07janeiro/fevereiro/março - 2009

informativo sbm • ano 2 • www.sbmicrobiologia.org.br

A revista doMicrobiologista.

Lições aprendidas com

a bactéria fastidiosa

Lições aprendidas com

a bactéria fastidiosa

Legionella sp e Legionelose: Legionella sp e Legionelose:

IS

SN

19

82

-13

01

Obtenção de pigmentos naturais a partir do cultivo

de Monascus sp

Ciência in Foco

Editorial

03

Índice

Ciência in Foco

LEGIONELLA SPP

E LEGIONELOSE:

LIÇÕES APRENDIDAS

COM A BACTÉRIA

FASTIDIOSA . . . . . . . . . . . . . . 04

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL

BIOSURFACTANTE

DE FUNGOS

FILAMENTOSOS

ASSOCIADOS A CNIDÁRIOS

MARINHOS COM

ATIVIDADE DE

DEGRADAÇÃO

DE HPAs . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

OBTENÇÃO DE

PIGMENTOS NATURAIS

A PARTIR DO CULTIVO

DE MONASCUS SP. . . . . . . . . 19

NOVOS PADRÕES DE

RESISTÊNCIA:

COMO INCORPORAR

A DETECÇÃO NO

LABORATÓRIO . . . . . . . . . . . . 27

PrezadoMicrobiologista,

Editorial

Prezado colega

Desde o primeiro número da Revista, em julho de 2007, temos enfatizado a necessidade de sua colaboração, enviando notícias, sugerindo temas, pes-quisadores, ofertas de emprego, enfim qualquer assunto que envolva a micro-biologia e que achar interessante para publicação e divulgação. Infelizmente, não temos recebido sugestões por parte dos leitores e da comunidade científi-ca microbiológica e isso tem limitado em muito a abrangência que idealizamos para a Revista e que deveria se refletir em cada número.

Dessa maneira, voltamos a enfatizar que esperamos e contamos com sua colaboração ativa para que essa iniciativa da SBM atinja o objetivo de divul-gar a Microbiologia nos mais diversos setores da comunidade brasileira.

Lembramos ao colega que a revista é de informação e divulgação e é com-posta de várias seções:

Seção 1: Ciência in foco: artigos de informação sobre temas relevantesSeção 2: Resenhas: comentários sobre livrosSeção 3: Resumos comentados de trabalhos científicos relevantesSeção 4: Homenagens a profissionais com destaque na fundação da

SBM e no desenvolvimento da MicrobiologiaSeção 5: Ensino em MicrobiologiaSeção 6: Departamento in Foco- Departamentos em destaque: Notíci-

as de interesse da MicrobiologiaSeção 7: Leitor in Foco- Espaço aberto ao leitor.Seção 8: Empresas in Foco- Informes publicitários: Espaço destinado

a EmpresasContamos com sua colaboração.

Escrevam para vgambale@usp.br ou taborda@usp.br

Marina B. Martinez

Presidente

Walderez Gambale

Carlos Taborda

Editores

ExpedienteEditores: - Aumento 1000xCarlos Taborda e Walderez Gambale

Editoração e Impressão:Marketing e Publicidade: Dolika Afa Artes Gráfica: (51) 3343.5533Prix Eventos: Silvia Neglia - Diretora Diagramação: Geanine Viviane BackesFone/fax: 51.32496164microbiologia@prixeventos.com.br Tiragem:

2000 exemplares - Circulação NacionalCapa: Distribuição gratuita para sócios SBMFoto de Dr. Fábio Ramos de Souza Carvalho. Imu-nofluorescência direta com anticorpos monoclo- Responsabilidade editorial:nais: Forma extracelular de L. pneumophila soro- Todos os artigos assinados são de responsabilida-grupo 1 e interação com Acanthamoeba castellanii de dos respectivos autores.

SBM in FocoRevista da Sociedade Brasileira deMicrobiologia

Ano 2, nº 7 (Janeiro, Fevereiro, Março)São Paulo: SBM, 2008

Periodicidade Trimestral

04

O gênero Legionella foi descrito no

ano de 1979, após um surto de pneumo-

nia ocorrido entre os membros da Legião

Americana, cuja convenção aconteceu

na cidade Filadélfia, Estados Unidos, em

julho de 1976. Naquela ocasião, 180 pes-

soas contraíram a doença e 29 pacientes

foram a óbito. Em janeiro de 1977, McDa-

de e colaboradores (1977) isolaram uma

bactéria gram-negativa de tecidos pulmo-

nares daqueles pacientes e denomina-

ram-na Legionella pneumophila, enquan-

to a respectiva infecção foi denominada

de Doença dos Legionários. Investiga-

ções posteriores efetuadas pelo Centro

de Controle de Infecções e Doenças nor-

te-americano (CDC) identificaram o siste-

ma de ar-condicionado do hotel, onde

aconteceu a convenção, como a fonte am-

biental de dispersão da bactéria. A partir

deste fato, bactérias do gênero Legionel-

la têm sido isoladas de ambientes aquáti-

cos e terrestres, e estudos ecológicos da

LEGIONELLA SPP E LEGIONELOSE: LIÇÕES APRENDIDAS COM A BACTÉRIA FASTIDIOSA

Ciência in Foco

família Legionellaceae têm demonstrado

a habilidade desta bactéria em habitar lo-

cais sob condições ambientais adversas

de pH, temperatura e salinidade (Carva-

lho et al., 2006; Sheehan et al., 2005).

Fontes naturais de água, sistemas de

distribuição municipais e tanques de ar-

mazenamento de grandes volumes de

água podem ser ambientes aquáticos pro-

pícios para o desenvolvimento de Legio-

nella spp. Estes locais podem fornecer

condições naturais para a proliferação da

bactéria, como temperaturas uniformes,

oferta de nutrientes dissolvidos presen-

tes em sedimentos e biofilmes e presença

de microrganismos comensais. A presen-

ça de Legionella pneumophila em siste-

mas de distribuição, por exemplo, está

associada com constituintes físico-quí-

micos presentes na água e nos materiais

constituintes dos sistemas de encana-

mento, como altas concentrações de Cál-

cio e Magnésio, principais componentes

dos sedimentos e biofilmes (Vickers et al.,

1987). Apesar da uniformidade de tempe-

ratura encontrada geralmente nos reser-

vatórios de água, estudo in situ utilizando

um modelo de sistema de encanamento

demonstrou a capacidade de L. pneu-

mophila de sobreviver e/ou crescer em

temperaturas de 20 , 40 e 50 C, não apre-

sentando, porém, viabilidade em tempe-

ratura igual ou acima de 60 C (Rogers et

al., 1994). Outro ambiente aquático propí-

cio para a ocorrência de microrganismos

do gênero Legionella são os sistemas de

climatização de ambientes interiores, co-

mo torres de refrigeração, bandejas de

condensação, chuveiros e caldeiras (Car-

valho et al., 2007). Estes sistemas artifici-

ais de climatização estão presentes prin-

cipalmente em prédios públicos, hospi-

tais e indústrias, e alguns fatores podem

ocasionar o desenvolvimento de Legio-

nella spp nestes ambientes aquáticos.

Dentre estes fatores podemos citar os ma-

Fábio Ramos de Souza CarvalhoUniversidade Federal de São Paulo/ Escola Paulista de Medicina

Doutor em Ciências, Microbiologia (ICB/ USP)

05

teriais metálicos utilizados, principalmen-

te ferro, e a complexidade na manuten-

ção que podem submeter as partes cons-

tituintes do sistema de climatização aos

processos de oxidação e acumulação ao

longo do tempo. Assim, a oferta de metais

oxidados, na forma de íons dissolvidos, e

a formação de biofilmes microbianos po-

deriam ser fatores importantes na perpe-

tuação e proliferação da bactéria nos sis-

temas de climatização, uma vez que re-

presentam uma fonte de nutrientes es-

senciais para o metabolismo de Legionel-

la spp e atuam como barreira natural à

ação de agentes antimicrobianos, res-

pectivamente.

Outro aspecto importante quanto ao

desenvolvimento de Legionella spp em

ambientes aquáticos está relacionado às

interações ecológicas de simbiose esta-

belecidas entre a bactéria e protozoários

de vida livre. A multiplicação no interior de

amebas de vida livre, por exemplo, tem de-

monstrado uma associação com o poten-

cial patogênico da bactéria, além de se-

rem observadas algumas similaridades

entre o processo de infecção de L. pneu-

mophila em Acanthamoeba castellanii e a

sua infecção em células humanas de defe-

sa, incluindo os macrófagos e monócitos

(Steinert et al., 1997). Algumas evidên-

cias indicam que o sinergismo entre Le-

gionella spp e os protozoários, considera-

dos reservatórios da bactéria na nature-

za, exercem importante papel na presen-

ça de L. pneumophila no ambiente, assim

como no processo de infecção da bacté-

ria em humanos (Miyake et al., 2005). Bac-

térias intracelulares, como Chlamydia

pneumonia e Mycobacterium avium, tam-

bém podem se reproduzir no interior de

amebas, no entanto, Legionella sp é a úni-

ca bactéria capaz de manter a multiplica-

ção no meio intracelular (Abu-Kwaik et

al., 1998). Além disso, esta bactéria apre-

senta em sua forma extracelular, após o

processo replicativo intracelular, resis-

tência contra diversos fatores abióticos,

por exemplo, antibióticos e variações

bruscas de temperatura, pH e osmolari-

dade, podendo sobreviver em águas tra-

tada, destilada e salina por longos perío-

dos de tempo (Abu-Kwaik et al., 1997; Bar-

ker et al., 1995b).

Amebas de vida livre das espécies

Acanthamoeba castellanii, Acanthamoe-

ba polyphaga e Hartmannella vermifor-

mis têm sido comumente isoladas de sis-

temas de distribuição, sendo, então, utili-

zadas para isolamento e posterior identi-

ficação de microrganismos do gênero Le-

gionella em laboratório (Rohr et al., 1998;

Steinert et al., 1997). Pesquisas in vitro de-

monstraram que o potencial de virulência

da bactéria, assim como a resistência aos

agentes antimicrobianos, pode aumentar

após o processo de fagocitose (ingestão)

pelo protozoário (Cirillo et al., 1994). Por-

tanto, a ocorrência de amebas em ambi-

entes aquáticos pode induzir o cresci-

mento e perpetuação da bactéria nos

ecossistemas aquáticos e terrestres

(Rohr et al., 1998).

Apesar de não existir uma metodolo-

gia universal padronizada para detecção

de Legionella sp tanto em amostras clíni-

cas quanto em ambientes naturais (água,

solo e sedimento), o procedimento adota-

do como padrão é o cultivo em meio sele-

tivo de ágar-carvão tamponado acrescido

de extrato de levedura e alfa-cetoglu-

tarato ( BCYE), baseando-se principal-

mente nas normas internacionais propos-

tas pelos seguintes órgãos: International

Standard Method ISO 11731 (Internatio-

nal Standard ISO 11731, 1998), French

Standard Method AFNOR NF T90-41

(Association Française de Normalisation,

2003) e Nederlands Normalisatie-

Instituut (Nederlands Normalisatie-

Instituut, 1991). O meio de cultura BCYE,

geralmente, é suplementado com L-cis-

teína e pirofosfato férrico, devido aos re-

querimentos nutricionais essenciais da

bactéria por estes compostos. Agentes

antimicrobianos como glicina, vancomici-

na e polimixina B, podem ser adicionados

ao meio para evitar a proliferação de ou-

tras bactérias oportunistas e propiciar o

isolamento de Legionella spp. Assim, es-

te meio de cultura é denominado ágar

BCYE-GVP (Alpha-ketoglutarate Buffe-

red Charcoal Yeast Extract Agar-Glicine,

Vancomycin, Polymyxin B). Além disso,

procedimentos sorológicos, como imuno-

fluorescência direta e aglutinação em par-

tículas de látex, têm sido utilizados para

identificação presuntiva dos isolados de

Legionella. Apesar do reconhecimento

quanto à importância epidemiológica

acerca da obtenção de isolados ambien-

tais de Legionella spp, principalmente, pa-

ra o estudo estrutural da população desta

bactéria, diversas limitações quanto à

sensibilidade e especificidade, têm sido

associadas aos métodos descritos anteri-

ormente de isolamento e identificação da

bactéria em amostras naturais (Behets et

al., 2007; Joly et al., 2006). Assim, consi-

derando a baixa concentração celular da

bactéria nos diferentes ambientes e a bai-

xa sensibilidade e especificidade dos mé-

todos de isolamento e identificação de Le-

gionella spp, técnicas moleculares inde-

pendentes de cultivo, a partir de produtos

da reação em cadeia da polimerase

(PCR), têm sido propostas como procedi-

mento alternativo para aumentar a sensi-

bilidade e especificidade na detecção e

quantificação destas bactérias em amos-

tras ambientais e clínicas.

A família Legionellaceae é constituída

apenas do gênero Legionella (Fields et

al., 2002). Alguns pesquisadores propu-

seram a inclusão de outros dois gêneros,

Fluoribacter e Tatlockia (Fox, Brown,

1993; Garrity et al., 1980). Porém, estu-

dos moleculares confirmaram a presença

apenas de um gênero (Legionella), bem

como a família Legionellaceae como sub-

grupo monofilético da subdivisão gam-

ma-2 de Proteobacteria (Benson, Fields,

1998; Fry et al., 1991). Assim, as denomi-

nações de algumas espécies de Legio-

nella, por exemplo, Legionella (Fluoribac-

ter) dumoffi, Legionella bozemanii (Fluo-

ribacter bozemanae), Legionella (Tatloc-

kia) maceachernii e Legionella (Tatlockia)

micdadei, permanecem atualmente sob

discussão taxonômica de grupos de pes-

quisa especializados. Atualmente, exis-

tem 51 espécies de Legionella e 72 soro-

grupos (Tabela 1), sendo Legionella jeonii

a última espécie descrita em literatura

(Park et al., 2004).

Legionella spp são microrganismos

CARACTERÍSTICAS DA FAMÍLIA LE-

GIONELLACEAE.

* As espécies estão listadas segundo a ordem da data de isolamento ou identificação.**Sorogrupo 2 de L. erythra tem sido associado a doença em humanos.

Espécies* N° de sorogrupos Capacidade de causar legionelose

L. pneumophila 15 SimL.bozemanii 2 SimL. dumoffii 1 SimL. micdadei 1 Sim

L. longbeachae 2 SimL. jordanis 1 Sim

L. wadsworthii 1 SimL. hackeliae 2 Sim

L. feeleii 2 SimL. maceachernii 1 Sim

L. birminghamensis 1 SimL. cincinnatiensis 1 Sim

L. gormanii 1 SimL. sainthelensi 2 SimL. tucsonensis 1 Sim

L. anisa 1 SimL. lansingensis 1 Sim

L. erythra 2 Sim**L. pariensis 1 Sim

L. oakridgensis 1 SimL. spiritensis 1 Não

L. jamestowniensis 1 NãoL. santicrucis 1 Não

L. cherri 1 NãoL. steigerwaltii 1 NãoL. rubrilucens 1 NãoL. israelensis 1 NãoL. quinlivanii 2 NãoL. brunensis 1 NãoL. moravica 1 NãoL. gratiana 1 Não

L. adelaidensis 1 NãoL. fairfieldensis 1 NãoL. shakespearei 1 Não

L. waltersii 1 NãoL. genomospecies 1 NãoL. quarteirensis 1 NãoL. worsleiensis 1 Não

L. geestiana 1 NãoL. natarum 1 Não

L. londoniensis 1 NãoL. taurinensis 1 Não

L. lytica 1 NãoL. drozanskii 1 Não

L. rowbothamii 1 NãoL. fallonii 1 Não

L. gresilensis 1 NãoL. beliardensis 1 NãoL. busanensis 1 NãoL. drauncortii 1 Não

L. jeonii 1 Não

TABELA 1. ESPÉCIES DE

DE CAUSAR DOENÇA (LEGIONELOSE).

LEGIONELLA E PROSSIBILIDADE

06

sem a adição deste aminoácido (Fields,

1992). Tesh e Miller (1981), utilizando a

espécie L. pneumophila, demonstraram a

assimilação de nove aminoácidos como

fonte de carbono e energia adicionais por

esta bactéria. Estudos realizados por Wa-

dowsky e Yee (1983; 1985) demonstra-

ram o efeito de bactérias não-Legio-

nellaceae na multiplicação de cepas de L.

pneumophila em amostras de água potá-

vel quando cultivadas em meio de cultura

seletivo sob condição de ausência do ami-

noácido L-cisteína. Além disso, foi de-

monstrado que a presença de íons metá-

licos em baixas concentrações no ambi-

ente aquático, principalmente ferro, zinco

e potássio, poderiam induzir a prolifera-

ção de microrganismos do gênero Legio-

nella (States et al., 1985).

As características fenotípicas conhe-

cidas das espécies de Legionella, com ex-

ceção de L. pneumophila, são limitadas.

Apresentam-se como bacilos gram-

negativos, não-esporulados, de formas e

tamanhos variáveis (0,3-0,9 m de diâme-

tro x 2,0-20,0 m de comprimento), se-

gundo a fonte nutricional e condições de

desenvolvimento. Por exemplo, em teci-

dos infectados ou secreções pulmonares

de humanos, onde a temperatura corpo-

ral interna varia entre 37 e 42 C, a bacté-

ria pode ser encontrada na forma de baci-

los filamentosos multinucleados e não-

septados, enquanto em ambientes natu-

rais, como água e solos úmidos, onde a

temperatura é geralmente 25 C, Legio-

nella spp podem ser encontradas na for-

ma bacilar curta e delgada (Piao et al.,

2006). Características bioquímicas adici-

onais, comuns do gênero são: mobilida-

de devido à presença de um, dois ou mais

flagelos situados nas regiões polares ou

laterais da bactéria; variabilidade na rea-

ção de oxidase; reações negativas para

redução de nitrato, urease, catalase e uti-

lização (fermentação e oxidação) de car-

boidratos; não formam endósporos ou mi-

crocistos; não-encapsulados e não apre-

sentam álcool-ácido resistência (Ben-

son, Fields, 1998). A maioria das espé-

cies produz a enzima beta-lactamase e li-

quefaz a gelatina (Fields et al., 2002), en-

quanto algumas espécies, quando culti-

vadas, demonstram autofluorescência

sob luz ultravioleta (UV) com comprimen-

to de onda de 365 nanômetros. Neste ca-

so, L. anisa, L. bozemanii, L. parisiensis,

L. tucsonensis, L. gormanii, L. cherrii, L.

aeróbios estritos e quimiorganotróficos,

utilizando aminoácidos, principalmente

L-cisteína, como fontes de carbono e

energia (Brenner et al., 1979), com exce-

ção das espécies L. oakridgensis e L. spi-

ritensis que crescem em meio seletivo

07

competem com Legionella spp pela mes-

ma fonte nutricional (Fields et al., 2002).

Estudos ecológicos de simbiose têm

demonstrado a importância da presença

de protozoários de vida livre na perpetua-

ção e replicação de espécies de Legionel-

la em corpos de água cujas condições

não favorecem o crescimento da bactéria

extracelularmente (Harb et al., 2000). A re-

lação ecológica estabelecida geralmente

é de parasitismo, e amebas de vida livre

dos gêneros Acanthamoeba, Hartmanel-

la e Naegleria, por exemplo, estão comu-

mente relacionadas à presença de algu-

mas espécies Legionella, principalmente

L. pneumophila, no ambiente aquático (Fi-

gura 1). Os gêneros Saccamoeba, Vexilli-

fera e Platyamoeba também constituem

um importante grupo de amebas de vida

livre que podem estar associadas à pre-

sença de Legionella spp no ambiente

aquático (Steinert et al., 2002). Outros

protozoários de vida livre, como os cilia-

dos Tetrahymena pyriformis, Tetrahyme-

na thermophila, e Tetrahymena vorax tam-

bém podem favorecer a proliferação in-

tracelular de algumas espécies desta bac-

téria, como L. pneumophila e L. longbea-

chae, em ambientes naturais (Kikuhara et

al., 1994; Smith-Sommerville et al., 1991;

Steele, Mclennan, 1996). Estudos adicio-

nais de interação hospedeiro-parasita, uti-

lizando L. pneumophila como modelo nos

ensaios de co-cultivo, demonstraram que

o crescimento intracelular prévio desta

bactéria em protozoários de vida livre, po-

de potencializar o processo de infecção

deste patógeno em células humanas de

defesa (Cirillo et al., 1994), induzir a modu-

lação fenotípica (Abu-Kwaik et al., 1993;

Barker et al., 1995a) e aumentar o fator de

resistência a desinfetantes químicos, bio-

Figura 1: Fotomicrografia fluorescente de L. pneumophila. A: forma intracelular viável da bactéria (pontos verdes demonstrados nas setas) obtidas pelo procedimento de

co-cultivo das amostras ambientais em culturas axênicas de A. castellanii. Coloração fluorescente de Live-Dead (Molecular Probes, Inc.) com corantes SYTO9 e Iodeto de

Propídio. B: aumento de 400x; A e C: aumento de 1000x.

steigerwaltii e L. dumoffii apresentam au-

tofluorescência branco-azulada; L. bir-

minghamensis e L. wadsworthii autofluo-

rescem verde-amareladas, enquanto L.

erythra e L. rubrilucens apresentam fluo-

rescência avermelhada sob luz UV

(Winn, 1999).

O ambiente aquático constitui o princi-

pal reservatório para microrganismos do

gênero Legionella e espécies desta bac-

téria podem ser encontradas sob as mais

adversas condições naturais, como

águas doce (rios e lagos), salobra (ambi-

ente estuarino) e salgada (mares e ocea-

nos), águas subterrâneas (lençóis freáti-

cos), águas residuárias, solos úmidos,

além de gotículas de água dispersas na at-

mosfera na forma de aerossóis (Bartie et

al., 2003; Carvalho et al. 2007; Catalan et

al., 1997; Fliermans et al., 1981; Ortiz-

Roque, Hazen, 1987; Palmer et al., 1993;

Pascual et al., 2001). A temperatura de

crescimento ideal destas bactérias é 35

C, podendo variar entre 25 e 42 C (Katz,

Hammel, 1987), considerando que ambi-

entes aquáticos alterados termicamente

podem gerar mudança na comunidade mi-

crobiana local e, conseqüentemente, alte-

ração no balanço entre as populações de

protozoários e bactéria (Fields et al.,

2002). Este fato pode resultar em rápida

multiplicação de Legionella spp e, even-

tualmente, se traduzir no aumento do ris-

co de infecção em humanos imunodepri-

midos se expostos a aerossóis contendo

esta bactéria. Além da presença de Le-

gionella spp no ambiente aquático e da

temperatura aquecida da água na qual ge-

ralmente se encontra, a composição de

nutrientes pode atuar como terceiro fator

relevante para a proliferação destas ba-

ctérias na água. No entanto, microrganis-

mos do gênero Legionella requerem uma

combinação específica de certos nutrien-

tes, semelhantes aos incorporados nos

meios de cultura elaborados em laborató-

rio, os quais são raramente encontrados

dissolvidos na água, e quando ocorrem

são assimilados principalmente por bac-

térias cujo crescimento é mais rápido e

ECOLOGIA DE LEGIONELLA SPP NO

AMBIENTE

08

Após o processo de contágio, a bacté-

ria se instala no trato respiratório, pulmões

e alvéolos pulmonares, podendo entrar na

corrente sangüínea sistêmica e infectar ou-

tros órgãos humanos relacionados princi-

palmente aos tratos gastro-intestinal e uri-

nário. O processo de resposta imune do or-

ganismo humano a presença de Legionel-

la spp ocorre pelas células de defesa, co-

mo macrófagos, monócitos e células epi-

teliais pulmonares, cujos mecanismos de

reconhecimento, englobamento e inativa-

ção da bactéria, assemelham-se aos mes-

mos processos de interação realizados na

natureza pelos protozoários de vida livre

(Abu-Kwaik et al., 1998; Shin, Roy, 2008).

Os casos clínicos de legionelose come-

çaram a surgir na segunda metade do sé-

culo 20, devido principalmente às altera-

ções ambientais decorrentes da ação hu-

mana. A espécie L. pneumophila é o agen-

te etiológico de 98% dos casos de Doen-

ças dos Legionários descritos em literatu-

ra, e o sorogrupo 1 desta espécie é res-

ponsável por 95% destas infecções (Do-

leans et al., 2004). Em termos mundiais, L.

longbeachae é a segunda espécie mais

isolada de pacientes portadores de legio-

nelose, sendo responsável por 30% dos

casos clínicos de Doença dos Legionários

diagnosticados na Austrália (Yu et al.,

2002). A transmissão de L. longbeachae,

ao contrário das demais espécies cuja

transmissão ocorre pela inalação de ae-

rossóis contaminados com a bactéria, tem

sido associada ao manejo de solos úmi-

dos, principalmente em países como Ja-

pão, Austrália, Nova Zelândia e Estados

Unidos (den Boer et al., 2007; Koide et al.

2001; Roig et al., 2003). Por outro lado, ou-

tras espécies como, L. anisa, L. micdadei,

L. dumoffii ou L. feeleii são raramente pato-

gênicas para os humanos, embora sejam

frequentemente isoladas de sistemas de

distribuição de água (Muder, Yu, 2002).

Levantamentos epidemiológicos reali-

zados regularmente pelo Grupo de Pes-

quisa Internacional de Infecções por Le-

gionella spp (EWGLI - The European Wor-

king Group of Legionnaires' Infections), in-

dicam o número crescente de casos de le-

gionelose que ocorrem principalmente na

Europa e demonstram a preocupação dos

órgãos de saúde daquele continente em

diagnosticar precocemente a infecção e

identificar as fontes ambientais de disper-

são da bactéria (Figura 2). Este grupo de

pesquisa é composto pela maioria dos pa-

íses membros do bloco europeu, como

Andorra, Áustria, Bélgica, Bulgária, Croá-

cia, República Tcheca, Dinamarca, Estô-

nia, Finlândia, França, Alemanha, Grécia,

Islândia, Irlanda e Irlanda do Norte, Itália,

Luxemburgo, Malta, Noruega, Polônia,

Portugal, Eslovênia, Espanha, Suécia,

Suíça, Holanda, Turquia, Inglaterra e Pa-

ís de Gales e Escócia, além de países de

outros continentes como Israel, Austrália

e Estados Unidos. A preocupação con-

centrada do bloco europeu quanto aos es-

tudos epidemiológicos constantes acerca

dos casos de legionelose se deve ao fato,

principalmente, dos sistemas de distribui-

ção de água de consumo entre os países

serem interligados e compostos, em sua

maioria, por tubulações metálicas de fer-

ro, zinco e cobre cujos efeitos da oxida-

ção ao longo do tempo, propiciam a colo-

nização de bactérias do gênero Legionel-

la e, consequentemente, a contaminação

da água para consumo humano (Robey,

Cianciotto, 2002). A crescente ocorrência

de surtos de legionelose levou as autori-

dades de vigilância pública daqueles paí-

ses a desenvolverem um programa espe-

cífico unificado de controle epidemiológi-

co e a utilização de um protocolo de diag-

nóstico clínico padronizado (European

Working Group for Legionella Infections,

2005). A implantação destes processos,

ao longo de duas décadas, geraram da-

dos preocupantes acerca das infecções

por Legionella spp no continente euro-

peu, como demonstrado na figura 2, e tem

despertado os órgãos responsáveis de vi-

gilância pública quanto à importância do

estudo das fontes ambientais de disper-

são da bactéria como método preventivo

da ocorrência de surtos de legionelose

(Pereira et al., 2006; Velonakis et al.,

2006).

Outros resultados, disponibilizados

pelo EWGLI para conhecimento da comu-

nidade científica internacional, demons-

tram a maior predisposição de indivíduos

do sexo masculino, cuja idade pode variar

quando Hartmanella vermiformis foi adi-

cionada ao reator. Além disso, aqueles

pesquisadores observaram que apesar

da persistência extracelular da bactéria

ter sido observado na ausência de H. ver-

miformis, a multiplicação extracelular de

L. pneumophila e o desenvolvimento

planctônico da bactéria estariam direta-

mente associados à presença de amebas

de vida livre em biofilmes microbianos.

Estudos complementares recentes con-

duzidos por Piao e colaboradores (2006)

demonstraram a capacidade de mem-

bros da família Legionellaceae em formar

biofilmes utilizando diferentes substra-

tos, como vidro, poliestireno e polipropile-

no. Neste estudo ele concluiu que L. pneu-

mophila possui melhor capacidade de for-

mação de biofilme em todos os materiais

testados quando comparadas às outras

espécies do gênero, além de relacionar

as diferenças morfológicas de L. pneu-

mophila e dinâmica de formação de cada

biofilme, com a temperatura de incuba-

ção e condição nutricional experimenta-

das.

A etiologia causada por microrganis-

mos do gênero Legionella é denominada

legionelose. Esta infecção se manifesta

sob duas formas clínicas denominadas fe-

bre de Pontiac e Doença dos Legionários.

A febre de Pontiac é uma enfermidade le-

ve e autolimitada de curta duração, carac-

terizada principalmente por aumento da

temperatura corporal, mialgia, mal-estar,

cefaléia e ausência de pneumonia. Por ou-

tro lado, a manifestação clínica da Doen-

ça dos Legionários (DL) é semelhante à

de outras doenças respiratórias de ori-

gem bacteriana, como pneumonias por

micobactérias e clamídia, podendo levar

o indivíduo ao óbito. Os sintomas da DL,

em geral, incluem pneumonia aguda, tos-

se seca, febre alta (38.8 a 40 C), calafrios,

diarréia, escassez de respiração, dores

no peito, cefaléia, sudorese excessiva,

náuseas e dores abdominais. Eventual-

mente, se observa presença de sangue

no escarro (Koneman et al. 2001). Letar-

gia e confusão podem ocorrer em casos

graves progressivos.

PATOGENICIDADE E EPIDEMIOLOGIA

09

laboradores (1991) descreveram o isola-

mento de Legionella pneumophila soro-

grupo 1 em amostras provenientes de

água de torres de ar - condicionado e Le-

gionella anisa em amostras de água de

torneiras hospitalares. Em 1995, Pellizari

e Martins descreveram o isolamento de

Legionella pneumophila, sorogrupos 1 e

6, e Legionella bozemanii, totalizando de-

zenove isolados, provenientes de dois

hospitais e um prédio público, situados na

cidade de São Paulo, Brasil (Pellizari, Mar-

tins, 1995). No aspecto clínico, em 1989,

Pereira Gomes e Mazzieri descreveram o

isolamento de Legionella pneumophila so-

rogrupo 1 proveniente de amostra clínica,

no Hospital das Clínicas da Faculdade de

Medicina de São Paulo (Pereira Gomes et

al., 1989). Em estudo conduzido por Fer-

reira, L. pneumophila foi detectada em

amostras de água de sistemas de distri-

buição hospitalar (Ferreira, 2004). Re-

centemente, Chedid e colaboradores des-

creveram a identificação de L. pneumop-

hila em amostras clínicas provenientes

de três pacientes internados no Hospital

Universitário da região sul do Brasil (Che-

did et al., 2005).

Apesar da denominação de microrga-

nismo fastidioso, a ocorrência de Legio-

nella sp em infecções humanas e no

ambiente natural tem sido acompanhada

de forma crescente pela comunidade cien-

tífica. Devido aos poucos estudos publi-

cados, a incidência deste microrganismo

no Brasil pode estar sendo subestimada,

uma vez que a literatura tem demonstra-

CONSIDERAÇÕES FINAIS

entre 50 e 80 anos, em contrair legionelo-

se. Hicks e colaboradores (2006) obser-

varam o aumento súbito nos casos de le-

gionelose reportados ao CDC durante a

estação da primavera. Estudos ecológi-

cos e epidemiológicos realizados por

aqueles autores relacionaram o aumento

do número de casos de legionelose diag-

nosticados ao aumento do índice pluvio-

métrico nos estados amostrados, suge-

rindo uma maior transmissibilidade da

bactéria ao homem durante as estações

climáticas de períodos chuvosos nos

Estados Unidos. Naquele país, o número

estimado de pacientes portadores de

Doença dos Legionários diagnosticados

pode variar entre 8.000 e 18.000 casos

anualmente, apesar da suspeita de

alguns pesquisadores de que o número re-

al possa variar entre 25.000 e 100.000

casos clínicos desta doença por ano

(Brooks et al., 2004; Fields, 2002).

Pouco se conhece sobre a ecologia da

família Legionellaceae no Brasil, onde os

estudos têm sido desenvolvidos em sua

maioria para o diagnóstico clínico. No ca-

so da região metropolitana de São Paulo,

o interesse pelo estudo de Legionella spp

tanto no aspecto clínico como no ambien-

tal existe desde os primeiros descritos da

ocorrência da bactéria na cidade de São

Paulo (Veronesi et al., 1984). No entanto,

após a e aprovação da Lei número 8080,

de 19 de setembro de 1990, acerca da

qualidade do ar de interiores de ambien-

tes climatizados, houve um maior interes-

se científico sobre a origem, persistência,

resistência a agentes de desinfecção des-

te microrganismo no ambiente. Levin e co-

Figura 2: Levantamento epidemiológico anual de casos clínicos de Doença dos Legionários diagnosticados em países membros do Grupo de Pesquisa Internacional de Infecções por Legionella spp no período 1997 a 2006. Fonte: The European Working Group of Legionnaires' Infections (EWGLI) website.

do que microrganismos do gênero Legio-

nella ocorrem a nível global em diferentes

10

hila: a case study in Rio de Janeiro-Brazil. Int. J. Envi-

ron. Health Res. 14: 453-459.

26. Fields BS. Procedures for the recovery of Le-

gionella from the environment. v. 2. Atlanta, Ga.:

U.S. Department of Health and Human Services,

1992.

27. Fields BS. 1996. The molecular ecology of legio-

nellae. Trends Microbiol. 4: 286-290.

28. Fields BS; Benson RF; Besser RE. 2002. Legio-

nella and Legionnaires' Disease: 25 years of investi-

gation. Clin. Microbiol. Rev. 15: 506-526.

29. Fliermans CB; Cherry WB; Orrison LH; Smith SJ;

Tison DL; Pope DH. 1981. Ecological distribution of

Legionella pneumophila. Appl. Environ. Microbiol.

41: 9-16.

30. Fox KF; Brown A. 1993. Properties of the genus

Tatlockia. Differentiation of Tatlockia (Legionella)

maceachernii and micdadei from each other and

from other legionellae. Can. J. Microbiol. 3: 486-491.

31. Fry NK; Warwick S; Saunders NA; Embley TM.

1991. The use of 16S ribosomal RNA analyses to in-

vestigate the phylogeny of the family Le-

gionellaceae. J. Gen. Microbiol. 137: 1215-1222.

32. Garrity GM; Brown A; Vickers RM. 1980. Tatloc-

kia and Fluoribacter : two new genera of organism re-

sembling Legionella pneumophila. Int. J. Syst. Bac-

teriol. 30: 609-614.

33. Harb OS; Gao L-Y; Abu Kwaik Y. 2000. From pro-

tozoa to mammalian cells: a new paradigm in the life

cycle of intracellular bacterial pathogens. Environ.

Microbiol. 2: 251-265.

34. Hicks LA; Rose Jr. CE; Fields BS; Drees ML;

Engel JP; Jenkins PR; Rouse BS; Blythe D; Khalifah

AP; Feikin DR; Whitney CG. 2006. Increased rainfall

is associated with increased risk for legionellosis.

Epidemiol. Infect. 23: 1-7.

35. Joly P; Falconnet P-A; André J; Weill N; Reyrolle

M; Vandenesch F; Maurin M; Etienne J; Jarraud S.

2006. Quantitative real-time Legionella PCR for envi-

ronmental water samples: data interpretation. Appl.

Environ. Microbiol. 72: 2801-2808.

36. Katz SM; Hammel JM. 1987. The effect of drying,

heat, and pH on the survival of Legionella pneumop-

hila. Ann. Clin. Lab. Sci. 17: 150-156.

37. Kikuhara H; Ogawa M; Miyamoto H; Nikaido Y;

Yoshida S. 1994. Intracellular multiplication of Legio-

nella pneumophila in Tetrahymena thermophila.

Sangyo Ika Daigaku Zasshi 16: 263-275.

38. Koide M; Arakaki N; Saito A. 2001 Distribution of

Legionella longbeachae and other legionellae in Ja-

panese potting soils. J. Infect. Chemother. 7: 224-

227.

39. Koneman E; Allen SD; Janda WM; Schrecken-

bergerPC; Winn Jr. WC. Diagnóstico Microbiológico.

5 ed. Rio de Janeiro. Editora Médica e Científica.

2001. 1465 p.

40. Levin AS; Caiaffa Filho HH; Sinto SI; Sabbaga E;

Barone AA; Mendes CM. 1991. An outbreak of noso-

comial Legionnaires' disease in a renal transplant

unit in Sao Paulo, Brazil. Legionellosis Study Team.

J. Hosp. Infect. 18: 243-248.

41. McDade JE; Shepard CC; Fraser DW; Tsai TR;

Redus MA; Dowdle WR. 1977. Legionnaires' disea-

se: isolation of a bacterium and demonstration of its

role in other respiratory disease. N. Engl. J. Med.

297: 1197-1203.

42. Miyake M; Watanabe T; Koike H; Molmeret M;

Imai Y; Abu-Kwaik Y. 2005. Characterization of Legi-

onella pneumophila pmiA, a gene essential for infec-

tivity of protozoa and macrophages. Infect. Immun.

73: 6272-6282.

43. Muder RR; Yu VL. 2002. Infection due to Legio-

nella species other than L. pneumophila. Clin. Infect.

Dis. 35: 990-998.

44. Murga R; Forster TS; Brown E; Pruckler JM; Fi-

elds BS; Donlan RM. 2001. The role of biofilms in the

survival of Legionella pneumophila in a model pota-

ble water system. Microbiology 147: 3121-3126.

45. ORTIZ-ROQUE, C. M.; HAZEN, T. C. Abundance

and distribution of Legionellaceae in Puerto Rican

waters. Appl. Environ. Microbiol. v. 53, p. 2231-

2236, 1987.

46. Palmer C J; Tsai Y-L; Pasko-Kolva C; Mayer C;

Sangermano LR. 1993. Detection of Legionella spe-

cies in sewage and ocean water by polymerase cha-

in reaction, direct fluorescent antibody, and plate cul-

ture methods. Appl. Environ. Microbiol. 59: 3618-

3624.

47. Park M; Yun ST; Kim MS; Chun J; Ahn TI. 2004.

Phylogenetic characterization of Legionella-like en-

dosymbiotic X-bacteria in Amoeba proteus: a propo-

sal for 'Candidatus Legionella jeonii' sp. nov. Envi-

ron. Microbiol. 6: 1252-1263.

48. Pascual L; Pérez-Luz S; Amo A; Moreno C; Apra-

iz D; Catalán V. 2001. Detection of Legionella pneu-

mophila in bioaerosols by polymerase chain reacti-

on. Can. J. Microbiol. 47: 341-347.

49. Pellizari VH; Martins MT. 1995. Occurrence of Le-

gionella sp in water samples from man-made

systems of Sao Paulo - Brazil. Rev. Microbiol. 26:

186-191.

50. Pereira A; Broadbent J; Mahgoub H; Morgan O;

Bracebridge S; Reacher M; Ibbotson S; Lee J; Harri-

son T; Nair P. 2006. Legionnaires' disease: when an

'outbreak' is not an outbreak. Euro Surveill. 11:

E061130.3

51. Pereira Gomes JC; Mazzieri NA; Godoy CVF; Ro-

cha AS. 1989. Legionella pneumophila associada à

insuficiência respiratória aguda. Primeiro isolamen-

to no Brasil. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo. 31:

vum, species nova, of the family Legionellaceae,

familia nova. Ann. Intern. Med. 90: 656-658.

13. Brooks T; Osicki RA; Springthorpe VS; Sattar

SA; Filion L; Abrial D; Riffard S. 2004. Detection

and identification of Legionella species from

groundwater. J. Toxicol. Environ. Health 67 :

1845-1859.

14. Carvalho FRS; Foronda AS; Pellizari VH.

2007. Detection of Legionella pneumophila in wa-

ter and biofilm samples by culture and molecular

methods from man-made systems in São Paulo -

Brazil. Braz. J. Microbiol. 38: 743-751.

15. Carvalho FRS; Nastasi FR; Gamba RC; Fo-

ronda, AS; Pellizari VH. Legionella: State of the

Art 30 Years after Its Recognition. 6 ed. Washing-

ton, DC: American Society for Microbiology, p.

417-419: Diversity of Legionella spp in Antarctic

Lakes of Keller Peninsula. 2006.

16. Carvalho FRS; Vazoller RF; Foronda AS; Pel-

lizari VH. 2007. Phylogenetic study of Legionella

species in pristine and polluted aquatic samples

from a tropical Atlantic forest ecosystem. Curr. Mi-

crobiol. 55: 288-293.

17. Catalan V; Garcia F; Moreno C; Vila MJ; Apra-

iz D. 1997. Detection of Legionella pneumophila

in wastewater by nested polymerase chain reacti-

on. Res. Microbiol. 148: 71-78.

18. Chedid MBF; Ilha DO; Chedid MF; Dalcin PR;

Buzzetti M; Saraiva PJ; Griza D; Barreto SSM.

2005. Community-acquired pneumonia by Legio-

nella pneumophila serogroups 1-6 in Brazil.

Resp. Med. 99: 966-975.

19. Cirillo JD; Falkow S; Tompkins LS. 1994.

Growth of Legionella pneumophila in Acanthamo-

eba castellanii enhances invasion. Infect. Immun.

62: 3254-3261.

20. Doleans A; Aurell H; Reyrolle M; Lina G; Fre-

ney J; Vandenesch F; Etienne J; Jarraud S. 2004.

Clinical and environmental distributions of Legio-

nella strains in France are different. J. Clin. Micro-

biol. 42: 458-460.

21. Donlan RM. 2002. Biofilms: microbial life on

surfaces. Emerg. Infect. Dis. 8: 881-890.

22. Donlan RM; Costerton JW. 2002. Biofilms: sur-

vival mechanisms of clinically relevant microor-

ganism. Clin. Microbiol. Rev. 15: 167-193.

23. Dunne WM. 2002. Bacterial adhesion: see

any good biofilms lately? Clin. Microbiol. Rev. 15:

155-166.

24. European Working Group For Legionella

Infections (EWGLI). 2005. The European Guideli-

nes for Control and Prevention of Travel Associa-

ted Legionnaires' Disease. Versão disponível no

site: http://www.ewgli.org/index.htm

25. Ferreira AP. 2004. Risk and management in

hospital water systems for Legionella pneumop-

11

Legionella isolates during an epidemiological inves-

tigation can be helpful but also misleading: an exam-

ple from Greece. Euro Surveill. 11: E060824.4.

66. Veronesi R; Barbosa SF; Coscina AL; Lima AC.

1984. Legionellosis in Brazil: a serological survey

among blood donors and personnel of intensive ca-

re units of 3 São Paulo hospitals. Rev. Hosp. Clin.

Fac. Med. Sao Paulo 39: 257-259.

67. Vickers RM; Stout JE; Yu VL, Rihs JD. 1987. Ma-

nual of culture methodology for Legionella. Seminar.

Respir. Infect. 2: 274-279.

68. Wadowsky RM; Yee RB. 1983. Satellite growth

of Legionella pneumophila with an environmental

isolate of Flavobacterium breve. Appl. Environ. Mi-

crobiol. 46: 1447-1449.

69. Wadowsky RM; Yee RB. 1985. Effect of non-

Legionellaceae bacteria on the multiplication of Legi-

onella pneumophila in potable water. Appl. Environ.

Microbiol. 49: 1206-1210.

70. Winn WC. Manual of Clinical Microbiology. 7 ed.

Washington, DC: American Society for Microbio-

logy, 1999. p. 572-582: Legionella .

71. Yu VL; Plouffe J; Pastoris M; Stout J; Schousboe

M; Widmer A.; Summersgill J; File T; Heath C; Pater-

son D; Chereshsky A. 2002.Distribution of Legionel-

la species and serogroups isolated by culture in pati-

ents with sporadic community-acquired legionello-

sis: an international collaborative survey. J. Infect.

Dis. 186: 127-128.

368-376.

52. Piao Z; Sze CC; Barysheva O; Iida K; Yoshida S.

2006. Temperature-regulated formation of mycelial

mat-like biofilms by Legionella pneumophila. Appl.

Environ. Microbiol. 72: 1613-1622.

53. Robey M; Cianciotto NP. 2002. Legionella pneu-

mophila feoAB promotes ferrous iron uptake and in-

tracellular infection. Infect. Immun. 70: 5659-5669.

54. Roig J; Sabria M; Pedro-Botet M. 2003. Legio-

nella spp.: community acquired and nosocomial in-

fections. Curr. Opin. Infect. Dis. 16: 145-151.

55. Rogers JA; Dowsett AB; Dennis PJ; Lee JV; Kee-

vil CW. 1994. Influence of temperature and plum-

bing material selection on biofilm formation and

growth of Legionella pneumophila in a model pota-

ble water system containing complex microbial flo-

ra. Appl. Environ. Microbiol. 60: 1585-1592.

56. Rohr U; Weber S; Michel R; Selenka F; Wilhelm

M. 1998. Comparison of free-living amoebae in hot

water systems of hospitals with isolates from moist

sanitary areas by identifying genera and determi-

ning temperature tolerance. Appl. Environ. Microbi-

ol. 64: 1822-1824.

57. Sheehan KB; Henson JM; Ferris MJ. 2005. Legi-

onella species diversity in an acidic biofilm commu-

nity in Yellowstone National Park. Appl. Environ. Mi-

crobiol. 71: 507-511.

58. Shin S, Roy CR. 2008. Host cell processes that

influence the intracellular survival of Legionella pne-

umophila. Cell Microbiol. 10:1209-1220.

59. Smith-Somerville HE; Huryn VB; Walker C; Win-

ters AL. 1991. Survival of Legionella pneumophila in

cold water ciliate Tetrahymena vorax. Appl. Environ.

Microbiol. 57: 2742-2749.

60. States SJ; Conley LF; Ceraso M; Stephenson

TE; Wolford RS; Wadowsky RM; Mcnamara AM;

Yee RB. 1985. Effects of metals on Legionella pneu-

mophila growth in drinking water plumbing systems.

Appl. Environ. Microbiol. 50: 1149-1154.

61. Steele TW; Mclennan AM. 1996. Infection of Te-

trahymena pyriformis by Legionella longbeachae

and other Legionella species found in potting mixes.

Appl. Environ. Microbiol. 62: 1081-1083.

62. Steinert M; Emödy L; Amann R; Hacker J. 1997.

Resuscitation of viable but nonculturable Legionella

pneumophila Philadelphia JR32 by Acanthamoeba

castellanii. Appl. Environ. Microbiol. 63: 2047-2053.

63. Steinert M; Hentschel U; Hacker J. 2002. Le-

gionella pneumophila: an aquatic microbe goes as-

tray. FEMS Microbiol. Rev. 26: 149-162.

64. Tesh MJ; Miller RD. 1981. Amino acid require-

ments for Legionella pneumophila growth. J. Clin.

Microbiol. 13: 865-869.

65. Velonakis E; Uldum S; Giakoupi P; Loukoussias

S; Nielsen S; Spala G; Vatopoulos A. 2006. Typing of

12

321 4

,1. Rafaella C. Bonugli-Santos¹ ²,

2. Michel R. Z. Passarini¹,

3. Marili V. L. Rodrigues¹,

4. Lucia R. Durrant² & 5. Lara D. Sette¹

¹ Divisão de Recursos Microbianos DRM - CPQBA ² Faculdade de Engenharia de Alimentos - DCA

Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) - Campinas - SP

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOSURFACTANTE DE FUNGOS FILAMENTOSOS ASSOCIADOS A CNIDÁRIOS MARINHOS COM ATIVIDADE DE DEGRADAÇÃO DE HPAs

Ciência in Foco

INTRODUÇÃO

As diversas atividades como explora-

ção, produção, refino e principalmente o

transporte do petróleo resultam em aci-

dentes com vazamentos de óleo para o me-

io ambiente, os quais têm ocorrido com fre-

qüência devido ao fato da intensa utiliza-

ção do petróleo e de seus derivados em

nossas vidas (Fingas, 2001). Derrames ca-

usados por navios são responsáveis por

dois milhões de toneladas de óleo por ano

no mar, sendo que 92% dos acidentes

ocorrem próximos à costa e são resultan-

tes de erros operacionais ou de falta de ma-

nutenção (Ferrão, 2005). Bicca e colabo-

radores (1999) relataram que a descarga

anual de óleo no oceano é em torno de 1.7

a 1.8 toneladas por metro. O impacto des-

5

ta poluição resulta em um severo desequi-

líbrio ambiental além de danos sociais e

econômicos, principalmente no que diz res-

peito às atividades costeiras e de explora-

ção dos recursos do mar.

De acordo com Ferrão (2005) os efei-

tos sobre os organismos marinhos e sobre

as comunidades ribeirinhas ao longo da

costa afetada serão sentidos por pelo me-

nos uma década. Quanto às atividades

pesqueiras comerciais, sabe-se que um

derrame de petróleo pode contaminar equi-

pamentos de pesca e instalações de mari-

cultura. O suprimento de água do mar para

operações industriais também pode ser

afetado por estes derrames, bem como po-

dem ser interrompidas as rotinas das ativi-

dades dos portos tais como balsas e servi-

ços de comportas, principalmente se fo-

rem derramados petróleo leve, gasolina

ou outros materiais inflamáveis. Em adi-

ção, os problemas gerados pelo derrama-

mento acidental de petróleo no ambiente

além de demandar elevados custos de lim-

peza da maré negra, podem acarretar ris-

cos intrínsecos à saúde pública, como as

mortes causadas por explosões e incêndi-

os, intoxicação causada pela ingestão de

alimentos contaminados, ou problemas

dermatológicos e irritações nos olhos, cau-

sadas pelo contato direto com o óleo.

Após o derramamento do óleo na água

ocorre o intemperismo, ou seja, um con-

junto de processos químicos, físicos e bio-

lógicos que como conseqüência, resulta

na degradação do óleo ao longo do tempo

(Dias 2008). Dentre estes fatores, pode-

mos destacar a biodegradação, um pro-

cesso biológico relacionado com a meta-

bolização dos hidrocarbonetos do petró-

leo, promovido por microorganismos (bac-

térias e fungos) que podem ser encontra-

dos no ambiente aquático ou terrestre.

Os hidrocarbonetos policíclicos aro-

máticos (HPAs) derivados do petróleo são

compostos de difícil degradação podendo

permanecer no ambiente (ar, água, solo,

sedimentos) durante longos períodos de

tempo, pois possuem uma alta afinidade

com solos ricos em matéria orgânica e se-

dimentos marinhos (AbbondanzI et al.,

2005). Os HPAs são uns dos principais po-

luentes ambientais e podem causar riscos

para a saúde e meio ambiente devido à for-

mação de substâncias genotóxicas e car-

cinogênicas (Baborová et al., 2006). Desta

forma, a preocupação mundial relaciona-

da à liberação de hidrocarbonetos no ambi-

ente decorrente da atividade industrial e

do derramamento acidental de óleo e de

seus componentes vem crescendo inces-

santemente nos últimos anos.

Inúmeros trabalhos envolvendo a bior-

remediação, ou seja, a busca por micror-

ganismos capazes de degradar os HPAs

têm sido conduzidos visando transforma-

ção desses compostos em moléculas me-

nos tóxicas, incluindo a mineralização com-

pleta ou ao menos sua biotransformação,

resultando em metabólitos altamente solú-

veis em água e biologicamente menos rea-

tivos (Cerniglia & Sutherland, 2001; da Sil-

va et al., 2003; da Silva et al., 2004). A

re-introdução de microrganismos autócto-

nes isolados de áreas contaminadas após

cultivo em laboratório tem demonstrado

ser uma eficiente estratégia no processo

de biorremediação (Korda et al., 1997).

Baseado neste contexto, a degradação de

HPAs por fungos filamentosos marinhos,

pode ser considerada uma vantagem bio-

lógica, visto que estes organismos estão

adaptados às condições de salinidade des-

te ecossistema.

Uma das principais características dos

HPAs é a baixa solubilidade em água, o

que dificulta o processo de biodegrada-

ção. Neste sentido, a aplicação de biosur-

factantes, compostos de origem microbia-

na que contenham propriedades surfac-

tantes, ou seja, que possuem a capacida-

de de diminuir a tensão superficial pode

ser considerado uma interessante alterna-

tiva para o aumento da solubilidade dos

compostos hidrofóbicos, resultando em

uma maior degradação destes poluentes

no ambiente impactado. Os tipos e as pro-

priedades dos biosurfactantes são deter-

minados pelas fontes de carbono utiliza-

das pelos microrganismos na sua produ-

ção, e conseqüentemente uma grande va-

riedade é conhecida (Banat, 1995). São

compostos de extrema importância em vá-

rios setores industriais como o alimentício

e farmacêutico, entretanto, seu maior mer-

cado é a indústria petrolífera (Desai & Ba-

nat, 1997).

Levando-se em consideração as con-

siderações acima citadas, o presente tra-

balho teve como objetivo principal a avali-

ação da degradação de HPAs e da produ-

ção de biosurfactantes por nove fungos fila-

mentosos isolados de invertebrados mari-

nhos previamente selecionados pela capa-

cidade de tolerância/descoloração do co-

rante RBBR (da Silva et al., 2008). Em adi-

ção, os fungos filamentosos foram carac-

terizados taxonomicamente e depositados

na Coleção Brasileira de Microrganismos

de Ambiente e Indústria (CBMAI).

METODOLOGIA

Fungos filamentosos derivados de cnidários marinhos (Mussismilia hispida, Palythoa caribaeorum, Palythoa variabilis) previamente

selecionados pela descoloração/tolerância ao corante

RBBR (da Silva et al, 2008)

Avaliação da degradação dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, (da Silva et al., 2004): caldo sabouraud

dextrose acrescidos de 2 mg de pireno e 1 mg de benzo[a]pireno. Avaliação por (GC-MS) da porcentagem dos HPAs consumida após 4 e 8 dias de cultivo

Avaliação da produção de biosurfactantes (Willumsen e Karlson, 1997): meio salino (0,6g MgSO4, 3,6g

Na2PO4, 1,2g Kh2PO4, 3% NaCl)acrescido de 1% de hexadecano como fonte de carbono (15 dias a 150 rpm)

Teste de emulsificação (Johnson et al.,1992): meio salino (0,6g MgSO4,

3,6g Na2PO4, 1,2g Kh2PO4, 3% NaCl) acrescido de

2,0 mL de óleo diesel e tolueno

Caracterização taxonômica dos fungos filamentosos derivados de ambiente

marinho por meio de análises morfológicas, seqüenciamento da região

ITS1-5,8S-ITS2 e análise filogenética (Sette et al., 2006)

Depósito dos fungos filamentosos na Coleção Brasileira de Microrganismos

de Ambiente e Indústria (CBMAI)

13

14

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Os nove fungos filamentosos isolados

de cnidários marinhos avaliados no pre-

sente estudo quanto à produção de biosur-

factantes e degradação dos HPAs de alto

peso molecular (pireno e benzo[a]pireno)

foram previamente selecionados por apre-

sentarem tolerância/descoloração ao co-

rante RBBR (Remazol Brilliant Blues R),

como reportado por da Silva et a.l (2008).

O uso de corantes poliméricos tem sido

proposto como um método eficiente para a

seleção de fungos que apresentam capa-

cidade para degradar poluentes recalci-

trantes, incluindo compostos aromáticos

tais como os HPAs (Sato et al., 2003; Vitali

et al., 2006). Neste contexto, o RBBR é

considerado como o corante mais apro-

TABELA 2: IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS DERIVADOS DE CNIDÁRIOS

MARINHOS, DADOS DE AMOSTRAGEM, ISOLAMENTO E NÚMEROS DE ACESSO.

CBMAI GenBank Invertebrado Identificação Molecular Identificação

Marinho Similaridade - BLAST Morfológica

847 FJ790879 M. hispida 97% Mucor racemosus CBS 111228 M. racemosus

97% Mucor racemosus CBS 111229

97% Mucor fragilis IFO 6449

97% Mucor racemosus ATCC 1216B

849 FJ790880 P.variabilis 99% Aspergillus bridgeri NRRL 13000 A. sclerotiorum

99% Aspergillus sclerotiorum NRRL 35054

99% Aspergillus persii NRRL 35669

98% Aspergillus sulphureus NRRL 4077

850 P.variabilis NS Khuskia oryzae

852 FJ790881 P.variabilis 99% Trichoderma sp. CBMAI 58 Trichoderma sp.

99% Trichoderma harzianum IMI 304056

99%Trichoderma aureoviride IMI 112086

99% Trichoderma harzianum ATCC 20873

853 FJ790883 Z. solanderi 99% Penicillium citrinum NRRL 35459 P. citrinun

99% Penicillium westlingii NRRL 800

98% Penicillium sartoryi NRRL 783

854 FJ790882 M. hispida 100% Fusarium oxysporum CBS 129.24 F. oxysporum

99% Fusarium oxysporum ATCC MYA-3931

99% Fusarium oxysporum ATCC MYA-3926

856 FJ790884 P. caribaeorum 99% Microsphaeropsis arundinis AMMRL 159.00 Microsphaeropsis sp.

99%Paraconiothyrium cyclothyrioides CBS 972.95

99% Paraconiothyrium estuarinum CBS 109850

96% Paraconiothyrium variabile CBS 119633

857 FJ790885 P. caribaeorum 99% Cladosporium cladosporioides ATCC 6721 C. cladosporioides

99% Cladosporium cladosporioides MUCC217

99% Cladosporium cladosporioides ATCC 34668

NS = não seqüenciado

TABELA 1: DEGRADAÇÃO DE HPAS E PRODUÇÃO DE BIOSURFACTANTES

POR FUNGOS ISOLADOS DE INVERTEBRADOS MARINHOS

* P = Pireno (após 4 dias de cultivo) ; ** Bp = Benzo[a]pireno (após 8 dias de cultivo)***Tensão superficial expressa em mN/m, usando meio salino como controle (54.6mN/m).¹ Média - ² Desvio padrão

Linhagem CBMAI % degradação Tensão

P* Bp** Superficial***

Aspergillus sclerotiorum 849 84,9 60,9 68.3¹±3.7²

Microsphaeropsis sp. 856 43,2 29,3 51.5¹±2.6²

Cladosporium cladosporioides 857 29,3 30,9 66.0¹±7.1²

Mucor racemosus 847 26,2 44,3 57.1¹±1.6²

Penicillium citrinum 853 21,5 12,9 58.1¹±3.7²

Khuskia oryzae 850 20,4 14,5 72.7¹±0.1²

Fusarium oxysporum 854 18,4 19,4 61.6¹±0.7²

Trichoderma sp. 852 16,4 10,3 68.5¹±2.7²

15

Figura 1: Árvore filogenética baseada na análise ITS dos fungos derivados de cnidários marinhos (Kimura 2p e neighbor-joining e 1.000 bootstrap replicatas). Valores de boostrap

70 podem ser observados na árvore. Ordens: Eur (Eurotiales), Hyp (Hypocreales), Cap (Capnodiales), Ple (Pleosporales) e Muc (Mucoralles).

priado para a seleção de fungos degrada-

dores de HPAs, visto que o mesmo é deri-

vado do antraceno, um HPA de baixo peso

molecular.

O fungo Aspergillus sclerotiorum

CBMAI 849 apresentou o melhor resultado

de degradação de pireno (84,9%) e benzo-

[a]pireno (60,9%) após 4 e 8 dias de culti-

vo, respectivamente (Tabela 1). Todos os

outros fungos apresentaram menos de

50% de degradação dos HPAs nas condi-

ções estudadas. Entretanto, resultados de

degradação acima de 30% foram obtidos

com o fungo Microsphaeropsis sp. CBMAI

856 para pireno; Mucor racemosus CBMAI

847 e Cladosporium cladosporioides

CBMAI 857 para benzo[a]pireno (Tabela 1).

De acordo com a literatura fungos do gê-

nero Aspergillus (Capotorti et al. 2004); Cla-

dosporium (Potin et al., 2004a; Potin et al.,

2004b); Mucor (Ravelet et al. 2000; Potin et

al., 2004a) e Microsphaeropsis (Ravelet et

al. 2000; Potin et al. 2004a) apresentam ca-

pacidade de degradação de HPAs de alto

peso molecular, tais como pireno e benzo-

[a]pireno. Entretanto, os fungos utilizados

no presente estudo foram capazes de de-

gradar os HPAs após o crescimento em me-

io contendo 3% de salinidade (condição si-

milar à encontrada no ambiente marinho),

o que confere a estes microrganismos

uma vantagem biológica na degradação

destes compostos em ambiente salino.

Em adição, não existem relatos na literatu-

ra a respeito da degradação de pireno e

benzo[a]pireno por fungos derivados de

ambientes marinhos pertencentes aos gê-

neros Aspergillus, Cladosporium, Mucor e

Microsphaeropsis.

São poucos os estudos reportados em

literatura sobre a relação da produção de

biosurfactantes e a degradação de HPAs

CBMAI 849 (FJ790880)

Aspergillus bridgeri NRRL 13000 (EF661404)

Aspergillus persii NRRL 35669 (EF661399)

Aspergillus sclerotiorum NRRL 35024 (EF661401)

Aspergillus sulphureus

NRRL 4077 (EF661409)

CBMAI 853 (FJ790883)

Penicillium sartoryi

NRRL 783 (AF033421)

Penicillium westlingii

NRRL 800 (AF033423)

Penicillium citrinum

NRRL 35459 (EF634428)

Trichoderma harzianum (AJ224016)

Trichoderma aureoviride

IMI 112086 (AF194020 )

CBMAI 852

(FJ790881)

Trichoderma harzianum ATCC20873 (AF057575) CBMAI 854

(FJ790882)

Fusarium oxysporum

ATCC MYA-3931 (FJ196767)

Fusarium oxysporum ATCC MYA-3926 (FJ196765)

Fusarium oxysporum CBS 129.24 (DQ453704)

Cladosporium cladosporioides

MUCC217 (EU301110)

Cladosporium cladosporioides

ATCC 34668 (AY463365 )

Cladosporium cladosporioides ATCC 6721 (AY625059)

CBMAI 857

(FJ790885)

Paraconiothyrium variabile

CBS 119633 (EU295649)

Paraconiothyrium cyclothyrioides CBS 972.95 (AY642529)

Paraconiothyrium estuarinum CBS 109850 (AY642530)

Microsphaeropsis arundinis

AMMRL 159.00 (EF094553) *

CBMAI 856

(FJ790884)

Mucor racemosus CBS 111228 (AY243945)

Mucor fragilis

IFO6449 (AF474242)

CBMAI 847

(FJ790879)

Mucor racemosus CBS 111 229 (AY243946)

Mucor racemosus ATCC1216B (AJ271061)

100

100

89

100

100

99

100

100

7277

100

87

80

0.05

*Fungo mitospórico

Eu

rH

yp

Ca

pP

leM

uc

16

por fungos filamentosos. Arun et al. (2008)

verificaram que o melhor resultado de de-

gradação de HPAs pelo basidiomiceto Co-

riolus versicolor correspondeu ao maior re-

sultado de atividade biosurfactante. Entre-

tanto, no presente estudo o fungo degra-

dador de HPAs A. sclerotiorum não apre-

sentou resultados satisfatórios de redução

da tensão superficial. Os melhores resul-

tados foram observados para os fungos Mi-

crosphaeropsis sp. CBMAI 856; M. race-

mosus CBMAI 847 e P. citrinum CBMAI

853, os quais apresentaram redução da

tensão superficial abaixo dos valores utili-

zados como controle (Tabela 1), contudo

para ser considerando como biosurfactan-

te o composto além da redução da tensão

superficial deve possuir alta capacidade

emulsificante. Os fungos Microsphaerop-

sis sp. CBMAI 856; M. racemosus CBMAI

847 e P. citrinum CBMAI 853 não apresen-

taram atividade emulsificante. Resultados

similares foram reportados por Vasconcel-

los (2006), onde bactérias derivadas de pe-

tróleo biodegradadoras de hidrocarbone-

tos não mostraram bons rendimentos

quanto à produção de biosurfactantes, su-

gerindo que a produção de determinados

biosurfactantes poderia ser um mecanis-

mo de sobrevivência, ou seja, a bactéria

que não consegue degradar os substratos

disponíveis produziria exopolímeros no in-

tuito de torná-los mais acessíveis ao con-

sumo. De fato, no meio ambiente os mi-

crorganismos atuam em interdenpendên-

cia metabólica, assim, enquanto alguns

produzem biosurfactantes para tornar os

substratos hidrofóbicos disponíveis, ou-

tros podem atuar especificamente na de-

gradação do substrato.

Os resultados derivados da caracteri-

zação taxonômica e análise filogenética

(Tabela 2, Figura 1) revelaram que os fun-

gos derivados de cnidários marinhos, são

em sua maioria, frequentemente encon-

trados em ambiente terrestre e, portanto,

foram classificados como marinhos facul-

tativos. A identificação e caracterização ta-

xonômica de microrganismos em estudos

de compostos naturais bioativos é crítica,

visto que na ausência de uma correta iden-

tificação e preservação dos isolados as in-

vestigações químicas tornam-se difíceis

de serem realizadas e impossíveis de se-

rem reproduzidas (Bugni & Ireland, 2004).

Em adição, o conhecimento da diversidade

de fungos filamentosos derivados de ambi-

ente marinho além de contribuir para com-

preensão das relações destes microrganis-

mos com seus hospedeiros é de extrema

importância ambiental, pois pode evitar pro-

blemas associados à utilização e liberação

no ambiente de potenciais patógenos de

plantas e animais (Sette et al., 2005).

Os resultados apresentados no presen-

te estudo demonstram o potencial de utili-

zação dos fungos filamentosos isolados de

cnidários marinhos em biorremediação de

ambientes contaminados com HPAs, prin-

cipalmente em áreas marinhas, devido ao

fato dos mesmos estarem adaptados às

condições de salinidade destes ambientes.

Entretanto, estudos posteriores devem ser

conduzidos visando caracterização dos

compostos formados a partir do metabolis-

mo dos isolados frente à degradação dos

HPAs, bem como, o conhecimento dos me-

canismos que podem estar envolvidos no

processo de produção de biosurfactantes,

visto que, em alguns dos trabalhos reporta-

dos na literatura os biosurfactantes foram

capazes de estimular a biodegradação e

em outros funcionaram como substâncias

de inibição.

Os autores agradecem ao apoio finan-

ceiro da Fundação de Amparo à Pesquisa

do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao

Conselho Nacional de Desenvolvimento Ci-

entífico e tecnológico (CNPq) pela bolsa de

Doutorado concedida a Rafaella C. Bonu-

gli-Santos.

Abbondanzi, F., Campisi, T., Focanti, M., Guerra,

R., Lacondini, A. Assessing degradation capability

of aerobic indigenous microflora in PAH-

contaminated brackish sediments. Marine Environ-

mental Research. 59: 419-434, 2005.

Arun, A., Praveen P. R., Arthi R., Ananthi M., Sat-

hish K. K., Eyini M. Polycyclic Aromatic Hydrocar-

bons (PAHs) Biodegradation by Basidiomycetes

Fungi, Pseudomonas Isolate, and Their Cocultures:

Comparative In Vivo and In Silico Approach. Appl Bi-

ochem Biotechnol, 2008.

Baborová, P., Möder, M., Baldrian, P., Cajthamlová,

K., Cajthaml, T. Purification of a new manganese pe-

AGRADECIMENTOS

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

roxidase of the white-rot fungus Irpex lacteus,

and degradation of polycyclic aromatic hydrocar-

bons by the enzyme. Research in Microbiology.

57: 248-253, 2006.

Banat, I.M. Biosurfactants Production And Pos-

sible Uses In Microbial Enhanced Oil Recovery

And Oil Pollution Remediation: A Review. Biore-

source Technology. 51: 1-12, 1995.

Bicca, F.C., Fleck, L.C., M.A.Z., Production of Bi-

osurfactant by Hydrocarbon Degrading Rhodo-

coccus Ruber and Rhodococcus Erythropolis.

Revista de Microbiologia. 30: 231-236, 1999.

Bugni, T.S., Ireland, C.M. Marine-derived fungi: a

chemically and biologically diverse group of mi-

croorganisms. Nat Prod Rep 21: 143-63, 2004.

Capotorti, G., Digianvincenzo, P., Cesti, P., Ber-

nardi, A., Guglielmetti, G. Pyrene and benzo-

(a)pyrene metabolism by an Aspergillus terreus

strain isolated from a polycylic aromatic hydro-

carbons polluted soil. Biodegradation.15: 79-85,

2004.

Cerniglia C.E., Sutherland, J.B. Bioremediation

of polycyclyc aromatic hydrocarbons by ligni-

nolyticand non-ligninolytic fungi. In Britsh Myco-

logical Society Symposium Series, Fungi in Bio-

remediation, ed. Gadd, G.M. Cambridge Univer-

sity Press, p. 136-187, 2001.

da Silva, M.; Cerniglia, C.E.; Pothuluri, J.V.; Ca-

nhos, V.P. Screening filamentous funfi isolated

from estuarine sedments for the ability to oxidize

polycyclic aromatic hydrocarbons. World Journal

of Microbiology & Biotechnology. 19: 399-405,

2003.

da Silva, M.; Espósito, E.; Moody, J. D.; Canhos,

V. P.; Cerniglia, C. E. Metabolism of aromatic

hydrocarbons by the fialmentous fungus

Cyclothyrium sp. Chemosphere. 57: 943-952,

2004.

da Silva M., Passarini M.R.Z., Bonugli R.C., Set-

te L.D. Cnidarian-derived filamentous fungi from

Brazil: isolation, characterisation and RBBR de-

colourisation screening. Environ Technol 29:

1331-1339, 2008.

Dias J.C. Contingenciamento Para Derrames de

Óleo No Mar A Partir De Estudo De Análise de

Riscos. Trabalho Individual Livre. Disponivel em:

<http://www.tecnoworkconsultoria.com.br/pdf/tx

t.pdf>, Acesso em: 10 março 2009.

Desai, J.D., Banat, I.M. Microbial Production of

Surfactants and Their Commercial Potential. Mi-

crobiology And Molecular Biology Reviews. 61:

47-64, 1997.

Ferrão, C. M. Derramamentos de óleo no mar

por navios petroleiros. Trabalho de conclusão de

curso (Especialização em MBE - Pós Gradua-

ção em Executiva do Meio Ambiente) - Instituto

Alberto Luiz Coimbra de Pós-Graduação, Rio de

Janeiro, 2005.

Fingas, Merv. The Basics of Oil Spill Cleanup.

Washington, Lewis Publishers, 2001.

Johnson, V., Singh, M., Saini, V.S., Adhikari, D.K.,

Sista, V., Yadav, N.K. Biotechnol. Lett. 6: 487-490,

1992.

Korda, A.; Santas, P.; Tenente, A.; Santas, R. Pe-

troleum hydrocarbon bioremediation: sampling

and analytical techniques, in situ treatments and

commercial microorganisms currently used. Appli-

ed and Environmental Microbiology, v. 48, p. 677-

686, 1997.

Potin, O., Rafin, C.; Veignie, E. Bioremediation of

an aged polycyclic aromatic hydrocarbons

(PAHs)-contaminated soil by filamentous fungi iso-

lated from the soil. International Biodeterioration &

Biodegradation. 54: 45-52, 2004a.

Potin, O.; Veignie, E.; Rafin, C. Biodegradation of

polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by Cla-

dosporium sphaerospermum isolated from an

aged PAH contaminated soil. Microbiology Eco-

logy. 51: 71-78, 2004b.

Ravelet, C.; Krivobok, S.; Sage, L.; Steiman, R. Bi-

odegradation of pyrene by sediment fungi. Che-

mosphere. 40: 557-63, 2000.

Sato, A., Watanabe, Y., Nugroho, N. B., Chrisna-

yanti, E., Natusion, U. J., Koesnandar, and Nishi-

da, H. Screening for dioxin-degrading basidiomy-

cetes from temperate and tropical forests. World J.

Microbiol. Biotechnol. 19: 763-766, 2003.

Sette, L.D., Oliveira, V.M., Manfio, G.P. Isolation

and characterization of alachlor-degrading acti-

nomycetes from soil. Antonie van Leeuwenhoek.

87: 81-89, 2005.

Sette L.D.; Passarini, M.R.Z.; Delarmelina, C.; Sa-

lati, F.; Duarte, M.C.T. Molecular characterization

and antimicrobial activity of endophytic fungi from

coffee plants. World Journal of Microbiology & Bio-

technology. 22: 1185-1195, 2006.

Vasconcellos, S. P. Tese de Doutorado. Atividades

enzimáticas e de biodegradação de microrganis-

mos do petróleo da Bacia de Campos (Pampo

Sul). São Paulo: Universidade Estadual de Cam-

pinas. 2006.

Vitali, V. M. V., Machado, K. M. G., de Andrea, M.

M. and Bononi, V. L. R., Screening mitosporic fungi

for organochloride degradation. Braz. J. Microbiol.

37: 256-261 2006.

Willumsen, P. A. & Karlson, V. Biodegradation. 7:

415-423, 1997.

17

18

OBTENÇÃO DE PIGMENTOS NATURAIS A PARTIR DO CULTIVO DE MONASCUS SP

Ciência in Foco

Débora Domenes Palmieri RodriguezNatura Inovação e Tecnologia de Produtos Ltda., Departamento de Tecnologia de Insumos - Biotecnologia

Rodovia Anhanguera, Km 30,5 Bloco A. 07750-000, Cajamar, São Paulo Brasil.

RESUMO

Os pigmentos naturais produzidos pelo

fungo filamentoso Monascus sp são tradi-

cionalmente utilizados nos países orienta-

is asiáticos, principalmente no sul da Chi-

na, Taiwan, Japão e Indonésia. Tem sido

objeto de intensivas pesquisas nas últimas

décadas devido ao seu potencial de apli-

cação na coloração de vários alimentos.

Atualmente esses pigmentos estão substi-

tuindo os sais de nitrito, precursores da ni-

trosamina. São tradicionalmente cultiva-

dos em meio sólido, grãos de arroz ou pão

(fermentação sólida). Porém, o controle de

alguns parâmetros de cultivo, tais como

transferência de oxigênio, concentração

celular e umidade, é difícil neste tipo de cul-

tivo. Por esse motivo, recentemente inicia-

ram-se diversos estudos a respeito do cul-

tivo de Monascus sp em meios de cultura

líquidos (fermentação submersa). O gêne-

ro Monascus é dividido em sete espécies

denominadas M. ruber, M. pilosus, M. pur-

pureus, M floridans, M. pallens, M. sangui-

neus e M. mucoroides, sendo M. ruber, M.

purpureus e M. pilosus as espécies de mai-

or importância para indústria alimentícia.

Produz seis principais pigmentos: verme-

lhos: rubropunctamina e monascorubra-

mina, amarelos: monascina e ankaflavina

e laranjas: rubropunctatina e monascoru-

bina. Através de estudos de purificação e

identificação foi isolado um composto de-

nominado monascidina A, também conhe-

cido como citrinina. Trata-se de uma mico-

toxina de ação nefrotóxica que também é

um poderoso antibiótico. O principal objeti-

vo deste trabalho foi realizar uma revisão

bibliográfica a respeito da obtenção de pig-

mentos naturais a partir do cultivo do fungo

filamentoso Monascus sp abordando os

aspectos legais e mercadológicos quanto

ao uso de pigmentos naturais no Brasil e

no mundo, as vantagens e desvantagens

da produção desses pigmentos, as carac-

terísticas microscópicas e macroscópicas

do gênero Monascus, as principais cepas

produtoras de pigmentos, os principais ti-

pos de pigmentos produzidos, os métodos

de fermentação, produção de citrinina, con-

dições de cultivo e os processos de extra-

ção e purificação desses pigmentos. Com

base na pesquisa realizada, conclui-se

que os estudos relacionados à produção

de biopigmentos a partir do cultivo de Mo-

nascus sp não retratam a viabilidade de

produzi-los em escala industrial, já que

são realizados em escala de bancada.

Isso só será minimizado quando for possí-

vel uma maior interação entre a universi-

dade e o setor industrial.

Ao final do século XIX, o desenvolvi-

mento da indústria alimentícia levou à pro-

dução de diversos corantes sintéticos, os

quais chegaram a totalizar o número de

700. Seguiu-se, então, a elaboração de le-

is para o uso destes corantes, com o obje-

tivo de proteger a saúde do consumidor.

Desse modo, no início do século XX, uma

lista de corantes permitidos foi divulgada

nos Estados Unidos e atualmente, apenas

cinco corantes sintéticos são permitidos.

Nos últimos anos, a preocupação dos con-

sumidores com a qualidade dos alimentos

vem aumentando, e por isso há uma ten-

dência cada vez maior de preferência por

1. INTRODUÇÃO

19

produtos naturais (Ribeiro, et al., 2004).

A utilização de substâncias sintéticas,

derivadas de produtos petroquímicos, atin-

ge diretamente a produção de corantes ali-

mentares, fato este que preocupa quanto

ao aspecto de alterações orgânicas que

possam ser causadas pela ingestão des-

tas substâncias ao longo do tempo (Hipler,

et al., 2002). De vinte e nove corantes para

alimentos aprovados pela União Européia,

dezesseis são sintetizados quimicamente,

e treze provêm de fontes naturais. É bem

provável que o aumento das restrições

quanto aos derivados petroquímicos ve-

nha a eliminar alguns corantes que são atu-

almente utilizados. Conseqüentemente,

há necessidade de se encontrar fontes al-

ternativas para corantes em alimentos,

sendo a cultura microbiana uma ferramen-

ta importante a ser explorada. Assim, os

pigmentos microbianos, apresentam-se

como uma alternativa viável aos outros pig-

mentos naturais de origem animal ou vege-

tal, porque, além de serem considerados

naturais, não apresentam problemas de

sazonalidade e possuem alta produtivida-

de (Carvalho, 2004).

Entre os pigmentos passíveis de pro-

dução por fermentação, destacam-se os

pigmentos de Monascus sp, um fungo fila-

mentoso que produz uma série de pigmen-

tos de estrutura policetídica, com cores

que variam entre tons de amarelo, laranja

e vermelho. Como ocorre com diversos ou-

tros fungos, as linhagens de Monascus pro-

duzem também micotoxinas, contaminan-

tes, cuja quantidade deve ser a mínima

possível em um produto. No caso de Mo-

nascus sp, a micotoxina produzida é a citri-

nina, uma substância nefrotóxica que tam-

bém apresenta atividade antibiótica (Pisa-

reva, et al., 2005).

Os pigmentos de Monascus sp vêm

sendo utilizados em alimentos tradiciona-

is, em países orientais, há séculos. No en-

tanto, a pesquisa sobre a produção e apli-

cação industrial desses pigmentos é bem

mais recente e ganhou força especialmen-

te na última década, em conjunção com a

produção de outros aditivos alimentares

por fermentação. A produção tradicional

desses pigmentos é feita por fermentação

em arroz (fermentação sólida), sendo que

a produção industrial normalmente utiliza

a fermentação em meios de cultivo líquidos

(fermentação submersa) (Moritz, 2005).

Vale ressaltar que a maioria dos estu-

dos apresentados atualmente, tanto no Bra-

sil, quanto no Japão, Estados Unidos, Fran-

ça e Alemanha são realizados com fermen-

tação sólida, uma vez que neste tipo de fer-

mentação a produção de pigmentos de Mo-

nascus sp é ainda maior. Porém, alguns au-

tores (Hajjaj, et al., 2000), afirmam que a

produção de pigmentos de Monascus sp

em cultivo submerso deve ser melhor ex-

plorada, por acreditarem ser possível pro-

duzir elevadas concentrações destes co-

rantes neste tipo de processo, além de pos-

sibilitar melhor controle dos parâmetros de

cultivo quando comparado ao cultivo em

substrato sólido. Estratégias para extrair o

pigmento do interior das células fúngicas,

descobertas de novos metabólitos bioati-

vos e enzimas de interesse comercial, são

atrativos que favorecem o investimento nes-

ta área de conhecimento. Além disso, é sa-

bido que moléculas tóxicas (citrinina) são

produzidas concomitantemente com os pig-

mentos de Monascus sp durante o cultivo

em meio sólido ou líquido (submerso). Este

fato é extremamente importante, uma vez

que a utilização dos pigmentos de Monas-

cus foi proibida em alguns países devido à

presença de citrinina. Tal avaliação ainda é

polêmica na atualidade, pois, segundo vá-

rios autores, o potencial tóxico da citrinina é

muito mais baixo que da nitrosamina utiliza-

da em carnes curadas (Bakosova, 2001).

Embora o consumo de um determinado

alimento devesse depender principalmente

do seu valor nutricional, a sua cor, aroma e

textura são fatores que conduzem à prefe-

rência do consumidor. Dentre estes fatores,

a cor é o mais importante fator de preferên-

cia, já que a qualidade que mais facilmente

desperta a atenção do consumidor e é con-

seqüentemente o principal critério para

identificação e julgamento da qualidade do

produto (Ribeiro, et al., 2004).

Pigmentos sintéticos, tradicionalmente

usados nos processamentos alimentícios,

continuam sendo utilizados com sucesso,

mas, por outro lado, está ocorrendo o au-

mento da preferência do consumidor por

aditivos alimentares naturais. Apesar da óti-

2. PIGMENTOS E CORANTES

ma oportunidade na utilização de pigmen-

tos de origem biotecnológica, como o

-caroteno e a riboflavina, seu segmento é

limitado. Isto se deve ao custo elevado de

produção destes pigmentos extraídos de

fontes naturais em relação aos pigmentos

sintéticos (Bailly, et al., 2002).

Uma grande variedade de vegetais,

plantas, animais e microrganismos produ-

zem pigmentos. Sua forma de produção é

variada e a tecnologia utilizada para sua

produção, depende principalmente, do

agente empregado neste processo (Ribei-

ro, et. al., 2004).

Tanto os corantes naturais como os sin-

téticos são, na maioria das vezes, isentos

de qualquer valor nutricional. A maior des-

vantagem dos corantes sintéticos se deve à

crescente descoberta de efeitos desagra-

dáveis como toxicidade, mutagênese e po-

tencial carcinogênico (Bailly, et al., 2002).

Quase todos os pigmentos naturais pre-

sentes nos alimentos possuem estruturas

complexas com diferentes grupos funcio-

nais nas moléculas. Os principais tipos de

pigmentos naturais estão agrupados pelo

tipo de estrutura básica em: porfirinas, beta-

laínas, flavonóides (antocianinas - cores

azul e vermelho, antoxantinas - cores nos

tons amarelos, leucoantocianidinas - inco-

lores), carotenóides, taninos e outros pig-

mentos como quinonas - ácido carmínico,

polifenóis, Monascus - Monascin, etc.) (Du-

ran, et.al., 2002).

Inovações tecnológicas podem melho-

rar a produção de pigmentos, melhorando

microrganismos ou formando novas linha-

gens que justifiquem a substituição dos pro-

dutos sintéticos. Neste contexto, o desen-

volvimento de novos sistemas fermentati-

vos como cultura de células, de plantas ou

microalgas, em níveis competitivos; ou ain-

da técnicas de mutagênese que aumentem

a produtividade destes metabólitos e/ou re-

duzam sua toxicidade. Oportunidades adi-

cionais para pigmentos derivados de fer-

mentação existem em função da raridade

do produto ou na dificuldade de síntese, co-

mo por exemplo, o pigmento Monascus, as

ficocianinas e as xantofilas, onde avanços

tecnológicos sempre serão de grande con-

tribuição (Duran, et al., 2002).

Embora os corantes sejam considera-

dos essenciais à indústria alimentícia, po-

ß

dendo ser obtidos através de fontes natu-

rais, este campo ainda é pouco explorado,

em particular os produzidos por microrga-

nismos. Os corantes vermelhos produzi-

dos por culturas em meios sólidos (arroz,

por exemplo) são os mais estudados na

Ásia, por diversas espécies do gênero Mo-

nascus; utilizados principalmente para co-

lorir alimentos fermentados. Isso demons-

tra que os países em desenvolvimento tam-

bém podem investir neste campo de co-

nhecimento, buscando competir neste

mercado, principalmente o Brasil devido a

sua imensa biodiversidade (Moritz, 2005).

Corantes são considerados essenciais

na indústria de processamento de alimen-

tos. A maioria dos corantes naturais é ex-

traída de plantas ou de produtos de plan-

tas ou são produzidos por microrganis-

mos. Uma vez que o número de corantes

sintéticos está diminuindo devido aos inde-

sejáveis efeitos tóxicos incluindo mutage-

nicidade e potencial carcinogênico, o foco

no desenvolvimento de pigmentos para ali-

mentos de fontes naturais está aumentan-

do (Constant, et al., 2002).

A literatura é farta em apontar cuidados

com a ingestão de corantes sintéticos, ape-

sar do grande uso deles pelos produtores

de alimentos e bebidas processadas.

Esses corantes são pigmentos ou tintas

sintéticas do grupo azóico, sendo a maior

parte delas sintetizadas a partir do alca-

trão do carvão mineral. Aproximadamente

20% da população é alérgica a esses co-

rantes artificiais. A quantidade dos coran-

tes sintéticos em produtos não é muito

grande (em frações médias de 0,01%),

mas preocupam os especialistas a fre-

qüência do expressivo consumo diário nos

mais variados alimentos e bebidas, desde

balas, laticínios, sobremesas até refrige-

rantes e sucos (Constant, et al., 2002; Du-

fossé, 2006).

As pesquisas nessa área, além de aler-

tar sobre os limites de tolerância dos co-

rantes permitidos, já fizeram vários sintéti-

cos serem proibidos pela maior parte dos

países. A publicação de estudos do Codex

Alimentarius, já fundamentou a eliminação

de alguns corantes por ministérios da saú-

2.1 CORANTES NATURAIS X CORAN-

TES SINTÉTICOS

de de todo o mundo, inclusive o brasileiro.

Os Estados Unidos, onde apenas cinco sin-

téticos são permitidos, e o Japão já alerta-

ram suas indústrias de que pretendem ba-

ni-los na próxima década. A Austrália e os

países escandinavos também possuem le-

is restritivas aos corantes sintéticos e o

mesmo deve ocorrer nos demais países

europeus, que já dão preferência a produ-

tos naturais (Constant, et al., 2002).

A legislação brasileira, atualizada com

boa parte das leis internacionais e seguin-

do as recomendações multilaterais da

FAO (Food and Agriculture Organization),

permite apenas oito sintéticos e mais cinco

sintéticos idênticos aos naturais (betaca-

roteno, beta-apo 8' carotenal, éster etílico

do ácido beta-apo 8 carotenóico, riboflavi-

na e xantofila). A permissão é condiciona-

da à indicação nos rótulos sobre a sua con-

dição sintética e sobre a ingestão diária

aceitável (Anvisa, 2008).

Como resposta aos riscos e má fama

dos sintéticos, os corantes naturais vêm

ganhando espaço. Trata-se de uma con-

quista gradual, não maior por causa das

vantagens competitivas dos sintéticos.

Além da estabilidade bastante superior

aos naturais, esses corantes artificiais pos-

suem maior capacidade tintorial, traduzida

por um poder de melhor fixação nos ali-

mentos, com cores mais intensas e menor

custo, tanto por necessitar de dosagens

menores como por seu preço direto infe-

rior (Sato et. al., 1992).

Os desenvolvimentos de novos coran-

tes englobam as principais famílias cromá-

ticas dos corantes naturais: amarelo (cur-

cumina, luteína, carotena); a laranja (uru-

cum e páprica); vermelho (carmim, licope-

na, betanina e antociana) e verde (clorofi-

la). Mas, de forma específica, prevalece-

ram nos cinco corantes naturais conside-

rados de maior importância no mercado

mundial: o urucum, a páprica, a cúrcuma,

as antocianinas e o carmim de cochonilha.

Destacam-se ainda os esforços para tor-

nar os corantes solúveis em água. Isso é

possível com o encapsulamento dos co-

rantes em bases de amido, gomas e gelati-

nas, tornando-os uma emulsão. Isso am-

plia o uso para outros produtos, tendo em

vista que a maior parte deles, sobretudo os

carotenóides e antraquinonas, são ape-

nas lipossolúveis (Constant, et. al., 2002).

A notoriedade que os corantes naturais

vêm assumindo deve-se não só à tendência

mundial de consumo de produtos naturais,

mas também às propriedades funcionais

atribuídas a alguns desses pigmentos. O

apelo mercadológico estimula cada vez ma-

is o desenvolvimento de novos estudos com

o intuito de superar as limitações tecnológi-

cas existentes (Constant, et. al., 2002).

Os corantes naturais obtidos através de

diversos processos, além de serem reco-

nhecidos com o rótulo "naturais", apresen-

tam outras vantagens, como:

• São encontrados em vegetais, frutas,

raízes e sementes. Estima-se que somente

0,5% das plantas terrestres são exploradas

quanto ao uso de seus corantes. Portanto, a

exploração de pigmentos naturais pode

crescer muito, embora novas moléculas de-

vam passar por todas as etapas do Food

and Drug Administration (FDA) antes do uso

regulamentar, demandando elevados in-

vestimentos (Moritz, 2005).

• Na formulação do pigmento natural in-

dustrializado, são utilizadas moléculas que

conferem maior solubilidade, estabilidade,

poder de emulsificação. Estes são fatores

importantes que favorecem sua substitui-

ção em detrimento dos pigmentos sintéticos

(Kilikian, 2002).

Como principais desvantagens para a

obtenção dos corantes naturais, citam-se:

• Estas moléculas possuem baixa solu-

bilidade em água. Porém, podem facilmente

reagir com compostos aminados do meio de

cultura e formar complexos solúveis em

água (Moritz, 2005).

• A cinética do cultivo submerso para ob-

tenção dos corantes naturais tem sido pou-

co descrita na literatura refletindo em pouco

conhecimento dos parâmetros cinéticos e,

conseqüentemente, um aumento na escala

de reatores mais eficazes para produção

desses pigmentos (Pereira, et. al., 2003).

• Formação conjunta de metabólitos in-

desejáveis (por exemplo, citrinina), deman-

dando a necessidade de realização de tes-

tes de seguranças, que são caros e longos,

antes do emprego desses produtos como

aditivos alimentares (situação nos países

2.2 VANTAGENS E DESVANTAGENS DA

PRODUÇÃO DE CORANTES NATURAIS

20

desenvolvidos) (Moritz, 2005).

• A maioria dos pigmentos obtidos por

processos biotecnológicos, não são ex-

cretados pelas células, mas sim, armaze-

nados em seu interior, aumentando com is-

so, os gastos com processos de extração

e purificação dos corantes intracelulares

(Kilikian, 2002).

Embora o custo de produção dos co-

rantes naturais seja mais elevado em rela-

ção aos sintéticos, o interesse por esses

produtos está crescendo no Brasil e no

mundo. Segundo a "Biotropical" empresa

de corantes naturais, localizada no Belém

do Pará, citado por Maimom (2000), o mer-

cado internacional de corantes naturais

movimenta cerca de US$ 5 bilhões. Em ter-

mos da distribuição geográfica, estimou-

se que esta apenas acompanha o merca-

do de alimentos, aumentando-se a partici-

pação do Japão, pelo fato desse país re-

gistrar um consumo privilegiado de coran-

tes naturais. Sendo assim, pesquisadores

nacionais citaram, em seu último relatório,

a seguinte participação no mercado: EUA

(30%), Japão e Ásia (30%), resto do mun-

do (10%) (Maimom, 2000).

No Brasil, a legislação de alimentos e

cosméticos está a cargo do Ministério da

Saúde, sendo que as normas brasileiras

de corantes e aditivos são baseadas nas

normas americanas especificadas pelo

FDA (Food and Drug Administration) (Car-

valho, 2004).

De acordo com a Portaria SVS/MS

540/97, considera-se corante a substância

ou a mistura de substâncias que possuem

a propriedade de conferir ou intensificar a

coloração de alimentos e bebidas.

Pela Resolução - CNPA n° 44, de

1977, os corantes são classificados em:

a) Corante Orgânico Natural: é aque-

le obtido a partir de um vegetal ou, eventu-

almente, de um animal, cujo princípio te-

nha sido isolado com o emprego de pro-

cessos tecnológicos adequados.

b) Corante Orgânico Sintético: é

aquele obtido por síntese orgânica, medi-

ante emprego de processos tecnológicos

adequados, e não encontrado em produ-

tos naturais.

2.3 LEGISLAÇÃO NACIONAL E INTER-

NACIONAL DE CORANTES

c) Corante Artificial: é o corante orgâ-

nico sintético não encontrado em produtos

naturais;

d) Corante Orgânico Sintético Idên-

tico ao Natural: é o corante elaborado sin-

teticamente, cuja estrutura química é se-

melhante a do princípio isolado do corante

orgânico natural.

e) Corante Inorgânico: é aquele obti-

do a partir de substâncias minerais e sub-

metido a processos de elaboração e purifi-

cação adequados a seu emprego em ali-

mentos.

f) Corante Caramelo: é aquele obtido

através do aquecimento controlado do açú-

car invertido ou de outros carboidratos na

presença de compostos de amônia e de

sulfitos.

g) Corante Caramelo (processo amô-

nia): é o corante orgânico sintético idênti-

co ao natural obtido pelo processo amô-

nia, desde que o teor de 4-metil, imidazol

não exceda no mesmo a 200mg. kg-¹.

Pela legislação atual através das reso-

luções n.º. 382 e 388 da ANVISA, no Brasil

é permitido o uso de apenas oito corantes

artificiais: amarelo crepúsculo, tartrazina,

azul brilhante, indigotina, Bordeaux S

(amaranto), eritrosina, ponceau 4R e ver-

melho 40.

Facilmente encontrado em diversos

ecossistemas, fungos do gênero Monas-

cus são usados tradicionalmente em paí-

ses orientais, originalmente na China e na

Tailândia. Enquanto alguns metabólitos do

Monascus sp são importantes devido à for-

te coloração, outros possuem atividade hi-

pocolesterêmica e antimicrobiana, e vêm

sendo estudados com mais intensidade na

última década (Carvalho, 2004). São culti-

vados tradicionalmente em meio sólido,

grão de arroz ou pão. Porém, o controle de

alguns parâmetros de cultivo tais como

transferência de oxigênio, concentração

celular e umidade, é difícil neste tipo de cul-

tivo. Já em cultivo submerso em meio com-

plexo ou sintético, os estudos começaram

a ser desenvolvidos recentemente (Oroz-

co, et al. 2008).

3. GÊNERO MONASCUS

3.1 OCORRÊNCIA DO MICRORGANIS-

MO

O gênero Monascus é dividido em sete

espécies denominadas M. ruber, M. pilo-

sus, M. purpureus, M. floridans, M. pallens

e M. sanguineus e M. mucoroides. Porém,

as espécies de maior importância para a in-

dústria alimentícia são: M. ruber, M. purpu-

reus e M. pilosus (Wang, 2005).

Recentemente, pesquisadores estu-

dando fungos termorresistentes, descobri-

ram que o fungo Monascus ruber também

faz parte deste grupo, tendo sido isolado

após processamento térmico de conser-

vantes de azeitonas verdes (Panagou, et

al., 2003).

Há formação de colônias de 20 a 30 mm

de diâmetro em PDA, após 7 dias. As colô-

nias são planas, eventualmente com pe-

queno desenvolvimento aéreo, esparsas,

com textura superficial floculenta, micélio

inicialmente branco (1 a 2 dias), passando

para laranja, a vermelho pardo à medida

que a cultura se desenvolve, com a forma-

ção de cleistotécios (Figura 1). Geralmente

há formação de pigmentos solúveis que se

difundem no ágar. Os cleistotécios são esfé-

ricos, de 30 a 60 m de diâmetro, formados

como um nó de hifas a partir de um "pedún-

culo" bem definido, com paredes celulares

tornando-se marrons com a maturação; as-

cósporos, elipsóides, hialinos, 5-7 x 4-

4,5 m, parede celular lisa. As colônias de

M. ruber são de crescimento mais rápido

que as outras espécies (Carvalho, 2004).

A escolha dos nutrientes adequados à

geração do produto de interesse está rela-

cionada à atividade metabólica desenvolvi-

da pelos microrganismos. Destaca-se a im-

portância das informações obtidas sobre as

exigências nutricionais dos organismos en-

volvidos no processo (Moritz, 2005).

Assim, é preciso suplementar o meio de

cultivo ou controlar os componentes que

possam inibir o seu desenvolvimento, de

modo a permitir uma rápida e eficiente con-

versão da fonte de carbono em produto

(Carvalho, 2004).

Os pigmentos produzidos por Monas-

cus são tradicionalmente produzidos por

3.2 MORFOLOGIA

3.3 FATORES QUE INFLUENCIAM O

CRESCIMENTO E A PRODUÇÃO DE

METABÓLITOS

µ

µ

21

22

processos biotecnológicos em estado sóli-

do ou pedaços de pão ou arroz. Estudos

envolvendo cultivos submersos têm au-

mentado recentemente (Hajjaj et al.,

2000). Os principais fatores que influenci-

am o crescimento e produção de pigmen-

tos são: composição do meio de cultivo,

temperatura, presença de oxigênio e aera-

ção, pH, fonte de nitrogênio e umidade

(Carvalho, 2004).

Temperatura: A faixa de temperatura

ótima é, em média, de 28-32°C, de acordo

com os registros de cada espécie em ban-

cos de cepas, embora essa temperatura

varie dependendo da linhagem entre 25°C

e 37° C (Rasheva et al., 1997).

Presença de oxigênio: Os fungos do

gênero Monascus são incapazes de cres-

cimento estritamente anaeróbio usando gli-

cose como substrato, mas podem crescer

em condições de limitação de oxigênio.

Nessas condições, aumenta a produção

de etanol e de CO , mas há menor produ-²

ção de pigmento; em condição de maior ae-

ração, a produção de etanol diminui en-

quanto a de pigmento aumenta. Obser-

vou-se ainda que um aumento na pressão

parcial do CO aumenta a produção de pig-²

mento (Rasheva et al., 1997).

pH inicial: Em diferentes trabalhos ob-

servou-se crescimento em uma ampla fai-

xa de pH, desde 2,5 até 8,0, sendo a faixa

ideal de 4,0 a 7,0 (Yongsmith et al., 1993).

pH durante o crescimento: A mudan-

ça de pH durante o crescimento depende

das fontes de nitrogênio, em primeiro lu-

gar, e em segundo das fontes de carbono.

Independentemente do pH inicial, o pH fi-

Figura 1: Cultura de Monascus em PDA, após 7 dias de incubação a 32°C. Nota-se o halo de difusão de pigmentos e a cor característica do micélio.

nal tende a ser o mesmo na faixa de 7 a 8.

(Yongsmith, et al., 1993).

Teor de umidade em meios sólidos:

O processo tradicional de produção de ang-

kak é o mesmo usado para outras varieda-

des de koji (arroz fermentado com diferen-

tes espécies de fungos, geralmente Asper-

gillus), daí o nome alternativo "koji verme-

lho". A umidade exigida na fermentação de

arroz varia dependendo da descrição tradi-

cional, mas recomenda-se que a umidade

seja suficiente para garantir o crescimento

do micélio pelo grão sem a desintegração

dos grãos (faixa de 56% com pH 6) (Yong-

smith, et al., 1993).

Composição do meio de cultivo:

Fontes de carbono: diversas fontes de

carbono vêm sendo usadas como substra-

to para o crescimento de Monascus sp, sen-

do as mais comuns a glicose, a sacarose e

o amido. O melhor crescimento geralmente

é observado com glicose. A produção volu-

métrica de pigmento em meio submerso é

melhor com amido e dextrina, enquanto a

produção específica é melhor com maltose

e quase tão boa quanto com glicose, mas

essa comparação entre açúcares deve ser

feita verificando-se cuidadosamente as con-

centrações. Uma boa fonte alternativa de

carbono é o etanol, que é produzido natu-

ralmente pelo fungo em condições de limi-

tação de oxigênio ou excesso de glicose

(Yongsmith, et al., 1993).

Fontes de nitrogênio: as fontes de ni-

trogênio usadas para o crescimento de Mo-

nascus sp vão desde nitrogênio inorgânico

(amônia e nitratos) até peptonas. Na produ-

ção tradicional de angkak, não há necessi-

dade de adição de fonte de nitrogênio, já que

o arroz possui de 5 a 8% de proteínas, (base

seca). Ao usar outros substratos, a adição

de uma fonte de nitrogênio (especialmente

nitrogênio orgânico) estimula a produção de

pigmentos (Carvalho, et al., 2004).

Outros Fatores Nutricionais: diversos

outros fatores podem afetar o crescimento

do fungo e a produção de pigmentos. Altas

concentrações de fosfato e de sulfato de

magnésio são inibidoras da produção de pig-

mentos; por outro lado, o crescimento é uma

função linear e crescente da concentração

de MgSO4, na faixa de 0,5-16mM. A adição

de óleo de milho estimula (dobra) a produ-

ção de pigmento, enquanto a adição de

0,4% de tween 80 não afeta o consumo de

glicose nem retarda a taxa de crescimento,

mas aumenta a produtividade de pigmento

(Yongsmith, et al., 1993).

Diversos trabalhos foram já realizados

com relação ao estudo da toxicidade de pig-

mentos Monascus, que aparentemente são

inócuos nas quantidades testadas. O longo

tempo pelo qual os pigmentos Monascus já

vêm sendo usados depõem a favor da sua to-

xicidade baixa ou inexistente. Por algum tem-

po, desde que os fungos do gênero Monas-

cus começaram a ser estudados sistemati-

camente, acreditou-se que os pigmentos

produzidos apresentavam também proprie-

dades antibióticas; mais tarde, verificou-se

que essa atividade deve-se principalmente

a outra substância, chamada monascidina A

(Wang, et al., 2005).

Estudos posteriores mostraram que es-

sa substância é na verdade a citrinina, uma

micotoxina de ação nefrotóxica e hepatotó-

xica produzida por diversos fungos e que

nem todas as cepas de Monascus sp a pro-

duz. A síntese de citrinina é dependente da

cepa de Monascus sp, tipo de fonte de car-

bono (extrato de levedura e arroz estimulam

a síntese de citrinina e o glutamato monos-

sódico e etanol a inibem) e fatores ambien-

tais (oxigênio e temperatura) (Wang, et al.,

2005). Embora a baixa concentração de oxi-

gênio dissolvido iniba fortemente a síntese

de citrinina, também reduz a produção de

pigmentos vermelhos (Hajjaj, et al., 2000).

Não existem dados reportados que compro-

3.4 TOXICIDADE E PRODUÇÃO DE ME-

TABÓLITOS

23

dade inicial no substrato (em torno de

25%), reduzindo o risco de contaminação

e de aglomeração do substrato (Hajjaj, et

al., 2000).

O cultivo de Monascus sp tem sido rea-

lizado principalmente em meio sólido, en-

tretanto o rendimento de produção é muito

baixo para a produção em escala industri-

al. Para aumentar o rendimento de pig-

mentos, alguns pesquisadores têm focado

em culturas submersas (Hajjaj, et al.,

2000). Existem artigos abrangendo muta-

ção de cepas, mudanças na composição

dos nutrientes e mudanças nas condições

físicas de cultivo. Técnicas de cultivos en-

volvendo fed-batch, imobilização por resi-

nas poliméricas e cultivos semi-sólidos

usando sacos de plásticos (Lotong) tam-

bém foram desenvolvidas (Moritz, 2005).

A utilização de técnicas de cultivo sub-

mersas, para a produção de pigmentos de

Monascus sp tem sido estudada para mini-

mizar os problemas de espaço, escala e

controle de processos (Moritz, 2005).

Os corantes produzidos por fermenta-

ção industrial estão ainda limitados à pro-

dução de -caroteno por algas. Porém

existem muitas outras formas de produção

de corantes, com grande potencial de mer-

cado (Moritz, 2005).

Em um processo fermentativo tradicio-

nal (Figura 3), como ocorre nos países do

oriente, o pigmento formado pelo Monas-

cus sp é adicionado ao mosto de arroz.

Após um período de 2 a 4 semanas, o pro-

duto é seco e armazenado na forma de

grão ou pó (Moritz, 2005).

â

vem a influência do pH na produção de ci-

trinina (Orozco, et al., 2008).

A citrinina possui caráter fortemente

ácido, sendo praticamente insolúvel em

água, porém, solúvel em álcool aquecido,

dioxano e outros solventes não polares.

Estudos em sistemas in vivo e in vitro indi-

cam que a citrinina tem uma ação biológi-

ca na inibição da síntese do colesterol e tri-

glicérides, essa inibição possivelmente

vem sendo causada pelo dano ao sistema

de transporte e/ou interferências no meta-

bolismo energético (Carvalho, et al.,

2005).

Fink-Gremmels et al., 1991 e Carvalho,

et al., 2005, mediram a atividade antibac-

teriana dos pigmentos Monascus depois

de empregados em alimentos e o resulta-

do foi uma ação inibitória contra Listeria

monocytogenes, Salmonella, Escherichia

coli, Bacillus subtilis, Enterococcus faeca-

lis e Staphylococcus aureus.

Embora não haja uma conclusão defi-

nitiva sobre a toxicidade dos pigmentos e

da produção de citrinina em processos in-

dustriais, diversas ações podem ser toma-

das para evitar ou minorar a produção de

toxinas: o uso de cepas que não produzam

citrinina; o controle da fonte de nitrogênio

(fontes de nitrogênio orgânico favorecem

a produção de pigmentos vermelhos e des-

favorecem a produção de citrinina); o con-

trole das condições de cultivo (aeração,

pH, fermentação sólida ou submersa); a

transformação de pigmentos laranja em

complexos vermelhos, atóxicos, usando

aminoácidos e a extração em condições

de baixa solubilidade de citrinina, o que po-

de ser feito controlando-se o pH, já que a ci-

trinina apresenta caráter fortemente ácido

(Orozco, et al., 2008).

Também foi isolada em várias cepas de

Monascus sp uma substância chamada

mevinolina, também conhecida como lo-

vastatina, monacolina ou mecavor. Essa

substância é um potente competitivo da en-

zima HMG-CoA (3-hidroxi-3-metilglutaril-

coenzima A) que limita a biossíntese do

colesterol. Ela é efetiva na hipercolestero-

lemia, sendo usada como produto medici-

nal. Foi primeiramente isolada de Asper-

gillus terreus (Pattanagul, et al., 2008).

O cultivo tradicional de fungos do gêne-

ro Monascus para produção de pigmentos

é feito em suporte de arroz, obtendo assim

altas concentrações destes metabólitos se-

cundários. Uma das condições para o su-

cesso do cultivo é a utilização de baixa umi-

4. PRODUÇÃO DE PIGMENTOS Monas-

cus - VIA BIOTECNOLÓGICA

Citrinina Mevinolina

Figura 2: Estrutura química dos principais metabólitos produzidos pelo gênero Monascus.

Figura 3: Esquema ilustrativo do processo de produção industrial do pigmento Monascus.

5. CARACTERÍSTICAS DO PIGMENTO

DE Monascus sp

Pigmentos de Monascus formam um

grupo de metabólitos secundários chama-

dos azafilonas, produzindo seis tipos de

pigmentos, divididos em três grupos:

1. Pigmento laranja: rubropunctatina

(C 2 1 H 2 3 NO 4 ) e monascu rub r i na

(C23H26NO4);

2. Pigmento vermelho: rubropuncta-

mina (C21H23NO4) e monascurubramina

(C23H27NO4);

3. Pigmento amarelo: monascina

(C21H26O5) e ankaflavina (C23H30O5) que

são formas reduzidas dos dois pigmentos

laranja (Figura 5) (Babitha, et al., 2007).

Embora por muito tempo se tenha reco-

nhecido que há seis pigmentos, na última

década foram descobertos alguns novos,

como a xantomonascina e o amarelo II,

possivelmente derivados da rubropuncta-

tina. Recentemente duas novas estrutu-

ras, chamadas monascopiridinas A e B,

análogos hidrogenados dos pigmentos

vermelhos, foram descritas. Esses com-

postos apresentam máximos de absorção

em UV a 306nm, e a sua contribuição na

coloração de Monascus sp ainda não foi in-

vestigada. Segundo alguns autores, há

mais de dez pigmentos, embora nem to-

dos de estrutura conhecida (Hamano, et

al., 2006).

6. EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO PI-

GMENTO Monascus

Alguns pigmentos produzidos por Mo-

nascus sp são intracelulares e insolúveis

em água, mas as condições de cultivo (es-

pecialmente relacionadas com fonte de ni-

trogênio e pH) podem resultar na forma-

ção de pigmentos extracelulares e hidros-

solúveis (Hamano, et al., 2006).

Os mecanismos de biossíntese desses

pigmentos são pouco conhecidos. No en-

tanto, a conversão de pigmentos intracelu-

lares e insolúveis em pigmentos extracelu-

lares e hidrossolúveis, pode ocorrer atra-

vés do processo de cultivo que resulta na

alta solubilização e aumento da recupera-

ção do produto no processo de downstre-

am (purificação). Uma alta produção tam-

bém pode ser obtida pela extração de pig-

mentos intracelulares utilizando métodos

de ruptura celular. Essas técnicas podem

ser classificadas como química, física, en-

zimática ou mecânica. Apesar de existirem

muitos exemplos de ruptura celular por mé-

todos enzimáticos e químicos, os métodos

mecânicos são os mais empregados pelas

indústrias. A utilização simultânea de dois

ou mais de métodos também estão em fo-

co devido à sua ação sinérgica. A escolha

do método de ruptura celular a ser utiliza-

do depende das características do micror-

ganismo (ex. composição da parede celu-

lar), do produto a ser recuperado, seu ren-

dimento, especificidade, e capital investi-

do. (Pessoa Jr., et al., 2005).

Os fungos filamentosos, como o Mo-

nascus sp, possuem uma parede celular

resistente constituída basicamente de glu-

cana e quitina, o qual necessita de alta ten-

são de cisalhamento para ser lisada. Co-

mo conseqüência dessas características,

é necessário fazer um pré-tratamento quí-

mico com solvente orgânico (normalmente

utiliza-se etanol 60%, 70%, 90% ou 95%) e

um tratamento mecânico (sonificação) pa-

ra extrair seus pigmentos (Hamano, et al.,

2006).

O uso de corantes naturais na indústria

alimentícia vem aumentando significante-

mente, seja como alternativa às restrições

legais de uso dos corantes sintéticos, seja

por exigência do consumidor por produtos

mais naturais. Nesse contexto, os pigmen-

tos microbianos são uma alternativa pro-

missora em relação a outros aditivos ex-

traídos de animais ou vegetais, porque

eles são considerados naturais, não apre-

sentam problema de sazonalidade e mos-

tram grande produtividade. Dentre os pig-

mentos produzidos por processos biotec-

nológicos, um dos mais importantes são

os pigmentos de Monascus, que são utili-

zados por séculos como corantes de ali-

mentos em países orientais, e que apre-

sentam potencial para uso em carnes, be-

bidas, sopas e molhos. O Monascus sp é

um fungo filamentoso e produz seis pig-

mentos principais, entre os quais o verme-

lho é apontado como o mais importante,

devido à sua aplicabilidade em diversos ali-

mentos. Esses pigmentos podem ser in-

tracelulares e insolúveis ou extracelulares

e hidrossolúveis, dependendo das condi-

ções de cultivo (principalmente a fonte de

nitrogênio). Os pigmentos intracelulares

necessitam de métodos de ruptura celular

para se extrair o pigmento de interesse,

sendo o mecânico o mais utilizado pela in-

dústria.

Existem inúmeros estudos sobre a

produção dos pigmentos de Monascus,

nos quais pesquisadores buscam alterna-

tivas de substratos, visando menor custo e

maior produtividade, isolamento de cepas

7. CONCLUSÃO

Figura 4: Estruturas dos principais pigmentos formados pelo gênero Monascus. Fonte: HAJJAJ et al., 2000.

24

fungi. Journal of biochemical and molecular toxi-

cology. v.42, n.1, p.53-66. 2002.

FINK-GREMMELS, J.; DRESEL,J.; LEISTNER, L.

Use of Monascus extracts as an alternative to nitri-

te in meat products. Fleischwirtsch, p.1184-1186,

1991.

HAJJAJ, H.; BLANC,P.; GROUSSAC,E.;

URIBELARREA J.L.; GOMA G.; LOUBIERE P. Ki-

netic analysis of red pigment and citrinin produ-

ction by Monascus ruber as a function of organic

acid accumulation Enz. Micr. Technol. p. 619-625,

2000.

HAMANO, P.S. e KILIKIAN, B.V. Production of red

pigments by Monascus ruber in culture media con-

taining corn steep liquor. Brazilian Journal of Che-

mical Engineering. Vol.23. p. 443-449, 2006.

HIPLER, U.C.; WIGGER-ALBERTI, W.; BAUER,

A.; ELSER,P. Case report. Monascus purpureus-a

new fungus of allergologic relevance. Mycoses,

v.45, n.1-2. p.58-60, 2002.

KILIKIAN, B. V. Produção de Enzimas e Pigmen-

tos por Processos Fermentativos. Fermentation

Technology - Modulo IV. UFSC - Florianópolis -

SC, 2002.

MAIMOM, D. Estudo de mercado de matéria-

prima: Corantes naturais (cosméticos, indústria

de alimentos), conservantes e aromatizantes, bio-

inseticidas e óleos vegetais e essenciais (cosméti-

cos e oleoquímica): PROJETO BRA/96/025 - Acor-

do SUDAM/PNUD, Rede Para Conservação e

Uso Dos Recursos Genéticos - GENAMAZ, 2000.

MARTÍNKOVÁ L.; J_ZLOVÁ, P.; VESELÝ, D. Bio-

logical activity of polyketide pigments produced by

the fungus Monascus J Appl Bacteriol 79, p. 609-

616, 1995.

MORITZ, D. E. Estudo da produção de pigmen-

tos alimentares por Monascus ruber CCT3802

em cultivo submerso. Florianópolis, 2005. 150p.

Dissertação de Doutorado - Universidade Federal

de Santa Catarina.

OROZCO, S.F.B.; PEREIRA D.G.; KILIKIAN, B.V.

Effect of pH on citrinin and red pigments producti-

on by Monascus purpureus CCT3802. World J. Mi-

crobiol. Biotechnol. p. 263-268, 2008.

PANAGOU, E.Z.; SKANDAMIS, P.N.; NYCHAS,

G.J. Modelling the combined effect of temperatu-

re, pH and aw on the growth rate of Monascus ru-

ber, a heat-resistant fungus isolated from green ta-

ble olives. Journal of applied microbiology, v.94,

n.1, p.146-156, 2003.

PATTANAGUL,P.; OINTHONG,R.; PHINMON-

GKHOL, A.; THARATHA, S. Mevinolin, citrinin and

pigments of adlay angkak fermented by Monascus

sp. International Journal of Food Microbiology. p.

20-23, 2008.

PEREIRA, D.G.; OROZCO, S.B.; TONSO, A.;

KILIKIAN, B.V. Efeito das condições de agitação e

aeração na síntese de metabólitos secundários

por Monascus purpureus CCT 3802. SINAFERM -

não produtoras de citrinina, otimização do

processo de cultivo através da suplemen-

tação dos meios e alterações dos parâme-

tros de cultivo. Todavia, todos esses estu-

dos são realizados em escala de bancada

e não retratam a viabilidade de se produzir

esses pigmentos em escala industrial o

que, de certa forma limita a sua comerciali-

zação. É necessário que haja uma maior in-

teração entre a academia e as indústrias,

pois, somente dessa forma, será possível

produzi-los em larga escala e isso vale pa-

ra uma infinidade de biomoléculas. Exis-

tem muitos trabalhos produzidos pelas uni-

versidades que, poderiam contribuir para

o desenvolvimento da sociedade, se colo-

cados em prática, mas, no Brasil, apesar

da evidente evolução nesse aspecto, ain-

da existe um grande desafio a ser vencido.

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitá-

ria. Legislação/Alimentos. Disponível em <http:

www.anvisa.gov.br/alimentos>, 2008.

BABITHA, S.; SOCCOL, C.R.; PANDEY, A. Effect

os stress on growth, pigment production and morp-

hology of Monascus sp in solid cultures. Journal of

Basic Microbiology.47.p. 118-126, 2007.

BAKOSOVA, A.M., D.; LACIAKOVA, A;

PIPOVA,M. Utilization of Monascus purpureus in

the production of food of animal origin. Bull Yet.

Inst. Pulawy, v.45, p.111-116, 2001.

BAILLY, J. D.; QUERIN, A.; LE BARS-BAILLY, S.;

BERNARD,G.; GUERRE,P. Citrinin production

and stability in cheese. Journal of food protection,

v.65, n.8, Aug, p.1317-1321, 2002.

CARVALHO, J.C. Desenvolvimento de biopro-

cesso para produção de pigmentos a partir de

Monascus por fermentação em substrato sóli-

do. Curitiba, 2004.101p. Dissertação de Doutora-

do - Universidade Federal do Paraná.

CARVALHO, J. C.; OISHI, B. O.; PANDEY, A.;

SOCCOL, C. R. Biopigments from Monascus: Stra-

in Selection, Citrinin Production and Color Stabi-

lity. Brazilian Archieves of Biology and Technology,

v. 48, n.6, p. 885-894, 2005.

CONSTANT, P.B.L.; STRINGHETA, P.C.; SANDI,

D. Corantes Alimentícios. Boletim Centro de Pes-

quisa de Processamento de Alimentos, v. 20, n. 2,

p. 203-220, 2002.

DUFOSSÉ,L. Microbial production of food grade

pigments. Food Technol. Biotechnol., v. 44, p. 313-

321, 2006.

DURAN, N.; TEIXEIRA,M.F.; R. DE CONTI,

ESPOSITO,E. Ecological-friendly pigments from

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

XIV Simpósio Nacional de Fermentações. Floria-

nópolis - SC: Anais - artigo 102 CD-room. p.7,

25

26

Corresponding author:

mais versátil entre os antimicrobianos, fru-

to da grande diversidade em termos de pro-

priedades químicas e de espectro de

ação. Existem quatro subclasses de

-lactâmicos: (I) as penicilinas e seus deri-

vados semi-sintéticos, como a penicilina

G, amoxicilina, ampicilina e ticarcilina; (II)

as cefamicinas e cefalosporinas de 1ª, 2ª,

3ª e 4ª gerações, constituindo o maior nú-

mero de representantes; (III) monobactâ-

micos, como, o aztreonam; e (IV) os carba-

penêmicos, como o imipenem, o merope-

nem e o ertapenem (2).

Ainda que os mecanismos de imper-

meabilidade e de alteração de sítio de

ação, acima citados, contribuam para a re-

sistência bacteriana aos -lactâmicos, as

â

â

â

â

â

-lactamases, enzimas capazes de clivar

o sítio de ação destes agentes, represen-

tam a maior ameaça à utilização terapêuti-

ca desta classe de antimicrobianos (3;4).

Entre os fatores que contribuíram para o

sucesso das -lactamases, destacam-se:

a crescente diversidade tanto em termos

de estrutura, como de espectro de ativida-

de; e a plasticidade das estruturas genéti-

cas que abrigam os genes que as codifi-

cam. Estes genes comumente estão loca-

lizados em elementos genéticos móveis,

capazes de conferir resistência a bactérias

antes sensíveis através da troca de mate-

rial genético, inclusive entre bactérias de

gêneros distintos (2;5).

Diferentes tipos de -lactamases já fo-

NOVOS PADRÕES DE RESISTÊNCIA: COMO INCORPORAR A DETECÇÃO NO LABORATÓRIO

Ciência in Foco

1. Renata C. Picão¹2. Danilo E. Xavier¹

3. Ana C. Gales¹* ¹ Laboratório ALERTA, Disciplina de Infectologia,

Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil;

21 3

As bactérias, procariotos que existem

há milhões de anos na superfície terrestre,

são seres extremamente adaptáveis e

que, portanto, respondem facilmente às

mudanças do ambiente. A esta capacida-

de de adaptação podemos atribuir tam-

bém o desenvolvimento de resistência os

antimicrobianos. Embora existam diver-

sas classes de antimicrobianos, as estra-

tégias utilizadas pelas bactérias para dri-

blar a ação destas drogas são limitadas,

envolvendo três principais mecanismos de

resistência: redução da acumulação intra-

celular destas drogas, modificação do sítio

de ação e alteração enzimática dos antimi-

crobianos (1).

Os -lactâmicos constituem a classe â

Ana Cristina Gales.Rua Pedro de Toledo, 781São Paulo, SP - 04039-032 - BrazilPhone/Fax: + 55-11-5084-6538Email: ana.gales@gmail.com

tante no cenário da resistência bacteriana

(3). Assim, em meados dos anos 80 as cefa-

losporinas de amplo espectro passaram a

ser amplamente utilizadas, favorecendo a

seleção de bactérias produtoras de -lacta-

mases de espectro ampliado, conhecidas

como ESBL (6). O surgimento dessas no-

vas enzimas, que apresentam atividade hi-

drolítica sobre as oximino cefalosporinas,

fez com que as opções terapêuticas entre

os agentes -lactâmicos para o tratamento

de infecções causadas por bactérias produ-

toras de ESBL ficassem limitadas aos agen-

tes carbapenêmicos. Já na década de 90, o

surgimento de bactérias produtoras de car-

bapenemases passou a ser observado, pro-

vavelmente como resposta à maior utiliza-

ção dos carbapenens na prática clínica (7).

Sempre que um novo mecanismo de re-

sistência é descrito, é importante questio-

â

â

nar qual é o impacto clínico que este cau-

saria e quais metodologias poderiam ser

ram descritos e inúmeras tentativas de es-

tabelecer um sistema de classificação para

essas enzimas foram propostas ao longo

dos anos. Atualmente, duas classificações

têm sido consideradas como de maior im-

portância: a de AMBLER, com base na es-

trutura molecular das -lactamases, e a de

BUSH-JACOBY-MEDEIROS que correla-

ciona o substrato preferencial e proprieda-

des inibitórias à estrutura molecular da enzi-

ma, como ilustrado na Tabela 1 (4).

Na tentativa de resumir a cronologia da

evolução das -lactamases, podemos di-

zer que a introdução da penicilina em larga

escala durante e após a segunda guerra

mundial foi rapidamente acompanhada pe-

lo surgimento de bactérias produtoras de

penicilinases. A descrição dessas -lacta-

mases entre bactérias antes sensíveis às

penicilinas representou um marco impor-

â

â

â

TABELA 1: CARACTERÍSTICAS FUNCIONAIS E MOLECULARES DOS PRINCIPAIS GRUPOS DE â-LACTAMASES.

Classificação de BUSH-JACOBY- Classificação de Características funcionais

MEDEIROS, 1995 AMBLER, 1989

Grupo Funcional Subgrupos Classe Molecular

1 C Enzimas cromossômicas e plasmidiais dos Gram-negativos.

Isoladamente conferem resistência a todos os â-lactâmicos, exceto

carbapenens. Não são inibidas pelo ácido clavulânico.

2 A, D Grande maioria das enzimas é inibida por ácido clavulânico

2ª A Penicilinases produzidas por Staphylococcus spp. e Enterococcus

spp. Conferem altos níveis de resistência às penicilinas

2b A â-lactamases de espectro reduzido de bactérias Gram-negativas.

Inclui TEM-1 e SHV-1.

2be A â-lactamases de espectro ampliado conferem

resistência às cefalosporinas de amplo

espectro e monobactâmicos

2br A â-lactamases derivadas da TEM resistentes ao inibidor de

â-lactamases (IRT)

2c A Enzimas que hidrolisam a carbenicilina

2d D Enzimas que hidrolisam a cloxacilina (oxacilina); pouco inibidas pelo

ácido clavulânico

2e A Cefalosporinases inibidas pelo ácido clavulânico

2f A Enzimas que hidrolisam carbapenens com sítio ativo serina,

inibidas pelo ácido clavulânico

3 3a, 3b, 3c B Metalo-â-lactamases que conferem resistência aos carbapenens e

todos os outros â-lactâmicos com exceção dos monobactâmicos.

Não são inibidas por ácido clavulânico

4 ND Enzimas não seqüenciadas que não se encaixam em outros grupos

Abreviatura: N.D., não determinada (Adaptado do artigo de Bush, 2001).

27

as cefotaximases (CTX-M) e as oxacilina-

ses (6;10); assim como à hiperexpressão

dos sistemas de efluxo MexXY-OprM (11).

Escherichia coli e Klebsiella spp. são os

principais reservatórios de enzimas do tipo

ESBL. Entretanto, nos últimos anos, tem-se

observado sua produção também por amos-

tras de Salmonella spp., Proteus spp., Ente-

robacter spp., Citrobacter spp., Serratia

spp. e Pseudomonas spp. isoladas de ambi-

ente hospitalar (6). Existem relatos da ocor-

rência de amostras de P. aeruginosa produ-

toras de ESBL em todos os continentes, evi-

denciando a grande disseminação desses

determinantes de resistência. As enzimas

do tipo ESBL que já foram descritas em P.

aeruginosa são: SHV, TEM, PER, VEB,

BEL, GES e CTX-M (10).

De forma geral, as ESBL não hidrolisam

PRODUÇÃO DE ESBL EM P. AERUGI-

NOSA

a cefoxitina e tem a sua atividade inibida

pelos inibidores de serino- -lactamases,

tais como sulbactam, ácido clavulânico e

tazobactam. Por isso, os testes fenotípi-

cos empregados no laboratório de rotina

para a detecção da produção de ESBL em

amostras clínicas se baseiam na reversão

da resistência a um substrato -lactâmico,

quando este é associado a um desses ini-

bidores (12).

As metodologias disponíveis para a de-

tecção fenotípica de ESBL são disco apro-

ximação e disco adição. Tais testes são re-

alizados em ágar Müeller-Hinton previa-

mente inoculado com uma suspensão da

bactéria a ser testada, de acordo com as re-

comendações do CLSI para o teste de dis-

co difusão (13). O teste de triagem é reco-

mendado somente para amostras de E. co-

li, K. pneumoniae, K. oxytoca e P. mirabilis

e consiste em testar os substratos

-lactâmicos como cefpodoxima, ceftazi-

â

â

Escherichia coli ,

Klesiella spp. e P.

mirabilis

Caldo de Müeller-Hinton

ajustado com cátions.

Incubar por 16-20h em ar

ambiente a 35 ± 2 C

Ágar Müeller-Hinton.

Incubar por 16-18h em ar

ambiente a 35 ± 2°C

°

Microdiluição em caldo

MIC > 2µg/ml para aztreonam,

ceftazidima, cefotaxima ou

ceftriaxona ou

MIC > 8µg/ml para

cefpodoxima.

Para P. mirabilis, MIC > 2µg/ml

para cefpodoxima, ceftazidima

ou cefotaxima.

Disco Difusão

Zonas de inibição:

Aztreonam: < 27 mm;

Cefpodoxima: < 17 mm;

Ceftazidima: < 22 mm;

Cefotaxima: < 27 mm;

Ceftriaxona: < 25 mm.

Para P. mirabilis, considerar:

Cefpodoxima: < 22 mm;

Ceftazidima: < 22 mm;

Ceftriaxone: < 27 mm

Redução 3

diluições da MIC de

ceftazidima e da

cefotaxima na

presença de 4µg/ml

de clavulanato

Aumento > 5 mm no

halo de inibição da

ceftazidima e da

cefotaxima na

presença de 10µg de

clavulanato

> Positivo:

K. pneumoniae ATCC

700603

Negativo: E. coli ATCC

25922

dima entre amostras de Pseudomonas ae-

ruginosa e (II) a emergência de amostras

clínicas de enterobactérias resistentes

aos carbapenens (9). Neste artigo preten-

demos discutir quais os mecanismos res-

ponsáveis por estes fenótipos e as estraté-

gias que podem auxiliar o laboratório clíni-

co na detecção destes mecanismos de re-

sistência.

Amostras clínicas de P. aeruginosa

que são resistentes à cefepima, mas que

mantém sensibilidade à ceftazidima, são

frequentemente isoladas em laboratórios

clínicos de diferentes partes do mundo.

Alguns estudos têm atribuído tal fenótipo a

dois principais mecanismos de resistên-

cia: à produção de ESBL, especialmente

RESISTÊNCIA À CEFEPIMA E SENSIBI-

LIDADE À CEFTAZIDIMA EM AMOS-

TRAS DE PSEUDOMONAS AERU-

GINOSA

TABELA 2: TESTES FENOTÍPICOS RECOMENDADOS PELO CLSI (2009) PARA DETECÇÃO DE AMOSTRAS

DA PRODUÇÃO DE â-LACTAMASES DE ESPECTRO AMPLIADO (ESBL) ENTRE AMOSTRAS DE

E. COLI, KLEBSIELLA SPP. E PROTEUS MIRABILIS.

Microrganismo Meio de cultura e Teste de Triagem Teste Confirmatório Controle de Qaulidade

Condições de incubação

28

29

TABELA 3: PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS QUE DIFERENCIAM

AS CARBAPENEMASES EM DOIS GRUPOS DISTINTOS.

a. Inibidores de betalactamases disponíveis clinicamente: ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam;

Metalo-betalactamases Serino-betalactamases

P. aeruginosa é cada vez mais comum, e re-

presenta um grande desafio ao laboratório

clínico já que o teste utilizado para a sua de-

tecção em enterobactérias não apresenta

sensibilidade e especificidade satisfatórios

quando aplicados a P. aeruginosa (12).

Essa dificuldade é conseqüente a dife-

rentes fatores, como a presença de cefa-

losporinases cromossomais do tipo AmpC,

que inativam as cefalosporinas de amplo es-

pectro e não são inibidas pelos inibidores

de -lactamases. Estas enzimas podem

mascarar a presença de ESBL favorecendo

a ocorrência de resultados falsos negati-

vos. Tal interferência poderia ser anulada

com a adição de um inibidor de AmpC co-

mo, por exemplo, a cloxacilina ao meio de

cultura (15). Entretanto, isolados de P. aeru-

ginosa freqüentemente produzem enzimas

do tipo OXA que possuem atividade hidrolí-

tica potente sobre a cloxacilina, o que tam-

bém prejudicaria a interpretação deste tes-

te. Outra forma de driblar a interferência da

AmpC, é a introdução no teste de disco

aproximação dos discos de ticarcilina, uma

ureidopenicilina que é resistente à ação

dessas cefalosporinases e, portanto, a re-

sistência a este agente em isolados clínicos

de P. aeruginosa pode indicar a presença

de uma ESBL. Por outro lado, a ticarcilina é

um bom substrato para algumas bombas

de efluxo presentes em P. aeruginosa que,

se hiperexpressas, podem representar ou-

tra interferência para a detecção de ESBL

(16). Amostras clínicas de P. aeruginosa po-

â

dem possuir, ainda, diferentes mecanismos

de resistência combinados, como a produ-

Espécies mais freqüentes

Classe Molecular de Ambler

Tipos

Resistência ao aztreonam

Inibição pelos inibidores de abetalactamases

Inibição pelos EDTA, e

derivados do tiol

Localização do gene

P. aeruginosa,

Acinetobacter spp.,

Enterobactérias

B

IMP, VIM, SPM, GIM,

SIM, AIM, KHM, NDM,

Não

Não

Sim

Variável

S. marcescens, E.

cloacae, K. pneumoniae,

Acinetobacter spp.

A e D

KPC, GES, OXA IMI,

NMC-A, SME,

Sim

Sim (fraca)

Não

Variável

dima, aztreonam, cefotaxima ou ceftriaxo-

na. A redução da sensibilidade a estes

agentes pode indicar a produção de ESBL.

O CLSI recomenda que amostras triadas

como produtoras de ESBL tenham este fe-

nótipo de resistência confirmado. O teste

confirmatório preconizado pelo CLSI que

utiliza ambos os agentes antimicrobianos,

cefotaxima e ceftazidima, individualmente

e em combinação com ácido clavulânico,

testados pela técnica de disco difusão (dis-

co adição) ou microdiluição em caldo. O au-

mento de pelo menos cinco milímetros no

diâmetro do halo, ou uma redução maior

ou igual a 3 diluições logarítmicas na con-

centração inibitória mínima (MIC) para qua-

isquer dos dois agentes antimicrobianos

testados em combinação com ácido clavu-

lânico contra o seu halo ou MIC testado in-

dividualmente, indica a produção de ESBL

- Tabela 2 (14).

A técnica de disco aproximação con-

siste em posicionar os discos de diferentes

substratos -lactâmicos, como ceftazidi-

ma, cefepima, cefotaxima e ceftriaxona a

três centímetros de distância de um disco

de amoxicilina com ácido clavulânico. A de-

formação do halo de inibição ou o apareci-

mento de uma zona fantasma entre o subs-

trato e o inibidor caracteriza fenotipica-

mente a amostra como produtora de

ESBL. A Figura 1 mostra o teste de disco

aproximação positivo para produção de

ESBL em K. pneumoniae, cepa ATCC

700603. Ainda que não seja a técnica pa-

dronizada pelo CLSI, a disco aproximação

é utilizada como teste de triagem em diver-

sos estudos com o objetivo de investigar a

prevalência de produção de ESBL entre

amostras clínicas (13).

A descrição de ESBLs em amostras de

â

Figura 1: Disco aproximação evidenciando a produção de ESBL pela cepa de K. pneumoniae ATCC 700603.

30

realizaram ainda o estudo da cinética enzi-

mática da oxacilinase OXA-1, observando

que esta enzima também era capaz de hidro-

lisar cefepime (24). Até o momento, não exis-

tem estudos realizados no Brasil que relatem

a prevalência de ESBL do tipo OXA entre iso-

lados clínicos de P. aeruginosa.

A detecção fenotípica da produção de

oxacilinases em P. aeruginosa não é tarefa

de fácil realização para o laboratório clínico.

Isto porque, além das dificuldades anterior-

mente mencionadas, a maioria das enzimas

do tipo OXA não são sensíveis à ação dos ini-

bidores de -lactamases. Atualmente, não

existe um teste fenotípico para identificação

deste mecanismo de resistência ou qualquer

recomendação do CLSI para que se faça a

detecção de enzimas do tipo OXA nos labo-

ratórios clínicos. Esta identificação, geral-

mente, é feita somente em laboratórios de

pesquisa a partir da amplificação e seqüen-

ciamento do gene blaOXA que as codificam

(6).

Efluxo é um processo em que a célula

transporta ativamente para seu exterior subs-

tâncias potencialmente tóxicas como meta-

bólitos, drogas e outros compostos quími-

cos. Os sistemas de efluxo podem ser ex-

pressos constitutivamente, quando geral-

mente são codificados por genes cromosso-

mais, contribuindo assim para o fenótipo de

resistência intrínseca do microrganismo a de-

terminadas drogas antimicrobianas. A resis-

tência adquirida ocorre após mutações nos

genes reguladores, o que leva à hiperex-

pressão desses sistemas e o surgimento de

resistência (25).

O sistema MexXY-OprM é responsável

pela resistência intrínseca a aminoglicosíde-

os, eritromicina e tetraciclina em cepas sel-

vagens de P. aeruginosa. O uso de aminogli-

cosídeos pode levar à hiperexpressão deste

sistema que é induzível, sendo assim capaz

de ejetar fluoroquinolonas e vários -

lactâmicos, incluindo algumas cefalospori-

nas. É interessante ressaltar que entre as ce-

falosporinas, a cefepima é ejetada por este

sistema, mas não a ceftazidima (26). O fenô-

meno de indução pode ser observado no anti-

biograma através do achatamento do halo

de inibição do crescimento bacteriano, pro-

duzido pela cefepima e por quinolonas, quan-

â

â

HIPEREXPRESSÃO DOS SISTEMAS DE

EFLUXO MEX-XY-OPRM

do esses agentes estão dispostos próxi-

mos a discos impregnados por aminogli-

cosídeos. Ainda que a cefepima e as fluo-

roquinolonas não sejam capazes de indu-

zir a expressão de MexXY-OprM, mutan-

tes resistentes que hiperexpressam esse

sistema podem ser selecionados pela ex-

posição a esses agentes. Dessa forma o fe-

nótipo de resistência a cefepima e sensibi-

lidade a ceftazidima pode ser também ser

sugestivo da hiperexpressão de MexXY-

OprM (11).

Pouco se sabe sobre a prevalência da

hiperexpressão deste sistema em isola-

dos clínicos de P. aeruginosa sensíveis a

ceftazidima e resistentes a cefepima. Ape-

nas um estudo realizado na França atribui

este fenótipo a este sistema de efluxo. Da

mesma maneira, não existem estudos clí-

nicos que nos permitam concluir se cefta-

zidima seria uma boa opção para o trata-

mento de infecções por estas bactérias.

Não existe ainda qualquer recomendação

para que se faça a detecção laboratorial

de cepas que hiperexpressem sistemas

de efluxo (11).

Os carbapenens são comumente pres-

critos para o tratamento de infecções cau-

sadas por bacilos Gram-negativos produ-

tores de ESBL. É cada vez mais frequente,

porém, o isolamento de bactérias resisten-

tes a estes agentes no laboratório clínico.

Estes achados são inquietantes visto que,

muitas vezes, as opções terapêuticas para

o tratamento destas infecções ficam limita-

das às polimixinas (27).

Cepas selvagens de Proteus mirabilis

RESISTÊNCIA AOS CARBAPENENS

EM AMOSTRAS CLÍNICAS DE ENTE-

ROBACTÉRIAS

O gene que codifica esta enzima foi cap-

turado do cromossomo de bactérias ambi-

entais do gênero Kluyvera spp. e incorpora-

do a elementos genéticos móveis, o que

possibilitou sua disseminação entre bactéri-

as patogênicas. Inicialmente, acreditava-se

que estas enzimas estavam disseminadas

somente entre membros da família Entero-

bacteriaceae, porém, recentemente, ESBL

do tipo CTX-M foram descritas em isolados

clínicos de Acinetobacter baumannii no Ja-

pão (20) e entre isolados clínicos de P. aeru-

ginosa provenientes da Holanda, Bolívia e

Brasil (21-23).

No estudo realizado no Brasil, a detec-

ção fenotípica da enzima CTX-M-2 só foi

possível com a realização do teste de disco

aproximação em condições especiais: os

discos de cefotaxima e de cefepime dispos-

tos a 1,5 cm de distância (centro a centro)

do disco de amoxicilina com ácido clavulâni-

co (Figura 2). Este achado é de extrema im-

portância clínica, visto que muitos infectolo-

gistas, ao se depararem com um antibiogra-

ma de uma bactéria que é resistente à cefe-

pime e sensível à ceftazidima, sem a infor-

mação de que esta bactéria é produtora de

uma ESBL, podem utilizar a ceftazidima pa-

ra o tratamento da respectiva infecção, po-

dendo resultar em falha terapêutica (21).

Ainda que saibamos que as enzimas do

tipo CTX-M já se disseminaram entre isola-

dos de P. aeruginosa no Brasil, sua preva-

lência ainda é desconhecida e, portanto, ou-

tros estudos são necessários para que se

possa avaliar a real magnitude deste pro-

blema.

O termo ESBL foi utilizado, inicialmente,

para designar apenas aquelas enzimas clas-

sificadas no grupo funcional 2be, da classe

A de Ambler. Porém, com o aparecimento

de oxacilinases da classe D (Tabela 1), tam-

bém capazes de hidrolizar cefalosporinas

de amplo espectro, o termo ESBL passou a

ser utilizadas igualmente para estas enzi-

mas, designadas ESBL do tipo OXA (6).

Um estudo realizado na França, a partir

de um isolado clínico de P. aeruginosa, reve-

lou que o fenótipo de resistência à cefepime

e sensibilidade à ceftazidima estava relacio-

nado à produção de uma ESBL do tipo OXA,

OXA-31. Neste trabalho, os pesquisadores

ESBL DO TIPO OXA

Figura 2: Disco aproximação realizada em condições não usuais evidenciando a produção da ESBL

do tipo CTX-M-2 por um isolado clínico de P. aeruginosa isolada em São Paulo.

grande quantidade. É sabido que tais enzi-

mas não são capazes de hidrolisar os car-

bapenens com eficiência. Porém, em si-

tuações onde a concentração de carbape-

nens no interior da célula se torna baixa, co-

mo, por exemplo naquelas bactérias que

perderam uma porina, a mais ineficiente hi-

drólise é capaz de fornecer à bactéria con-

dições de sobrevida na presença do anti-

biótico.

K. pneumoniae normalmente expressa

três principais porinas, OmpK35, OmpK36

e OmpK37. Porém, somente a diminuição

da expressão ou a perda das porinas

OmpK35 e OmpK36 são associadas à re-

sistência aos -lactâmicos. Estudos inte-

ressantes foram realizados introduzindo di-

ferentes -lactamases em cepas mutantes

de K. pneumoniae deficientes em ambas as

porinas OmpK35 e OmpK36 (30;31). Os au-

tores observaram que a expressão das ce-

falosporinases, tanto as cromossomais, co-

mo as plasmidiais, aumentaram a MIC de

imipenem em até 5 diluições, conferindo re-

sistência aos carbapenens. A introdução de

ESBL da classe A do tipo TEM, SHV e CTX,

aumentou a MIC de ertapenem em pelo me-

nos 4 diluições, enquanto que houve um au-

mento máximo de 2 diluições nas MICs de

imipenem e de meropenem (29).

Ao contrário do que se conhece sobre

porinas em K. pneumoniae produtoras de

ESBL, escassos são os dados sobre pori-

nas naturalmente expressas e/ou possivel-

mente relacionadas à resistencia bacteria-

na E. coli. Sabe se que esta espécie bacte-

riana apresenta duas principais porinas,

OmpF e OmpC, e alguns relatos indicaram

que a perda dessas duas estruturas leva-

ram à resistência a agentes -lactâmicos

na presença de -lactamases. Ainda que a

perda de OmpF em E. coli produtores de

ESBL tenha causado discretas mudanças

no perfil de sensibilidade aos â-lactâmicos,

é importante ressaltar que as MICs para imi-

penem e meropenem nestas amostras fo-

ram mais elevadas, mas não o suficiente pa-

ra que estas amostras fossem classificadas

como resistentes a estes agentes (32).

Existem muitos relatos da associação

de perda de porina e maiores níveis de re-

sistência aos antimicrobianos em outras en-

terobactérias, como Salmonella enterica,

Enterobacter spp. e Serratia spp (33). Ape-

â

â

â

â

sar de poucos artigos tratarem especifica-

mente de isolados produtores de ESBL ou

31

são desprovidas de -lactamases, e por-

tanto, são naturalmente sensíveis às ami-

nopenicilinas, às carboxipenicilinas, às

ureidopenicilinas, ao aztreonam, às cefa-

losporinas e aos carbapenens. O diâmetro

do halo de inibição de imipenem, no entan-

to, muitas vezes é reduzido entre isolados

clínicos de P. mirabilis, como para outras

espécies do grupo Proteae. Tal diminuição

foi atribuída à baixa afinidade do imipenem

pela proteína ligadora de penicinina

(PBP2) dessas espécies. Adicionalmente,

algumas amostras de Enterobacter cloa-

cae, Serratia marcescens e S. fonticola

produzem carbapenemases da classe A

cromossomais e induzíveis, como, por

exemplo, as enzimas NMC-A, IMI, SME e

SFC-1 (5;7). Estes isolados apresentam

sensibilidade diminuída ou são resistentes

às penicilinas, às cefalosporinas de prime-

ira e segunda geração, ao aztreonam e ao

imipenem, mantendo a sensibilidade às ce-

falosporinas de terceira e quarta geração.

Estes mecanismos são, entretanto, natu-

rais da espécie ou muito raros. Além disso,

não existem relatos da presença de ente-

robactérias produtoras das carbapenema-

ses NMC, IMI, SME ou SCF no Brasil. Por

estas razões, neste tópico vamos nos con-

centrar naqueles mecanismos de resistên-

cia adquirida aos carbapenens já descritos

ou observados no Brasil.

Dois mecanismos principais estão rela-

cionados à resistência adquirida aos car-

bapenens em enterobactérias: a produção

de -lactamases de amplo espectro asso-

ciada aos mecanismos de impermeabili-

dade, como a perda de porinas; e a produ-

ção de carbapenemases (28).

Não é raro encontrarmos na literatura

científica relatos de isolados clínicos de en-

terobactérias, principalmente Klebsiella

spp., Escherichia coli e Enterobacter spp.

resistentes aos carbapenens que não apre-

sentam produção detectável de carbape-

nemases (29). Estes isolados normalmen-

te apresentam mecanismos de impermea-

bilidade associados à produção de -la-

ctamases, tais como ESBL, AmpC plasmi-

diais ou ainda AmpC cromossomal em

â

â

â

PRODUÇÃO DE -LACTAMASE DE

AMPLO ESPECTRO ASSOCIADO A ME-

CANISMOS DE IMPERMEABILIDADE

Â

sensibilidade da cepa teste na presença de

um inibidor de MBL. Entretanto, esse méto-

do não é satisfatório como aquele observa-

do para os grupos de P. aeruginosa e Acine-

tobacter spp devido a pouca variabilidade

nos valores da MIC na presença do inibidor.

Uma estratégia para a detecção da produ-

ção de MBL entre enterobactérias é o teste

de disco combinado utilizando disco de imi-

penem em associação a 10 µl de uma solu-

ção de EDTA a 100 mM, e considerando-se

5 mm de variação no halo, em relação ao ta-

manho do halo na ausência do inibidor, co-

mo ponto de corte para sugerir a produção

de MBL (40).

Neste manuscrito, optamos por discutir

dois mecanismos: resistência à cefepima

com sensibilidade à ceftazidima em amos-

tras de P. aeruginosa e resistência aos car-

bapenens em enterobactérias que, apesar

de conhecidos, têm sido observados com

freqüência cada vez maior em nosso meio.

Novos padrões de resistência têm surgido,

mas infelizmente, a detecção fenotípica

destes nem sempre tem sido uma tarefa

simples de ser incorporada pelos laborató-

rios clínicos de microbiologia. Esta dificul-

dade se deve principalmente a dois fatores:

diferentes mecanismos de resistência po-

dem mostrar o mesmo fenótipo; e a associ-

ação de mecanismos de resistência fre-

qüentemente está presente em amostras

clínicas, o que limita o desenvolvimento e

implementação de testes fenotípicos com

boa sensibilidade e especificidade na rotina

laboratorial. Entretanto, considerando que

um teste fenotípico pode apresentar exce-

lente desempenho em uma determinada re-

gião geográfica e um desempenho insatis-

fatório em outra localidade, cabe aos labo-

ratórios de pesquisas determinarem a fre-

qüência destes mecanismos localmente,

para que estudos epidemiológicos possam

ser realizados com o intuito de determinar o

seu impacto clínico e, a partir destas análi-

ses, validar e/ou aperfeiçoar os testes feno-

típicos a serem incorporados na rotina dos

laboratórios de microbiologia clínica.

(1) Couce A, Blazquez J. Side effects of antibiotics on

genetic variability. FEMS Microbiol Rev 2009.

(2) Pitout JD. Multiresistant Enterobacteriaceae: new

REFERÊNCIAS

threat of an old problem. Expert Rev Anti Infect

Ther 2008; 6(5):657-669.

(3) Hawkey PM. Molecular epidemiology of clinically

significant antibiotic resistance genes. Br J Phar-

macol 2008; 153 Suppl 1:S406-S413.

(4) Bush K. The impact of beta-lactamases on the de-

velopment of novel antimicrobial agents. Curr

Opin Investig Drugs 2002; 3(9):1284-1290.

(5) Poirel L, Pitout JD, Nordmann P. Carbapenema-

ses: molecular diversity and clinical consequen-

ces. Future Microbiol 2007; 2(5):501-512.

(6) Paterson DL, Bonomo RA. Extended-spectrum

beta-lactamases: a clinical update. Clin Microbiol

Rev 2005; 18(4):657-686.

(7) Walther-Rasmussen J, Hoiby N. Class A carba-

penemases. J Antimicrob Chemother 2007;

60(3): 470-482.

(8) Wolter DJ, Kurpiel PM, Woodford N, Palepou MF,

Goering RV, Hanson ND. Phenotypic and enz-

ymatic comparative analysis of the novel KPC va-

riant KPC-5 and its evolutionary variants, KPC-2

and KPC-4. Antimicrob Agents Chemother 2009;

53(2):557-562.

(9) Nordmann P, Poirel L. Emerging carbapenema-

ses in Gram-negative aerobes. Clin Microbiol

Infect 2002; 8(6):321-331.

(10) Livermore DM, Woodford N. The beta-lactamase

threat in Enterobacteriaceae, Pseudomonas and

Acinetobacter. Trends Microbiol 2006; 14(9):413-

420.

(11) Hocquet D, Nordmann P, El Garch F, Cabanne L,

Plesiat P. Involvement of the MexXY-OprM efflux

system in emergence of cefepime resistance in

clinical strains of Pseudomonas aeruginosa. Anti-

microb Agents Chemother 2006; 50(4):1347-

1351.

32

nem, formado pelo crescimento da E. coli

ATCC 25922, é sugestiva da produção de

carbapenemase pela amostra teste e repre-

senta um teste de Hodge positivo (Figura 3)

(14).

Resultados falsos positivos para o teste

de Hodge modificado têm sido observado en-

tre amostras hiperprodutoras de AmpC ou

entre aquelas que produzem ESBL associa-

da à deficiência na expressão de porinas.

Desta maneira, a utilização do teste de Hod-

ge modificado fica comprometida em re-

giões, onde é alta a prevalência de amostras

produtoras de ESBL e/ou AmpC.

Adicionalmente, a produção de MBL, an-

tes observada entre amostras de Gram-

negativos não-fermantadores, tais como,

Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp., a

produção das MBL do tipo IMP e VIM vem

sendo detectada em espécies da família

Enterobacteriaceae (40). O aparecimento

de enterobactérias produtoras de MBL foi re-

portado em hospitais brasileiros, em 2003,

com um relato de uma cepa K. pneumoniae

que carreava o gene IMP-1 na cidade de

São Paulo. A presença da enzima IMP-1 no

Brasil foi reportada em pelo menos outras du-

as espécies de enterobactérias, Providencia

rettgeri e em E. cloacae, além de relatos da

presença de isolados de K. pneumoniae ge-

neticamente relacionadas em hospitais bra-

sileiros (41;42).

Interessantemente, apesar de sua forte

atividade hidrolítica, as MBLs presentes em

enterobactérias freqüentemente conferem

baixa resistência aos carbapenens. A con-

centração inibitória mínima para imipenem

destes isolados varia de 0,12-0,25 µg/mL a

1-4 µg/mL, valores abaixo do limite de sen-

sibilidade estabelecidos pelo CLSI (14). A

maior permeabilidade a essas drogas entre

as diferentes espécies bacterianas seria

uma das hipóteses para justificar o baixo ní-

vel de resistência aos carbapenens apre-

sentado pelas enterobactérias. Uma vez

que os genes codificadores das MBLs rela-

tadas em enterobactérias encontram-se em

estruturas genéticas móveis, passíveis de

transferência inter-espécie, sua detecção e

o conhecimento da sua epidemiologia é es-

sencial para o controle da disseminação des-

se mecanismo de resistência. A detecção da

produção de MBL pode ser feita fenotipica-

mente pela observação da restauração da

Figura 3: Teste de Hodge modifi-cado indicando a possível produção de uma carbapenemase por uma amostra

clínica de K. pneumoniae. Notar que houve o crescimento da cepa de E.

coli ATCC 25922 próximo ao disco de ertapenem. Este crescimento ocorreu

porque provavelmente houve a inativação (hidrólise) do ertapenem

pela amostra clínica testada.

33

clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa.

Antimicrob Agents Chemother 2006; 50(9):2990-

2995.

(19) Aubert D, Girlich D, Naas T, Nagarajan S, Nord-

mann P. Functional and structural characterizati-

on of the genetic environment of an extended-

spectrum beta-lactamase blaVEB gene from a

Pseudomonas aeruginosa isolate obtained in

India. Antimicrob Agents Chemother 2004;

48(9):3284-3290.

(20) Nagano N, Nagano Y, Cordevant C, Shibata N,

Arakawa Y. Nosocomial transmission of CTX-M-

2 beta-lactamase-producing Acinetobacter bau-

mannii in a neurosurgery ward. J Clin Microbiol

2004; 42(9):3978-3984.

(21) Picao RC, Poirel L, Gales AC, Nordmann P. Furt-

her identification of CTX-M-2 extended-spectrum

{beta}-lactamase in Pseudomonas aeruginosa.

Antimicrob Agents Chemother 2009.

(22) al Naiemi N, Duim B, Bart A. A CTX-M extended-

spectrum beta-lactamase in Pseudomonas aeru-

ginosa and Stenotrophomonas maltophilia. J

Med Microbiol 2006; 55(Pt 11):1607-1608.

(23) Celenza G, Pellegrini C, Caccamo M, Segatore

B, Amicosante G, Perilli M. Spread of bla(CTX-M-

type) and bla(PER-2) beta-lactamase genes in cli-

nical isolates from Bolivian hospitals. J Antimi-

crob Chemother 2006; 57(5):975-978.

(24) Aubert D, Poirel L, Chevalier J, Leotard S, Pages

JM, Nordmann P. Oxacillinase-mediated resis-

tance to cefepime and susceptibility to ceftazidi-

Halo de inibição (mm) MIC ( g/mL)µ

(12) Bradford PA. Extended-spectrum beta-lactama-

ses in the 21st century: characterization, epide-

miology, and detection of this important resistan-

ce threat. Clin Microbiol Rev 2001; 14(4):933-51,

table.

(13) Drieux L, Brossier F, Sougakoff W, Jarlier V. Phe-

notypic detection of extended-spectrum beta-

lactamase production in Enterobacteriaceae: revi-

ew and bench guide. Clin Microbiol Infect 2008;

14 Suppl 1:90-103.

(14) Clinical and Laboratory Standards Institute

(CLSI). Performance standards for antimicrobial

susceptibility testing; Nineteenth informational

supplement M100-S19. 2009.

(15) Jacoby GA. AmpC beta-lactamases. Clin Micro-

biol Rev 2009; 22(1):161-82, Table.

(16) Hocquet D, Roussel-Delvallez M, Cavallo JD, Ple-

siat P. MexAB-OprM- and MexXY-overproducing

mutants are very prevalent among clinical strains

of Pseudomonas aeruginosa with reduced sus-

ceptibility to ticarcillin. Antimicrob Agents Che-

mother 2007; 51(4):1582-1583.

(17) Poirel L, Weldhagen GF, Naas T, De Champs C,

Dove MG, Nordmann P. GES-2, a class A beta-

lactamase from Pseudomonas aeruginosa with

increased hydrolysis of imipenem. Antimicrob

Agents Chemother 2001; 45(9):2598-2603.

(18) Jiang X, Zhang Z, Li M, Zhou D, Ruan F, Lu Y. De-

tection of extended-spectrum beta-lactamases in

Ertapenem 19-21 2

Imipenem - 2-4

Meropenem 16-21 2-4

Sem aumento do crescimento da cepa ATCC:

Teste de Hodge Negativo

Realizar o Teste de Hodge Modificado

E. coli

ATCC 25922

Inóculo 1:10 McFarland 0,5

Discos de ertapenem 10 µg

ou meropenem 10

µg

Semear a amostra teste da periferia do disco em direção à periferia da placa de Petri

por pelo menos 25 mm

Cepas Controle de qualidade:

BAA-1705 (Positivo) e BAA-1706 (negativo)

Incubar por 16-20h em ar ambiente a 35 ?

2? C

Com aumento do crescimento

da cepa ATCC:Teste de Hodge Positivo

Para interpretação dos resultados do TSA aos carbapenens - utilizar o critério

do CLSI

Reportar a MIC dos carbapenens sem utilizar o critério para interpretação dos

resultados do TSA -

Nota:

Este isolado demonstra produção de carbapenemase. A eficác ia clínica dos

carbapenens ainda não foi bem estabelecida para o tratamento das

infecções causadas por Enterobactérias produtoras de carbapenemases, mas apenas

com a sensibilidade aos carbapenens preservada in vitro.

Figura 4: Testes de triagem e confirmatório para detecção fenotípica da produção de carbapenemase em Enterobacteriaceae de acordo com o documento M100-S19 (CLSI, 2009).

34

2006; 50(8):2880-2882.

(37) Wei ZQ, Du XX, Yu YS, Shen P, Chen YG, Li LJ.

Plasmid-mediated KPC-2 in a Klebsiella pneumo-

niae isolate from China. Antimicrob Agents Che-

mother 2007; 51(2):763-765.

(38) Peirano G, Seki LM, Val P, V, Pinto MC, Guerra LR,

Asensi MD. Carbapenem-hydrolysing beta-

lactamase KPC-2 in Klebsiella pneumoniae isola-

ted in Rio de Janeiro, Brazil. J Antimicrob Chemot-

her 2009; 63(2):265-268.

(39) Monteiro J, Santos AF, Asensi MD, Peirano G, Ga-

les AC. First report of KPC-2-producing Klebsiella

pneumoniae strains in Brazil. Antimicrob Agents

Chemother 2009; 53(1):333-334.

(40) Walsh TR, Toleman MA, Poirel L, Nordmann P. Me-

tallo-beta-lactamases: the quiet before the storm?

Clin Microbiol Rev 2005; 18(2):306-325.

(41) Penteado AP, Castanheira M, Pignatari AC, Gui-

maraes T, Mamizuka EM, Gales AC. Dissemination

of bla(IMP-1)-carrying integron In86 among Klebsi-

ella pneumoniae isolates harboring a new trimet-

hoprim resistance gene dfr23. Diagn Microbiol

Infect Dis 2009; 63(1):87-91.

(42) Lincopan N, Leis R, Vianello MA, de Araujo MR, Ru-

iz AS, Mamizuka EM. Enterobacteria producing ex-

tended-spectrum beta-lactamases and IMP-1 me-

tallo-beta-lactamases isolated from Brazilian hos-

pitals. J Med Microbiol 2006; 55(Pt 11):1611-1613.

13 de janeiro de 2005. Os leucócitos obti-

dos serão submetidos à transformação

por EBV, com o intuito de perenizar a fon-

te de informação. O mapeamento dos po-

limorfismos utilizará plataforma de geno-

tipagem baseadas no uso de SNPs tipo

\"tag\" (etiquetados), escolhidos predo-

minantemente conforme dados obtidos

no HapMap Project.

O painel para o ensaio deverá ser pre-

parado para incluir marcadores de

ancestralidade (em torno de 50) e genes

candidatos para as diversas doenças

em estudo pela equipe do iii. Os SNPs

deverão, na medida do possível, serem

funcionalmente relevantes, localizados

em genes para citocinas, quimiocinas e

respectivos receptores, genes de res-

posta inata como receptores tipo Toll

e KIR, moléculas de adesão e de \"ho-

ming\", entre outros. A previsão é de que

cada array para genotipagem por SNPs

seja representativo de aproximadamen-

te 300 genes.

Este projeto se beneficiará de cone-

xão com as plataformas de Bioinformáti-

ca (ferramentas de análise), Epidemiolo-

gia e Ensaios Clínicos (estatística e

amostragem) e Ensino e Relação com a

Sociedade (formação de recursos huma-

nos), já existentes na rede integrada de

pesquisadores do iii.

É recomendável o candidato ter expe-

riência prévia em biologia molecular e ge-

nética de populações.

Os interessados deverão enviar cur-

rículo completo atualizado e carta de in-

tenções para: Anna Carla Goldberg no

endereço <goldberg@einstein.br>.

Profa. Dra. Anna Carla Goldberg -

Pesquisadora Instituto Israelita de Ensi-

no e Pesquisa Albert Einstein.

Contato: goldberg@einstein.br ou

11-3747 0941

PÓS DOC EM MICROBIOLOGIA -

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA -

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO

CARLOS

Abrimos uma vaga para Pós-dou-

torando com experiência em Microbio-

logia, principalmente de fungos filamen-

tosos.

Uma bolsa de pós-doutoramento

está disponível para recém doutores

com especialidade em Microbiologia

para atuar em um projeto visando à bus-

ca de compostos inseticidas em extratos

obtidos de micro-organismos. O candi-

dato se envolverá com a obtenção e

manutenção de cepas e o cultivo de fun-

gos filamentosos, a preparação de extra-

tos, e colaborar na condução de ensaios

para detecção de atividade inseticida

em Diaphorina citri e Spodoptera

frugiperda. São exigidas capacidades

de interação com especialistas em

química de produtos naturais e entomo-

logistas. Os interessados devem ter

o título de doutor em microbiologia

ou área correlata com especialidade em

fungos filamentosos; devem ter no míni-

mo três artigos na área, publicados em

revistas especializadas, e bom desem-

penho acadêmico.

O projeto terá início em maio de

2009. Os candidatos devem enviar CV,

lista de publicações e duas cartas de re-

comendação via e-mail, endereçadas à

Profa. Dra. Maria Fátima das Graças Fer-

nandes da Silva (dmfs@power. ufs-

car.br) com cópia para Prof. Edson Ro-

drigues Filho (edinho@pq.cnpq.br)

VIII ENCONTRO DO INSTITUTO

ADOLFO LUTZ.

Será realizado entre 19 e 22 de outu-

bro de 2009, no Centro de Convenções

Rebouças, São Paulo, o VIII Encontro do

Instituto Adolfo Lutz. Para maiores infor-

mações e programação científica aces-

sar o site htpp://encontro.ial.sp.gov.br

35

Notícias in Foco

Caros colegas e amigos:

Sob a nova gestão o Instituto Israeli-

ta de Ensino e Pesquisa Albert Einstein

está expandindo suas linhas de pesqui-

sa e recrutando novos pesquisadores. O

seu Centro de Pesquisa Experimental

conta com um laboratório com toda a in-

fra-estrutura para biologia molecular e ce-

lular, uma equipe com larga experiência

e competência em análises de seqüenci-

amento, cultura celular, citometria, ob-

tenção e pesquisa com células-tronco de

medula e de cordão, técnicas de ima-

gem e arrays, entre outros.

Procuramos um pós-doutor Junior pa-

ra preenchimento imediato de vaga com

Bolsa CNPq, para trabalhar: Em Imuno-

genética: Implantação do BIGiii, Banco

Brasileiro de Informação Genética em

Imunologia (INCT- Instituto de Investiga-

ção em Imunologia).

O objetivo principal desta plataforma

é estabelecer o primeiro Banco Brasilei-

ro de Informação Genética em Imunolo-

gia (BIGiii), para aplicação no estudo de

doenças típicas do Brasil, em andamen-

to no iii.

Análise preliminar do tamanho amos-

tral de indivíduos sadios indica que um N

de 1000 amostras seja suficiente. Esse

cálculo se baseia em SNPs já analisa-

dos, ao longo dos últimos anos (22 SNPs

em genes não-HLA), com freqüências do

alelo raro entre 3,3 e 43,5%. Essas amos-

tras serão de 2 tipos, cada uma com um

N de 500:

1) amostras pediátricas de sangue pe-

riférico, de indivíduos não relacionados e

2) amostras de sangue periférico de

indivíduos adultos não relacionados,

com dados demográficos similares aos

da população de pacientes em tratamen-

to no complexo hospitalar do HC-

FMUSP. Coleta será feita obedecendo

as diretrizes da resolução CNS 347 de

EDITAL DO CONCURSO PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE ESPECIALISTA EM MICROBIOLOGIA - TEMICRO 2009.

1. ApresentaçãoO Presidente da Sociedade Brasileira de Microbiologia, MARINA BAQUERIZO MARTINEZ, e o Secretário, Carlos Peleschi Taborda, no uso de suas atribuições legais, farão realizar Concurso para Obtenção do Título de Especialista em Mi-crobiologia-TEMICRO, no dia 08 de novembro de 2009, regulamentado pelo presente Edital.

O Título de Especialista em Microbiologia terá validade por 5 (cinco) anos, de-vendo ser renovado de acordo com as normas estabelecidas pela Comissão Na-cional de Titulação SBM.

2. Das inscrições2.1. A inscrição do candidato implicará o conhecimento e a tácita aceitação das normas e condições estabelecidas neste Edital, em relação às quais não poderá alegar desconhecimento.2.2. As inscrições serão recebidas no período de 01de junho a 30 de agosto de 2009, por via eletrônica (www.sbmicrobiologia.org.br).2.3. O candidato deverá efetuar o pagamento da taxa de inscrição conforme no valor de R$ 615,00

As Especialidades É importante esclarecer que as especialidades regulamentadas são profissio-nais, isto é, são especialidades no campo do exercício profissional do microbio-logista. Foram regulamentadas algumas que se configuraram como mais defini-das e consensuais. A Saber: Microbiologia AmbientalMicrobiologia de AlimentosMicrobiologia Industrial Microbiologia ClínicaDeve ser destacado que o título de especialista em microbiologia é uma referên-cia sobre a qualificação do profissional, não se constituindo condição obrigatória para o exercício da profissão. Podem solicitar o título de Especialista os Biólogos, Biomédicos, Farmacêuti-cos, Médicos, Médicos Veterinários e outros profissionais que tenham atuação em uma das áreas da Microbiologia, desde que preencham alguns dos prerequi-sitos abaixo relacionados:

I - Das Inscrições:- O candidato deverá ser associado da Sociedade Brasileira de Microbiologia (SBM) tendo quitado o ano vigente;- O candidato deverá ter nível superior e cinco anos de experiência profissio-nal comprovada na área após a graduação OU carga horária mínima de 1.200 horas de estágio em microbiologia comprovadas depois de formado;- Pagar a taxa estabelecida pela SBM;- O candidato deverá ter uma carta de apresentação e três indicações de as-sociados da SBM;- O certificado terá validade por cinco anos.

II - Documentos necessários para Inscrição:- Preencher a ficha de inscrição;

Enviar para a SBM via correio curriculum vitae documentado, que deverá ser confeccionado de acordo com a "Plataforma Lattes" , histórico escolar e carteira ou comprovante de trabalho e uma fotografia recente 3x4;

III - Pontuação dos Títulos e Atividades:- Para obtenção do título o candidato deverá atingir média final = 7,0;Provas - 90% Títulos - 10%

IIIa - ProvasProva escrita: será composta de questões de múltipla escolha e dissertativas sendo que 60% do conteúdo deverá versar sobre Microbiologia Geral e 40% so-

bre Microbiologia Específica da área de especialização escolhida.Prova Prática: Versará sobre temas específicos da área de especialização esco-lhida

Critérios a serem utilizados na avaliação do CV para OBTENÇÃO do Título de Especialista

TÍTULOSDoutor na área escolhida, Mestre na área escolhida Especialização na área escolhida

Liderança técnica

Atividade Docente

Artigos científicos

Apresentação em Congresso

Cursos de aperfeiçoamento

Cursos de atualização

Estágio em microbiologiaEventos

Eventos

ExigênciasPrograma regular credenciado pela CAPES

Programa regular credenciado pela CAPES

Deverão ter carga horária mínima de 720 ho-ras, considerando-se as horas-aulas e os tra-balhos de campo, experimental, de estudo e monografia, bem como deverão atender às exigências do Conselho Federal de Educa-ção e deverão ser reconhecidos pela SBMLiderança técnica em Laboratórios de Micro-biologia nos últimos 10 anos

Atividade Docente em Microbiologia nos últi-mos 10 anos

Artigo científico em Microbiologia na área es-colhida, publicados em revistas indexadas no ISI e/ou PubMed, como autor ou co-autor nos últimos 5 anosTrabalhos científicos em Microbiologia, apre-sentados em Congressos reconhecidos pela SBM, como autor ou co-autor Em microbiologia nos últimos 5 anos, carga horária mínima de 180 horas, reconhecido pela SBMEm microbiologia nos últimos 5 anos, , reco-nhecido pela SBM. Abaixo de 36 horas de atualização nos últimos cinco anos não será pontuadoPeríodo mínimo de 480 h consecutivas, nos últimos cinco anosParticipação em Congresso de Microbiologia e afins nos últimos 5 anos. Somente eventos reconhecidos pela SBM serão pontuados (ve-ja anexo). Eventos não reconhecidos serão julgados pela comissãoParticipação ativa como palestrante em Con-gressos de Microbiologia nos últimos 5 anos

Pontuação5

3

1,5

1 ponto a cada 2 anos de atividade (máximo 5 pontos)1 ponto a cada 2 anos de atividade (máximo 5 pontos)1 ponto por artigo (máximo 5 pontos)

0,2 por apresentado(máximo 1 pontos)

1 ponto

36 - 72 h 0,5; 73 - 109 h 1.0; >110 h

1,5(máximo 1,5 ponto)Máximo de 1 ponto

0,2 por evento(Máximo de 1 ponto)

0,2 por evento(Máximo de 1 ponto)

TEMICRO 2009TEMICRO 2009

OBS: Os documentos referentes às atividades pontuadas deverão ser enviados organizadamente, agrupados por atividade. Caberá à SBM, através da Comis-são de Titulação, proceder a pontuação estabelecida nos itens acima discrimi-nados, para cada candidato, ação essa que será executada antes da realização da prova. Outrossim, a comprovação de títulos e atividades constantes do currículo de-vem somar no mínimo 10 pontos nos últimos 5 anos para a aprovação da inscri-ção no concurso. O título terá validade por cinco anos. Para revalidação, o solicitante deve-rá encaminhar CV circunstanciado à SBM. A avaliação será feita pela Co-missão de Titulação pela análise e pontuação do CV. Pontuação mínima exigida será de 10 pontos.

Procedimento:

Categorias de associação e seus respectivos valores:

Formas de pagamento:

O interessado deverá preencher a ficha de adesão, especificando a categoria (Estudante de graduação, Estudande de Pós-Graduação ou Profissional).

Aluno de Graduação e Pós-Graduação: R$ 55,00Aluno de Pós-Doutorado: R$ 105,00Profissional: R$ 185,00

Enviar a ficha de adesão por E-mail (cadastro@sbmicrobiologia.org.br), solicitando o boleto bancário.Informações sobre pagamento com boleto que poderá ser acesso na área restrita logo após o cadastramento em nossos sistemas.

COMO ASSOCIAR-SECOMO ASSOCIAR-SE

FICHA DE ADESÃOFICHA DE ADESÃO

DATA:___________________________________________________________ ANO DE REFERÊNCIA:___________________________

Categoria: ( ) Estudante de Graduação ( ) Estudante de Pós-Graduação ( ) Profissional

Nome completo:__________________________________________________________________________________________________

RG:______________________________________________________ CPF:________________________________________________

Endereço Res:____________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________ Bairro:___________________________________

Cidade:__________________________________________________________ UF:___________ CEP:__________________________

TEL.:____________________________________________________ FAX:________________________________________________

E-MAIL:_________________________________________________________________________________________________________

Instituição:_______________________________________________________________________________________________________

Departamento:___________________________________________________________________________________________________

Cargo que exerce:_________________________________________________________________________________________________

Titulação:________________________________________________________________________________________________________

Endereço:_______________________________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________ Bairro:______________________________________

Cidade:__________________________________________________________ UF:___________ CEP:__________________________

TEL.:____________________________________________________ FAX:________________________________________________

E-MAIL:_________________________________________________________________________________________________________

Microbiologia Especializada em:

1.Alimentos (MAL); 2.Ambiental (MAM); 3.Básica (BAS); 4. Biotecnologia (BIO); 5.Clínica (MC); 6.Industrial (MIN); 7.Micologia (MI);

8.Micotoxinas (MX); 9.Oral (MO); 10.Solo (MS); 11.Veterinária (MV); 12.Virologia (VI); 13.Outros (especificar):

Endereço para correspondência: Residencial ( ) Comercial ( )

Presidente

Vice-presidente

1º Secretário

2º Secretário

1º Tesoureira

2º Tesoureira

Conselho Fiscal:

Marina Baquerizo Martinez (USP-SP)

Maria José M. Giannini (UNESP-SP)

Carlos Taborda (USP-SP)

Loreny Giugliane (UNB-DF)

Adalberto Pessoa Jr. (USP-SP)

Alexandre S. Rosado (UFRJ-RJ)

Bernadete G. Franco (USP-SP)Sergio E. L. Fracalanzza (UFRJ-RJ)

Antonio Fernando Pestana de Castro (USP-SP)

Coleções de Cultura Micro Clinica Parasito-Hospedeiro- Lara D Sette, UNICAMP-SP - Lauro Santos Filho, UFPB-PB - Sandro R. de Almeida, USP-SP- Elisa Cupollilo, FIOCRUZ-RJ - Pedro D´Azevedo, FFFCMPA-RS - Marcelo Bozza, UFRJ-RJ

Ensino Micro Industrial Solo- Alexandre Lourenço, UNIP/UNISA/FMU -SP - José Gregório, USP-SP - Vivian H. Pelizzari, USP-SP- Maria Ligia C. Carvalhal, USP-SP - Eleni Gomes, UNESP-Rio Preto - Mariangela Hungria, EMBRAPA-PR

Infecção Hospitalar Micro Médica Veterinária- Ana Lúcia Darini, USP-RP - Elizabeth Marques, UERJ-RJ - Walter Lilenbaum, UFF-RJ- Jorge Sampaio Fleury, SP - Waldir P Elias Jr, I. Butantan, SP - Vasco Azevedo, UFMG-RJ

Micro de Alimentos Micologia Virologia- Bernadete G. Franco, USP - Rosana Puccia, UNIFESP-SP - Maurício L. Nogueira, FAMERP-SP- Ricardo Dias, FUNED -MG - Marilene Vainstein, UFRGS-RS

Presidente do CBM 2007Micro Ambiental Micotoxinas Prof. Dr. Marina B. Martinez- Irma Grivera, USP-SP - Marta Taniwaki ITAL-SP- Leda M. Hagler, UFRJ-RJ - Myrna Sabino Instituto Adolfo Lutz-SP

DiretoriaDiretoriaBiênio 2008-2009

Representantes de ÁreaRepresentantes de ÁreaSBM 2008-2009