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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
Listeria monocytogenes EM VEGETAIS FRESCOS,
CONGELADOS E PRONTOS PARA O CONSUMO E
RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS
VANESSA DE VASCONCELOS BYRNE
Salvador - BA 2014
VANESSA DE VASCONCELOS BYRNE
Listeria monocytogenes EM VEGETAIS FRESCOS,
CONGELADOS E PRONTOS PARA O CONSUMO E
RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS
Orientadora: Profª Dra. Rogeria Comastri de Castro Almeida
Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade Federal da Bahia, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, para obtenção do título de Mestre
Salvador - BA 2014
Sistema de Bibliotecas - UFBA
Byrne, Vanessa de Vasconcelos.
Listeria monocytogenes em vegetais frescos, congelados e prontos para o consumo e
resistência a antimicrobianos / Vanessa de Vasconcelos Byrne. - 2014.
72 f. : il.
Orientadora : Prof.ª Drª Rogeria Comastri de Castro Almeida.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Farmácia, 2014.
1. Listeria monocytogenes. 2. Alimentos - Contaminação. 3. Listeriose. 4. Segurança
alimentar. I. Almeida, Rogeria Comastri de Castro. II. Universidade Federal da Bahia.
Faculdade de Farmácia. III. Título.
CDD - 579.37
CDU - 579.67
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, pela vida e oportunidade de ter me trazido até aqui;
Ao meu “pequeno grande homem”, Guilherme, pelo simples fato de existir em minha vida tornando os meus dias mais belos e serenos;
Ao meu esposo, Fernando, que sempre me incentivou e deu forças nos momentos mais difíceis, ajudando-me a alcançar esse objetivo;
À professora Rogeria pela orientação e contribuição na formação da minha vida acadêmica;
Ao Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial (SENAI), nos nomes de Caroline Passos e Cleide Guedes, pela parceria na utilização das instalações da instituição no desenvolvimento da pesquisa;
Ao Instituto Oswaldo Cruz de Manguinhos, RJ, na pessoa do Dr. Ernesto Hofer pelas identificações sorológicas das cepas;
A todos os amigos e familiares que compreenderam e respeitaram a minha ausência em diversos momentos;
Enfim, a todos que cruzaram o meu caminho ao longo dessa caminhada e que de alguma forma contribuíram com a realização desse sonho.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL.......................................................................................... OBJETIVOS .......................................................................................................... GERAL................................................................................................................... ESPECÍFICOS....................................................................................................... ORGANIZAÇÃO DO TRABALHO.........................................................................
12 14 14 14 15
CAPÍTULO 1: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.......................................................... 1 VEGETAIS.......................................................................................................... 1.1 NOVOS HÁBITOS ALIMENTARES.............................................................. 1.2 VEGETAIS FRESCOS.................................................................................. 1.3 VEGETAIS MINIMAMENTE PROCESSADOS............................................. 1.4 EFEITO DA TEMPERATURA NOS VEGETAIS........................................ 2 Listeria monocytogenes.................................................................................. 2.1 HISTÓRICO E IDENTIFICAÇÃO.................................................................. 2.2 CLASSIFICAÇÃO E CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS........................... 2.3 LISTERIOSE................................................................................................. 2.4 OCORRÊNCIA DE Listeria monocytogenes EM ALIMENTOS..................... 2.5 REGULAMENTAÇÃO SOBRE L. monocytogenes EM ALIMENTOS........... 2.6 MÉTODOS DE DETECÇÃO DE Listeria monocytogenes............................ 2.6.1 Métodos Convencionais ...................................................................... 2.6.2 Métodos Rápidos................................................................................... 2.6.2.1 Meio Ágar Listeria Ottaviani Agosti – ALOA................................... 2.7 SUSCEPTIBILIDADE DE L. monocytogenes A
ANTIMICROBIANOS..................................................................................... 2.7.1 Antibióticos ......................................................................................... REFERÊNCIAS......................................................................................................
16 16 16 17 18 20 21 21 22 27 28 31 32 33 35 36 38 39 42
CAPÍTULO 2: OCORRÊNCIA DE Listeria monocytogenes EM VEGETAIS .... OCCURRENCE OF Listeria monocytogenes IN VEGETABLES…………..…… RESUMO………………………………………………………………………………… ABSTRACT……………………………………………………………………………… 1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 2 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 2.1 MATERIAL .................................................................................................... 2.1.1 Microrganismo de referência .............................................................. 2.1.2 Grupos de alimentos analisados......................................................... 2.1.3 Antimicrobianos.................................................................................... 2.1.4 Origem dos isolados bacterianos....................................................... 2.2 METODOLOGIA............................................................................................ 2.2.1 Desenho e local de estudo.................................................................. 2.2.2 Amostragem........................................................................................... 2.2.3 Ocorrência de Listeria monocytogenes..............................................
53 53 54 55 56 58 58 58 58 58 58 59 59 59 60
2.2.4 Avaliação da resistência a antimicrobianos........................................ 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................ 3.1 OCORRÊNCIA DE L. monocytogenes EM VEGETAIS................................ 3.2 RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS........................................................ 4 CONCLUSÃO..................................................................................................... REFERÊNCIAS......................................................................................................
61 63 63 66 69 70
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
Tabela 1: Antibióticos Antibióticos utilizados no estudo....................................59
Tabela 2: Isolados de L. monocytogenes submetidos à avaliação da
resistência/susceptibilidade aos antibióticos ....................................................63
Tabela 3: Ocorrência de Listeria monocytogenes em vegetais frescos,
congelados e prontos para o consumo (saladas)..............................................64
Tabela 4: Resistência/susceptibilidade de isolados de Listeria monocytogenes
aos antimicrobianos...........................................................................................67
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figura 1: Flagelos peritríquios do gênero Listeria .............................................23
Figura 2: Prova de motilidade – formato de “guarda-chuva”.............................24
Figura 3: Colônias típicas de Listeria monocytogenes em Ágar ALOA ............38
LISTA DE ABREVIATURAS
L. ivanovii – Listeria ivanovii
L. monocytogenes – Listeria monocytogenes
L. seeligeri – Listeria seeligeri
L. inoccua – Listeria inoccua
LISTA DE SIGLAS
AES - Advanced Encryption Standard AFNOR - Association Française of Normalization AIDS - Acquired Immunodeficiency Syndrome ALOA - Ágar Listeria Ottaviani Agosti ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária APHA - American Public Health Association BAM - Bacteriological Analitycal Manual BHI - Brain Heart Infusion BPA - Boas Práticas Agrícolas CAMP - Christie, Atkins e Munch-Petersen CDC - Centers for Diseases Control and Prevention CE – Comunidade Europeia CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute DI – Dose Infectante ECSC - European Commission Scientific Committee FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations FDA - Food and Drug Administration HC - Health Canada ICMSF - International Commission on Microbiological Specifications for Foods IFPA - International Fresh-Cut Producers Association ILSI - International Life Sciences Institute ISO - International Organization for Standardization LPM - Ágar Cloreto de Feniletanol Moxalactam MG - Ágar Mueller Hinton MOX - Ágar Oxford Modificado NMP - Número Mais Provável OXA - Ágar Oxford PAL - Ágar Palcam RDC - Resolução da Diretoria Colegiada SENAI – Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial SIM - Sulfeto Indol Motilidade TSA - Ágar tríptico de soja UFC – Unidades Formadoras de Colônia USDA - United States Department of Agriculture VMP - Vegetais Minimamente Processados WHO – World Health Organization
RESUMO
Apesar do consumo de vegetais frescos e minimamente processados ser considerado saudável, a ocorrência de surtos de toxinfecções alimentares associados a esses produtos demonstra que os mesmos não são seguros microbiologicamente, pois podem veicular microrganismos patogênicos. A impossibilidade de aplicação de conservantes químicos e tratamentos térmicos que reduzem consideravelmente a presença de patógenos em alimentos, torna esses produtos mais susceptíveis a contaminação. Dentre os patógenos de origem alimentar associados a vegetais, destaca-se a Listeria monocytogenes, bactéria ubíqua que apresenta como principal característica a sobrevivência e multiplicação em temperaturas de refrigeração. A doença causada pelo microrganismo, a listeriose, acomete principalmente pessoas de grupos de risco, ou seja, gestantes, idosos, crianças e pacientes imunodeprimidos. Diversas combinações de antibióticos podem ser utilizadas no tratamento da listeriose, sendo que a crescente resistência do microrganismo aos mesmos já se torna preocupante. O presente estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de L. monocytogenes em vegetais frescos, congelados e prontos para o consumo e a resistência das cepas isoladas a antibióticos. Um total de 99 amostras de vegetais foi avaliado para a ocorrência de L. monocytogenes, sendo 33 de vegetais frescos, 33 de vegetais congelados e 33 de vegetais prontos para o consumo (saladas prontas). Os resultados demonstraram que 4,04% das amostras apresentavam contaminação pela bactéria. Dessas, 3,03% pertenciam ao grupo dos vegetais frescos e 9,09% pertenciam ao grupo dos vegetais prontos para o consumo. Os vegetais congelados não apresentaram a contaminação. As cepas isoladas pertenciam ao sorotipo 4b. Quanto à resistência aos antibióticos, os testes de sensibilidade mostraram que 80% dos isolados de L. monocytogenes foram sensíveis aos oito antibióticos utilizados. Os resultados também demonstraram que duas amostras de vegetais prontos para o consumo (saladas) estavam contaminadas com L. monocytogenes resistente à penicilina e tetraciclina. Palavras-chave: Vegetais. Listeriose. Toxinfecção alimentar.
ABSTRACT
Despite the consumption of fresh vegetables and minimally processed to be considered healthy, the occurrence of outbreaks associated with these products show a hazard from microbiological, as they may be the vehicle for transmission of pathogens. The impossibility of applying chemical preservatives and heat treatments, which considerably reduces the pathogenic microorganisms in these products, makes them more susceptible to contamination. Among the food-borne pathogens associated with vegetables, there is the Listeria monocytogenes, a ubiquitous organism, that present as main characteristic the survival and multiplication in refrigerated temperatures. The disease caused by it, Listeriosis, affects mainly people in risk group, such as pregnant women, older age, children and immunocompromised patients. Several combinations of antibiotics may be used in the treatment of listeriosis, with the increasing resistance of the microorganism have the same becomes disturbing. The present study aimed to evaluate the occurrence of L. monocytogenes in raw, frozen and ready-to-eat vegetables and the antibiotic resistance of the isolates. To evaluate the occurrence of L. monocytogenes, a total of 99 samples of vegetables were analyzed, including 33 samples of fresh vegetables, 33 of frozen vegetables and 33 of ready-to-eat vegetables (salads). The results demonstrated that 4.04% of the samples were contaminated with bacteria. Of these, 3.03% belonged to the group of fresh vegetables and 9.09% belonged to the group of ready-to-eat vegetables (salads). None of sample group of frozen vegetables showed contamination. The strains isolated belonged to serotype 4b. Antimicrobial resistance profiling showed that 80% of the isolates were sensitive to eight antibiotics used. L. monocytogenes isolated from two samples of vegetables ready-to-eat were resistant to penicillin and tetracycline.
Keywords: Vegetables. Listeriosis. Food poisoning.
12
INTRODUÇÃO GERAL
A segurança dos alimentos é cada vez mais um assunto relevante no
cotidiano dos consumidores. Está relacionada com a presença de perigos
químicos, físicos e microbiológicos nos gêneros alimentícios, os quais podem
surgir em qualquer etapa da cadeia alimentar, constituindo um risco para a
saúde pública. A produção e o consumo de alimentos são indispensáveis em
qualquer sociedade, o que leva a necessidade de um rigoroso controle de
qualidade nos produtos que são oferecidos para a população. O controle deve
aplicar-se desde a produção primária, através das Boas Práticas Agrícolas
(BPA) nas plantações até o consumo do produto final.
Os vegetais frescos e os vegetais minimamente processados fazem
parte da dieta humana em todo o mundo. A busca por uma alimentação mais
saudável e ao mesmo tempo mais rápida tem favorecido o consumo desses
produtos. O fato de não serem submetidos a tratamentos que reduzam
consideravelmente os perigos microbiológicos, estes alimentos, essenciais a
uma dieta equilibrada e rica em nutrientes, são potenciais veículos de
transmissão de microrganismos patogênicos (DE ROEVER, 1998;
VISWANATHAN et al., 2001).
Para inibir a multiplicação microbiana e garantir uma conservação
adequada, os vegetais necessitam ser estocados em temperatura de
refrigeração. Porém, tal situação favorece o crescimento de microrganismos
patógenos psicrotróficos, como Listeria monocytogenes que representa grande
importância em saúde pública (DE ROEVER, 1998; GANDHI et al., 2007).
Listeria monocytogenes é uma bactéria ubíqua, podendo ser encontrada
na água de irrigação, no solo e no adubo utilizado nas plantações. Além disso,
é uma bactéria saprófita, que participa na decomposição da matéria orgânica
vegetal. Mediante estes fatos, é possível encontrá-la nos vegetais (BEUCHAT,
1998).
Por ser ubíqua, a bactéria é largamente distribuída no ambiente,
incluindo o ambiente de processamento de uma grande variedade de
alimentos. Isso faz com que os seres humanos estejam frequentemente em
contato com ela (GANDHI et al., 2007; SAUDERS et al., 2007). Nas últimas
13
décadas a bactéria tem emergido como um importante patógeno de toxinfecção
alimentar (WARRINER et al., 2009; TODD et al., 2011). Surtos associados a
uma grande gama de alimentos processados têm sido reportados
(CARPENTIER et al, 2011; TODD et al., 2011).
A doença causada pela L. monocytogenes, a listeriose, é uma infecção
alimentar que acarreta um quadro clínico severo, tem um período de incubação
longo e apresenta alta taxa de letalidade em pessoas pertencentes ao grupo de
risco: idosos, gestantes, crianças e pacientes imunodeprimidos (ROCOURT et
al., 1997). Surtos de listeriose humana são muitas vezes associados com
produtos prontos para o consumo que são consumidos sem cozimento prévio
(NORTON, 2002).
O tratamento da listeriose consiste na administração de antibióticos e
aminoglicósidios (CONTER et al., 2009). Pesquisas recentes têm demonstrado
a resistência e multirresistência do microrganismo aos antibióticos comumente
utilizados no tratamento de listeriose, o que é um fato preocupante.
Mediante o exposto e considerando a importância da L. monocytogenes
para a saúde pública, o presente estudo teve como objetivo verificar a
ocorrência do microrganismo em amostras de vegetais e a resistência dos
isolados a antibióticos comumente utilizados no tratamento da doença.
14
OBJETIVOS
GERAL
Verificar a ocorrência de Listeria monocytogenes em amostras de
vegetais frescos, congelados e prontos para o consumo comercializados na
cidade de Salvador, BA e avaliar a resistência dos isolados de Listeria
monocytogenes a antimicrobianos.
ESPECÍFICOS
● Verificar a ocorrência de Listeria monocytogenes em amostras de
vegetais frescos, vegetais congelados e vegetais prontos para o consumo;
● Identificar os sorotipos das cepas isoladas de Listeria monocytogenes;
● Comparar a frequência de isolamento entre os grupos de amostras:
vegetais frescos, vegetais congelados e vegetais prontos para o consumo;
● Avaliar a resistência das cepas de Listeria monocytogenes isoladas
aos antibióticos cefoxitina, ciprofloxacina, eritromicina, estreptomicina,
oxacilina, penicilina, tetraciclina e vancomicina.
15
ORGANIZAÇÃO DO TRABALHO
Este estudo organiza-se em dois capítulos, sendo o primeiro de revisão
da literatura, com abordagem de temas relacionados à mudança dos hábitos
alimentares salientando o aumento no consumo de vegetais, as características
do microrganismo, Listeria monocytogenes, a sua ocorrência em alimentos e
resistência a antibióticos.
O segundo capítulo, em forma de artigo, avalia a ocorrência de Listeria
monocytogenes em amostras de vegetais frescos, vegetais congelados e
vegetais prontos para o consumo, identificando os sorotipos e comparando a
frequência de isolamento entre os grupos de vegetais investigados. Avalia
também a resistência dos isolados aos antimicrobianos comumente utilizados
na medicina humana.
16
CAPÍTULO 1: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1 VEGETAIS
1.1 NOVOS HÁBITOS ALIMENTARES
Nas últimas décadas, foi possível observar mudanças nos hábitos
alimentares em diversos países, o que reflete a complexidade dos modelos de
consumo e dos fatores que os determinam (PINHEIRO, 2001). Tais mudanças
afetam a qualidade dos alimentos produzidos e industrializados. Na tentativa de
adequar a alimentação ao ritmo acelerado do dia-a-dia, as escolhas e os
hábitos de consumo passaram a apontar para alimentos mais condizentes com
o novo estilo de vida, fazendo com que fossem incorporados hábitos de
consumo rápido e prático (FLANDRIN et al., 1996; OLIVEIRA, 1997; ABREU et
al., 2001; SOUZA et al., 2002).
Nesse contexto, observa-se que na contemporaneidade, a alimentação é
caracterizada pelo estilo de vida moderno, marcado pela escassez de tempo
para preparo e consumo de alimentos, o que leva à emergência de alimentos
do tipo fast food. Em contrapartida, uma parte da população desperta para os
aspectos da saúde, optando por uma alimentação mais saudável, associada ao
consumo de produtos que não tenham sofrido profundas alterações em sua
composição química e valor biológico agregados (PEREIRA et al, 2001;
CAMPOS, 2004).
A busca por uma alimentação saudável aliada à conveniência conduziu
ao aumento da produção e disponibilização de vegetais minimamente
processados para consumo imediato. A agroindústria de alimentos
processados, prontos para o consumo, tem se esforçado para preparar,
manusear e entregar produtos frescos, saudáveis e seguros para o consumidor
(BEUCHAT, 2002; VANETTI, 2004).
Segundo Sato et al. (2007), a emergência do mercado para esses
produtos deveu-se a diversos fatores, tais como: o acesso cada vez maior das
mulheres ao mercado de trabalho, a necessidade de conveniência pela falta de
17
tempo dos consumidores, e o aumento da renda real dos trabalhadores com a
estabilização da inflação.
Quando se pensa em frutas e hortaliças minimamente processadas,
evoca-se, além da praticidade e da comodidade desses produtos, as novas
exigências sociais do cotidiano de mulheres, homens, crianças, jovens, adultos
e idosos. Considera-se também a oferta de alimentos frescos prontos para o
consumo, seguros e nutritivos; portanto, com funções utilitárias fundamentais
para uma vida mais longa, prazerosa e saudável (SEBRAE, 2008).
1.2 VEGETAIS FRESCOS
O apelo por alimentos frescos, de baixas calorias, saudáveis, nutritivos e
de alta qualidade é cada vez maior. Consumidores vêm modificando seus
hábitos alimentares e, cada vez mais, tornam-se conscienciosos da relação
entre dieta e prevenção de doenças. Agências governamentais e organizações
americanas vêm recomendando o incremento no consumo de vegetais, frutas e
cereais na dieta da população para prevenção e promoção da saúde. Esses
produtos hortícolas frescos apresentam diversidade de cores, formatos,
texturas e sabores, além das características nutricionais imprescindíveis à
preservação da saúde (MAISTRO, 2001).
Nos vegetais frescos em geral, a contaminação ou presença de
microrganismos patogênicos pode ocorrer em diferentes etapas, desde a sua
produção no campo até o consumo final. Na etapa de produção agrícola,
plantio, colheita e transporte, a contaminação pode ser oriunda do ar, do solo
contaminado, da água de irrigação, dos vetores, do adubo orgânico, de fezes
de animais, da manipulação humana, entre outros (BEUCHART, 1996; IFPA,
2013).
Segundo Moretti (2007), a adoção de Boas Práticas Agrícolas (BPA) é
indispensável para a obtenção de matéria-prima de boa qualidade,
principalmente considerando-se os riscos de contaminação por produtos
químicos e de natureza microbiológica.
Como a maioria dos vegetais possui pH superior a 4,5 e, portanto,
favorável à multiplicação microbiana, as temperaturas de estocagem e de
comercialização são os fatores determinantes da segurança destes produtos.
18
Destaca-se então, a possibilidade da presença de patógenos psicrotróficos
ubíquos, como Listeria monocytogenes. Essa bactéria é capaz de contaminar
os alimentos por várias vias; consegue formar e sobreviver em biofilmes; é um
microrganismo psicrotolerante e, por esse motivo, mesmo estando o alimento
armazenado sob refrigeração, a bactéria continua a multiplicar-se, podendo
alcançar níveis perigosos, representando uma grande preocupação em saúde
pública (DE ROEVER, 1998; CONCEPCIÓN et al., 2007; GANDHI et al., 2007).
1.3 VEGETAIS MINIMAMENTE PROCESSADOS
Segundo a International Fresh-Cut Producers Association (IFPA, 2013),
produtos minimamente processados são definidos como qualquer fruta ou
hortaliça, ou ainda qualquer combinação delas, que foi alterada fisicamente a
partir de sua forma original, embora mantenha o seu estado fresco.
Independentemente do tipo, ele é selecionado, lavado, descascado e cortado,
resultando num produto 100% aproveitável que, posteriormente, é embalado ou
pré-embalado com vistas à comercialização.
Nos Estados Unidos da América (EUA), hortaliças minimamente
processadas são comercializadas desde 1970. No Brasil, o processamento
mínimo de frutos e hortaliças foi introduzido na década de 90 por empresas
atraídas pela nova tendência, encontrando-se atualmente em franca expansão.
Esse mercado tem sido impulsionado pelas mudanças no perfil demográfico
brasileiro. Dentre essas mudanças pode-se destacar o crescimento da
participação feminina no mercado de trabalho e o aumento no número de
pessoas morando sozinhas, o que diminuiu o tempo disponível para o preparo
de refeições, consolidando assim um perfil específico de consumidor. Essa
linha de produtos representa economia de tempo, conveniência e redução de
lixo gerado (CHITARRA, 1998; MORETTI, 2007; SATO et al., 2007; SILVA et
al., 2009).
A demanda por vegetais minimamente processados, por serem naturais
e saudáveis, tem aumentado e a necessidade de torná-los estáveis e seguros
representa um desafio para pesquisadores e processadores. O aumento do
19
tempo entre o processamento e o consumo poderá contribuir para maiores
riscos de doenças veiculadas por estes alimentos (ALZAMORA et al., 2000).
Segundo Oetterer et al. (2006), o sucesso desta técnica depende, no
entanto, das condições higiênico-sanitárias em todas as etapas envolvidas na
produção desses vegetais, com objetivo de garantir a qualidade do produto,
prolongar a vida útil e manter o mesmo frescor apresentado pelos produtos in
natura.
Os conceitos de qualidade e de segurança alimentar são inseparáveis
do conceito de produtos minimamente processados e devem figurar entre seus
principais apelos, independente da grande força motivacional dos aspectos
práticos e convenientes desses produtos. Além disso, o processamento mínimo
de hortaliças e frutas, pela sua proposta conceitual, deve garantir as
propriedades nutritivas e organolépticas originais dos produtos in natura
(SEBRAE, 2008).
Para que os vegetais minimamente processados tenham um período de
validade maior e permaneçam conservados, faz-se necessário que depois de
embalados e rotulados, eles sejam armazenados em câmaras providas de
isolamento térmico e com máquinas produtoras de frio capazes de mantê-los
refrigerados à temperatura variando de 2°C a 5°C (SEBRAE, 2008).
O controle rigoroso da temperatura em todas as etapas da produção é
essencial para a manutenção da qualidade do produto minimamente
processado (NASCIMENTO et al., 2003).
Após serem processados, os produtos minimamente processados
devem apresentar atributos de qualidade, como o frescor, aroma, cor e sabor,
mantendo o máximo de suas características nutritivas e sensoriais. No entanto,
observa-se que não é fácil preservar os atributos naturais dos vegetais, uma
vez que o processamento, frequentemente, provoca lesões mecânicas nos
tecidos, levando a perda de água e alterações de cor (escurecimento ou
descoloração). Além disso, há formação de um fluido rico em minerais,
açúcares, vitaminas e outros nutrientes que favorecem o crescimento
microbiano. Em função disso, eles são classificados como produtos altamente
perecíveis (CHITARRA; CHITARRA, 2005; SOARES; GERALDINE, 2007).
Como mencionado anteriormente, o processamento mínimo de vegetais
envolve a manipulação dos tecidos vivos, portanto, para sua conservação
20
devem ser monitorados parâmetros como respiração, transpiração, produção
de etileno, características sensoriais – inerentes de cada variedade ou cultivar
– e suscetibilidade ao ataque de microrganismos. Dessa forma, o
processamento requer a aplicação de tecnologia adequada e o conhecimento
da fisiologia de cada matéria prima (OETTER et al., 2006).
Por apresentaram-se ainda em estado fresco, os vegetais minimamente
processados, na maioria das vezes, não necessitam de preparo subsequente
para o consumo (SANTOS et al., 2010).
Apesar dos processamentos terem por objetivo preservar a qualidade
sensorial, nutricional e microbiológica dos produtos, conservando-os por mais
tempo, tais etapas podem não ser eficientes para eliminar a contaminação
microbiológica dos vegetais minimamente processados e, além disso, o
armazenamento sob refrigeração pode favorecer o crescimento de
psicrotróficos patogênicos e microrganismos deteriorantes (RODRIGUES et al,
1999; AGUADO et al., 2004; GLEESON; O’BEIRNE, 2005).
De acordo com De Roever (1998) os patógenos de importância para os
vegetais minimamente processados são: Shigella spp., Escherichia coli
O157:H7, Escherichia coli enterotoxigênica, Vibrio cholerae, Bacillus cereus,
vírus da Hepatite A e Listeria monocytogenes.
1.4 EFEITO DA TEMPERATURA NOS VEGETAIS
A temperatura é um dos fatores ambientais que mais influencia no
desenvolvimento e na atividade metabólica dos microrganismos. A refrigeração
inibe o crescimento dos microrganismos termófilos e de muitos mesófilos,
porque eles têm a temperatura ótima superior às empregadas nesse processo,
entretanto, o mesmo não é observado para os microrganismos psicrófilos ou
psicrotróficos (ORDÓÑEZ, 2005). Ainda, segundo Ordóñez (2005), o efeito
conservador do frio baseia-se na inibição total ou parcial dos principais agentes
responsáveis pelas alterações nos alimentos: o crescimento e a atividade dos
microrganismos, as atividades metabólicas dos tecidos vegetais após a
colheita, as enzimas e as reações químicas.
21
Em se tratando de congelamento, o objetivo dessa prática é reter, tanto
quanto possível, e no mais alto grau, as propriedades dos vegetais ou outros
produtos alimentícios. Entretanto, ao descongelar o alimento ocorrem
mudanças irreversíveis que tornam o produto descongelado bem diferente do
produto fresco, principalmente quanto à sua textura. Geralmente há
rompimento das células dos tecidos, devido à formação de cristais de gelo. A
extensão dos danos depende muito do produto. Durante o descongelamento o
produto se torna muito mais flácido e perde bastante água (SILVA et al., 2007).
Durante muitos anos, pensou-se que alimentos refrigerados eram
seguros do ponto de vista microbiológico, considerando que as temperaturas
inferiores a 5°C inibiriam o crescimento da maioria dos microrganismos
patogênicos de interesse para os alimentos. Contudo, comprovou-se que
alguns são capazes de proliferar-se em temperaturas de refrigeração (3°C a
10°C), como: Aeromonas hydrofila, Clostridium botulinum, Yersinia
enterocolitica, Vibrio parahaemolyticus, Plesiomonas shigelloides e Listeria
monocytogenes (ORDÓÑEZ, 2005).
2 Listeria monocytogenes
2.1 HISTÓRICO E IDENTIFICAÇÃO
Listeria monocytogenes é uma bactéria conhecida dos cientistas já há
muitos anos. Suas características de patógeno intracelular vêm atraindo
estudos desde que Murray et al., relataram, em 1924, o primeiro isolamento de
um microrganismo que foi responsável por uma leucocitose mononuclear típica
em coelhos. Eles descreveram uma infecção espontânea entre os coelhos e
cobaias de laboratório no biotério da Universidade de Cambridge, no Reino
Unido, e denominaram o agente de Bacterium monocytogenes, em virtude da
infecção ser caracterizada por uma monocitose (MURRAY et al., 1926;
SALAMANO et al., 2005).
Em 1927, Pirie estudando uma epizootia em roedores na África do Sul,
isolou do fígado dos animais uma bactéria que recebeu a denominação de
Listerella hepatolytica, em homenagem ao cientista e cirurgião britânico lorde
22
Joseph Lister. Contudo, considerando ser parecido com o agente isolado pelos
autores ingleses e como já existia um gênero vegetal chamado Listerella,
finalmente, em 1940, o microrganismo foi denominado de forma definitiva como
Listeria monocytogenes. Entretanto, somente em 1948 a bactéria foi incluída no
Manual Bacteriológico Determinativo de Bergey (BREED; MURRAY, 1948;
HOFER et al., 2005).
Nyfeldt, em 1929, foi quem confirmou o primeiro isolamento do
microrganismo em indivíduos infectados. A partir desse ano, casos esporádicos
e pontuais de listeriose foram identificados, os quais estavam associados a
indivíduos que tiveram contato com animais doentes, caracterizando-a como
uma doença de caráter ocupacional. Já na década de 1980, outros surtos
foram relatados, agora ligados à ingestão de alimentos contaminados. A partir
daí, o interesse pela pesquisa da bactéria aumentou rapidamente entre
pesquisadores, indústrias e agências reguladoras (FARBER; PETERKIN,
1991).
O gênero Listeria pertence à família Listeriaceae, à ordem Bacillaceae, à
classe Bacilli e ao filo Firmicute (NCBI, 2010).
2.2 CLASSIFICAÇÃO E CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS
L. monocytogenes foi a primeira espécie reconhecida do gênero Listeria,
mas atualmente são consideradas oito espécies. L. monocytogenes e Listeria
ivanovii são patogênicas para o homem e/ou animais, Listeria seeligeri é
avirulenta. Quanto as outras cinco espécies, Listeria innocua, Listeria
welshimeri, Listeria grayi, Listeria marthii e Listeria rocourtiae são saprófitas
(BREED et al., 1948; GOPAL et al., 2010).
As espécies citadas podem ser divididas em dois grupos, quando
inoculadas em ágar sangue: hemolíticas, que produzem enzimas que lisam as
hemácias formando uma zona clara ao redor da colônia e as não hemolíticas,
que dissolvem as hemácias, e, portanto, não formam este halo. As espécies
hemolíticas são L. monocytogenes, L. ivanovii e L. seeligeri (BILLE et al.,
2003).
23
No gênero Listeria, apenas as espécies L. ivanovii e L. monocytogenes
são consideradas virulentas. Embora haja relatos de infecções humanas
causadas por L. ivanovii e L. seeligeri, somente determinadas linhagens de L.
monocytogenes conseguem vencer os mecanismos de defesa do trato
gastrentérico, sobreviver aos ataques do sistema imune, aderir às células
epiteliais e multiplicar/difundir para enterócitos, hepatócitos, células endoteliais
e dendríticas, alcançando a submucosa intestinal, fígado, baço, cérebro e
placenta. Assim, somente L. monocytogenes é considerada consistentemente
patogênica a humanos (POYART et al., 1996; BREHM et al., 1996;
LOESSNER et al., 1997).
São 14 as sorovariedades de L. monocytogenes descritas com base nos
antígenos somáticos e flagelares e identificadas pelo esquema alfa-numérico
(1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4bx, 4b, 4c, 4d, 4e, 7). Dentre essas,
cabe destacar os sorotipos 1/2a, 1/2b e 4b, responsáveis por 90% dos casos
de listeriose humana. Estas estirpes são, na sua maioria, quase todas isoladas
de alimentos, sendo que o sorotipo 4b é identificado em 50% destes
(MCLAUCHLIN, 1990; SEELIGER, 1996; VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001).
As bactérias do gênero Listeria são encontradas na forma de bastonetes
curtos, com diâmetro de 0,4 a 0,5 µm e comprimento de 0,51 a 2,0 µm; são
Gram positivas, anaeróbias facultativas e possuem flagelos peritríquios (Figura
1), os quais promovem motilidade ao microrganismo (LOGUERCIO et al.,
2001). Esse comportamento ocorre somente em faixas restritas de temperatura
(20°C a 25°C). Nessa faixa de temperatura, a colônia segue a linha da picada
e, em seguida, distribui-se sobre o meio semi-sólido, lembrando o formato de
um “guarda-chuva” (Figura 2) (FARBER; PETERKIN, 1991; HOLT et aI., 1994;
ROCOURT, 1999).
24
Figura 1: Flagelos peritríquios do gênero Listeria. Fonte: University of Wisconsin-Madison Department Bacteriology. Kenneth
Todar (2003).
Figura 2: Prova de motilidade – formato de “guarda-chuva”. Fonte: Instituto Pasteur (2004).
A bactéria é desprovida de cápsula e não forma esporos. É importante
ressaltar que, para uma bactéria que não forma esporos, ela resiste bem aos
efeitos deletérios do congelamento, dessecamento e aquecimento. Assim,
demonstra ser um microrganismo que revela particularidades em relação a
capacidade e resistência de multiplicação que a torna ainda mais perigosa à
saúde (UHITIL et al., 2004).
25
Muitos fatores podem ser apontados como determinantes para o
crescimento, multiplicação e sobrevivência de Listeria em alimentos, dentre
eles: temperatura, pH, atividade de água, concentração salina, nitrito de sódio,
conservantes e atmosfera (KASNOWSKI, 2004).
Como a maior parte das bactérias, L. monocytogenes cresce a valores
de pH próximo à neutralidade, entretanto, estudos relatam crescimentos da
bactéria a pH entre 4,3 e 9,6. Tal característica favorece o crescimento em
vegetais, pois estes apresentam pH na faixa de 4,2 e 6,5, como é o caso do
tomate e brócolis, respectivamente (SALAMINA et aI., 1996; TIENUNGOON et
al., 2000).
Ainda apresenta reação da catalase positiva e oxidase negativa;
expressa ββββ -hemolisina, produzindo uma zona de clareamento em ágar
sangue, que não se estende muito para fora da região da colônia (FARBER;
PETERKIN, 1991; HOLT et aI., 1994). Produz ácido por fermentação da
glicose, frutose, manose, galactose, celobiose, maltose, melezitose, trealose e
ramnose, sem formação de gás; hidrolisa esculina, salicina, amigdalina e
hipurato de sódio; apresenta teste vermelho de metila positivo; produz amônia
a partir da arginina; reage negativamente para produção de sulfeto de
hidrogênio, indol e nitrato redutase; liquefaz gelatina; hidrolisa amido e ureia;
reduz telurito, e é parcialmente inibida por 0,02% de azida e cianida (JAY,
1996).
A diferenciação laboratorial entre espécies de Listeria pode ser realizada
através da observação de hemólise em ágar-sangue, do teste de CAMP
(Christie, Atkins e Munch-Petersen), e da produção de ácidos a partir de
açúcares (QUINN et al., 2007).
Quando observado ao microscópio, em cultura fresca, o patógeno
apresenta uma forma isolada. As células jovens, por vezes, apresentam uma
morfologia que pode facilmente confundir-se com diplococos ou cocos. Este
organismo pode apresentar, ainda, uma formação em paliçada, ou em arranjos
na forma de “V” ou de “Y”. As culturas frescas são sempre Gram positivas, ao
contrário das menos jovens, que ao fim de dois a cinco dias apresentam uma
coloração Gram negativa (RYSER et al., 2001).
A L. monocytogenes tem a capacidade de crescer a temperaturas entre
1 e 45ºC, o que favorece o seu desenvolvimento nos alimentos, embora a sua
26
temperatura ótima de crescimento esteja entre 30 e 37 ºC. Em função disso, a
bactéria tem a capacidade de multiplicar-se consideravelmente em alimentos
armazenados sob refrigeração por um longo período de tempo, antes do
consumo. Porém, o seu crescimento, a essas temperaturas, é fortemente
afetado pelo pH do meio (BEUCHAT, 1998).
Ainda, de acordo com Germano e Germano (2008), L. monocytogenes
tem como característica peculiar à capacidade de multiplicação em temperatura
de refrigeração e a tolerância a repetidos ciclos de congelamentos e
descongelamentos. Essa característica psicrotrófica depende da integridade
celular e de um sistema de transporte energético resistente ao frio, que
estimula o metabolismo sob baixas temperaturas, propiciando altas
concentrações de substratos intracelulares e uma fase de adaptação
prolongada em temperaturas de refrigeração.
A tolerância ao frio contribui para a disseminação do microrganismo nos
produtos alimentares refrigerados. Dessa forma, o uso de baixas temperaturas
durante o processamento dos alimentos e durante o seu armazenamento, a
longo prazo, é ineficaz para o combate à proliferação desta bactéria, embora
seja um bom método para controlar outros patógenos alimentares (OLIVEIRA,
1993).
Com relação à concentração de sal, a L. monocytogenes pode
multiplicar-se em até 10% de NaCl, e o limite máximo de atividade de água
(Aa) pode ser considerado baixo, em se tratando de microrganismos
patogênicos (0,93) (ROCOURT et al., 2007).
A presença da bactéria tem sido relatada em muitos alimentos crus,
como verduras e legumes não cozidos; também pode ser encontrada em
alimentos processados que se contaminaram durante ou após o
processamento, tais como queijos macios, frios de delicatessen, produtos de
peixes defumados e alimentos prontos para o consumo. Acredita-se que de 1%
a 10% da população seja portadora intestinal desse patógeno (SAUDERS et
al., 2007).
27
2.3 LISTERIOSE
A doença provocada pela L. monocytogenes, listeriose, é considerada
uma doença de grande preocupação para a saúde pública devido à gravidade
da enfermidade, e às altas taxas de mortalidade (30%) (ROCOURT et al.,
2003).
A listeriose ganhou importância como enfermidade de origem alimentar
para humanos no início dos anos 1980, quando foram iniciadas pesquisas em
decorrência de surtos de listeriose humana ocorridos naquela década, ligados
ao consumo de diversos alimentos contaminados (FARBER; PETERKIN, 1991;
COBB et al, 1996; SAUDERS et al., 2007).
Existem duas formas de listeriose associada a L. monocytogenes: a
forma invasiva e a não invasiva. A forma invasiva ocorre principalmente em
pessoas do grupo de risco para a doença (LUNDÉN et al., 2004).
Segundo Hof (2003) são consideradas pessoas do grupo de risco, os
idosos acima de 70 anos, crianças, recém-nascidos, alcoólatras, diabéticos,
anêmicos, gestantes, pacientes com câncer, AIDS, lúpus ou leucemia, bem
como indivíduos submetidos a transplantes.
A forma invasiva da doença corresponde à disseminação da infecção no
sistema nervoso central e pode resultar em meningite. Em gestantes, a
infecção é mais frequente no terceiro trimestre, geralmente assintomática ou
com sintomas parecidos com os da gripe; porém, para o feto ou recém-nascido
as consequências são mais graves, incluindo parto prematuro, aborto, morte
fetal, meningite, septicemia e hidrocefalia. O tempo médio de incubação para
esta forma da doença é de 30 a 90 dias (ROCOURT et al., 1997; CRESPO et
al., 1999; DIMAIO, 2000; LACIAR et al., 2000; VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001;
COLODNER et al., 2003).
A L. monocytogenes em adultos pode provocar tropismo pelo sistema
nervoso central, causando meningite e meningoencefalite. Em pacientes
imunossuprimidos, a presença da bactéria na corrente sanguínea é mais
frequente e pode ser precedida por infecções focais como osteomielite,
pneumonias, endocardites, hepatite e peritonite além de outras patologias
(KERR, 1988; CRESPO et al., 1999; HOFER, 2001).
28
A listeriose não invasiva pode provocar gastrenterites com febre. O
período de incubação é bastante menor, do que na listeriose invasiva, sendo
necessárias apenas 18 a 20 horas até ao surgimento dos primeiros sintomas
(SALAMINA et al., 1996; DALTON et al., 1997).
A doença, embora seja considerada de origem alimentar, pode também
ser transmitida por outras vias: via ocular, respiratória e urogenital. Os casos de
listeriose cutânea, conjuntivite e pneumónica têm sido verificados em
indivíduos que têm contato direto com animais infectados. A infecção
transplacentária e a transmissão a partir do canal vaginal durante o nascimento
também pode ser a causa de infecções perinatais e neonatais (GAHAN;
COLLINS, 1991).
2.4 OCORRÊNCIA DE Listeria monocytogenes EM ALIMENTOS
A principal forma de transmissão da listeriose é o consumo de alimentos
contaminados (WHO, 1988). Uma diversidade de alimentos de origem vegetal
e animal têm sido relacionados a casos esporádicos de listeriose no mundo.
Além disso, a L. monocytogenes é capaz de crescer e sobreviver tanto em
alimentos crus, quanto em alimentos processados (MCLAUCHLIN et al., 1990).
A maioria dos casos diagnosticados concentra-se na Europa e nos
Estados Unidos. Recentemente, o número de casos informados vem
aumentando, provavelmente devido a um melhor diagnóstico laboratorial,
juntamente com um aumento da população susceptível, alta prevalência da
bactéria no ambiente e hábitos de manuseio, preparo e armazenamento
inadequados dos alimentos (CRESPO et al., 2003 citados por KASNOWSKI,
2004).
Em 1981 ocorreu o primeiro surto de listeriose de origem alimentar
comprovado e documentado em Nova Escócia, Canadá, com 41 doentes
(sendo 34 perinatais e sete adultos) e 11 mortes. O alimento implicado como
veículo de transmissão foi uma salada preparada com repolho; este estava
contaminado porque foi cultivado a partir do uso de adubo in natura (fezes)
proveniente de ovinos que estavam infectados por L. monocytogenes
(LOGUERCIO et al., 2001).
29
Em 1983, 49 pacientes no Estado de Massachusets, nos Estados
Unidos, adquiriram listeriose. Sete casos ocorreram em fetos ou crianças e 42
em adultos imunossuprimidos, com taxa de letalidade de 29% (14 pessoas)
(FLEMING et al., 1985).
Dois anos depois, na Califórnia, em 1985, ocorreu um surto de listeriose
atingindo 67% da população de risco. 305 casos foram notificados, com 105
mortes. O alimento causador do surto foi um queijo macio do tipo mexicano. L.
monocytogenes 4b foi isolada dos pacientes, do alimento ingerido e da planta
de processamento do queijo (LINNAN et al., 1998). Nesse mesmo ano, nos
Estados Unidos, foram confirmados 94 casos de listeriose, dos quais 37
acometidos eram neonatos e suas mães. Os alimentos implicados no surto
foram: queijo tipo Mexicano, sorvete e iogurte; e a taxa de letalidade foi de 31%
(MASCOLA et al., 1989).
Um caso esporádico de listeriose materno-fetal foi relatado em 1986 em
Ankara, na Turquia, onde a gestante consumiu carne de frango cozida, sem
prévio reaquecimento, em uma salada armazenada por três dias em
refrigerador. A infecção da mãe resultou no aborto de um feto de 23 semanas
de vida e L. monocytogenes 4b foi isolada da carne de frango, do feto e do
sangue materno (KERR et al., 1988).
Na parte ocidental da Suíça foi registrado um surto de listeriose humana,
no período de 1983 a 1987. O veículo da bactéria foi o queijo do tipo Vacheun
Mont d’Or. Esse surto resultou em 122 casos com 34 óbitos (BILLE et al, 2003).
Entre os anos de 1987 a 1989, no Reino Unido, houve um aumento
considerável na incidência de listeriose, subindo de aproximadamente 100
casos por ano para cerca de 300 em 1989 (MCLAUCHLIN, 1991). Nesse
período, relatou-se uma contaminação associada à ingestão de um patê
preparado a partir de emulsão de carnes, óleo, algumas especiarias e outros
ingredientes, com identificação do sorotipo 4b em amostras do produto
(MCLAUCHLIN, 1993).
Um surto de listeriose ocorreu em 1992 na França, com 279 casos, 63
mortes e 22 abortos, tendo sido identificada L. monocytogenes no alimento
ingerido, língua de porco mal cozida, que desencadeou uma contaminação
cruzada em produtos de delicatessen. Também nesse mesmo ano foi relatado
30
outro surto, tendo como veículo mexilhões comercializados na cidade de Nova
Zelândia. Os sorotipos isolados foram 1/2a e 4b (DEVER et al., 1993).
Entre junho de 1998 a abril de 1999, uma manteiga contaminada foi o
veículo de um novo surto de L. monocytogenes em um hospital universitário na
Finlândia. Os isolados de L. monocytogenes provenientes dos pacientes, das
amostras de manteiga, dos equipamentos e do ambiente de processamento
apresentaram o mesmo perfil. A maioria dos casos estava relacionada a
indivíduos imunossuprimidos, hospitalizados na Helsniki University Central
Hospital. A manteiga contaminada também foi vendida a outros hospitais
centrais e para o comércio varejista da região (LYYTIKÄINEN et al., 2000).
Entre 2000 e 2001 foi descrito, na Carolina do Norte, EUA, listeriose
veiculada por queijo do tipo Mexicano Foram diagnosticados 12 casos: um
homem imunossuprimido de 70 anos de idade e 11 mulheres (idade média de
18-28 anos), sendo que destas dez estavam grávidas. A infecção resultou em
cinco abortos, três nascimentos prematuros e dois recém-nascidos infectados.
A última mulher apresentou um quadro de meningite. Cepas de L.
monocytogenes 4b foram isoladas dos pacientes, do leite cru e do queijo
(BOGGS, et al., 2001; MACDONALD et al., 2005).
O consumo de queijo maturado, produzido a partir de leite submetido a
tratamento térmico insuficiente, foi o responsável por um surto de listeriose no
Canadá em 2002 que acometeu 17 pessoas (GAULIN et al., 2003).
Em 2005, no nordeste da Suíça, um surto de listeriose acometeu 10
pessoas. Eram oito pacientes imunossuprimidos, ocasionando oito óbitos e
duas mulheres grávidas que tiveram aborto séptico. Todos os casos foram
causados por L. monocytogenes 1/2a. O veículo da contaminação foi um queijo
macio do tipo “tomme” (BILLE et al., 2003).
Em 2007, foi relatado um surto de listeriose em Massachusetts, Estados
Unidos, envolvendo cinco pessoas, e resultando na morte de três idosos. O
alimento associado foi leite pasteurizado adquirido de um laticínio local (CDC,
2008).
Recentemente, nos EUA, listeriose humana atribuída ao consumo de
melão foi reportada pelo Center for Disease Control and Prevention (CDC,
2011). Também, peixe defumado, produtos marinados cozidos, produtos
31
cárneos, e vegetais foram relatados como contaminados com L.
monocytogenes (MELONI et al., 2009).
2.5 REGULAMENTAÇÃO SOBRE L. monocytogenes EM ALIMENTOS
A dose mínima infectante (DI) de L. monocytogenes é ainda
desconhecida, devido à impossibilidade de se realizar pesquisas com
voluntários saudáveis, à variação da suscetibilidade e condição imunológica do
hospedeiro e à variabilidade na virulência do patógeno. Outra dificuldade em se
estabelecer a DI é que os dados coletados de surtos de listeriose podem não
representar a real contaminação do alimento incriminado. Devido ao tempo
entre a exposição e o início dos sintomas, pode haver multiplicação, morte ou
injúria da bactéria no alimento, ou mesmo não haver mais o alimento disponível
(BARANCELLI et al., 2011). Porém, informações sobre a população de L.
monocytogenes em alimentos contaminados envolvidos em surtos indicam que
populações entre 103 e 104 UFC/g em alimento foram responsáveis pelo
desencadeamento da doença (DUFFY et al., 1999).
Estudo realizado na Finlândia indica que a exposição da população de
risco a doses baixas (0,3 Número Mais Provável (NMP/g) de L.
monocytogenes, por períodos prolongados, pode também levar ao
desenvolvimento da doença (MAIJALA et al., 2001).
Outros dados (FAO/WHO, 2004) sugerem que contagens menores do
que 102 UFC/g em alimentos não são infectantes, mas não excluem essa
possibilidade. Assume-se que menos do que 1.000 células possam causar a
doença em populações susceptíveis (UNITED, 2003).
A maioria dos países possui regulamentação específica para o controle
de L. monocytogenes nos alimentos. Os Estados Unidos possuem a legislação
mais rígida, considerando a política de “Tolerância Zero”, de modo que a
presença do microrganismo em 25g de qualquer alimento pronto para o
consumo é considerada como inaceitável, caracterizando-o como impróprio
para o consumo (JAY, 2000; CHEN et al., 2003).
Já na comunidade europeia, alimentos prontos para o consumo devem
apresentar contagem de L. monocytogenes inferior a 100 UFC/g. Este critério é
32
aplicado para todo o período de vida útil do alimento. Ainda, na comunidade
europeia, existe também o critério de ausência de L. monocytogenes em 25 g
do alimento na saída do processamento e também ausência em 25 g ou 25 ml
no produto para alimentos destinados a lactentes e para fins medicinais
(REGULAMENTO CE N° 1441, 2007).
Na Dinamarca tolera-se que duas a cinco amostras de alimentos prontos
para o consumo possam conter entre 10 e 100 UFC/g de L. monocytogenes,
mas nenhuma amostra poderá exceder a 100 UFC/g (EUROPEAN
COMMISSION SCIENTIFIC COMMITTEE, 1999).
No Canadá, alimentos prontos para o consumo que não tenham sido
associados a surtos de listeriose e que não permitam o crescimento de L.
monocytogenes durante 10 dias sob refrigeração, podem conter até 100 UFC/g
do microrganismo sem se constituir uma infração legal (FARBER; HARWIG,
2003).
Na Grã Bretanha, padrões foram determinados para alguns alimentos
prontos para o consumo estabelecendo grupos baseados no número de L.
monocytogenes presentes. Quando o microrganismo não é detectado em 25 g,
o alimento é considerado satisfatório; entre 102 e 103 UFC/25g é considerado
insatisfatório, e acima de 103 UFC/25g o alimento é considerado inaceitável
(JAY, 2000).
No Brasil, os padrões microbiológicos para alimentos, estabelecidos pela
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), através da Resolução da
Diretoria Colegiada (RDC) número 12, de 2 de janeiro de 2001, exigem a
ausência de L. monocytogenes em 25 g, em cinco amostras do produto de um
mesmo lote, somente para os queijos de média, alta a muito alta umidade. Para
os demais produtos prontos para o consumo não são contemplados limites
específicos para essa bactéria (BRASIL, 2001).
2.6 MÉTODOS DE DETECÇÃO DE Listeria monocytogenes
De modo geral, as espécies do gênero Listeria multiplicam-se em quase
todos os meios bacteriológicos não seletivos, tais como Triptona de soja e
33
Caldo de infusão de cérebro e coração. A dificuldade de isolamento ocorre
muitas vezes quando a bactéria está presente em pequeno número na amostra
e está contaminada por outra microbiota competitiva. Existe uma ampla
variedade de meios seletivos para o isolamento de Listeria a partir de amostras
não estéreis como alimentos, amostras do meio ambiente, amostras clínicas e
de fezes. Além disso, têm sido desenvolvidos vários protocolos para detectar L.
monocytogenes nos vários tipos de amostras (WAGNER; MCLAUCHLIN,
2008).
2.6.1 Métodos Convencionais
Os métodos convencionais recebem essa denominação porque foram
desenvolvidos há muitos anos e desde então vêm sendo empregados como
métodos oficiais na maioria dos laboratórios brasileiros e também em outros
países. Esses métodos estão descritos em publicações consideradas de
referência, internacionalmente aceitas (GREGHI, 2005).
Segundo Franco e Landgraf (2005), entre essas publicações destacam-
se o Bacteriological Analitical Manual (1992) publicado em conjunto pela United
States Food and Drug Administration (FDA) e Association of Official Analytical
Chemists International (1992), o Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods, inicialmente editado pela American
Public Health Association (APHA) e na edição mais recente por Vanderzant e
Splittstoesser (1992), e o Microrganisms in foods- their significance and
methods of enumeration (1978), publicado pela International Commission on
Microbiological Specifications for Foods (ICMSF).
Os métodos convencionais para isolamento de Listeria spp. a partir de
alimentos são complexos e demorados, sendo geralmente necessários cinco a
sete dias para obtenção do resultado, envolvendo procedimentos de pré-
enriquecimento e/ou enriquecimento, semeadura em meios seletivos
diferenciais e caracterização bioquímica e sorológica (GERMANO; GERMANO,
2008).
Nos últimos anos, inúmeros métodos de detecção de Listeria spp. em
alimentos foram desenvolvidos, sendo mais amplamente difundidos e utilizados
34
o método da United States Food and Drug Administration (FDA), descrito no
capítulo 10 do Bacteriological Analitycal Manual (BAM) com aplicação para
todos os alimentos e o método do United States Department of Agriculture
(USDA) descrito no capítulo 8.04 do Microbiology Laboratory Guidebook, com
aplicação para carnes vermelhas, aves, ovos e amostras ambientais
(HITCHINS, 2003; USDA/FSIS, 2005; SILVA et al., 2007).
Para os métodos da FDA utiliza-se o caldo de enriquecimento para
Listeria (LEB) a 30°C por 48h, semeadura de superfície no Ágar Oxford (OXA)
a 35°C e 48h e Ágar Tripticase de Soja e Extrato de Levedura (TSA-YE) a 30°C
por 24-48h. Já o método da USDA utiliza enriquecimento primário em Caldo
Universidade de Vermont (UVM) a 30°C por 24h, seguido de enriquecimento
secundário em Caldo Fraser a 35°C por 24-48h e semeadura de superfície no
Ágar Oxford Modificado (MOX) a 35°C por 24-48h (SILVA et al., 2007).
Além dos métodos da FDA e USDA, sobressai também o método do
Health Protection Branch (HPB) do Canadá, utilizado para todos os tipos de
alimentos e amostras ambientais. Ele é baseado no enriquecimento primário
em caldo LEB a 35°C por 24h no enriquecimento secundário em Caldo Fraser
a 35°C por 24 e 48h e na semeadura de superfície no Ágar Oxford (OXA) a
35°C por 24 e 48h, Ágar Cloreto de Feniletanol Moxalactam (LPM) a 35°C por
24-48h, Ágar Oxford Modificado (MOX) a 35°C por 24-48h e Ágar Palcam
(PAL) a 35°C por 24-48h. Tais métodos avaliam apenas a presença ou
ausência de Listeria spp. em amostras (WARBURTON et aI., 1991).
Segundo Ryser e Donnelly (2001), o método de plaqueamento direto,
sugerido pela American Public Health Association (APHA), no capítulo 36 do
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods tem a
seguinte aplicação: enumeração em alimentos “in natura” (leite cru, carnes
cruas, pescado cru e vegetais não processados) e em ambiente industrial, nos
quais as células não sofreram injúria subletal. Nesse caso, a técnica do
Número mais Provável (NMP) aumenta a complexidade da análise em pelo
menos nove vezes, para um NMP utilizando-se três tubos. Essa é a única
forma de obter dados quantitativos quando os números de L. monocytogenes
são inferiores a 50 UFC/g. Esse método também utiliza caldos de
enriquecimento primários e secundários, seguidos de semeadura em meios
sólidos seletivos recomendados pela FDA e USDA (BUCHANAN, 1990).
35
Segundo Bruhn et al. (2005), os meios de enriquecimento empregados
para a pesquisa de L. monocytogenes podem facilitar a multiplicação de L.
innocua em detrimento a L. monocytogenes. Assim, muitas vezes a obtenção
de resultados negativos não refletem a realidade, pois o microrganismo pode
apresentar-se injuriado, não conseguindo se recuperar no caldo de
enriquecimento, ou pode estar em números inferiores à microbiota
acompanhante, e com isto não ser detectado.
Os métodos convencionais para caracterização de um determinado
microrganismo são baseados na observação da capacidade deste
microrganismo de realizar determinadas reações bioquímicas. Em geral, estas
reações são realizadas em tubos de ensaio e podem representar um volume de
trabalho muito grande, e a um custo bastante elevado (FRANCO; LANDGRAF,
2005).
Tendo em vista as dificuldades e morosidade encontradas para o
isolamento de L. monocytogenes por semeadura em meio sólido em placa,
diversos autores têm trabalhado no desenvolvimento de técnicas mais rápidas
e precisas, que envolvem sempre uma ou mais etapas de enriquecimento e
meios de cultura seletivos (DENDER, 1988).
2.6.2 Métodos Rápidos
As indústrias de alimentos precisam detectar Listeria com rapidez
necessária para poder implementar e avaliar programas preventivos de
qualidade microbiológica e atender à legislação vigente. A presença de
qualquer espécie de Listeria nos alimentos e superfícies envolvidas com o
processamento de alimentos é uma possível indicação de que cepas
patogênicas do microrganismo possam estar envolvidas (BARBALHO, 2002).
Ainda que alguns estudos demonstrem a eficiência dos métodos
convencionais de análises microbiológicas para a detecção de patógenos e de
procedimentos que melhoram a adequação da técnica, a busca por métodos
rápidos, sensíveis e seguros para a detecção de patógenos em alimentos é
36
uma área de pesquisa essencial para enfrentar a agilidade que o mercado atual
exige (MATA, 2009).
Técnicas modernas de análises economizam tempo, além de serem
reprodutíveis e confiáveis. Dentro de uma economia globalizada, essas
técnicas constituem uma ferramenta importante que agiliza a obtenção de
resultados e possibilita que lotes de alimentos sejam fornecidos ao consumo
em um tempo menor, representando assim, diminuição das perdas e gastos no
armazenamento de produtos alimentícios (MALORNY et al., 2003).
Embora confiáveis e considerados oficiais, os métodos convencionais de
detecção de microrganismos em alimentos demandam muito tempo para
obtenção dos resultados. Além disso, devido a fatores ambientais, variações na
expressão gênica dos microrganismos podem ocorrer e afetar o poder
discriminatório dos testes bioquímicos. Outro problema na metodologia
convencional são as células viáveis não-cultiváveis, que não são detectadas na
metodologia convencional (FARBER et al., 2001; MALORNY et al., 2003;
MARIN et al., 2006).
Os métodos rápidos surgiram a partir da década de 70, como
consequência da necessidade de se abreviar o tempo necessário para
obtenção dos resultados analíticos e melhorar a produtividade laboratorial.
Além desses objetivos, esses métodos visam também à simplificação do
trabalho e a redução dos custos. Para alguns métodos, a essas vantagens
aliam-se outras como maior sensibilidade e especificidade que os métodos
convencionais (FRANCO; LANDGRAF, 2005).
Diversas técnicas baseadas em substratos enzimáticos fluorogênicos
e/ou cromogênicos, têm sido desenvolvidas e envolvem a capacidade de
detectar a presença de enzimas específicas com o emprego de substratos
apropriados. A incorporação de tais substratos permite a detecção,
enumeração e identificação de forma direta em placa de isolamento ou em
caldo, evitando o uso de subculturas e testes bioquímicos para estabelecer a
identificação de certos microrganismos (MANAFI, 2000).
2.6.2.1 Ágar Listeria Ottaviani Agosti – ALOA
37
O ágar Listeria Ottaviani Agosti (ALOA™) é um meio rápido de
isolamento, cromogênico, usado para identificação laboratorial de L.
monocytogenes baseado na detecção de fosfatidilinositol específico da
atividade da enzima fosfolipase C da L. monocytogenes (HITCHINS, 2003).
O meio utiliza o princípio básico da adição dos agentes seletivos
inclusive cloreto de lítio, ceftazidina e polimixina para reduzir o
desenvolvimento de microrganismos competidores. A esculina é substituída por
um substrato cromogênico e um substrato enzimático (lipase) que resulta em
um aparecimento de colônia azulada típica. A combinação cromogênica X-
glucosidase é somada com o substrato para a detecção da β- glucosidase, que
é comum para toda as espécies de Listeria, resultando nas colônias de
coloração azul (VLAEMYNCK et al., 2000) (Figura 4).
O ALOA é um meio seletivo e diferencial para o isolamento de Listeria
spp. e identificação presuntiva de L. monocytogenes em amostras de
alimentos. Como já mencionado, o meio contém cloreto de lítio e uma mistura
equilibrada de antimicrobianos e antifúngicos para minimizar o crescimento de
outros microrganismos contaminantes (VLAEMYNCK et al., 2000).
O uso do Ágar ALOA Listeria é recomendado pela Association Française
de Normalisation (AFNOR), AES 10/3-09/00 e foi validado pela International
Organization for Standardization (ISO) 16140:2003.
Segundo Aurora (2008) as fosfolipases de L. monocytogenes são
determinantes essenciais de patogenicidade e a atividade de PI-PLC é
expressa somente para L. monocytogenes e L. ivanovii patogênicas, e tem sido
utilizada como marcador para diferenciação entre espécies de Listeria
patogênicas e não patogênicas. Desta forma, o ágar ALOA tem demonstrado
excelentes resultados na diferenciação de L. monocytogenes de outras
espécies de Listeria não patogênicas.
38
Figura 4: Colônias típicas de Listeria monocytogenes em ágar ALOA. Fonte: Vlaemynck et al., (2000).
2.7 SUSCEPTIBILIDADE DE Listeria monocytogenes A ANTIMICROBIANOS
Uma vasta gama de fármacos é ativa contra L. monocytogenes, mas no
paciente, geralmente, encontra-se uma eficiência inferior. Este fato pode ser
devido a fatores como: a incidência da doença em pacientes
imunocomprometidos ou em faixas etárias específicas, em que a
susceptibilidade a antibióticos é diferente do comum; a localização da bactéria
no interior das células do hospedeiro (nomeadamente nos macrófagos)
dificultando a atuação do antibiótico; diagnóstico tardio que implica o início do
tratamento adequado também tardio; ou muitos dos antibióticos utilizados são
apenas bacteriostáticos. O conjunto destes fatores pode contribuir para a
elevada taxa de mortalidade descrita em infecções por L. monocytogenes
(HOF, 1991; JONES et al., 1995).
Com a exceção da resistência natural in vitro às antigas quinolonas,
fosfomicinas e a um largo espectro de cefalosporinas, Listeria spp. são
largamente susceptíveis às classes de antibióticos clinicamente relevantes
contra as bactérias Gram-positivas. A primeira estirpe resistente de L.
monocytogenes foi descrita em 1988. Desde então tem ocorrido um aumento
do número de descrições de estirpes resistentes isoladas de alimentos, animais
e humanos (POYART et al., 1990; CHARPENTIER, 1999).
Os estudos na última década têm demonstrado evidências do surgimento
de Listeria spp., incluindo L. monocytogenes, resistentes a vários antibióticos
tais como ácido nalidíxico, ampicilina, cefalosporina, cefotaxime, cefalotina,
39
clindamicina, cloranfenicol, eritromicina, estreptomicina, flumequina,
gentamicina, kanamicina, lincomicina, meticilina, oxacilina, penicilina G,
rifampina, rifampicina, sulfonamida, sulfametazol-trimetoprim, tetraciclina,
teicoplanina, vancomicina (CHARPENTIER et al., 1999; LIN et al., 2006;
CONTER et al., 2009; REIS et al., 2011; ALTUNTAS et al., 2012; GELBÍČOVA
et al., 2012). Embora seja rara, a resistência à tetraciclina é o fenótipo de
resistência mais frequentemente descrito em Listeria spp. de diferentes origens
(BERTRAND et al., 2005).
A terapia de escolha para o tratamento da listeriose consiste na
administração de ampicilina ou penicilina G combinados com um
aminoglicósidio, classicamente a gentamicina. A associação de trimetoprim
com uma sulfonamida, como o sulfametoxazol com co-trimoxazol, é
considerada como a segunda escolha de terapia, geralmente administrada nos
casos de doentes alérgicos aos antibióticos da classe β-lactâmicos
(CHARPENTIER, 1999; CONTER et al., 2009). A existência de resistência e
multirresistência a antibióticos comumente utilizados no tratamento de listeriose
é uma grande preocupação para a área médica e consequentemente para a
saúde pública.
2.7.1 Antibióticos
● Cefoxitina
A cefoxitina faz parte do grupo das cefamicinas, relacionada com a
penicilina. É um antibiótico β-lactâmico e pode ser utilizada no tratamento da
listeriose humana. Porém, apresenta melhores resultados quando utilizadas
contra bactérias Gram-negativas (JONES et al., 1995). ● Ciprofloxacina
A ciprofloxacina, uma quinolona, tem uma boa absorção a nível celular e
dos tecidos. No entanto, nem sempre demonstra bons resultados em testes de
susceptibilidade em L. monocytogenes, pois apresenta melhores resultados em
bactérias Gram-negativas (HOF, 1991; JONES et al.,1995).
40
● Eritromicina
A eritromicina tem uma boa atividade in vitro e há também casos de
sucesso como monoterapia em pacientes, principalmente no tratamento de
grávidas infectadas (JONES et al., 1995).
● Estreptomicina
A estreptomicina apresenta bons resultados no tratamento da listeriose,
porém quando administrada sozinha os resultados não são muito eficientes
(HOF, 1991; JONES et al.,1995).
● Oxacilina
Pertencente à classe da penicilina, é um composto ativo contra Listeria
monocytogenes, porém estudos recentes mostram crescente resistência do
microrganismo ao fármaco (SOUZA, 2005).
● Penicilina
A penicilina é um antibiótico eficaz na inibição de L. monocytogenes,
como já citado por diversos autores. As penicilinas estáveis na presença de
cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcillin e oxacilina possuem um espectro
predominantemente contra bactérias Gram-positivas (HOF, 1991; JONES et
al.,1995).
O espectro de atividade da penicilina também inclui bactérias Gram-
negativas, que não produzem ß-lactamase, algumas das quais são fastidiosas.
As aminopenicilinas (ampicilina e amoxicilina) são ativas contra outras espécies
de Gram-negativos, incluindo alguns membros das Enterobacteriaceae. As
carboxipenicilinas (carbenicilina e ticarcilina) e ureidopenicilinas (mezlocilina e
piperacilina) possuem um espectro contra Gram-negativos consideravelmente
ampliado, incluindo atividade contra muitas Pseudomonas e Burkholderia spp.
(CLSI, 2012).
● Tetraciclina
41
A tetraciclina tem boa atividade contra a L. monocytogenes. Geralmente
é usada no tratamento onde existe alergia do paciente a outros antibióticos. Ela
inibe a síntese proteica em nível ribossômico das bactérias Gram-negativas e
Gram-positivas. Os organismos suscetíveis à tetraciclina são considerados
sensíveis também a doxiciclina e minociclina (CLSI, 2012).
● Vancomicina
A vancomicina é o agente indicado para o tratamento de infecções
bacterianas Gram-positivas nos pacientes alérgicos à penicilina, sendo útil na
terapia de infecções causadas por cepas bacterianas Gram-positivas
resistentes aos agentes ß-lactâmicos. Além disso, também é utilizada em
pacientes grávidas (JONES, 1995; CLSI, 2012).
Segundo Jay (2005), mesmo com o uso destes fármacos, a terapia com
antimicrobianos para listeriose não é inteiramente satisfatória, uma vez que
pacientes imunodeprimidos e hospedeiros comprometidos (gestantes, idosos e
crianças) são mais difíceis de tratar do que hospedeiros sadios.
42
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53
CAPÍTULO 2: OCORRÊNCIA DE Listeria monocytogenes EM VEGETAIS COMERCIALIZADOS EM SALVADOR, BA, E RESISTÊNCIA DOS ISOLADOS A ANTIMICROBIANOS
OCCURRENCE OF Listeria monocytogenes IN VEGETABLES COMMERCIALIZED IN SALVADOR, BRAZIL, AND THE ANTIMICROBIAL RESISTANCE OF ISOLATES
Vanessa de Vasconcelos Byrnea, Rogeria Comastri de Castro Almeidab
aMestranda do Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos (PGALI), Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia (UFBA).
bProfessora do Departamento de Ciência dos Alimentos, Escola de Nutrição, UFBA.
54
RESUMO
Embora o consumo de vegetais frescos e minimamente processados seja considerado saudável, surtos relacionados ao consumo desses produtos são frequentemente relatados. Entre os microrganismos de toxinfecção alimentar afetando os vegetais, se encontra a Listeria monocytogenes, um microrganismo ubíquo que exibe a habilidade de sobreviver e multiplicar-se a temperaturas de refrigeração. A doença causada por esse microrganismo conhecida como listeriose, afeta principalmente pessoas de grupo de risco, como gestantes, idosos, crianças e pacientes imunodeprimidos. Várias combinações de antibióticos podem ser usadas no tratamento da listeriose, mas o aumento de resistência da bactéria a essas drogas tem trazido algumas mudanças. Esse estudo teve como objetivo verificar a ocorrência de L.
monocytogenes em vegetais frescos, vegetais congelados e vegetais prontos para o consumo (saladas prontas) e avaliar a resistência dos isolados da bactéria aos antimicrobianos. A ocorrência de L. monocytogenes foi investigada em 99 amostras, incluindo 33 vegetais frescos, 33 vegetais congelados e 33 vegetais prontos para o consumo (saladas prontas). Os resultados alcançados demonstraram que 4.04% das amostras apresentaram contaminação pela bactéria, sendo 3,03% dos vegetais frescos e 9,09% dos vegetais prontos para o consumo (saladas prontas). As cepas isoladas pertenciam ao sorotipo 4b. Os testes de resistência/susceptibilidade mostraram que 80% dos isolados foram susceptíveis aos antibióticos usados. L. monocytogenes isolada de duas amostras de vegetais prontos para o consumo (saladas) apresentaram resistência aos antibióticos penicilina e tetraciclina. A presença do patógeno nos vegetais, principalmente prontos para o consumo é um dado preocupante, demonstrando a necessidade de readequação das boas práticas agrícolas e de manipulação, assim como a utilização de métodos eficazes de limpeza e sanitização no processamento mínimo dos vegetais, na perspectiva do oferecimento de alimentos seguros para o consumidor.
Palavras-chave: Vegetais. Listeriose. Antibióticos.
55
ABSTRACT
Although the consumption of fresh and minimally processed vegetables is considered healthy, outbreaks related to the contamination of these products are frequently reported. Among the food-borne pathogens, affecting vegetables is Listeria monocytogenes, a ubiquitous organism that exhibits the unique ability to survive and multiply at refrigerated temperatures. The disease caused by this organism, known as listeriosis, mainly affects those in high-risk groups, such as pregnant women, the elderly, children and immunocompromised patients. Several combinations of antibiotics may be used in the treatment of listeriosis, but the increasing resistance of the microorganism to these drugs has presented a challenge. This study aimed to evaluate the occurrence of L.
monocytogenes in raw, frozen and ready-to-eat vegetables as well as the antimicrobial resistance of isolates. The occurrence of L. monocytogenes was investigated in 99 samples, including 33 raw vegetables, 33 frozen vegetables and 33 ready-to-eat vegetables. The results showed that 4.04% of the samples were contaminated with bacteria. Of these, 3.03% were raw vegetables, and 9.09% were ready-to-eat vegetables. The strains isolated belonged to serotype 4b. Antimicrobial resistance profiling showed that 80% of the isolates were susceptible to the antibiotics used. The L. monocytogenes isolated from two samples of ready-to-eat vegetables were resistant to penicillin G and tetracycline. The presence of this pathogen in vegetables, mainly in ready-to-eat, is concern and demonstrated the importance in the adoption of good agricultural practices and handling, and claim for use of effective methods to cleaning and sanitizing in the process of minimally processed vegetables, to offer safe food to the consumer.
Keywords: Vegetables. Listeriosis. Antibiotics.
56
1 INTRODUÇÃO Acompanhando a tendência mundial no âmbito da alimentação,
observa-se a procura por uma alimentação mais saudável atrelada a uma vida
mais prática, o que vem gerando o aumento no consumo de vegetais,
principalmente os prontos para o consumo.
Atualmente, o consumidor procura por produtos saudáveis, saborosos e
que não demandem tempo para o preparo. Dessa forma, os vegetais prontos
para o consumo conseguem atender a esse público, pois são produtos que, na
grande maioria, não necessitam de preparo antes do consumo.
Apesar dos vegetais representarem um importante componente de uma
alimentação saudável, a ocorrência de microrganismos patogênicos nesse tipo
de alimento é um dado preocupante.
Para assegurar a qualidade e estabilidade durante a vida de prateleira,
os vegetais necessitam de temperatura de refrigeração, o que favorece o
desenvolvimento e crescimento de microrganismos psicrotróficos, como a
Listeria monocytogenes.
O crescimento deste microrganismo é particularmente importante
quando se trata de vegetais, pois esses produtos apresentam características
físico-químicas que permitem o crescimento microbiano e, também, porque são
refrigerados por longos períodos de tempo.
Listeria monocytogenes é uma bactéria ubíqua, podendo ser encontrada
na água de irrigação, no solo e no adubo utilizado nas plantações. Além disso,
é uma bactéria saprófita, que participa na decomposição da matéria orgânica
vegetal. Mediante estes fatos, é possível encontrá-la nos vegetais (Beuchat,
1998).
A doença causada pela L. monocytogenes, a listeriose, é uma infecção
alimentar que acarreta um quadro clínico severo; tem um período de incubação
longo e apresenta alta taxa de letalidade em pessoas pertencentes ao grupo de
risco: idosos, gestantes, crianças e pacientes imunodeprimidos (Rocourt et al.,
1997).
O primeiro surto bem documentado de listeriose de origem alimentar
ocorreu em 1981 na América do Norte, em Nova Escócia, Canadá, com 41
57
doentes e 11 mortes. O alimento apontado como veículo de transmissão foi
uma salada contendo repolho; este foi contaminado a partir de fezes de ovelha
que estavam infectadas por L. monocytogenes e que foram usadas como
adubo (Loguercio et al., 2001).
Recentemente, um novo surto envolvendo a bactéria foi relatado pelo
CDC. Entre os meses de agosto a outubro de 2011 no Colorado, EUA, L.
monocytogenes foi isolada de melão fatiado na residência de um paciente
durante a investigação do surto. O paciente relatou ter ingerido melão antes de
adoecer. O caso foi o ponto inicial para a pesquisa do microrganismo em
melões em estados vizinhos. Um total de 147 pessoas foram infectadas no
surto, os casos foram notificados ao CDC de 28 estados (CDC, 2011).
Uma vasta gama de antibióticos são utlizados no tratamento da
listeriose, porém nem sempre o resultado é positivo em função da faixa etária
ou do estado de saúde em que o paciente se encontra, necessitando de
cuidados especiais. Nessa população, a taxa de mortalidade pode chegar a
30% (Charpentier, 1995).
No Brasil, não temos ainda relato de surtos envolvendo o patógeno e a
legislação brasileira não preconiza a quantidade limite para a presença de L.
monocytogenes em vegetais. Ainda, devido à fragilidade do sistema de
vigilância epidemiológica brasileiro, não existem relatos de surtos associados
ao consumo de vegetais envolvendo a bactéria. Nesse contexto, observa-se a
importância de pesquisas que retratem esse assunto e forneçam informações
para os órgãos de vigilância sanitária e epidemiológica.
Esse estudo teve como objetivo verificar a ocorrência de L.
monocytogenes em vegetais frescos, congelados e prontos para o consumo
comercializados em Salvador, BA, e avaliar a resistência dos isolados da
bactéria a antimicrobianos comumente utilizados no tratamento da listeriose.
58
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 MATERIAIS 2.1.1 Microrganismos de referência
� Listeria monocytogenes SCOTT A (sorotipo 4b), ATCC 15313
� Staphylococcus aureus ATCC 33591
2.1.2 Grupos de alimentos analisados Vegetais Frescos - alface, brócolis, repolho branco, repolho roxo e rúcula.
Vegetais Congelados - seleta de legumes (ervilha, cenoura, vagem e milho),
ervilha e brócolis.
Vegetais Prontos para o Consumo (Saladas Prontas) - alface, tomate, cenoura,
repolho branco, repolho roxo e beterraba.
2.1.3 Antimicrobianos
Os discos de antibióticos utilizados nesse estudo estão descritos na
Tabela 1.
2.1.4 Origem dos isolados bacterianos
Um total de quatro isolados de L. monocytogenes oriundos de vegetais
frescos (1 amostra) e vegetais prontos para o consumo (3 amostras) foram
caracterizados através de teste de resistência/susceptibilidade antimicrobiana.
59
Tabela 1. Antibióticos utilizados no estudo.
2.2 MÉTODOS
2.2.1 Desenho e local de estudo
Trata-se de um estudo de corte transversal de caráter exploratório e
experimental que foi desenvolvido no Laboratório de Microbiologia de
Alimentos do SENAI – Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial – unidade
Dendezeiros, Salvador, BA e no Laboratório de Zoonoses do Departamento de
Bacteriologia do Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, no Rio de
Janeiro, RJ.
2.2.2 Amostragem
No período de outubro de 2013 a janeiro de 2014, 99 amostras de
vegetais foram colhidas na rede de supermercados de Salvador, BA. Destas,
33 eram de vegetais frescos, comercializados em temperatura ambiente, 33 de
vegetais congelados e 33 de vegetais prontos para o consumo (saladas
prontas), comercializados sob refrigeração.
60
2.2.3 Ocorrência de Listeria monocytogenes
A investigação da ocorrência de L. monocytogenes foi realizada de
acordo com a metodologia recomendada por Becker et al. (2006).
Para o isolamento, aproximadamente 250 g de cada vegetal foram
colhidos, acondicionados em sacos plásticos estéreis, codificados e
transportados em isopor contendo gelo para o laboratório de análises.
Posteriormente, 25 g de cada amostra de vegetal foram pesadas em cabine de
fluxo laminar (Labconco Corporation, Labconco Purifier Class IIb, Total
Exhaust, modelo 36210-04, certificada ISO 9002; Kansas City, MO, USA) e
homogeneizados com 225 mL de caldo Fraser ½ concentração em
homogeneizador do tipo stomacher (240 bpm; ITR model 1204, series 126; São
Paulo, SP, Brasil) para o pré-enriquecimento. Após incubação por 24 horas a
30ºC, uma alíquota de 0,1 ml foi transferida para a superfície do ágar ALOA e,
com o auxílio de uma alça de Drigalski, espalhada na superfície da placa. Em
seguida, as placas foram incubadas a 35ºC por 48 horas. Três a cinco colônias
típicas de cor verde azulada com formação de halo foram retiradas das placas,
purificadas em ágar tríptico de soja (TSA) e submetidas aos testes para
confirmação.
Uma cepa de Listeria monocytogenes Scott A (sorotipo 4b; ATCC
15313) foi usada como controle positivo e um meio não inoculado como
controle negativo, para cada uma das etapas da análise.
● Coloração de Gram: Foram preparados esfregaços em lâmina para a
verificação das características morfotintoriais das colônias isoladas. Culturas
apresentando bastonetes Gram positivos, em arranjo individual ou em forma de
paliçada, foram consideradas presuntivas para o microrganismo.
● Produção de Catalase: Com o auxílio de uma pipeta, gotas de peróxido de
hidrogênio a 3% foram adicionadas sobre a cultura. Culturas catalase positiva
foram consideradas presuntivas para a presença do microrganismo.
61
Provas bioquímicas:
● Teste de Motilidade: As colônias suspeitas foram ativadas em TSA e
inoculadas no Meio Sulfeto Indol Motilidade (SIM) por picadas no centro, até
uma distância de 1 cm do fundo do tubo. Os tubos foram incubados a 25oC por
sete dias, observando-os diariamente. Culturas demonstrando migração típica,
ou seja, espalhando-se na parte superior do meio e mantendo-se restritas à
picada no fundo do tubo, lembrando o formato de um guarda-chuva, indol e
sulfito negativas, foram consideradas presuntivas para a presença do
microrganismo.
● Teste de Fermentação de Carboidratos (xilose): Utilizou-se como meio o
Caldo Púrpura Base para Carboidratos. A solução do carboidrato xilose foi
esterilizada por filtração em membrana de 0,45 µm e foi adicionada ao meio-
base estéril. A viragem da coloração originalmente púrpura para amarela,
devido à produção de ácido, indica ausência da bactéria, pois a mesma não
fermenta a xilose.
Caracterização sorológica:
Para identificação sorológica das espécies de L. monocytogenes
isoladas dos vegetais, foi utilizada a técnica baseada na aglutinação “O” e “H”,
conforme recomendações de Donker-Voet (1959) e Seeliger e Hohne (1979).
2.2.4 Avaliação da resistência a antimicrobianos
A resistência/susceptibilidade dos isolados de L. monocytogenes a oito
antibióticos foi avaliada pelo método de Kirby-Bauer ou disco difusão (Bauer,
1966). Tal método baseia-se na inibição do crescimento microbiano pelo
antibiótico, que é visualizado pela formação de um halo claro em volta da
colônia. O tamanho do halo formado é medido em milímetros, indicando
resistência/susceptibilidade do agente ao antibiótico (breakpoints). Nesse
estudo, uma cepa padrão de Staphylococcus ATCC 33591 foi usada como
controle positivo para os testes, conforme recomendação do Clinical Laboratory
62
Standards Institute (CLSI) (2012), uma vez que ainda não existem critérios
estabelecidos para Listeria spp. Em vários estudos, o tamanho do halo formado
para Staphylococcus aureus são utilizados para interpretação do teste (Conter
et al., 2009; Davis et al., 2009; Chen et al., 2010).
Inicialmente, os isolados de L. monocytogenes (Tabela 2) foram
ativados em caldo tríptico de soja (TSB) com 0,6% de extrato de levedura a
37°C por 24h. Em seguida, uma alçada foi estriada em placas de ágar tríptico
de soja (TSA) e as placas foram incubadas a 35 ± 2°C por 24h. Com o auxílio
de uma alça de platina bacteriológica flambada, colônias foram retiradas das
placas de TSA e suspensas em 5 ml de solução salina estéril (NaCl 0,85%) até
o alcance do padrão de turbidimetria de 0,5 pela escala de McFarland (c.a. 108
UFC/ml). Em seguida, um suabe estéril foi embebido na suspensão, retirado o
excesso e semeado de forma suave em todas as direções da placa contendo
ágar Mueller Hinton (MH), de forma a abranger toda a superfície. Após a
secagem do inóculo nas placas, os discos de antibióticos foram colocados na
superfície com o auxílio de pinças flambadas. Uma leve pressão foi exercida
com a ponta da pinça para que ocorresse uma boa adesão dos discos nas
placas. As placas foram incubadas a 34 ± 2°C por 24h e, passado esse
período, realizada a leitura dos testes, para detectar a resistência ou
susceptibilidade a determinado antibiótico, de acordo com o tamanho dos halos
formados ao redor do disco, em milímetros.
Conforme mencionado acima, a cepa de Staphylococcus aureus (ATCC
33591) foi usada como controle positivo para cada passo da análise Os
isolados foram testados contra um painel de oito agentes antimicrobianos:
penicilina G (PEN) (10 IU), eritromicina (ERI) (15 µg), tetraciclina (TET) (30 µg),
oxacilina (OXA) (1 µg), cefoxitina (CEF) (30 µg), vancomicina (VCM) (30 µg),
estreptomicina (STR) (10 µg) e ciprofloxacina (CIP) (5 µg).
63
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Ocorrência de Listeria monocytogenes em vegetais
Nesse estudo foi detectada a presença de L. monocytogenes em
vegetais frescos e em vegetais prontos para o consumo (saladas),
demonstrando risco no consumo desses alimentos.
Tabela 2. Isolados de L. monocytogenes submetidos à avaliação da resistência/susceptibilidade aos antibióticos.
N° de isolados
Origem Amostra
1 Vegetais frescos
Alface
3
Vegetais prontos para
consumo
Repolho roxo, repolho branco, alface e beterraba
(2 amostras)
Alface, beterraba e repolho roxo (1 amostra)
Total 4
Das 99 amostras analisadas, L. monocytogenes foi isolada de quatro
amostras (4,04%), sendo um isolamento proveniente de vegetal fresco (3,03%)
e 3 isolamentos de vegetais prontos para o consumo (9,09%) (Tabela 3).
A alface foi o único vegetal fresco contaminado pelo microrganismo,
enquanto dois tipos diferentes de saladas apresentaram-se contaminadas.
Nenhuma amostra de vegetal congelado apresentou a contaminação.
Os quatro isolados recuperados das amostras de vegetais frescos e de
vegetais prontos para o consumo foram identificados como L. monocytogenes
pertencente ao sorotipo 4b.
Em uma amostra de salada preparada com alface, beterraba e repolho
roxo foi isolada a espécie não patogênica, Listeria innocua, sorotipo 6a.
64
Tabela 3. Ocorrência de Listeria monocytogenes em vegetais frescos, congelados e prontos para o consumo (saladas).
Grupo de Vegetais Amostras
Positivas
Origem
N %
Frescos 1 3,03 Alface (1 amostra)
Congelados 0 0,00 -
Prontos para o consumo
(saladas)
3 9, 09 Repolho roxo, repolho branco,
alface e beterraba (2 amostras)
Alface, beterraba e repolho
roxo (1 amostra)
TOTAL 4 4,04%
A presença de L. monocytogenes em vários tipos de vegetais frescos ou
prontos para o consumo tem sido documentada em vários países.
No Brasil, a ocorrência de L. monocytogenes em vegetais tem sido
relatada em muitos estudos por vários pesquisadores. Os resultados
encontrados no presente trabalho demonstram níveis mais altos de detecção
de L. monocytogenes em saladas do que aqueles previamente relatados por
Porto et al. (2001) (3,2%); Froder et al. (2007) (0.55%); Oliveira et al. (2011)
(3.7%); Sant’Ana et al. (2012) (3.1%); Maistro et al. (2012) (1,74%).
Em outros países, também vários resultados têm sido reportados para a
presença de L. monocytogenes em vegetais. Em Santiago (Chile), a bactéria foi
isolada de 10,2% das amostras de saladas (Cordono et al., 2009); na Malasia,
de 22.5% das amostras de saladas (Ponniah et al., 2009); na Espanha, de
4.18% dos vegetais (Moreno et al., 2012); e na Alemanha, em apenas quatro
amostras de 1001 vegetais investigados (Schwaiger et al., 2011).
65
Jamali et al. (2012) analisaram 396 amostras de alimentos prontos para
o consumo, onde 170 foram de saladas e vegetais. Dessas, 25 (14,1%) foram
confirmadas para a presença de L. monocytogenes.
Sabe-se que saladas prontas necessitam de temperatura de refrigeração
para sua conservação e armazenamento, o que favorece a sobrevivência e
multiplicação de L. monocytogenes devido a sua característica psicrotrófica.
Tais resultados demonstram que as técnicas de limpeza, higienização e
manipulação utilizadas no preparo dos vegetais prontos para o consumo ou
vegetais minimamente processados não foram eficientes para garantir um
produto inócuo para o consumidor.
Considera-se também que por tratar-se de uma mistura de vegetais,
existe uma maior probabilidade de contaminação, pois vários vegetais são
manipulados durante todo o processo, criando mais oportunidades para a
introdução e dispersão de L. monocytogenes.
Quanto à não detecção do microrganismo nos vegetais congelados,
analisa-se que, provavelmente, tal resultado seja em função da etapa do
branqueamento utilizada para inativação enzimática antes do congelamento.
Como o branqueamento é um tratamento térmico, possivelmente cepas de L.
monocytogenes, caso presentes, foram eliminadas ou reduzidas a níveis não
detectáveis.
Quanto à sorotipagem das cepas, observa-se a frequência do sorotipo
4b isolado no presente estudo e em outros estudos, como no trabalho
conduzido por Sant’Ana et al. (2012) e Moreno et al. (2012). É importante
mencionar que o sorotipo 4b é o mais implicado nos surtos de toxinfecção
alimentar por L. monocytogenes.
Como pode ser observado em alguns estudos mencionados
anteriormente, a frequência da ocorrência do microrganismo nos vegetais
prontos para o consumo foi próxima à do presente estudo. Já para os vegetais
frescos, a ocorrência verificada foi inferior à encontrada por Moreno et al.
(2012) que também estudou esse grupo de vegetais. No grupo dos vegetais
congelados, o presente estudo também demonstrou percentagem de
isolamento da bactéria inferior aos estudos mencionados, já que nenhuma
amostra foi positiva para L. monocytogenes.
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A presença de L. monocytogenes em vegetais, verificada no presente
estudo, e em outros estudos reportados por vários autores é preocupante,
considerando que os casos de listeriose estão aumentando em nível mundial,
em muitos casos devido à contaminação cruzada de alimentos processados
(Moreno et al., 2012). Nesse contexto, as Boas Práticas Agrícolas e Boas
Práticas de Fabricação devem ser atendidas para garantir um alimento seguro
para os consumidores.
3.2 Resistência a antimicrobianos
Em se tratando da resistência bacteriana aos antimicrobianos, verifica-se
que o tema é pesquisado por diversos autores, devido à grande importância do
uso desses fármacos na medicina humana e também na veterinária. À medida
que os antimicrobianos vão sendo utilizados indiscriminadamente, aumenta-se
o número de bactérias resistentes às drogas mais utilizadas na terapia
humana.
A terapia de escolha para o tratamento da listeriose consiste na
administração de ampicilina ou penicilina G em combinação com um
aminoglicósidio, classicamente a gentamicina. A associação de trimetoprim
com uma sulfonamida, como o sulfametoxazol com co-trimoxazol, é
considerada como a segunda escolha de terapia, geralmente administrada nos
casos de doentes alérgicos aos antibióticos da classe β-lactâmicos
(Charpentier, 1999; Conter et al., 2009). A existência de resistência e
multirresistência aos antibióticos comumente utilizados no tratamento de
listeriose é uma grande preocupação para a saúde pública.
Os resultados obtidos no presente estudo podem ser observados na
Tabela 4.
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Tabela 4. Resistência/susceptibilidade de isolados de Listeria monocytogenes aos antimicrobianos.
Todos os isolados de L. monocytogenes estudados nesta pesquisa
apresentaram-se sensíveis aos antimicrobianos cefoxitina (CEF), ciprofloxacina
(CIP), eritromicina (ERI), estreptomicina (EST), oxacilina (OXA) e vancomicina
(VAN). Entretanto, verificou-se a presença de dois isolados que apresentaram
resistência a tetraciclina (TET) e a penicilina G (PEN), que são drogas
indicadas para o tratamento da listeriose (Jay, 2005).
Em contraste, aos resultados relatados por Kovacevic et al. (2012),
todos os isolados foram susceptíveis a CIP. Outros estudos têm demonstrado
resultados similares àqueles do presente trabalho (Davis e Jackson, 2009;
Safdar e Armstrong, 2003; Troxler et al., 2000). Entretanto, as diferenças de
resultados entre os estudos podem ser atribuídas às metodologias empregadas
para determinar a resistência (em geral, microdiluição em caldo versus disco
difusão, diferença de meios, dentre outros).
Quanto à resistência aos antibióticos, o estudo conduzido por Korsac et
al. (2012) na Polônia com 471 amostras de alimentos demonstrou resultado
semelhante ao do presente estudo, ou seja, os autores encontraram resistência
de um isolado de L.monocytogenes à tetraciclina. Também dados semelhantes
foram relatados por Chen et al. (2013) que investigaram isolados de L.
monocytogenes de 10 amostras de alimentos vendidos no varejo do sul da
China. Os resultados do estudo apontou que 2,7% dos isolados foram
resistentes à tetraciclina e 8,1% à penicilina.
Detalhando o trabalho conduzido por Kovacevi et al. (2012) os autores
demonstraram que todos os isolados de Listeria spp. foram resistentes à
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cefoxitina e ao ácido nalidíxico e que os isolados de L. monocytogenes foram
resistentes a clindamicina, estreptomicina e amicacina.
Gómez et al. (2014) investigaram a resistência/susceptibilidade de
isolados de L. monocytogenes a 20 antibióticos e observaram resistência a um
ou dois antibióticos em 71 isolados (34,5%). Multirresistência aos antibióticos
testados foi encontrada pelos autores em seis isolados de L. monocytogenes
(2,9%). Ainda, segundo os autores, o fenótipo resistente à oxacilina foi o mais
comumente observado, e foi identificado em 100% dos isolados de Listeria
investigados. Uma prevalência média de isolados resistentes a clandomicina e
prevalência baixa de isolados resistentes à tetraciclina também foram relatadas
pelos autores. Concluindo, os autores afirmam que todos os isolados foram
sensíveis aos antibióticos de escolha para o tratamento da listeriose.
Os isolados do presente estudo não demonstraram multirresistência aos
antibióticos.
Apesar dos resultados de alguns estudos indicarem uma certa
tranquilidade na terapia com antibióticos para tratamento da listeriose, é
importante considerar o aparecimento de cepas multiresistentes e também a
possibilidade de aquisição de resistência por cepas de L. monocytogenes
isoladas dos alimentos. Ainda, segundo Jay (2005), mesmo com o uso destes
fármacos, a terapia com antimicrobianos para listeriose não é inteiramente
satisfatória, uma vez que pacientes imunodeprimidos e hospedeiros
comprometidos (gestantes, idosos e crianças) são mais difíceis de tratar do que
hospedeiros sadios.
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4 CONCLUSÃO
De acordo com os resultados desse estudo e com os relatados por
diversos autores, observa-se que a ocorrência de L. monocytogenes em
vegetais prontos para o consumo é frequente. Esse fato constitui um risco para
a população, especialmente para o grupo de risco, gestantes, idosos, crianças
e pacientes imunodeprimidos, pois esses produtos, na sua maioria, são
consumidos após a compra, sem nenhum tratamento prévio que elimine o
perigo microbiológico.
A existência de isolados de L. monocytogenes resistentes à penicilina e
tetraciclina utilizadas nesse estudo representa um problema para a escolha da
terapia na medicina humana, por se tratarem de antibióticos frequentemente
utilizados no tratamento da listeriose.
Os resultados desse estudo servem de alerta para as autoridades de
saúde pública, indicando a necessidade de reforçar as normas na produção,
preparo e comercialização dos vegetais, na perspectiva de oferecer alimentos
não apenas nutritivos, mas também seguros para os consumidores.
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REFERÊNCIAS
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![RELATÓRIO DO SISTEMA DE INFORMAÇÕES DE … · alimentos é de como classificar cada caso: intoxicação alimentar, toxinfecção alimentar ou infecção associada a alimentos[5]](https://img.document.onl/doc/110x75/5be7e44c09d3f27e3c8d46f7/relatorio-do-sistema-de-informacoes-de-alimentos-e-de-como-classificar-cada.jpg)
