Medio Ambiente

Diagnóstico microbiológico de Legionella: situación actual

Medio Ambiente

Ningún método puede ser mejor que la muestra sobre laque se realiza el análisis

Medio AmbienteEstudio medioambiental de Legionella

AGUA LODO AIRE

Toma de muestras eficaz

Medio Ambiente

REDES DE DISTRIBUCIÓN:

- Cabos extremos- Zonas de bajo consumo- Fuentes públicas- Bocas de riego

Toma de muestra de agua

Medio Ambiente

REDES INTERNAS:- Aljibes y depósitos- Intercambiadores de calor- Acumuladores de agua caliente- Grifos y duchas- Circuitos de aa- Redes contraincendios

Toma de muestra de agua

Medio Ambiente

EQUIPOS QUE UTILIZAN AGUA EN SU FUNCIONAMIENTO:

- Torres de refrigeración- Acondicionadores evaporativos- Humidificadores- Terapia respiratoria- Equipos de hidroterapia

Toma de muestra de agua

Medio Ambiente

VENTAJAS

• Q ↑ (100 L/min ⇒ ↓ t

• ↑ V de muestra

• No procesamietnode muestra

• Bateriaincluida

INCONVENIENTES

• Saturación de placas

• ↓ viabilidad (stress, desecación)

• Cultivo

• Equipos caros

VENTAJAS

• No desecación

• Diluciones y ≠medios de cultivo

• Cultivo y otras técnicas (PCR)

INCONVENIENTES

• Q max 12,5 L/min ⇒ ↑ t

• A V ↑ ⇒evaporacion, reaerosoliz. y ↓viabilidad

• ↑ recuentos (“clusters”)

• Partículas hidrofóbicas

• Bomba

Toma de muestra de bioaerosoles

Medio Ambiente

EDIFICIOS DE OFICINAS

• Torres refrigeración (25-30ºC)

• Sistemas de aire acondicionado

Toma de muestra de bioaerosoles

Medio Ambiente

INDUSTRIA

Torres refrigeración (30-35ºC)

Humidificadores

Toma de muestra de bioaerosoles

Medio Ambiente

EDAR• Pretratamiento• Decantadores primarios•Tratamiento biológico•Deshidratación fangos

Toma de muestra de bioaerosoles

Medio Ambiente

CENTROS HOSPITALARIOS

Quirofanos

Toma de muestra de bioaerosoles

Medio Ambiente

Medio Ambiente

PCR Secuenciaciónde

rDNA 16S

Hibridación FISH

Fenotípicos Genotípicos

Aislamiento en cultivo

Pruebas de confirmación metabólicas

MétodosInmunológicos

Microscopía

Métodos diagnósticos

Medio AmbienteMétodos fenotípicos de detección

1. Detección de antígeno

- Rápidos y sencillos

2. Inmunofluorescencia directa (IFD)

- Límite de detección elevado - Solo detecta L. pneumophila sg. 1- Presencia de reacciones cruzadas

3. Estudios serológicos (IFI)- Estudios retrospectivos

Medio AmbienteMétodos fenotípicos de detección

4. Aislamiento en cultivo (ISO 11731)

Ventajas:

• Metodología normalizada

• Aislamiento de Legionella

• Metodología sencilla

Inconvenientes:

• Períodos de incubación largos (Días, semanas)• Baja especificidad. Problema con muestras

conteniendo abundante microbiota• No se detectan viables no cultivables

• Perdida de viabilidad después del muestreo

Medio Ambiente

RESULTADOS OBTENIDOS

TRATAMIENTO ACIDO DIRECTO

Medio Ambiente

TRATAMIENTO CONVENCIONAL

RESULTADOS OBTENIDOS

Medio Ambiente

Amplificación de DNA por la Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)

Solución

PCR: Técnica enzimática sencilla que permite copiar un fragmentoespecífico de DNA millones de veces en pocas horas

DNA Pol

Mg2+

Primer

dCTPdGTP

dTTPdATP

Componentes:

- Molde- Tampón PCR - Taq DNA polymerase- Cebadores- Mg+2

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Medio Ambiente

Desnaturalización (95 oC)

Extensión (72 oC)

Hibridación (55 oC) PCR

1 copia

2 Copias

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Medio Ambiente

• Secuenciación de DNA• Mutagénesis dirigida• Clonaje de DNA • Mapeado de genes y secuencias reguladoras• Expresión génica• Análisis forense y determinación de sexo• Pruebas de paternidad• Sistemática molecular y evolución• Genética de poblaciones• Detección de OGMs• Análisis de mutaciones• Carga viral• Cuantificación de genomas bacterianos

• Estudios de epidemiología molecular (RAPID-PCR; AFLP; MLST)

• Detección de patógenos

PCR: Aplicaciones prácticas

Medio Ambiente

L . pneumophila

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Standard Curve

010

2030

4050

0 2 4 6 8 10

Log Nº copies

Ct

CIP

404 pb

900 pb

• Rapidez• Elevada sensibilidad y especificidad• Reproducibilidad• Permite cuantificación• Procesado de elevado nº muestras• Posibilidad de amplificación ydetección simultánea

PCR Convencional

“real-time” PCR (Cuantitativa)

PCR: Ventajas

Medio Ambiente

Diagnóstico molecular de Legionella

Medio Ambiente

Legionella spp.

Legionella pneumophila

Gen dotA (defective organelle trafficking)Gen mip (macrophage infectivity potentiator)

Gen 16 S rDNA

Espaciador 23S-5S rDNA

Gen dnaJ (“heat shock protein”)

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Dianas

Medio Ambiente

PCR

CUALITATIVA CUANTITATIVA

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Medio Ambiente

Amplificación

(4 h 20 min)Electroforesis (45 min)

Extracción/Purificación de DNA (85 min.)

PCR convencional: Proceso

Medio Ambiente

Dot F

Dot M Dot M

Dot F

Dot M

Dot K

Dot M

CIint F

444 bp 890 bp

1stamplification

Amplification Conditions

94ºC 4:00

94ºC 0:3058ºC 0:30 35 Cycles72ºC 1:00

72ºC 10:00

dotA IPC (dot-gyrB-dot)

825 bp387 bp

2nd amplification

Amplification Conditions

94ºC 4:00

94ºC 0:3058ºC 0:30 35 Cycles72ºC 1:00

72ºC 10:00

Legionella pneumophila

PCR convencional: Sistema

Medio Ambiente

L . pneumophila

L. pneumophila Control Interno (CIP)

INTERPRETACIÓN

Positivo Positivo Positivo

Negativo Positivo Negativo

Positivo Negativo Positivo

Negativo Negativo Inhibición

Carrera

1, 2

3, 4, 5

6, 7

8, 9

2 3 4 5 6

CIP

404 pb

900 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PCR convencional: Interpretación de resultados

Detección de células totales (vivas y muertas)

Medio Ambiente

Solución:

“Real-Time” PCR (PCR cuantitativa)

Amplificación y Detección simultáneas en una única reacción

SYBR-Green Sondas internas marcadasfluorescentemente

PCR convencional Cualitativa

PCR a “tiempo-real”

Medio Ambiente

SYBR-Green se intercalaentre la doble hélice del DNA y emite fluorescencia

Inconvenientes:

• Detección no específica

•Aparición de productos PCR inespecíficos (Falsos positivos)

PCR a “tiempo-real”

Medio Ambiente

Sondas específicas marcadas hibridan con la diana amplificada

Ventajas Alta especificidad

Sondas HybProbe Molecular Beacon

Sondas TaqMan

PCR a “tiempo-real”

Medio Ambiente

Detección y análisis (10 min.)

Amplificación

(90 min.)

Extracción/Purificación de DNA (85 min.)

PCR a “tiempo-real”: Proceso

Medio Ambiente

5 35 3 5 35 3

80 bp53

dotA (FAM) Internal Control (VIC)

53202 bp

33 535 3

R QR Q5 3

53

Step 1: Hold 50ºC for 2 min

Step 2: Hold 95ºC for 10 min

Step 3: 42 cycles

- Hold 95ºC for 15 sec

- Hold 60ºC for 1min

Legionella pneumophila

PCR a “tiempo-real”: Sistema

Medio Ambiente

Standard Curve

010

2030

4050

0 2 4 6 8 10

Log Nº copies

Ct

Ct=-3,028 log[DNA] +39,6148

R²= 0,94743 r= -0,9733

PCR a “tiempo-real”: Interpretación de resultados

Medio AmbientePCR y viabilidad

1. Realización de un precultivo

3. Uso de agentes intercalantes (Monoazida de etidio)Bloquean DNA libre y de células muertas

2. Cambio de molécula diana. DNA mRNA(RT-PCR)(NASBA)

Métodos cualitativos (Presencia/Ausencia)

Método cuantitativo

Medio Ambiente

Controles de calidad en PCR

Medio AmbientePCR: Controles de calidad

Evaluación interna de la calidad:

1. Controles del método:Control de proceso (positivo/negativo)Control de extracción (positivo/negativo)Control de PCR (positivo/negativo)Control interno positivo (CIP)Control de cuantificación

Materiales de referencia: Células - Suspensiones a partir de cepas colección

- Material de referencia comercial

DNA - Cuantificado (espectrofotométricamente)- Material de referencia comercial

Medio Ambiente

Evaluación interna de la calidad:

2. Plan de evaluación de ensayos:Muestras ciegasMuestras dobles ciegasEnsayos entre analistasEnsayos entre métodos

PCR: Controles de calidad

Materiales de referencia: Células - Suspensiones a partir de cepas colección

- Materiales de referencia comercial

DNA - Cuantificado (espectrofotométricamente)- Material de referencia comercial

3. Auditorías

Medio Ambiente

Evaluación externa de la calidad:

1. Ejercicios de Intercomparación

PCR: Controles de calidad

2. Auditorías

Medio Ambiente

Inconvenientes de la PCR

Medio Ambiente

1. Presencia de inhibidores puede provocar errores de interpretación (falsos negativos) Importancia del patrón interno (CIP)

PCR: Inconvenientes y soluciones

2. Métodos científicos mas que procedimientos normalizados. Necesidad de conocimientos en el diseño, desarrollo y validación desistemas de amplificación

Evolución de los sistemas de preparación de muestras

Medio Ambiente

Validación. Proceso de evaluación de las características de un procedimiento de medida y comprobación de que dichas características cumplen una serie de requisitos preestablecidos.

PCR: Validación

Medio Ambiente

1. Diseño de cebadores:Múltiples alineamientos del gen diana (secuencias del GenBank)mediante CLUSTAL X.

2. Secuencias potenciales:. Analizadas por BLAST con las secuencias del GenBank

. Analizadas con programas de diseño de primers (Primer express,etc.)

Medio Ambiente

3. Sensibilidad, Especificidad, Falsos positivos, Falsos negativos,Eficiencia, Selectividad

4. Optimización de la reacción PCR

5. Límite de detección

6. Límite de cuantificación

7. Exactitud7. Exactitud

8. Repetibilidad y reproducibilidad

9. Incertidumbre

10. Linealidad

Medio Ambiente

1. Presencia de inhibidores puede provocar errores de interpretación (falsos negativos) Importancia del patrón interno (CIP)

PCR: Inconvenientes y soluciones

2. Métodos científicos mas que procedimientos normalizados. Necesidad de conocimientos en el diseño, desarrollo y validación desistemas de amplificación

Evolución de los sistemas de preparación de muestras

Sistemas comerciales en formato kitDocumentos de validación de métodos PCREstudios intercolaborativos (AFNOR)

Medio Ambiente

Diseño

Desarrollo

Validación

Fabricación ycomercialización

Aplicación

Asesoramiento técnico

•Tan sencillo como unos pocos pipeteos• Fiable• Fácil de interpretar• Coste asequible

•Evaluación interna de la calidad•Evaluación externa de la calidad

Medio AmbientePCR: Inconveniente y Soluciones

3. Técnica laboriosa

4. Elevado coste

Plataformas automatizadas de procesamiento de muestrasy realización de la PCR

A medida que aumente el consumo se reducirán los costes

Medio Ambiente

El futuro de los métodos diagnósticos moleculares

Medio Ambiente

Ventajas:

- Detección simultánea de miles de genes

- Posibilidad de automatización - Gran potencial analítico

DNA arrays (DNA chips)

Inconvenientes:

- Baja sensibilidad (necesita PCR)- Tecnología con un coste elevado

Medio Ambiente

1. Procedimientos biológicos en miniatura, incluyendo PCR

2. Integración de múltiples protocolos en un único chip para realizar el análisisíntegro de una muestra

3. La tecnología de microfluidics acoplada a PCR será una herramienta muypotente para la detección simultánea de patógenos

Biosensores de microcanales: Microfluidics

Medio Ambiente

Actualmente la mayoría de las legislaciones no contemplan los métodos basados en PCR

Sin embargo, sabemos que los métodos PCR mejorandrásticamente la detección de patógenos

En consecuencia:

- Más que protocolos científicos, importancia de emplear métodos validados y normalizados - Participación en Ejercicios de Intercomparación- Incorporación progresiva a las legislaciones nacionales

PCR: Implicaciones Legales

Medio Ambiente