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Universidade De São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Departamento De Genética
“Avaliação de microRNAs associados às quinases ROCK em
Osteossarcoma e seu papel no processo de invasão celular”
Lara Elis Alberici Delsin
Ribeirão Preto – SP 2015
Universidade De São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Departamento De Genética
“Avaliação de microRNAs associados às quinases ROCK em
Osteossarcoma e seu papel no processo de invasão celular”
Lara Elis Alberici Delsin
Dissertação apresentada ao Departamento de Genética da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas - Genética.
Orientador: Profº. Dr. Luiz Gonzaga Tone
Ribeirão Preto – SP 2015
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo ou pesquisa, desde que citada a fonte.
Delsin, Lara Elis Alberici Avaliação de microRNAs associados às quinases ROCK em Osteossarcoma e seu papel no processo de invasão celular. Ribeirão Preto, 2015. 87f.
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/USP. Área de concentração: Genética Orientador: Tone, Luiz Gonzaga
1. Osteossarcoma. 2. ROCK. 3. miR-708-5p.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Lara Elis Alberici Delsin
“Avaliação de microRNAs associados às quinases ROCK em
Osteossarcoma e seu papel no processo de invasão celular”
Dissertação apresentada ao Departamento de Genética da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas - Genética.
Área de Concentração: Genética
Data da defesa:
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
Prof.Dr.________________________________________________________________
Instituição:__________________________Assinatura:__________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________________
Instituição:__________________________Assinatura:__________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________________
Instituição:__________________________Assinatura:__________________________
Apoio e Suporte Financeiro Este trabalho foi realizado com o apoio financeiro das seguintes entidades e instituições:
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (Processo n° 2014/07117-3 e processo nº 2014/03877-3);
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq;
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP;
Dedico este trabalho ao meu avô Delfino
Alberici, que me ensina a cada dia lições de
Superação, Força e Fé, e que Desistir simplesmente
não é uma opção.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por nunca desistir de mim nos momentos em que me faltou fé. A meu orientador Prof. Dr. Luiz Gonzaga Tone, que colaborou para meu crescimento profissional, dando toda a estrutura e apoio necessários para o desenvolvimento do trabalho. A Profª Drª María Sol Brassesco Annichini, que me acompanha desde meus primeiros passos no mundo científico, me conduzindo, auxiliando, apoiando e me ensinando lições não apenas científicas, mas que vou levar comigo pela vida toda. Obrigada! À Fundação de Apoio do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pela concessão da bolsa de Mestrado e apoio financeiro. Ao Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, especialmente a secretária Susie Adriana Penha Nalon, pela atenção e apoio prestados durante o mestrado. Ao Departamento de Puericultura e Pediatria da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, pelo apoio prestado aos Laboratórios de Citogenética, Biologia Molecular e Biologia Celular e Oncogenética, onde realizei meus experimentos. Aos Prof. Dr. Carlos Alberto Scridelli, Prof. Dr. Edgarg Engel, Prof. Dr. Rodrigo Tocantins Calado, Prof. Dr. Rodrigo Panepucci e ao Estatístico Davi Aragon por todo o apoio científico e discussões. Ao serviço de Ortopedia Oncológica HC-FMRP do Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor da FMRP-USP, por auxiliar na coleta das amostras tumorais aqui analisadas; Aos meus Pais, que sempre estiveram ao meu lado, obrigada por acreditarem em mim, me apoiarem e me incentivarem em todas as minhas decisões, ainda que seja o caminho mais difícil. Espero poder sempre orgulhar vocês, retribuindo tudo o que vocês fazem por mim. Gustavo Borges, pelo carinho, dedicação, paciência, apoio e amor. Por me ajudar desde a prova de seleção até o desenvolvimento desta dissertação. Por me escutar e me ajudar em todos os problemas que enfrentei, sejam eles científicos ou emocionais. Por me apoiar em todas as decisões e, mais que isso, me acompanhar. Obrigada! Aos meus amigos Gabriela Molinari Roberto, Lenisa Geron, Karina Bezerra Salomão, Marcela Oliveira da Silva, Gabriela Maciel Vieira, Rodrigo Hakime, Guilherme Vargas, por serem minha família dentro do laboratório. Ser amigo é interpretar olhares, entender silêncios, perdoar os erros, guardar segredos, secar lágrimas e claro, comemorar as vitórias. Obrigada por serem essas pessoas maravilhosas na minha vida.
A minha Família por ser minha segurança, minha motivação e minha inspiração. Amo cada um de vocês, perto ou longe. A todos os amigos do laboratório Augusto, Caio, Camilla, Carol, Daniel, Giovanna, Jaqueline, Julia, Kleiton, Gustavo, Mariana, Maurício, Mirella, Pâmela, Paola, Régia, Rosane, Vanessa e Veridiana, pela verdadeira amizade e por sempre me ajudarem e apoiarem quando precisei, contribuindo extremamente para o meu aprendizado e crescimento. Às técnicas do laboratório de Citogenética do Departamento de Puericultura e Pediatria Aide Barbosa, Sônia Scandussi, Lucimar Fernandes Laureano, Paola, Sara e às secretárias do Laboratório de Puericultura e Pediatria Evelice Visconte, assim como aos funcionários do departamento de Pediatria pelo apoio, conversas no almoço e convivência pelos corredores. A todos que de algum modo me apoiaram e contribuíram para que este trabalho fosse realizado.
“I am among those who think that science has great
beauty. A scientist in his laboratory is not only a
technician: he is also a child placed before natural
phenomena which impress him like a fairy tale.”
Marie Curie
RESUMO
“Avaliação de microRNAs associados às quinases ROCK em osteossarcoma e seu
papel no processo de invasão celular”
Osteossarcoma (OS) é uma neoplasia que acomete principalmente as metáfises de ossos
longos, sendo o tumor ósseo pediátrico mais comum. O tratamento consiste em ressecção cirúrgica,
tratamento quimioterápico multimodal neo-adjuvante e adjuvante. No entanto, apesar dos
tratamentos, cerca de 80% dos pacientes que apresentam metástase tem uma sobrevida curta.
Deste modo, torna-se necessário um melhor entendimento do processo metastático, assim como da
busca por novos alvos terapêuticos. Uma das principais vias relacionada à invasão e migração das
células neoplásicas é a das GTPases Rho, cujas principais moléculas efetoras são as quinases ROCK1 e
2, responsáveis por mediar a migração através do controle do citoesqueleto. Tais quinases têm sido
relatadas hiperexpressas em diversas neoplasias e associadas ao pior prognóstico. Recentemente,
pesquisas também têm apontado a desregulação de miRNAs na tumorigênese, sendo que a
hipoexpressão de alguns microRNAs estão relacionados à hiperexpressão das ROCKs e, portanto,
envolvidos no processo metastático. No presente trabalho, estudou-se a expressão tanto das ROCKs
quanto de miRNAs associados a elas em amostras tumorais de OS por meio de PCR em tempo real.
Encontramos uma hipoexpressão de ROCK1 nas amostras OS quando comparadas ao osso não
neoplásico controle, enquanto que ROCK2 não apresentou diferença. O miR-138 foi encontrado
hiperexpresso e obteve correlação com ROCK2, além de associação com a sobrevida. Os miR-139 e
miR-708 demonstraram-se hipoexpressos nas amostras tumorais. Já os miR-196b e miR-584 não
apresentaram diferenças. Após as análises de expressão, optou-se pelo estudo do miR-708 em
linhagens de OS, desta forma, sua expressão foi induzida em três linhagens celulares, através de um
vetor lentiviral, e foram realizados ensaios funcionais com o objetivo de estabelecer o papel deste
miRNA. Não foi observada diferença nas taxas de proliferação ou capacidade clonogênica quando a
expressão do miR-708 foi indizida. No ensaio de migração wound healing o miR-708 reduziu a
migração da linhagem SAOS-2, enquanto que no ensaio de invasão induziu a invasão da linhagem
MG-63 em matrigel, mas reduziu esse potencial nas linhagens HOS e SAOS-2 na matriz de gelatina.
Uma análise in silico dos alvos deste miRNA apontou sua associação às vias WNT, MAPK e de Junções
Aderentes. Desta forma, sugere-se que o miR-708 pode estar envolvido no controle processos que
levam ao desenvolvimento de metástase, principalmente na interação com a matriz extracelular.
Palavras-chave: Osteossarcoma, ROCK, miR-708-5p
ABSTRACT “Evaluation of the expression of microRNAs associated with ROCK kinases and their
role in the invasion process in osteosarcoma”
Osteosarcoma (OS) is a neoplasia that mainly occurs at the metaphyses of long bones, being
the most common pediatric bone tumor. The treatment is based on surgical resection and the
multimodal chemoterapy adjuvant and neoadjuvant. However, despite the treatment, around 80% of
patients who evolve to metastais present a poor survival. Therefore, understanding the metastatic
process is essencial, as well as the search for new therapy targets. The mainly pathway related to
invasion and migration in neoplasic cells is regulated by the Rho GTPases, and their main effectors
are the kinases ROCK1 and ROCK2, which are responsible for cytoskeleton control. The
hyperexpression of these kinases has been described in different cancers and it has been associated
to poor prognostic. In parallel, several studies have extensively demonstrated miRNA deregulation in
tumorigenesis, and the hipoexpression of some miRNA are related to ROCK upregulation,
consequently, involved with metastasis. Herein, we studied the expression profiles of ROCK1 and 2
and associated miRNAs in OS tumor samples by means of qRT-PCR. We found downregulation of
ROCK1 in OS samples when compared to normal bone (control), while ROCK2 did not show
differences. MiR-138 showed hiperexpression and was correlated with ROCK2, and an association
with survival rates. MiR-139 and miR-708 were found downregulated in tumor samples, though miR-
196b and miR-584 did not show differences in expression. Afterwards, miR-708 expression was
induced in three OS cell lines, aiming establish miR-708 role. Proliferation and clonogenic essays did
not present any effects when miR-708 was induced. In the wound healing essay, miR-708 reduced
the migration of SAOS-2 cells, and in invasion essay, miR-708 induced invasion of MG-63 cells in a
matrigel matrix, while reduced the invasive potential of HOS and SAOS-2 cell lines in a gelatin matrix.
An in silico analysis of miR-708 targets highlighted its association with WNT, MAPK and Adherent
Junction pathways. Therefore, we suggest that miR-708 can be involved in process that leads to
metastasis, mainly related to extracellular matrix interation.
Keywords: Osteosarcoma,ROCK, miR-708-5p.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: GTPases da família Rho e seus efetores....................................................................19 Figura 2: (A) Modelo de auto-inibição de ROCK onde o extremo C-terminal bloqueia a atividade quinase; (B) Modelo de liberação do sítio catalítico e ativação de ROCK após ligação de Rho-GTP..................................................................................................................21
Figura 3: Vetor de expressão da proteína de empacotamento lentiviral psPAX2...................31 Figura 4: Vetor de expressão da proteína de envelope lentiviral pCMV-VSV-G......................31
Figura 5: Vetor de expressão controle (pLV-miRNA-Expression).............................................32
Figura 6: Expressão relativa de ROCK1 e 2 em amostras de osso não neoplásico, amostras tumorais pré-QT e linhagens celulares de OS .........................................................................39
Figura 7: Expressão relativa de ROCK1 e 2 em amostras neoplásicas pré-quimioterapia (pré-QT) e pós-quimioterapia (pós-QT)...........................................................................................39 Figura 8: Expressão dos miR-138 (A), miR139 (B), miR-196b (C), miR-584 (D) e miR-708 (E) em amostras de osso não neoplásico comparados a amostras tumorais e linhagens celulares...................................................................................................................................40 Figura 9: Expressão dos miR-138 (A), miR139 (B), miR-196b (C), miR-584 (D) e miR-708 (E) em amostras pré-quimioterapia (pré-QT) comparadas a amostras pós-quimiterapia (pós-QT)...........................................................................................................................................41 Figura 10: Curvas de sobrevida global relativas a expressões dos genes ROCK1 (A), ROCK2 (B), miR-138 (C), miR-139 (D), miR-196b (E), miR-584 (F) e miR-708 (G)............................................................................................................................................43 Figura 11: Expressão Relativa do miR-708-5p nas linhagens HOS, MG-633 e SAOS-2 não transduzida (N.T.), transduzida com vetor vazio (V.V.) e com vetor de indução do miR-708...........................................................................................................................................47 Figura 12: Expressão relativa dos genes ROCK1 (A) e ROCK2 (B) nas linhagens HOS, MG-63 e SAOS-2 N.T., V.V. e miR-708....................................................................................................48 Figura 13: Taxa de proliferação das linhagens HOS, MG63 e SAOS-2 com hiperexpressão do miR-708-5p nos tempos de 24h a 144h...................................................................................49 Figura 14: Porcentagem de colônias apresentadas pelas linhagens HOS, MG-63 e SAOS-2 miR-708 em relação às linhagens vetor vazio (V.V.) correspondente.....................................50
Figura 15: Fotos e gráficos correspondentes ao ensaio de migração wound healing realizado nas linhagens HOS, MG-63 e SAOS-2 V.V. e miR708................................................................51 Figura 16: Gráfico e figuras da taxa de invasão relativa nas linhagens HOS (A), MG-63(B) e SAOS-2(C) transduzidas com vetor vazio (V.V.) ou miR-708. O traço representa p<0,05......................................................................................................................................53
Figura 17: Figura e gráfico representando o número de colônias relativo obtidas através de crescimento independente de ancoragem na linhagem SAOS-2 vetor vazio (V.V.) e miR-708...........................................................................................................................................54
LISTA DE TABELAS
Tabela I: Valores do índice de correlação de Spearman, nível de significância das correlações (valor p) e n amostral entre miR-138, miR-139, miR-196b, miR-584, miR-708-5p, ROCK1 e ROCK2......................................................................................................................................42
Tabela II: Análise das associações clínicas obtidas a partir da expressão dos genes ROCK1 e ROCK2, apresentando valores de média, mediana, mínima, máxima, tamanho amostral (n) e nível de significância (valor p) para cada grupo.......................................................................44 Tabela III: Análise das associações clínicas obtidas a partir da expressão dos miR-138, miR-139, miR-196b, miR-584 e miR-708, apresentando valores de média, mediana, mínima, máxima, tamanho amostral (n) e nível de significância (valor p) para cada grupo........................................................................................................................................45 Tabela IV: Fold change entre as linhagens transduzidas (V.V. e miR-708) de não transduzidas (N.T.), demonstrando a eficiência da transdução....................................................................47
Tabela V: Vias e processos biológicos nos quais o miR-708-5p pode estar envolvido.................................................................................................................................55
LISTA DE SIGLAS
CO2 Dióxido de carbono
DMEN Solução Nutritiva para o Cultivo Celular
DNA ácido desoxirribonucleico
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
FMRP Faculdade de Medicina de Riberião Preto
GTP Guanosina Trifosfato
HAM F-10 Solução Nutritiva para o Cultivo Celular
HC Hospital das Clínicas
HEK293T/17 Linhagem Celular competente para produção lentiviral
HOS Linhagem Celular de Osteossarcoma
INCA Instituto Nacional do Câncer
McCoy´s Solução Nutritiva para o Cultivo Celular
MEC Matriz Extracelular
MG-63 Linhagem Celular de Osteossarcoma
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
MRC-5 Linahgem Celular de Fibroblasto
N.T. Não Transduzido
OMS Organização Mundial de Saúde
OS Osteossarcona
PBS Tampão salina fosfato
PCR Reação em cadeia da polimerase
QT quimioterapia
RNA Ácido ribonucleico
ROCK1 Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 1
ROCK2 Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 2
RT-qPCR Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real
SAOS-2 Linhagem Celular de Osteossarcoma
SBF Soro Bovino Fetal
SPSS Statistical Package for the Social Sciences
USP Universidade de São Paulo
V.V. Vetor Vazio
LISTA DE SÍMBOLOS
°C Graus Celsius
cm3 Centímetros cúbicos
h horas
L Litro
mg Miligrama
min Minuto
mL Mililitro
mM Milimolar
nm Nanometro
rpm Rotações por minuto
µg Micrograma
µL Microlitro
µM Micromolar
µm Micrômetro
SUMÁRIO
1 Introdução......................................................................................................................................16
2 Objetivos.........................................................................................................................................25 2.1. Objetivos Específicos................................................................................................................26
3 Materiais e Métodos......................................................................................................................27
3.1 Linhagens Celulares e Condições de Cultura............................................................................28
3.2 Amostras de Pacientes (Casuística)..........................................................................................28
3.3 Extração de mRNA e Síntese de cDNA......................................................................................28
3.4 RT-qPCR....................................................................................................................................29
3.5 Transfecção e Transdução de linhagens celulares com microRNA de
interesse...................................................................................................................................29
3.5.1 Amplificação dos plasmídeos lentivirais, vetor de expressão e do miR-708-
5p.................................................................................................................................29
3.5.2 Purificação dos plasmídeos.........................................................................................30
3.5.3 Plasmídeos e produção lentiviral.................................................................................30
3.5.4 Infecção Lentiviral........................................................................................................32
3.5.5 Confirmação da Transdução........................................................................................32
3.5.6 Confirmação da autenticidade das linhagens celulares após processo de
transdução...................................................................................................................32
3.6 Ensaios Funcionais – Crescimento Celular................................................................................33
3.6.1 Proliferação Celular.....................................................................................................33
3.6.2 Ensaio Clonogênico......................................................................................................33
3.7 Ensaios Funcionais – Migração, Invasão e Ancoragem.............................................................34
3.7.1 Ensaio de migração por Wound Healing......................................................................34
3.7.2 Ensaio de Invasão em Matrigel e Gelatina..................................................................34
3.7.3 Ensaio de Crescimento Independente de Ancoragem.................................................34
3.8 Forma de Análise Estatística.....................................................................................................35
3.9 Análise in silico..........................................................................................................................35
4 Resultados......................................................................................................................................36
4.1 Resultados Clínicos e Patológicos.............................................................................................37
4.2 Dados de Expressão.................................................................................................................38
4.2.1 Expressão dos genes ROCK1 e ROCK2.........................................................................38
4.2.2 Expressão dos miRNAs miR-138, miR-139, miR-196b, miR-584 e miR-708-
5p.................................................................................................................................39
4.2.3 Correlação entre as expressões...................................................................................41
4.3 Associação com Diagnóstico e Evolução Clínica dos Pacientes................................................43
4.3.1 Associação com Sobrevida Global...............................................................................43
4.3.2 Associação dos dados de expressão e características clínicas e biológicas dos
pacientes.....................................................................................................................44
4.4 Transdução das linhagens de OS..............................................................................................46
4.4.1 Escolha do miRNA de interesse...................................................................................46
4.4.2 Confirmação da eficiência de transdução....................................................................46
4.4.3 Expressão das quinases ROCKs nas linhagens transduzidas........................................48
4.5 Ensaios Funcionais....................................................................................................................49
4.5.1 Ensaio de Proliferação.................................................................................................49
4.5.2 Ensaio Clonogênico......................................................................................................50
4.5.3 Ensaio de migração por Wound Healing......................................................................51
4.5.4 Ensaio de Invasão em Matrigel e Gelatina..................................................................52
4.5.5 Ensaio de Crescimento Independente de Ancoragem (Soft Agar)..............................54
4.6 Análise In Silico.........................................................................................................................55
5 Discussão........................................................................................................................................56
6 Conclusão........................................................................................................................................65
7 Referências Bibliográficas..............................................................................................................67
8 Apêndice.........................................................................................................................................81
9 Anexo..............................................................................................................................................86
Introdução
________________________ INTRODUÇÃO
17
O Osteossarcoma (OS) corresponde ao subgrupo de tumores ósseos malignos de maior
ocorrência na criança e no adolescente, segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), (Steliarova-
Foucher et al., 2005; Rivera-Valentin et al., 2015), e representa a oitava malignidade mais comum
da infância (Ottaviani & Jaffe, 2009). Pode acometer qualquer região do esqueleto, entretanto, os
ossos com maiores índices de incidência são o fêmur na região distal, a tíbia proximal e o úmero
proximal, respectivamente (Bielack et al., 2002). O OS se caracteriza por apresentar um crescimento
radial, apresentando grande volume tumoral com mais de cinco centímetros. Frequentemente
ultrapassa o córtex e associa-se a tecidos moles (Fletcher et al., 2002; Wittig et al., 2002).
Esta neoplasia se desenvolve principalmente no espaço intramedular das metáfises de ossos
longos, geralmente provocada pelo rápido crescimento de tais regiões durante o período da
puberdade. Durante o processo de transformação maligna, ocorre uma proliferação indiscriminada
de células mesenquimais malígnas, capazes de produzir uma substância osteóide neoplásica,
característica dessa doença (Federman et al., 2009; Gill et al., 2013). O principal sintoma do OS é dor
localizada na região tumoral (Federman et al., 2009).
Histologicamente, os OSs convencionais podem ser divididos em três subtipos principais
dependendo da ausência ou presença de matriz e da composição desta, sendo eles osteoblástico,
condroblástico e fibroblástico (Fletcher et al., 2002). Cerca de 85% dos casos ocorrem de novo e 70%
deles apresentam anormalidades cromossômicas (Fletcher et al., 2002), sendo divididos em OS com
cariótipos balanceados e não balanceados, contendo tanto alterações numéricas quanto estruturais
(Gorlick et al., 2003; Hayden & Hoang, 2006).
Ainda não foi identificada nenhuma anomalia genética distinta e específica como causa
primária dos OSs, mas estudos têm demonstrado que a desregulação de diversos genes, também
comuns a outras neoplasias, estão presentes em casos de OS. Têm-se indicado como alterações
principais àquelas relacionadas a dois processos basais: controle de crescimento e proliferação
celular, como alterações nas vias do Wingless (WNT) ou Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF),
e controle do ciclo celular e reparo do DNA, como alterações nas vias do TP53, Rb, superexpressão de
FOS e amplificação de CDK4 (Gorlick & Khanna, 2010). Recentemente, diversos trabalhos têm focado
em terapias que têm como alvo receptores tirosino-kinase, como IGF-1R, ERBB, PDGFR, críticos para
oncogênese de diferentes tipos tumorais; além de vias intracelulares de sinalização, tendo como
alvos ezrin, associada aos casos metastáticos da doença, além de vias como mTOR, Notch, Hedgehog
e Ras, cujo potencial terapêutico tem sido demonstrado em diferentes tipos tumorais (Rivera-
Valentin et al., 2015).
O procedimento terapêutico consiste na realização de quimioterapia neoadjuvante,
ressecção cirúrgica e quimioterapia adjuvante, isto é, os quimioterápicos são ministrados nos
________________________ INTRODUÇÃO
18
processos pré- e pós-operatórios (Bielack et al., 2002; Hayden & Hoang, 2006). O tratamento
neoadjuvante se iniciou na década de 1970 com o objetivo de prevenir a amputação dos membros
acometidos pelo OS, e assim pode-se também mensurar a resposta tumoral ao quimioterápico
através da análise do grau de necrose da neoplasia. Os primeiros e principais quimioterápicos
utilizados são metotrexato, doxorubicina e cisplatina. Mais recentemente introduziram-se também a
ifosfamida e o etoposide para os casos de maus respondedores, entretanto o uso destes
medicamentos ainda é questionável, uma vez que nem sempre é obtida uma melhora na sobrevida
destes pacientes (Bielack et al., 2002; Gill et al., 2013; Rivera-Valentin et al., 2015).
Apesar do tratamento multimodal, as terapias pouco evoluíram para o tratamento de
pacientes diagnosticados com OS nos últimos 30 anos (Isakoff et al., 2015). Além do que, as maiores
taxas de mortalidade ocorrem nos casos em que há eventos metastáticos, sendo que apenas cerca
de 20% dos pacientes com metástases apresentam uma sobrevida média de cinco anos (Gorlick &
Khanna, 2010; Brennecke et al., 2013). Cerca de 80% das metástases ocorrem nos pulmões, seguido
de 15% dos casos em ossos (Kempf-Bielack et al., 2005; Hayden & Hoang, 2006; Isakoff et al., 2015).
Um dado interessante levantado por Gorlick & Khanna (2010) foi que mesmo sem o uso de
quimioterápicos, quando o tratamento se baseava exclusivamente na ressecção cirúrgica e, portanto,
eram frequentes eventos de amputação, 85% dos casos apresentavam metástases, indicando a
presença inclusive de micrometástases durante o desenvolvimento tumoral. Sendo assim, visando
diminuir os índices de mortalidade neste tipo tumoral, ainda é necessária a busca por novos alvos
terapêuticos.
Neste contexto, estudos mais aprofundados sobre os aspectos moleculares que regem o
processo metastático se tornam primordiais, visto que esta é a principal causa da redução da
expectativa de vida dos pacientes com OS.
Sob uma perspectiva mais ampla podemos definir o processo metastático, como um
processo que envolve o desprendimento das células de seu tecido primário, invasão da matriz
extracelular, circulação pelo sistema vascular ou linfático e finalmente o estabelecimento e
colonização de um tecido secundário (Croft & Olson, 2008; Kumar, 2012). Em condições não
neoplásicas, existe uma homeostase entre as forças de adesão célula-célula e célula-matriz
extracelular. Entretanto, em condições tumorigênicas a matriz extracelular sofre alterações e este
equilíbrio é perdido, fazendo com que a célula neoplásica adquira capacidade de se desprender e
invadir a matriz (Lu et al., 2012). Tal processo pode se iniciar através da sinalização molecular ou
mecânica de receptores de membrana, como as integrinas, que respondem às mudanças na matriz
extracelular e ativam vias de sinalização intracelulares capazes de interagir com o citoesqueleto e
promover forças propulsoras do processo invasivo (Kumar, 2012).
________________________ INTRODUÇÃO
19
Dessa forma, a migração no meio intracelular, envolve a polarização na direção do
movimento, reorganização do citoesqueleto, remodelamento na adesão celular e alteração na
dinâmica da membrana celular (Amano et al., 2010). Dentre as vias intracelulares de sinalização
desse processo, está a família das GTPases Rho, que inclui as moléculas Rho, Rac e Cdc42. Estas
proteínas, quando ativadas por uma molécula de GTP, são capazes de ativar uma variedade de
substratos relacionados ao controle do citoesqueleto (Kumar, 2012; Sahai & Marshall, 2003) (Figura
1).
A GTPase Rho é necessária para a geração da força contrátil através da ativação das
proteínas ROCK (Rho-associated coiled-coil containing kinase), que induzem a formação de estruturas
contráteis associadas aos filamentos de actina (F-actina) do citoesqueleto. A proteína Rac se
relaciona à formação de lamelipódios, e a GTPase Cdc42 à formação de protrusões do tipo filopódios,
além de controlar a formação de estruturas ricas em actina responsáveis pela sensibilidade à
gradientes quimiostáticos (Kumar, 2012; Sahai & Marshall, 2003).
Existem dois principais mecanismos de invasão controlados pelas GTPases da família Rho. No
primeiro deles ocorre polimerização dos F-actina concedendo à célula uma morfologia alongada ou
mesenquimal, e através da liberação de proteases e do alongamento dos F-actina a célula torna-se
capaz de invadir a matriz extracelular. Já no segundo mecanismo de invasão a célula adota uma
morfologia arredondada e não necessita da liberação de proteases, pois se comprime através dos
poros da matriz utilizando movimentos ameboides gerados pela força contrátil dos filamentos de
actomiosina (Wolf et al., 2003; Sahai & Marshall et al., 2003). Sabe-se que esses processos são
Figura 1: GTPases da família Rho e seus efetores. Adaptado de Sadok & Marshall, 2014.
________________________ INTRODUÇÃO
20
mutuamente excludentes, ou seja, a ativação da via mesenquimal implica na inibição da via
ameboide, e a célula pode variar entre estes mecanismos invasivos conforme as condições
ambientais ou intrínsecas da célula (Kumar, 2012; Wyckoff et al., 2006). A invasão do tipo
mesenquimal é dependente da ativação da GTPase Rac, enquanto que o mecanismo tipo ameboide é
controlado pela GTPase Rho, especificamente RhoA e seus efetores, as quinases ROCK 1 e ROCK 2
(Croft & Olson, 2008; Sahai & Marshall, 2003).
ROCK 1 e 2 são proteínas codificadas por genes diferentes, entretanto possuem cerca de 64%
de homologia em seus aminoácidos, sendo que no domínio quinase este valor chega a 83%,
indicando a similaridade no substrato específico (Amano et al., 2010; Nakagawa et al, 1996). São
quinases do tipo serina-treonina compostas por um domínio catalítico N-terminal, um domínio
central na forma coiled-coil constituído de duas α-hélices enroladas, nas quais a proteína Rho pode
se ligar para ativação das mesmas, e um domínio C-terminal com homologia a plecstrina (PH)
interrompido por uma região rica em cisteína e contendo um domínio RB (Amano et al., 2010).
Ambas as quinases possuem capacidade de autoinativação. Nesta conformação os
segmentos N-terminais se posicionam de forma que permita aos domínios quinases das moléculas
ROCK formarem homodímeros, nos quais os domínios RB e PH C-terminais se ligam, inativando as
quinases (Yamagushi et al.,2006; Amano et al., 1999). A ativação das proteínas ROCK ocorre quando
há alteração desta conformação de autoinativação. Para isso, deve haver a ligação de uma Rho-GTP
no domínio RB da quinase ROCK induzindo a liberação dos homodímeros e ativando a molécula
(Morgan-Fisher et al., 2013; Amano et al., 1999) (Figura 2).
Após serem ativadas, as proteínas ROCK são capazes de modular a ação de diversos
substratos. Um deles é a MLC (myosin light chain – cadeia leve da miosina), que pode tanto ser
modulada diretamente quanto indiretamente pela fosforilação de MLCP; esta proteína é capaz de
promover a formação de fibras de estresse responsáveis por aumentar a contratilidade da célula
Figura 2: (A) Modelo de auto-inibição de ROCK onde o extremo C-terminal bloqueia a atividade quinase; (B) Modelo de liberação do sítio catalítico e ativação de ROCK após ligação de Rho-GTP (adaptado de Morgan-
Fisher et al., 2013)
________________________ INTRODUÇÃO
21
(Morgan-Fisher et al., 2013; Amano et al., 1996). As quinases ROCK também são capazes de fosforilar
as moléculas da família ECM (ezrin/radixin/moesin), responsáveis pelo ancoramento das fibras de
estresse às proteínas integrais da membrana plasmática (Morgan-Fisher et al.,2013; Matsui et
al.,1998). Outro substrato relevante das ROCKs são as LIMK (Lin11 Isl-1 & Mec-3 domain-kinases),
que após fosforiladas estabilizam o citoesqueleto de actina através da fosforilação da cofilina e do
fator de despolimerização da actina (Morgan-Ficher et al., 2013; Scott & Olson, 2007;). Amano e
colaboradores (2003) encontraram que ROCK modula não apenas moléculas relacionadas à actina,
mas também as proteínas TAU e MAP2 que são responsáveis por regular a polimerização dos
microtúbulos.
Apesar da grande homologia estrutural, existem diferenças funcionais entre ROCK 1 e 2. A
primeira quinase parece estar essencialmente relacionada à formação das fibras de estresse,
enquanto que ROCK2 se associa aos processos de fagocitose dependente de miosina-II e contração
celular. Além disso, ocorre uma diferença espacial na localização intracelular destas moléculas, pois
diferentemente de ROCK1, ROCK2 encontra-se principalmente na periferia celular (Yoneda et al.,
2005).
As quinases ROCK não estão envolvidas apenas no processo de migração. Na apoptose as
ROCKs podem ser ativadas por caspases, se relacionando neste processo à formação de protrusões
na membrana plasmática, desintegração nuclear e relocação dos fragmentos de DNA para os corpos
apoptóticos via regulação dos filamentos de actomiosina e fibras de estresse de actina (Street &
Bryan, 2011; Coleman et al., 2001). As ROCKs também têm papel importante durante a mitose,
controlando de modo direto ou indireto a dinâmica dos microtúbulos e a integridade do
centrossomo (Oku et al., 2014). Durante a citocinese controlam a formação do anel contrátil e do
sulco de clivagem (Matsumura, 2005; Kosako et al., 2000). Além disso, se destacam no controle do
ciclo celular durante a progressão para a fase S pela regulação de alvos como ciclinas A/D1/D3 ou
CDKs (Street & Bryan, 2011; Croft & Olson, 2006). Recentemente, tem sido descrita sua atuação
inclusive na regulação da expressão global de microRNAs (miRNAs), sendo que sua inibição está
relacionada a um aumento na função de deadenilação dos miRNAs (Stiller et al., 2013; Yoshikawa et
al., 2015).
Estando, portanto, envolvidas em vias essenciais para a homeostase celular, as quinases
ROCK se tornam influentes no desenvolvimento de diversas doenças, incluindo o câncer. A
hiperexpressão destas quinases foi descrita em condições neoplásicas (Sahai & Marshall, 2003),
sendo que as maiores taxas de expressão são relacionadas com o pior prognóstico e menor sobrevida
dos pacientes em diferentes tipos tumorais, e recentemente tem sido explorado o potencial
________________________ INTRODUÇÃO
22
terapêutico da sua inibição (Kamai et al., 2003; Lane et al., 2008; Liu et al., 2011; Wu et al., 2013;
Feng et al., 2015).
Experimentos de knockdown ou inibição por drogas específicas de ROCK1 e ROCK2
provocaram uma diminuição da proliferação celular em carcinoma hepatocelular (Takeba et al.,
2012) e câncer de pulmão (Yang et al., 2012), redução da viabilidade em linhagens de osteossarcoma
e sarcoma de Ewing (Liu et al., 2011) e alterações morfológicas nas células de glioblastoma (Mertsch
& Thanos, 2013). Adicionalmente, alterações na expressão e/ou ativação de ROCK estão sendo
principalmente relacionadas a processos invasivos e metastáticos, como em câncer de mama (Lane
et al., 2008), gástrico (Wu et al., 2013) ou pancreático (Fujimura et al., 2015).
Outras moléculas que têm se destacado na participação dos processos invasivos e
metastáticos das células tumorais são os microRNAs (miRNA), inclusive no controle das ROCKs De
fato, a desregulação destes têm sido relacionada ao processo de tumorigênese como um todo (Calin
et al., 2004; Calin et al., 2006) e é crescente seu destaque como biomarcadores em diferentes
neoplasias (Lan et al., 2015).
Os miRNAs são pequenos RNAs não codificantes de aproximadamente 18 a 24 nucleotídeos
originados a partir das regiões intrônicas de RNAs codificantes ou não (Bartel, 2004). São
considerados reguladores negativos pós-transcricionais, uma vez que direcionam o complexo
proteico RISC (RNA-induced silencing complex) aos RNA mensageiros (mRNA) através da ligação
completa ou parcial dos miRNAs a estes, fazendo com que os mRNA sejam, respectivamente,
clivados ou silenciados pelo RISC (Bartel, 2004). Recentemente, demonstrou-se que mesmo em casos
de complementaridade incompleta entre o miRNA e o mRNA há uma diminuição na concentração
deste último na célula, através de uma regulação pós-transcricional (Lim et al., 2005; Bagga et al.,
2005). Um dos processos indicados pelo qual o miRNA leva a degradação do mRNA alvo é sua
atuação na desestabilização através da deadelinação destes, uma vez que a retirada da cauda poli-A
levaria então a degradação do mRNA devido a exposição da extramidade 5´ desta molécula (Wu et
al., 2006).
Existem mais de dois mil miRNAs descritos no genoma humano e cada um deles pode ter
como alvo centenas de mRNA, sendo assim, os miRNAs se tornam essenciais na regulação de
inúmeros processos celulares, dentre eles diferenciação, proliferação, apoptose, entre outros (Kong
et al., 2012 ; Hwang & Mendell, 2006; Bartel, 2004). De forma interessante, Calin e colaboradores
(2004) demonstraram que os genes de miRNAs encontram-se frequentemente localizados em sítios
frágeis do cromossomo e em regiões genômicas associadas ao câncer, destacando a associação dos
miRNAs e o desenvolvimento e progressão tumoral.
________________________ INTRODUÇÃO
23
Em casos de neoplasias os miRNAs podem atuar tanto como oncogenes quanto no papel de
supressores tumorais. No primeiro caso, também chamados “oncomirs”, determinados miRNAs se
encontram hiperexpressos e tem como alvos genes supressores tumorais. Quando hipoexpressos, os
miRNAs são considerados supressores tumorais, controlando negativamente oncogenes. Em ambos
os casos os miRNAs também podem estar agindo como reguladores pós-transcricionais de genes
relacionados à diferenciação celular e apoptose (Manikandan et al., 2008; Zhang et al., 2007). Além
disso, o perfil de expressão dos miRNAs tem sido usado em diferentes malignidades para auxiliar na
classificação tumoral, além de servirem como fator prognóstico (Lu et al., 2005; Hernando, 2007;
Schooneveld et al. , 2012).
Em 2009, Hurst e colaboradores estabeleceram o termo metastamiR, agrupando os miRNAs
associados a regulação de genes envolvidos nas múltiplas vias do processo metastático, tanto
miRNAs pró- como antimetastáticos. Grande atenção tem sido depositada especificamente nos
processos de invasão e migração celular. Diversos artigos têm demonstrado que a hipoexpressão de
determinados miRNAs está associada a estes processos específicos em diferentes neoplasias, como
câncer de cólon (Li et al., 2013), carcinoma hepatocelular (Zheng et al., 2012; Wong et al. ,2011,
Wang et al., 2015), glioma (An et al., 2013), câncer de próstata (Lin et al., 2008; Kroiss et al., 2014),
entre outros (Yamasaki et al., 2012; Ueno et al., 2011; Song et al., 2013; Lopez-Camarillo et al., 2012).
Diferentes miRNAs têm sido descritos como associados ao desenvolvimento e progressão do
OS, destacando o papel desta classe de moléculas nesta neoplasia (Zhang et al., 2015). Mais
especificamente, muitos miRNAs estão sendo relacionados aos processos de invasão e migração em
OS, apresentando diferentes genes envolvidos no processo metastático como alvos, como por
exemplo, os miR-646 (Sun et al., 2014), miR-33b (Xu et al., 2014), miR-195 (Han et al., 2015), miR-140
(Gu et al., 2015), miR-34a (Liu et al., 2013; Yan et al., 2012).
Uma das vias citadas nos artigos acima pela qual os miRNAs atuam para garantir a diminuição
dos processos metastáticos e invasivos é a Rho/ROCK quinase, isto é, os miRNAs são responsáveis
por inibir a expressão das proteínas Rho e suas quinases ROCK, impedindo que ocorra migração das
células neoplásicas. Sendo assim, conclui-se que a hipoexpressão de tais miRNAs leva à uma
expressão desregulada de Rho e ROCK quinases, potencializando os processos de invasão e
aumentando a ocorrência de metástases.
Já foram descritos alguns miRNAs em OS envolvidos na regulação da via Rho/ROCK, como os
miR-144, miR-145, miR-335 e miR-340. Estes miRNAs foram descritos como supressores tumorais, e
que seu reestabelecimento na célula leva a menores taxas de proliferação, migração e invasão (Lei et
al., 2014.; Wang et al., 2015; Zhou et al., 2013; Wang et al., 2013). A principal quinase descrita como
________________________ INTRODUÇÃO
24
alvo destes miRNAs é ROCK1, sendo que seu perfil de expressão juntamente com o do miR-340 foi
associado ao pior prognostico de pacientes com OS (Cai et al., 2014).
Neste contexto, com o objetivo de selecionar alguns miRNAs que tenham as quinases ROCK
como alvos, nosso grupo realizou uma predição através da ferramenta miRWalk (Dweep et al., 2011),
na qual foram utilizadas oito bases de dados para análise, e foram selecionados miRNAs que estavam
presentes em ao menos três bases de dados. Dessa forma, foram escolhidos os miR-196b-5p e miR-
708-5p, como preditos para ROCK1 e ROCK2, respectivamente, visto que ambos já foram associados
aos processos invasivos e migratórios em outras neoplasias (Li et al., 2015; Jang et al., 2012; Saini et
al., 2011; Ryu et al., 2013; Li et al., 2010, Lu et al., 2014). E como miRNAs já validados para ROCK1
foram selecionados os miR-138 e miR-139, e para ROCK2 o miR-584. Esses miRNAs já foram descritos
em diferentes tipos tumorais (Jiang et al., 2010; Ueno et al., 2011; Wong et al., 2011; Shen et al.,
2014), mas ainda não verificados em OS.
Através da análise destes miRNAs associados às quinases ROCK em OS poderemos ampliar
nosso conhecimento sobres as vias responsáveis pela migração, invasão e metástase das células
neoplásicas e assim identificar novas abordagens sobre estes processos com o intuito de minimizá-
los, e assim possibilitar a diminuição dos índices de mórbido-mortalidade causados principalmente
pelos casos de OS com metástase.
Objetivos
________________________ OBJETIVOS
26
O objetivo principal do trabalho aqui apresentado foi estudar os processos de invasão e
migração celular de Osteossarcoma, através do papel das quinases ROCK1 e ROCK2 e dos miRNAs
associados.
2.1. Objetivos específicos:
Analisar o perfil de expressão gênica utilizando a técnica de RT-qPCR de ROCK1 e 2 em
amostras tumorais e linhagens celulares de OS;
Analisar o perfil de expressão dos miRNAs preditos e validados (miR-708, miR-196b, miR-138,
miR-139, miR-584) por RT-qPCR em amostras tumorais e linhagens celulares de OS;
Analisar a associação entre os níveis de expressão encontrados nas amostras tumorais ao
diagnóstico e evolução clínica dos pacientes;
Verificar os efeitos da modulação do miRNA de maior interesse em linhagens de OS em
relação a proliferação celular e capacidade clonogênica;
Realizar ensaios funcionais com as células transfectadas com o miRNA de interesse
relacionados aos processos invasivos e migratórios (wound healing, invasão em matrigel e
em gelatina, crescimento independente de ancoragem).
Materiais e
Métodos
_______________________ MATERIAIS E MÉTODOS
28
3.1 Linhagens Celulares e Condições de Cultura
Para o presente estudo foram utilizadas as linhagens celulares de osteossarcoma HOS, MG-
63 (gentilmente cedidas por Jeremy Squire – University of Toronto – Canada) e SAOS-2 (gentilmente
cedida pelo Prof. Dr. Keith Oswaldo Okamoto, do IB-USP). Além das linhagens de OS, foi utilizada a
linhagem de fibroblasto MRC-5 como amostra calibradora para as reações de RT-qPCR e a linhagem
HEK293T/17 para produção lentiviral.
Todas as linhagens foram cultivadas em garrafas de 75cm2, incubadas em atmosfera úmida
contendo 5% de CO2 e temperatura de 37°C. Foi utilizado meio de cultivo apropriado a cada
linhagem (HAM F10 ou McCoy´s) complementados com 60mg/L de penicilina, 100mg/mL de
estreptomicina e 10% a 15% de soro bovino fetal (pH de 7,2-7,4).
As células em cultura, quando confluentes, foram desprendidas através do uso de 0,05 %
da enzima tripsina (Gibco BRL, Life Technologies, Carlsbad, California, USA), e expandidas para novas
garrafas ou congeladas com SBF e 10%DMSO a -80ºC. Os experimentos foram realizados com células
com menos de 10 passagens a partir de seu descongelamento.
3.2 Amostras de Pacientes (Casuística)
As amostras de OS (n=35) e amostras de osso não neoplásico (n=8) foram coletadas durante
o procedimento cirúrgico pelo serviço de Ortopedia Oncológica HC-FMRP do Departamento de
Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor da FMRP-USP. Imediatamente após a
cirurgia, as amostras de tumor foram congeladas a -80°C e estocadas no Banco de Tumores do
Laboratório de Oncologia Pediátrica do Hospital das Clínicas (aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa Proc. 9373/2003) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
(FMRP-USP). O presente trabalho foi aprovado pelo comitê de ética da Faculdade de Filosofia
Ciências e Letras de Riberão Preto, USP, processo nº 43619215.9.0000.5407.
3.3 Extração de mRNA e Síntese de cDNA
O mRNA foi extraído das culturas celulares e das amostras tumorais por meio do Trizol
Reagent (Invitrogen Inc, Carsdab, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA foi
quantificado e armazenado em freezer – 80°C até a sua utilização. Foi sintetizado o cDNA a partir do
mRNA extraído através da utilização de sondas RT específicas para os miRNAs de interesse por meio
do kit High capacity (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).
_______________________ MATERIAIS E MÉTODOS
29
3.4 RT-qPCR
A RT-qPCR (PCR quantitativa tempo real) foi realizada utilizando aparelho ABI Prism 7500
Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os primers e as sondas TaqMan®
foram adquiridas pelo sistema by-demand da Applied Biosystems. O volume final para cada PCR foi
de 10μL, sendo utilizados 5,0 μL do Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, part
number 4304437), 0,5 μL de sonda e 4,5 μL de cDNA (diluído 1/20).
O controle endógeno utilizado na análise da expressão de ROCK1 e ROCK2 foi o gene GUSB
(glucuronidase beta) (4326320E), enquanto que o RNU6B (001093) e RNU48 (001006) foram
utilizados como controles endógenos na expressão de microRNAs. A amostra calibradora foi
proveniente da linhagem de fibroblasto MRC-5. A quantificação relativa da expressão gênica foi
determinada utilizando o método 2-ΔΔCT (Livak & Schmittgen, 2001).
Foi mensurada a expressão dos genes ROCK1 (Hs01127699-m1) e ROCK2 (Hs00178154-m1),
assim como dos miR-138-5p (002284), miR-139-5p (002289), miR-196b-5p (002215), miR-584-5p
(001624) e miR-708-5p (002341).
3.5 Transfecção e Transdução de linhagens celulares com microRNA de interesse
3.5.1 Amplificação dos plasmídeos lentivirais, vetor de expressão e do miR-708-5p
Foram adicionados 1μL do plasmídeo pCMV-VSV-G (Addgene, Cambridge, MA, #Cat. 8454) ou
1μL do plasmídeo psPAX2 (Addgene, Cambridge MA, #Cat. 12260) em 50μL de células competentes
Subcloning Efficiency™ DH5-alfa™ Competent Cells (Invitrogen Inc, Carlsbad, California, #Cat. 18265-
017) e mantidas em gelo por 30 minutos. Em seguida as células foram submetidas a um choque
térmico a 42°C por 1 minuto e novamente transferidas para o gelo por mais 3 minutos. Foi
adicionado 250uL de meio S.O.C. (Invitrogen Inc, Carlsbad, California, #Cat. 15544-034) e a solução
foi incubada por 1 hora a 37°C . Então, 20uL de cada solução foi plaqueada por espalhamento em
placas de petri com LB-Ágar com ampicilina e incubadas por aproximadamente 18 horas a 37°C,
obtendo-se colônias isoladas. Para os plasmídeos pLV-miR-708-Expression ou seu controle pLV-miR-
Expression foram utilizadas as bactérias competentes empregando-se a técnica de semeadura por
esgotamento nas mesmas condições descritas acima. Após o tempo de incubação as placas foram
colocadas na geladeira para a diminuição do crescimento das colônias. Colônias isoladas foram
selecionadas para crescimento em 5 mL de meio LB líquido com ampicilina e incubadas por
aproximadamente 18 horas. A solução total foi transferida para um tubo Falcon de 15mL e
centrifugadas a 2000 rpm, 4°C por 20 minutos. O sobrenadante foi descartado e as bactérias
transformadas foram congeladas a -20C até a extração do plasmídeo.
_______________________ MATERIAIS E MÉTODOS
30
3.5.2 Purificação dos Plasmídeos
Os plasmídeos foram purificados através de soluções de ressuspensão, lise, neutralizante,
preparadora da coluna, além da coluna e solução de aluição, utilizando o protocolo QIAprep Spin
Miniprep Kit (Qiagen Company, Hilden, Alemanha, #Cat. 27104), segundo especificações do
fabricante. A partir deste procedimento, e solução eluída foi estocada a -20oC. O rendimento e a
pureza dos plasmídeos foram avaliados através do NanoDrop Spectrophotometer (Thermo Scientific,
DE, EUA).
3.5.3 Plasmídeos e Produção Lentiviral
Resumidamente, 1μg pCMV-VSV-G (Addgene, Cambridge MA) e 1μg psPAX2 (Addgene,
Cambridge MA) foram combinados com 1,5μg de vetor de expressão lentiviral pLV-miR-708-5p-
Expression ou seu controle pLV-miR-Expression. A mistura foi feita em um tubo contendo 500uL de
meio de cultivo sem soro e 6 μL de TurboFect Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific Inc.,
Waltham, MA, EUA, #Cat. R0531). A solução foi incubada a temperatura ambiente por 20 min, sendo
agitada por inversão algumas vezes. O volume então foi adicionado sobre cultura de HEK293T/17
com 50% confluência em placa de 6 poços, para o empacotamento viral, contendo 3 mL de meio
DMEM com 10% SBF e sem antibiótico. Na manhã do dia seguinte, o meio de cultura foi substituído
por novos 3mL de DMEM com 10% SBF com antibióticos previamente definidos nas condições de
cultura. O sobrenadante contendo partículas virais foi coletado 72 horas após transfecção. O
conteúdo foi filtrado com poro de 0,45μm e criopreservado a -80°C até momento da infecção.
A sequência utilizada para expressão do miR-708-5p (pLV-[hsa-miR-708-5p] expression
plasmid) foi:
AACUGCCCUCAAGGAGCUUACAAUCUAGCUGGGGGUAAAUGACUUGCACAUGAACACAACUAGA
CUGUGAGCUUCUAGAGGGCAGGGA
O desenho dos plasmídeos utilizados estão representados nas figuras 1, 2 e 3 abaixo.
_______________________ MATERIAIS E MÉTODOS
31
Figura 3: Vetor de expressão da proteína de empacotamento lentiviral psPAX2. Addgene,
Cambridge MA, #Cat.12260
Figura 4: Vetor de expressão da proteína de envelope lentiviral pCMV-VSV-G. Addgene, Cambridge, MA, #Cat. 8454
_______________________ MATERIAIS E MÉTODOS
32
Figura 5: Vetor de expressão controle (pLV-miRNA-Expression) e a sequência do Mirna-708-5p (pVL-[hsa-mir-708] plasmid). BioSettia, San Diego California, EUA, #Cat. mir-p495 e mir-expression-ctrl.
3.5.4 Infecção lentiviral
Células das linhagens HOS, MG-63 e SAOS-2 foram plaqueadas (variando entre 4x105 a 8x105
células dependendo da linhagem) em placas de seis poços contendo 2mL de meio de cultivo e após
período de aderência, foram expostas a 0,5mL de suspensão viral e centrifugadas por 30min a
2200rpm, sendo posteriormente incubadas à 37°C com 5% de CO2 em estufa umidificada por 24
horas. Decorrido o tempo, o sobrenadante foi apropriadamente descartado e foi adicionado 3mL de
meio suplementado. Após 48/96 horas este procedimento foi repetido. Ao atingir a confluência as
células foram transferidas para garrafas de 25cm3 e posteriormente, de 75cm3. Após
aproximadamente um mês de cultivo de expansão foi realizada a seleção positiva por puromicina
(1ug/uL).
3.5.5 Confirmação da transdução
A confirmação da transdução pelo miR-708-5p foi realizada por RT-qPCR, sob as mesmas
condições técnicas da RT-qPCR realizada para as amostras tumorais. Para isso, foi extraído RNA
(Trizol Reagent - Invitrogen Inc, Carsdab, CA) das linhagens transduzidas em três tempos diferentes,
garantindo uma triplicata biológica. Foi sintetizado cDNA (kit High capacity- Applied Biosystems,
Foster City, CA, EUA). Os endógenos utilizados foram RNU6B e RNU48 e como amostra calibradora
utilizou-se a linhagem de fibroblasto MRC-5.
_______________________ MATERIAIS E MÉTODOS
33
3.5.6. Confirmação da autenticidade das linhagens celulares após processo de transdução
A confirmação da autenticidade das linhagens após transdução foi realizada através da
análise de marcadores STR (Short Tandem Repeats) característicos de cada linhagem celular. Estas
análises foram gentilmente reaizadas pelo Laboratório de Investigação de Paternidade do
Departamento de Genética da FMRP-USP, sob a responsabilidade do Prof Dr Aguinaldo Simões.
Foram utilizados oito marcadores para cada linhagem e os resultados obtidos foram comparados
com os marcadores disponibilizados na base de dados online da ATCC. Todas as linhagens foram
confirmadas, obtendo 100% de correspondência. Estes dados podem ser encontrados no anexo A.
3.6 Ensaios Funcionais – Crescimento Celular
3.6.1 Proliferação Celular
Neste ensaio, as células transfectadas miR-708 e V.V. foram semeadas em concentração
inicial de 2x103cel/poço em placas de 96 poços e mantidas em condições de cultura. As análises da
proliferação foram realizadas nos tempos de 24, 48 e 72, 96, 120 e 144 horas. A cada intervalo de
tempo, foi realizada a remoção do meio de cultura dos poços e foram adicionados 100μL de meio de
cultura com 5μL/poço de Resazurina (Sigma, ST. Louis, MO, USA) (0,25 mg/mL em PBS esterilizado) e
as placas incubadas por mais 4h em estufa. A leitura da absorbância de 570nm foi realizada
utilizando o aparelho iMark Microplate Absorbance reader (BioRad Laboratories, Inc, CA, EUA). Após
a leitura, as células foram fixadas com metanol 100% e coradas com Giensa (1%), foi realizada nova
leitura a 655nm para confirmação dos resultados. Os experimentos foram repetidos três vezes, em
triplicata e os resultados expressos como média ± desvio padrão.
3.6.2 Ensaio Clonogênico
Para este ensaio, foram semeadas 300 (para a linhagem SAOS-2) ou 500 (para as linhagens
HOS e MG-63) células hiperexpressando miR-708-5p ou vetor vazio por poço em placas de seis poços.
As células foram incubadas em estufa por sete dias a nove dias, tempo suficiente para a formação de
colônias.
Para visualização das colônias o meio de cultura foi descartado e as células foram fixadas
com metanol absoluto e coradas com Giemsa (1%). A contagem foi realizada com auxílio de
estereomicroscópio (40x) e foram consideradas apenas colônias com número de células maior ou
igual a 50. Os experimentos foram repetidos três vezes, em triplicata e os resultados expressos como
média ± desvio padrão.
_______________________ MATERIAIS E MÉTODOS
34
3.7. Ensaios Funcionais – Migração, Invasão, Ancoragem
3.7.1 Ensaio de migração por wound healing
Os ensaios de migração in vitro foram realizados de acordo com Liang et al. (2007) com
pequenas alterações. As células transfectadas e controle foram mantidas em condições de cultivo até
confluência de 100% em placa de 12 poços e então foi realizado um risco central em cada poço
através da retirada mecânica das células nesta região com o auxílio de uma ponteira de 200μl. Assim
que realizado este procedimento, isto é, no tempo zero, o risco central foi fotografado. Após 16h ou
24h a partir do processo de lesão mecânica (de modo linhagem-dependente), as células foram
fotografadas e o software Motic Images Plus v2.0 (Motic China Group Co., Ltd) foi utilizado para
calcular a área livre de células. A taxa de migração foi calculada então como a distância em
nanômetros migrada ao longo do tempo. Os experimentos foram repetidos três vezes, em triplicata e
os resultados expressos como média ± desvio padrão.
3.7.2 Ensaio de Invasão em Matrigel ou Gelatina
Para o ensaio de invasão em matrigel ou gelatina, foi adicionado 100uL de matriz de matrigel
do kit BD BiocoatTM MatrigelTM Matrix–24 well plate (Becton, Dickinson and Company, NJ, EUA) ou
gelatina (Teleostean Gelatin – Sigma Aldrich), nas concentrações de, respectivamente, 3% e 0,2%,
sob os insertos correspondentes a placa de 24 poços. Posteriormente, as células transduzidas foram
plaqueadas em uma concentração de 3X105 a 5X105 células por insertos no topo da matriz de
matrigel em meio apropriado para cada linhagem sem SBF. Na parte inferior do inserto foi
adicionado meio de cultivo com 10% de SBF, servindo como quimioatrativo. Após a incubação a 37°C
por 24 horas, as células que não transpassaram a camada de matrigel ou gelatina foram removidas
da parte superior do inserto com o uso de um swab. As células que invadiram foram fixadas com
metanol absoluto por 15 min e coradas com uma solução de Giemsa (1%). As membranas do inserto
foram então removidas, montadas em laminas de vidro com Entellan (Merk®) e fotografadas ao
microscópio de luz clara (magnificência de 40x) sendo contadas com o auxilio do software Image-J,
versão 1.48 (Abramoff et al., 2004) Os experimentos foram repetidos três vezes, em triplicata e os
resultados expressos como média ± desvio padrão.
3.7.3 Ensaio de Crescimento Independente de Ancoragem
A partir das linhagens celulares modificadas, foram plaqueadas de 5X102 a 2X103 células em
placas de 6 poços, em 1,5 mL de uma mistura (1:1) de meio de cultivo 2X e de agarose 0,6%,
adicionado sobre 1,5mL de uma mistura (1:1) de meio 2X e agarose 1,2% (meio solidificado). Foram
_______________________ MATERIAIS E MÉTODOS
35
adicionadas, duas vezes por semana, 100ul de meio de cultura 1X para evitar o ressecamento da
agarose. Vinte dias após o plaqueamento das linhagens de interesse, o número de colônias (mais de
50 células) foram contadas para determinar a eficiência de formação de colônias. Protocolo
adaptado de Borowicz et al. (2014).
3.8 Forma de Análise Estatística
Para análise estatística dos dados de expressão gênica e da relação destas expressões
encontradas com os dados clínicos dos pacientes foi utilizado o programa estatístico SPSS 15.0 (SPSS
Inc. Chicago, USA), realizando-se o teste não paramétrico de Mann Whitney. Para analisar a
associação com sobrevida foi usado o teste de Kaplan Meier. Para análise dos ensaios funcionais
foram utilizados os testes T-Student ou one-way ANOVA, utilizando como pós-teste Holm-Sidack.
Sempre se considerando um valor significativo de p<0,05. Todos os ensaios funcionais foram
realizados em triplicata, com três experimentos independentes e os gráficos apresentados
representam a média e desvio padrão, considerando-se um desvio máximo entre as replicatas de 0,3.
Os gráficos de expressão estão no formato box-plot padrão representam a mediana, interquartis e
valores máximos e mínimos.
3.9 Análise in silico
Foi realizada uma análise através do software miRWalk v2.0, utilizando as bases de dados
DIANAmT, miRanda, miRDB, miRWalk, RNAhybrid, PICTAR4, PICTAR5, PITA, RNA22 e TargetScan,
visando detectar os alvos preditos para o miR-708-5p, considerando-se a região 3´UTR e um p-valor
de 0,05. Foram também verificados os genes já validados como alvos deste microRNA nesta
plataforma. Foram então selecionados os genes preditos em no mínimo 5 bases de dados, e a esta
lista foram acrescentados os genes validados. No total foram selecionados 1917genes alvos do miR-
708 pelo software miRWalk.
Esta lista foi então submetida a uma análise para inspecionar quais vias estes genes estão
inseridos. Para isso, foi utilizada a ferramenta de bioinformática DAVID – v6.7 (Database
for Annotation, Visualization and Integrated Discovery), que utiliza a base de dados KEGG-Pathways
para a análise. Obtendo-se, deste modo, as principais vias que o miR-708 pode estar envolvido.
.
Resultados
_______________________________ RESULTADOS
37
4.1. Resultados Clínicos e Patológicos
Foi analisada a expressão dos genes e microRNAs de interesse em 35 amostras tumorais. As
amostras analisadas compreendem biópsias de tumores pré-quimioterapia (pré-QT) (n=15), de
metástases (n=1), recidivas (n=2) e também biópsias pós-quimioterapia neoadjuvante (pós-QT)
(n=17). Para análise de expressão, todas as amostras foram consideradas. Para análise de associação
com os dados clínicos dos pacientes apenas amostras de tumores pré-quimioterapia (pré-QT) foram
utilizadas.
Dentre as amostras de tumores pré-QT (n=15), nove amostras são provenientes de pacientes
do sexo feminino (60%), enquanto que seis amostras são provenientes de pacientes do sexo
masculino (40%). As amostras também foram divididas em pacientes pediátricos e adultos. A idade
de corte escolhida foi igual ou menor de 21 anos para os casos pediátricos, uma vez que este tipo
tumoral se estabelece principalmente na fase infanto-juvenil, e pacientes maiores que 21 anos foram
considerados como casos adultos. Assim, o número de amostras pediátricas é de 13 (86,7%),
enquanto foram coletadas duas amostras de casos considerados adultos (13,3%).
As amostras de tumores pós-QT (n=17) compreendem sete amostras femininas (41,1%) e 10
amostras masculinas (58,9%), sendo 14 amostras pediátricas (82,4%) e três amostras de pacientes
adultos (17,6%). Apenas dois casos são pareados, ou seja, apenas de dois pacientes haviam sido
coletadas tanto amostras pré-QT, quanto amostras pós-QT.
A amostra coletada de metástase é proveniente de um paciente pediátrico e do sexo
masculino, sendo uma metástase pulmonar. Ambas as amostras de recidiva são de pacientes
femininos, porém uma pediátrica e outra adulta.
As características clínicas dos pacientes que foram consideradas relevantes para o
desenvolvimento e progressão da doença foram:
Grau de malignidade tumoral, sendo graus 1 e 2 considerados tumores de baixo grau,
enquanto que 3 e 4 são características de tumores com alto grau de malignidade;
Metástase, na qual foi analisada presença ou ausência da mesma ao diagnóstico;
Amputação, considerando se foi ou não realizado este procedimento, uma vez que a
necessidade de amputação está relacionada à malignidade da doença;
Recidiva, sendo considerados casos de ausência ou presença da mesma;
Óbito, considerando-se os casos de pacientes que vieram a falecer devido à neoplasia;
Um resumo dos dados clínicos dos pacientes está apresentado no apêndice A.
Foram ainda incluidas oito amostras de osso normal. Os pacientes apresentavam as idades de 7, 10,
15, 17, 18, 27, 32 e 42 anos, sendo apenas uma do gênero feminino. Entretanto, as amostras de
_______________________________ RESULTADOS
38
pacientes com 32 e 42 anos foram excluídas de todas as análises, uma vez que tais idades, ou
próximas de, não apresentavam correspondente no grupo de amostras neoplásicas
4.2. Dados de Expressão
4.2.1. Expressão dos genes ROCK1 e ROCK2
Os dados gerais de expressão (n amostral, média, desvio-padrão, mínima, máxima, percentis)
dos grupos analisados (osso não neoplásico, pré-QT, pós-QT e linhagens celulares) para essas
quinases se encontram no apêndice B.
A expressão dos genes ROCK1 e ROCK2 encontradas nas amostras tumorais pré-QT foi
comparada àquela encontrada nas amostras de osso não neoplásico, também comparada às
linhagens celulares de OS (HOS, MG-63, SAOS-2) (Figura 6). Foi encontrada uma hipoexpressão
significativa de ROCK1 nas amostras tumorais analisadas em relação às amostras controle de osso
(p=0,01), entretanto, essa hipoexpressão não foi verificada nas linhagens celulares. Não foi
encontrada alteração de expressão de ROCK2 nas amostras e linhagens tumorais quando
comparadas aos ossos não neoplásicos.
Outro tipo de análise realizada foi a comparação entre as expressões das ROCKs entre o
grupo de amostras pré-QT ao grupo pós-QT (Figura 7). O grupo pré-QT e pós-QT demonstrou grande
semelhança de expressão de ambas as quinases, não apresentando diferença significativa.
Entretanto, devemos considerar que os grupos não eram amostras pareadas, o que pode influenciar
nos resultados encontrados.
Não foi realizada comparação entre grupos envolvendo as amostras de metástase ou recidiva
devido ao pequeno n amostral coletado.
_______________________________ RESULTADOS
39
Figura 6: (A) Expressão Relativa de ROCK1 em amostras de osso não neoplásico, amostras tumorais coletadas antes do tratamento quimioterápico (pré-QT) e três linhagens celulares de OS (HOS, MG-63, SAOS-2)
(B)Expressão Relativa de ROCK2 em amostras de osso não neoplásico, amostras tumorais coletadas antes do tratamento quimioterápico (pré-QT) e três linhagens celulares de OS (HOS, MG-63, SAOS-2) O traço representa
diferença significativa entre os grupos analisados (p<0,05).
Figura 7: (A) Expressão Relativa de ROCK1 em amostras neoplásicas pré-quimioterapia (pré-QT) e pós-quimioterapia (pós-QT). (B) Expressão Relativa de ROCK2 em amostras neoplásicas pré-quimioterapia (pré-QT) e pós-quimioterapia (pós-QT). Foram excluídos os dois casos pareados de pré-QT e pós-QT, para que a análise
estatística não fosse influenciada pela presença de amostras dependentes.
4.2.2. Expressão dos microRNAs miR-138, miR-139, miR-196b, miR-584 e miR-708-5p
Os dados gerais de expressão (n amostral, média, desvio-padrão, mínima, máxima, percentis)
dos grupos analisados (osso não neoplásico, pré-QT, pós-QT e linhagens celulares) para os
microRNAs estudados se encontram no apêndice B.
As análises de expressão para todos os microRNAs estudados foram realizadas em
comparação entre os mesmos grupos analisados para os genes ROCK1 e ROCK2.
Ao comparar as amostras pré-QT e linhagens celulares com o grupo de osso não neoplásico
controle pudemos verificar que há uma hiperexpressão do miR-138 nas amostras neoplásicas, mas
não nas linhagens celulares devido a grande variação na expressão entre as linhagens. Também
encontramos uma hipoexpressão dos miR-139 e miR-708 tanto nas amostras tumorais quanto nas
_______________________________ RESULTADOS
40
linhagens celulares. Não foi encontrada diferença significativa entre os grupos na expressão dos miR-
196b e miR-584 (Figura 8).
Entretanto, nenhuma diferença estatisticamente relevante foi observada na comparação
entre os grupos de amostras pré-QT e pós-QT (Figura 9).
Figura 8: Expressão dos miR-138 (A), miR139 (B), miR-196b (C), miR-584 (D) e miR-708 (E) em amostras de osso não neoplásico comparados a amostras tumorais e linhagens celulares. O traço representa diferença significativa entre os
grupos analisados (p<0,05). Amostras que apresentavam valor de expressão igual a zero para o miR-584 não foram incluídas no gráfico, porém, foram analisadas estatísticamente.
_______________________________ RESULTADOS
41
4.2.3. Correlação entre as expressões
Foi realizada uma análise de correlação entre as expressões dos genes de ROCKs e também
dos microRNAs estudados através do programa SPSS, utilizando-se o índice de correlação de
Spearman. Para este tipo de análise, todas as amostras neoplásicas deste trabalho foram utilizadas
(n=35). Com este tipo de análise pudemos demonstrar a correlação positiva entre ROCK1 e ROCK2
(p=0,003, R=0,493). Verificou-se também uma correlação negativa entre ROCK2 e o miR-138
(p=0,028, R= -0,377). Outro dado interessante foi a correlação entre ROCK1 e o miR-196b (p=0,045,
R=0,345), também predita neste trabalho, porém trata-se de uma correlação positiva, o que não é
esperado para microRNAs e genes. Além disso, pudemos observar uma correlação positiva entre os
miR-196b e miR-708 (p=0,037, R=0,359) (Tabela I).
Figura 9: Expressão dos miR-138 (A), miR139 (B), miR-196b (C), miR-584 (D) e miR-708 (E) em amostras pré-quimioterapia (pré-QT) comparadas a amostras pós-quimiterapia (pós-QT).
_______________________________ RESULTADOS
42
Tabela I: Valores do índice de correlação de Spearman, nível de significância das correlações (valor p) e n
amostral entre miR-138, miR-139, miR-196b, miR-584, miR-708-5p, ROCK1 e ROCK2.
ROCK1 ROCK2 miR138 miR139 miR196b miR584 miR708
Sp
ea
rma
n's
rh
o
ROCK1
Coeficiente de
Correlação 1,000 0,493
** 0,049 0,287 0,345
* 0,301 0,252
Sig. (2-tailed) 0,003 0,784 0,100 0,045 0,083 0,150
N 35 35 34 34 34 34 34
ROCK2
Coeficiente de
Correlação 0,493
** 1,000 -0,377
* -0,165 0,121 -0,070 -0,099
Sig. (2-tailed) 0,003 0,028 0,352 0,497 0,692 0,578
N 35 35 34 34 34 34 34
miR138
Coeficiente de
Correlação 0,049 -0,377
* 1,000 0,140 -0,033 0,227 0,045
Sig. (2-tailed) 0,784 0,028 0,429 0,851 0,197 0,799
N 34 34 34 34 34 34 34
miR139
Coeficiente de
Correlação 0,287 -0,165 0,140 1,000 0,254 0,199 0,288
Sig. (2-tailed) 0,100 0,352 0,429 0,148 0,260 0,099
N 34 34 34 34 34 34 34
miR196b
Coeficiente de
Correlação 0,345
* 0,121 -0,033 0,254 1,000 -0,092 0,359
*
Sig. (2-tailed) 0,045 0,497 0,851 0,148 0,605 0,037
N 34 34 34 34 34 34 34
miR584
Coeficiente de
Correlação 0,301 -0,070 0,227 0,199 -0,092 1,000 0,055
Sig. (2-tailed) 0,083 0,692 0,197 0,260 0,605 0,757
N 34 34 34 34 34 34 34
miR708
Coeficiente de
Correlação 0,252 -0,099 0,045 0,288 0,359
* 0,055 1,000
Sig. (2-tailed) 0,150 0,578 0,799 0,099 0,037 0,757
N 34 34 34 34 34 34 34
_______________________________ RESULTADOS
43
4.3. Associação com Diagnóstico e evolução clínica dos pacientes
4.3.1. Associação com Sobrevida Global
Para a construção do gráfico e análise de sobrevida global (Kaplan-Meier) foram utilizados as
expressões de ROCK1, ROCK2 e microRNAs estudados das amostras de tumores pré-QT,
considerando-se para contagem dos meses da data do diagnóstico até o último retorno do paciente
ou data do óbito. Pudemos verificar que houve uma associação significativa do miR-138, cuja maior
expressão foi encontrada relacionada aos casos de menor sobrevida (p=0,042). Não foram
observadas associações das quinases ou microRNAs estudados com a sobrevida. Entretanto, ambas
quinases e o miR-708 apresentaram uma tendência de uma menor sobrevida quando há uma baixa
expressão (Figura 10).
Figura 10: Curvas de sobrevida global relativas a expressões de ROCK1 (A), ROCK2 (B), miR-138 (C), miR-139 (D), miR-196b (E), miR-584 (F) e miR-708 (G). As linhas azuis representam uma expressão abaixo da mediana
enquanto que as linhas verdes representam uma expressão acima da mediana.
_______________________________ RESULTADOS
44
4.3.2. Associação dos dados de expressão e características clínicas e biológicas dos pacientes
A partir dos resultados obtidos através da técnica de RT-qPCR, utilizamos o software SPSS
para analisar a relação da expressão dos genes ROCKe dos microRNAs em questão nas amostras de
tumores pré-QT com os dados clínicos dos pacientes.
Para que a análise estatística fosse válida, consideramos as características cujos
agrupamentos mantinham um n mínimo de 3 amostras. Sendo assim, para ROCK1 e ROCK2 foram
consideradas as características Grau de Malignidade, Metástase, Recidiva, Amputação e Óbito,
enquanto que para análise dos microRNAs foram consideradas Grau de Malignidade, Metástase e
Óbito, pois para uma das amostras não foi a possível síntese de RNA específica para microRNA. O
resultado desta análise para ROCK1 e 2 está apresentado na tabela II, enquanto dos microRNAs se
encontram na tabela III. As tabelas resumem os valores de média, mediana, mínima e máxima da
expressão de cada variável analisada, assim como o valor p e n dos agrupamentos.
Nenhuma associação clínica foi encontrada, tanto para as quinases quanto para os
microRNAs estudados, entretanto, deve ser considerado o pequeno n amostral disponível.
Tabela II: Análise das associações clínicas obtidas a partir da expressão dos genes ROCK1 e ROCK2,
apresentando valores de média, mediana, mínima, máxima, tamanho amostral (n) e nível de significância (valor
p) para cada grupo.
Grau Malignidade Metástase Recidiva Amputação Óbito
Baixo Grau
Alto Grau
Ausente Presente Ausente Presente Não
Realizada Realizada Ausente Presente
RO
CK
1
média 0,87 0,50 0,68 0,58 0,57 0,86 0,63 0,64 0,53 0,80
mediana 0,97 0,43 0,62 0,42 0,50 0,97 0,56 0,66 0,43 0,60
mínima 0,30 0,17 0,30 0,17 0,17 0,54 0,26 0,17 0,17 0,41
máxima 1,47 0,97 1,07 1,47 1,47 1,07 1,47 1,07 1,07 1,47
n 5 9 7 8 12 3 12 3 9 5
p valor 0,13 0,20 0,15 0,77 0,21
RO
CK
2
média 2,97 1,62 2,13 2,01 1,92 2,67 2,03 2,23 1,60 2,75
mediana 3,01 1,43 1,57 1,37 1,48 3,01 1,50 1,52 1,10 2,40
mínima 0,54 0,70 0,54 0,70 0,70 0,54 0,54 0,72 0,54 1,31
máxima 5,96 2,92 4,45 5,96 5,96 4,45 5,96 4,45 4,45 5,96
n 5 9 7 8 12 3 12 3 9 5
p valor 0,39 0,56 0,56 0,89 0,21
_______________________________ RESULTADOS
45
Tabela III: Análise das associações clínicas obtidas a partir da expressão dos miR-138, miR-139, miR-196b, miR-
584 e miR-708, apresentando valores de média, mediana, mínima, máxima, tamanho amostral (n) e nível de
significância (valor p) para cada grupo.
Grau Malignidade Metástase Óbito
Baixo Grau Alto Grau Ausente Presente Ausente Presente
miR
-138
média 1,18 2,98 1,60 3,08 2,25 2,75
mediana 0,53 1,58 1,49 1,50 0,89 2,73
mínima 0,29 0,27 0,27 0,46 0,27 0,52
máxima 3,35 9,06 3,35 9,06 9,06 8,63
n amostral 4 9 6 8 8 5
p valor 0,35 0,61 0,14
miR
-139
média 2,00 2,18 1,76 2,40 1,59 3,32
mediana 2,04 1,30 1,96 1,33 1,34 2,15
mínima 1,33 0,35 0,45 0,35 0,35 1,33
máxima 2,58 11,10 2,58 11,10 2,33 11,10
n amostral 4 9 6 8 8 5
p valor 0,12 0,37 1,00
miR
-196
b
média 66,55 41,73 57,17 52,90 43,99 79,97
mediana 67,45 32,93 36,41 40,66 28,82 113,96
mínima 15,91 14,45 14,45 17,99 15,91 41,70
máxima 115,39 113,96 124,45 113,96 70,86 124,45
n amostral 4 9 6 8 8 5
p valor 0,35 0,90 0,38
miR
-584
média 0,04 0,17 0,05 0,18 0,04 0,28
mediana 0,05 0,06 0,06 0,04 0,02 0,06
mínima 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,05
máxima 0,07 1,11 0,09 1,11 0,09 1,11
n amostral 4 9 6 8 8 5
p valor 0,53 0,70 0,19
miR
-708
média 0,28 0,35 0,32 0,38 0,21 0,63
mediana 0,30 0,20 0,30 0,22 0,16 0,53
mínima 0,12 0,06 0,09 0,06 0,06 0,34
máxima 0,40 1,45 0,69 1,45 0,35 1,45
n amostral 4 9 6 8 8 5
p valor 0,44 0,52 0,14
_______________________________ RESULTADOS
46
4.4. Transdução das linhagens de OS
4.4.1. Escolha do microRNA de interesse
O miR-708 foi o escolhido para estudos de sua modulação. A seleção do microRNA de
interesse foi feita, primeiramente, analisando os dados de expressão das amostras tumorais quando
comparadas ao controle não neoplásico. Observamos que os miR-138, miR-139 e miR-708
apresentavam desregulação da expressão nas amostras neoplásicas quando comparadas as amostras
controle saudável. Porém, apesar da associação do miR-138 com os dados de sobrevida e sua
correlação com ROCK2, apenas os miR-139 e miR-708 apresentavam diferença também nas linhagens
celulares, característica primordial para os estudos in vitro, favorecendo a escolha dos miR-139 ou
miR-708. Uma revisão na literatura mostrou que ambos microRNAs já haviam sido relacionados com
o processo metastático em outros tipos tumorais (Krishnan et al.,2013; Shen et al.,2012; Yue et
al.,2015; Li et al.,2015; Lin et al.,2014), mas não foram encontradas informações em osteossarcoma.
Deste modo, ambos microRNAs apresentavam grande potencial de estudo, porém o miR-708
mostrou-se mais relevante.
4.4.2. Confirmação da eficiência de transdução
As linhagens celulares de osteossarcoma HOS, MG-63 e SAOS-2 foram transduzidas, através
de lentivírus, com um vetor de expressão vazio (V.V.) ou com vetor de expressão carregando a
sequência para aumentar a expressão do miR-708-5p (miR-708). Após este processo, foi extraído
RNA em três tempos diferentes e sintetizado o cDNA de cada linhagem. Foi mensurada a expressão
do miR-708-5p em cada uma das linhagens através de RT-qPCR, visando confirmar a eficiência da
transdução (Figura 11). Em todas as linhagens não houve diferença entre as linhagens N.T. e V.V.,
sendo encontrada diferença significativa ao comparar as linhagens miR-708 e V.V. com valor de
p=3X10-4 para linhagem HOS, p=0,015 para linhagem MG-63 e p=3x10-3 para linhagem SAOS-2.
_______________________________ RESULTADOS
47
Como pode ser verificado nos gráficos acima, todas as linhagens obtiveram sucesso na
transfecção. O fold change entre as linhagens não transduzidas, linhagens com vetor vazio e
linhagens com vetor para miR-708 podem ser observados na tabela IV abaixo:
Tabela IV: Fold change entre as linhagens transduzidas (V.V. e miR-708) de não transduzidas (N.T.),
demonstrando a eficiência da transdução.
Figura 11: Expressão Relativa do miR-708-5p nas linhagens HOS (A), MG-63 (B) e SAOS-2 (C)
transduzidas com vetor vazio (V.V.), não transduzidas (N.T.), e transduzidas com vetor para
miR-708 (miR-708). O traço representa p<0,05.
Fold Change V.V./N.T. miR-708/V.V. miR-708/N.T.
HOS 0,68 113,38 77,44
MG-63 0,33 5,65 1,85
SAOS-2 0,42 43,59 18,18
_______________________________ RESULTADOS
48
A linhagem MG-63 foi a que obteve menor sucesso de transdução, uma vez que seu fold
change foi de 5,65 em relação ao V.V. Entretanto, em uma busca na literatura foram encontrados
trabalhos com o mesmo tipo de transdução lentiviral visando a hiperexpressão de determinado
miRNA em linhagens celulares que apresentaram fold change semelhante ou menor que 5,65 (Lei et
al., 2015; Li et al., 2014; Liu et al., 2014). Deste modo, a linhagem MG-63 também foi utilizada para
realização dos ensaios funcionais.
4.4.3. Expressão das quinases ROCKs nas linhagens transduzidas
Pudemos verificar que a expressão relativa das quinases ROCKs entre as linhagens N.T. (não
transduzida), V.V. (vetor vazio) e miR-708 (Figura 12) não apresentou diferença significativa (p>0,05)
em nenhuma das linhagens celulares estudadas.
Figura 12: Expressão relativa dos genes ROCK1 (A) e ROCK2 (B) nas linhagens HOS, MG-63 e SAOS-2 N.T., V.V. e miR-
708.
_______________________________ RESULTADOS
49
4.5. Ensaios Funcionais
4.5.1. Ensaio de proliferação
Todas as linhagens celulares deste trabalho foram submetidas ao ensaio funcional de
proliferação, nos tempos de 24h, 48h, 72h, 96h, 120h e 144h. A taxa de proliferação nas linhagens
com hiperexpressão miR-708 foi mantida em todos os tempos, não obtendo diferença estatística
(p>0,05) com as linhagens vetor controle correspondentes, sugerindo que o miR-708 provavelmente
não exerce influência na capacidade de replicação destas células (Figura 13).
Figura 13: Taxa de proliferação das linhagens HOS, MG63 e SAOS-2 com hiperexpressão do miR-708 nos tempos de 24h a 144h. Não houve diferença significativa quando comparadas
as linhagens com vetor controle com os mesmos tempos.
_______________________________ RESULTADOS
50
4.5.2. Ensaio clonogênico
O ensaio clonogênico foi realizado nas três linhagens celulares estudadas, HOS, MG-63 e
SAOS-2. Não se encontrou diferença estatística entre as linhagens vetor vazio (V.V.) e miR708 em
nenhuma das linhagens (Figura 14), indicando que o miR-708-5p pode não estar envolvido na
capacidade das células neoplásicas estudadas de formação de clones.
Figura 14: Número de colônias relativas apresentadas pelas linhagens HOS (A), MG-63 (B) e SAOS-2 (C) miR-708 em relação às linhagens vetor vazio (V.V.) correspondente. Não houve
diferença estatística.
_______________________________ RESULTADOS
51
4.5.3. Ensaio migração Wound Healing
Foi realizado o ensaio de migração Wound Healing nas linhagens HOS, MG-63 e SAOS-2
transduzidas por lentivirus para avaliar o efeito da hiperexpressão do miR-708-5p na capacidade de
migração de tais células (Figura 15). Pode-se observar diferença significativa entre os grupos vetor
vazio (V.V.) e miR-708 apenas na linhagem SAOS-2 (p=0,02), onde o miR-708 induziu uma diminuição
na taxa de migração.
Figura 15: Fotos e gráficos correspondentes ao ensaio de migração wound healing realizado nas linhagens HOS V.V. e miR708 (A, B), MG-63 V.V. e miR-708 (C,D) e SAOS-2 V.V. e miR-708 (E,F).
_______________________________ RESULTADOS
52
4.5.4. Ensaio de Invasão em Matrigel e Gelatina
As três linhagens celulares controle vetor vazio e miR-708 foram utilizadas neste ensaio, em
dois tipos de matrizes: matrigel e gelatina (Figura 16). Foi possível observar um comportamento
distinto tanto entre as linhagens quanto entre os tipos de matrizes.
Na matriz composta por Gelatina, o miR-708 induziu uma diminuição nas taxas de invasão
das linhagens HOS (p=0,01) e SAOS-2 (p=0,02). Entretanto, este miRNA induziu um comportamento
diferente na matriz de Matrigel, uma vez que a linhagem MG-63 apresentou um aumento nas taxas
de invasão quando comparadas ao controle V.V. (p=0,008).
Apesar de não ter sido encontrada diferença significativa, pudemos também observar uma
tendência ao aumento da invasão nas linhagens HOS (p=0,096) e MG-63 (0,612) nas matrizes de
matrigel e gelatina, respectivamente. Deste modo, podemos observar um comportamento ambíguo
da linhagem HOS dependente da matriz.
Já a linhagem SAOS-2 miR-708 também apresentou uma tendência a redução do potencial
invasivo na matriz de matrigel (0,149), mostrando o mesmo comportamento, independente da
matriz.
_______________________________ RESULTADOS
53
Figura 16: Taxa de invasão relativa nas linhagens HOS (A), MG-63(B) e SAOS-2(C) transduzidas com vetor vazio (V.V.) ou miR-708. O traço representa p<0,05.
_______________________________ RESULTADOS
54
4.5.5. Ensaio Crescimento Independente de Ancoragem (Soft Agar)
Neste ensaio, apenas a linhagem SAOS-2 foi utilizada, uma vez que esta é a única linhagem
tumorigênica in vivo. O mir-708 não alterou o comportamento desta linhagem de modo significativo
(p=143), entretanto, pudemos observar que a hiperexpressão do miR-708 induziu uma tendência à
um aumento no número de colônias quando comparada ao vetor vazio controle (Figura 17).
Figura 17: Figura e Gráfico representando o número de colônias relativo obtidas através de crescimento independente de ancoragem na linhagem SAOS-2 vetor vazio (V.V.) e miR-708.
_______________________________ RESULTADOS
55
4.6. Análise In Silico
A partir das análises realizadas nos programas miRWalk (v2.0) e DAVID (v6.7), foram obtidos
os processos biológicos nas quais o miR-708 pode estar envolvido. Na Tabela VI foram resumidas as
vias de maior interesse, o número de genes preditos como alvos do miR-708 participantes de cada
via e o p-valor.
Tabela V: Vias e processos biológicos nos quais o miR-708-5p está envolvido, segundo base de dados
KEGG-Pathways (Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes).
Categoria Vias/Processos Biológicos Número de genes p-valor Genes
KEGG_PATHWAY hsa05200:Pathways in cancer
(Vias em Câncer) 40 0,0084
TRAF1, DCC, E2F2, WNT5B, PTGS2, PGF, STK36, WNT3A, ARNT2, FGF11, FOXO1, PTEN, SUFU, MAX, ACVR1B, CDKN2B, PAX8, WNT8B, AKT2, PRKCA, FZD8, BCR, RALBP1, CBL, SMAD4, FZD1, SMAD3, FGF23, FADD, STK4, FZD4, MAPK1, CCDC6, NRAS, CDKN1A, FZD10, GSK3B, JAK1, PTCH1, IKBKB
KEGG_PATHWAY hsa04514:Cell adhesion
molecules (CAMs) (Moléculas de Adesão Celular)
20 0,0094
PVR, GLG1, PTPRF, SELL, NFASC, CD276, NLGN2, SDC4, PDCD1LG2, PDCD1, SDC3, NRCAM, NCAM1, SIGLEC1, SDC1, CD34, CD274, CNTNAP2, HLA-DOA, JAM3, CD28
KEGG_PATHWAY hsa04310:Wnt signaling
pathway (Via de Sinalização WNT)
21 0,019
PRKCA, FZD8, WNT5B, VANGL1, BTRC, WNT3A, VANGL2, FZD1, SMAD4, PPP3R2, SMAD3, FZD4, MAP3K7, FZD10, CCND2, GSK3B, PRICKLE2, NFAT5, CAMK2D, NFATC2, WNT8B
KEGG_PATHWAY hsa04010:MAPK signaling
pathway (Via de Sinalização MAPK)
31 0,039
ZAK, GNA12, FGF11, PPP3R2, GNG12, SRF, MAP3K7, MAX, ACVR1B, PAK2, MAP3K2, RASGRP4, NFATC2, AKT2, PRKCA, CACNA1I, PTPRR, FGF23, STK4, MAPK1, DUSP4, NRAS, RPS6KA1, RAP1A, CACNA1E, RAP1B, CACNA1C, IKBKB, MAP3K13, PLA2G5, PLA2G2F
KEGG_PATHWAY hsa04520:Adherens junction
(Junção Aderente) 12 0,044
MAP3K7, PTPRB, PTPRJ, MAPK1, ACVR1B, PTPRF, WASF3, SMAD4, SMAD3, SSX2IP, YES1, IQGAP1
Discussão
___________________________________________________________________________DISCUSSÃO
57
Os casos com maior taxa de mortalidade em OS são aqueles que apresentam metástase,
sendo assim, é essencial ampliar o conhecimento sobre a regulação deste processo, visando também
identificar possíveis alvos terapêuticos. Além disso, a evolução no tratamento dos OSs atingiu um
platô, não havendo opção para casos que não apresentam uma boa resposta ao tratamento padrão
(Zhang et al., 2015). Deste modo, torna-se primordial a procura por novos alvos terapêuticos.
Dois possíveis alvos estudados neste trabalho foram as quinases ROCK1 e ROCK2. Tais
quinases são efetores da GTPase Rho, envolvida no controle do citoesqueleto e, consequentemente,
no processo de motilidade celular. Ambas as quinases foram encontradas desreguladas em diversos
tipos tumorais, e frequentemente associadas ao processo metastático (Sahai & Marshall, 2003).
Desta forma, o presente trabalho teve como um de seus objetivos mostrar os níveis de expressão
destes genes em amostras de pacientes diagnosticados com OS.
Estudos relatam que tanto ROCK1 quanto ROCK2 apresentaram-se hiperexpressas em
amostras de OS. Liu e colaboradores (2011) encontraram, através de técnicas de imunohistoquímica,
uma hiperexpressão de ROCK1 em 51 amostras de OS, além de confirmar esta hiperexpressão por
western-blotting em duas linhagens celulares (U-2OS e KHOS) e seis amostras de tecido neoplásico.
Esta análise utilizou como amostras controles duas linhagens celulares de osteoblasto (HOB-c e
NHOST). O trabalho de Wang e colaboradores (2015) encontrou uma hiperexpressão, através da
técnica RT-qPCR, tanto de ROCK1 quanto de ROCK2 utilizando 91 amostras de OS quando
comparadas a 24 amostras de tecido não neoplásico adjacente utilizadas como controle. Além disso,
trabalhos demonstraram que a inibição de ROCK1 e 2, seja por técnicas de siRNA, pela utilização de
drogas específicas ou pelo estudo de microRNAs que apresentem as quinases ROCKs como alvo,
diminuem taxas de proliferação e invasão celular, levando à uma regressão tumoral em OS (Wang et
al., 2015; Zucchini et al., 2013).
No presente trabalho, encontramos uma hipoexpressão de ROCK1 nas amostras tumorais
pré-QT quando comparadas ao controle não neoplásico. Além disso, a expressão de ROCK2 não
apresentou diferença estatística quando comparada as amostras controle. Ao analisar os dados de
expressões e suas possíveis associações com os dados clínicos dos pacientes, podemos perceber que
uma menor expressão tanto de ROCK1 como de ROCK2 tende a se associar a uma menor sobrevida.
Entretanto, os níveis proteicos dessas quinases devem ser investigados a fim de reforçar os dados
aqui encontrados.
A incongruência encontrada entre os resultados aqui apresentados e os dados da literatura
pode ser devida aos diferentes tipos de amostras utilizadas como controle nos trabalhos. Enquanto
que no presente trabalho foram utilizadas seis amostras de osso não neoplásico, o trabalho de Liu e
colaboradores (2011) utilizaram como referência linhagens de osteoblasto e Wang e colaboradores
___________________________________________________________________________DISCUSSÃO
58
(2015) fizeram uso de amostras adjacentes à neoplasia. Além das diferentes técnicas utilizadas
(imunohistoquímica, Western Blotting e RT-qPCR).
No uso de amostras de osso como controle, deve ser considerado que o tecido ósseo é um
tecido dinâmico, com capacidade de remodelagem ao longo da vida. Deste modo, a proporção de
células (osteoblastos, osteoclastos, condrócitos, células progenitoras mesenquimais, além de células
hematopoiéticas e endoteliais) e fase mineral (como fosfato de cálcio) varia consideravelmente
conforme a região óssea, além da idade do paciente (Kartsogiannis et al., 2004; Alfranca et al., 2015).
Por outro lado, o uso de linhagens celulares de osteoblastos não expõe a variabilidade celular
encontrada no tecido ósseo. No presente trabalho optou-se pela utilização de amostras de osso de
pacientes que não desenvolveram OS, com o objetivo de garantir a heterogeneidade encontrada no
tecido ósseo. Além disso, buscou-se selecionar ossos controle com idades semelhantes às amostras
de OS, visando minimizar os efeitos da idade nesta análise, além de serem preferencialmente
coletadas amostras de ossos longos, como fêmur e úmero. Porém, o tamanho amostral ainda é um
fator limitante, além do fato das amostras de osso normal e OS não serem pareadas, como acontece
nos dados encontrados na literatura.
Além das diferentes amostras controle utilizadas nos trabalhos que estudaram a expressão
das ROCKs, as amostras neoplásicas per se podem apresentar grande variabilidade, uma vez que não
foi relatada desregulação de nenhuma via especifica que leve ao desenvolvimento do OS, mas sim
diferentes alterações genéticas (Rivera-Valentin et al., 2015). Deste modo, o estudo de coortes
amostrais diferentes podem apresentar expressões gênicas distintas.
O tipo de matriz extracelular (MEC) é um fator relevante e que deve ser considerado nestas
análises. O OS é um tipo tumoral cujo desenvolvimento é dependente também da composição da
MEC (Alfranca et al., 2015). Rubio e colaboradores (2010, 2013 e 2014) demonstraram a influência da
MEC no desenvolvimento do OS, destacando a importância da composição do ambiente ósseo no
desenvolvimento deste tipo tumoral.
A MEC não é apenas importante para o desenvolvimento da neoplasia aqui estudada, mas
também especificamente para a regulação da via Rho/ROCK. Tem sido observado que o câncer de
ovário apresenta uma tendência ao desenvolvimento de metástases em tecidos moles. McGrail e
colaboradores (2014) demonstraram que a ativação ou inibição de ROCK apresenta diferentes efeitos
na migração deste tipo tumoral dependendo da rigidez encontrada na matriz extracelular,
ressaltando que estudos na densidade da matriz são essenciais para o entendimento da
mecanosensibilidade mediada pela via Rho/ROCK. Em linhagens celulares de glioblastoma
knockdown para ROCK1 foi demonstrado que há uma diminuição da migração wound healing sobre
superfícies cobertas por laminina, enquanto que ao retirar a laminina, estas taxas de migração
___________________________________________________________________________DISCUSSÃO
59
aumentam (Mertsch & Thanos, 2014), enfatizando a influência da composição da matriz extracelular
na regulação destas quinases.
Uma matriz extracelular mais macia favorece uma migração mesenquimal, enquanto que o
aumento da rigidez desta matriz induz uma migração do tipo ameboide. A variação entre estes tipos
de migração é mutuamente excludente e controlada pela via Rho-ROCK, no caso da migração
ameboide, ou Rac, no caso da migração mesenquimal (Sahai & Marshall, 2003; Amin et al., 2013).
Han e colaboradores (2015) demonstraram hiperexpressão de PAK7 (p21-activated kinase 7) em
amostras tumorais e na linhagem celular SAOS-2 de OS. Tal quinase é um membro da família
Rac/Cdc42, podendo indicar que a migração em OS é controlada por Rac e, consequentemente, uma
baixa ativação de ROCKs.
Foi demonstrado que em OS há uma hiperexpressão de Cyr61, e que tal molécula promove a
transição epitélio-mesenquimal e induz a migração neste tipo tumoral através da ativação de alvos
como MEK (MAP kinase kinase), ERK (extracelullar signal-regulated kinase) e Raf1 (MAP kinase kinase
kinase) (Hou et al., 2014), efetores da via das MAPK (mitogen-activated protein kinase). Uma inibição
direta das proteínas ROCKs pode ser realizada através da ativação de Raf-1 (c-Raf) (Amin et al., 2013).
Portanto, existe uma possibilidade das ROCKs estarem sendo inibidas por Raf-1 pela via das MAPKs
em nossa coorte de amostras, entretanto, as técnicas aqui utlizadas não apropriadas para validar
essa hipótese e mais análises devem ser feitas.
Deste modo, apesar das quinases ROCK se encontrarem hiperexpressas em diversos tipos
tumorais e sua inibição estar relacionada à diminuição nas taxas de migração (Sadok,et al., 2015; Oku
et al., 2014) a interação com a matriz extracelular, além da correlação inversa com a via Rac e sua
inativação direta por Raf-1 poderiam justificar a hipoexpressão de ROCK1 encontrada nas amostras
de OS aqui estudadas.
O presente trabalho também avaliou o perfil de expressão de cinco miRNAs em amostras
tumorais e linhagens celulares de OS, sendo que nenhum deles haviam sido descritos previamente
em OS. A hipoexpressão do miR-138 foi previamente demonstrada em tumores como do pâncreas
(Yu et al., 2015) e carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (Islam et al., 2014), e em
câncer de pulmão sua hiper-regulação foi associada a uma diminuição na migração e maior quimio- e
radio- sensibilidade (Han et al., 2015; Yang et al., 2014). Entretanto, este miRNA foi encontrado
hiperexpresso em câncer de bexiga (Pignot et al., 2013). Chan e colaboradores (2012) encontraram
uma hiperexpressão do miR-138 em células tronco de glioblastoma, além de uma associação desta
hiperexpressão com tumores recorrentes e com menores taxas de sobrevida. No presente trabalho
foi demonstrada uma hiperexpressão deste miRNA em amostras de tumores pré-QT quando
comparadas ao controle não neoplásico. Além disso, esse miRNA demonstrou uma correlação
___________________________________________________________________________DISCUSSÃO
60
negativa com ROCK2, dando suporte aos trabalhos de Jiang e colaboradores (2010) e Liu e
colaboradores (2011), que demonstraram que ROCK2 é um alvo do miR-138 em carcinoma de células
escamosas de língua. Outro dado interessante apresentado neste trabalho é a associação do miR-138
com a sobrevida dos pacientes avaliados (p=0,042), sendo que as maiores expressões deste miRNA
estão associadas as menores taxas de sobrevida.
Já o miR-139 foi encontrado hipoexpresso em tumores pré-QT de OS, assim como nas
linhagens celulares, o que condiz com a literatura. Krishnan e colaboradores (2013) encontraram
baixos níveis de expressão deste miRNA em câncer de mama, além da associação desta com tumores
mais metastáticos. Tal miRNA foi predito para diversos alvos relacionados ao processo de migração,
incluindo as cascatas de sinalização Rho e MAPK/PI3K. Em carcinoma hepatocelular também foi
verificada uma diminuição do miR-139, além de sua associação com os casos metastáticos. Neste
estudo os autores ressaltam a relação deste miRNA com transição epitélio-mesenquimal (Qiu et al.,
2015). Também foi demonstrada uma hipoexpressão do miR-139 em câncer de pulmão (Xu et al.,
2015) e câncer coloretal (Zhang et al., 2014). Deste modo, apesar de não apresentar associação aos
casos metastáticos em OS, sua hipoexpressão pode estar associada a este processo também neste
tipo tumoral, sendo necessários mais estudos.
Ainda, a hiperexpressão do miR-196b foi associada à uma menor taxa de apoptose e ao pior
prognóstico em câncer coloretal (Mo et al., 2015; Ge et al., 2014), e seu perfil de expressão permitiu
uma predição da resposta a quimioterapia em pacientes com adenocarcinoma de pulmão,
ressaltando seu papel como biomarcador (Saito et al., 2014; Li et al., 2014). Zhang e colaboradores
(2014) demonstraram um aumento dos miR-196a e miR-196b em amostras de tecido e soro de
pacientes com OS. Entretanto, no presente trabaho não foram demonstradas diferenças entre as
amostras de pré-QT e osso não neoplásico, apesar da evidente alta taxa de expressão deste miRNA
em tais tecidos. Além disso, a expressão do miR-196b apresentou uma correlação positiva com
ROCK1. O trabalho aqui apresentado havia encontrado, através de uma análise na base de dados
miRWalk, que esta quinase seria um alvo predito deste miRNA. Apesar da análise de Spearman ter
mostrado uma correlação entre estas moléculas, trata-se de uma correlação positiva, que não é
comumente esperada para uma interação mRNA/miRNA.
Por outro lado, poucos estudos têm demonstrado o perfil de expressão do miR-584 em
neoplasias. A hiperexpressão deste miRNA foi encontrada em câncer retal (Gaedcke et al., 2012) e
em amostras de glioma, mas não em linhagens celulares (Wang et al., 2014). Contrariamente, foi
verificada uma hipoexpressão do miR-584 em carcinoma renal (Ueno et al., 2011). No trabalho aqui
apresentado o miR-584 mostrou uma expressão muito baixa e em algumas amostras e linhagens não
___________________________________________________________________________DISCUSSÃO
61
foi possível detectar sua expressão, e uma alta variação de expressão nos ossos não neoplásicos, não
apresentando diferença significativa entre os grupos neoplásicos e normal.
No presente trabalho, também foi encontrada uma diminuição nos níveis de expressão do
miR-708 em amostras de tumores pré-QT e linhagens celulares de OS. Uma busca na literatura
mostrou que a expressão do miR-708 varia conforme os tipos tumorais estudados. Por exemplo, este
miRNA se mostrou hipoexpresso em glioblastoma, sendo considerado um supressor tumoral neste
tipo de neoplasia (Guo et al., 2013), assim como foi encontrado atenuado em câncer renal (Saini et
al., 2011). Já em câncer colo retal foi encontrada hiperexpressão deste miRNA (Lei et al., 2014) e o
mesmo foi verificado em carcinoma de bexiga (Song et al., 2013).
Tais trabalhos também demonstram a atuação do miR-708 nos processos de proliferação e
apoptose, sendo que sua hipoexpressão reduziu a proliferação e induziu apoptose em câncer de
bexiga (Song et al., 2013) e câncer coloretal (Lei et al., 2014) enquanto que, em câncer renal (Saini et
al., 2011) e glioblastoma (Guo et al., 2013), a indução de sua expressão levou à diminuição na taxa de
proliferação e a um aumento na apoptose. Entretanto, ao induzir a expressão deste miRNA em
linhagens de OS, não foram encontrados efeitos anti-proliferativos ou uma diminuição na capacidade
clonogênica das células, indicando que o miR-708 pode não estar atuando de forma significativa no
controle do ciclo celular ou indução da apoptose em células de OS.
Por outro lado, trabalhos têm descrito o miR-708 como associado ao processo metastático
em alguns tipos tumorais, como câncer de ovário (Lin et al., 2015) ou câncer coloretal (Pizzini et al.,
2013). Ao realizar o ensaio de migração wound healing com linhagens hiperexpressando o miR-708,
foi observada redução da taxa de migração na linhagem SAOS-2. Porém, não foi encontrada
diferença estatística entre os grupos controle V.V. e miR-708 nas linhagens HOS e MG-63.
No ensaio de invasão, a linhagem SAOS-2 manteve o comportamento encontrado na
migração, uma vez que o miR-708 reduziu a taxa de invasão na matriz de gelatina. Resultados
semelhantes foram encontrados em carcinoma hepatocelular e câncer de ovário, onde a indução do
miR-708 levou a uma diminuição tanto da migração wound healing quanto da invasão em linhagens
celulares (Li et al., 2015; Lin et al., 2014). Ao contrário dos resultados encontrados no ensaio de
migração wound healing, o miR-708 induziu uma resposta de invasão diferenciada nas linhagens HOS
e MG-63. Na linhagem HOS, o miR-708 diminuiu a taxa invasiva em gelatina. Já na linhagem MG-63, o
miR-708 aumentou as taxas de invasão na matriz de matrigel.
Sabe-se que o matrigel é um composto de proteínas da MEC extraído do tumor Englebreth-
Holm-Swarm de camundongo, e que apresenta não apenas proteínas estruturais, como laminina,
colágeno IV e enactina, mas também foram identificadas fatores de crescimento e seus ligantes,
como FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor) e IGF-1 (insulin growth factor 1)
___________________________________________________________________________DISCUSSÃO
62
além de proteínas de baixo peso molecular (Hugues et al.,2010; Vukicevic et al.,1992). Já a gelatina é
um composto extraído de estruturas como tendões, ossos, ligamentos e pele, apresentando
principalmente proteínas de alto peso molecular presentes no colágeno, que favorecem a adesão das
células (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA).
Já foi discutida anteriormente a importância da interação com a MEC para o
desenvolvimento do OS. Desta forma, o comportamento encontrado nas linhagens celulares aqui
estudadas é condizente com as características deste tipo tumoral. A partir disso, podemos concluir
que o papel do miR-708 no comportamento celular é também dependente da interação com este
fator externo, papel ressaltado pelos diferentes comportamentos apresentados pelas células
dependendo da MEC utilizada. Uma vez que as MEC de gelatina e matrigel apresentam compostos
diferentes, podemos inferir que o miR-708 pode estar regulando a interação da célula tumoral com
esses fatores, estimulando diferentes respostas.
Resultados semelhantes foram encontrados no ensaio de Crescimento Independente de
Ancoragem, onde as células são colocadas em um terceiro tipo de matriz, a agarose, e crescem sem
contato com um substrato de apoio, ou seja, de modo independente de ancoragem. Neste ensaio
realizado com a SAOS-2, pôde-se observar um tênue aumento do crescimento neste tipo de matriz
nas células com hiperexpressão do miR-708, o que não foi observado no ensaio clonogênico comum.
Além disso, capacidade de crescimento independente de ancoragem é fundamental para o
estabelecimento de um tumor secundário, o passo final do processo metastático.
Desta forma, os ensaios funcionais realizados no presente trabalho demonstram que, em OS,
o miR-708 pode não estar relacionado com a capacidade de proliferação celular, controle do ciclo ou
apoptose, mas se relaciona principalmente à processos ligados ao desenvolvimento de metástases,
destacando-se a interação com a MEC. São necessários estudos mais aprofundados nestas vias para
se estabelecer a função deste miRNA para o OS.
Através do software miRWalk®, foi verificado que ROCK2 seria um alvo predito do miR-708-
5p. Entretanto, a análise pelo índice de correlação de Spearman não indicou uma correlação
significante entre essas moléculas. Além disso, a análise da expressão de ROCK1 e ROCK2 nas
linhagens transduzidas não mostrou uma diminuição destas quinases quando o miR-708-5p era
induzido. Entretanto, para confirmar que não há correlação entre estas moléculas ainda seriam
necessários estudos proteicos ou com outros marcadores moleculares.
Considerando os resultados aqui obtidos, ainda que o miR-708-5p não esteja regulando tal
quinase neste tipo tumoral, sugere-se que este miRNA pode estar envolvido com os processos de
migração, invasão ou ancoragem através da regulação de outros mRNA, uma vez que levou a
alterações no comportamento celular, principalmente de forma dependente da MEC.
___________________________________________________________________________DISCUSSÃO
63
Com objetivo de encontrar as principais vias e processos biológicos que o miR-708 poderia
estar envolvido, foi realizada uma nova análise in silico através do software miRWalk® e a ferramenta
bioinformática DAVID®. A partir destas análises foram encontradas algumas vias que poderiam estar
relacionadas ao desenvolvimento e progressão tumoral.
Uma das vias encontradas foi a via de sinalização WNT (Wingless). Sabe-se que esta via tem
papel fundamental em diversos processos do desenvolvimento embrionário, sendo bem conservada
entre as espécies, além de sua influência na tumorigênese ser bem estabelecida (Akiyama, 2000). Cai
e colaboradores (2014), em uma revisão sobre a via WNT especificamente em OS, descrevem
diversos trabalhos que demonstraram uma superexpressão de diferentes ligantes e receptores desta
via, tanto em amostras tumorais quanto em linhagens celulares, indicando que pode haver uma
sinalização autócrina e parácrina em OS para ativação da via WNT. Além disso, trabalhos têm
demonstrado que a inibição desta leva a uma diminuição do potencial invasivo e alterações em
moléculas de ancoragem em linhagens de OS (Hoang et al., 2004a; Lin et al., 2013).
Uma vez que o miR-708 encontra-se hipoexpresso nas amostras estudadas, e analisando os
dados de predição, podemos sugerir que a hiperexpressão de diferentes componentes da via WNT
pode estar sendo regulada pelo miR-708, como os genes WNT3a, WNT5b ou receptores Frizzled 1 e
4, que já foram relatados hiperexpressos nas linhagens de OS estudadas neste trabalho (Ma et al.,
2013; Chen et al., 2008; Hoang et al., 2004b). Sendo assim, o reestabelecimento desse miRNA
poderia alterar membros dessa via e, consequentemente, os processos de invasão e ancoragem,
como visto nos ensaios funcionais.
Outra via de destaque encontrada na análise in silico é a das MAPKs (mitogen-actvated
protein kinase). Esta via é ativada através da sinalização do oncogene Ras, encontrado downstream a
fatores de crescimento como PDGF e VEGF, e que tem como principais moléculas efetoras RAF1, MEK
e ERK (Young et al., 2009). Sasaki e colaboradores (2011) encontraram que esta via está ativa em OS
através da análise dos alvos RAF1 e MEK, e demonstraram que a inibição desta leva a uma
diminuição na proliferação. Outros trabalhos relacionaram a inibição da via MAPK não apenas a uma
redução das taxas proliferativas, mas também a uma diminuição da invasão neste tipo tumoral
(Zhang et al., 2013; Miao et al., 2014).
Além do possível papel da molécula RAF1 na inibição direta de ROCK em OS discutido
anteriormente, outros membros desta via já foram estudados em OS e através das análises in silico
aqui realizadas, estão sendo relacionados ao miR-708. Um destes alvos é Rap1, cuja supressão
através da indução do miR-708 levou a uma diminuição da invasão, migração e adesão em câncer de
ovário (Lin et al., 2014). Outro alvo do miR-708 que ganha destaque é MAPK7, que foi apontado
___________________________________________________________________________DISCUSSÃO
64
como um oncogene em OS e quando silenciado, reduziu a proliferação, invasão e migração celular
(Tesser-Gamba et al., 2015).
Ao avaliar os resultados obtidos pela análise in silico juntamente aos resultados dos ensaios
funcionais realizados neste trabalho, a associação do miR-708 com os processos biológicos das
Junções Aderentes, assim como Moléculas de Adesão Celular ganham grande destaque. O
envolvimento do miR-708 nestes processos poderia corroborar com os resultados aqui apresentado,
uma vez que a regulação de moléculas de adesão é dependente da interação da célula com a MEC,
justificando as diferentes respostas encontradas nos ensaios de invasão, que variaram tanto de uma
linhagem para outra como de uma MEC para outra.
Ao explorar as moléculas apontadas na via das Junções Aderentes, o gene WASF3 (WAVE3)
teve destaque. Este gene é um membro da família de proteínas da Síndrome de Wiskott Aldrich
(Wiskott Aldrich syndrome family of proteins – WASP), composta por 5 membros, dos quais dois são
efetores de Cdc42, enquanto que os outros três membros (WAVE1, WAVE2 e WAVE3/WASF3) são
efetores de Rac1. As moléculas Cdc42 e Rac1 são GTPases da família Rho, sendo que as vias
Rho/ROCK e Rac/WAVE são vias de controle de actina e miosina mutuamente excludentes (Takenawa
& Miki, 2001; Lane et al., 2014; Sadok & Marshall, 2014). Shen e colaboradores (2014) demonstraram
a hiperexpressão de WASF3 em sete amostras de OS quando comparadas a seus tecidos não
tumorais pareados, além da regulação desta molécula pelo miR-217.
Deste modo, o miR-708 pode também estar atuando na regulação desta molécula, e
consequentemente, nos processos de invasão e migração, assim como ancoragem, através de uma
via alternativa a Rho/ROCK, podendo justificar não apenas os dados obtidos nos ensaios funcionais,
mas também os resultados de expressão encontrados.
Entretanto, é imprescindível destacar que essas hipóteses são especulações com base em
análises in silico, e que todos os dados devem ser confirmados e validados através de experimentos
biológicos.
Conclusão
________________________ CONCLUSÃO
66
A partir dos resultados obtidos neste estudo, foi possível verificar uma hipoexpressão de
ROCK1 na coorte de amostras tumorais, além de diferentes perfis de expressão de cinco microRNAs
em OS. O miR-138 apresentou uma hiperexpressão nas amostras tumorais quando comparadas ao
grupo controle, e os miR-139 e miR-708 apresentaram-se hipoexpressos nas amostras neoplásicas.
Especificamente o miR-138 obteve uma associação com a sobrevida dos pacientes, sendo que os
maiores níveis de expressão foram relacionados as menores sobrevidas. Além disso, através dos
estudos de correlações, pudemos confirmar que ROCK2 é um alvo do miR-138.
Desta forma, podemos sugerir que tanto ROCK1, quanto os miR-138, miR-139 e miR-708
apresentam um potencial de utilização como biomarcadores de OS. Especialmente o miR-138 que
demonstra inclusive um papel de biomarcador de prognóstico, devido a sua associação com a
sobrevida dos pacientes.
O miR-708, através dos ensaios funcionais, demonstrou estar envolvido no controle
processos que levam ao desenvolvimento de metástase neste tipo tumoral, ganhando grande
destaque na interação com a MEC, pois não induziu alterações na proliferação celular ou capacidade
clonogênica, mas reduziu a migração e diminuiu ou aumentou as taxas de invasão dependendo da
matriz utilizada.
Uma vez que o OS e o processo metastático apresentam uma relação intrínseca com a MEC,
o estudo deste miRNA nesta neoplasia se torna de extrema importância. No presente trabalho
foram apontadas, por estudos in silico, três principais vias nas quais o miR-708 pode estar atuando
em OS: WNT, MAPK e Junção Aderente. Desta forma, este estudo contribuiu para a descoberta de
novas funções do miR-708 em OS e ressalta a relevância deste miRNA na tumorigênese do OS e em
processos ligados a metástase, principal causa da mortalidade encontrada em OS.
.
Referências
Bibliográficas
__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
68
Abramoff, M.D., Magalhaes, P.J., Ram, S.J. (2004). "Image Processing with ImageJ".
Biophotonics International, volume 11, issue 7, pp. 36-42.
Akiyama, T. (2000). Wnt/b-catenin signaling. Cytokine & Growth Factor Reviews. Vol 11, pp
273-282.
Alfranca A., Martinez-Cruzado L., Tornin J. et al. (2015).
Bone microenvironment signals in osteosarcoma development. Cell Mol Life Sci. Vol 72, n 16, PP
3097-113. doi: 10.1007/s00018-015-1918-y.
Amano, M., Chihara, K., Nakamura, N. et al. (1999). The COOH Terminus of Rho-kinase
Negatively Regulates Rho-kinase Activity. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. Vol. 274, n 45,
pp. 32418–32424.
Amano, M., Ito, M., Kimura, K., et al. (1996). Phosphorylation and Activation of Myosin by
Rho-associated Kinase (Rho-kinase). The Journal Of Biological Chemistry. Vol. 271, n 34, pp. 20246–
20249.
Amano, M., Kaneko, T., Maeda, A., et al. (2003). Identification of Tau and MAP2 as novel
substrates of Rho-kinase and myosin phosphatase. Journal of Neurochemistry, 2003, vol 87,pp 780–
790, DOI:10.1046/j.1471-4159.2003.02054.x
Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. (2010). Rho-Kinase/ROCK: A Key Regulator of the
Cytoskeleton and Cell Polarity. Cytoskeleton, vol 67, pp 545–554, DOI: 10.1002/cm.20472.
Amin, E., Dubey, N., Zhang, S., et al. (2013). Rho-kinase: regulation, (dys)function, and
inhibition. Biol. Chem. Vol 394, n 11, pp 1399–1410. DOI 10.1515/hsz-2013-0181
An, L., Liu, Y., Wu, A., Guan, Y. (2013). microRNA-124 Inhibits Migration and Invasion by
Down- Regulating ROCK1 in Glioma. PLoS ONE. vol 8, n 7, DOI:10.1371/journal.pone.0069478.
Bagga S., Bracht J., Hunter S., et al.,(2005). Regulation by let-7 and lin-4 miRNAs Results in
Target mRNA Degradation. Cell , vol 122 , n 4 , pp 553 – 563.
Bartel, D.P. (2004). MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function – Review.
Cell. vol 116, pp 281–297.
Bielack,S.S., Kempf-Bielack, B., Delling, G., et al. (2002). Prognostic Factors in High-Grade
Osteossarcoma of the Extremities or Trunk: An Analysis of 1,702 Patients Treated on Neoadjuvant
Cooperative Osteossarcoma Study Group Protocols. Journal of Clinical Oncology. vol 20, n 3, pp 776-
790.
Borowicz S., Van Scoyk M., Avasarala S. et al. (2014). The Soft Agar Colony Formation Assay. J
Vis Exp. Vol 92. e51998. doi: 10.3791/51998.
__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
69
Brennecke, P., Arlt, M.J.E., Campanile, C., et al. (2013). CXCR4 antibody treatment suppresses
metastatic spread to the lung of intratibial human osteossarcoma xenografts in mice. Clin Exp
Metastasis. DOI 10.1007/s10585-013-9632-3.
Cai Y., Cai T. & Chen Y. (2014). Wnt pathway in osteosarcoma, from oncogenic to therapeutic.
J Cell Biochem. Vol 115, n 4, pp 625-31. doi: 10.1002/jcb.24708.
Cai, H., Lin, L., Cai, H., et al.(2014). Combined MicroRNA-340 and ROCK1 mRNA Profiling
Predicts Tumor Progression and Prognosis in Pediatric Osteosarcoma. International Journal of
Molecular Sciences, vol 15, n 1,pp 560–573. http://doi.org/10.3390/ijms15010560
Calin, G.A. & Croce, C.M. (2006). MicroRNA-Cancer Connection: The Beginning of a New Tale.
Cancer Res, vol 66, pp 7390-7394.
Calin, G.A., Sevignani, S., Dumitru, C.D. et al. (2004). Human microRNA genes are frequently
located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. PNAS, vol 101, n 9, pp 2999–3004
Chan X.H., Nama S., Gopal F. et al. (2012).
Targeting glioma stem cells by functional inhibition ofa prosurvival oncomiR-
138 in malignant gliomas. Cell Rep. Vol 2, n 3, pp 591-602. doi: 10.1016/j.celrep.2012.07.012.
Chen K., Fallen S., Abaan H.O. et al. (2008).
Wnt10b induces chemotaxis of osteosarcoma and correlates with reduced survival. Pediatr Blood
Cancer. Vol 51, n 3, pp 349-55. doi: 10.1002/pbc.21595.
Coleman M.L., Sahai E.A., Yeo M., et al. (2001). Membrane blebbing during apoptosis results
from caspase-mediated activation of ROCK I. Nat Cell Biol. Vol 3, n 4, pp 339-45.
Croft, D.R. & Olson, M.F. (2006). The Rho GTPase Effector ROCK Regulates Cyclin A, Cyclin D1,
and p27Kip1 Levels by Distinct Mechanisms. Molecular And Cellular Biology, vol 26, n 12 , pp 4612–
4627.
Croft, D.R. & Olson, M.F. (2008). Regulating the Conversion between Rounded and Elongated
Modes of Cancer Cell Movement. Cancer Cell, vol 14, pp 349-351, DOI: 10.1016/j.ccr.2008.10.009.
Dweep, H., Sticht, C., Pandey, P., Gretz, N. (2011). miRWalk - database: prediction of possible
miRNA binding sites by "walking" the genes of 3 genomes, Journal of Biomedical Informatics, vol 44,
pp 839-7.
Federman, N., Bernthal,N., Eilber, F.C., Tap, W.D. (2009). The Multidisciplinary Management
of Osteossarcoma. Current Treatment Options in Oncology. vol 10, pp 82–93, DOI:10.1007/s11864-
009-0087-3.
Feng Y., LoGrasso P.V., Defert O. et al. (2015). Rho Kinase (ROCK) Inhibitors and
Their Therapeutic Potential. J Med Chem. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.5b00683
__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
70
Fletcher, C.D., Unni, K.K., Mertens, F., et al. (2002). World Health Organization Classification
of Tumours: Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. Lyon, France, IARC Press.
Fujimura K., Choi S., Wyse M. et al. (2015). Eukaryotic Translation Initiation Factor 5A (EIF5A)
Regulates Pancreatic Cancer Metastasis by Modulating RhoA and Rho-associated Kinase (ROCK)
Protein Expression Levels. J Biol Chem. pii: jbc.M115.687418
Gaedcke J., Grade M., Camps J. et al. (2012). The rectal cancer microRNAome--microRNA
expression in rectal cancer and matched normal mucosa. Clin Cancer Res. Vol 18, n 18, pp 4919-30.
Ge,J., Chen, Z., Li,R. et al. (2014). Upregulation of microRNA-196a and microRNA-196b
cooperatively correlate with aggressive progression and unfavorable prognosis in patients with
colorectal cancer. Ge et al. Cancer Cell International, 14:128.
Gill, J., Ahluwalia, M.K., Geller, D., Gorlick, R. (2013). New targets and approaches in
osteossarcoma. Pharmacology & Therapeutics vol 137, pag 89–99.
Gorlick, R.& Khanna, C. (2010). Osteossarcoma. Journal of Bone and Mineral Research. vol.
25, n 4, pp 683–691, DOI: 10.1002/jbmr.77.
Gorlick, R., Anderson, P., Andrulis, I., et al. (2003). Biology of Childhood Osteogenic Sarcoma
and Potential Targets for Therapeutic Development: Meeting Summary. Clin Cancer Res. vol 9 pp
5442-5453.
Gu R., Sun Y.F., Wu M.F. et al.,(2015). Biological roles of microRNA-140 in tumor growth,
migration, and metastasis of osteosarcoma in vivo and in vitro. Tumor Biology. DOI
10.1007/s13277-015-3801-8
Guo, P., Lan, J., Ge, J., et al. (2013). miR-708 acts as a tumor suppressor in human
glioblastoma cells. ONCOLOGY REPORTS 30: 870-876
Han, K., Chen, X., Bian, N., et al. (2015). MicroRNA profiling identifies MiR-195 suppresses
osteosarcoma cell metastasis by targeting CCND1. Oncotarget. vol 6, n 11,pp 8875–8889.
Han, K., Zhou, Y., Gan, Z.-H., et al. (2014). p21-activated kinase 7 is an oncogene in human
osteosarcoma. Cell Biology International. Vol 38, n 12, pp 1394–1402.
http://doi.org/10.1002/cbin.10351
Han, L., Fu, T., Lin, Y. et al. (2015). MicroRNA-138 negatively regulates non-small cell lung
cancer cells through the interaction with cyclin D. Tumor Biol. DOI 10.1007/s13277-015-3757-8
Hayden, J.B. & Hoang, B.H. (2006). Osteossarcoma: Basic Science and Clinical Implications.
Orthop Clin N Am. vol 37, pp1 – 7, DOI:10.1016/j.ocl.2005.06.004.
Hernando E.(2007). microRNAs and cancer: role in tumorigenesis, patient classification and
therapy. Clin Transl Oncol. vol 9, pp 155-160. DOI 10.1007/s12094-007-0029-0
__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
71
Hoang B.H., Kubo T., Healey J.H. et al. (2004) B. Expression of LDL receptor-
related protein 5 (LRP5) as a novel marker for disease progression in high-gradeosteosarcoma. Int J
Cancer. Vol 109, n 1, pp 106-11.
Hoang B.H., Kubo T., Healey J.H. et al. (2004)A.
Dickkopf 3 inhibits invasion and motility of Saos-2 osteosarcoma cells by modulating the Wnt-beta-
catenin pathway. Cancer Res. Vol 64, n 8, pp 2734-9.
Hou, C., Lin, F., Hou, S. et al. (2014). Cyr61 promotes epithelial-mesenchymal transition and
tumor metastasis of osteossarcoma by Raf-1/MEK/ERK/Elk-1/TWIST-1 signaling pathway. Molecular
Cancer. Vol 13, n 236.
Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA. (2009). Bioinformatics enrichment tools: paths toward
the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. Vol 37, n 1, pp 1-13.
Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA. (2009). Systematic and integrative analysis of large
gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. Nature Protoc. Vol 4, n 1, pp 44-57
Hughes C.S., Postovit L.M. & Lajoie G.A. (2010). Matrigel: A complex protein mixture required
for optimal growth of cell culture. Proteomics. Vol10, n 9, pp1886-90. doi: 10.1002/pmic.200900758.
Hurst D.R., Edmonds M.D. & Welch D.R. (2009). Metastamir - the field of metastasis-
regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. vol 69, n 19, pp 7495–7498. doi:10.1158/0008-
5472.CAN-09-2111
Hwang, H.W. & Mendell, J.T. (2006). MicroRNAs in cell proliferation, cell death, and
tumorigenesis. British Journal of Cancer. vol 94, pp 776 – 780.
Isakoff M.S., Bielack S.S., Meltzer P. et al.(2015). Osteosarcoma: Current Treatment and
a Collaborative Pathway to Success. J Clin Oncol. Vol 33, n 27, pp 3029-35. doi: 10.1200/
JCO.2014.59.4895
Islam, M., Datta, J., Lang, J. et al. (2014).Down regulation of RhoC by microRNA-138 results in
de-activation of FAK, Src and Erk1/2 signaling pathway in head and neck squamous cell carcinoma.
Oral Oncol. Vol 50, n 5, pp 448–456. doi:10.1016
Jang, J.S., Jeon, H., Sun, Z., et al. (2012). Increased miR-708 Expression in NSCLC and Its
Association with Poor Survival in Lung Adenocarcinoma from Never Smokers. Clin Cancer Res. vol 18,
n 13, pp 3658–3667, DOI:10.1158/1078-0432.CCR-11-2857.
Jiang, L., Liu, X., Kolokythas, A. et al. (2010). Down-regulation of the Rho GTPase signaling
pathway is involved in the microRNA-138 mediated inhibition of cell migration and invasion in tongue
squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. Vol 127, n
3, pp 505–512. http://doi.org/10.1002/ijc.25320
__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
72
Jiang, L., Liu, X., Kolokythas, A., et al. (2010). Down-regulation of the Rho GTPase signaling
pathway is involved in the microRNA-138 mediated inhibition of cell migration and invasion in tongue
squamous cell carcinoma. Int J Cancer. vol 127, n 3, pp 505–512, DOI:10.1002/ijc.25320.
Kamai, T., Tsujii, T., Arai,K., et al.(2003). Significant Association of Rho/ROCK Pathway with
Invasion and Metastasis of Bladder Cancer. Clin Cancer Res. vol 9, pp 2632-2641.
Kartsogiannis, V. & Wah Ng, K. (2004). Cell lines and primary cell cultures in the study of bone
cell biology. Molecular and Cellular Endocrinology. Vol 228, pp 79–102.
Kempf-Bielack,B.K., Bielack, S.S, Ju¨rgens, H., et al. (2005). Osteossarcoma Relapse After
Combined Modality Therapy: An Analysis of Unselected Patients in the Cooperative Osteossarcoma
Study Group (COSS). J Clin Oncol. vol 23, pp 559-568, DOI: 10.1200/JCO.2005.04.063.
Kong, Y.W., Ferland-McCollough,d., Jackson, T.J., Bushell, M. (2012). microRNAs in cancer
management. Lancet Oncol. vol 13, pp 249–58.
Kosako, H., Yoshida, T., Matsumura, F., et al. (2000). Rho-kinase/ROCK is involved in
cytokinesis through the phosphorylation of myosin light chain and not ezrin/radixin/moesin proteins
at the cleavage furrow. Oncogene. vol 19,pp 6059-6064.
Krishnan, K., Steptoe, A. L., Martin, H. C et al. (2013). miR-139-5p is a regulator of metastatic
pathways in breast cancer. RNA, 19(12), 1767–1780. doi:10.1261/rna.042143.113
Kroiss A., Vincent S., Decaussin-Petrucci M. et al. (2015). Androgen-regulated microRNA-
135a decreases prostate cancer cell migration and invasion through
downregulating ROCK1 and ROCK2. Oncogene. vol 34, n 22, pp 2846-55. doi: 10.1038/onc.2014.222
Kumar, S. (2012). Cell-Extracellular Matrix Mechanobiology in Cancer. Elsevier B.V. pp 143-
155.
Lan, H., Lu, H., Wang, X., & Jin, H. (2015). MicroRNAs as Potential Biomarkers in Cancer:
Opportunities and Challenges. BioMed Research International. 125094.
http://doi.org/10.1155/2015/125094
Lane J., Martin T., Weeks H.P. et al. (2014).
Structure and role of WASP and WAVE in Rho GTPase signalling in cancer. Cancer Genomics
Proteomics. Vol 11, n 3, pp 155-65.
Lane, J., Martin, T.A., Watkins, G., et al. (2008). The expression and prognostic value of ROCK
I and ROCK II and their role in human breast cancer. International Journal Of Oncology. vol 33, pp
585-593, DOI: 10.3892/ijo_00000044.
Lei, SL., Zhaou, H., Yao, H.L., et al. (2014). Regulatory roles of microRNA-708 and microRNA-
31 in proliferation, apoptosis and invasion of colorectal cancer cells. Oncology Letters. Vol 8, pp
1768-1774.
__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
73
Lei, SL., Zhaou, H., Yao, H.L., et al. (2014). Regulatory roles of microRNA-708 and microRNA-
31 in proliferation, apoptosis and invasion of colorectal cancer cells. Oncology Letters. Vol 8, pp
1768-1774.
Li G., Yang F., Xu H. et al. (2015). MicroRNA-708 is downregulated in hepatocellular
carcinoma and suppresses tumor invasion and migration. Biomed Pharmacother. Vol 73, pp 154-9.
doi: 10.1016/j.biopha.2015.05.010.
Li, N., Tang, A., Huang, S. et al. (2013). MiR-126 suppresses colon cancer cell proliferation and
invasion via inhibiting RhoA/ROCK signaling pathway. Mol Cell Biochem. vol 380, pp 107–119, DOI
10.1007/s11010-013-1664-0.
Li, X., Shi, Y., Yin, Z.et al. (2014). An eight-miRNA signature as a potential biomarker for
predicting survival in lung adenocarcinoma. Journal of Translational Medicine, 12, 159.
doi:10.1186/1479-5876-12-159
Li, Y., Zhang, M., Chen, H., et al. (2010). Ratio of miR-196s to HOXC8 mRNA Correlates with
Breast Cancer Cell Migration and Metastasis. Cancer Res. vol 70, n 20, pp 7894–7904,
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-1675.
Liang, C., Park A. & Guan, J. (2007). In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive
method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. Vol 2, n 2, pp 329-33.
Lim L.P., Lau N.C., Garrett-Engele P. Microarray analysis shows that
some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. Vol 433, n 7027, pp769-73.
Lin, C. H., Guo, Y., Ghaffar, S., McQueen, P., Pourmorady, J., Christ, A., … Hoang, B. H. (2013).
Dkk-3, a Secreted Wnt Antagonist, Suppresses Tumorigenic Potential and Pulmonary Metastasis in
Osteosarcoma. Sarcoma,2013, 147541. http://doi.org/10.1155/2013/147541
Lin, K., Yeh, Y., Chuang, C., et al. (2015). Glucocorticoids mediate induction of microRNA-708
to suppress ovarian cancer metastasis through targeting Rap1B.Nat Commun.;6:5917. doi:
10.1038/ncomms6917.
Lin, K.-T., Yeh, Y.-M., Chuang, C.-M., Yang, S. Y., Chang, J.-W., Sun, S.-P., … Wang, L.-H. (2015).
Glucocorticoids mediate induction of microRNA-708 to suppress ovarian cancer metastasis through
targeting Rap1B. Nature Communications. Vol 6, 5917. http://doi.org/10.1038/ncomms6917
Lin, S., Chiang, A., Chang, D., Ying, S. (2008). Loss Of Mir-146a Function In Hormone-
Refractory Prostate Câncer. Rna. Vol 14, pp 417–424.
Liu, X., Choy, E., Hornicek, F.J., et al. (2011). ROCK1 as a Potential Therapeutic Target in
Osteossarcoma. Journal Of Orthopaedic Research August, pp 1259-1266.
Liu, X., Choy, E., Hornicek, F.J., et al. (2011). ROCK1 as a Potential Therapeutic Target in
Osteossarcoma. Journal Of Orthopaedic Research August, pp 1259-1266.
__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
74
Liu, X., Wang, C., Chen, Z. et al. (2011). MicroRNA-138 suppresses epithelial–mesenchymal
transition in squamous cell carcinoma cell lines. Biochemical Journal. Vol 440, n 1, pp 23–31.
http://doi.org/10.1042/BJ20111006
Lopez-Camarillo, C., Marchat, L. A., Arechaga-Ocampo, E., et al. (2012). MetastamiRs: Non-
Coding MicroRNAs Driving Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular
Sciences.Vol 13, n 2, pp 1347–1379. http://doi.org/10.3390/ijms13021347
Lu J., Getz G., Miska E.A. et al. (2005). MicroRNA expression profiles classify human cancers.
Nature. Vol 435, n 7043, pp 834-8.
Lu, P., Weaver, V.M., Werb, Z. (2012). The extracellular matrix: A dynamic niche in cancer
progression. J. Cell Biol. Vol. 196, n 4, pp 395–406, DOI:10.1083/jcb.201102147.
Lu, Y.C., Chang, J. T., Liao, C.-T., et al. (2014). OncomiR-196 promotes an invasive phenotype
in oral cancer through the NME4-JNK-TIMP1-MMP signaling pathway. Molecular Cancer. Vol 13,n
218. http://doi.org/10.1186/1476-4598-13-218
Ma, Y., Ren, Y., Han, E. Q., Li, H., Chen, D., Jacobs, J. J., … Li, T.-F. (2013). Inhibition of the
Wnt-β-catenin and Notch signaling pathways sensitizes osteosarcoma cells to
chemotherapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. Vol 431, n 2, pp 274–279.
http://doi.org/10.1016/j.bbrc.2012.12.118
Manikandan, J., Aarthi1, J.J., Kumar, S.D., Pushparaj, P.N. (2008). Oncomirs: The potential
role of non-coding microRNAs in understa nding cancer. Bioinformation, Vol 2, n 8, pp 330-334.
Matsumura, F. (2005). Regulation of myosin II during cytokinesis in higher eukaryotes. Trends
in Cell Biology Vol 15, n 7, pp 371-377.
McGrail, D. J., Kieu, Q. M. N., & Dawson, M. R. (2014). The malignancy of metastatic ovarian
cancer cells is increased on soft matrices through a mechanosensitive Rho–ROCK pathway. Journal of
Cell Science, vol 127, n 12, pp 2621–2626. doi:10.1242/jcs.144378
Mertsch, S. & Thanos, S. (2013). Opposing Signaling of ROCK1 and ROCK2 Determines the
Switching of Substrate Specificity and the Mode of Migration of Glioblastoma Cells. Mol Neurobiol.
DOI: 10.1007/s12035-013-8568-6.
Mertsch, S., & Thanos, S. (2014). Opposing Signaling of ROCK1 and ROCK2 Determines the
Switching of Substrate Specificity and the Mode of Migration of Glioblastoma Cells. Molecular
Neurobiology, vol 49, n 2, pp 900–915. doi:10.1007/s12035-013-8568-6
Miao J.H., Wang S.Q., Zhang M.H. et al. (2014). Knockdown of galectin-
1 suppresses the growth and invasion of osteosarcoma cells through inhibition of the
MAPK/ERK pathway. Oncol Rep. Vol 32, n 4, pp 1497-504. doi: 10.3892/or.2014.3358.
__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
75
Mo, J.-S., Alam, K. J., Kang, I.-H. et al. (2015). MicroRNA 196B regulates FAS-mediated
apoptosis in colorectal cancer cells. Oncotarget, 6(5), 2843–2855
Morgan-Fisher, M., Wewer, U.M., Yoneda, A. (2013). Regulation of ROCK Activity in Cancer.
Journal of Histochemistry & Cytochemistry. vol 61, n 3, pp 185–198. DOI:
10.1369/0022155412470834.
Nakagawa, O., Fujisawa, K., Ishizaki, T., et al. (1996). ROCK-I and ROCK-II, two isoforms of
Rho-associated coiled-coil forming protein serine/threonine kinase in mice. Federation of European
Biochemical Societies Letters. Vol 392, pp 189-193.
Oku,Y., Tareyanagi, C., Takaya, S. et al. (2014). Multimodal Effects of Small Molecule ROCK
and LIMK Inhibitors on Mitosis, and Their Implication as Anti- Leukemia Agents. PLoS ONE. vol 9, n
3,DOI:10.1371/journal.pone.0092402Ottaviani & Jaffe, 2009
Oku,Y., Tareyanagi, C., Takaya, S. et al. (2014). Multimodal Effects of Small Molecule ROCK
and LIMK Inhibitors on Mitosis, and Their Implication as Anti- Leukemia Agents. PLoS ONE vol 9, n
3,DOI:10.1371/journal.pone.0092402
Ottaviani G. & Jaffe N. (2009). The epidemiology of osteosarcoma. Cancer Treat Res. Vol 152,
pp 3-13. doi: 10.1007/978-1-4419-0284-9_1.
Pignot G., Cizeron-Clairac G., Vacher S. et al. (2013). microRNA expression profile in
a large series of bladder tumors: identification of a 3-miRNA signature
associated with aggressiveness of muscle-invasive bladder cancer. Int J Cancer. Vol 132, n 11, pp
2479-91. doi: 10.1002/ijc.27949.
Pizzini, S., Bisognin, A., Mandruzzato, S., et al. (2013). Impact of microRNAs on regulatory
networks and pathways in human colorectal carcinogenesis and development of metastasis . BMC
Genomics, 14:589.
Qiu,G., Lin, Y., Zhang, H. et al. (2015). miR-139-5p inhibits epithelialemesenchymal transition,
migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells by targeting ZEB1 and ZEB2. Biochemical
and Biophysical Research Communications, 1-7.
Rivera-Valentin R. K., Zhu, L.,Hughes, D.P.M. (2015). Bone Sarcomas in Pediatrics: Progress in
Our Understanding of Tumor Biology and Implications for Therapy. Pediatr Drugs. vol 17, pp 257–
271. DOI 10.1007/s40272-015-0134-4
Rubio R., Abarrategi A., Garcia-Castro J. et al. (2014).
Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem
cells. Stem Cells. Vol 32, n 5, PP 1136-48. doi: 10.1002/stem.1647.
Rubio R., García-Castro J., Gutiérrez-Aranda I. et al (2010). Deficiency in p53 but not
retinoblastoma induces the transformation of mesenchymal stem cells in vitro and initiates
__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
76
leiomyosarcoma in vivo. Cancer Res. Vol 70, n 10, pp 4185-94. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-
4640.
Rubio R., Gutierrez-Aranda I., Sáez-Castillo AI. El al (2013). The differentiation stage of p53-
Rb-deficient bone marrow mesenchymal stem cells imposes the phenotype of in
vivo sarcoma development. Oncogene. Vol 32, n 41, pp 4970-80. doi: 10.1038/onc.2012.507.
Ryu, S., McDonnell, K., Choi, H., et al. (2013). Suppression of miRNA-708 by Polycomb Group
Promotes Metastases by Calcium-Induced Cell Migration. Cancer Cell. vol 23, pp 63–76, DOI:
10.1016/j.ccr.2012.11.019.
Sadok, A., & Marshall, C. J. (2014). Rho GTPases: Masters of cell migration.Small GTPases.
Vol 5, e29710. http://doi.org/10.4161/sgtp.29710
Sadok, A., McCarthy, A., Caldwell, J. et al. (2015). Rho kinase inhibitors block melanoma cell
migration and inhibit metastasis. Cancer Res. Vol 75, n 11, pp 2272-84. doi: 10.1158/0008-5472
Sahai, E. & Marshall, C.J. (2003). Differing modes of tumour cell invasion have distinct
requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nature Cell Biology Vol 5, n 8, pp
711-719.
Saini, S., Yamamura, S., Majid, S., et al. (2011). MicroRNA-708 induces apoptosis and
suppresses tumorigenicity in renal cancer cells. Cancer Res. vol 71, n 19, pp 6208–6219,
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-11-0073.
Saini, S., Yamamura, S., Majid, S., et al. (2011). MicroRNA-708 induces apoptosis and
suppresses tumorigenicity in renal cancer cells. Cancer Res, vol 71, No 19, pp 6208–6219,
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-11-0073.
Saito M., Shiraishi K., Matsumoto K. et al. (2014). A three-microRNA signature predicts
responses to platinum-based doublet chemotherapy in patients with lung adenocarcinoma. Clin
Cancer Res. Vol 20, n 18, pp 4784-93. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-14-1096.
Sasaki K., Hitora T., Nakamura O. et al. (2011). The role of MAPK pathway in bone and soft
tissue tumors. Anticancer Res. Vol 31, n 2, pp 549-53.
Scott R.W. & Olson M.F. (2007). LIM kinases: function, regulation and association with human
disease. J Mol Med (Berl). Vol 85, n 6, pp 555-68.
Shen K., Mao R., Ma L., et al. (2014) A. Post-transcriptional regulation of
the tumor suppressor miR-139-5p and a network of miR-139-5p-mediated
mRNA interactions in colorectal cancer. FEBS J. Vol 281, n 16, pp 3609-24. doi: 10.1111/febs.12880
Shen, L., Wang, P., Yang, J., & Li, X. (2014). MicroRNA-217 Regulates WASF3 Expression and
Suppresses Tumor Growth and Metastasis in Osteosarcoma. PLoS ONE, 9(10), e109138.
http://doi.org/10.1371/journal.pone.0109138
__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
77
Slobodan Vukicevic, S., Kleinman,H.K., Luyten,F.P.,et al.(1992). Identification of multiple
active growth factors in basement membrane matrigel suggests caution in interpretation of cellular
activity related to extracellular matrix components. Experimental Cell Research. Vol 202, n 1,pp 1-8.
http://dx.doi.org/10.1016/0014-4827(92)90397-Q.
Song , T. Zhang , X., Zhang , L., et al. (2013). miR-708 promotes the development of bladder
carcinoma via direct repression of Caspase-2. J Cancer Res Clin Oncol. Vol 139, pp 1189–1198, DOI:
10.1007/s00432-013-1392-6.
Song , T. Zhang , X., Zhang , L., et al. (2013). miR-708 promotes the development of bladder
carcinoma via direct repression of Caspase-2. J Cancer Res Clin Oncol, vol 139, pp 1189–1198, DOI:
10.1007/s00432-013-1392-6.
Steliarova-Foucher, E., Stilller, C., Lacour, B., Kaatsch, P. (2005) Classificação Internacional do
Câncer na Infância, Terceira Edição. American Cancer Society. DOI 10.1002/cncr.20910.
Stiles,J.M., Kurisetty,V., Mitchell, D.C. et al.(2013). Rho Kinase Proteins Regulate Global
miRNA Expression in Endothelial Cells.CANCER GENOMICS & PROTEOMICS. Vol 10, pp 251-264
Street, C.A. & Bryan, B.A. (2011). Rho Kinase Proteins—Pleiotropic Modulators of Cell Survival
and Apoptosis. Anticancer Research. Vol 3, pp 3645-3658.
Sun X.H., Geng X.L., Zhang J. et al. (2014). miRNA-
646 suppresses osteosarcoma cell metastasis by downregulating fibroblast growth factor 2 (FGF2).
Tumor Biol. Vol 36, n 3, pp2127-34. DOI 10.1007/s13277-014-2822-z
Takeba, Y., Matsumoto, N., Watanabe, N. et al. (2012). The Rho kinase inhibitor fasudil is
involved in p53-mediated apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells. Cancer Chemother
Pharmacol. Vol 69, pp 1545–1555, DOI: 10.1007/s00280-012-1862-6.
Takenawa T. & Miki H. (2001).
WASP and WAVE family proteins: key molecules for rapid rearrangement of cortical actin filaments
and cell movement. J Cell Sci. Vol 114, n 10, pp 1801-9.
Tesser-Gamba F., Lopes L.J., Petrilli A.S. et al. (2015).
MAPK7 gene controls proliferation, migration and cell invasion in osteosarcoma. Mol Carcinog. doi:
10.1002/mc.22420.
Ueno, K., Hirata, H., Shahryari, V., et al. (2011). Tumour suppressor microRNA-584 directly
targets oncogene Rock-1 and decreases invasion ability in human clear cell renal cell carcinoma.
British Journal of Cancer. Vol 104,pp 308 – 315.
Ueno, K., Hirata, H., Shahryari, V., et al. (2011). Tumour suppressor microRNA-584 directly
targets oncogene Rock-1 and decreases invasion ability in human clear cell renal cell carcinoma.
British Journal of Cancer. Vol 104,pp 308 – 315.
__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
78
Ueno, K., Hirata, H., Shahryari, V., et al. (2011). Tumour suppressor microRNA-584 directly
targets oncogene Rock-1 and decreases invasion ability in human clear cell renal cell carcinoma.
British Journal of Cancer , vol 104,pp 308 – 315.
Van Schooneveld, E., Wouters, M. C., Van der Auwera, I., et al. (2012). Expression profiling of
cancerous and normal breast tissues identifies microRNAs that are differentially expressed in serum
from patients with (metastatic) breast cancer and healthy volunteers. Breast Cancer Research :
BCR, 14(1), R34. http://doi.org/10.1186/bcr3127
Wang Y., Zhao W. & Fu Q. (2013). miR-
335 suppresses migration and invasion by targeting ROCK1 in osteosarcoma cells. Mol Cell
Biochem. Vol 384, n 1-2, pp 105-11. doi: 10.1007/s11010-013-1786-4
Wang, W., Zhou, X., & Wei, M. (2015). MicroRNA-144 suppresses osteossarcoma growth and
metastasis by targeting ROCK1 and ROCK2.Oncotarget. Vol 6, n 12, pp 10297–10308.
Wang, W., Zhou, X., & Wei, M. (2015). MicroRNA-144 suppresses osteossarcoma growth and
metastasis by targeting ROCK1 and ROCK2.Oncotarget. Vol 6, n 12, pp 10297–10308.
Wang, W., Zhou, X., & Wei, M. (2015). MicroRNA-144 suppresses osteossarcoma growth and
metastasis by targeting ROCK1 and ROCK2.Oncotarget, vol 6,n 12, pp 10297–10308
Wang, X.-P., Deng, X.-L., & Li, L.-Y. (2014). MicroRNA-584 functions as a tumor suppressor
and targets PTTG1IP in glioma. International Journal of Clinical and Experimental Pathology, 7(12),
8573–8582.
Wittig, J.C., Bickels, J., Priebat, D. et al. (2002). Osteossarcoma: A Multidisciplinary Approach
to Diagnosis and Treatment. American Family Physician. Vol 65, n 6.
Wolf, K., Mazo, I., Leung, H. et al. (2003). Compensation mechanism in tumor cell migration:
mesenchymal–amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. The Journal of Cell
Biology. Vol 160, n 2, pp 267–277, DOI:10.1083/jcb.200209006.
Wong, C.C., Wong, C. Tung, E. K., Et Al. (2011). The Microrna Mir-139 Suppresses Metastasis
And Progression Of Hepatocellular Carcinoma By Down-Regulating Rho-Kinase 2. Gastroenterology,
Vol 140, pp 322–331, Doi:10.1053/J.Gastro.2010.10.006.
Wong, C.C., Wong, C. Tung, E. K., Et Al. (2011). The Microrna Mir-139 Suppresses Metastasis
And Progression Of Hepatocellular Carcinoma By Down-Regulating Rho-Kinase 2. Gastroenterology.
Vol 140, pp322–331, Doi:10.1053/J.Gastro.2010.10.006.
Wu, L., Fan, J., & Belasco, J. G. (2006). MicroRNAs direct rapid deadenylation of
mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(11),
4034–4039. http://doi.org/10.1073/pnas.0510928103
__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
79
Wu,Y, Tang,Y., Li, Z. et al. (2013). Expression and significance of Rac1, Pak1 and Rock1 in
gastric carcinoma. Asia_Pacific Journal of Clinical Oncology, DOI: 10.1111/ajco.12052.
Wu,Y, Tang,Y., Li, Z. et al. (2013). Expression and significance of Rac1, Pak1 and Rock1 in
gastric carcinoma. Asia_Pacific Journal of Clinical Oncology, DOI: 10.1111/ajco.12052.
Wyckoff J.B., Pinner S.E., Gschmeissner S. et al. (2006). ROCK- and myosin-
dependent matrix deformation enables protease-independent tumor-cell invasion in vivo. Curr Biol.
Vol 16, n 15, pp 1515-23.
Xu, N., Li, Z., Yu, Z., et al.. (2014). MicroRNA-33b Suppresses Migration and Invasion by
Targeting c-Myc in Osteosarcoma Cells. PLoS ONE. vol 9, n 12. e115300.
http://doi.org/10.1371/journal.pone.0115300
Xu, W., Hang, M., Yuan, C.-Y. et al. (2015). MicroRNA-139-5p inhibits cell proliferation and
invasion by targeting insulin-like growth factor 1 receptor in human non-small cell lung
cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. Vol 8, n 4, pp 3864–3870.
Yamaguchi H., Kasa M., Amano M. et al.(2006). Molecular mechanism for
the regulation of rho-kinase by dimerization and its inhibition by fasudil. Structure. Vol 14, n 3, pp
589-600.
Yamasaki, T., Seki, N., Yamada, Y., Et Al. (2012). Tumor Suppressive Microrna-138 Contributes
To Cell Migrationand Invasion Through Its Targeting Of Vimentinin Renal Cell Carcinoma.
International Journal Of Oncology, Vol 41, Pp 805-817, Doi: 10.3892/Ijo.2012.1543
Yan, K., Gao, J., Yang, T., et al. (2012). MicroRNA-34a Inhibits the Proliferation and Metastasis
of Osteosarcoma Cells Both In Vitro and In Vivo. PLoS ONE. Vol 7, n 3, e33778.
http://doi.org/10.1371/journal.pone.0033778
Yang H., Tang Y., Guo W. et al (2014). Up-regulation of microRNA-138 induce
radiosensitization in lung cancer cells. Tumour Biol. Vol 35, n 7, pp 6557-65. doi: 10.1007/s13277-
014-1879-z.
Yang, X., Di, J., Zhang, Y. et al. (2012). The Rho-kinase inhibitor inhibits proliferation and
metastasis of small cell lung cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. Vol 66, pp 221–227,
DOI:10.1016/j.biopha.2011.11.011.
Yoneda,A., Multhaupt,H.A.B., Couchman, J.R. (2005). The Rho kinases I and II regulate
different aspects of myosin II activity. The Journal of Cell Biology. Vol. 170, n 3, pp 443–453,
DOI:10.1083/jcb.200412043.
Yoshikawa, T., Wu, J., Otsuka, M., et al. (2015). ROCK inhibition enhances microRNA function
by promoting deadenylation of targeted mRNAs via increasing PAIP2 expression. Nucleic Acids
Research. Vol 43, n 15, 7577–7589. http://doi.org/10.1093/nar/gkv728
__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
80
Young A., Lyons J., Miller A.L. et al. (2009). Ras signaling and therapies. Adv Cancer Res. Vol
102, pp 1-17. doi: 10.1016/S0065-230X(09)02001-6.
Yu, C., Wang, M., Li, Z. et al. (2015). MicroRNA-138-5p regulates pancreatic cancer cell
growth through targeting FOXC1. Cellular Oncology (Dordrecht). Vol 38, n 3, pp 173–181.
doi:10.1007/s13402-014-0200-x
Zhang, B., Pan, X., Cobb, G.P., Anderson, T.A. (2007). microRNAs as oncogenes and tumor
suppressors. Developmental Biology. Vol 302, pp 1–12, DOI:10.1016/j.ydbio.2006.08.028.
Zhang, C., Yao, C., Li, H., et al. (2014) B. Combined Elevation ofmicroRNA-196a and
microRNA-196b in Sera Predicts Unfavorable Prognosis in Patients with Osteossarcomas.
International Journal of Molecular Sciences,15(4), 6544–6555. doi:10.3390/ijms15046544
Zhang, J., Yan, Y, Wang, C. et al. (2015). MicroRNAs in osteossarcoma. Clinica Chimica Acta
vol 444, pp 9–17
Zhang, L., Dong, Y., Zhu, N., et al. (2014) A. microRNA-139-5p exerts tumor suppressor
function by targeting NOTCH1 in colorectal cancer. Molecular Cancer, 13, 124. doi:10.1186/1476-
4598-13-124
Zhang, Y., Tang, Y. J., Li, Z. H., Pan, F., Huang, K., & Xu, G. H. (2013). KiSS1 Inhibits Growth and
Invasion of Osteosarcoma Cells through Inhibition of the MAPK Pathway. European Journal of
Histochemistry : EJH. Vol 57, n 4, e30. http://doi.org/10.4081/ejh.2013.e30
Zhao H., Ma B., Wang Y., et al. (2013). miR-34a inhibits the metastasis of osteosarcoma
cells by repressing the expression of CD44. Oncology Reports. Vol 29, pp 1027-1036.
Zheng, F., Liao, Y., Cai, M. et al.(2012). The putative tumour suppressor microRNA-124
modulates hepatocellular carcinoma cell aggressiveness by repressing ROCK2 and EZH2. Gut. Vol 61,
pp278-289, DOI:10.1136/gut.2011.239145.
Zhou, x., Wei, M., Wang, W. (2013). MicroRNA-340 suppresses osteossarcoma tumor growth
and metastasis by directly targeting ROCK1. Biochemical and Biophysical Research Communications.
Vol 437, pp 653–658, DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.07.033.
Zucchini, C., Manara, M., Pinca, R.S., et al.(2013). CD99 suppresses osteossarcoma cell
migrateon through inhibition of ROCK2 activity. Oncogene. pp 1–10.
Apêndices
_______________________ ____________________________________________________APÊNDICE
82
Apêndice A
Tabela com resumo dos dados dos pacientes cuja amostra tumoral foi coletada para análise no
presente trabalho. ID,indentidade; F, feminino; M, masculino; R, realizada; N.R., não realizada.
ID Idade Gênero Etnia Diagnóstico Malignidade
pré-QT
1 21 F Branca OS Parosteal Justa-cortical não informado
2 12 F Branca OS Convencional Grau 4
3 18 M Branco OS Convencional Central Grau 3
4 24 M Branco OS Condroblástico Grau 2
5 15 M Branco OS Convencional Condroblástico Intramedular Alto Grau
6 10 F Branca OS Paraosteal Grau 1
7 12 F Branca OS Central Convencional Alto Grau
8 13 M Negro OS Osteoblástico Central Convencional Grau 3
9 13 M Mulato OS Osteoblástico Convencional Grau 3
10 12 F Branca OS Osteoblástico Grau 3
11 15 F Mulato OS Osteoblástico Convencional Grau 2
12 18 F Negra OS Baixo Grau
13 11 M Branco OS Convencional Grau 3
14 21 F Branca OS Paraosteal Grau 1
15 26 F Mulata OS Condroblástico Central Alto Grau
pós-QT
16 16 F Branca OS Clássico Central Grau 3
17 13 F Branca OS Condroblástico Grau 3
18 66 M Branco OS Central Convencional não informado
19 17 F Branca OS Osteoblástico Grau 3
20 12 M Branco OS Clássico Osteoblástico Grau 3
21 57 F Branca OS Central Clássico Osteoblástico Grau 2
22 21 M Branco OS Clássico Intramedular Grau 2
3
23 9 F Branca OS Convencional Condroblástico Grau 3
24 15 F Branca OS Convencional Central Grau 2
25 16 M Branco OS Central Condroblástico Grau 3
26 20 M Branco OS Condroblástico Central Convencional Grau 3
8
27 21 M Mulato OS Central Osteoblástico não informado
28 18 F Branca OS Osteoblástico Medular Grau 3
29 28 M Branco OS Osteoblástico Central Grau 3
30 15 M Branco OS Convencional Grau 3
Metástase 30 Metástase de OS Condroblástico
Recidiva 31 36 F Branca OS Parosteal Extracompartimental não informado
12 OS Paraosteal Recidivado
_______________________ ____________________________________________________APÊNDICE
83
Apêndice A - Continuação
ID Volume ao diagnóstico
Localização Amputação HUVOS
pré-QT
1 401,76 Fêmur Direito N.R. não recebeu quimioterapia
2 1393,92 Fêmur Esquerdo N.R. não informado
3 865,92 Fêmur Esquerdo R. Grau 2
4 82,5 Tíbia Direita R. amputação ao diagnóstico
5 255,474 Tornozelo R. amputação ao diagnóstico
6 não informado Tíbia Esquerda N.R. retirada cirurgica ao diagnóstico
7 221,858 Fíbula Direita N.R. Grau 2
8 432 Fêmur Direito N.R. Grau 1
9 486 Fêmur Esquerdo N.R. Grau 4
10 651,776 Fêmur Direito N.R. Grau 1
11 455 Joelho Esquerdo N.R. Grau 3
12 465,108 Fêmur Esquerdo N.R. Grau 1
13 396,171 Fêmur Esquerdo N.R. Grau 2
14 não informado Fêmur Direito N.R. não informado
15 não informado Asa Ilíaca Esquerda N.R. não informado
pós-QT
16 não informado Tíbia Direita N.R. Grau 2
17 não informado Tíbia e Fibula Esquerda N.R. Grau 2
18 90,651 Fêmur Esquerdo N.R. não informado
19 não informado Fêmur Esquerdo e Joelho N.R. Grau 2
20 não informado Fêmur Direito N.R. Grau 2
21 não informado Clavícula Direita N.R. não recebeu quimioterapia
22 1391,94 Fêmur Direito N.R. Grau 2
3
23 não informado Tíbia e Fibula Esquerda N.R. Grau 2
24 não informado Fêmur Direito N.R. Grau 2
25 não informado Tíbia Esquerda R. amputação ao diagnóstico
26 não informado Fêmur Esquerdo R. amputação ao diagnóstico
8
27 764,4 Fíbula Esquerda N.R. Grau 3
28 não informado Fêmur Direito N.R. Grau 2
29 568,905 Fêmur Esquerdo N.R. Grau 1
30 não informado Fêmur Esquerdo N.R. Grau 3
Metástase 30 Parênquima Pulmonar Lobo Inferior Esquerdo
Recidiva 31 não informado Tíbia Direita N.R. não informado
12 Fossa Poplítea Esquerda
_______________________ ____________________________________________________APÊNDICE
84
Apêndice A - Continuação
ID Metástase Recidiva Status
Sobrevida Global (meses)
pré-QT
1 Ausente Ausente Sem Informações Atuais
2 Pulmonar, Esternal, Hepática Ausente Óbito 6
3 Pulmonar Ausente Óbito 28
4 Ausente Presente Sem Doença 57
5 Ausente Ausente Sem Doença 67
6 Pulmonar Ausente Sem Doença 65
7 Pulmonar Ausente Óbito 24
8 Pulmonar e Coluna Ausente Óbito 39
9 Pulmonar Ausente Sem Doença 46
10 Linfonodos das Cadeias
Inguinais e Poplíteas Ausente Óbito 12
11 Ausente Ausente Sem Doença 30
12 Ausente Presente Sem Doença 22
13 Pulmonar Ausente Sem Doença 25
14 Ausente Presente Sem Doença 17
15 Ausente Ausente Perda de Seguimento (Paliativo)
pós-QT
16 Tecido Muscular Esquelético e
Pulmonar Presente Óbito
34
17 Ausente Ausente Sem Doença 103
18 Ausente Ausente Óbito 12
19 Epífise Tibial e Pulmonar Ausente Óbito 12
20 Pulmonar Ausente Óbito 20
21 Ausente Ausente Sem Doença 12
22 Pulmonar Ausente Óbito 8
3
23 Pulmonar Ausente Viva Sem Informação 27
24 Pulmonar e Encefálica não informado Sem Informações Atuais
25 Ausente Ausente Vivo Sem Informação 1
26 Ausente Ausente Sem Doença 22
8
27 Ausente Ausente Sem Informações Atuais
28 Pulmonar Ausente Óbito 19
29 Ausente Ausente Sem Doença 30
30 Pulmonar Ausente Com Doença 28
Metástase 30
Recidiva 31 Ausente Presente Sem Doença 67
12
_______________________ ____________________________________________________APÊNDICE
85
Apêndice B
Tabela com resumos das expressões dos genes ROCK1 e ROCK2 e miRNAs associados: miR-138, miR-
139, miR-196b, miR-584 e miR-708 em amostras de ossos não neoplásicos, amostras de OS pré-QT,
pós-QT e linhagens celulares de OS.
Grupos Genes n Média Desvio Padrão Mínima Máxima
Percentis
25% 50%
(mediana) 75%
Osso N
ão
Neop
lásic
o
ROCK1 6 1,10 0,28 0,81 1,50 0,81 1,08 1,38
ROCK2 6 1,26 0,92 0,54 3,01 0,69 0,88 1,89
miR138 6 0,38 0,33 0,09 0,84 0,14 0,23 0,79
miR139 6 10,45 6,62 2,47 21,90 4,87 10,61 14,03
miR196b 6 79,92 70,51 14,27 210,86 32,48 56,62 129,67
miR584 6 1,06 1,47 0,03 3,64 0,03 0,32 2,45
miR708 6 0,82 0,38 0,39 1,42 0,55 0,69 1,21
pré
-QT
ROCK1 15 0,63 0,35 0,17 1,47 0,39 0,57 0,97
ROCK2 15 2,07 1,53 0,54 5,96 0,90 1,52 2,92
miR138 14 2,44 2,87 0,27 9,06 0,50 1,50 2,88
miR139 14 2,13 2,67 0,35 11,10 0,99 1,36 2,20
miR196b 14 54,73 40,81 14,45 124,45 19,03 39,75 99,74
miR584 14 0,13 0,29 0,00 1,11 0,01 0,06 0,08
miR708 14 0,35 0,37 0,06 1,45 0,11 0,24 0,43
pós-Q
T
ROCK1 17 ,58 ,21 ,29 ,96 ,42 ,55 ,76
ROCK2 17 2,41 1,88 ,42 6,92 1,15 1,72 2,73
miR138 17 2,81 3,25 ,11 10,24 ,48 1,78 3,88
miR139 17 2,88 2,79 ,54 10,42 ,98 1,49 4,32
miR196b 17 42,90 19,19 18,44 72,67 26,90 37,99 62,36
miR584 17 ,24 ,54 ,00 1,96 ,00 ,02 ,15
miR708 17 ,24 ,16 ,07 ,52 ,10 ,14 ,36
Lin
hag
ens C
elu
lare
s
ROCK1 3 2,29 2,12 0,99 4,74 0,99 1,15 4,74
ROCK2 3 0,90 0,66 0,36 1,63 0,36 0,71 1,63
miR138 3 15,38 21,99 0,36 40,61 0,36 5,16 40,61
miR139 3 0,16 0,10 0,04 0,22 0,04 0,21 0,22
miR196b 3 75,73 23,48 48,81 91,97 48,81 86,40 91,97
miR584 3 1,11 1,23 0,00 2,43 0,00 0,90 2,43
miR708 3 0,03 0,03 0,01 0,07 0,01 0,02 0,07
Anexo
____________________________________________________________________________ANEXO
87
Anexo A
Tabela com perfis de STR apresentados pela ATCC e encontrados na análise das linhagens utilizadas
no presente trabalho, sendo elas HOS, MG-63 e SAOS-2 não transduzidas (N.T.), Vetor vazio (V.V.) e
miR-708.
Linhagens Perfil STR
CSF1PO D13S317 D16S539 D5S818 D7S820 THO1 TPOX vWA
HOS
Ref ATCC 12 12 10;13 13 11;12 6 8;11 18
HOS N.T. 12 12 10;13 13 11;12 6 8;11 18
HOS V.V. 12 12 10;13 13 11;12 6 8;11 18
HOS miR-708 12 12 10;13 13 11;12 6 8;11 18
MG-63
Ref ATCC 10;12 11 11 11;12 10 9.3 8;11 16;19
MG-63 N.T. 10;12 11 11 11;12 10 9.3 8;11 16;19
MG-63 V.V. 10;12 11 11 11;12 10 9.3 8;11 16;19
MG-63 miR-708 10;12 11 11 11;12 10 9.3 8;11 16;19
SAOS-2
Ref ATCC 10 12;13 12;13 12 8;10 6;9 8 18
SAOS-2 N.T. 10 12;13 12;13 12 8;10 6;9 8 18
SAOS-2 V.V. 10 12;13 12;13 12 8;10 6;9 8 18
SAOS-2 miR-708 10 12;13 12;13 12 8;10 6;9 8 18