando a cepa Candida utilis WSH 02-08. Constataram que o menor valor

52

de pH favorece o crescimento de células, mas retarda a produção de GSH,

em contrapartida, o maior valor do pH promove aumento na produção de

GSH enquanto inibe o crescimento de células. Então uma estratégia de

mudança de pH, otimizada via simulação da função de Gauss, foi

desenvolvida. Através da aplicação de dois estágios de mudança de pH

estratégia de controle do pH em 5,0 para os primeiros 7,5 h e depois

mudando para 6,0 com um rendimento final de GSH e produtividade de 279

e 12,7 mg L-1 h-1 após 22 h de cultura, aumentaram 30 e 42%,

respectivamente,em comparação com a operação constante de pH de 5,5.

Além disso, através da alimentação de glicose, em vez de ácido sulfúrico

(H2SO4) solução para controlar o pH, o rendimento máximo de GSH foi de

315 mg L-1, sugerindo que a aplicação de estratégias de mudança de pH

para a superprodução de GSH como sendo viável.

Os processos fermentativos incorporam uma serié de características

que os diferem de processos químicos, o que pode explicar as dificuldades

encontradas na formulação e elaboração de modelos matemáticos que

representem adequadamente estes processos, ao contrário do que ocorre

com processos químicos convencionais. Pode se citar baixas concentrações

e baixas velocidades de reação, como resultado da utilização de um meio

diluído; complexidade de mistura reagente e capacidade do sistema de

sintetizar seu próprio catalisador; conhecimento insuficiente de vários

fenômenos limitantes das velocidades de produção e falta de sensores para

automação on-line; problemas de esterilidade, segurança e eventualmente

toxicidade dos processos fermentativos (ENGASSER, 1988).

Há dois grandes grupos de modelos matemáticos de processos

fermentativos: Modelos fenomenológicos e Modelos entrada-saída. Um

modelo fenomenológico, também denominado de mecanicista, é constituído

por um conjunto de relações matemáticas entre as variáveis de interesse do

sistema em estudo (BONONI; SCHMIDELL, 2001).

Na formulação de um convencional modelo matemático

fenomenológico (caixas brancas), normalmente são utilizadas equações que

53

podem ser classificadas em: equações de balanço ou conservação (massa,

energia e quantidade de movimento); equações de velocidade (equações de

velocidade de transporte de massa, energia e componentes ou espécies

químicas; equações de velocidade de geração ou consumo de espécies

dentro do sistema); equações termodinâmicas. As equações de velocidade

de transformação, ou equações cinéticas, são específicas para processos

fermentativos e constituem os chamados modelos cinéticos (BONONI;

SCHMIDELL, 2001).

Os modelos cinéticos de processos fermentativos podem ser

classificados, quanto ao número de componentes usados na representação

celular. Modelos não estruturados, onde o material celular é representado

por uma única variável e os modelos estruturados nos quais as células são

descritas com maiores detalhes (BONONI; SCHMIDELL, 2001).

Quanto a heterogeneidade da população, os modelos cinéticos são

classificados em modelos não segregados, onde a população celular é

considerada homogênea, isto é, apresentam o mesmo comportamento e os

modelos segregados em que as células são consideradas discretas, como

indivíduos de uma população heterogênea, com distribuição de idade, de

tamanho e de propriedades celulares (BONONI; SCHMIDELL, 2001).

Modelos entrada-saída (caixa-preta) permitem calcular uma ou mais

respostas do sistema (duas saídas) a partir de um número definido de

variaveis de entrada medidas. Um exemplo, são as redes neurais artificiais,

a síntese das informações de entrada é feita por uma ponderação dos

diversos sinais, através de ajustes de coeficientes e uma posterior

transformação não linear, comumente do tipo sigmóide (BONONI;

SCHMIDELL, 2001).

Em resumo a literatura reporta a existência de três grupos que

compreendem as técnicas de modelagem: caixa branca, caixa preta e caixa

cinza. Nos modelos de caixa branca a técnica é subsumir, assim, todos os

tipos de equações diferenciais (ordinárias ou parciais). Por outro lado, os

modelos de caixas-pretas são obtidos principalmente pelas classes de

54

modelo parametrizado, por exemplo, consistem em combinações de funções

de base simples. Os parâmetros dos modelos tem de ser identificados

(estimado) por meio de dados úteis, por exemplo, por meio de redes neurais.

O terceiro tipo de técnica é chamado de modelo caixa-cinza. Este subsume

todos os modelos entre os dois extremos de modelos caixa branca e preta,

como exemplo, podemos citar os modelos que consistem de equações

diferenciais, onde vários parâmetros que ocorrem nestas equações não são

conhecidos e têm de ser extraídos a partir do sistema através de métodos

com base de dados (HAUTH, 2008).

As noções de modelos caixa-branca e caixa-preta são idealistas. Na

realidade, a modelagem é sempre algo entre essas duas visões extremas,

mesmo que tenha-se alguma introspecção estrutural no sistema real e

deseja-se aplicar a modelagem de caixa-branca, processo no qual muitas

vezes não há conhecimento dos parâmetros exatos nas equações

derivadas. Estes parâmetros precisam então ser identificados através de

medições e otimização. Ou, de forma reversível, o conjunto de possíveis

modelos para a modelagem caixa-preta é muitas vezes guiados por algum

conhecimento sobre o comportamento fenômenológico do sistema dado. Em

todos os casos, estão na verdade usando um tipo de modelo chamado

caixa-cinza, o que constitui uma mistura entre os regimes de modelo caixa

branca e caixa-preta (HAUTH, 2008).

A essa junção de duas ou mais técnicas para diferentes aspectos de

um sistema microbiano dá-se o nome de modelagem híbrida (PATANAIK,

2009). Esta técnica de modelagem também é chamada de caixa-cinza

(ZORZETTO, 2000; KOMIVES, 2003; BOARETO, 2005).

Após obter o modelo é importante realizar simulações, que nada mais

é do que utilizar o modelo gerado, de maneira que o mesmo reproduza o

comportamento real do sistema, objetivando sua otimização (maximizar a

produtividade ou o lucro) e ainda permitam extrapolações válidas deste

comportamento. Em seguida faz-se necessário submeter os modelos obtidos

a análises estatísticas para verificar se os modelos representam

55

adequadamente o conjunto de dados experimentais (BONOMI; SCHMIDELL,

2001).

3.6. CONCLUSÕES SOBRE A REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

A glutationa é sintetizada no organismo humano pela ação

sequencial de duas enzimas (γ-GS e GS) e o órgão responsável pela

produção e exportação de GSH é o fígado. É definida como um tripeptídeo

linear e hidrossolúvel, sendo possível encontra-la sob as formas reduzida e

oxidada. Sua principal função é atuar como antioxidante. Possui outras

funções também, fato este que dificulta atribuir uma causa direta para

determinadas doenças por alterações dos níveis de GSH, somente pode-se

inferir que há participação da GSH para a manifestação e progressão de

doenças. Atualmente é aplicada nos segmentos alimentício, ambiental,

farmacêutico e desportivo.

Sinteticamente é produzida pelos métodos químico, enzimático e

fermentativo. A metodologia fermentativa possui a vantagem de ser prática e

eficiente, além de empregar leveduras como S.cerevisiae e C. utilis.

Estressando-se a cepa por meio de choque osmótico, redução de nutrientes

e elevação da temperatura aumenta-se o consumo de energia pelas

leveduras e consequentemente acumula-se GSH no interior da célula.

Sendo que a glutationa é excretada para o meio externo após ruptura da

membrana celular.

Para os processos fermentativos que empregam células

leveduriformes os meios de cultura necessitam conter fontes de carbono e

nitrogênio, desta maneira o glicerol e o melaço de cana-de-açúcar são fontes

alternativas de carbono e de baixo custo, úteis para a multiplicação celular,

originando GSH. Essa biomolécula é detectada por espectrofotometria a 412

nm após a amostra reagir com o DTNB.

Sabe-se que processos fermentativos envolvem elevados custos,

estes por sua vez, podem ser contornados aplicando-se técnicas de

56

modelagem matemática, possibilitando-se predizer a produção de GSH por

S.cerevisiae usando-se subprodutos industriais.

As técnicas de modelagem compreendem três grupos: caixa branca,

caixa preta e caixa cinza. Os modelos caixa brancas são também

denominados de fenomenológicos, nestes utilizam-se equações diferenciais

ordinárias ou parciais. Os modelos caixa pretas, chamados também de

empíricos são obtidos pelas classes de modelos parametrizados. E os

modelos caixa cinzas, intitulados híbridos, trata-se de uma junção das

técnicas fenomenológicas e empíricas.

Após obter o modelo é fundamental realizar simulações e análises

estatísticas, a fim de verificar se o modelo obtido representa os dados

experimentais. E um aspecto importante de se ressaltar é referente a

otimização de processos biotecnológicos, pois uma vez que os resultados

são passíveis de predição, um dos últimos objetivos é o cálculo de um

projeto metabólico otimizado. A partir do qual se fundamenta a validação do

modelo otimizado.

57

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. MICRORGANISMO E SUA MANUTENÇÃO

A cepa de Saccharomyces cerevisiae utilizada nos experimentos foi

a ATCC 7754, cedida pela Coleção de Culturas Tropical da Fundação André

Tosello (Campinas-SP). Esta foi mantida em tubos de ensaio inclinados com

meio Yeast Extract - Malt Extract (YM). No Quadro 2 está a composição do

meio utilizado para manutenção da levedura.

Quadro 5 – Meio de cultura para manutenção da cepa Saccharomyces cerevisiae ATCC

7754

Componentes do meio de manutenção Concentração (g L-1

)

D-(+)-Glicose Anidra P.A (NEON®-01467) 10,0

Peptona (HIMEDIA®-RM001) 5,0

Extrato de levedura (HIMEDIA®-RM027) 3,0

Extrato de malte (HIMEDIA®-RM004B) 3,0

Ágar tipo 1 (HIMEDIA®-RM666) 20,0

Trimestralmente foram feitos repiques. Técnica que consiste na

transferência de um microrganismo de um meio de cultura para outro a fim

de garantir a viabilidade celular da cepa. Inicialmente dissolveu-se o extrato

de levedura, o extrato de malte, a peptona e a glicose em 1,0 L de água

destilada, o pH foi ajustado a 5, a temperatura ambiente, depois adicionou-

se o ágar até dissolver completamente evitando a ebulição para que não

ocorra caramelização do meio. Dispensou-se 9 mL do material em tubos de

ensaio com rosca. Esterilizaram-se em autoclave por 15 minutos, a 121ºC.

Após retirar da autoclave, inclinou os tubos ainda quentes para que

solidificarem, com a superfície em forma de "bico de flauta" (ângulo de 45º).

Com o material solidificado estriou-se a superfície inclinada do meio e

incubou em estufa a 30ºC, por 48 h. Assim foram obtidos os tubos para

manutenção sob refrigeração a 4ºC (ANVISA, 2016).

58

4.2. POLIMORFISMO NO COMPRIMENTO DE

FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO DNA MITOCONDRIAL

Com o intuito de confirmar a pureza da cepa foi utilizada a técnica de

polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição do DNA

mitocondrial.

As cepas foram inoculadas em placas com meio GPY (Quadro 3) e

incubadas durante 24 horas. Dessas placas foram coletadas quatro colônias

isoladas para comprovação de pureza da linhagem.

Quadro 6 – Composição do meio GPY

Componentes do meio de manutenção Concentração (g L-1

)

D-(+)-Glicose Anidra P.A (NEON®-01467) 20,0

Peptona (HIMEDIA®-RM001) 5,0

Extrato de levedura (HIMEDIA®-RM027) 5,0

Ágar tipo 1 (HIMEDIA®-RM666) 20,0

4.2.1 Extração do DNA

A extração do DNA foi realizada conforme metodologia descrita por

Querol et al. (1992).

As células foram cultivadas em 1 mL de meio GPY (sem a adição de

ágar) durante 12 horas, a 28ºC, sem rotação. Após este período as células

foram centrifugadas a 2500 rpm, por 3 min, suspensas em água ultra pura

estéril e, em seguida, centrifugada sob as mesmas condições citadas

anteriormente.

As células sedimentadas foram ressuspendidas em 0,5 mL de uma

solução de enzima lítica de Rhizoctonia solani (SIGMA), contendo 25 mg

mL-1 de enzima em sorbitol 1 M e EDTA 0,1 M (pH 7,5). A suspensão foi

transferida para tubos de 1,5 mL e incubadas a 45 °C por 2 horas com

agitação por 30 min. Para obter os protoplastos, foram adicionados 30 µl de

“Zymolyase” 20T (Seikagaku Corporation, Tóquio, Japão) (1 mg mL-1) e

incubado a 37°C, durante 40 minutos. Em seguida as amostras foram

transferidas para tubos de centrífuga de 1,5 mL, os protoplastos foram

59

coletados por centrifugação, o sobrenadante foi descartado, e os

protoplastos foram incubados durante 5 minutos a 65°C em 0,5 mL de

solução de Tris HCl 50 mM (USB, Cleveland, EUA), pH 8 e EDTA 20 mM

(Panreac), pH 7,4. Foram adicionandos 13 µL de SDS (Sódio dodecil sulfato)

10% e incubado a 65°C, por 5 min. Logo após, 0,2 mL de acetato de

potássio 5 M foi adicionado aos tubos em banho de gelo, por 10 min.

Novamente os tubos foram centrifugados a 14000 rpm, durante 15 min, a

4ºC. O sobrenadante foi transferido para tubos novos contendo 0,7 mL de

isopropanol (para precipitação do DNA). A seguir, os tubos foram incubados

a temperatura ambiente por 10 min e centrifugados a 12000 rpm, por 10 min.

O DNA foi lavado com etanol 70% e, depois de seco, solubilizado em 20 µL

de água ultra pura estéril e congelado até o uso.

4.2.2 Digestão enzimática do DNA mitocondrial

Para digestão enzimática do DNA mitocondrial foi utilizada a

endonuclease Hinf I (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)

segundo o protocolo descrito por Querol et al. (1992). A mistura reacional

continha 19 µl de DNA, 1 µL de RNAase a 500 µg/mL (Boehringer

Mannheim), 1,5 µL de Hinf I e 2,5 µL de tampão 10X específico. A mistura foi

incubada a 37°C durante 12 horas. Os fragmentos de restrição de DNA

mitocondrial foram separados em géis de agarose com solução de coloração

de ácidos núcleicos Realsafe Stainig 20.000X (5 µL/100 mL) (Real), agarose

(Pronadisa) 1% (p/v), em tampão TAE 1X (40 mM de Tris-acetato, 1 mM de

EDTA, pH 8) a 90 V. Os fragmentos foram visualizados com luz UV e

fotografados em comparação com os marcadores λ digerido com PstI (247 a

11,501 pares de bases, a uma concentração 0,1 µg/µL).

60

4.3. OBTENÇÃO DE DADOS PARA MODELAGEM

MATEMÁTICA

Parte dos resultados para modelagem matemática foi constituído

dos resultados de Anshau (2010) em uma parceria com a pesquisa de

modelagem (Anexos A e B). Outros experimentos também foram elaborados

para complementação e ajuste de alguns resultados.

4.4. INÓCULO E PROCESSO FERMENTATIVO

O pré-inóculo consistiu de 50 mL de meio de cultivo preparados em

erlenmeyers de 250 mL, as células adicionadas no meio foram recolhidas

dos tubos de manutenção. As condições de agitação, temperatura, tempo de

fermentação e o meio de cultivo utilizado foram 150 rpm a 30ºC por 24 horas

em meio YM, sem ágar.

No meio para fermentação havia melaço de cana-de-açúcar (0-90 g

L-1), glicerol P.A. (0-90 g L-1), Água de maceração de milho (50 g L-1),

proteína de soro de queijo (50 g L-1), extrato de levedura (10 g L-1), sulfato

de magnésio (10 g L-1) e lecitina (5 mM). O melaço de cana-de-açúcar e o

glicerol foram adicionados de acordo com os níveis do planejamento

experimental, esterilizados separadamente (121ºC, 15 min) e posteriormente

misturados ao meio.

A água de maceração de milho (AMM) foi cedida pela Corn Products

- Mogi Guaçu/ SP (sua composição encontra-se no Anexo C). O soro de

queijo desidratado foi adquirido da ALIBRA Ingredientes Ltda, Campinas/SP,

porém antes de ser utilizado, foi realizado processo de extração de proteína

de acordo com Ogrodowski (2006) para evitar a precipitação e o

escurecimento do meio quando esterilizado.

As fermentações foram preparadas em agitador rotativo, com

frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio. A concentração de

inóculo foi fixada em 5%. O procedimento fermentativo foi conduzido a 20ºC,

61

com um pH 5 e 300 rpm, de acordo com Santos et al. (2007), durante 96 h

com retiradas de amostras nos tempos 0, 24, 48, 72 e 96 h.

4.5. PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

Um delineamento composto central rotacional (DCCR) 2² foi

elaborado para avaliar a concentração de melaço de cana-de-açúcar e de

glicerol, totalizando 11 ensaios, sendo quatro fatoriais (combinação dos

níveis -1 e +1), quatro axiais (-α e +α, com α igual a 1,41) e três repetições

no ponto central (0). A Tabela 2 apresenta os níveis codificados e reais das

variáveis estudadas.

Tabela 2 – Matriz dos ensaios do DCCR 2² com níveis codificados e reais das variáveis

estudadas.

Ensaio Melaço de cana (g L-1

) Glicerol (g L-1

)

1 -1 (13,1) -1 (13,1) 2 +1 (76,9) -1 (13,1) 3 -1 (13,1) +1 (76,9) 4 +1 (76,9) +1 (76,9) 5 -1,41 (0) 0 (45) 6 +1,41 (90) 0 (45) 7 0 (45) -1,41 (0) 8 0 (45) +1,41(90) 9 0 (45) 0 (45)

10 0 (45) 0 (45) 11 0 (45) 0 (45)

Fonte: Anshau (2010).

4.6. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

A determinação da concentração celular foi realizada por

espectrofotometria, através da leitura da absorbância do meio de cultura a

600 nm, utilizando espectrofotômetro (Lambda 45 da Perkin Elmer UV -

Visível). Todas as amostras foram homogeneizadas em vórtex por 1 min e

colocadas em cubetas de vidro para leitura da absorbância. O sobrenadante

obtido após a centrifugação foi utilizado como branco para eliminar a

interferência de coloração do meio de cultivo. As análises foram realizadas

em triplicata.

62

Os valores de concentração celular foram obtidos através de uma

curva padrão. Para construção desta, as leveduras foram incubadas durante

24 h no mesmo meio descrito no Item 4.1. Em seguida 6 ml foram

centrifugado a 4000 rpm, por 15 minutos. A massa celular foi duas vezes

lavada com água destilada e com diferentes diluições foi determinada a

absorbância a 600 nm e a massa seca correspondente (105ºC até peso

constante).

A partir dos resultados obtidos foi elaborado o gráfico da

absorbância versos concentração celular. Expresso em gramas de célula por

litro de meio. A curva padrão utilizada está apresentada no Apêndice A.

4.7. EXTRAÇÃO E DETERMINAÇÃO DA GLUTATIONA

A extração e a determinação da GSH foram realizadas por meio da

metodologia descrita por Owens e Belcher (1965).

Em cada tempo estipulado para coleta de amostra, iniciava-se a

extração da GSH. Transferiu-se 5 mL de meio fermentado para tubos

cônicos. Nos quais as células foram lavadas três vezes e centrifugadas a

4000 rpm, por 15 min. Na última centrifugação, foi desprezado o

sobrenadante e adicionado 5 mL de etanol P.A a 40% (v/v). Em seguida os

tubos eram homogeneizados (Homogeneizador de soluções AP 22, Phoenix

Luterco), durante 2 h, a 30°C. Após esse período as amostras foram

centrifugadas a 4000 rpm, por 15 min, obtendo-se GSH no meio extracelular.

Para a determinação da GSH adicionava-se 0,5 mL do sobrenadante

de extração da GSH, 1,5 mL do tampão fosfato de potássio (KH2PO4 –

NaOH, 0,5 M; pH 8,0) e 0,3 mL de solução de 5,5`-dithiobis-2-nitrobenzoic

acid (DTNB, Fluka, Japão) em tubos de ensaio. Após 3 min de reação, foi

realizada a leitura em espectrofotômetro (Lambda 45 da Perkin Elmer UV -

Visível) a 412 nm. Paralelamente, foi feito o branco da reação (duplicata),

utilizando solução de etanol 40% (v/v). Os valores individuais de absorbância

63

foram interpolados com base na curva padrão de glutationa. Os resultados

foram expressos em mg de GSH por litro de meio fermentado.

A solução de DTNB foi preparada adicionando 0,396 g deste

reagente e 0,15 g de NaHCO3 em tampão fosfato de sódio (NaH2PO4 –

Na2HPO4, 0,1 M, pH 7,0). A solução foi avolumada para 100 mL e congelada

(-18ºC) para demais usos.

A curva padrão foi elaborada a partir de uma solução estoque com

0,01 g de L-glutationa reduzida (Fluka, Japão), em 100 mL de HCl 0,01 M.

Os resultados da curva padrão estão descritos no Apêndice B.

4.8. DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL HIDROGÊNIÔNICO

(pH)

As medidas de pH do meio de fermentação foram feitas através de

medida direta por potenciômetro de bancada, após calibração do

instrumento com as soluções de pH 7 e 4.

4.9. DESENVOLVIMENTO DO MODELO MATEMÁTICO

Para obter o modelo matemático de predição da produção de GSH

foram utilizados os Softwares Matlab® versão 7.6, Assistat®, Minitab® v. 17

e o pacote computacional Excel®. A construção do modelo híbrido foi

conduzida de acordo com as etapas descritas nos itens 4.9.1, 4.9.2 e 4.9.3.

4.9.1. Modelo mecanicista (Caixa Branca)

Na formulação do modelo mecanicista foi utilizada a equação de

velocidade específica de formação de produto dentro do sistema, com dados

advindos dos ensaios realizados no laboratório por Anshau (2010) descrito

nos Anexos A e B. Os dados foram usados na Equação 1, proposta por

Gaden em 1955.

64

(1)

Onde é a velocidade específica de formação de produto (h-1), X é a

concentração de biomassa em um dado instante de tempo (h), / é a

taxa de formação de produto.

4.9.2. Modelo Empírico (Caixa Preta)

Inicialmente realizaram-se testes preliminares nos quais se

aplicaram diferentes funções matemáticas (função linear, função

exponencial, função logarítmica) a fim de definir qual seria a equação

matemática aplicada à caixa preta. Para determinar a melhor equação

matemática de ajuste dos resultados experimentais, utilizou-se o software

Minitab® v.17.

Em seguida, foi definido que a resposta seria obtida a partir da

Equação 2, onde y (velocidade específica de formação de produto

experimental) é função de y1 (velocidade específica de formação de produto

predito). Nesta etapa do trabalho foi utilizado o software Matlab® versão 7.6.

(2)

Posteriormente foram obtidos os valores dos coeficientes da função

y1, onde posteriormente estes coeficientes foram linearizados e

parametrizados em função de uma equação senoidal com o propósito de

melhorar o ajuste e obter o modelo final.

4.9.3. Modelo Híbrido (Caixa cinza)

A modelagem matemática híbrida se refere à junção das equações

mecanicistas com o modelo empírico. O Fluxograma de obtenção do modelo

híbrido pode ser visualizado na Figura 8 e no Apêndice C encontram-se as

programações elaboradas para a construção do modelo.

65

Figura 8 – Fluxograma De Obtenção Do Modelo Hibrido

Os valores dos coeficientes de determinação foram obtidos pela

metodologia dos mínimos quadrados.

Os resultados experimentais e os preditos foram avaliados

estatisticamente por análise de variância para possível constatação de

diferenças significativas.

Realizou-se também a análise da intensidade de associação do

modelo. Para tal, utilizou-se o índice de concordância (d) proposto por

Willmott (1982), descrito pela Equação 3.

[∑ | |

∑ (| | | |)

] (3)

Onde:

: é a média entre os dados obtidos pelo modelo híbrido.

O índice de concordância (d) é uma medida de quão bem o modelo

estima o afastamento dos dados da média observada. O índice de

concordância tem um intervalo variando entre 0 e 1, sendo que valores

próximos a 1 mostram uma concordância perfeita.

66

4.10. OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA

Por meio do modelo final foi possível obter os resultados ótimos de

produção de GSH, usando as condições de concentrações de melaço e

glicerol. Essas concentrações foram maximizadas a fim de definir as

condições que apresentaram as melhores respostas de GSH.

Para obter os valores ótimos para melaço e glicerol e o tempo

máximo de fermentação, procedeu-se da seguinte forma: Realizaram-se

combinações das concentrações de melaço e glicerol. Inicialmente em um

intervalo de valor maior (0 a 90 g L-1, para melaço e glicerol) após encontrar

uma faixa ótima realizou-se os testes com intervalos menores dentro dessa

faixa (80 a 30 g L-1, para melaço e glicerol). Assim obtiveram-se os valores

para melaço e glicerol e o maior tempo de fermentação no qual haveria essa

produção (Apêndice D).

Os melhores resultados (estimados) foram usados como pontos

centrais, na etapa de validação do modelo.

4.11. VALIDAÇÃO DO MODELO

A partir dos resultados obtidos na otimização numérica procedeu-se

a validação do modelo. A validação foi feita através de um planejamento

fatorial completo 2², sendo quatro fatoriais (combinação dos níveis -1 e +1),

e quadruplicada no ponto central. A Tabela 3 apresenta o delineamento

experimental utilizado para a etapa de validação, sendo os pontos centrais

as condições otimizadas numericamente. Trabalhou-se com 90 g L-1 de

melaço e 60 g L-1 de glicerol nos níveis superiores e 50 g L-1 de melaço e 20

g L-1 de glicerol nos níveis inferiores.

67

Tabela 3 – Matriz dos ensaios do Delineamento Fatorial Completo 2² com níveis de variação

codificados e reais para as variáveis estudadas.

Ensaio Melaço de cana (g/L) Glicerol (g/L)

1 -1 (50) -1 (20) 2 -1 (50) +1(60) 3 +1(90) -1 (20) 4 +1 (90) +1 (60) 5 0 (70) 0 (40) 6 0 (70) 0 (40) 7 0 (70) 0 (40) 8 0 (70) 0 (40)

4.11.1. Cálculos e fórmulas utilizados durante as análises da

etapa de validação

Os cálculos utilizados durante as análises foram o conteúdo

intracelular de glutationa e as produtividades celular e de produto.

Através da Equação 4 foi calculado o conteúdo intracelular de GSH

(%), que relaciona o conteúdo de GSH (mg) e a massa celular (g).

Conteúdo Intracelular de GSH= ⁄

⁄ (4)

As Equações 5 e 6 foram utilizadas para cálculos da produtividade

em célula (PX – g L-1 h-1), que relaciona a concentração celular sobre

determinado tempo e em produto (PP – mg L-1 h-1), que relaciona a formação

do produto sobre determinado tempo.

PX =

(5)

PP =

(6)

68

4.12. ALTERNATIVA DE MEIO DE CULTIVO PARA

MINIMIZAÇÃO DE CUSTOS DA PRODUÇÃO DE

GLUTATIONA.

Em paralelo a pesquisa de modelagem desenvolveu-se um estudo

com o intuito de minimizar os custos de produção da GSH. O meio de cultivo

consistia de mosto sintético de uva e diferentes concentrações de melaço e

glicerol. As concentrações destes componentes foram feitos de acordo com

um Delineamento Composto Central Rotacional 2².

O estudo foi uma parceria com o Instituto de Agroquímica e

Tecnologia de Alimentos (IATA), situado na cidade de Valência, Espanha.

4.12.1. Processo Fermentativo

O meio de fermentação proposto para minimizar custos de produção

foi mosto de uva. Porém, para garantir a reprodutividade dos resultados,

optou-se por utilizar mosto sintético. Fez parte do meio 100 g L-1 de glicose;

100 g L-1 de frutose; 5 g L-1 ácido málico; 0,5 g L-1 ácido cítrico; 3 g L-1 ácido

tartárico; 0,75 g L-1 KH2PO4; 0,5 g L-1 K2SO4; 0,25 g L-1 MgSO4.7H20; 0,155 g

L-1 CaCl2.2H20; 0,2 g L-1 NaCl; 0,46 g L-1 NH4Cl; 13,09 mL de solução de

aminoácidos; 1 mL de solução de oligoelementos; 10 mL de solução de

vitaminas (No Apêndice E encontram-se descritas a composição das

soluções de aminoácidos, oligoelementos e vitaminas).

Em seguida o meio foi ajustado a pH 3,3 e esterilizado em filtro de

0,2 m.

O melaço de cana-de-açúcar e o glicerol foram adicionados

previamente aos frascos de acordo com os níveis de um Delineamento

Composto Central Rotacional 22 (Tabela 4), totalizando 12 ensaios, sendo

quatro fatoriais (combinação dos níveis -1 e +1), 4 pontos axiais e 4 pontos

centrais. Posteriormente, os recipientes foram fechados e esterilizados a

121ºC, por 20 min. Após resfriamento destes, foi adicionado o mosto

69

sintético em capela de fluxo laminar para garantir esterilidade do sistema de

fermentação.

Tabela 4 – Matriz dos ensaios do Delineamento Composto Central Rotacional 2² com os

níveis codificados e descodificados

Ensaios Melaço (g L-1

) Glicerol (g L-1

)

1 -1 (0,44) -1 (0,44)

2 -1 (0,44) +1 (2,56)

3 +1 (2,56) -1 (0,44)

4 +1 (2,56) +1 (2,56)

5 -1,41 (0) 0 (1,5)

6 +1,41 (3) 0 (1,5)

7 0 (1,5) -1,41 (0)

8 0 (1,5) +1,41 (3)

9 0 (1,5) 0 (1,5)

10 0 (1,5) 0 (1,5)

11 0 (1,5) 0 (1,5)

12 0 (1,5) 0 (1,5)

As fermentações foram conduzidas em garrafas de vidro com

capacidade de 1000 mL e volume útil de 700 mL. O processo foi conduzido

com rotação de 150 rpm, a 30ºC, durante 117 horas. As amostras foram

coletadas em 0, 24, 40, 72, 96 e 117 h.

4.12.2. Determinação da concentração celular

A determinação da concentração celular foi feita por

espectrofotometria, através da leitura da absorbância do meio de cultura a

600 nm, utilizando espectrofotômetro (UVmini-1240, UV-VIS

Spectrophotometer, Shimadzu). Conforme descrito no item 4.6

Os valores de concentração celular foram obtidos por meio de uma

curva padrão (Apêndice F). Para construção desta, as leveduras foram

incubadas em meio GPY, 170 rpm, 28ºC. Coletaram-se amostras nos

tempos 0, 12, 24, 32 e 45. As amostras foram centrifugada a 4000 rpm, por

15 minutos. A massa celular foi duas vezes lavada com água destilada e

com diferentes diluições foi determinada a absorbância a 600 nm e a massa

70

seca correspondente (105ºC até peso constante). Com os resultados obtidos

elaborou-se a curva padrão que relaciona a absorbância versos

concentração celular, expressa em gramas de células por litro de meio.

4.12.3. Determinação da glutationa total

Para a determinação da GSH foram utilizadas as metodologias

descritas por Tietze (1969), Griffith (1980) e Grant et al (1998). Em cada

tempo estipulado para coleta de amostra foram retirados amostras de

células do meio fermentado, estas foram lavadas duas vezes com tampão

fosfato de sódio (0,1 M pH 7,4) e centrifugadas, por 1 min, a 12000 rpm. As

células foram ressuspendidas em 1 mL de HCl (8 mM) e 1,3% de ácido 5-

sulfossalicílico, a 4ºC. Em seguida as células foram transferidas para tubos

de rosca, procedendo-se à dissociação das células com esferas de vidro

3x30’’. Posteriormente as amostras foram incubadas, por 15 minutos em

banho de gelo, centrifugadas durante 10 min em 13000 rpm a 4ºC, recolheu-

se o sobrenadante e armazenou no congelador.

A fim de medir a glutationa ligada a proteína ressuspendeu-se o

sedimento em boro-hidreto de sódio (1%), tornou-se a quebrar durante 20

segundos, a 4ºC, centrifugou-se a 10000 rpm, durante 1 h a temperatura

ambiente. O sobrenadante obtido após a centrifugação foi neutralizado com

100 mM de tampão fosfato de potássio (0,1 M pH 7,4).

Para quantificar a glutationa total, preparou-se tampões MES 2X (pH

6,0), MES 1X (pH 7,4) e fosfato EDTA (pH 7,5) bem como as soluções de

GSH, G6P, DTNB, NADP+, G6PDH e GSH redutase (Todas descritas no

Apêndice G). Em seguida diferentes concentrações de GSH foram

preparadas (Tabela 5) para construção da curva padrão que foi utilizada

para correlacionar os resultados encontrados nos diferentes experimentos

proposto no delineamento experimental.

71

Tabela 5 – Condições utilizadas para obtenção da curva padrão de glutationa.

GSH 50 µm Em MES 1X µL

Mes 1X µL

[GSH] µM equivalente

0 500 0,0 5 495 0,5

10 490 1,0 20 480 2,0 40 460 4,0 80 420 8,0

120 380 12 160 340 16

Logo, todos os componentes (Mix) foram adicionados e misturados

de acordo com a ordem descrita na Tabela 6. Em seguida, foram preparados

tubos eppendorf com 200 µL de amostra (revestidos com papel alumínio).

Foram adicionados 120 µL do Mix e 480 µL de DTNB, incubado a 100 rpm,

na ausência de luz, por 20 min. Após este tempo, mediu-se a absorbância

da amostra a 412 nm. Os resultados foram expressos com base em uma

curva padrão de GSH (Apêndice H) e os resultados foram expressos em

miligramas de GSH por litro de meio.

Tabela 6 – Mistura (Mix) de reagentes utilizados para determinação de glutationa total.

Componente Concentração estoque

Volume por amostra (µL)

Concentração final do ensaio

MES 2X 54.8 1X Gsh redutase 1,92 U/mL 5.2 1mU

G-6-P DH 0,125 mg/mL 20 3 µg/mL G-6-P 6,4 mg/mL 20 0,16 mg/mL NADP 16 mg/mL 20 0,4 mg/mL

4.12.4. Determinação do consumo de acúcares e produtos do

metabolismo celular

Os sobrenadantes foram analisados por CLAE. Em um cromatógrafo

Thermo (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) equipado com um detector

de índice de refração e ultravioleta. A coluna usada foi a HyperREZTM XP

Carboidratos H+ 8µm (Thermo Fisher Scientific), que foi protegido por

HyperREZTM XP Carboidratos (Thermo Fisher Scientific). As condições

usadas nas análises foram eluente 1,5 mM de H2SO4; fluxo de 0,6 mL min-1

e temperatura de 50ºC. As amostras foram diluídas cinco vezes, filtradas em

filtro de nylon de 0,22 mícrons (Symta, Madrid, Espanha) e analisadas em

72

duplicada. Os açúcares foram analisados nos tempos 0, 2, 17, 24, 40 e 72

horas.

73

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1. POLIMORFISMO NO COMPRIMENTO DE FRAGMENTOS

DE RESTRIÇÃO DO DNA MITOCONDRIAL

Todas as colônias estudadas apresentaram a presença de um perfil

molecular dominante (padrão de banda), referente à S. cerevisiae ATCC

7754 (Figura 9), mostrando a pureza da cepa de trabalho.

Figura 9 - Perfis Moleculares De S. cerevisiae ATCC 7754 Isoladas A Partir

De Placas Com Meio GPY, Obtidos Através Da Análise De Polimorfismo No

Comprimento De Fragmentos De Restrição Do DNA Mitocondrial. Na Pista

M: Marcador De Peso Molecular E Nas Pistas De 1 A 4 Perfis Moleculares

Referentes À Cepa ATCC 7754.

74

Verificou-se que as enzimas de restrição que clivam o DNA em

posições específicas, geraram um número restrito de comparáveis

fragmentos com vários comprimentos nas pistas de 1 a 4. A partir desses

fragmentos foi possível assegurar a pureza da cepa.

Ribéreau-Gayon et al. (2006) descreve que existem duas vantagens

em relação ao DNA mitocondrial de S. cerevisiae. Primeiramente, ele é

extremamente polimórfico dependendo da linhagem e, segundo, é estável

durante a multiplicação vegetativa. Dessa forma endonucleases de restrição

cortam o DNA em sítios específicos. Processo que origina fragmentos

distintos em número e tamanho, fator que possibilita sua separação por gel

de agarose.

5.2. DESENVOLVIMENTO DO MODELO

5.2.1 Modelo mecanicista

Os resultados de velocidade específica de formação de produto

( variaram de -3,46. 10-4 h-1 a 1,68. 10-4 h-1 (Tabela 7).

Tabela 7 - Resultados das velocidades específicas de formação de produto (h

-1) para os

ensaios realizados de acordo com o DCCR 2² nos tempos de 24 a 96 horas de fermentação.

Ensaio Melaço de cana (g L

-1)

Glicerol (g L

-1)

Tempo de fermentação (h)

24 48 72 96

1 -1 (13,1) -1 (13,1) 1,4E-04 7,0E-05 2,0E-05 -1,8E-04

2 +1 (76,9) -1 (13,1) 1,5E-04 1,5E-04 -1,8E-05 -2,9E-04

3 -1 (13,1) +1 (76,9) 1,2E-04 1,3E-04 -5,7E-05 -1,6E-04

4 +1 (76,9) +1 (76,9) 8,9E-05 9,4E-05 4,5E-05 -2,8E-04

5 -1,41 (0) 0 (45) 6,0E-05 1,4E-04 -3,3E-05 -3,1E-05

6 +1,41 (90) 0 (45) 9,7E-05 7,5E-05 6,1E-05 -3,4E-04

7 0 (45) -1,41 (0) 1,0E-04 1,0E-04 -1,79E-05 -3,4E-05

8 0 (45) +1,41(90) 8,0E-05 1,6E-04 -1,73E-05 -8,5E-05

9 0 (45) 0 (45) 1,0E-04 1,1E-04 3,2E-05 -1,2E-04

10 0 (45) 0 (45) 1,0E-04 1,1E-04 3.20E-05 -1,2E-04

11 0 (45) 0 (45) 1,0E-04 1,1E-04 3.20E-05 -1,2E-04

Após aproximadamente 75 horas de fermentação (Figura 10), os

valores da velocidade específica de formação de GSH diminuíram para os

75

ensaios contendo respectivamente 13,1 g L-1 de melaço e glicerol (Ensaio 1);

76,9 g L-1 de melaço e 13,1 g L-1 de glicerol (Ensaio 2); 13,1 g L-1 melaço e

76,9 g L-1 de glicerol (Ensaio 3); 76,9 g L-1 de melaço e glicerol (Ensaio 4);

90 g L-1 de melaço e 45 g L-1 de glicerol (Ensaio 6); 45 g L-1 de melaço e 45

g L-1 de glicerol (Ensaios 9, 10 e 11).

Figura 10 - Velocidade Específica De Formação De Produto Obtida A Partir

Do DCCR 2².

Shimizu et al. (1991) afirma que o declínio na velocidade pode ser

decorrente da alta concentração de glicose presente no meio e

consequentemente a formação de etanol. Processo bioquimicamente

denominado de fermentação alcoólica.

A fermentação alcóolica (Figura 11) é completada com duas reações

complementares utilizadas para reoxidar NADH + H+ a NAD+ e garantir a

continuação da glicólise. Na glicólise ou Via de Embden Meyerhof-Parnas

76

(EMP), uma molécula de glicose é degradada em uma série de reações

catalisadas por enzimas para liberar duas moléculas de piruvato. O destino

desse piruvato será em condições anaeróbias a fermentação alcóolica ou

em condições aeróbias o Ciclo de Krebs. Na fermentação, primeiramente o

piruvato é descarboxilado resultando a acetaldeído e dióxido de carbono

pela enzima piruvato descarboxilase, o que requer pirofosfato de tiamina

como uma coenzima. Finalmente, o acetaldeído é reduzido a etanol pela

enzima álcool desidrogenase em uma reação que envolve a oxidação de

NADH a NAD+ (CARRASCOSA et al., 2011).

Figura 11 - Esquema Onde Moléculas De Piruvato Formadas Na Glicólise

São Convertidas Em Moléculas De Etanol Durante A Fermentação Alcóolica

Shimizu et al. (1999) com base no balanço de massa, em conjunto

com a relação entre µ (velocidade específica de crescimento) e a velocidade

específica de produção de GSH, desenvolveu um modelo matemático para

determinar o perfil ótimo de µ em um processo de batelada alimentada para

a produção de biomassa e GSH. Como consequência, a produção máxima

de GSH foi 41% mais elevada do que meio controle. Para valores de µ de

0,3 h-1 o conteúdo de GSH foi constante e para valores de µ maiores que 0,3

h-1 o conteúdo de GSH diminuiu.

77

5.2.2 Modelo empírico

Após obter os resultados para o modelo mecanicista. Seguiu-se para

a elaboração do modelo empírico. Os testes preliminares evidenciaram que

a aplicação de uma equação polinomial seria o mais satisfatório no que diz

respeito à proximidade com os valores experimentais. Os polinômios de

segundo, terceiro e quarto grau foram testados para verificar qual forneceria

o melhor ajuste dos dados.

Os polinômios de terceiro e quarto grau resultaram em valores de

coeficiente de determinação (R²) próximos de 1, porém apresentaram

modelos finais com comportamento bem oscilante. Essa condição permitiu

inferir que os resultados não seriam confiáveis. Dessa maneira, optou-se por

utilizar ajustes polinomiais de segundo grau, conforme ilustrado na Figura

12.

Na Figura 12 estão apresentados os 165 resultados da formação de

GSH obtidos pelo DCCR 2² (Apêndice A). Nesta figura é possível inferir que

o tempo de fermentação é uma variável importante para o modelo, uma vez

que os resultados de produção de GSH no presente trabalho são

dependentes desta variável.

Portanto, a resposta dada pelo modelo denominada de f(y1) na

Equação 2 passou a ser numericamente representada pela Equação 7.

µGSH = A1+A2.t+A3.t² (7)

Onde:

µGSH = velocidade específica de formação de glutationa (h-1);

A1, A2 e A3 = Coeficientes da equação 1 e

t = Tempo de fermentação (h).

Figura 12 - Ajuste Polinomial De Segunda Ordem Adotado Para Representar

O Modelo Matemático Do Processo Fermentativo De Produção De GSH

78

Para Os 165 Valores De Glutationa Obtidos De Acordo Com O DCCR 2². As

Barras De Erro Indicam O Desvio Padrão Da Média De 4 Repetições (n =

11).

5.2.1 Modelo híbrido

Uma vez obtido os resultados dos modelos mecanicista e empírico

iniciou-se a junção destes, a fim de obter um modelo híbrido. Os dados de

entrada foram às velocidades específicas de GSH (h-1) e os tempos de

fermentação (h), e em seguida esses foram ajustados polinomialmente

(segunda ordem). Na Tabela 8 estão os conjuntos de coeficientes A1, A2 e

A3 e os valores de R² (entre 0,56 e 0,99) obtidos para cada curva, referente

ao DCCR 2².

Tempo (h)

0 20 40 60 80 100 120

GS

H (

mg L

-1)

0

20

40

60

80

100

120

140

GSH = 2,319 + 2,447 * T -0,02428*T²

79

Tabela 8 – Coeficientes A1, A2 e A3, referentes a Equação 9, obtidos pelo ajuste polinomial

de segunda ordem dos resultados experimentais da produção de glutationa a partir do

DCCR 2².

Coeficientes ajuste polinomial

Ensaio A1 A2 A3 R²

1 1,31570E-05 5,96898E-06 -8,35441E-08 0,9449

2 4,40000E-06 9,07583E-06 -1,27256E-08 0,9965

3 -3,45500E-06 9,27479E-06 -1,38498E-08 0,9935

4 -1,57742E-05 8,05160E-06 -1,10255E-08 0,9520

5 5,26571E-06 3,82202E-06 -4,66269E-08 0,5612

6 -1,98114E-05 8,88970E-06 -1,24193E-08 0,9150

7 1,91000E-05 3,46291E-06 -4,45312E-08 0,7062

8 1,34857E-06 5,66345E-06 -7,06349E-08 0,7991

9 1,17142E-06 5,81904E-06 -7,41567E-08 0,9934

10 1,17142E-06 5,81904E-06 -7,41567E-08 0,9934

11 1,17142E-06 5,81904E-06 -7,41567E-08 0,9934

Com a finalidade de obter o modelo final, o conjunto de valores dos

coeficientes (A1, A2 e A3) apresentados na Tabela 8, foram ajustados a uma

função linear (Equações 8,9, 10), sendo a equação linear dependente de

outra função, denominada C (Equação 11).

A1 = B1 + B2. C (8)

A2 = B3 + B4. C (9)

A3 = B5 + B6. C (10)

Onde:

B1, B3 e B5 = Bi;

B2, B4 e B6= Bj;

Sendo Bi e Bj são os coeficientes linear e angular, respectivamente.

C = sen((g1.*x1)-(g2.*x2)); (11)

Onde:

g1 e g2 = Parâmetros da função C;

80

x1 = Concentração de melaço de cana (g L-1) e

x2 = Concentração de glicerol (g L-1).

A função C tinha como variáveis as concentrações de melaço de

cana-de-açúcar (x1) e a concentração de glicerol (x2), ambas em (g L-1), os

parâmetros g1 e g2 variaram entre os valores 1 a 5. Com essas condições o

par (g1, g2) que apresentou o maior valor para o coeficiente de

determinação foi escolhido e a Equação 11 determinada. Na Tabela 9 são

apresentados os valores de Bi e Bj juntamente com os parâmetros g1 e g2

da função parametrizada C (Equação 11) e os valores de R² para cada uma

das Equações 8,9 e 10

Nos resultados expressos na Tabela 9 para os ajustes lineares dos

coeficientes observa-se que os valores para os parâmetros adotados são

significativos em relação aos valores dos coeficientes de determinação (R²)

os quais variaram de 0,83 a 0,90, representando um bom ajuste aos dados.

Tabela 9 – Resultados dos coeficientes Bi e Bj, dos parâmetros g1 e g2 e dos coeficientes

de determinação.

Coeficientes Bi Bj g1 g2 R²

A1 6,00E-07 -1,80E-07 2,67 3,43 0,9011 A2 6,67E-06 -4,55E-07 1,50 4,90 0,8784 A3 -5,35E-08 8,61E-09 3,62 4,75 0,8329

A literatura reporta a existência de três grupos que compreendem as

técnicas de modelagem: caixa branca, caixa cinza e caixa preta. O modelo

adotado no trabalho é a modelagem caixa cinza. De acordo com Aguirre

(2007) as técnicas desse grupo caracterizam-se por utilizar informação

auxiliar, o que também pode ser denominado de informação a priori. A

informação a priori, ou conhecimento prévio foi empregado nesse trabalho

por saber antecipadamente que o comportamento dos dados experimentais

poderia ser evidenciado por uma equação senoidal.

Segundo Gretschmann (2009) o uso de ajuste de curvas é uma

ferramenta para modelagem matemática bem ampla para distintos sistemas,

81

também que qualquer modificação no sistema, faz com que os parâmetros

ou até mesmo a equação do ajuste se modifique.

Experimentalmente utilizando 76,9 g L-1 de melaço e 76,9 g L-1 de

glicerol (Ensaio 4), em um tempo de 72 horas a máxima produção de GSH

foi de 119,6 mg L-1 e nas mesmas condições o modelo estimou 118,6 mg L-1

em 72 h (Tabela 10 e Apêndice I).

Tabela 10 – Resultado comparativo da produção de GSH entre os dados experimentais e os

dados preditos pelo modelo no tempo de 72 horas.

Ensaios Melaço de cana (g L

-1)

Glicerol (g L

-1)

GSH (mg L-1

) Experimental em 72 h

GSH (mg L-1

) Preditos em 72 h

1 -1 (13,1) -1 (13,1) 66,1 66,4

2 +1 (76,9) -1 (13,1) 97,9 95,4

3 -1 (13,1) +1 (76,9) 78,6 121,4

4 +1 (76,9) +1 (76,9) 119,6 118,6

5 -1,41 (0) 0 (45) 51,0 71,1

6 +1,41 (90) 0 (45) 117,8 78,8

7 0 (45) -1,41 (0) 63,9 79,9

8 0 (45) +1,41(90) 76,0 75,4

9 0 (45) 0 (45) 108,7 104,0

10 0 (45) 0 (45) 108,7 104,0

11 0 (45) 0 (45) 108,7 104,0

A simples adoção do coeficiente de determinação (R2) como único

critério de definição da qualidade de métodos não é adequado (BARROS et

al., 2009). Assim, a análise dos índices de concordância de Wilmont (d) e a

ANOVA auxiliam a interpretação dos resultados.

Os resultados preditos e experimentais para a produção de

glutationa foram analisados pela ANOVA (Tabelas 11, 12, 13 e 14). Como o

valor de Fcalculado não foi maior que valor de Ftabelado conclui-se que não há

diferenças significativas ao nível de 5% de probabilidade (0,34> p <0,83)

entre os dados preditos e os experimentais.

82

Tabela 11 - Resultado ANOVA para os dados preditos e os dados experimentais no tempo

de 24 horas

Fonte da variação SQ¹ gl² MQ³ Fcalculado4 valor-P Ftabelado

5

Regressão 29,21011 1 29,21011 0,512335 0,482404 4,351243

Resíduo 1140,275 20 57,01373 Total 1169,485 21

1- Soma dos quadrados; 2- Grau de liberdade, 3- Quadrado médio; 4- Valor de F calculado, 5- Valor de F tabelado.


de 48 horas


5

Regressão 324,48 1 324,48 0,932968 0,345628 4,351243

Resíduo 6955,866 20 347,7933 Total 7280,346 21


de 72 horas


5

Regressão 22,18037 1 22,18037 0,046438 0,831564 4,351243

Resíduo 9552,66 20 477,633 Total 9574,84 21


de 96 horas


5

Regressão 54,44782 1 54,44782 0,226921 0,638979 4,351243

Resíduo 4798,832 20 239,9416 Total 4853,28 21

Os resultados preditos pelo modelo híbrido apresentaram valores

próximos de 1 para o índice de concordância de Willmottt (Tabela 15). Assim

pode-se afirmar que a proximidade dos resultados do valor de referência 1

evidenciam a exatidão do modelo.

83

Tabela 15 – Resultado do índice de concordância de Willmontt (d), o qual relaciona os

dados preditos e os dados experimentais para cada ensaio realizado de acordo com o

Delineamento Composto Central Rotacional 2²

Ensaio Indíce de Willmott (d)

1 0,9954

2 0,9927

3 0,9994

4 0,9959

5 0,9915

6 0,9821

7 0,9963

8 0,9881

9 0,9988

10 0,9988

11 0,9988

Os resultados numéricos possibilitaram gerar os gráficos

comparativos entre os dados experimentais e os dados preditos. Antes do

perfil das curvas serem gerados os valores foram convertidos de µGSH (h-1)

para GSH (mg L-1). As Figuras 13, 14 e 15 apresentam as simulações dos

dados preditos em relação aos experimentais para os 11 ensaios

experimentais e modelados, assim como os tempos de fermentação que

compreendem de 0 a 96 horas. Ressaltando que a sobreposição das curvas

para os ensaios de 9 a 11 foram normalizados por serem pontos centrais.

Observa-se que nos resultados experimentais dos ensaios 7 e 8,

contendo a mesma concentração de melaço de cana-de-açúcar (45 g L-1) e

variando as concentrações de glicerol (0 e 90 g L-1, respectivamente), as

concentrações de GSH foram inferiores se comparadas com os ensaios 5 e

6 que continham 45 g L-1 de glicerol e concentrações de melaço variando

entre 0 e 90 g L-1. Nestes as concentrações de GSH variaram

consideravelmente, evidenciando que sua produção é influenciada por essa

fonte de carbono. Observação que também foi numericamente predita pelo

modelo.

84

Figura 13 - Resultados Experimentais e Preditos Encontrados Durante 96

Horas De Fermentação Para os Ensaios 1, 2 e 3

Figura 14 – Resultados Experimentais e Preditos Encontrados Durante 96

Horas De Fermentação Para os Ensaios 4, 5 e 6

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100

Co

nce

ntr

ação

de

GSH

(m

g L-1

)

Tempo (h)

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100

Co

nce

ntr

ação

de

GSH

(m

g L-1

)

Tempo (h)

Legenda:

Experimental Predito

Legenda:


85

Figura 15 – Resultados Experimentais E Preditos Encontrados Durante 96

Horas De Fermentação Para Os Ensaios 7, 8, 9, 10 e 11

Wei et al. (2003a) aplicaram um modelo cinético modificado com

sucesso para estimar a cinética de crescimento de células em uma

fermentação por C. utilis WSH 02-08 para a produção de GSH. A taxa

máxima de crescimento específico e a inibição constante pelo substrato

foram calculadas a partir desta equação juntamente com a temperatura. Os

resultados da experiência mostraram que este modelo poderia prever o

padrão de crescimento.

Segundo Volesky; Votruba (1992), os modelos são baseados em

sua maioria, na idealidade e, em geral, fornecem uma representação fiel de

apenas algumas das propriedades do processo. Dessa maneira, verifica-se

que o modelo proposto foi capaz de predizer a produção de glutationa

mesmo simplificando o modelo em relação à inibição pelo substrato.

A produção de GSH por meio de microrganismos como S. cerevisiae

e C. utilis tem sido bem estudada (MUSSATI et al., 2013). Porém ainda não

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100

Co

nce

ntr

ação

de

GSH

( m

g L-1

)

Tempo (h)

Legenda:


86

foi reportado na literatura trabalho envolvendo modelagem hibrida da

produção de GSH por S.cerevisiae usando subprodutos industriais.

5.3. OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA

O modelo determinou valores maximizados de 70 g L-1 de melaço e

40 g L-1 de glicerol. A simulação realizada com dados da otimização

numérica demonstraram que seria possível produzir 126 mg L-1 de GSH,

conforme ilustra a Figura 16 e Apêndice J.

Liang et al. (2008) após realizar uma estratégia de otimização, por

meio da elaboração de um modelo matemático, aplicando a Equação de

Gauss, obteve um coeficiente de determinação de 0,9767. A estratégia

estimou que fosse possível produzir 276 mg L-1 de GSH, sendo que

experimentalmente obteve-se 279 mg L-1. O equivalente a 1% de erro entre

o resultado estimado pelo modelo e o resultado experimental.

Figura 16 - Resultado Dos Valores Estimados Pelo Modelo De Otimização

Numérica, Usando 70 g L-1 De Melaço De Cana-De-Açúcar e 40 g L-1 De

Glicerol.

87

5.4. VALIDAÇÃO DO MODELO

A partir dos resultados obtidos pela otimização numérica, procedeu-

se a validação do modelo usando os pontos centrais como região otimizada.

De acordo com a Tabela 16 e Apêndice K observa-se que as

concentrações de biomassa estão em torno de 0,4 a 5 g L-1, sendo que o

máximo valor obtido para a concentração de biomassa a partir do

Delineamento Fatorial Completo 2² foi de 4,89 g L-1, sendo o ensaio 8 um

dos pontos centrais. A média nos pontos centrais (Ensaios 5, 6, 7 e 8) foi de

4,41 g L-1. Rollini; Manzoni (2006) e Liang et al. (2008) obtiveram

concentrações celulares experimentais de 10,5 g L-1 e 11,65 g L-1,

respectivamente.

A Figura 17 ilustra as curvas de crescimento microbiano. Tais

resultados mostram a inexistência da fase “lag” ou de latência, porque o

microrganismo foi adaptado previamente na etapa de preparação do pré-

inoculo. Portanto, ao inocular o microrganismo no erlenmmeyer com o meio

a ser fermentado, a levedura encontrava-se na fase exponencial.

Nos ensaios 5, 6, 7 e 8 a levedura encontra-se até as 22 h na fase

exponencial, de 32 a 43 h na fase estacionária, depois entram na fase de

declínio e voltaram a ter crescimento celular após 50 h de fermentação

(Figura 15). O ensaio 1 (50 g L-1 de melaço e 20 g L-1 de glicerol) foi o único

que encontrou-se na fase exponencial até aproximadamente 43 horas,

iniciando a fase estacionária somente após este período. Já o ensaio 2 (50 g

L-1 de melaço e 60 g L-1 de glicerol) e o 3 (90 g L-1 de melaço e 20 g L-1 de

glicerol) em 24 horas entraram na fase de declínio e após 48 horas ocorreu

um leve crescimento. No ensaio 4 (maiores concentrações das fontes de

carbono) observa-se que a fase linear se prolonga do inicio até o fim da

fermentação.

Verificou-se que no processo de fermentação da GSH, o

crescimento de S. cerevisiae foi inibido pelo excesso de açúcares presente

no meio, devido a uma diminuição na atividade respiratória, que é conhecido

88

como o efeito de Crabtree (van Urk et al., 1988), fato observado no ensaio 4.

E quando a biomassa após a fase de declínio voltou a aumentar sua

concentração foi supostamente porque as leveduras utilizaram outros

compostos como fonte de carbono para seu crescimento, como por exemplo,

o etanol e glicerol presentes no meio.

Figura 17 - Acompanhamento Dos Resultados Das Concentrações De

Biomassa (g L-1), Obtidos Pelo Delineamento Fatorial Completo 2² Para

Validação Do Modelo

Em relação as concentrações de GSH (Figura 18 e Tabela 16), as

maiores foram encontradas entre 113,0 mg L-1 a 127,3 mg L-1, em 72 horas

de fermentação. Usando 70 g L-1 de melaço e 40 g L-1 de glicerol (Ensaios 5,

6, 7 e 8), Apêndice K. Valor inferior ao encontrado por Santos et al.(2007),

154,5 mg L-1, e Piedrahita-Aguirre (2008), 278,42 mg L-1, em 72 horas de

fermentação e superior ao obtido por Zhang et al. (2007), 74,6 mg L-1, em 24

horas de fermentação. Portanto esses resultados para os pontos centrais

confirmam a estimativa gerada pelo modelo hibrido a fim de validar a

modelagem, empregando otimização numérica.

89

E a menor concentração de GSH encontrada foi de 63,1 mg L-1 para

o ensaio 4 (Figura 17), experimento no qual trabalhou-se com as maiores

concentrações de melaço e glicerol, respectivamente, 90 g L-1 e 60 g L-1.

Nos ensaios 1 e 2 os quais continham a mesma concentração de

melaço de cana-de-açúcar (50 g L-1) e variou-se as concentrações de

glicerol (20 e 60 g L-1, respectivamente), de acordo com a resposta obtida

verificou-se que a concentração de GSH aumentou significativamente no

ensaio 1 em relação ao ensaio 2. Já nos ensaios 3 e 4 contendo a mesma

concentração de melaço (90 g L-1) e modificando as concentrações de

glicerol (20 e 60 g L-1, respectivamente), a concentração de GSH alterou

pouco, reforçando que a produção de GSH é mais fortemente influenciada

quando se utiliza melaço como fonte de carbono, como descrito por Anshau

et al. 2013.

Figura 18 - Resultados Da Concentração De GSH (mg L-1) Obtidos Pelo

Delineamento Fatorial Completo 2² Para Validação Do Modelo.

Conforme apresentados na Tabela 16, em 72 horas de fermentação

(tempo de maior concentração de GSH) foi possível realizar um estudo entre

90

os oito ensaios do Delineamento Fatorial Completo 2², analisando as

seguintes variáveis respostas; concentrações de biomassa e glutationa,

conteúdo intracelular de glutationa (CIG, %) e produtividades celular e de

GSH. Os resultados nos tempos de 0, 24 e 48 horas são apresentados no

Anexo L.

Nos ensaios 5, 6, 7 e 8 (contendo 70 g L-1 de melaço de cana-de-

açúcar e 40 g L-1 de glicerol), verifica-se que a maior produtividade de GSH

foi para o ensaio 5, as melhores produtividades celulares foram nos ensaios

5 e 8 e para as concentrações de GSH e biomassa os ensaios 5 e 8

apresentam as melhores respostas. Visto que os ensaios 5, 6, 7 e 8 são

pontos centrais, observou-se que em média as concentrações de biomassa

e GSH, produtividades celular e de GSH e os valores de CIG para os oito

ensaios do delineamento fatorial completo 2², foram respectivamente, 4,41 g

L-1,118,9 mg L-1, 0,055 g L-1 h-1, 1,17 mg L-1 h-1 e 2,71%.

Nos ensaios de 1 a 4 em que variou as concentrações de glicerol e

fixaram as concentrações de melaço, observa-se primeiramente, no ensaio 1

que este obteve valores de biomassa e produtividade celular próximas ao

ensaio 8, porém as concentrações de GSH do ensaio 1 em relação ao

ensaio 8 foram 1,37 vezes menor. Já os ensaios 2 e 3 apresentaram

respostas baixas para todas as variáveis respostas estudadas.

O menor resultado de CIG foi encontrado para o ensaio 1 (1,70%), e

a maior resposta para essa variável foi de 14,34 (Ensaio 4). O que

hipoteticamente justifica um elevado valor CIG no ensaio 4 é o excesso de

açúcar presente no meio, pois quando esses açúcares no meio foram

tornando-se insuficientes, o etanol foi assimilado como fonte de carbono

para a levedura e a GSH produzida, limitando a quantidade de biomassa e

elevando a concentração de glutationa intracelular (SHIMIZU et al., 1991).

91

Tabela 16 – Resultados do estudo comparativo entre os ensaios do Delineamento Fatorial

Completo 2² em 72 horas de fermentação.

Ensaio

Delineamento Biomassa

(g L-1

) GSH

(mg L-1

) CIG (%)

Produtividades

Melaço Glicerol Celular

(g L-1

h-1

) GSH

(mg L-1

h-1

)

1 -1 (50) -1 (20) 4,85 82,20 1,70 0,06 0,67

2 -1 (50) +1(60) 2,20 65,60 3,00 0,03 0,43

3 +1(90) -1 (20) 1,80 68,10 3,81 0,02 0,47

4 +1 (90) +1 (60) 0,44 62,80 14,34 0,00 0,40

5 0 (70) 0 (40) 4,65 127,30 2,74 0,06 1,29

6 0 (70) 0 (40) 3,88 120,70 3,10 0,05 1,19

7 0 (70) 0 (40) 4,22 114,70 2,72 0,05 1,11

8 0 (70) 0 (40) 4,89 113,00 2,31 0,06 1,09

No caminho metabólico da síntese de GSH no interior das leveduras,

a glicose incialmente é transformada em piruvato (SHIMIZU, 1991), em

condições anaeróbias, o piruvato é convertido a etanol com desprendimento

de CO2 (BAI et al., 2008).

Conforme afirmam Lin et al. (2004), durante a fermentação a

produção do etanol é indesejada, pois não favorece o crescimento celular.

Valores de velocidade específica de crescimento relativamente baixo,

nutriente em quantidade suficiente e elevados valores de oxigênio

dissolvidos, impedem o acúmulo de etanol no meio, favorecendo

positivamente a produção de GSH e o crescimento celular, atingindo altas

concentrações.

Wen et al. (2006) afirmam que aparentemente, a concentração de

etanol no meio de cultivo tem estreita relação com a síntese de GSH e para

maximizar a produção de glutationa há dois fatores importantes: aumentar a

densidade celular e aumentar o conteúdo intracelular de glutationa.

Liu et al. (1999) trabalhou com um Delineamento Box Behken e RSM

(Resposta de superfície de resposta) seguida de análise canônica para

otimizar a concentração de glicose, peptona e MgSO4 na produção de GSH

por S. cerevisiae ATCC 7754 e comparou os dados com um modelo

proposto por rede neural. O modelo gerado pela rede neural predizeu o

92

crescimento celular e produção de GSH mais precisamente que o modelo de

superfície de resposta de segunda ordem.

A produção biotecnológica da GSH tem objetivado obter elevadas

concentrações de GSH por meio de aumento no conteúdo intracelular de

GSH e densidade celular. Para tal, o conteúdo intracelular de GSH será

melhorado significativamente por mutagêneses, a melhora da concentração

celular também pode ser abordada por processos de otimização e controle.

Em virtude da descoberta de novos produtos, a produção biotecnológica de

glutationa tende a melhor, a fim de expandir as variadas aplicações deste

tripéptido fisiologicamente e clinicamente importante (LI et al., 2004).

5.5. ALTERNATIVA DE MEIO DE CULTIVO PARA

MINIMIZAÇÃO DE CUSTOS DA PRODUÇÃO DE GLUTATIONA

O intuito desse estudo foi promover um meio de cultivo alternativo

para diminuir os custos da produção de glutationa. Essa finalidade pode ser

alcançada por meio de aumento no conteúdo intracelular de GSH e

densidade celular, conforme afirma Wen et al. (2006).

A literatura reporta que a via glicólise não apenas está envolvida na

produção de energia para a levedura, como também gera metabolitos que

podem ser utilizados como substratos para a biossíntese de moléculas

ligadas a um aumento da biomassa (CARRASCOSA et al., 2011). Dessa

forma, no processo fermentativo a levedura S. cerevisiae produz além de

biomassa, etanol, glicerol e dióxido de carbono (WHEALS et al., 1999).

Os resultados obtidos evidenciaram que as maiores concentrações

de biomassa foram encontradas nos ensaios 9, 10, 11 e 12 (usando 1,5 g L-1

de melaço de cana-de-açúcar e 1,5 g L-1 de glicerol) os resultados variaram

de 6,93 a 7,80 g L-1, em 40 horas de fermentação (Tabela 17 e Figura 19).

Cha et al. (2004) obteve um valor de biomassa próximo aos obtidos nesse

estudo (8,28 g L-1). Baixa concentração de biomassa foi encontrada no

93

experimento empregando somente glicerol como fonte adicional de carbono

(Ensaio 5). Fei et al., (2009) obteve uma concentração de biomassa de 4,15

g L-1, em 50 h de fermentação.

Tabela 17 – Resultados de crescimento celular, consumo de açúcares, concentração de

glicerol adicionada ao meio e produtos do metabolismo celular da S. cerevisiae ATCC 7754,

em 40 horas de fermentação, obtidos de acordo com Delineamento Composto Central

Rotacional 2².

Ens.

Delineamento (g L-1

) Biom. (g L

-1)

Glic. (g L

-1)

Frut. (g L

-1)

Et. (%)

Glicer. (g L

-1)

Ácid. Acét.

(mg L-1) Melaço Glicerol

1 -1 (0,44) -1 (0,44) 7,18 0,00 0,00 11,50 13,75 715,77

2 -1 (0,44) +1 (2,56) 6,73 0,00 2,45 10,64 48,70 835,66

3 +1 (2,56) -1 (0,44) 7,43 0,00 1,41 11,70 14,77 332,48

4 +1 (2,56) +1 (2,56) 6,59 2,21 1,24 10,98 47,39 520,55

5 -1,41 (0) 0 (1,5) 1,34 34,02 44,48 3,98 30,00 850,00

6 +1,41 (3) 0 (1,5) 7,03 0,00 1,01 10,93 31,27 465,47

7 0 (1,5) -1,41 (0) 6,98 0,00 0,09 11,90 7,37 165,33

8 0 (1,5) +1,41 (3) 7,22 0,00 1,46 10,96 55,50 450,84

9 0 (1,5) 0 (1,5) 6,96 0,00 1,21 11,24 31,76 308,89

10 0 (1,5) 0 (1,5) 7,54 0,00 0,00 11,00 31,00 297,17

11 0 (1,5) 0 (1,5) 6,93 0,00 0,41 11,37 32,24 264,26

12 0 (1,5) 0 (1,5) 7,80 0,00 0,00 11,31 32,32 301,18

Ens: Ensaios; Biom: Biomassa; Glic: Glicose; Frut: Frutose; Et: Etanol; Glicer: Glicerol; Ácid.

Acét: Ácido Acético.

Nas Figuras 19, 20, 21 e 22 é possível verificar que conforme a

quantidade de glicose e frutose diminui com o decorrer do tempo, a

concentração de etanol (%) aumenta. Sendo que as concentrações de

glicose se esgotam rapidamente e as concentrações de frutose foram

totalmente consumidas após 40 horas de fermentação, com exceção do

ensaio 5. O consumo de glicose (substrato) e a produção de etanol com os

níveis de glicose decrescendo gradualmente e a de etanol e GSH

aumentando, corresponde à primeira fase do processo fermentativo,

conforme descrito por Wen et al. (2005).

O etanol é principal produto da fermentação etanólica e pode

alcançar concentrações de até 12 a 14% (v/v). O gás carbônico, segundo

produto da fermentação etanólica, tem rendimento de 0,4 a 0,5 gramas de

94

CO2 por grama de açúcar degradado consumido (BARRE et al., 2004). Os

resultados de etanol (%), concentração celular (g L-1) e consumo de glicose

e frutose (g L-1) estão descritos no Apêndice M.

Quando os açúcares são totalmente consumidos, constata-se que as

leveduras iniciaram a fase estacionária do crescimento celular. Wen et al.

(2005) denominam essas reações como segunda fase do processo

fermentativo, na qual o crescimento celular ocorre de forma mais lenta e o

etanol é utilizado como fonte de carbono para crescimento celular e para

síntese de GSH.

Figura 19 – Acompanhamento Da Concentração Celular (g L-1), Obtidos Pelo

Delineamento Composto Central Rotacional 2² Para Minimização De Custos

Na Produção De GSH, Durante 117 Horas De Fermentação

95

Figura 20 - Acompanhamento Do Consumo De Glicose (g L-1), Durante 117

h De Processo Fermentativo.

Figura 21 - Acompanhamento Do Consumo De Frutose (g L-1), Durante 117

h De Processo Fermentativo.

96

Figura 22 - Acompanhamento Da Concentração De Etanol Obtido Pelo

Delineamento Composto Central Rotacional 2² Para Minimização Dos

Custos Da Produção De Glutationa.

O ponto fundamental entre a disseminação respiratória e a

fermentação alcóolica nas leveduras, é o destino das moléculas de piruvato.

A etapa mais lenta da Via Glicolítica está ligada à conversão de trioses-

fosfatos em Piruvato. O piruvato durante o crescimento fermentativo pode

ser convertido em diversos compostos, inclusive em moléculas de

hidrogênio, CO2 e alguns metabólitos orgânicos, enquanto que durante a

respiração celular, o piruvato segue para o Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos,

onde ocorre sua completa oxidação para CO2 e H2O (PRONK et al., 1996).

Quando a célula segue um metabolismo fermentativo, os principais

metabólitos excretados por ela serão o etanol e o CO2, sendo que o glicerol

também pode ser encontrado, porém não como um produto obtido

primariamente pela oxidação do açúcar e sim, devido a reoxidação do NADH

97

gerado pela Via Glicolítica. Como durante o metabolismo respiratório, o

NADH é reoxidado por enzimas específicas na mitocôndria, no caso de

limitação ou ausência de oxigênio, esta reoxidação será efetuada através da

formação de glicerol, funcionando portanto, como uma válvula redox

(PRONK et al., 1996).

De acordo com a Figura 23 e Apêndice M, os pontos centrais

(Ensaios 9, 10, 11 e 12) diminuem sua concentração inicial de glicerol

adicionada no meio nas primeiras 24 h e após esse período até o fim da

fermentação aumenta sua concentração. Para os ensaios 1, 3 e 7 visualizou-

se aumento na concentração de glicerol nas 24 h iniciais de fermentação e

manteve-se essa concentração até o fim do processo fermentativo. A

hipótese que justifica o aumento na concentração de glicerol após 117 horas

de fermentação é que a levedura passando por limitação ou ausência de

oxigênio, esta convertendo a frutose 1,6-bifosfato por meio da enzima aldose

em Didroxiacetona fosfato e em seguida o NADH é reoxidado e forma-se

glicerol.

O ensaio 5 que continha somente glicerol como fonte adicional de

carbono foi o que apresentou maior comportamento oscilatório em relação a

análise da concentração de glicerol presente no meio, porque aumentou sua

concentração nas primeiras 24 horas, reduziu após 40 horas e tornou a

aumentar as 72 h, e após 117 h diminuiu sua concentração.

98

Figura 23 – Acompanhamento Da Concentração De Glicerol Adicionada Ao

Meio De Fermentação De Acordo Com O Delineamento Composto Central

Rotacional 2² Para Minimização Dos Custos Da Produção De Glutationa.

A presença de metabólitos secundários (etanol, ácido acético e

compostos aromáticos) também podem inibir o crescimento de S. cerevisiae

e contribuir para o decréscimo da população (PATARO et al., 2000;

BORZANI et al., 2001).

Observe que o ensaio 5 (1,5 g L-1 de glicerol) foi o que apresentou

as maiores concentrações de ácido acético em 24 horas de fermentação.

Esse resultado auxilia para comprovar seu efeito inibitório, pois apresentou

os menores resultados para concentrações de glicerol, etanol, biomassa e

glutationa (Figura 24 e Apêndice M) sendo que foi um dos ensaios que levou

maior tempo para consumir as fontes de glicose e frutose existentes no meio

de fermentação. Também se verificou que o ensaio 7 possui a menor

porcentagem de etanol e a menor concentração de ácido acético.

99

Figura 24 - Acompanhamento Da Concentração De Ácido Acético Obtido

Pelo Delineamento Composto Central Rotacional 2² Para Minimização Dos

Custos Da Produção De Glutationa.

De acordo com a Tabela 18 observa-se que com 40 horas de

fermentação obteve-se concentração de 10,23 g L-1 GSH (Ensaio 2).

Quando adicionado 1,5 g L-1 de melaço e 1,5 g L-1 de glicerol (Ensaios 9, 10,

11 e 12) foram alcançados 7,8 g L-1 de GSH. Em 40 h de fermentação,

baixas concentrações de GSH foram observadas nos ensaios usando

somente glicerol e somente melaço como fontes adicionais de carbono

(Ensaios 5 e 7, respectivamente).

No mosto sintético de uva, continha 13,09 mL de uma solução de

aminoácidos, nesta solução continha também os três aminoácidos

precursores da GSH. As concentrações destes aminoácidos foram de 9,2 g

L-1 de ácido glutâmico; 1,4 g L-1 de glicina e 1,5 g L-1 de cistéina.

100

Então, supõe-se que as altas concentrações de GSH obtidas

rapidamente no tempo de 40 h, sejam por causa das concentrações de

aminoácidos presentes no meio de fermentação. Estudos evidenciaram que

a cisteína é um aminoácido essencial para a acumulação de GSH (WU et al.,

2004).

Portanto, encontrar a concentração ideal de cisteína é necessário,

porque este aminoácido inicia a formação da glutationa por meio da enzima

γ-GS, esta é responsável pela síntese de GSH, mas ao mesmo tempo atua

como inibidor do crescimento celular. Dessa maneira, estudos mais

aprofundados sobre o envolvimento dos aminoácidos na síntese de GSH

podem ser realizados para elucidar mecanismos bioquímicos (MUSSATI et

al., 2013).

Assim quantidade de GSH nos ensaios realizados foram superiores

aos encontrados por Wen et al., (2006), Wang et al., (2007) e Liang et al.,

(2008).

Wen et al., (2006) maximizaram a produção de GSH por

S.cerevisiae T65. Adicionou-se 2 mM de cisteína em 6 h e 10 mM de ácido

glutâmico, 3,35 mM de cisteína e 18 mM de glicina em 24, 44 e 56 h em um

fermentação de batelada alimentada. A maior concentração de GSH foi de

2,19 g L-1, em 60 h de fermentação.

Wang et al., (2007) utilizando biorreator de 5 L, S. cerevisiae G14, em

batelada alimentada com glicose (600 g L-1) e adição de aminoácidos (4 mM

de cisteina, glicina e ácido glutâmico) em 32 h de fermentação, conseguiram

alcançar concentrações de até 2,02 g L-1, após 38 h de cultivo.

Liang et al., (2008), desenvolveram uma estratégia para aumentar a

produção de GSH utilizando Candida utilis WSH 02-08 por meio da adição

dos três aminoácidos precursores juntamente com ATP. A produção de GSH

foi de 2,04 g L-1, em 72 h de fermentação.

101

Tabela 18 – Resultados das concentrações de glutationa, em g L-1

, obtidos pelo

Delineamento Composto Central Rotacional 2² durante as 117 horas de fermentação.

Ensaios

Delineamento Tempo de fermentação (h)

Melaço Glicerol 0 24 40 72 96 117

1 -1 (0,44) -1 (0,44) 0,10 6,81 7,47 0,02 0,01 0,03

2 -1 (0,44) +1 (2,56) 0,10 7,57 10,23 0,03 0,02 0,05

3 +1 (2,56) -1 (0,44) 0,10 5,06 3,96 0,04 0,03 0,05

4 +1 (2,56) +1 (2,56) 0,10 3,60 6,94 0,04 0,02 0,03

5 -1,41 (0) 0 (1,5) 0,10 4,27 5,10 0,24 0,19 0,14

6 +1,41 (3) 0 (1,5) 0,10 3,74 4,73 0,02 0,02 0,06

7 0 (1,5) -1,41 (0) 0,10 5,62 4,42 0,03 0,06 0,06

8 0 (1,5) +1,41 (3) 0,10 4,71 7,03 0,03 0,03 0,05

9 0 (1,5) 0 (1,5) 0,10 4,68 5,94 0,02 0,02 0,02

10 0 (1,5) 0 (1,5) 0,10 5,55 6,64 0,02 0,05 0,03

11 0 (1,5) 0 (1,5) 0,10 6,13 8,73 0,02 0,08 0,03

12 0 (1,5) 0 (1,5) 0,10 5,54 9,33 0,02 0,03 0,03

Após 45 horas de fermentação, notou-se que os níveis de GSH

caíram drasticamente (Figura 25), e as concentrações de biomassa

oscilaram bastante. Tal observação coincide com o completo consumo dos

açucares do meio de cultivo antes de 40 horas. A provável explicação é que

as leveduras estão consumindo a glutationa como fonte de nutriente, mais

preferencialmente que o glicerol.

102

Figura 25 – Resultados Da Concentração De GSH (mg L-1) Obtidas Pelo

Delineamento Composto Central Rotacional 2², Durante 117 h De Processo

Fermentativo

Segundo Li et al. (2004) e Cha et al. (2004) aumentar a produtividade

é uma estratégia eficiente para reduzir os custos na produção de GSH. E de

acordo com Wen et al. (2005) aprimorar as metodologias de produção de

glutationa, minimizando custos na produção tende a reduzir o preço desta

biomolécula

Com os resultados obtidos nesse estudo, verifica-se que o objetivo

de iniciar estudos para propor um meio alternativo com o intuito de minimizar

os custos da produção de glutationa foi atingido, visto que foi possível

produzir em 40 horas de fermentação 10,23 g L-1 de GSH, empregando

matérias-primas que tendem a diminuir os custos da produção que é o uso

de mosto de uva natural (com composição similar ao mosto sintético

utilizado para o presente experimento), melaço de cana-de-açúcar e o

glicerol.

103

Os últimos dados relacionados a produtividade da cana-de-açúcar

da safra de 2015/16 informam aumento de 9,1%. Originando um incremento

de 4,9% na produção de cana-de-açúcar em relação à safra de 2014/15,

totalizando uma produção de 665,6 milhões de toneladas de cana-de-açúcar

nesta safra (CONAB, 2016).

Nessa perspectiva, verifica-se que matéria prima como o melaço

(resíduo de fabricação do açúcar cristalizado, do melado ou da refinação do

açúcar bruto) não precisará ser importada, já que o Brasil é o maior produtor

de cana-de-açúcar, fato que auxilia na etapa de minimizar os custos da

produção de GSH.

E tratando-se do glicerol que atua como coprodutor no processo de

produção de biodiesel. Correspondendo cerca de 10% do volume total de

biodiesel produzido, torna-se interessante o aproveitamento direto do

glicerol, pois permite a viabilidade do processo produtivo de biodiesel, e

auxilia para que esteja sendo competitivo no mercado.

Para complementação do presente estudo foi realizada uma cotação

dos materiais para desenvolver o processo fermentativo alternativo. A

primeira metodologia proposta foi a descrita no item 4.5, a segunda esta no

item 4.12. O estudo revelou que com o primeiro procedimento gastasse R$

10,29 por litro de meio fermentado. Entretanto, o segundo método

envolvendo mosto sintético de uva, o custo com o meio de fermentação foi

estimado em R$ 1,92 por litro de meio.

Então, optando-se por dar uma nova aplicação comercial aos

subprodutos melaço e glicerol os quais são utilizados por inúmeros

microrganismos como fonte de carbono originando produtos, auxiliando em

aumentar as produções e minimizar os custos operacionais e de capital

(YAZDANI; GONZALEZ, 2007). Assim, constata-se que o estudo utilizando

mosto de uva pode diminuir significativamente os gastos econômicos

envolvidos na descrição do item 4.5, referente à produção da GSH.

104

6. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos permitiram concluir que a cepa estava pura.

O modelo hibrido conseguiu predizer o bioprocesso, pois quando

experimentalmente a máxima produção de GSH foi encontrada em 72 horas

(119,6 mg L-1) utilizando 76,9 g L-1 de melaço e glicerol, respectivamente.

Aplicando o modelo para as mesmas condições estimou-se 118,6 mg L-1. Os

resultados experimentais e preditos foram analisados estatisticamente para

verificar a similaridade dos mesmos, não havendo diferenças significativas

entre as respostas experimental e predita. Isso enfatiza que o uso de

modelos matemáticos polinomiais parametrizados é uma ferramenta

importante para prever a produção de GSH.

A partir do modelo gerado foi possível validar experimentalmente a

otimização numérica desenvolvida para maximizar a produção de glutationa.

A otimização estimou uma produção de 126 mg L-1 de GSH. E o resultado

obtido a partir do Delineamento Fatorial Completo 2² foi de 127,3 mg L-1 de

GSH em 72 horas, o resultado obtido experimentalmente corresponde 1% a

mais do que o valor estimado pela otimização numérica.

Nos estudos para minimização de custos da produção de glutationa

por Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754, parceria com o Instituto de

Agroquímica e Tecnologia de Alimentos (IATA). Os resultados obtidos foram

satisfatórias a pesquisa, pois somente de GSH em um tempo menor de

fermentação obteve-se aproximadamente 10,23 g L-1, sendo possível

relacionar a elevada concentração de GSH com o ciclo bioquímico da

levedura. Além de que o estudo revelou que o processo fermentativo

proposto tem um valor de custo 5,36 vezes inferior a metodologia descrita

por Anshau (2010), evidenciando sua viabilidade econômica.

105

7. SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS

- Trabalhar com cepas recombinantes a partir de engenharia metabólica;

- Construir modelos matemáticos que relacionem a concentração de

biomassa de foma independente no modelo;

- Verificar se com outras cepas de leveduras é possível melhorar os

resultados de produção de GSH usando o mosto de uva;

- Controlar as concentrações de etanol formadas no meio a fim de deixá-las

a niveis baixos, melhorando a concentração de GSH;

- Desenvolver estudos com redes neurais para predizer a produção de GSH;

- Construir modelos fenomenológicos a partir de fermentações conduzidas

em batelada alimentada empregando subprodutos industriais como fonte

adicional de carbono.

106

8. REFERÊNCIAS

ALFAFARA, C.G.; MIURA, K.; SHIMIZU, H.; SHIOYA, S.;SUGA, K.; SUZUKI, K. Fuzzy control of ethanol concentracion and its application to maximum glutathione production in yeast fed-batch culture. Biotechnology and Bioengineeing, v. 41, p. 493-501, 1993.

ANDERSON, M. E. Glutathione: an overview of biosynthesis and modulation. Chemico-Biological Interactions, v. 111/112, p. 1-14; 1998.

ANSHAU, A. Produção de glutationa utilizando subprodutos industriais em processos de batelada simples e batelada alimentada. Campinas, 2010. 158p. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Alimentos) - Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas.

ANSHAU, A.; SANTOS, L.O.; ALEGRE, R.M. A cost effective fermentative production of glutathione by saccharomyces cerevisiae with cane molasses and glycerol. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 56, n. 5, p. 849-857, 2013.

ANVISA, Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_4_2004.pdf. Acesso em 15 de junho de 2016.

AOYAMA, K.; NAKAKI, T. Imparied Glutathione Syntesis in Neurodegeneration. International Journal of Molecular Sciences, v. 14, n.10, p. 21021-21044, 2013.

BAI, F. W.; ANDERSON, W. A.; MOO-YOUNG, M. Ethanol Fermentation Technologies from sugar and starch feedstocks. Biotechnology Advances, v. 26, p.89-115, 2008.

BALLATORI, N.; KRANCE, S. M.; NOTENBOOM, S.; SHI, S.; TIEU, K.; HAMMOND, C.L. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. The Journal of Biological Chemistry, v. 390, n. 3, p. 191-214, 2009.

BARRE, P.; BLONDIN, B.; DEQUIN, S.; FEUILLAT, M.; SABLAYROLLES, J.M.; ASSOS, L.C. Fisiologia e ecologia microbiana, In: WORKSHOP TECNOLÓGICO SOBRE PRODUÇÃO DE ETANOL, 1. São Paulo, 2004.

BARROS, V. R.; SOUZA, A.P.; FONSECA, D.C.; SILVA, L.B.D. Avaliação da evapotranspiração de referência na Região de Seropédica, Rio de Janeiro, utilizando lisímetro de pesagem e modelos matemáticos. Revista Brasileira de Ciências Agrárias, v.4, n.2, p.198-203, 2009.

BONNEFOY, M.; DRAI, J.; KOSTKA, T. Antioxidants to slow aging, facts na

107

perspectives. Presse Medicine, v. 31, n. 25, p. 1174-1184, 2002.

BONOW, F.; CARDIAS, B.B.; SANTOS, L.O. Produção de gutationa a partir de Saccharomyces cerevisiae utilizando soro de leite como substrato. In: SIMPÓSIO DE BIOQUÍMICA E BIOTECNOLOGIA, 5. PARANÁ, 2015.

BORGES, L. L.; LÚCIO, T.C.; GIL, E.de S.; BARBOSA, E.F. Uma abordagem sobre métodos analíticos para determinação da atividade antioxidante em produtos naturais. Enciclopédia Biosfera, v.7, n. 12, p.1-21, 2011.

BONONI, A.; SCHMIDELL, W. ; MODELAGEM MATEMÁTICA E SIMULAÇÃO DE PROCESSOS FERMENTATIVOS. In: SCHMIDELL, W. ; LIMA, U. de A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia Industrial, 1ed. São Paulo, Edgard Blucher LTDA, 2001, v. 2, cap. 7, p. 123-178.

BOARETO, A. J. M.; Modelagem híbrido-neuronal da produção de lipase por Candida rugosa. Rio de Janeiro, 2005. 271p. Dissertação de Mestrado - Universidade Federal do Rio de Janeiro.

BORZANI, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E. Biotecnologia Industial, v. 3. São Paulo: Edgard Blucher, 2001.

BUHL R.; JAFFE H. A.; HOLROYD K. J.; WELLS F. B.; MASTRANGELI A.; SALTINI C.; CANTIN, A.M.; CRYSTAL, R.G. Systemic glutathione deficiency in symptom free HIV-seropositive individuals. The Lancet, v.334, n. 8675, p. 1294-1298, 1989.

CARDOSO, L. M.; COLOMBARI, D. S. A.; MENANI, J. V.; PAULA, M.; CHIANCA-JR, D. A.; COLOMBARI, E. Espécies reativas de oxigênio no controle neurovegetativo da pressão arterial. Revista da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e do Hospital das Clínicas da FRMP, v. 39, n. 1, p. 77-88, 2006.

CONAB. Disponível em: http://www.conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/16_04_14_09_06_31_boletim_cana_portugues_-_4o_lev_-_15-16.pdf. Acesso em 16 de junho de 2016.

CARRASCOSA, A.V.; MUÑOZ, R.; GONZÁLEZ, R. Molecular Wine Microbiology. 5 ed. USA, Elsevier, p. 11, 2011.

CHA, J.; PARK, J.; JEON, B.; LEE, Y.; CHO, Y. Optimal fermentation conditions for enhanced glutathione production by Saccharomyces cerevisiae FF-8. The Journal of Microbiology, v. 42, n. 1, p.51-55, 2004.

CHEN, J.; HE, Z.; LIU, H.; CHA, C. Electrochemical determination of reduced glutathione (GSH) by applying the powder microelectrode technique. Journal of Electroanalytical Chemistry, v.588, n.2, p.324–330, 2006.

108

GRANT, C. M.; PERRONE G.; DAWES, I. W. Glutathione and catalase provide overlapping defenses for protection against hydrogen peroxide in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochemical and biophysical research communications, v. 253, n.3, p. 893-898, 1998.

CHEN, R.C.; CHOU, C.C.; Cane Sugar handbook, 12th ed. New York, John Wiley & Sons, p. 959, 1993.

COOPER, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. In: Strathern J N, Jones E W, Broach J B, editors; Strathern J N, Jones E W, Broach J B, editors. The molecular biology of the yeast Saccharomyces. Metabolism and gene expression. New York, v. 1, p.39-99, 1982.

CORREIA, D. Determinação voltamétrica de 1,4-benzodiazepínicos e dietilpropiona como adulterantes em fitoterápicos para emagrecimento. Santa Maria, 2008. 102p. Dissertação (Mestrado) - Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de Santa Maria.

DONG, Y.; YANG, Q.; JIA, S.; QIAO, C. Effects of high pressure on the accumulation of trehalose and glutathione in the Saccharomyces cerevisiae.Biochemical Engineering Journal, v. 37, n. 2, p. 226-230, 2007.

DOUGLAS, K. T. Chemical Synthesis of Glutathione and Analogues.Chem Inform, v. 20, n. 36, 1989.

ENGASSER, J.M. Bioreactor enginnering: the design and otimization of reactor with living cells. Chemical Engineering Science, v. 43, n. 8, p. 1739-1748, 1988.

ELLMAN, G. L. Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys, v. 82, n.1, p. 70-77, 1959.

FERIN, R.; PAVÃO, M. L.; BAPTISTA, J. Methodology for a rapid and simultaneous determination of total cysteine, homocysteine, cysteinylglycine and glutathione in plasma by isocratic RP-HPLC. Journal of Chromatography B, v. 911, n. 24, p. 15-20, 2012.

FAHOR, L. G. Modelagem matemática da produção de etanol utilizando ajuste de curvas e o modelo de crescimento logístico de verhulst. In: ENCONTRO GAÚCHO DE EDUCAÇÃO MATEMÁTICA, 10. Ijuí, 2009.

FEI, L.; WANG, Y.; CHEN, S. Improved glutathione production by gene expression in Pichia pastoris. Bioprocess Biosystem Engineering, v. 32, n.6, p. 729–735, 2009.

FLORES, C-L.; RODRÍGUEZ, C.; PETIT, T.; GANCEDO, C. Carbohydrate and energy-yielding metabolism in non-conventional yeasts. FEMS Microbiology Reviews, v. 24, p. 507-529, 2000.

GADEN, E. L. Jr. Fermentation kinetics and productivity. Chemistry and

109

Industry, v. 7, p. 154-159, 1955.

GALLI, A.; SOUZA, D.; GARBELLINI,G. S.; COUTINHO, C. F. B.; MAZO, L. H.; AVACA, L. A.;MACHADO, S. A. S. Utilização de técnicas eletroanalíticas na determinação de pesticidas em alimentos. Química Nova, v. 29, n. 1, p.105-112, 2006.

GARG, N.; AGGARWAL, N. Effects of interactions between cadmium and lead on growth, nitrogen fixation, phytochelatin and glutathione production in Mycorrhizal Cajanus cajan (L.) Mill sp. Journal Plant Growth Regulaction, v. 30, n. 3, p. 286-300, 2011.

GHARIEB, M. M.; GADD, G. M. Role of glutathione in detoxification of metal (loid)s by Saccharomyces cerevisiae. Biometals, v. 17, n. 2, p. 183-188, 2004.

GOFFEAU, A.; BARREL, B.G.; BUSSEY, H.; DAVIS, R.W.; DUJON, B.; FELDMANN, H.; GALIBERT, F.; HOHEISEL, J.D.; JACQ, C.; JOHNSTON, M.; LOUIS, E.J.; MEWES, H.W.; MURAKAMI, Y.; PHILIPPSEN, P.; TETTELIN, H.; OLIVER, S.G. Life with 6000 genes. Science, v.274, n. 5287, p.563-567, 1996.

GONÇAVES, V. C. Síntese e caracterização de derivados de politiofeno para a utilização em sensores, São Carlos, 2010. - Instituto de Física de São Carlos, Instituto de Química de São Carlos e Escola de Engenharia de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2010,/Tese/Doutorado.

GONÇALVES, I. da M. Influência de campos magnéticos na produção de glutationa por Saccharomyces cerevisiae em biorreator “air-lift” pressurizado. Seropédica, 2012. 101p. Dissertação (Mestrado) – Instituto de Tecnologia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.

GOTOH, T.; WATANABE, M.; IGUCHI, H.; KIKUCHI, K. Glutathione production by glutathione-degrading enzymes displayed on proteoliposomes reconstituted from bovine kidney brush border membranes. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v. 79, n. 11, p.1204-1211, 2004.

GRIFFITH, O.W. Determination of glutathione disulfite using GSH reductase and 2-Vinilpyridine. Analytical Biochemistry, v. 106, n. 1, p. 207-212, 1980.

GRETSCHMAN, A. S. Ajuste de curvas na produção de etanol num processo em batelada. In: ENCONTRO GAÚCHO DE EDUCAÇÃO MATEMÁTICA, 10. Ijuí, 2009.

GUILLAMÓN, J. M.; BARRIO, E.; HUERTA, T.; QUEROL, A. Rapid characterization of fours species of the Saccharomyces sensu stricto complex according to mitochondrial DNA patterns. International Journal of Systematic Bacteriology, v. 44, n. 4, p. 708-714, 1994.

HAUTH, J. Grey-Box Modelling for Nonlinear Systems. 2008, 383p.

110

Doctored (Thesis) - Fachbereich Mathematik der Universität Kaiserslautern.

HUBER, P. C.; ALMEIDA, W. P.; DE FÁTIMA, Â. Glutationa e enzimas relacionadas: Papel biológico e importância em processos patológicos. Quimica Nova, v. 31, n. 5, p. 1170–1179, 2008.

HEYROVSKÝ, J. The development of polarographic analysis. Analyst, v. 81, n. 961, p.189-192, 1956.

HORÁK, J. Yeast nutrient transporters. Biochimica et Biophysica Acta, Czech Republic, v. 1331, n. 2, p. 41-79, 1997.

KOMIVES, C.; PARKER, R. S.; Bioreactor state estimation and control. Current Opinion in Biotechnology, v. 14, n. 5, p. 468-474, 2003.

LI, Y.; WEI, G.; CHEN, J. Glutathione: a review on biotechnological production. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 66, n. 3, p.233-242, 2004.

LI, Y.; HUGENHOLTZ, J.; SYBESMA, W.; ABEE, T.; MOLENAAR, D. Using Lactococcus lactis for glutathione overproduction. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 67, n. 1, p. 83-90, 2005.

LIANG, G.B.; DU, G.C.; CHEN J. A novel strategy of enhanced glutathione production in high cell density cultivation of Candida utilis cysteine addition combined with dissolved oxygen controlling. Enzyme Microb. Technol. v. 42, n.3, p. 284-289, 2008.

LIANG, G.; WANG, B.; XIE, J.; MO, Y. Novel pH control strategy for glutathione overproduction in batch cultivation of Candida utilis. African Journal of Biotechnology, v. 8, n. 22, p. 6337-6345, 2009.

LIN, J.; TIAN, J.; YOU, J.; JIN, Z.; XU, Z.; CEN, P. An effective strategy for the coproduction of S-adenosyl-l-methionine and glutathione by fed-batch fermentation. Biochemical Engineering Journal, v. 21, n. 1, p.19-25, 2004.

LIMA, U.A.; BASSO, L.C.; AMORIM, H.V., PRODUÇÃO DE ETANOL. IN: LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W. Biotecnologia Industrial, 1 ed. São Paulo, Edgard Blücher LTDA, 2001, v. 3, cap. 1, p. 11-39.

LIU, C; HWANG, C.; LIAO, C. Medium optimization for glutathione production by Saccharomyces cerevisiae. Process Biochemistry, v. 34, n. 1, p.17-23, 1999.

MAGASANIK, B. Regulation of nitrogen utilization. In: BROACH, J. R.; STRATHERN, J. N.; JONES, E. W. (Ed). The molecular and cellular biology of the yeast Saccharomyces: gene expression, New York: Cold Spring Harbor, v. 2, p. 283, 1992.

MANDAL, P.K.; TRIPATHI, M.; SUGUNAN, S. Brain oxidative stress:

111

Detection and mapping of anti-oxidant marker “Glutathione” in different brain regions of healthy male/female, MCI and Alzheimer patients using non-invasive magnetic resonance sptectroscopy. Biochemical and Biophysical Research Communication, v. 417, n. 1 p. 43-48, 2012. doi: 10.1016/j.bbrc.2011.11.047

MARZAL, P. C. Desenvolvimento de um eletrodo amperométrico para a determinação de glutationa em eritrócitos. Doutorado. Instituto de Química. Departamento de Química Analítica. Universidade Estadual de Campinas. Campinas, 2005.

MEISTER, A. On the Discovery of glutathione.Trends Biochemistry Science, v. 13, n.5, p. 185-188, 1988.

MEISTER, A.; ANDERSON, M.E. Glutathione. Annual Reviews Biochemistry, v. 52, p. 711-760, 1983.

MOSES, P.R.; WIER, L.; MURRAY, R. W. Chemically modified tin oxide electrode. Analytical Chemistry. v. 47, n. 12, p. 1882 – 1886, 1975.

MUSSATI, A.; MANZONI, M.; ROLLINI, M. Post-fermentataive production of glutathione by baker’s yeast (S.cerevisiae) in compressed and dried foms. New Biotechnology. v.30, n. 2, p. 219-226, 2013.

NAVARRO, J.; OBRADOR, E.; CARRETERO, J.; PETSCHEN, I.; AVIÑO, J.; PEREZ, P.; ESTRELA, J. M. Changes in glutathione status and the antioxidante system in blood and in cancer cells associate with tumour growth in vivo. Free Radical Biology and Medicine, v. 26, n. 3-4, p. 410-418, 1999.

NETO, A.S.S.R. Glutationa: Envolvimento em defesa antioxidante, regulação de morte celular programada e destoxificação de drogas. Porto, 2010. 77p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade Ciências da Saúde, Universidade Fernando Pessoa. Faculdade Ciências da Saúde.

OGRODOWSKI, R. Produção de biomassa a partir do soro de queijo para obtenção de ribonucleotideos. Campinas, 2006. Tese (Doutorado) – Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas.

OLIVEIRA, L. S. Desenvolvimento de um sistema eletroquímico de análise por injeção em fluxo para detecção de cocaína. Ribeirão Preto, 2011. 47p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.

OLIVEIRA, R.; Combining first principles modelling and artificial neural networks: a general framework; Computers and Chemical Engineering, v. 28, n. 5, p. 755-766, 2004.

ORWAN, O; FISHMAN, H. A.; ZIV, N.E.; SCHELLER, R.H.; ZARE, R.N. Use of 2,3-naphthalenedicarboxaldehyde derivatization for single-cell analysis of

112

glutathione by capillary electrophoresis and histochemical localization by fluorescence microscopy. Analytical Chemistry, v. 67, n. 23, p. 4261-4268, 1995.

OWENS C. W. I.; BELCHER R. V. A colorimetric micro-method for the determination of glutathione. Biochemical Journal, v. 94, n. 3, p. 705-711, 1965.

PATARO, C.; GUERRA, J.B.; PETRILLO-PEIXOTO, M. L.; MEDONÇA-HAGLER, L.C.; LINARDI, V. R.; ROSA, C. A. Yeast communities and genetic polymorphism of Saccharomyces cerevisiae strains associated with artisanal fermentation in Brazil. Journal of Applied Microbiology, v. 88, n. 1, p.1-9, 2000.

PARK K. S.; KIM M.; WOO M-A.; PARK H. G.; A label-free method for detecting biological thiols based on blocking of Hg2+-quenching of fluorescent gold nanoclusters. Biosensors Bioelectronics, v.45, p. 65–69, 2013.

PASTORE A.; FEDERICI G.; BERTINI E.; PIEMONTE F. Analysis of glutathione: Implication in redox and detoxification. Clinica Chimica Acta, v.333, n.1, p.19–39, 2003.

PATNAIK, P. R.; Intelligent model of the quantitative behavior of microbial systems. Food and Bioprocess Technology, v. 2, n. 2, p. 122-137, 2009.

PENNINCKX, M. J. An overview on glutathione in Saccharomyces versus non-conventional yeasts.FEMS Yeast Research, v. 2, n. 3, p. 295-305, 2002.

PENNINCKX, M.J.; ELSKENS, M.T. Metabolism and functions of glutathione in microorganisms. Advances in Microbial Physiology, v. 34, p. 239–301, 1993.

PEREIRA, S.L; DUQUE-ESTRADA, E. de O. Biotechnology, biopharmaceuticals for human use and evironmental auditing: an important association for Brazil. J. Bus. School,São Paulo. Edition July 2011. Disponível em: <http://www.revistabsp.com.br/edicao-julho-2011/en/2011/07/26/biotechnology-biopharmaceuticals-for-human-use-and-environmental-auditing-an-important-association-for-brazil/>, acesso em 23/07/2014.

PIEDRAHITA-AGUIRRE, C.A. Estudo da produção de glutationa por Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 em meios proteicos de baixo custo. Campinas, 2008. 68p. Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas.

PICCOLI, G.; FIORANI, M.; BIAGIARELLI, B.; PALMA, F.; POTENZA, L.; AMICUCCI, A.; STOCCHI, V. Simultaneous high-performance capillary electrophoretic determination of reduced and oxidized glutathione in red blood cells in the femtomole range. Journal of Chromatography A, v. 676,

113

n.1, p. 239, 1994.

PRONK, J. T.; STEENSMA, H.Y.; VAN DIJKEN, J.P. Piruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, v. 12, n. 16, p. 1607-1633, 1996.

QUEROL, A.; BARRIO, E.; HUERTA, T.; RAMÓN, D. Molecular monitoring of wine fermentations conducted by active dry yeasts strains. Applied and Environmental Microbiology, v. 58, n. 9, p. 2948-2593, 1992.

REIS, C.; CAPANEMA, L. X. de L.; FILHO, P. L. P.; PIERONI, J. P.; BARROS, J.O.; SILVA, L.G. da. Biotecnologia para saúde humana: tecnologias, aplicações e inserção na indústria farmacêutica. Disponível em: http://www.bndes.gov.br/bibliotecadigital. Acesso em 10 de junho de 2016.

RIBEREAU-GAYON, P.; DUBOURDIEU, D.; DONÈCHE, B.; LONVAUD, A.The Handbook of Enology: Microbiology of Wine. John Wiley & Sons Ltda, v. 1, 2° ed., 497 p., 2006.

ROLLINI, M.; MANZONI, M. Influence of different fermentation parameters on glutathione volumetric productivity by Saccharomyces cerevisiae. Process Biochemistry, v. 41, n. 7, p.1501-1505, 2006.

ROUM J. H.; BUHL R.; MCELVANEY N. G.; BOROK Z.; CRYSTAL R. G. Systemic glutathione deficiency in cystic fibrosis. Journal of Applied Physiology, v. 75, n.6, p. 2419-2424, 1993.

ROVER JÚNIOR, L.; HÖEHR, N. F.; VELLASCO, A. P.; KUBOTA, L. T. Sistema antioxidante envolvendo o ciclo metabólico da glutationa associado a Métodos eletroanalíticos na avaliação do estresse oxidativo. Química Nova, v. 24, n. 1, p.112-119, 2001.

SANTOS, L.O.; GONZALES, T.A.; UBEDA, B.T.; MONTE ALEGRE, R. Influence of culture conditions on glutathione production by Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. v.77, n. 4, p.763-769, 2007.

SGARBIERE, VALDEMIRO C. Propriedades fisiológico-funcionais das proteínas do soro de leite. Revista de Nutrição, v. 17, n. 4. p. 397-409, 2004.

SHAN, X.; TY, A. W.; JONES, D. P. Glutathione dependent protection against oxidative injury. Pharmacology& Therapeutics, v. 47, n.1, p. 61-71, 1990.

SCHMIDELL, W. MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA PARA UTILIZAÇÃO INDUSTRIAL, In: Biotecnologia Industrial, 1ed. São Paulo, Edgard Blucher LTDA, 2001, v. 2, cap. 2, p. 5-18.

SHIMIZU, H.; ARAKI, K.; SHIOYA, S.; SUGA, K. Optimal production of glutathione by controlling the specific growth rate of yeast in fed-batch

114

culture. Biotechnology and Bioengineering, v. 38, n. 2, p. 196-205, 1991.

SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princípios de análise instrumental. 5 ed. Porto Alegre, Bookman (SBQ), p. 598-676, 2002.

SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. M.; CROUCH, S. R. Fundamentos de Química Analítica. São Paulo: Ed. Thomson, 2007.

SIAN, J.; DEXTER, D.T.; LEES, A.J.; DANIEL, S.; AGID.; JAVOY-AGID,F.; JENNER, P.; MARSDEN, C.D.; Alterations in glutathione levels in Parkinson’s disease and other neurodegenerative disordens affecting basal ganglia. Annals of Neurology, v. 36, n.3, p. 348-355, 1994.

SIES, H. Glutathione and its role in cellular functions. Free Radical Biology & Medicine, v. 27, n. 9, p. 916-920, 1999.

SILVA, G. P.; MACK, M.; CONTIERO, J. Glycerol: a promising and abundant carbon source for industrial microbiology. Biotechnology Advances, v. 27, n. 1, p. 30-39, 2009.

TASKIN, M. A new strategy for improved glutathione production from Saccharomyces cerevisiae: use of cysteine- and glycine-rich chicken feather protein hydrolysate as a new cheap substrate. Journal of the Science of Food Agriculture, v. 93, n. 3, p. 535-541, 2012.

ter SCHURE, E. G.; SILLJÉ, H. H. W.; RAEVEN, L. J. R. M.; BOONSTRA, J.; VERKLEIJ, A. J.; VERRIPS, C. T. Nitrogen-regulated transcription and enzyme activities in continuous cultures of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology, v. 141, p. 1101-1108, 1995.

TIETZE, F. Enzymatic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione:application to mammalian blood and others tissues. Analytical Biochemistry, v. 27, p. 502- 522, 1969.

TOWNSEND D. M.; TEW K. D.; TAPIERO H. The importance of glutathione in human disease. Biomedicine & Pharmacotherapy, v. 57, n. 3/4, p.145-155, 2003.

VALENTE, A. L. P.; COLLINS, C. H.; MANFREDI, J. E. Conceitos básicos de cromatografia líquida de alta eficiência. Química Nova, v. 6, n. 3, p.103-109, 1983.

VAN URK, H.; MAK, P.R.; SCHEFFERS, W. A.; VAN DIJKEN, J.P. Metabolic responses of Saccharomyces cerevisiae CBS 8066 and Candida utilis CBS 621 upon transition from glucose limitation to glucose excess. Yeast, v.4 p. 283–291, 1988.

VOLESKI, B.; VOTRUBA, J. Modeling and optimization of fermentation processes. Amsterdã, Elsevier Science Publishers, 1992.

WANG, Z.; TAN, T.W.; SONG, J. Effect of amino acids addition and feedback

115

control strategies on the high-cell-density cultivation of Saccharomyces cerevisiae for glutathione production. Process Biochemistry. v. 42, n. 1, p. 108-111, 2007.

WANG, Q.; GUAN, Y.; YANG, M. Application of superparamagnetic microspheres for affinity adsorption and purification of glutathione. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, v. 324, n. 20, p.3300–3305, 2012.

WEI G Y.; LI Y.; DU G.C.; CHEN J. Application of a two-stage temperature control strategy for enhanced glutathione production in the batch fermentation by Candida utilis. Biotechnology Letters, v. 25, n. 11, p. 887- 890, 2003.

WEI, G.Y.; LI, Y.; DU, G.C.; CHEN, J. Kinetic models for the effect of temperature on batch glutathione fermentation by Candida utilis. (ABSTRACT). Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, v. 19, n.3, p. 358-363, 2003a.

WEICHERT, W. Modeling and Simulation: tools for metabolic engineering. Journal of Biotechnology, v. 94, n. 1, p. 37-63, 2002.

WEN, S.; ZHANG, T.; TAN, T. Utilization of amino acids to enhance glutathione production in Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology, v. 35, n. 6/7, p. 501-507, 2004.

WEN, S.; ZHANG, T.; TAN, T. Optimization of the amino acid composition in glutathione fermentation. Process Biochemistry, v. 40, n. 11, p. 3474-3479, 2005.

WEN, S.; ZHANG, T.; TAN, T. Maximizing production of glutathione by amino acid modulation and high-cell-density fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae. Process Biochemistry, v. 41, n. 12, p. 2424–2428, 2006.

WHEALS, E. A.; BASSO, L.C.; ALVES, D. M. G.; AMORIM, H. V. Fuel ethanol after 25 years. Trends in Biotechnology. v.17, p.482-487, 1999.

WIAME, J. M.; GRENSON, M.; ARST, H. N. Nitrogen catabolite repression in yeast and filamentous fungi. Advances in Microbiology Physiology, v.26, p. 1-88, 1985.

WILLMOTT, C.J. Some comments on evaluation of model performance, Bulletin of American Meteorological Society, v.63, p.1309- 1313, 1982.

WOICIECHOWSHI, A.L.; CARVALHO, J.C. de.; SPIER, M. R.; HABU, S.; YAMAGUISHI, C.T.; GHII, V.; SOCCOL, C.R. EMPREGO DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS EM BIOPROCESSOS. In: Biotecnologia de Alimentos. PASTORE, G.M.; BICAS, J. L.; MARÓSTICA Jr. M. R. v. 12, Atheneu, 2012.

WU, G.; FANG, Y.; YANG, S.; LUPTON, J. R.; TURNER, N. D. Glutathione metabolism and its implications for health. The Journal of Nutrition, v. 134,

116

n. 3, p. 489-492, 2004.

YAZDANI, S. S.; GONZALEZ, R. Anaerobic fermentation of glycerol: a path toeconomic viability for the biofuels industry. Energy Biotechnology, v. 18, n. 3,p.213-218, 2007.

ZHANG, T.; WEN, S.; TAN, T. Optimization of the medium for glutathione production in Saccharomyces cerevisiae. Process Biochemistry, v. 42, n. 3, p.454-458, 2007.

ZORZETTO, L. F. M.; MACIEL FILHO, R.; WOLF-MACIEL, M. R.; Process modelling development through artificial neural networks and hybrid models; Computers and Chemical Engineering, v. 24, n. 2-5, p. 1355-1360, 2000.

117

APÊNDICES

A. RESULTADOS CURVA DE CALIBRAÇÃO: BIOMASSA

Tabela 19 – Resultados médios das absorbâncias e concentração celular (g

L-1), referente a curva padrão.

Média das absorbâncias

Concentração celular em (g L-1)

0,078 0,18

0,119 0,22

0,237 0,24

0,384 0,32

0,423 0,34

0,561 0,40

0,650 0,42

0,837 0,48

0,880 0,52

Figura 26 – Perfil Da Curva De Calibração De Biomassa

y = 0,4026x + 0,1602 R² = 0,9896

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Co

nc

en

tra

çã

o c

elu

lar

(g L

-1)

Absorbância (600 nm)

118

B. RESULTADOS CURVA DE CALIBRAÇÃO: GLUTATIONA

Tabela 20 – Resultados médios das absorbâncias e concentração de

glutationa (mg L-1), referente a curva padrão.


Concentração celular em (mg L-1)

0,071 5

0,183 10

0,472 20

0,552 25

0,643 30

0,731 35

0,796 40

0,908 45

Figura 27 – Perfil Da Curva De Calibração De Glutationa

C. PROGRAMAÇÕES

y = 47,753x + 0,2484 R² = 0,9862

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Co

ncen

tração

de

GS

H

(mg

L-1

)


119

Exemplo 1: Ajuste Polinomial dos resultados das velocidades específicas de

produção de glutationa para o Ensaio 1, utilizando 13,1 g L-1 de melaço de

cana-de-açúcar e 13,1 g L-1 de glicerol.

clear all clc % entrada de dados; tempo de fermentação X(1) = 0; X(2) = 24; X(3) = 48; X(4) = 72; X(5) = 96; % entrada com os valores de velocidade especifica de GSH para ensaio 1 y(1)= 0.00000; y(2)= 1.47E-04; y(3)= 7.00E-05; y(4)= 2.07E-05; y(5)= -1.83E-04; % y = f(y) % m é o número de pontos m = 5; % inicializando os valores dos somatórios que serão os elementos da matriz A SX1 = 0; SX2 = 0; SX3 = 0; SX4 = 0; Sy = 0; Sy2 = 0; SXy = 0; SX2y = 0; % Somatório dos elementos da matriz A for i = 1: m SX1 = SX1 + X(i);

120

SX2 = SX2 + X(i).*X(i); SX3 = SX3 + X(i)^3; SX4 = SX4 + X(i)^4; Sy = Sy + y(i); Sy2 = Sy2 + y(i).*y(i); SXy = SXy + X(i).*y(i); SX2y = SX2y + X(i).*X(i).*y(i); end % matriz A A = [ m SX1 SX2 SX1 SX2 SX3 SX2 SX3 SX4]; % matriz B transposta para poder obter a solução do sistema B = [Sy, SXy, SX2y]'; % Resolução do sistema C = A\B; % Calculo de R2 Sn1 = C(1)* (Sy - m * Sy/m); Sn2 = C(2)* (SXy - SX1 * Sy/m); Sn3 = C(3)* (SX2y - SX2 * Sy/m); R2 = (Sn1+Sn2+Sn3)/(Sy2-Sy * Sy/m); y1 = C(1) + C(2).* X + C(3).* X.^2; plot(X,y,X,y1) disp(' '); fprintf('R2=%d',R2); disp(' '); fprintf('C(1)=%d',C(1)); disp(' '); fprintf('C(2)=%d',C(2)); disp(' '); fprintf('C(3)=%d',C(3)); disp(' '); Exemplo 2: Ajuste Linear dos resultados das velocidades específicas de

produção de glutationa para o conjunto de coeficientes A2, a partir do qual

121

se obtém também os valores dos parâmetros g1 e g2, relacionadas à função

C.

clear all clc % entrada dos dados: x1 representa o Melaço de cana (g L-1) x1(1) = 13.1 ; x1(2) = 76.9 ; x1(3) = 13.1 ; x1(4) = 76.9 ; x1(5) = 0 ; x1(6) = 90 ; x1(7) = 45 ; x1(8) = 45 ; x1(9) = 45 ; % x2 representa o glicerol (g L-1) x2(1) = 13.1 ; x2(2) = 13.1 ; x2(3) = 76.9 ; x2(4) = 76.9 ; x2(5) = 45 ; x2(6) = 45 ; x2(7) = 0 ; x2(8) = 90 ; x2(9) = 45 ; %a1 = %a2 = a2new = 0.0; a1new = 0.0; r2new = 0.0; for a2 = 1.0:0.01:5.0 for a1 = 1.0:0.01:5.0 X = sin((a1*x1)-(a2*x2)); %coeficientes C(2) y(1) = 5.96898e-6; y(2) = 9.07583e-6; y(3) = 9.27479e-6; y(4) = 8.05160e-6; y(5) = 3.82202e-6; y(6) = 8.88970e-6; y(7) = 3.46291e-6;

122

y(8) = 5.66345e-6; y(9) = 5.81904e-6; % m é o numero de pontos m = 9; % inicializando os valores dos somatórios que serão os elementos da matriz A SX = 0; SX2 = 0; SXy = 0; Sy = 0; Sy2 = 0; % somatórios dos Elementos da matriz A for i = 1:m SX = SX + X(i); SX2 = SX2 + X(i).*X(i); SXy = SXy + X(i) .* y(i); Sy = Sy + y(i); Sy2 = Sy2 + y(i) .* y(i); end %Matriz A A = [ m SX SX SX2]; % Matriz B transposta para poder obter a solução do sistema B = [Sy, SXy]'; % Resolução do Sistema C = A\B; %Calculo de R2 R2 = (SXy - SX * Sy / m)^2 / ((SX2 - SX^2/m) * (Sy2 - Sy^2 / m)); if r2new < R2; r2new = R2; a2new = a2; a1new = a1; end end end

123

%end % matriz calculada do tg y1 = C(1) + C(2)* X; fprintf('A1=%d',a1new); disp(' ');%espaço entre os valores fprintf('A2=%d',a2new); disp(' '); fprintf('R=%d',R2); disp(' '); fprintf('R2=%d',r2new); disp(' '); fprintf('C(1)=%d',C(1)); disp(' '); fprintf('C(2)=%d',C(2));

Exemplo 3: Modelo final para velocidade específica de produção de

glutationa, utilizando 45 g L-1 de melaço e 45 g L-1 de glicerol.

clc % entrada de valores de melaço e glicerol x1 = 45; x2 = 45; Z1 = sin((2.67.*x1)-(3.43.*x2)); Z2 = sin((1.50.*x1)-(4.90.*x2)); Z3 = sin((3.62.*x1)-(4.75.*x2)); c1a = 6.002333e-007; c1b = -1.799738e-007; c2a = 6.669813e-006 ; c2b = -4.549737e-007; c3a = -5.347641e-008; c3b = 8.613470e-009; t = [0:24:96]; y1 = c1a+c1b.*Z1 + (c2a+c2b.*Z2).*t +(c3a+c3b.*Z3).*t.^2; plot(t,y1) disp(' '); fprintf('y1=%d',y1); D. PROGRAMAÇÃO OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA

clc % entrada de valores de melaço e glicerol

124

x2new = 0.0; x1new = 0.0; for x2 =10.0:5.0:90.0 for x1 =10.0:5.0:90.0 Z1 = sin((2.67.*x1)-(3.43.*x2)); Z2 = sin((1.50.*x1)-(4.90.*x2)); Z3 = sin((3.62.*x1)-(4.75.*x2)); c1a = 6.023330e-007; c1b = -1.799738e-007; c2a = 6.669813e-006 ; c2b = -4.549737e-007; c3a = -5.347641e-008; c3b = 8.63470e-009; t = [0:24:96]; y1 = c1a+c1b.*Z1 + (c2a+c2b.*Z2).*t +(c3a+c3b.*Z3).*t.^2; end end plot(t,y1) disp(' '); fprintf('y1=%d',y1);

E. SOLUÇÕES PARA PREPARAÇÃO DE MOSTO DE UVA

SINTÉTICO

Tabela 21 – Quantidade dos componentes pertencentes a solução de

oligoelementos empregadas no meio sintético, mosto de uva.

Oligoelemento Quantidade (g. L-1)

MnSO4.H20 4

ZNSO4.7H20 4

CuSO4.5H20 1

KI 1

CoCl25H20 0,4

H3BO3 1

(NH4)6Mo7O24 1

125


minerais empregado no meio sintético, mosto de uva.

Minerais Quantidade (g L-1)

MyO-Inositol 2

Pantotenato 0,15

Tiamina Hidroclor

0,025

Ácido nicotinico 0,2

Pirodoxina 0,025

Biotina 0,0003


minerais empregado no meio sintético, mosto de uva.

Aminoácidos Quantidade (g L-1)

Tirosina 1,5

Triptofano 13,4

Isoleucina 2,5

Ácido Aspartico 3,4

Ácido Glutâmico 9,2

Arginina 28,3

Leucina 3,7

Treonina 5,8

Glicina 1,4

Glutamina 38,4

Alanina 11,2

Valina 3,4

Metionina 2,4

Fenilanina 2,9

Serina 6

Histidina 2,6

Lisina 1,3

Cisteina 1,5

Proteina 46,1

F. RESULTADOS CURVA DE CALIBRAÇÃO: BIOMASSA

126

Tabela 24 – Resultados médios das absorbâncias e concentração celular (g

L-1), referente a curva padrão


Concentração celular em (g L-1)

0,11 0,08

5,78 4,4

10,27 7,6

14,63 9,7

15,40 10,7

Figura 28 – Perfil Da Curva De Calibração De Biomassa

G. METODOLOGIA PARA QUANTIFICAR GSH POR

MÉTODOLOGIA ENZIMÁTICA

1. MES 2X (para 100 mL)

MES Pm: 195,24 g/mol. Deve estar a 0,4 M: Cálculo: 195,24 g/mol x 0,4mol/L = 78,096 g/L

0,1L x 78,096 = 1L x PESO PESO = 7,81 gramas de MES em 100 mL de tampão fosfato sódico 0,1M pH 7,4. 2mM EDTA: 2x 10-³ M = 2x 10-3 mol/L Pm = 292,25 g/mol Cálculo: 2x10-3 mol/L x 292,25 g/mol = 0,58 g/L

0,58 g x 0,1 L

y = 0,6738x + 0,2731 R² = 0,9936

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00

Co

nce

nta

ção

ce

lula

r (

g L-1

)


127

PESO = 0,058 gramas de EDTA em 100 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 7,4. Ajustar o pH para 6 com NaOH. 2. MES 1X

Se dilui o tampão MES 2X no tampão fosfato sódico pH 7,4 0,1M. 3. Tampão fostato EDTA

Tampão fosfato sódico 0,01M EDTA 0,005 M Em 10 mL de tampão fosfato deve ser adicionado 0,0146g de EDTA com Pm = 292,25 g/mol.

4. GSH

0,003 g/1 mL de MES 1X para tê-lo a 10 mM, mas deve ser a 50 µM. Asssim é preciso fazer duas diluições: 100 µL do que foi pesado e dissolvido em 1 mL + 900 µL de MES1X de modo que é a 1 mM. Para se chegar a 50 µM pegar 50 µL da última dissolução e adicionar 950 µL de MES 1X.

5. G6P

0,0064 g/mL tampão fosfato + EDTA.

6. DTNB

Dissolver 0,00396 g/50 mL MES1X (Estará a 200µM), dissolver no momento

do uso.

7. NADP+

(adicionar ao coquetel de ensaio final): 0,016 g/ 1mL tampão fosfato +

EDTA.

8. G6PDH:

Utiliza-se a 0,125 mg/mL e o estoque (a 4ºC) é de 8,4 mg/mL em 14,88 µL

fazendo um balanço adicione 985,11 µL de tampão fosfato edta.

9. GSH redutase

Como é necessário 192 unidades/mL, e o estoque é de 160 unidades/mL, é

preciso dissolver 12 µL de enzima em 988 µL de tampão fosfato edta.

128

H. RESULTADOS CURVA DE CALIBRAÇÃO: GLUTATIONA

Tabela 25 – Resultados médios das absorbâncias e concentração de GSH

(µM) referente à curva padrão


Concentração de GSH (µM)

0 0

0,125 2

0,251 4

0,446 8

0,72 12

Figura 29 - Perfil Da Curva De Calibração De Glutationa

I. RESULTADO DOS DADOS MODELADOS

y = 16,69x + 0,0234 R² = 0,9981

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Co

nce

ntr

ação

de

GSH

(µ

M)

Absorrbância (412 nm)

129

Tabela 26 – Resultado das concentrações de GSH (mg L-1) preditas pelo

modelo híbrido para os 11 ensaios do DCCR 2² nos tempos de fermentação

de 0,24, 48, 72 e 96 horas.

Ensaios GSH (mg L-1)

0 24 48 72 96

1 0 33,82 43,63 66,41 27,91

2 0 30,43 77,41 95,43 40,32

3 0 45,35 83,4 121,38 45,31

4 0 49,8 106,56 118,6 58,64

5 0 41,89 57,19 71,12 40,98

6 0 45,09 87,27 78,78 13,88

7 0 44,51 62,11 79,94 40,46

8 0 36,62 61,81 75,4 31,84

9 0 47,98 95,61 104,01 48,55

10 0 47,98 95,61 104,01 48,55

11 0 47,98 95,61 104,01 48,55

J. RESULTADO OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA

Tabela 27 – Resultado da concentração de GSH (mg L-1) para ensaio

utilizado para expressar a otimização numérica.

Ensaio 6 GSHExp* GSHPre*

Tem

po

(h

) 0 7,9 0,0

24 44,9 50,7

48 84,2 110,2

72 117,8 126,0

96 25,7 52,1 *GSHExp: Valores da concentração de glutationa determinados experimentalmente, GSHPred:

Valores de concentração de Glutationa preditas pela otimização numérica através do

modelo híbrido.

K. RESULTADOS PARA GLUTATIONA E BIOMASSA OBTIDOS NA

ETAPA DE VALIDAÇÃO

130

Tabela 28 – Resultados da concentração de glutationa (mg L-1) obtidas no

Delineamento Fatorial Completo 2².

Ensaio

Tempo

0 24 48 72

GS

H (

mg

L-1)

1 34,6 64,8 80,8 82,5

2 34,6 71,6 67,9 65,8

3 34,6 60,3 81,3 68,3

4 34,6 51,4 61,1 63,1

5 34,6 75,2 85,7 127,3

6 34,6 74,8 74,2 120,1

7 34,6 71,1 79,3 114,7

8 34,6 77,7 79,8 113,0

Tabela 29 – Resultados da concentração de biomassa (g L-1) obtida no

Delineamento Fatorial Completo 2².

Ensaio Tempo

0 24 48 72

Bio

ma

ss

a (

g L

-1)

1 0,38 2,62 4,77 4,85

2 0,38 4,22 2,06 2,20

3 0,38 1,21 0,31 1,80

4 0,38 0,48 0,36 0,44

5 0,38 3,99 4,59 4,65

6 0,38 3,50 3,63 3,88

7 0,38 3,71 4,48 4,22

8 0,38 3,74 3,45 4,89

L. RESULTADOS DAS CONDIÇÕES ESTUDADAS PARA OS TEMPOS

DE 0, 24, 48 E 72 HORAS.

131

Tabela 30 – Resultado da etapa de validação para os valores da

concentração intracelular de GSH (%) para os tempos de 0, 24, 48 e 72

horas.

Ensaio Tempo

0 24 48 72

1 9,09 2,47 1,69 1,70

2 9,09 1,70 3,30 3,00

3 9,09 4,99 26,24 3,81

4 9,09 10,83 17,22 14,34

5 9,09 1,89 1,87 2,74

6 9,09 2,14 2,04 3,10

7 9,09 1,92 1,77 2,72

8 9,09 2,08 2,31 2,31


Produtividade celular (g L-1 h-1) para os tempos de 0, 24, 48 e 72 horas.

Ensaio Tempo

0 24 48 72

1 0,00 0,09 0,09 0,06

2 0,00 0,16 0,04 0,03

3 0,00 0,03 0,00 0,02

4 0,00 4E-03 -5E-04 8E-04

5 0,00 0,15 0,09 0,06

6 0,00 0,13 0,07 0,05

7 0,00 0,14 0,09 0,05

8 0,00 0,14 0,06 0,06


Produtividade de GSH (mg L-1 h-1) para os tempos de 0, 24, 48 e 72 horas.

Ensaio Tempo

0 24 48 72

1 0,00 1,26 0,96 0,67

2 0,00 1,54 0,69 0,43

3 0,00 1,07 0,97 0,47

4 0,00 0,70 0,55 0,40

5 0,00 1,69 1,06 1,29

6 0,00 1,68 0,83 1,19

7 0,00 1,52 0,93 1,11

8 0,00 1,80 0,94 1,09

132

M. RESULTADOS PARA A CONCENTAÇÃO CELULAR (g L-1),

CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO (mg L-1), CONCENTRAÇÃO DE

GLICEROL (g L-1), ETANOL (%) E CONSUMO DE GLICOSE E FRUTOSE

(g L-1)

Tabela 33 – Resultados da concentração de biomassa (g L-1) obtida no

Delineamento Composto Rotacional 2² durante 117 h de fermentação.

Ensaio Tempo (h)

0 24 40 72 96 117

1 0,08 5,69 7,18 5,01 4,47 4,60

2 0,08 3,95 6,73 4,64 4,25 4,65

3 0,08 5,46 7,43 4,51 5,76 6,58

4 0,08 4,58 6,59 5,73 6,06 6,01

5 0,08 1,35 1,34 1,44 1,65 1,81

6 0,08 3,54 7,03 6,15 5,99 5,83

7 0,08 6,89 6,98 7,08 6,34 6,04

8 0,08 5,00 7,22 5,87 6,21 5,81

9 0,08 6,43 6,96 5,44 5,83 5,91

10 0,08 5,59 7,54 5,47 5,87 6,19

11 0,08 6,20 6,93 5,86 6,76 5,90

12 0,08 5,98 7,80 6,26 6,59 6,60

Tabela 34 – Resultados da concentração de ácido acético (mg L-1) obtida no

Delineamento Composto Rotacional 2² durante 117 h de fermentação.

Ensaio Tempo (h)

0 24 40 72 96 117

1 0 377,41 715,77 780,33 780,86 781,39

2 0 616,08 835,66 927,27 930,00 931,60

3 0 363,97 332,48 378,33 382,15 380,73

4 0 897,34 520,55 600,99 598,20 610,37

5 0 1390,78 850,00 865,07 941,21 895,00

6 0 473,78 465,47 519,68 539,33 540,64

7 0 317,37 165,33 196,21 202,17 204,68

8 0 452,11 450,84 508,92 504,45 512,88

9 0 335,44 308,89 347,10 353,64 354,46

10 0 291,30 297,17 330,99 331,64 332,39

11 0 248,70 264,26 317,62 319,53 320,51

12 0 249,63 301,18 319,23 323,50 323,39

133

Tabela 35 – Resultados da concentração de glicerol (g L-1) adicionada ao

meio de fermentação de acordo com o Delineamento Composto Rotacional

2².

Ensaio Tempo (h)

0 24 40 72 96 117

1 8,79 12,68 13,75 13,58 13,74 13,73

2 51,21 51,66 48,70 48,01 48,00 48,40

3 8,79 14,14 14,77 15,19 14,78 14,85

4 51,21 49,98 47,39 47,59 46,08 47,40

5 30,00 32,49 30,00 31,00 31,82 30,30

6 30,00 31,74 31,27 30,86 31,24 31,31

7 0,00 6,75 7,37 7,75 7,61 7,79

8 60,00 53,15 55,50 55,23 53,37 54,83

9 30,00 29,01 31,76 31,23 31,52 32,39

10 30,00 30,38 31,00 32,00 31,61 31,90

11 30,00 30,07 32,24 31,96 32,07 32,16

12 30,00 31,03 32,32 31,90 32,05 32,01

Tabela 36 – Resultados da porcentagem de etanol formado durante as 117 h

de fermentação.

Ensaio Tempo (h)

0 24 40 72 96 117

1 0 9,77 11,50 11,83 11,91 11,95

2 0 10,68 10,64 11,46 11,50 11,55

3 0 10,86 11,70 11,90 11,92 11,90

4 0 11,00 10,98 11,43 11,33 11,45

5 0 9,49 3,98 5,93 7,02 7,74

6 0 8,53 10,93 11,62 11,35 11,41

7 0 10,34 11,90 12,17 12,17 12,16

8 0 10,56 10,96 11,67 11,51 11,64

9 0 9,96 11,24 11,65 11,98 11,93

10 0 9,82 11,00 11,98 12,06 11,92

11 0 9,08 11,37 12,02 12,02 12,04

12 0 10,62 11,31 11,96 12,04 12,00

134

Tabela 37 – Resultados do consumo de glicose adicionado ao meio de

fermentação em g L-1.

Ensaio Tempo (h)

0 2 17 40 72

1 100,00 90,94 48,75 25,56 0,00

2 100,00 88,20 56,19 32,87 0,00

3 100,00 97,40 52,23 31,21 0,00

4 100,00 104,89 69,20 39,43 2,21

5 100,00 90,33 72,21 62,09 34,02

6 100,00 95,54 63,92 20,83 0,00

7 100,00 92,34 47,74 14,98 0,00

8 100,00 90,05 56,10 16,32 0,00

9 100,00 93,24 51,28 15,35 0,00

10 100,00 94,75 52,55 16,14 0,00

11 100,00 95,00 54,37 15,87 0,00

12 100,00 94,54 56,11 15,93 0,00

Tabela 38 – Resultados do consumo de frutose adicionado ao meio de

fermentação em g L-1.

Ensaio Tempo (h)

0 2 17 40 72

1 100,00 87,09 69,22 57,32 0

2 100,00 84,18 70,45 59,39 2,45

3 100,00 86,25 63,77 54,78 1,41

4 100,00 107,47 72,57 64,65 1,24

5 100,00 86,96 80,21 69,36 44,48

6 100,00 81,76 68,44 59,32 1,01

7 100,00 83,70 65,74 50,21 0,09

8 100,00 81,66 67,31 48,29 1,46

9 100,00 84,77 65,72 50,98 1,21

10 100,00 86,03 66,53 52,48 0

11 100,00 86,27 67,80 51,83 0,41

12 100,00 79,99 67,81 51,61 0

135

ANEXOS

A. RESULTADOS CONCENTRAÇÃO DE GLUTATIONA

Tabela 39 – Resultados de concentração de GSH (mg L-1) obtidos no DCCR

2².

Ensaio GSH (mg L-1)

0h 24 h 48 h 72 h 96 h

1 5,2 42,86 58,47 66,08 19,10 2 6,2 44,29 106,72 97,85 24,83 3 7,8 54,92 113,31 78,58 29,84 4 9,7 44,81 95,10 119,60 32,22 5 3,9 22,54 61,98 51,30 43,00 6 7,9 44,91 84,21 117,79 25,73 7 5,7 10,95 70,47 63,89 55,12 8 6,4 28,93 82,97 76,00 51,58 9 6.6 58,80 74,40 106,10 10,70

10 4,7 34,40 94,00 109,30 62,20 11 5,4 40,66 92,47 108,70 66,09


Tabela 40 – Resultados da concentração de biomassa (mg L-1) obtidos no

DCCR 2².

Ensaio Biomassa (mg L-1)

0h 24 h 48 h 72 h 96 h

1 180 10700 9400 14900 10700 2 40 10200 16800 19500 10500 3 130 15300 18300 25300 12300 4 220 16300 22100 22300 12900 5 110 12900 11500 13700 10500 6 160 15800 21800 22700 11100 7 110 13400 12300 15400 10800 8 130 11700 13400 16900 11900 9 80 11700 15800 20000 12100

10 60 14800 19300 20200 21400 11 90 14700 19500 21100 14500


136

B. COMPOSIÇÃO DA ÁGUA DE MACERAÇÃO DE MILHO

Tabela 41 – Composição da água de maceração de milho (AMM) utilizada

como substrato para o meio de fermentação.

Componente Quantidade Concentração (%)

Aminoácidos 19 2 a 18

Proteína bruta (base seca) 35 a 40

Vitaminas - -

Minerais - -


Documents

OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA DA PRODUÇÃO DE GLUTATIONA POR ...repositorio.bc.ufg.br/tede/bitstream/tede/6204/5/Dissertação - Késia... · amizade e lanchinhos no decorrer da última