KiKKiiKit Autossômico Gt Autossômico Gt Autossômico GEM … · 3 D22S1045 22q12.3 10,11,14,15,16,17,18 Vermelha 15,16 Penta D 21q22.3 2.2,3.2,5,7,8,9,10,11,12 Vermelha 9,10 O kit

Engenharia MolecularEngenharia MolecularEngenharia MolecularEngenharia Molecular

KiKiKiKit Autossômico Gt Autossômico Gt Autossômico Gt Autossômico GEMEMEMEM----22plex sem extração22plex sem extração22plex sem extração22plex sem extração

Manual TécnicoManual TécnicoManual TécnicoManual Técnico

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1

GGGGEMEMEMEM----22plex22plex22plex22plex

1111. . . . IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução

STRs (short tandem repeats) são sequências repetitivas de 3 a 7 pares de

bases encontradas ao longo de todo o genoma humano. Devido ao alto

polimorfismo apresentado, esses marcadores têm sido utilizados como método

padrão de investigação de vínculo genético, uma vez que apresentam poder de

discriminação adequado para a solução da maioria dos problemas de identificação

humana.

Os marcadores STRs podem ser analisados através da reação em cadeia da

polimerase (PCR) utilizando-se “primers” marcados com fluoróforos. Diferentes

locos STRs podem ser analisados simultaneamente através de reações multiplex,

na qual vários pares de “primers” marcados, um para cada loco, são usados na

mesma reação. Os alelos são analisados através de eletroforese capilar e podem

ser diferenciados entre si tanto pela cor emitida a partir dos fluoróforos ligados

aos primers quanto pelos tamanhos dos produtos obtidos.

O kit GEM-22plex permite a co-amplificação de 22 locos (21 autossômicos

e amelogenina) em um sistema de detecção de cinco cores. Além dos 13 locos que

constituem o banco de dados dos Estados Unidos (CODIS), o kit permite a análise

de STRs nos locos PentaE, D10S1237, D2S1338, D1S1656, D19S433, HUMF13B,

D22S1045 e PentaD (Tabela 1) .

2

GEMGEMGEMGEM----22plex22plex22plex22plex

Tabela 1:Tabela 1:Tabela 1:Tabela 1: Descrição dos locos analisados no sistema e dos alelos presentes na Escada Alélica e no DNA genômico controle.

LocoLocoLocoLoco Localização no Localização no Localização no Localização no

cromossomocromossomocromossomocromossomo AlelosAlelosAlelosAlelos presentes na Escada Alélica presentes na Escada Alélica presentes na Escada Alélica presentes na Escada Alélica FluorescênciaFluorescênciaFluorescênciaFluorescência

DNA DNA DNA DNA

genômico genômico genômico genômico

controlecontrolecontrolecontrole

HUMTPOX 2p23-2per 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 Azul 8,12

HUMVWA 12p12-pter 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 Azul 15,16

D13S317 13q22-31 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 Azul 11,12

D18S51 18q21.3 8,9,10,11,12,13,13.2,14,14.2,15,15.2,16,

16.2,17,18,19,20,21,22,23,24,25,27 Azul 14,17

Penta E 15q26.2 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,

17,18,19,20,21,22,23 Azul 5,7

Amelogenina X: p22.1-22.3

Y: p11.2 X, Y Verde X,Y

D5S818 5q21-31 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 Verde 11,12

D21S11 21q11.2-q21

25.2,26,27,28,28.2,29,29.2,30,31.2,32,3

2.2,

33,33.2,34,34.2,35,35.2,36,37,38,39

Verde 29,31.2

HUMCSF1PO 5q33.3-34 6,7,8,9,10,12,13,14,15 Verde 9,12

D10S1237 10q25.3 9,10,11,12,13,15,16,17,18,19,20,21,22,2

3,

24,25,26,27

Verde 20

D2S1338 2q35-37.1 15,16,17,18,19,20,22,23,25,26 Verde 17,25

D3S1358 3p21.31 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 Amarela 16,17

D16S539 16q24-qter 7,8,9,10,11,12,13,14,15 Amarela 9,11

D7S820 7q21.11 7,8,9,10,11,12,13,15 Amarela 5,6

HUMFIBRA_

FGA 4q28

15,17,18,19,19.2,20,21,22,23,23.2,24,25

,

25.2,26,27,28,29,30,31,31.2,32.2,43,44,

45,

46

Amarela 22,22.2

D1S1656 1q42 11,12,13,14,15,15.2,16,17 Amarela 16,17.3

D8S1179 8q24.13 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 Vermelha 11,14

D19S433 19q12-13.1 9,10,11,12,12.2,13,13.2,14,14.2,15.2,16,

16.2,17,17.2 Vermelha 14,16

HUMTH01 11p15.5 4,5,6,7,8,9,9.3,10,11 Vermelha 7,9.3

HUMF13B 1q31-32.1 5,6,7,8,9,10,11,12 Vermelha 6,8

3

D22S1045 22q12.3 10,11,14,15,16,17,18 Vermelha 15,16

Penta D 21q22.3 2.2,3.2,5,7,8,9,10,11,12 Vermelha 9,10

O kit GEM-22plex foi desenvolvido com uma solução tampão que permite a

amplificação do DNA a partir de um único disco de sangue ou saliva em papel filtro

de 1mm, sem a necessidade de qualquer tipo de extração prévia da amostra. Essa

possibilidade resulta em uma redução no tempo de obtenção do resultado e também

permite a realização das reações a partir de amostras contendo pouca quantidade

de material.

4


2222.... ComposiçãoComposiçãoComposiçãoComposição ddddo kito kito kito kit Componentes fornecidosComponentes fornecidosComponentes fornecidosComponentes fornecidos

Todos os reagentes necessários para a amplificação e análise dos 22 locos

são fornecidos com o kit em uma série de 5 tubos (Tabela 2).

Tabela2:Tabela2:Tabela2:Tabela2: Componentes do kit e suas respectivas quantidades para 100 reações.

ComponenteComponenteComponenteComponente DescriçãoDescriçãoDescriçãoDescrição VolumeVolumeVolumeVolume

PCR Mix GEM-22plex

Dois tubos contendo

MgCl2,

desoxinucleotídeos

trifosfatos e Taq DNA

polimerase em solução

tampão para amostras

sem extração.

1,0 mL/tubo

Primer Mix GEM-22plex

Um tubo contendo

primers fluorescentes e

não-fluorescentes para

amplificação de 21 locos

STRs + amelogenina.

0,11 mL/tubo

DNA genômico controle

GEM-22plex

Um tubo contendo

2ng/uL de DNA genômico

masculino (Tabela 1).

0,015 mL/tubo

Escada Alélica

GEM-22plex

Um tubo contendo uma

mistura de alelos

amplificados (ver Fig.2).

0,01 mL/tubo

GEMDYC-512

Marcador de peso

molecular para

eletroforese capilar.

0,06 mL/tubo

5


ArmazenameArmazenameArmazenameArmazenamento dos Componentesnto dos Componentesnto dos Componentesnto dos Componentes

Os fluoróforos ligados aos primers são sensíveis à luz. Portanto, devem ser

protegidos quando não estiverem em uso. O armazenamento dos materiais

fornecidos deve seguir recomendações específicas (Tabela 3).

Tabela 3:Tabela 3:Tabela 3:Tabela 3: Condições de armazenamento dos componentes do kit.

ComponenteComponenteComponenteComponente Temperatura de Temperatura de Temperatura de Temperatura de

ArmazenamentoArmazenamentoArmazenamentoArmazenamento

PCR Mix GEM-22plex -15ºC a -25ºC

Primer Mix GEM-22plex

DNA genômico controle GEM-

22plex

Escada Alélica GEM-22plex

2ºC a 8ºC

GEMDYC-512 -15ºC a -25ºC

6

GEMGEMGEMGEM----22222222plexplexplexplex

3333. . . . Equipamentos e materiais Equipamentos e materiais Equipamentos e materiais Equipamentos e materiais necessáriosnecessáriosnecessáriosnecessários

Tabela 4 : Tabela 4 : Tabela 4 : Tabela 4 : EEEEquipamentos e materiais necessários que não são fornecidos com o kit.

EquipamentosEquipamentosEquipamentosEquipamentos MateriaisMateriaisMateriaisMateriais

1Termociclador Microtubos 0,2 mL

Microcentrífuga Microtubos 0,5 mL

Micropipetas Microtubos 1,5 mL

Vortex Ponteiras 10 uL e 200 uL

2Sequenciador HI-DI-Formamida

1 O kit foi otimizado com equipamentos Veriti – Applied Biosystem. 2 Recomenda-se a utilização de sequenciador ABI 3130 - Applied Biosystem.

7


4444. . . . Reação de PCRReação de PCRReação de PCRReação de PCR PreparoPreparoPreparoPreparo do Master do Master do Master do Master mmmmixixixix

Recomenda-se vortexar os tubos por 5 segundos antes do preparo do

master mix (Tabela 5).

Tabela 5:Tabela 5:Tabela 5:Tabela 5: Volumes necessários para o preparo do Master mix para uma reação.

ComponenteComponenteComponenteComponente VolumeVolumeVolumeVolume

PCR Mix GEM-22plex 19 uL

Primer Mix GEM-22plex 1,0 uL

Amostra de DNAAmostra de DNAAmostra de DNAAmostra de DNA

O kit GEM-22plex foi desenvolvido para ser usado com 1 disco de papel

FTA ou papel filtro comum de 1 mm contendo sangue ou saliva.

Preparo das reaçõesPreparo das reaçõesPreparo das reaçõesPreparo das reações de PCR de PCR de PCR de PCR

Tabela 6:Tabela 6:Tabela 6:Tabela 6: Quantidade de amostra necessária para cada reação de PCR.

ComponenteComponenteComponenteComponente AmostraAmostraAmostraAmostra Controle Controle Controle Controle

negativonegativonegativonegativo

Controle Controle Controle Controle

positivopositivopositivopositivo

Master mix 20 uL 20 uL 20 uL

Disco de 1 mm com sangue ou saliva 1 disco

---- ----

DNA genômico controle GEM-22plex ---- ---- 1 uL

8


Condições para Condições para Condições para Condições para amplificaçãoamplificaçãoamplificaçãoamplificação

Tabela 7:Tabela 7:Tabela 7:Tabela 7: Condições dos ciclos para a reação de amplificação do sistema.

IncubaçãoIncubaçãoIncubaçãoIncubação Desnat.Desnat.Desnat.Desnat. AnelamentoAnelamentoAnelamentoAnelamento ExtensãoExtensãoExtensãoExtensão IncubaçãoIncubaçãoIncubaçãoIncubação

95ºC 94ºC 58ºC 72ºC 60ºC 4-10ºC

5 min. 30 seg. 90 seg. 60 seg. 60 min. ∞

1 ciclo 33330 ciclos0 ciclos0 ciclos0 ciclos 1 ciclo

O tempo da reação pode variar entre os diferentes modelos de

termocicladores, porém, estima-se sua conclusão em aproximadamente 3 horas.

9


5555. . . . EletroforeseEletroforeseEletroforeseEletroforese da da da dassss reaç reaç reaç reaçõesõesõesões emememem sequenciador ABI 3sequenciador ABI 3sequenciador ABI 3sequenciador ABI 3130130130130

Importante:Importante:Importante:Importante:

1. Antes de injetar as amostras no sequenciador ABI 3130, deve-se realizar a

calibração do equipamento utilizando a matrix DS33 (Dye Set G5 - Applied

Biosystems) (6-FAM™,VIC™,NED™,PET™ e LIZ™ -para mais informações,

consulte manual do equipamento).

2. O sistema foi desenvolvido utilizando-se polímero POP7 e capilares de 36cm.

Elaboração do protocolo de corrida Elaboração do protocolo de corrida Elaboração do protocolo de corrida Elaboração do protocolo de corrida para eletroforese no para eletroforese no para eletroforese no para eletroforese no sequenciador ABI 3130sequenciador ABI 3130sequenciador ABI 3130sequenciador ABI 3130

1.1.1.1. Abra o software do equipamento e espere o início da tela principal. Em “Module

Manager”, nomeie o protocolo e insira os parâmetros conforme mostrado abaixo.

10


2.2.2.2. Em “Protocol Manager”, insira o nome e os parâmetros adequados.

11


Preparo das amostrasPreparo das amostrasPreparo das amostrasPreparo das amostras

1.1.1.1. Primeiramente, prepare uma mistura contendo 1280 uL de Formamida Hi-Di

(Applied Biosystems) e 50 uL de GEMDYC-512.

2.2.2.2. Pipete 12 uL da mistura GEMDYC-512/Formamida Hi-Di em cada poço da

placa.

* Lembre-se sempre de considerar ao menos um poço da placa para corrida da

Escada Alélica.

3.3.3.3. Adicione 1,0 uL das reações ou 1,0 uL da escada alélica GEM-22plex por poço.

4.4.4.4. Sele a placa com a “Septa” e centrifugue a placa a 3000 r.p.m por 20 segundos.

5.5.5.5. Desnature as amostras por 3 minutos a 95ºC.

6.6.6.6. Incube por 3 minutos a -20ºC.

Eletroforese das soluçõesEletroforese das soluçõesEletroforese das soluçõesEletroforese das soluções 1.1.1.1. Clique em “Plate Manager” e então em “New”.

12


2.2.2.2. Crie a planilha preenchendo os campos necessários.

Sample name - insira o nome das amostras;

Sample type - selecione “sample” para as amostras e “allelic ladder” para a

escada alélica.

Size Standard - selecione GEMDYC-512.

Panel - selecione 22plex_GEM_v1.

Analysis Method - HID_Advanced_GEM-22plex.

Results Group - crie uma pasta para armazenamento dos arquivos das corridas.

Instrument Protocol - HID_36_POP7_G5_GEM-22plex.

3.3.3.3. Clique em “OK”.

4.4.4.4. Selecione a planilha em “Plate view” e insira a placa em um dos

compartimentos A ou B.

5.5.5.5. Clique em “run” .

13


6666. . . . Análise das Análise das Análise das Análise das amostras utilizando o amostras utilizando o amostras utilizando o amostras utilizando o software GeneMapper 3.2software GeneMapper 3.2software GeneMapper 3.2software GeneMapper 3.2

A análise dos resultados obtidos na eletroforese capilar descritas abaixo se

referem à versão 3.2 do software GeneMapper. Antes de iniciar, solicite os

arquivos de análise pelo email [email protected].

Importando o PImportando o PImportando o PImportando o Painel eainel eainel eainel e o arquivo dos o arquivo dos o arquivo dos o arquivo dos ““““BBBBins”ins”ins”ins” 1.1.1.1. Abra o programa GeneMapper v3.2, clique em “Tools” e posteriormente em

“Panel Manager”.

2.2.2.2. No painel de navegação, clique uma vez em “Panel Manager” e então

selecione “File” e “Import Panels”.

3.3.3.3. Na pasta “Arquivos_GEM-22plex” selecione “Megaplex_POP7_Panels_v1.txt”

e selecione “Import”.

4.4.4.4. No painel de navegação, clique uma vez em “Megaplex_POP7_Panels_v1.txt”,

selecione “File” e então “Import Bin Set”.

5.5.5.5. Na pasta “Arquivos_GEM-22plex” selecione “Megaplex_POP7_Bins_v1.txt” e

selecione “Import”.

6.6.6.6. Clique em “Apply” e então “OK”. A janela do “Panel Manager” fechará

automaticamente.

14


Importando oImportando oImportando oImportando o método de análise método de análise método de análise método de análise HID_Advanced_GEM HID_Advanced_GEM HID_Advanced_GEM HID_Advanced_GEM----22plex para22plex para22plex para22plex para programa GeneMapper ID programa GeneMapper ID programa GeneMapper ID programa GeneMapper ID

1.1.1.1. Selecione “Tools” e então “GeneMapper Manager”.

2.2.2.2. Clique em “Analysis Methods”.

3.3.3.3. Clique em “Import” e procure na pasta “Arquivos_GEM-22plex” o arquivo

“HID_Advanced_GEM-22plex”, selecione e clique em “Import”.

4.4.4.4. Clique em “Done”.

Importando oImportando oImportando oImportando o padrão de tamanho GEMDYCpadrão de tamanho GEMDYCpadrão de tamanho GEMDYCpadrão de tamanho GEMDYC----512 para512 para512 para512 para programa GeneMapper IDprograma GeneMapper IDprograma GeneMapper IDprograma GeneMapper ID 1.1.1.1. Selecione “Tools” e então “GeneMapper Manager”.

2.2.2.2. Clique em “Size Standards”.

3.3.3.3. Clique em “Import” e procure na pasta “Arquivos_GEM-22plex” o arquivo

GEMDYC_512, selecione e clique em “Import”.

4.4.4.4. Clique em “Done”.

Analisando o resultado da eletroforese capilarAnalisando o resultado da eletroforese capilarAnalisando o resultado da eletroforese capilarAnalisando o resultado da eletroforese capilar Para mais detalhes, consulte o tutorial da Applied Biosystems GeneMapper®

ID Software Human Identification Analysis.

1.1.1.1. Abra o programa GeneMapper v3.2, clique em “File” e então “Add Samples to

Project”.

15


2.2.2.2. Selecione a pasta com os arquivos da eletroforese capilar, clique em “Add to

list” e então “Add”.

3.3.3.3. Na coluna “Sample Type”, selecione “Ladder”, “Sample”, “Positive Control” or

“Negative Control”. Todo projeto deve conter no mínimo um “Ladder”.

4.4.4.4. Na coluna “Analysis Method” selecione o método de análise

HID_Advanced_GEM-22plex.

5.5.5.5. Na coluna “Panel”, selecione o painel 22plex_GEM_v1 que está dentro da pasta

Megaplex_POP7_Panels_v1.

6.6.6.6. Na coluna “Size Standard”, selecione o padrão de tamanho GEMDYC-512.

7.7.7.7. Clique no botão “Analyze” .

ResultadosResultadosResultadosResultados Um painel representativo de uma reação GEM-22plex feita a partir de 1

disco de papel filtro de 1mm com sangue e o painel da escada alélica são

mostrados nas figuras 1 e 2.

16

Figura 1:Figura 1:Figura 1:Figura 1: Resultado da eletroforese de 1,0 uL de uma reação feita a partir de um disco de papel filtro de 1mm contendo sangue seguindo os

procedimentos descritos para o kit GEM-22plex.

17

Figura 2:Figura 2:Figura 2:Figura 2: Resultado da eletroforese de 1,0 uL da mistura de alelos fornecida com o kit GEM-22plex, seguindo os procedimentos descritos

anteriormente.

18


7777. . . . ContatoContatoContatoContato

Genomic Engenharia Molecular

Rua Itapeva, 500 Conjunto 5AB

São Paulo- SP

Responsável técnico: Dr. Martin Whittle

Contato:[email protected]

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