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i

LUCAS NOVAES TEIXEIRA

ESTUDO DA EXPRESSÃO DE OSTEOPONTINA EM SISTEMAS DE

COCULTURAS DE CÉLULAS OSTEOBLÁSTICAS E EPITELIAIS

NEOPLÁSICAS HUMANAS E SEUS EFEITOS SOBRE O FENÓTIPO

NEOPLÁSICO E A ATIVAÇÃO OSTEOCLÁSTICA

Piracicaba

2015

ii

iii

Universidade Estadual de Campinas

Faculdade de Odontologia de Piracicaba

LUCAS NOVAES TEIXEIRA

ESTUDO DA EXPRESSÃO DE OSTEOPONTINA EM SISTEMAS DE COCULTURAS DE

CÉLULAS OSTEOBLÁSTICAS E EPITELIAIS NEOPLÁSICAS HUMANAS E SEUS

EFEITOS SOBRE O FENÓTIPO NEOPLÁSICO E A ATIVAÇÃO OSTEOCLÁSTICA

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia

de Piracicaba da Universidade Estadual de

Campinas como parte dos requisitos exigidos

para a obtenção do título de Doutor em

Estomatopatologia, na Área de Patologia.

Orientador: Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira

Este exemplar corresponde à versão final da tese

defendida por Lucas Novaes Teixeira e orientada

pelo Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira

_________________________

Assinatura do Orientador

Piracicaba

2015

iv

v

FOLHA DE APROVAÇÃO

vi

vii

RESUMO

O carcinoma espinocelular (CEC) oral representa a neoplasia maligna mais

prevalente das estruturas bucais, podendo invadir o tecido ósseo e promover sua

reabsorção em até 56% dos casos. A expressão da proteína matricelular

osteopontina (OPN) tem sido relacionada a uma maior agressividade de

neoplasias malignas, incluindo o CEC oral. No tecido ósseo, a OPN representa a

proteína mais abundante da matriz não colágena, concentrada nas interfaces

ósseas, i.e. lâminas limitantes, linhas de cimentação e reversas, sendo essencial

para adesão e funções de osteoblastos e osteoclastos. Apesar de no

microambiente tumoral a OPN estar associada a um fenótipo neoplásico mais

agressivo, ainda não está estabelecido o papel da OPN secretada por

osteoblastos sobre células neoplásicas derivadas de CEC oral e o impacto sobre

osteoclastos. O presente estudo teve como objetivos avaliar a expressão de OPN

em sistemas de coculturas de células osteoblásticas e epiteliais neoplásicas

malignas humanas e os efeitos da expressão de OPN secretada por osteoblastos

sobre o fenótipo neoplásico in vitro. Adicionalmente, avaliou-se o efeito das

coculturas sobre a atividade osteoclástica. Células epiteliais neoplásicas malignas

derivadas de CEC oral (SCC9) foram plaqueadas sobre membranas de

Transwell®, recobertas ou não por uma camada fina e uniforme de Matrigel, e

cocultivadas com células osteoblásticas (SAOS-2) durante seu pico de expressão

de OPN (10o dia de cultura). Células SCC9 expostas a culturas SAOS-2

silenciadas para OPN por RNA de interferência (RNAi) e células SCC9 cultivadas

isoladamente foram usadas como controles. Após 24 h de cocultivo, células SCC9

foram avaliadas, quantitativamente, para adesão, proliferação, migração e invasão

de Matrigel. A atividade de osteoclastos derivados de células monocíticas U-937

foi avaliada, quantitativamente, por meio dos ensaios de reabsorção de fosfato

cálcio e de dosagem de citocinas em eluentes obtidos de células SCC9 e SAOS-2

após o cocultivo durante o pico de OPN ou com o seu silenciamento. A análise

estatística foi realizada pelo teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis (p < 0,05). Os

viii

resultados indicaram indução recíproca na expressão de OPN em SAOS-2 e

SCC9 em cocultura. A OPN secretada por células SAOS-2 afetou o fenótipo de

culturas SCC9, promovendo a adesão e a proliferação celulares e a invasão de

Matrigel, a qual também estava aumentada, mas em menor intensidade, com o

silenciamento para OPN. A migração celular não foi afetada. O cocultivo com

SAOS-2, principalmente durante o pico de OPN, resultou na sobre-expressão das

citocinas IL 6 e IL 8 pelas células SCC9, aumentando a capacidade de células

osteoclásticas em reabsorver fosfato de cálcio. Conjuntamente, esses resultados

sugerem que a OPN derivada de osteoblastos afeta as interações entre células

epiteliais neoplásicas malignas, osteoblastos e osteoclastos, possivelmente

contribuindo para a progressão de lesões ósseas do CEC oral.

Palavras-chave: osteoblastos, osteopontina, carcinoma espinocelular oral,

cocultura, invasão óssea.

ix

ABSTRACT

The oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most prevalent malignant

neoplasm of the oral structures. It may invade bone in up to 56% of the cases and

promote osteoclast-mediated bone extracellular matrix (ECM) resorption.

Expression of the matricellular protein osteopontin (OPN) in malignant neoplasms,

including OSCC, has been positively correlated with aggressive tumor behavior.

OPN is the most abundant non collagenous ECM protein in bone, where it

preferentially accumulates at interfaces, including cement lines, laminae limitantes

and reversal lines, being essential for the adhesion and function of osteoblasts and

osteoclasts. Despite the importance attributed to OPN in the tumor

microenvironment, indicative of more aggressive neoplastic phenotypes, the

effects of osteoblast-derived OPN on OSCC cells and on OSCC-induced

osteoclast activity are still not fully understood. The present in vitro study aimed to

evaluate temporal expression of OPN in cocultures of human osteoblastic cells and

malignant neoplastic epithelial cells and the effects of osteoblast-derived OPN on

the neoplastic cell phenotype. Additionally, the effects of cocultures on osteoclastic

activity were evaluated. Human OSCC-derived epithelial cells (SCC9 cell line)

were plated on Transwell® membranes coated or not by a thin uniform layer of

Matrigel and cocultured with human osteoblastic cells (SAOS-2 cell line) during its

peak of OPN expression (day 10 of SAOS-2 culture). SCC9 cells exposed to OPN-

silenced SAOS-2 cultures by means of interference RNA and SCC9 cells cultured

alone were used as controls. At 24 h of coculture, SCC9 cells were quantitatively

evaluated for cell adhesion, proliferation, migration and invasion of Matrigel. The

impact of coculturing SCC9 and SAOS-2 cells either during the OPN peak

expression or under the silencing of OPN was quantitatively evaluated in terms of

calcium phosphate resorption by U-937-derived osteoclastic cells and expression

of cytokines in the culture medium by ELISA assay. The statistical analyses were

carried out using the non-parametric Kruskal-Wallis test (p < 0.05). The results

showed a reciprocal induction of SAOS-2 and SCC9 cells in terms of OPN

x

expression over the coculture interval. SAOS-2-secreted OPN altered the SCC9

cell phenotype, leading to enhanced cell adhesion and proliferation and higher

Matrigel invasion, which was also enhanced, but to a lesser degree, by SAOS-2

cultures silenced for OPN. Cell migration was not affected. Cocultures with SAOS-

2, mainly during the peak expression of OPN, resulted in overexpression of IL 6

and IL 8 by SCC9 cells, which corresponded with an enhanced resorptive capacity

of osteoclastic cells. Taken together, the results suggest that osteoblast-derived

OPN affects the interactions among malignant neoplastic epithelial cells,

osteoblasts and osteoclasts, likely contributing to the progression of bone lesions

in OSCC.

Key Words: osteoblasts, osteopontin, oral squamous cell carcinoma, coculture,

bone invasion.

xi

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA...................................................................................................................xv

AGRADECIMENTOS.........................................................................................................xix

EPÍGRAFE........................................................................................................................xxiii

LISTA DE ABREVIATURAS.............................................................................................xxv

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 1

2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................................... 3

2.1 OPN ................................................................................................................................................... 3

2.2 OPN e seu papel na carcinogênese ............................................................................................. 7

2.3 Invasão do CEC oral no tecido ósseo ........................................................................................ 10

3 PROPOSIÇÃO ...................................................................................................................... 15

3.1 Objetivo geral ................................................................................................................................. 15

3.2 Objetivos específicos .................................................................................................................... 15

4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................................... 17

4.1 Culturas celulares .......................................................................................................................... 17

4.1.1 Obtenção e cultura de SAOS-2 ............................................................................................ 17

4.1.2 Obtenção e cultura de SCC-9 .............................................................................................. 17

4.1.3 Obtenção e cultura de U-937 ................................................................................................ 18

4.2 Análise do perfil de expressão de OPN em células SAOS-2 e SCC9 .................................. 19

4.2.1 Imunolocalização de OPN por imunofluorescência indireta ............................................ 19

4.2.2 Expressão de OPN por Real Time PCR ............................................................................. 20

4.2.3 Quantificação de OPN por ELISA ........................................................................................ 21

4.3 Análise do perfil de expressão de OPN em coculturas de SAOS-2/SCC9 .......................... 21

4.3.1 Coculturas de SAOS-2/SCC9 ............................................................................................... 22

4.4 Avaliação do efeito da OPN secretada por SAOS-2 sobre a expressão gênica e o

fenótipo de células SCC9 em cocultura ............................................................................................ 22

4.4.1 Silenciamento do transcrito do gene da OPN por RNAi ................................................... 22

4.4.2 Adesão celular ........................................................................................................................ 23

4.4.3 Proliferação celular ................................................................................................................. 23

xii

4.4.4 Migração celular...................................................................................................................... 24

4.4.5 Invasão celular ........................................................................................................................ 24

4.4.6 PCR Array ................................................................................................................................ 25

4.5 Avaliação do efeito da OPN secretada por SAOS-2, em cocultura com células

SCC9, sobre a atividade de osteoclastos humanos e citocinas envolvidas na

diferenciação e ativação osteoclástica .............................................................................................. 26

4.5.1 Avaliação da atividade osteoclástica por meio do ensaio de reabsorção de

fosfato de cálcio ................................................................................................................................ 26

4.5.2 Quantificação de RANKL, OPG, PTHrP e citocinas inflamatórias por ELISA .............. 27

4.6 Análise estatística .......................................................................................................................... 28

5 RESULTADOS ...................................................................................................................... 29

5.1 Análise do perfil de expressão de OPN em células SAOS-2 e SCC9 .................................. 29




5.2 Análise do perfil de expressão de OPN em coculturas de SAOS-2/SCC9 .......................... 32




5.3 Avaliação do efeito da OPN secretada por células SAOS-2 sobre a expressão

gênica e o fenótipo de células SCC9 em cocultura ........................................................................ 38

5.3.1 Adesão celular ........................................................................................................................ 38

5.3.2 Proliferação celular ................................................................................................................. 39

5.3.3 Migração celular...................................................................................................................... 40

5.3.4 Invasão celular ........................................................................................................................ 41

5.3.5 PCR Array ................................................................................................................................ 42

xiii



diferenciação e ativação osteoclástica .............................................................................................. 44


fosfato de cálcio ................................................................................................................................ 44

5.4.2 Quantificação de RANKL, OPG, PTHrP e citocinas inflamatórias por ELISA .............. 46

6 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 49

7 CONCLUSÃO ........................................................................................................................ 57

REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 59

APÊNDICE 1 ............................................................................................................................ 97

APÊNDICE 2 .......................................................................................................................... 101

ANEXO ................................................................................................................................... 105

xiv

xv

DEDICATÓRIA

A Deus, por estar presente em minha vida e tornar tudo possível.

Aos meus pais, José Roberto e Goreti, por todos os esforços e sacrifícios

realizados para que eu pudesse estudar e alcançar meus objetivos. A vocês,

minha eterna gratidão.

Às minhas irmãs, Lívia e Letícia, e aos meus sobrinhos, Vítor, Felipe e Igor, pelo

amor, carinho e apoio incondicional.

xvi

xvii

Ao meu orientador, Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira, por ter acreditado em

mim desde o início, quando eu ainda era apenas um aluno de iniciação científica,

pelos conselhos e incentivos constantes, pela humildade e generosidade com as

quais sempre me tratou e, principalmente, pelo exemplo de dedicação à pesquisa

e ao ensino.

xviii

xix

AGRADECIMENTOS

À Larissa Moreira Spinola de Castro Raucci, pelo seu enorme coração,

que muitas vezes a obriga a deixar de lado seus compromissos para socorrer os

amigos. Palavras não são suficientes para agradecer tudo que já fez por mim em

nossos mais de 10 anos de amizade;

Ao Walter Raucci Neto, pela amizade de longa data, pelas conversas e

momentos de descontração compartilhados;

Ao Roger Rodrigo Fernandes, pela amizade, conselhos e, principalmente,

pela certeza de que sempre poderei contar com sua ajuda;

Ao Prof. Dr. Adalberto Luiz Rosa, pelo seu dinamismo, que resultou na

criação dos Laboratórios de Cultura de Células e de Biologia Molecular da

FORP/USP, locais onde pude crescer como pesquisador e onde todo o trabalho

desta Tese de Doutorado foi realizado;

Ao Prof. Dr. Márcio Mateus Beloti, pelas conversas, conhecimentos

compartilhados e pelos exemplos de competência e dedicação à pesquisa;

Ao Prof. Dr. Ricardo Della Coletta, pelas oportunidades que me

proporcionou e pela humildade e educação com as quais sempre me recebeu;

À Fabíola Singaretti de Oliveira, pela amizade e por sua inestimável ajuda

na execução deste trabalho;

À Milla Sprone Tavares Ricoldi, pelo auxílio prestado nos procedimentos

laboratoriais e pelas risadas em momentos de descontração;

xx

À Emanuela Prado Ferraz, pela amizade, conversas e, principalmente,

pelo exemplo de determinação;

À Gabriela Carolina Alonso, pela dedicação e colaboração como aluna de

iniciação científica;

À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de

Campinas, na pessoa de seu diretor, Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha

Henriques; por ter me recebido como aluno de pós-graduação;

À Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São

Paulo, na pessoa de seu diretor, Prof. Dr. Valdemar Mallet da Rocha Barros;

pela infra-estrutura oferecida para execução deste trabalho;

Ao Prof. Dr. Alan Roger dos Santos Silva, coordenador do Programa de

Pós-Graduação em Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia de

Piracicaba – UNICAMP; pela solicitude e exemplo de profissionalismo;

Aos Profs. Drs. Alan Roger dos Santos Silva, Edgard Graner, Jacks

Jorge Júnior, Márcio Ajudarte Lopes, Oslei Paes de Almeida, Pablo Augustin

Vargas e Ricardo Della Coletta, professores das áreas de Patologia e

Semiologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP, pelo

exemplo de dedicação à docência e à pesquisa;

À FAPESP, pelo auxílio financeiro a esta pesquisa (2012/07531-9) e pela

concessão da bolsa de doutorado (2012/08605-6);

xxi

Aos amigos do laboratório Emanuela Ferraz, Fernanda Grilo, Gabriela

Alonso, Gabriela Cerminaro, Gileade Freitas, Helena Bacha, Mayara

Semeghini, Rodrigo Abuna e Thiago Santana, pelos bons momentos

compartilhados e pelo excelente ambiente de trabalho;

Aos amigos da pós-graduação Alícia Rumayor Piña, Ana Lúcia Noronha,

Elizabete Bagordakis, Felipe Paiva, Isadora Luana Flores, Katya, Lara

Alencar, Luciana Yamamoto, Marcondes Sena, Marisol Martínez, Rogério

Gondak, Rose Ortega, Sabino Bezerra, Sabrina Nogueira, Sibele Aquino e

Wilfredo Gonzalez, pelos conhecimentos e momentos de descontração

compartilhados;

Muito obrigado!

xxii

xxiii

EPÍGRAFE

“Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas

usadas, que já tem a forma do nosso corpo, e

esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre

aos mesmos lugares. É o tempo da travessia: e, se

não ousarmos fazê-la, teremos ficado, para sempre, à

margem de nós mesmos.”

Fernando Teixeira de Andrade

xxiv

xxv

LISTA DE ABREVIATURAS

AKT: Proteína quinase B

ANOVA: Análise de variância

ATCC: American Type Culture Collection

BSP: Sialoproteína óssea

cDNA: DNA complementar

CEC: Carcinoma espinocelular

Ct: Ciclo limiar

DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole

DMEM-F12: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium e Ham’s F-12 Nutrient Mixture

DNA: Ácido desoxirribonucleico

EDTA: Ácido etileno-diamino-tetracético

EGF: Fator de crescimento epidérmico

ELISA: Ensaio de imunoabsorbância ligado à enzima

ERK: Quinases reguladores de sinais extracelulares

FGF-2: Fator de crescimento fibroblástico 2

FN: Fibronectina

GAPDH: Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase

GM-CSF: Fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos

h: Hora

HGF: Fator de crescimento hepático

IGF-1: Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1

IL: Interleucina

xxvi

kDa: Quilodaltons

MAPK: Proteína quinase ativadora de mitose

MEC: Matriz extracelular

MEK: Mitogen-activated protein

min: Minuto

mL: Mililitro

mM: Milimolar

MMP: Metaloproteinase

NFkB: Fator nuclear cadeia leve kappa intensificador de células B ativadas

ng: Nanograma

nM: Nanomolar

nm: Nanômetro

OPG: Osteoprotegerina

PB: Tampão fosfato

PBS: Salina tamponada com fosfato

PGE2: Prostaglandina E2

PI3K: Fosfatidilinositol-3-quinase

PTHrP: Peptídeo relacionado ao paratormônio

RAF: RAF proteína quinase serina/treonina

RANK: Receptor ativador do fator nuclear-Kappa B

RANKL: Ligante do receptor ativador do fator nuclear-Kappa B

RAS: Rat Sarcoma vírus

Real Time PCR: Reação em cadeia da polimerase em tempo real

RGD: Sequência arginina-glicina-ácido aspártico

xxvii

RIN: RNA Integrity Number

RNA: Ácido ribonucleico

RNAi: RNA de interferência

RNAm: RNA mensageiro

RPMI: Roswell Park Memorial Institute medium

SAOS-2: Células osteoblásticas humanas

SCC9: Células epiteliais malignas humanas derivadas de CEC oral

Scr: Proteína tirosina-quinase Scr

SIBLING: Small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins

siRNA: Small interfering RNA

SVVYGLR: Sequência serina-valina-valina-tirosina-glicina-leucina-arginina

TA: Temperatura ambiente

TGF-β: Fator de crescimento transformante beta

TIMP: Inibidores teciduais de MMP

TNFSF10: Ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral

TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa

U-937: Linhagem celular de monócitos humanos

UI: Unidades internacionais

µg: Micrograma

µL: Microlitro

uPA: Plasminogênio do tipo uroquinase

VEGF: Fator de crescimento vascular endotelial

xxviii

1

1 INTRODUÇÃO

O CEC oral representa a neoplasia maligna mais comum da região de cabeça e

pescoço e corresponde a mais de 90% de todos os tumores que acometem as

estruturas bucais (Saman, 2012; Simard et al., 2014). Anualmente, estima-se que o

CEC oral seja responsável por aproximadamente 130.000 mortes em todo o mundo,

das quais 75% estão localizadas em países em desenvolvimento (De Camargo

Cancela et al., 2010). No Brasil, apresenta-se como a quinta e a décima segunda

neoplasia maligna mais comum em homens e mulheres, respectivamente; com uma

média de 15 mil novos casos/ano (Instituto Nacional de Câncer - INCA, 2014).

O CEC oral desenvolve-se por um processo multifatorial caracterizado por

alterações genéticas e epigenéticas que resultam em ativação e/ou inativação de proto-

oncogenes e genes supressores de tumores, os quais controlam diferentes atividades

celulares (Feinberg & Tycko, 2004; Campo-Trapero et al., 2008; Lichtenstein, 2010;

Hanahan & Weinberg, 2011). De fato, fatores de crescimento, citocinas e outras

moléculas bioativas exercem efeitos sobre adesão, proliferação, viabilidade, migração e

invasão de células neoplásicas (Gaur et al., 2014; Ohnishi et al., 2014; Ribeiro et al.,

2014; Lee et al., 2015).Entre os mecanismos biológicos envolvidos na progressão das

neoplasias, destaca-se o papel das proteínas da MEC, em particular uma classe de

glicoproteínas denominada SIBLING, da qual faz parte a OPN (Bellahcène et al., 2008;

Shevde & Samant, 2014).

A OPN é uma proteína multifuncional da MEC que foi inicialmente isolada de

células epiteliais neoplásicas, linfócitos T e matriz óssea (Senger et al., 1979; Franzén

& Heinegård, 1985; Weber & Cantor, 1996), sendo posteriormente identificada em

outros órgãos e fluidos biológicos (Young et al., 1990; Brown et al., 1992; Denhardt &

Guo, 1993; Kohri et al., 1993; Bautista et al., 1996). Diversos estudos têm demonstrado

que o potencial de invasão de numerosas neoplasias malignas é maior quando são

altos os níveis de expressão de OPN no parênquima tumoral (Chen R et al., 2011; Lu

et al., 2011; Wang et al., 2011; Zhang R et al., 2011; Zhang Y et al., 2011). Para o CEC

oral, há evidências que indicam que a OPN produzida pelas células neoplásicas

2

promove sua invasão para os tecidos circunjacentes (Matsuzaki et al., 2007; Routray et

al., 2013). Adicionalmente, a OPN tem sido considerada um marcador prognóstico para

neoplasias malignas, incluindo o CEC oral (Weber et al., 2010; Avirović et al., 2013;

Ingale et al., 2014).

No tecido ósseo, a OPN representa a proteína não colágena mais abundante e

atua nos processos de formação e remodelação óssea (Sodek et al., 2000). Enquanto

que a secreção de OPN por osteoblastos contribui para adesão celular e controle do

crescimento de cristais de apatita na MEC colágena (Standal et al., 2004b; Hunter et

al., 2013; Holm et al., 2014), estudos têm demonstrado o papel da OPN nos processos

de adesão e ativação osteoclástica, fisiológica e patologicamente, incluindo neoplasias

e metástases ósseas (Semba, 1996; Guise & Mundy, 1998; Chellaiah et al., 2003; Li et

al., 2006; Reufsteck et al., 2012; Kruger et al., 2014).

Durante a reabsorção óssea, três moléculas são cruciais para diferenciação e

ativação dos osteoclastos: RANKL, RANK e OPG (Gruber, 2014). A via de sinalização

RANK/RANKL regula a diferenciação de monócitos/macrófagos em osteoclastos e ativa

a reabsorção óssea, enquanto que a presença de OPG inibe a osteoclastogênese

(Lacey et al., 2012). Além do sistema RANK/RANKL, várias citocinas inflamatórias

sintetizadas pelas células neoplásicas, como as IL 1α, IL 1β, IL 6, IL 8, IL 11, TNF-α,

GM-CSF e PTHrP, também estão envolvidas na ativação osteoclástica (Guise &

Mundy, 1998; Shibahara et al., 2005; Takayama et al., 2010; Quan et al., 2012).

Embora avanços tenham ocorrido na compreensão dos mecanismos de invasão do

tecido ósseo pelo CEC oral, o papel da OPN secretada por osteoblastos presentes no

microambiente tumoral sobre a ativação osteoclástica mediada por células neoplásicas

malignas não está ainda completamente elucidado. Assim, os resultados do presente

estudo in vitro devem contribuir para uma melhor compreensão das complexas

interações celulares que ocorrem no microambiente tumoral durante a invasão óssea

pelo CEC oral.

3

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 OPN

A OPN é uma proteína matricelular, multifuncional, que atua tanto em processos

fisiológicos como patológicos, entre os quais inflamação, reparação tecidual, formação

e remodelação óssea, aterosclerose e câncer (Sodek et al., 2000; Tuck et al., 2007;

Cho et al., 2009). Descrita inicialmente como uma fosfoproteína secretada por células

epiteliais neoplásicas (Senger et al., 1979), esta proteína foi redescoberta por Craig et

al. (1989) por meio da clonagem molecular do gene 2ar associado à transformação.

Posteriormente, outros cientistas, de modo independente, identificaram a OPN,

juntamente com a BSP, como a principal sialoproteína da MEC óssea (Franzén &

Heinegard, 1985; Fisher et al., 1987; Prince et al., 1987); essas duas moléculas foram

denominadas, inicialmente, BSP I e BSP II, respectivamente (Franzén & Heinegard,

1985).

Nos tecidos do corpo humano, a OPN é encontrada em células epiteliais dos

tratos gastrointestinal, urinário e reprodutor, vesícula biliar, pâncreas, brônquios

pulmonares, glândulas mamárias, glândulas salivares e ductos de glândulas

sudoríparas, em fluidos biológicos, como sangue, leite materno, urina e líquido seminal

(Higashibata, 2004; Takahashi et al., 2004).

O gene que codifica a OPN humana está localizado no braço longo do

cromossomo 4, região 4q21, sendo composto por 7 exons (Young et al., 1990; Hijiya et

al., 1994). A expressão de OPN é influenciada por várias moléculas, como hormônios,

citocinas e fatores de crescimento, que podem modular a transcrição gênica, o

processamento, a estabilidade e a tradução do RNA mensageiro, bem como as

alterações pós-tradução sofridas por esta molécula (Denhardt & Noda, 1998). Embora

essa regulação geralmente seja similar em diferentes tecidos, há algumas diferenças

relevantes, inclusive no contexto de um mesmo tecido; o controle diferencial tem sido

descrito e atribuído, pelo menos em parte, à célula-alvo e ao estágio de maturação

celular (Sodek et al., 2000). A literatura relata a existência do splicing alternativo para

OPN humana, que produz 3 isoformas da proteína: OPN-a, constituída por todos os

exons codificantes do gene, OPN-b e OPN-c, que exibem a ausência dos exons 5 e 4,

4

respectivamente. A distribuição das isoformas nos tecidos humanos está relacionada à

presença de fatores célula-específicos que determinam qual tipo de isoforma

prevalecerá nos diferentes tipos celulares (Gimba & Tilli, 2013).

A sequência de aminoácidos da OPN está disponível para várias espécies,

como a humana (Kiefer et al., 1989), a bovina (Kerr et al., 1991), a suína (Wrana et al.,

1989) e a murina (Oldberg et al., 1986; Craig et al., 1989). De modo geral, a OPN é

extremamente hidrofílica com baixo ponto isoelétrico (3.5) e exibe uma composição

distinta de aminoácidos, com 42 serinas, 48 ácidos aspárticos e 47 resíduos de ácido

glutâmico, que, juntos, constituem mais da metade da proteína. Interessantemente, 27

dos 42 resíduos de serina são fosforilados. A proteína nascente exibe massa molecular

média de 34 kDa. Contudo, a OPN secretada varia entre 41-75 kDa, em função de

suas modificações pós-tradução (Christensen et al., 2008). A OPN é rica em ácidos

aspártico e glutâmico, serina, e contém uma sequência de ácido poliaspártico, por meio

da qual é capaz de se ligar à hidroxiapatita e aos íons cálcio, e uma, de RGD, a qual

medeia a adesão celular. Além disso, sítios de fosforilação em resíduos de serina e

treonina, sítios de N- e O- glicosilação, sítios de clivagem para trombina e sítios para

ação de transglutaminases também já foram identificados na OPN (Kazanecki et al.,

2007). Variações nos níveis de fosforilação, glicosilação e sulfatação geram diferentes

formas funcionais de OPN, as quais podem ser encontradas no mesmo tecido ou em

tecidos distintos (Sodek et al., 2000; Christensen et al., 2007; Zhang et al., 2007).

As interações célula-matriz e célula-célula mediadas por OPN ocorrem entre

sequências específicas presentes na estrutura da proteína e receptores, como as

integrinas, localizadas na membrana plasmática (Sodek et al., 2000). Essas ligações

resultam na ativação de quinases e/ou fatores de transcrição que promovem adesão,

migração e sobrevivência celulares (Hynes, 1992; Shattil et al., 2010). Além disso, as

atividades biológicas da OPN também podem ser moduladas por processos

proteolíticos, que clivam a proteína e separam domínios funcionais ou revelam sítios

crípticos (Senger et al., 1994; Myles & Leung, 2008).

As integrinas são proteínas transmembrana compostas por duas subunidades,

denominadas α e β, que atravessam a membrana plasmática, com uma pequena

cauda C-terminal intracelular e um grande domínio extracelular N-terminal (Schwartz et

5

al., 1995). A porção extracelular do dímero se liga às sequências específicas de

aminoácidos de proteínas da MEC ou aos receptores de superfície presentes em

outras células. A porção intracelular se liga a um complexo de proteínas que interagem

com o citoesqueleto (Wang & Luo, 2010). A OPN, por meio da sequência RGD,

interage com várias integrinas, entre as quais αvβ3, αvβ5, αvβ1, α4β1, α8β1 e α9β1

(Wai & Kuo, 2008; Zou et al., 2013). A sinalização por essas integrinas pode resultar

em ativação do complexo de adesão focal, que inclui várias proteínas reguladoras e

estruturais, como a quinase de adesão focal, quinases da família Src e proteínas

citoesqueléticas (Han et al., 2007; Li et al., 2007; Fong et al., 2009). O recrutamento de

diferentes componentes do complexo de adesão focal ativam diferentes vias de

sinalização que, por sua vez, regulam diferentes parâmetros da atividade celular, como

adesão, migração, proliferação e sobrevivência (Khan et al., 2002; Kang et al., 2008;

Song et al., 2008; Shattil et al., 2010; Zou et al., 2013).

O receptor CD44 é uma glicoproteína transmembrana que possui diferentes

isoformas e modificações pós-tradução (Ponta et al., 1998). Diversos tipos celulares

expressam o receptor CD44, como linfócitos, macrófagos, fibroblastos, osteoblastos,

células musculares lisas, endoteliais e epiteliais (Underhill, 1992; Hughes et al., 1994;

Nakamura et al., 1995; Jain et al., 1996; Schmits et al., 1997; Johnson et al., 2000). O

principal ligante do receptor CD44 é o ácido hialurônico (Underhill, 1992). Contudo,

fatores de crescimento, bem como outras proteínas da MEC, entre as quais colágeno,

sulfato de condroitina, fibronectina, laminina e OPN podem se ligar ao receptor CD44

(Orian-Rousseau & Sleeman, 2014). Assim como descrito para interações OPN-

integrinas, a ativação do receptor CD44 recruta vias de sinalização que promovem

adesão, migração e proliferação celulares (Ponta et al., 2003; Orian-Rousseau, 2010).

A OPN possui um sítio de clivagem pela trombina, contíguo à sequência RGD,

que gera fragmentos contendo diferentes domínios da proteína, como os de ligação às

integrinas e ao receptor CD44, e revela sítios crípticos, como a sequência SVVYGLR

(Senger et al., 1994; Myles & Leung, 2008). Assim, determinadas funções celulares

podem prevalecer sobre outras de acordo com os níveis de cada fragmento aos quais

as células foram expostas. Por exemplo, o fragmento N-terminal da OPN se liga às

integrinas αvβ3 e αvβ5, por meio da sequência RGD, ou às integrinas α9β1 e α4β1,

6

pela sequência SVVYGLR, e promove adesão celular (Yokosaki et al., 1999; Ito et al.,

2009). Por outro lado, o fragmento C-terminal se liga às isoformas 3 e 6 do receptor

CD44 e resulta em migração e invasão celulares (Teramoto et al., 2005). A clivagem

proteolítica da OPN também pode ocorrer por ação de MMPs, particularmente pelas

MMPs 2, 3, 7 e 9, gerando peptídeos que se ligam a integrinas com subunidade β1

e/ou ao receptor CD44, promovendo adesão, migração e invasão celulares (Agnihotri et

al., 2001; Dean & Overall, 2007; Takafuji et al., 2007).

A enzima transglutaminase catalisa a formação de ligações covalentes entre

resíduos de lisina e glutamina presentes na estrutura da proteína, que estabilizam as

interações proteína-proteína, proteína-MEC e/ou proteína-célula (Aeschlimann &

Thomazy, 2000; Iismaa et al., 2009). A OPN possui dois sítios de ação para

transglutaminase, representados pelos resíduos de glutamina localizados próximos à

porção N-terminal da proteína (Sørensen et al., 1994). A polimerização da OPN,

promovida pela transglutaminase, potencializa os efeitos da OPN sobre a adesão, o

espraiamento e a migração celular (Higashikawa et al., 2007; Forsprecher et al., 2011).

Diferentes domínios funcionais da OPN mantiveram-se conservados durante a

evolução de várias espécies, destacando-se os sítios de ligação ao cálcio, constituídos

por sequências ricas em ácido aspártico e serinas fosforiladas (Sodek et al., 2000).

Estudos têm demonstrado a associação entre a expressão de OPN e a formação dos

cristais de hidroxiapatita, seja em situações fisiológicas ou patológicas (Sodek et al.,

2000). Além disso, a expressão diferencial de OPN durante a histogênese do tecido

ósseo, particularmente no estágio inicial de diferenciação osteoblástica e durante a

mineralização da MEC, sugere que esta proteína exerça importante papel no

metabolismo do cálcio e no processo de biomineralização (Aubin, 1998; Sodek et al.,

2000; Hunter, 2013; Zurick et al., 2013). Com efeito, a OPN participa das interações

entre células e MEC no tecido ósseo, promovendo a união de células osteoblásticas às

fases orgânicas e minerais da MEC e controlando as funções de osteoblastos,

osteócitos e osteoclastos (Oldberg et al., 1986; McKee & Nanci, 1996; Sodek et al.,

2000; Staines et al., 2012).

7

2.2 OPN e seu papel na carcinogênese

As primeiras evidências do papel da OPN no desenvolvimento de neoplasias

surgiram a partir de estudos que demonstraram elevados níveis de OPN em culturas

células transformadas (Senger et al., 1983; Senger et al., 1989) e de células tumorais

com alto potencial metastático (Craig et al., 1988; Craig et al., 1990). Posteriormente,

detectou-se alta expressão de RNAm para OPN em vários carcinomas, com as células

positivas para os transcritos de OPN localizando-se predominantemente no fronte

tumoral e em áreas de necrose. Corroborando esses achados, outros trabalhos

também relataram a sobre-expressão de OPN, tanto em níveis de RNAm quanto

proteico, em diversas neoplasias, como em tumores de mama, próstata, pâncreas,

pulmão, ovário, útero e cabeça e pescoço (Bellahcène et al., 2008).

Devido à sua ampla distribuição em diferentes carcinomas e, principalmente, por

ser uma proteína secretada passível de ser quantificada por métodos menos invasivos,

estudos sugerem a utilização da OPN como um biomarcador prognóstico (Wai & Kuo,

2008; Terpos et al., 2009; Weber et al., 2010; Weber et al., 2011), inclusive para o CEC

oral (Ingale et al., 2014; Mardani et al., 2014). Em um estudo clínico prospectivo,

Bramwell et al. (2006) dosaram os níveis plasmáticos de OPN em mulheres com

diagnóstico recente de metástases de carcinoma de mama. Nesse trabalho, os autores

observaram um aumento significativo da OPN em função do tempo, bem como uma

correlação entre níveis plasmáticos elevados de OPN e reduzida taxa de sobrevida das

pacientes. Além da presença no plasma, a expressão de OPN no tecido tumoral

também afeta o prognóstico do paciente. Zhang et al. (2009) demonstraram que

indivíduos com câncer gástrico, cujo tumor mostrou-se positivo para OPN,

apresentavam pior prognóstico e redução de sobrevida em comparação àqueles

portando a neoplasia negativa para OPN. De modo semelhante, níveis de RNAm para

OPN em câncer colorretal exibiram correlações positivas com o estágio da doença,

metástases para linfonodos, invasão de vasos sanguíneos e linfáticos, e correlações

negativas com o período livre da doença e a sobrevida do paciente (Likui et al., 2010).

Para o CEC oral, a expressão de OPN está associada com o tamanho do tumor (T3-

8

T4), envolvimento de linfonodos cervicais (N1-N2), estágios avançados da doença (III-

IV) e redução da taxa de sobrevida (Chien et al., 2009).

A OPN atua em múltiplas etapas da carcinogênese. Em um modelo de

progressão do carcinoma de mama, Cook et al. (2005) demonstraram que a expressão

de diversos genes é modulada pela OPN. Como consequência, diferentes vias de

sinalização podem ser estabelecidas, como AKT, Raf/MEK/ERK (Robertson et al.,

2010), ILK/PI3K/GSK-3β (Robertson et al., 2010) e RAN GTPase/c-Met/PI3 quinase

(Kurisetty et al., 2008; Yuen et al., 2012). Essas alterações resultam em mudanças

fundamentais na fisiologia celular, que, conjuntamente, determinam o fenótipo maligno

(Shevde & Samant, 2014).

A adesão de células neoplásicas à OPN, bem como aos seus diferentes

fragmentos, acontece por meio de inúmeros tipos de integrinas e pelas distintas

variantes do receptor CD44 expressas na superfície das células (Gao et al., 2003;

Marroquin et al., 2004; Beausoleil et al., 2011). Células do mieloma múltiplo, por

exemplo, se ligam à OPN, indicando que o aumento da expressão de OPN no estroma

tumoral, característico de mielomas múltiplos, poderia representar um dos fatores

responsáveis pela retenção das células neoplásicas na medula óssea (Standal et al.,

2004a). Além disso, a OPN também modula positivamente a migração celular. Shevde

et al. (2006) demonstraram que o bloqueio da expressão de OPN reduz o potencial de

migração de linhagens celulares derivadas de carcinoma de mama. Parte desses

efeitos é mediado por diferentes integrinas, entre as quais αvβ1, αvβ5, α4β1, α9β1 e

α8β1 (Hu et al., 1995a; Hu et al., 1995b; Smith et al., 1996; Bayless et al.,1998; Denda

et al., 1998). Contudo, a integrina mais comumente associada aos efeitos da OPN

sobre células malignas é a αvβ3 (Seftor et al., 1999; Jin et al., 2012; Jin et al., 2014;

Zhang et al., 2014). Chen et al. (2009) demonstraram que a interação entre a integrina

αvβ3 e a OPN ativa a via de sinalização FAK/ERK/NF-κB e promove aumento da

migração de células de condrossarcoma. Resultados semelhantes foram observados

para células derivadas de carcinoma de pulmão (Fong et al., 2009).

Assim como descrito para as integrinas, as variantes de 3 a 9 do receptor CD44,

também afetam os processos de adesão e migração celulares (Ponta et al., 2003;

Caers et al., 2006; Orian-Rousseau, 2010; Orian-Rousseau & Sleeman, 2014). Khan et

9

al. (2005) demonstraram que OPN induz a expressão dos receptores CD44v6 e

CD44v9 em células de carcinoma de mama, com consequente aumento da migração

celular. Corroborando esses achados, células derivadas de camundongos knock-out

para OPN exibem reduzida adesão e migração celulares mediadas pelo receptor CD44

(Zohar et al., 2000). A ativação do receptor CD44 pela OPN também pode promover a

adesão e migração de células neoplásicas de forma indireta, por meio da expressão de

integrinas, particularmente as que contem a subunidade β1 (Lee et al., 2007). Como

resultado dessa ativação, as integrinas recrutam as vias de sinalização de HGF e EGF

e promovem o aumento da migração celular (Tuck et al., 2000; Tuck et al., 2003). Além

do papel das integrinas e do receptor CD44, há evidências de que a OPN também

pode afetar a migração celular por meio da interação com os complexos de adesão

focal (Tuck et al., 2000; Li et al., 2007). Dessa forma, a OPN é capaz de modular a

motilidade das células neoplásicas pela ativação de diferentes mecanismos.

O crescimento de tumores malignos ocorre principalmente por desregulação do

ciclo celular, que resulta em proliferação excessiva das células neoplásicas, bem como

pela evasão do processo de apoptose (Hanahan & Weinberg, 2011). A OPN promove a

proliferação celular de várias neoplasias malignas (Angelucci et al., 2004; Khodavirdi et

al., 2006; Phillips et al., 2012; Liu et al., 2014; Yang et al., 2014), sendo seu efeito

mediado, predominantemente, pelo receptor do EGF e pela sinalização do cálcio

intracelular (Lecrone et al., 2000; Angelucci et al., 2004). Como consequência,

diferentes vias são estabelecidas, como, por exemplo, a via das quinases ativadas por

mitógenos (Rangaswami et al., 2006). Por outro lado, o silenciamento da expressão de

OPN reduz a proliferação de células neoplásicas (Muramatsu et al., 2005; Wu et al.,

2014).

A angiogênese, processo de formação de novos vasos sanguíneos a partir dos

já existentes, é fundamental para o crescimento e metástase das neoplasias malignas

(Hanahan & Folkman, 1996; Tomao et al., 2014). Estudos recentes têm demonstrado o

papel da OPN na angiogênese tumoral (Kale et al., 2014; Wu et al., 2014; Yu et al.,

2014). De fato, a expressão de OPN está positivamente correlacionada com a

microdensidade vascular e a neovascularização tumoral (Jain et al., 2006; Tang et al.,

2007; Du et al., 2009). O efeito da OPN sobre a angiogênese pode ser atribuído, pelos

10

menos em parte, à expressão de integrina αvβ3 na membrana plasmática de células

endoteliais, cuja ativação promove a migração celular durante a formação de novos

vasos (Brooks et al., 1994). Outras moléculas, como o VEGF, FGF-2 e o PGE2 podem

induzir a angiogênese via OPN (Shijubo et al.,1999; Leali et al., 2003; Jain et al., 2006).

As neoplasias são capazes de degradar a matriz extracelular por meio de, pelo

menos, duas vias que controlam os mecanismos de proteólise: a dos ativadores de

uPA e a das MMPs (Bellahcène et al., 2008). Diversos estudos demonstram aumento

da invasão celular mediada pela OPN (Khodavirdi et al., 2006; Song et al., 2009; Zhang

R et al., 2011, Courter et al., 2010; Song et al., 2015). Com efeito, a exposição de

células derivadas de carcinoma de mama à OPN resulta em maior invasão celular, bem

como em elevados níveis de expressão de uPA e de atividade de uroquinase (Mi et al.,

2006). Resultados semelhantes foram descritos por Chen R et al. (2011). Nesse

trabalho, os autores induziram a sobre-expressão de OPN em células derivadas de

carcinoma hepático e observaram um aumento da invasão celular, provavelmente

mediado por MMP 2 e uPA. Interessantemente, o silenciamento da expressão de OPN

reduz os níveis de MMP 2 e MMP 9 e, consequentemente, o processo de invasão

celular (Liu et al., 2010a; Liu et al., 2010b).

Devido à sua participação em diferentes etapas do processo de tumorigênese, a

OPN tem sido considerada um potencial alvo terapêutico (Bandopadhyay et al., 2014).

Inibição da expressão, modulação das alterações pós-tradução e bloqueio da proteína

e/ou receptores são possíveis estratégias por meio das quais os efeitos da OPN sobre

as células neoplásicas malignas podem ser reduzidos e/ou eliminados (Johnston et al.,

2008; Ahmed et al., 2011). Contudo, estudos ainda são necessários para a melhor

compreensão dos eventos que controlam a expressão de OPN e as vias que são

estabelecidas após a ligação da OPN com seus receptores (Johnston et al., 2008).

2.3 Invasão do CEC oral no tecido ósseo

O CEC oral invade o tecido ósseo com uma prevalência que varia entre 12% e

56% dos casos (Hoffmannová et al., 2010; Chen Y et al., 2011; Lubek et al., 2011). O

envolvimento do tecido ósseo contribui para os aumentos da morbidade e das taxas de

11

recidiva e de mortalidade do CEC oral (Shaw et al., 2004; Ebrahimi et al., 2011; Fried et

al., 2014). Nesses casos, previamente ao tratamento, o paciente deve ser avaliado,

clinicamente e por exames de imagem, para determinar a extensão da invasão tumoral

(Van Cann et al., 2008). O exame clínico do tumor e das estruturas adjacentes

fornecem sinais sugestivos de invasão, como espessamento cortical, irregularidades da

superfície óssea, parestesia do nervo alveolar inferior e dor (Rao et al., 2004; Pandey

et al., 2009). Em um primeiro momento, as radiografias convencionais (panorâmicas e

periapicais) podem ser utilizadas para identificar sinais de invasão. Contudo, exames

mais sofisticados, como tomografia computadorizada (multi-detector e/ou emissão de

pósitrons), cintilografia e ressonância magnética exibem maior sensibilidade para a

detecção da invasão óssea (Vidiri et al., 2010; Abd El-Hafez et al., 2011). O tratamento

de escolha é a remoção cirúrgica completa do tumor juntamente com o tecido ósseo

comprometido. A ressecção cirúrgica pode ser marginal, com manutenção da

integridade do tecido ósseo, ou segmentar, com perda de sua continuidade (Van Cann

et al., 2008). De modo geral, a ressecção marginal se aplica aos casos em que não há

evidências de invasão óssea ou, quando presente, não envolve o canal mandibular; por

outro lado, a ressecção segmentar está indicada para lesões extensas no tecido ósseo

e para os casos que acometem mandíbulas atróficas. Contudo, recomenda-se que a

decisão final seja tomada no transoperatório, por meio de criteriosa avaliação da

proximidade e da fixação do CEC oral ao tecido ósseo (Rao et al., 2012).

O CEC oral progride no osso por meio de três padrões histopatológicos: erosivo,

infiltrativo e misto, uma combinação entre os dois primeiros. O padrão erosivo é

marcado pela interface nítida entre o tumor e o tecido ósseo e pela ausência de ilhotas

de tecido mineralizado no interior da massa tumoral. Diferentemente, o padrão

infiltrativo é caracterizado por projeções e ninhos de células neoplásicas ao longo de

uma superfície óssea irregular, bem como pela presença de ilhotas residuais de tecido

ósseo no interior da massa tumoral e por invasão dos sistemas haversianos pelas

células neoplásicas (Jimi et al., 2011). O padrão histopatológico de invasão parece

correlacionar-se com o comportamento clínico do tumor. Com efeito, as lesões

infiltrativas exibem uma maior chance de recorrência local e à distância (Wong et al.,

2000). Assim, a classificação histopatológica fornece uma importante informação para

12

o prognóstico do paciente e deve ser rotineiramente solicitada para os casos de CEC

oral que invadem o tecido ósseo (Wong et al, 2000).

A invasão do tecido ósseo pelo CEC oral é um processo altamente coordenado,

podendo ser divido em três fases: 1) inicial, 2) de reabsorção e 3) final (Quan et al.,

2012). Várias moléculas controlam essas fases e exercem funções distintas em cada

uma delas. Na fase inicial, quando os osteoclastos ainda não foram recrutados,

proteases derivadas das células neoplásicas auxiliam na degradação da matriz óssea.

Nessa etapa, atuam predominantemente as MMPs e as catepsinas (Kawamata et al.,

1997; Kawasaki et al., 2002; Erdem et al., 2007; Chuang et al., 2008). Na fase seguinte,

os osteoclastos assumem o papel principal na reabsorção da MEC óssea. Essas

células surgem a partir da fusão de precursores mononucleares da linhagem

monocítica/macrofágica, derivados da medula óssea (Cappariello et al., 2014; Gruber,

2014). A diferenciação osteoclástica é regulada por um complexo sistema de

sinalização que envolve três moléculas principais: RANKL, RANK e OPG (Boyce &

Xing, 2008; Lacey et al., 2012). O RANKL é sintetizado por osteoblastos, osteócitos

(Bellido, 2014) e por células do estroma da medula óssea, e induz a osteoclastogênese

por meio de sua ligação ao RANK, uma proteína transmembrana localizada na

superfície de monócitos/macrófagos e de osteoclastos maduros (Boyce, 2013). A OPG,

secretada por osteoblastos e células do estroma da medula óssea, bloqueia a ação de

RANKL e inibe a osteoclastogênese (Martin & Sims, 2015). Assim, o equilíbrio entre a

expressão de RANKL e OPG é fundamental para a diferenciação e a função

osteoclásticas. Essa via de sinalização está envolvida na invasão do tecido ósseo e na

formação de metástase por neoplasias osteotrópicas (Ibrahim et al., 2011; Casimiro et

al., 2013; Li X et al., 2014; Sigl & Penninger, 2014). No CEC oral, as células

neoplásicas são capazes de promover a diferenciação osteoclástica, diretamente, pela

secreção de RANKL ou, indiretamente, pela indução da síntese de RANKL por células

do estroma tumoral (Ishikuro et al., 2008; Sato et al., 2013). Além disso, as células do

CEC oral são capazes de inibir a expressão de OPG derivada de osteoblastos,

aumentado, assim, os níveis relativos de RANKL e, consequentemente, a diferenciação

osteoclástica (Tada et al., 2005). Paralelamente ao sistema RANK-RANKL, diversas

citocinas atuam ativamente na reabsorção do tecido ósseo promovida pelo CEC oral.

13

Células neoplásicas, com alto potencial de invasão do tecido ósseo, expressam

elevados níveis de IL 6 e são capazes de promover a osteoclastogênese (Kayamori et

al., 2010). Por outro lado, a inibição dessa citocina reduz a invasão óssea pelo CEC

oral (Okamoto et al., 2000). Diversos estudos in vitro e in vivo demonstraram a síntese

de outras citocinas e fatores pelas células neoplásicas, incluindo IL 1α/β, IL 6, IL 8, IL

11, TNF-α e PTHrP (Jimi et al., 2011). Em um estudo sobre o perfil de expressão de

citocinas em CECs orais com invasão óssea, notaram-se níveis significativamente

maiores de IL 6, IL 11 e TNF-α, indicando sua importância nesse fenômeno (Shibahara

et al., 2005). As quimiocinas, uma subfamília das citocinas, exercem seus efeitos por

meio de receptores de membrana acoplados à proteína G (Zlotnik & Yoshie, 2000;

Sarvaiya et al., 2013). Essas moléculas, presentes na MEC óssea e secretadas por

células neoplásicas, ativam, direta ou indiretamente, as células osteoclásticas (Bonfil et

al., 2007; Lee et al., 2012; Palacios-Arreola et al., 2014). Pandruvada et al. (2010)

demonstraram que a quimiocina CXCL13 derivada de CEC oral promove a quimiotaxia

de monócitos do sangue periférico, contribuindo para a formação dos osteoclastos.

Recentemente, Oue et al. (2012) relataram que a quimiocina CXCL2 secretada pelo

CEC oral induz a osteoclastogênese pelo aumento dos níveis de expressão de RANKL

e redução de OPG em células do estroma tumoral. Contudo, essa quimiocina pode

atuar diretamente na diferenciação osteoclástica, promovendo migração, proliferação e

fusão de células precursoras mononucleares (Ha et al., 2010). O PTHrP é responsável

pela ativação osteoclástica e reabsorção do tecido ósseo em diversas neoplasias

(Kayamori et al., 2010; Cafforio et al., 2014). Essa molécula foi descrita inicialmente

como o principal fator de hipercalcemia associada à malignidade (Nakajima et al.,

2013) e é altamente expressa em CECs que invadem o osso (Shibahara et al., 2005;

Deyama et al., 2008). O PTHrP pode atuar de modo sinérgico com outras moléculas

presente no microambiente tumoral, como TGF-β (Takayama et al., 2010). Com a

reabsorção óssea, os níveis de TGF-β aumentam no microambiente tumoral, induzindo

a expressão de PTHrP pelas células neoplásicas. Além desse efeito, o TGF-β promove

a transição epitélio-mesenquimal e, consequentemente, a invasão do CEC oral no

tecido ósseo (Takayama et al., 2010; Quan et al., 2013). Na fase final de invasão, com

a intensa reabsorção do tecido ósseo pelo CEC oral, fatores de crescimento, citocinas

14

e outras moléculas bioativas que estavam incorporadas na MEC mineralizada tornam-

se disponíveis e atuam sobre as células neoplásicas e os demais elementos do

microambiente tumoral, o que inclui o estímulo à osteoclastogênese, estabelecendo,

assim, um círculo vicioso que acelera o processo de reabsorção óssea (Shimo et al.,

2008; Goda et al., 2010; Chappard et al., 2011; Krishnan et al., 2014).

Considerando a complexidade das interações celulares e moleculares que

influenciam a reabsorção óssea induzida pelo CEC oral, é relevante que novos estudos

avaliem os efeitos recíprocos entre os diferentes tipos celulares envolvidos, i.e. células

do parênquima e do estroma tumoral e células ósseas, para identificar moléculas que

promovam os processos de invasão e destruição óssea e, assim, definir possíveis

marcadores prognósticos e potenciais alvos terapêuticos.

15

3 PROPOSIÇÃO

3.1 Objetivo geral

Investigar os efeitos da OPN em sistemas de cocultura de células osteoblásticas

e epiteliais neoplásicas malignas humanas sobre o fenótipo neoplásico e a ativação

osteoclástica.

3.2 Objetivos específicos

1. Determinar o perfil de expressão de OPN em culturas de células

osteoblásticas e epiteliais neoplásicas malignas humanas isoladamente e em sistema

de coculturas.

2. Verificar o efeito da OPN produzida por células osteoblásticas sobre a

expressão gênica e o fenótipo de células epiteliais neoplásicas malignas humanas em

cocultura.

3. Analisar os efeitos da OPN secretada nas coculturas sobre a atividade

osteoclástica e citocinas envolvidas na diferenciação e ativação osteoclástica.

16

17

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Culturas celulares

4.1.1 Obtenção e cultura de SAOS-2

Células SAOS-2 (ATCC, Manassas, VA, EUA) foram descongeladas e

transferidas para tubos de centrífuga contendo 10 mL de McCoy's 5A (Sigma, St. Louis,

MO, EUA) e centrifugadas a 336 g por 3 min. O sobrenadante foi desprezado e as

células foram cultivadas em frascos de cultura de 75 cm2 (Corning Incorporated,

Costar, Corning, Nova York, NY, EUA) contendo McCoy's 5A (Sigma) suplementado

com 15% de soro fetal bovino (Gibco, Invitrogen, Grand Island, Nova York, NY, EUA),

100 IU/mL de penicilina (Invitrogen) e 50 µg/mL estreptomicina (Invitrogen). Na

subconfluência, foi removido o meio de cultura e adicionada solução de tripsina a

0,25% (Gibco) e EDTA a 1 mM (Gibco) para obtenção de suspensão de células. Em

seguida, foram plaqueadas 2x104 células/poço em placas de poliestireno de 24 poços

(Corning Incorporated) e cultivadas em McCoy's 5A (Sigma) suplementado com 10%

de soro fetal bovino (Gibco), 7 mM de β-glicerofosfato (Sigma), 5 µg/mL de ácido

ascórbico (Gibco), 100 IU/mL de penicilina (Invitrogen) e 50 µg/mL estreptomicina

(Invitrogen). As culturas foram mantidas por períodos de até 10 dias e sua progressão

foi avaliada em microscópio de fase invertido (Axiovert 25, Zeiss, Jena, Alemanha). O

meio de cultura foi trocado a cada 2 ou 3 dias. Durante todo o tempo de cultivo as

células foram mantidas a 37ºC em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 e 95%

de ar atmosférico.

4.1.2 Obtenção e cultura de SCC-9

Células SCC9 (ATCC) foram descongeladas e transferidas para tubos de

centrífuga contendo 10 mL de DMEM/Ham’s F12 (Gibco) e centrifugadas a 336 g por 3

min. O sobrenadante foi desprezado e as células foram cultivadas em frascos de

cultura de 75 cm2 (Corning Incorporated) contendo DMEM/Ham’s F12 (Gibco)

suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco), 50 μg/mL de vancomicina (Acros

18

Organics, Geel, Antwerp, Bélgica), 50 µg/mL gentamicina (Invitrogen) e 0,4 μg/mL de

hidrocortisona (Sigma). Na subconfluência, foi removido o meio de cultura e adicionada

solução de tripsina a 0,25% (Gibco) e EDTA a 1 mM (Gibco) para obtenção de

suspensão de células. Em seguida, foram plaqueadas 2x104 células/poço em placas de

poliestireno de 24 poços (Corning Incorporated). As culturas foram mantidas por

períodos de até 10 dias e sua progressão foi avaliada em microscópio de fase invertido

(Zeiss). O meio de cultura foi trocado a cada 2 ou 3 dias. Durante todo o tempo de

cultivo as células foram mantidas a 37ºC em atmosfera umidificada contendo 5% de

CO2 e 95% de ar atmosférico.

4.1.3 Obtenção e cultura de U-937

Células U-937 (ATCC) foram descongeladas e transferidas para tubos de

centrífuga contendo 10 mL de RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA)

e centrifugadas a 336 g por 3 min. O sobrenadante foi desprezado e as células foram

cultivadas em frascos de cultura de 75 cm2 (Corning Incorporated) contendo RPMI

1640 (Life Technologies) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco), 100

IU/mL de penicilina (Invitrogen) e 50 µg/mL estreptomicina (Invitrogen). Para induzir à

diferenciação osteoclástica, as células foram cultivadas com RPMI 1640 suplementado

com 12-O-tetradecanoilforbol 13-acetato (TPA; Sigma) na concentração de 10-7 M.

Após 48 h, o meio foi removido e as culturas foram lavadas uma vez com RPMI 1640

para remover as células não aderidas. Em seguida, foi acrescentado RPMI 1640

suplementado com 1,25 dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3; Sigma) na concentração de

10-8 M por 6 dias (Amoui et al., 2004). A progressão da cultura foi avaliada em

microscópio de fase invertido (Zeiss) e o meio de cultura, trocado a cada 2 ou 3 dias.

Durante todo o tempo de cultivo as células foram mantidas a 37ºC em atmosfera

umidificada contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico.

19

4.2 Análise do perfil de expressão de OPN em células SAOS-2 e SCC9

Para determinar o perfil de expressão de OPN, foram realizadas: 1) detecção de

OPN por imunofluorescência indireta; 2) expressão de OPN por Real Time PCR e 3)

quantificação de OPN por ELISA, conforme metodologia descrita a seguir:

4.2.1 Imunolocalização de OPN por imunofluorescência indireta

Aos 3, 5, 7 e 10 dias, as culturas foram fixadas em paraformaldeído a 4% em PB

a 0,1 M, pH 7,2, por 10 min à TA. Em seguida, as células foram processadas

rotineiramente para imunofluorescência indireta (Schwartz Fo et al., 2007). A

permeabilização foi feita com solução de Triton X-100 a 0,5% em PB por 10 min,

seguida de bloqueio com leite desnatado a 5% em PB por 30 min. Anticorpo primário

para OPN (1:800, MPIIIB10-1, DSHB, Iowa City, IA, EUA) foi utilizado, seguido de

anticorpo secundário conjugado com fluoróforo Alexa Fluor 594 (fluorescência

vermelha; 1:200, Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) em mesma solução de faloidina

conjugada com Alexa Fluor 488 (fluorescência verde; 1:200, Molecular Probes), usada

para visualização do citoesqueleto de actina. A incubação do anticorpo foi feita em

atmosfera úmida por 60 min em TA. Entre cada incubação, as amostras foram lavadas

três vezes (5 min cada) em PB. Antes da montagem para observação microscópica, as

amostras foram lavadas rapidamente com água bidestilada e os núcleos celulares,

marcados com DAPI (Molecular Probes) a 300 nM por 5 min. As lamínulas de

Thermanox® (Nunc Inc., Rochester, NY, EUA) foram montadas sobre lâminas de vidro

com meio de montagem anti-fade (Vectashield, Vector Labs, Burlingame, CA, EUA) e

examinadas utilizando microscópio de fluorescência Zeiss modelo AxioImager M2

(Zeiss), acoplado a uma câmara digital AxioCam MRm. As imagens adquiridas foram

processadas com o programa Adobe Photoshop CS5.1.

20

4.2.2 Expressão de OPN por Real Time PCR

As reações de Real Time PCR foram feitas utilizando-se o sistema TaqMan

(Invitrogen), no aparelho CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). Após o

período de 3, 5, 7 e 10 dias, as células foram coletadas com o reagente Trizol (Gibco) e

a extração do RNA total foi realizada por meio do kit SV Total RNA Isolation System

(Promega, Madison, WI, EUA), de acordo com especificações do fabricante.

Posteriormente, a concentração e a pureza do RNA total foram avaliadas por

espectrofotometria em aparelho NanoVue Plus (GE Healthcare Life Sciences,

Piscataway, NJ, EUA). A leitura foi realizada em diferentes comprimentos de onda (260

nm, 280 nm e 230 nm), para obtenção da concentração de RNA/µL e detecção de

contaminação das amostras por proteínas e fenol. A integridade do RNA foi verificada

previamente aos ensaios de Real Time PCR pela visualização de duas subunidades

ribossômicas características de células eucarióticas (18S e 28S). Essa análise foi

realizada por meio do aparelho 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara,

CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Foram consideradas amostras

viáveis para realização da Real Time PCR aquelas que apresentavam valores de RIN

superiores a 8 (escores variando de 0 a 10; consulte-se o Apêndice 1). Em seguida, foi

confeccionada a fita de cDNA a partir de 1 µg de RNA total. Esse procedimento foi feito

no termociclador Mastercycle Gradient (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) por meio de

reação com a enzima transcriptase reversa, utilizando-se o kit High-capacity cDNA

Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As reações de

Real Time PCR foram realizadas em triplicata com volume final de 10 µL e quantidade

de cDNA correspondente a 11,25 ng do RNA inicial. A reação de amplificação foi

composta por: a) 50°C por 2 min; b) 95°C por 10 min, e c) 40 ciclos a 95°C por 15 s e

60°C por 1 min (desnaturação e extensão). Os resultados foram analisados com base

no valor de Ct, sendo esse o ponto correspondente ao número de ciclos em que a

amplificação das amostras atinge um limiar (determinado entre o nível de fluorescência

dos controles negativos e a fase de amplificação exponencial das amostras), que

permitiu a análise quantitativa da expressão do gene avaliado. Como controle

endógeno, foi avaliada a expressão do gene β-actina. A expressão do controle

21

endógeno foi utilizada para a normalização dos níveis de expressão do gene alvo. Uma

amostra negativa (água) foi submetida à reação com cada uma das sondas utilizadas.

O método de 2-ΔΔCT (Livak & Schmittgen, 2001) foi utilizado para determinar a

expressão de OPN das células osteoblásticas e epiteliais neoplásicas, isoladas e em

sistemas de cocultura.

4.2.3 Quantificação de OPN por ELISA

Ao final de 3, 5, 7 e 10 dias, o sobrenadante das culturas foi coletado para

quantificação de OPN. Brevemente, o meio de cultura foi removido 24 h antes de cada

tempo experimental, e foram acrescentados 500 µL do meio de cultura sem soro. Em

seguida, o meio foi coletado e centrifugado a 336 g por 10 min. Após a centrifugação,

apenas a fração superior foi coletada para eliminar qualquer contaminação celular.

Posteriormente, foi adicionado 1 µL do coquetel de inibidor de protease (Sigma), sendo

o meio aliquotado em tubos Eppendorf de 1,5 mL e estocados em freezer -80°C até o

momento do uso. Para a realização desta técnica foi utilizado o kit DuoSet para OPN

humana (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA), seguindo-se as orientações do

fabricante. Os valores obtidos de expressão de OPN foram normalizados pelo número

de células.

4.3 Análise do perfil de expressão de OPN em coculturas de SAOS-2/SCC9

O efeito do microambiente tumoral sobre o perfil de expressão de OPN foi

avaliado por meio do cocultivo de células SAOS-2 e SCC9, conforme protocolo descrito

no item 4.3.1. Foram avaliadas: 1) detecção de OPN por imunofluorescência indireta; 2)

expressão de OPN por Real Time PCR e 3) quantificação de OPN por ELISA, descritas

nos itens 4.2.1, 4.2.2 e 4.2.3. Especificamente para o ensaio de ELISA, 24 h antes de

cada tempo experimental, as células SAOS-2 e SCC9 em cocultura foram separadas,

acrescentados 500 µL de meio sem soro por 24 h para, em seguida, ser coletado e

centrifugado a 336 g por 10 min. Após a centrifugação, apenas a fração superior foi

coletada para eliminar qualquer contaminação celular. Posteriormente, foi adicionado 1

22

µL do coquetel de inibidor de protease (Sigma), sendo o meio aliquotado em tubos

Eppendorf de 1,5 mL e estocados em freezer -80°C até o momento do uso.

4.3.1 Coculturas de SAOS-2/SCC9

SAOS-2 foram plaqueadas na densidade de 2x104 células/poço em placas de

poliestireno de 24 poços (Corning Incorporated) e cultivadas na presença de McCoy's

5A (Sigma) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco), 7 mM de β-

glicerofosfato (Sigma), 5 µg/mL de ácido ascórbico (Gibco), 100 IU/mL de penicilina

(Invitrogen) e 50 µg/mL estreptomicina (Invitrogen). Em seguida, SCC9 foram

plaqueadas sobre membranas de Transwell® (Corning Incorporated), com poro de 0,4

µm, posicionadas sobre a cultura de SAOS-2. A densidade de plaqueamento foi de 104

células/Transwell®.

4.4 Avaliação do efeito da OPN secretada por SAOS-2 sobre a expressão gênica e

o fenótipo de células SCC9 em cocultura

As respostas de células SCC9 cocultivadas com SAOS-2 foram avaliadas sob as

seguintes condições experimentais:

Cocultura: SCC9 foram cocultivadas durante o pico de expressão de OPN em

culturas de SAOS-2.

Cocultura+RNAi: SCC9 foram cocultivadas com SAOS-2 em que a expressão

de OPN foi silenciada por RNAi.

SCC9: SCC9 cultivadas isoladamente (controle).

4.4.1 Silenciamento do transcrito do gene da OPN por RNAi

O silenciamento gênico da OPN foi realizado por meio da técnica de RNAi,

utilizando-se pequenas moléculas de RNA dupla fita, conhecidas como siRNA, que

possuem sequência específica complementar ao RNAm alvo. Para o presente estudo,

foram adquiridas sequências pré-desenhadas de oligonucleotídeos complementares ao

RNAm da OPN (Silencer® Select siRNA; ID: s13376; Invitrogen) e como agente de

23

transfecção foi utilizada a lipofectamina (Lipofectamine® RNAiMAX Transfection

Reagent; Invitrogen). A eficiência da transfecção foi avaliada por meio do bloqueio do

gene GAPDH. Os resultados dos ensaios de silenciamento estão descritos no

Apêndice 2.

Para análise dos efeitos da OPN derivada de células SAOS-2 sobre o fenótipo

neoplásico foram avaliados os seguintes parâmetros:

4.4.2 Adesão celular

Para a quantificação da adesão celular, as células SCC9 foram avaliadas em 4 e

24 h de cocultivo com SAOS-2, sob as condições experimentais descritas no item 4.4.

Após cada período, o Transwell® (Corning) contendo as células foi transferido para uma

nova placa e os poços foram lavados três vezes com PBS (Gibco) aquecida a 37ºC

para remover as células não aderidas. Em seguida, cada Transwell® foi preenchido

com 200 µL de uma solução de EDTA a 1 mM e tripsina a 0,25% (Gibco) para remover

as células aderidas. O número de células foi contado utilizando hemocitômetro (Fischer

Scientific). A adesão celular foi expressa como porcentagem do número de células

aderidas em relação ao número inicialmente plaqueado (104células/Transwell®).

4.4.3 Proliferação celular

A proliferação celular foi expressa em termos de proporção de células no ciclo

celular por imunomarcação ao antígeno nuclear Ki-67, expresso apenas por células

durante o ciclo celular e não por células em G0 (Scholzen & Gerdes, 2000). Foram

avaliados, por imunofluorescência indireta, 5 espécimes de cada grupo experimental,

em objetiva de 20X, determinando-se a proporção de células Ki-67 positivas de um

total de células aderidas e espraiadas não inferior a 100 (3 a 5 campos microscópicos),

quantificadas pela marcação do DNA nuclear por DAPI (De Oliva et al., 2009). O

método de imunofluorescência indireta está descrito no item 4.2.1.

24

4.4.4 Migração celular

Para o ensaio de migração celular, células SCC9 foram ressuspendidas em 200

μL de McCoy's 5A na ausência de soro e plaqueadas sobre Transwell® (poro: 8 µm;

Corning Incorporated) na densidade de 105 células/Transwell®. Em seguida, as células

SCC9 foram cocultivadas com SAOS-2 sob as condições experimentais descritas no

item 4.4. Após 24 h de cocultivo, as células remanescentes localizadas na parte

superior da membrana foram removidas com o auxílio de um swab. Posteriormente, as

células presentes na parte inferior foram fixadas em metanol (Merck, Darmstadt,

Alemanha) por 2 min à TA e coradas com azul de toluidina a 1% por 2 min. A

quantificação da migração celular foi realizada por contagem em microscópio de luz

Leica modelo DMLB (Leica, Bensheim, Alemanha), acoplado à câmera digital

DFC310FX. As imagens adquiridas foram processadas com o programa Adobe

Photoshop CS5.1. Para cada Transwell® foram selecionados quatro campos aleatórios

em objetiva de 20x. Os dados obtidos foram expressos em porcentagem de migração.

4.4.5 Invasão celular

O ensaio de invasão foi realizado utilizado-se o kit BD BioCoat™ Matrigel™

Invasion Chamber (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA). Esse sistema é composto por

placas de 24 poços contendo Transwell® de politereftalato de etila com poros de 8 μm

recobertos por uma camada fina e uniforme de Matrigel. Esse revestimento mimetiza in

vitro a membrana basal e impede a passagem de células não invasivas pelos poros da

membrana. Para realização deste ensaio, células SCC9 foram ressuspendidas em 200

μL de McCoy's 5A na ausência de soro e plaqueadas sobre BD BioCoat™ Matrigel™

Invasion Chamber na densidade de 105 células/Transwell®. Em seguida, as células

SCC9 foram cocultivadas com SAOS-2 sob as condições experimentais descritas no

item 4.4. Após 24 h de cocultivo, as células remanescentes localizadas na parte

superior da membrana foram removidas com o auxílio de um swab. Posteriormente, as

células presentes na parte inferior foram fixadas em metanol (Merck) por 2 min à TA e

coradas com azul de toluidina a 1% por 2 min. A quantificação da invasão celular foi

25

realizada por contagem em microscópio de luz Leica modelo DMLB (Leica, Bensheim,

Alemanha), acoplado à câmera digital DFC310FX. As imagens adquiridas foram

processadas com o programa Adobe Photoshop CS5.1. Para cada Transwell® foram

selecionados quatro campos aleatórios em objetiva de 20x. Os dados obtidos foram

expressos em porcentagem de invasão, determinada a partir do quociente entre

número de células que invadiram pela média das células que migraram.

4.4.6 PCR Array

A técnica PCR Array permite a análise simultânea de 84 genes envolvidos em

vias específicas de sinalização. Para a reação de PCR Array, foram adicionados em

um tubo Falcon: 1350 μL do tampão 2X SuperArray RT2 qPCR Master Mix; 102 μL de

reação de síntese de cDNA (descrita no item 4.2.2) diluídos 5,6 vezes e 1248 μL de

água deionizada. Foram adicionados 25 μL dessa mistura em cada poço da placa já

contendo pares de primers liofilizados. Em seguida, a reação de Real Time PCR foi

executada no aparelho CFX96 (BioRad) e os cálculos realizados pelo Software RT2

Profiler PCR Array Data Analysis (QIAGEN, Valencia, CA, EUA). Genes apresentando

valores de Ct acima de 35 foram considerados não expressos. No Anexo (consulte-se

Tabela 2) encontra-se a tabela contendo os genes envolvidos nos processos de

invasão e metástase presentes na placa de PCR Array.

A normalização e quantificação relativa da expressão gênica foram realizadas

pelo método de 2-ΔΔCT (Livak & Schmittgen, 2001). Usando esse método, os dados

foram representados como diferença (em vezes) na expressão gênica, que foi

normalizada pela média geométrica dos genes endógenos β-actina e GAPDH e relativa

ao controle, composto por culturas de SCC9 crescidas isoladamente.

26



diferenciação e ativação osteoclástica

O efeito da OPN secretada em coculturas de SAOS-2/SCC9 sobre a ativação de

osteoclastos humanos foi avaliado sob as seguintes condições experimentais:

SAOS-2: células osteoclásticas foram expostas ao eluente obtido a partir de

SAOS-2 cultivadas isoladamente.

SAOS-2/Cocultura: células osteoclásticas foram expostas ao eluente obtido a

partir de SAOS-2, após seu cocultivo com SCC9.

SAOS-2/Cocultura+RNAi: células osteoclásticas foram expostas ao eluente

destituído de OPN, obtido a partir de SAOS-2, após seu cocultivo com SCC9.

SCC9: células osteoclásticas foram expostas ao eluente obtido a partir de SCC9

cultivadas isoladamente.

SCC9/Cocultura: células osteoclásticas foram expostas ao eluente obtido a

partir de SCC9, após seu cocultivo com SAOS-2.

SCC9/Cocultura+RNAi: células osteoclásticas foram expostas ao eluente

destituído de OPN, obtido a partir de SCC9, após seu cocultivo com SAOS-2.

Para obtenção dos eluentes, após o cocultivo, as células foram separadas e

cultivadas em meio sem soro por 24 h. Após esse período, os meios foram coletados e

centrifugados a 336 g por 5 min. Em seguida, os meios foram aliquotados em tubos

Eppendorf de 1,5 mL e estocados em freezer -80°C até o momento do uso.

4.5.1 Avaliação da atividade osteoclástica por meio do ensaio de reabsorção de fosfato

de cálcio

Para avaliação da atividade osteoclástica foi utilizado o sistema BD BioCoat™

Osteologic™ Bone Cell Culture (BD Biosciences). Esse sistema é composto por uma

fina lâmina de fosfato de cálcio sintético, o qual fornece um substrato sólido e uniforme

27

que pode ser utilizado para caracterizar e mensurar áreas de reabsorção formadas por

osteoclastos. Sendo assim, para avaliar a atividade de osteoclastos por meio do ensaio

de reabsorção de fosfato de cálcio, células U-937 foram cultivadas em placas de 12

poços BD BioCoat™ Osteologic™ Bone Cell Culture (BD Biosciences), na densidade

de 3,2x105 células/poço. No 6o dia de cultura, o meio foi removido e as células foram

cultivadas com os eluentes por 10 dias. Os eluentes eram trocado a cada 2 dias. Como

controle negativo, dois poços desse sistema foram incubados com meio de cultura na

ausência de células. Ao final de 10 dias, o meio foi removido e os poços foram lavados

com água milli-Q. Em seguida, foi acrescentada solução alvejante contendo hipoclorito

de sódio a 6% (Rioquímica, São José do Rio Preto, SP, Brasil) e NaCl a 5,2% (Merck)

e os poços foram deixados à TA por 5 min, para remoção das células aderidas.

Posteriormente, os poços foram lavados três vezes com água destilada e deixados à

TA para secagem. Para quantificação das áreas de reabsorção foram selecionados

aleatoriamente 10 campos de cada grupo experimental utilizando-se a objetiva de 10X

em microscópio de luz Leica modelo DMLB (Leica), acoplado à câmera digital

DFC310FX. As imagens adquiridas foram processadas com o programa Adobe

Photoshop CS5.1. Com auxílio de um analisador de imagens (Image Tool, University of

Texas Health Science Center, San Antonio, TX, EUA), as áreas de reabsorção foram

quantificadas e os dados foram expressos em porcentagem de áreas de reabsorção.

4.5.2 Quantificação de RANKL, OPG, PTHrP e citocinas inflamatórias por ELISA

Para avaliar o papel da OPN em sistemas de cocultura de SAOS-2/SCC9 sobre

a síntese de citocinas envolvidas na ativação osteoclástica, foram quantificadas as

expressões de RANKL, OPG, PTHrP e citocinas inflamatórias (IL 1α, IL 1β, IL 6, IL 8,

TNF-α e GM-CSF), a partir do eluente obtido dos grupos descritos no item 4.5. Para a

realização destes ensaios foram utilizados os kits: 1) Human TRANCE/RANK

L/TNFSF11 DuoSet (R&D Systems) 2) Human Osteoprotegerin/TNFRSF11B DuoSet

(R&D Systems); 3) Human PTHrP (Uscn Life Science, Wuhan, China); 4) Multi-Analyte

ELISArray™ Kit para citocinas inflamatórias humanas (QIAGEN). Todos os ensaios

foram realizados de acordo com as instruções dos fabricantes.

28

4.6 Análise estatística

Os dados quantitativos foram submetidos ao teste não paramétrico de Kruskal-

Wallis, seguido de pós-teste, quando apropriado. Os experimentos foram realizados em

triplicata. O nível de significância estabelecido foi de 5%.

A análise estatística dos resultados do PCR Array foi realizada por meio do

Software RT2 Profiler PCR Array Data Analysis (QIAGEN). O software realizou o teste t

entre o grupo controle (SCC9) e cada grupo experimental (Cocultura e

Cocultura+RNAi), sendo os valores posteriormente submetidos ao teste de correção de

Benjamini-Hochberg. Foram apresentados apenas os dados com cut-off de 1,5. Os

experimentos foram realizados em triplicata. O nível de significância estabelecido foi de

5%.

29

5 RESULTADOS

5.1 Análise do perfil de expressão de OPN em células SAOS-2 e SCC9


Em células SAOS-2, a epifluorescência revelou marcação positiva para OPN em

região perinuclear em todos os tempos avaliados (Figura 1A, C, E e G). Em culturas

SCC9, eram raras as áreas positivamente marcadas para OPN. Quando detectadas,

particularmente nos períodos de 3 e 10 dias, exibiam o mesmo padrão perinuclear

observado em células SAOS-2 (Figura 1B e H).

30

Figura 1. Epifluorescência de culturas de células SAOS-2 (A, C, E e G) e SCC9 (B, D, F e H) aos 3 (A-

B), 5 (C-D), 7 (E-F) e 10 (G-H) dias. Cor vermelha para marcação de OPN, cinza para o citoesqueleto de

actina e azul para os núcleos celulares. Barra de escala = 100 µm.

31


A expressão de RNAm para o gene da OPN foi distinta entre as duas linhagens

celulares e afetada pelo tempo (Kruskal-Wallis, p < 0,05). Os resultados indicaram

maiores níveis de RNAm em culturas SAOS-2 aos 7 e 10 dias em comparação àqueles

observados para SCC9 (Figura 2).

Figura 2. Expressão relativa de RNAm para OPN em culturas de células SAOS-2 e SCC9, avaliada aos

3, 5, 7 e 10 dias. Os dados foram normalizados pelo gene constitutivo β-actina e calibrados pelo período

de 3 dias. Barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p >

0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.


A quantificação de OPN no sobrenadante das culturas indicou expressão

diferencial entre as linhagens SAOS-2 e SCC9 (Kruskal-Wallis, p < 0,05). Aos 3 dias,

em culturas de SAOS-2 e SCC9, não foram observados níveis detectáveis de OPN.

Contudo, a partir do 5o dia de cultivo, notou-se expressão crescente de OPN para

ambas as linhagens, sendo os maiores valores observados em culturas SAOS-2

(Figura 3).

0

1

2

3

4

5

3 5 7 10

Exp

ressão

rela

tiv

a d

e R

NA

m

Período (dias)

Expressão de OPN

SAOS-2

SCC9a a

b c

d

, e

f

d

32

Figura 3. Quantificação de OPN em sobrenadante de culturas de células SAOS-2 e SCC9, avaliada aos

3, 5, 7 e 10 dias. Barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre

si (p > 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.

5.2 Análise do perfil de expressão de OPN em coculturas de SAOS-2/SCC9


O cocultivo de SAOS-2 com SCC9 resultou em aumento da expressão de OPN

em ambas as linhagens, particularmente no 10o dia, como notado, por simples

observação, por epifluorescência, em comparação com as células cultivadas

isoladamente (Figuras 4 e 5). Em todos os tempos avaliados e para ambas as

condições experimentais (células isoladas ou em cocultura), a marcação para OPN era

citoplasmática, predominantemente em região perinuclear.

0

2

4

6

8

10

3 5 7 10

pg

/10

4célu

las

Período (dias)

Quantificação de OPN Extracelular

SAOS-2

SCC9

a

c

d

b a

e

33

Figura 4. Epifluorescência de culturas de células SAOS-2 crescidas isoladamente (A, C, E e G) ou

cocultivadas com SCC9 (B, D, F e H), aos 3 (A-B), 5 (C-D), 7 (E-F) e 10 (G-H) dias. Em vermelho,

marcação para OPN, cinza para o citoesqueleto de actina e azul para os núcleos celulares. Nota-se um

aumento moderado no número de células OPN positivas para SAOS-2 em cocultura. Barra de escala =

100 µm.

34

Figura 5. Epifluorescência de culturas de células SCC9 crescidas isoladamente (A, C, E e G) ou

cocultivadas com SAOS-2 (B, D, F e H), aos 3 (A-B), 5 (C-D), 7 (E-F) e 10 (G-H) dias. Em vermelho,

marcação para OPN, cinza para o citoesqueleto de actina e azul para os núcleos celulares. Nota-se um

aumento moderado no número de células OPN positivas para SCC9 em cocultura. Barra de escala = 100

µm.

35


Detectou-se uma expressão diferencial para os níveis de RNAm para OPN entre

culturas SAOS-2 crescidas isoladamente e cocultivadas com SCC9 (Kruskal-Wallis, p <

0,05). Níveis significativamente maiores de expressão de OPN ocorreram para SAOS-2

em cocultura, particularmente no 10o dia (Figura 6). Resultados semelhantes foram

observados para SCC9 em cocultura (Kruskal-Wallis, p < 0,05, Figura 7).

Figura 6. Expressão relativa de RNAm para OPN em culturas de células SAOS-2 crescidas

isoladamente ou cocultivadas com SCC9, avaliada aos 3, 5, 7 e 10 dias. Os dados foram normalizados

pelo gene constitutivo β-actina e calibrados pelo período de 3 dias de culturas SAOS-2 crescidas

isoladamente. Barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre si

(p > 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

SAOS-2ISOLADA

SAOS-2COCULTURA

SAOS-2ISOLADA

SAOS-2COCULTURA

SAOS-2ISOLADA

SAOS-2COCULTURA

SAOS-2ISOLADA

SAOS-2COCULTURA

3º dia 5º dia 7º dia 10º dia

Exp

ressão

rela

tiv

a d

e R

NA

m

Expressão de OPN

a b b

c

d c

e

f

36

Figura 7. Expressão relativa de RNAm para OPN em culturas de células SCC9 crescidas isoladamente

ou cocultivadas com SAOS-2, avaliada aos 3, 5, 7 e 10 dias. Os dados foram normalizados pelo gene

constitutivo β-actina e calibrados pelo período de 3 dias de culturas SCC9 crescidas isoladamente.

Barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os

dados são apresentados como média ± desvio padrão.


A quantificação de OPN em sobrenadante de SAOS-2 cocultivada com SCC9

revelou níveis significativamente maiores da proteína em comparação aos de

sobrenadante de SAOS-2 isolada (Kruskal-Wallis, p < 0,05; Figura 8). Resultados

semelhantes foram observados para sobrenadante de SCC9 em cocultura, em

comparação ao de SCC9 isolada (Kruskal-Wallis, p < 0,05; Figura 9). Aos 3 dias, não

foram observados níveis detectáveis de OPN em sobrenadantes de ambas as

linhagens celulares (Figuras 8 e 9).

0

1

2

3

4

5

SCC9ISOLADA

SCC9COCULTURA

SCC9ISOLADA

SCC9COCULTURA

SCC9ISOLADA

SCC9COCULTURA

SCC9ISOLADA

SCC9COCULTURA


Exp

ressão

rela

tiv

a d

e R

NA

m

Expressão de OPN

a

b b

c

d

c

c

e

37

Figura 8. Quantificação de OPN em sobrenadante de culturas SAOS-2 crescidas isoladamente ou em

cocultura com células SCC9, avaliada aos 3, 5, 7 e 10 dias. Barras que apresentam letras semelhantes

não são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são apresentados como média ±

desvio padrão.

Figura 9. Quantificação de OPN em sobrenadante de culturas SCC9 crescidas isoladamente ou em

cocultura com células SAOS-2, avaliada aos 3, 5, 7 e 10 dias. Barras que apresentam letras

semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são apresentados como

média ± desvio padrão.

0

4

8

12

16

20

SAOS-2ISOLADA

SAOS-2COCULTURA

SAOS-2ISOLADA

SAOS-2COCULTURA

SAOS-2ISOLADA

SAOS-2COCULTURA

SAOS-2ISOLADA

SAOS-2COCULTURA


pg

/10

4célu

las


0

1

2

3

4

SCC9ISOLADA

SCC9COCULTURA

SCC9ISOLADA

SCC9COCULTURA

SCC9ISOLADA

SCC9COCULTURA

SCC9ISOLADA

SCC9COCULTURA


pg

/10

4célu

las


a b

c

d

e

f

a b

c

d

e

f

38

5.3 Avaliação do efeito da OPN secretada por células SAOS-2 sobre a expressão

gênica e o fenótipo de células SCC9 em cocultura

5.3.1 Adesão celular

Em 4 h, não se observaram diferenças significantes entre os grupos em relação

ao número de células SCC9 aderidas ao Transwell® (Kruskal-Wallis, p > 0,05).

Contudo, em 24 h, notou-se maior número de células aderidas no grupo Cocultura em

comparação aos demais (Kruskal-Wallis, p < 0,05). Não houve diferenças significantes

entre Cocultura+RNAi e SCC9 (Figura 10).

Figura 10. Adesão de células SCC9 cocultivadas com células SAOS-2 durante o pico de expressão de

OPN (Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição (Cocultura+RNAi), expressa como

porcentagem de células aderidas em relação ao número inicialmente plaqueado no Transwell® (10

4

células), em 4 e 24 h. Células SCC9 cultivadas isoladamente foram utilizadas como controle (SCC9). Em

cada tempo, barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p

> 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.

0

5

10

15

20

25

30

4 24

% d

e c

élu

las a

deri

das

Período (horas)

Adesão celular

SCC9

Cocultura

Cocultura+RNAia a a

b

a a

39

5.3.2 Proliferação celular

Em 24 h, a proporção de células SCC9 Ki-67 positivas foi maior para o grupo

Cocultura em comparação aos demais (Kruskal-Wallis, p < 0,05) e semelhante entre os

grupos Cocultura+RNAi e SCC9 (Figuras 11 e 12).

Figura 11. Epifluorescência de células SCC9 cocultivadas com SAOS-2, durante o pico de expressão de

OPN (Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição (Cocultura+RNAi). Células SCC9 crescidas

isoladamente foram utilizadas como controle (SCC9). Fluorescência vermelha indica células no ciclo

celular, em atividade proliferativa (Ki-67 positivas). Em azul, DNA nuclear. Barra de escala = 100 µm.

Figura 12. Proliferação de células SCC9 cocultivadas com células SAOS-2, durante o pico de expressão

de OPN (Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição (Cocultura+RNAi), expressa como

porcentagem de células Ki-67 positivas. Células SCC9 cultivadas isoladamente foram utilizadas como

controle (SCC9). Barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre

si (p > 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.

0

5

10

15

20

25

SCC9 Cocultura Cocultura+RNAi

% d

e c

élu

las k

i-67 p

osit

ivas

Proliferação celular

a

b

a

40

5.3.3 Migração celular

Em 24 h, não se observaram diferenças significantes entre os grupos para a

migração de células SCC9 (Kruskal-Wallis, p > 0,05; Figuras 13 e 14).

Figura 13. Migração de células SCC9 cocultivadas com SAOS-2, durante o pico de expressão de OPN

(Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição (Cocultura+RNAi), coradas por azul de toluidina.

Células SCC9 crescidas isoladamente foram utilizadas como controle (SCC9). Notam-se células

espraiadas na superfície inferior do Transwell®, voltada para a cultura SAOS-2, em quantidades

semelhantes entre os grupos. Barra de escala = 100 µm.

Figura 14. Migração de células SCC9 cocultivadas com SAOS-2, durante o pico de expressão de OPN

(Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição (Cocultura+RNAi), expressa como porcentagem de

migração celular. Células SCC9 cultivadas isoladamente foram utilizadas como controle (SCC9). Barras

que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados

são apresentados como média ± desvio padrão.

0

20

40

60

80

100

120


% d

e m

igra

ção

celu

lar

Migração celular

a a a

41

5.3.4 Invasão celular

Em 24 h, maior invasão de Matrigel foi detectada para células SCC9

cocultivadas com SAOS-2 durante o pico de OPN (Cocultura) (Kruskal-Wallis, p < 0,05;

Figuras 15 e 16).

Figura 15. Invasão de células SCC9 em Transwell® recoberto com Matrigel, quando cocultivadas com

SAOS-2 durante o pico de expressão de OPN (Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição

(Cocultura+RNAi), coradas por azul de toluidina. Células SCC9 crescidas isoladamente foram utilizadas

como controle (SCC9). Note-se, para o grupo Cocultura, maior número de células na superfície inferior

do Transwell® (que atravessaram o Matrigel). Barra de escala = 100 µm.

Figura 16. Invasão de células SCC9 em Transwell®

recoberto com Matrigel, quando cocultivadas com

SAOS-2 durante o pico de expressão de OPN (Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição

(Cocultura+RNAi), expressa como porcentagem de invasão celular. Células SCC9 cultivadas

isoladamente foram utilizadas como controle (SCC9). Barras que apresentam letras semelhantes não

são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio

padrão.

0

5

10

15

20

25

30


% d

e i

nv

asão

celu

lar

Invasão celular

a

b

c

42

5.3.5 PCR Array

Células SCC9 cocultivadas com SAOS-2 durante o pico de OPN sobre-

expressaram genes relacionados com adesão e proliferação celulares, remodelação da

MEC e apoptose, nunca superior a 2 vezes dos valores de sobre-expressão em SCC9

expostas a SAOS-2 silenciadas para OPN. Adicionalmente, cerca de 10% dos genes

avaliados em SCC9 foram reprimidos com o silenciamento de OPN (Tabela 1).

Tabela 1. Expressão gênica por PCR Array de células SCC9 cocultivadas com SAOS-2

durante o pico de expressão de OPN (Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição

(Cocultura+RNAi). Os valores foram normalizados pela média geométrica dos genes

constitutivos β-actina e GAPDH e calibrados em relação ao grupo SCC9 (controle). Com cut-off

de 1,5 e p < 0,05, utilizando a correção de Benjamini-Hochberg, valor positivo indica sobre-

expressão, valor negativo, inibição de expressão, e traço, expressão inalterada

Cocultura Cocultura+RNAi

1.63 -

- -2.13

3.06 2.8

5.54 2.78

- -2.13

3.76 1.97

1.83 -

2.32 -

2 -

2.71 2.4

7.12 3.6

- -1.71

3.34 2.23

1.55 1.54

7.08 4.62

1.92 1.62

2.68 1.64

Outras proteínas da MEC

COL4A2

HPSE

CTNNA1

FN1

MGAT5

Proteínas da MEC

TIMP3

Metaloproteinases

MMP2

MMP7

MMP9

MMP10

Inibidores de metaloproteinases

TIMP2

Outros genes relacionados com adesão celular

ITGA7

PNN

VEGFA

Receptores transmembrana

ITGA7

ITGB3

Adesão célula-célula

CDH1 (E-cadherin)

Símbolo/FunçãoExpressão Relativa (fold)

Adesão celular

43

Tabela 1. Continuação


2.09 1.62

2.75 2.86

3.02 2.5

1.58 -

2.36 -

3.46 3.05

5.54 2.78

1.89 -

2.49 2.44

2.03 1.65

2.75 2.86

1.72 -

1.58 -

2.36 -

5.34 5.2

1.99 -

5.54 2.78

5.34 5.2

5.54 2.78

- -2.13

3.14 2.19

1.99 -

2.75 2.86

41.83 28.28

- -2.13

1.56 1.7

2.21 1.64

1.87 -

2.09 1.62

1.89 -

1.7 -

1.54 -

HRAS

MYC

SET

SRC

NR4A3

Outros genes relacionados com proliferação celular

EPHB2

MET

CXCL12

IL18

IL1B

TNFSF10

Receptores

CXCR4

IGF1

VEGFA

Citocinas

CCL7

IL18

VEGFA

Fatores de crescimento e hormônios

IGF1

HRAS

IL1B

KRAS

Regulação negativa da proliferação celular

CTBP1

VEGFA

MYC

RB1

IL1B

MDM2

NF2

NME1

Regulação positiva da proliferação

Ciclo celular

Proliferação celular

NF2

NME1

PTEN


44




diferenciação e ativação osteoclástica


fosfato de cálcio

Observaram-se áreas mais extensas de reabsorção de fosfato de cálcio em

culturas de células osteoclásticas expostas ao eluente obtido de células SCC9 após o

cocultivo com SAOS-2, particularmente com o pico de expressão de OPN

(SCC9/Cocultura) (Kruskal-Wallis, p < 0,05; Figuras 17 e 18). Essas áreas eram

significativamente maiores do que as observadas por efeito de eluentes de células

controles (SAOS-2 e SCC9) e de eluentes de SAOS-2 após o cocultivo com SCC9 nas


- -2.13

2.75 2.86

1.99 -

41.83 28.28

3.28 2.3

1.89 -

- -1.68

1,87 -

2.49 2.44

1.95 1.55

2.52 1.63

3 1.84

2 2.41

- -2.13

1.95 1.85

1.55 -

CD82

KISS1

METAP2

NME4

Outros genes relacionados com invasão e metástase

CTSK

CTSL1

MYCL1

NR4A3

RB1

SMAD4

CHD4

MYC

IL18

TNFSF10

Fatores de transcrição

Aptotose

CXCR4

IL1B


45

duas condições experimentais propostas (Cocultura e Cocultura+RNAi). A exposição

aos eluentes de SAOS-2 após o cocultivo com SCC9, independentemente da

expressão ou não de OPN, resultou em maiores áreas de reabsorção em comparação

àquelas obtidas por efeito de eluentes de SAOS-2 cultivada isoladamente (Kruskal-

Wallis, p < 0,05; Figura 18).

Figura 17. Áreas circulares (brancas) de reabsorção de fosfato de cálcio (escuro), decorrentes da

atividade de células osteoclásticas derivadas da linhagem U-937 após exposição ao eluente obtido de

células SAOS-2 e SCC9 cultivadas isoladamente (A e D) e de células SAOS-2 e SCC9 após o cocultivo

durante o pico de expressão de OPN (B e E) ou com pelo menos 90% de sua inibição (C e F). Barra de

escala = 200 µm.

46

Figura 18. Áreas de reabsorção de fosfato de cálcio decorrentes da atividade de células osteoclásticas,

após exposição ao eluente obtido de células SAOS-2 e SCC9 cultivadas isoladamente e de células

SAOS-2 e SCC9, após o cocultivo durante o pico de expressão de OPN ou com pelo menos 90% de sua

inibição. Barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p >

0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.

5.4.2 Quantificação de RANKL, OPG, PTHrP e citocinas inflamatórias por ELISA

A expressão de IL 6 e IL 8 foi significativamente maior nos grupos SCC9 em

comparação aos grupos SAOS-2 (Kruskal-Wallis, p < 0,05; Figuras 19 e 20). Embora

não tenham sido detectadas diferenças entre SCC9/Cocultura e

SCC9/Cocultura+RNAi, notou-se tendência a maiores níveis de expressão de IL 6 e IL

8 para SCC9/Cocultura (Figuras 19 e 20). Não se detectou a presença de RANKL,

OPG, PTHrP, IL 1α, IL 1β, TNF-α e GM-CSF nos 6 grupos avaliados.

0

10

20

30

40

50

% d

e á

rea r

eab

so

rvid

a

Atividade osteoclástica

a

b b

c

d

e

47

Figura 19. Quantificação da expressão de IL 6 em sobrenadante de culturas de células SAOS-2 e SCC9

cultivadas isoladamente (grupos SAOS-2 e SCC9, respectivamente) e de células SAOS-2 e SCC9 após

o cocultivo durante o pico de expressão de OPN (grupos SAOS-2/Cocultura e SCC9/Cocultura,

respectivamente) ou com pelo menos 90% de sua inibição (grupos SAOS-2/Cocultura+RNAi e

SCC9/Cocultura+RNAi, respectivamente). Barras que apresentam letras semelhantes não são

significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio

padrão.

0

1

2

3

Qu

an

tid

ad

e r

ela

tiv

a

IL 6

a

b

b

48

Figura 20. Quantificação da expressão de IL 8 em sobrenadante de culturas de células SAOS-2 e SCC9

cultivadas isoladamente (grupos SAOS-2 e SCC9, respectivamente) e de células SAOS-2 e SCC9 após

o cocultivo durante o pico de expressão de OPN (grupos SAOS-2/Cocultura e SCC9/Cocultura,

respectivamente) ou com pelo menos 90% de sua inibição (grupos SAOS-2/Cocultura+RNAi e

SCC9/Cocultura+RNAi, respectivamente). Barras que apresentam letras semelhantes não são


padrão.

0

1

2

3

4

5

Qu

an

tid

ad

e r

ela

tiv

a

IL 8

a b

c

d

d

49

6 DISCUSSÃO

Os resultados do presente estudo utilizando a estratégia de cocultivo celular

mostraram que a OPN secretada por células SAOS-2 afeta o fenótipo de culturas

SCC9, promovendo os fenômenos de adesão e proliferação celulares e invasão de

Matrigel, a qual foi estimulada em menor intensidade com o silenciamento para OPN. O

cocultivo com SAOS-2, sobretudo durante o pico de expressão de OPN, resultou na

sobre-expressão das citocinas IL 6 e IL 8 pelas células SCC9, a que se atribuiu a maior

capacidade de células osteoclásticas em reabsorver fosfato de cálcio. Conjuntamente,

esses resultados sugerem que a OPN derivada de osteoblastos afeta as interações

entre as células epiteliais neoplásicas malignas e as células ósseas durante a invasão

do CEC oral no osso.

A OPN tem sido considerada um biomarcador prognóstico para neoplasias

malignas em razão de oscilações em sua expressão exibirem correlação com

diferentes graus de agressividade dos tumores; a sobre-expressão de OPN está

associada ao desenvolvimento de fenótipos neoplásicos mais agressivos (Wai & Kuo,

2008; Terpos et al., 2009; Weber et al., 2010; Weber et al., 2011; Ingale et al., 2014;

Mardani et al., 2014). No caso de neoplasias malignas osteotrópicas, níveis elevados

de OPN contribuem para adesão, proliferação e sobrevivência das células neoplásicas

no microambiente ósseo; esses efeitos têm sido atribuídos à capacidade do próprio

parênquima tumoral em expressar OPN (Kruger et al., 2014; Buijs & van der Pluijm,

2009). No presente estudo, demonstramos que a OPN derivada de células

osteoblásticas pode também promover características relacionadas ao fenótipo de

invasão de células SCC9. Adicionalmente, observamos que a interação entre as

linhagens SAOS-2 e SCC9 resultou em indução recíproca da expressão de OPN,

sugerindo que a invasão do CEC oral no osso poderia potencializar características

malignas dessa neoplasia, levando a piores prognósticos. Recentemente, um estudo

mostrou que este efeito é particularmente importante quando a neoplasia atinge o osso

esponjoso, mas não quando se restringe ao osso compacto (Fried et al., 2014).

Os sistemas de cocultura de células permitem estudar, em um ambiente

controlado, os efeitos de interações recíprocas entre diferentes tipos e fenótipos

50

celulares, constituindo-se em um importante modelo in vitro para simular as

comunicações entre células que ocorrem in vivo no complexo microambiente tumoral

(Miki et al., 2012). Em nosso trabalho, com as culturas celulares separadas por

membrana de Transwell®, os efeitos sobre adesão, proliferação, migração e invasão de

células SCC9 decorreram da ação direta e/ou indireta da OPN secretada por SAOS-2

ou da ação indireta de SAOS-2 não mediada por OPN, dependendo do parâmetro

avaliado. Especificamente, o aumento da adesão de células SCC9 cocultivadas com

SAOS-2 durante o pico de expressão de OPN poderia estar associado aos efeitos

diretos da OPN (Gao et al., 2003) ou aos indiretos, por meio da modulação da

expressão de genes relacionados com esse fenômeno, que codificam proteínas de

adesão celular e da MEC (Lyons & Jones, 2007). A análise da proliferação celular

revelou uma participação importante da OPN no aumento da proporção de células Ki-

67 positivas, em um contexto de alta complexidade de sobre-expressões e inibições

diferenciais de genes envolvidos nesse processo. Por outro lado, ainda que a presença

de OPN tenha resultado nos maiores valores de invasão de células SCC9 no Matrigel,

a inibição de sua expressão também exerceu efeito positivo, mas em menor

intensidade, indicando uma ação indireta de osteoblastos não mediada por OPN sobre

esse parâmetro. Por fim, apesar de a literatura destacar os efeitos estimuladores da

OPN sobre a migração celular (Polat et al., 2013; Zhang et al., 2014), nossos

resultados não permitiram identificar diferenças significantes entre os grupos

experimentais, o que poderia estar relacionado ao tempo definido para a análise,

possivelmente posterior ao de maior impacto da OPN sobre esse processo.

A progressão dos carcinomas caracteriza-se pela invasão das células

neoplásicas nos tecidos adjacentes e por metástases (Friedl & Alexander, 2011). Esses

processos requerem mudanças nas interações célula-célula e célula-MEC, as quais

são mediadas por diferentes moléculas adesivas, como integrinas, caderinas,

selectinas, lamininas, FN e tenascina (Lyons & Jones, 2007). No presente estudo,

células SCC9 cocultivadas com SAOS-2 durante o pico de expressão de OPN exibiram

maior adesão celular, o que poderia estar diretamente relacionado com níveis

significativamente superiores de RNAm para subunidade β3 de integrina e FN. Com

efeito, atribui-se à expressão de integrina β3 uma maior capacidade de células

51

neoplásicas em aderir a proteínas da MEC do estroma tumoral, por sua ligação com

sequências RGD de BSP, FN, OPN e osteonectina, proteínas matricelulares

multifuncionais reconhecidamente envolvidas nos processos de adesão e migração

celulares (Furger et al., 2003; Shi & Stack, 2010; Okada et al., 2011; Kostourou &

Papalazarou, 2014). A sobre-expressão de β3 resultaria, portanto, em maior adesão da

célula neoplásica à MEC, incluindo a do tecido ósseo (Clëzardin, 2009; Schneider et

al., 2011). Interessantemente, o aumento de expressão de FN em tumores primários de

CEC oral está diretamente relacionado ao desenvolvimento de metástases (Harada et

al., 1994) e, consequentemente, à maior agressividade dessa neoplasia.

O crescimento da massa tumoral decorre da desregulação do ciclo celular, que

resulta em proliferação excessiva das células neoplásicas, bem como da inibição do

processo de apoptose (Hanahan & Weinberg, 2011). No presente estudo, a cocultura

com células osteoblásticas permitiu detectar, em células SCC9, a sobre-expressão de

diferentes genes que regulam tanto positiva como negativamente o ciclo e a

proliferação celulares. Apesar de a expressão desses genes ter sido semelhante em

SCC9 em ambas as coculturas com SAOS-2, maior atividade proliferativa de SCC9

ocorreu com o pico de expressão de OPN. Têm sido identificados efeitos

potencializadores dessa proteína sobre a proliferação celular induzida por fatores de

crescimento (Angelucci et al., 2004), o que, em nosso caso, poderia ter ocorrido na

sinalização mitogênica por IGF-1 (Nam et al., 2000; Duan & Xu, 2005; Zhi et al., 2014),

cuja sobre-expressão ocorria em níveis semelhantes nas condições de cocultivo com

silenciamento ou não da OPN. A sobre-expressão do fator de transcrição MYC também

poderia contribuir para a maior proliferação de SCC9 induzida por OPN, considerando

que a região promotora do gene para OPN exibe sítios de ligação para esse fator de

transcrição (Martinez et al., 2010). Adicionalmente, a análise da expressão gênica de

SCC9 revelou uma sobre-expressão importante do TNFSF10, da ordem de 1,5x

superior para o grupo exposto ao pico de OPN, ainda que não houvesse

correspondência desses resultados moleculares com os aspectos fenotípicos das

culturas à observação por epifluorescência. Uma das explicações para isso estaria

relacionada à reconhecida resistência de células epiteliais neoplásicas malignas aos

efeitos desse ligante (Fukuda et al., 2003). Por outro lado, in vivo, a expressão de

52

TNFSF10 representaria uma estratégia do tumor para evasão do sistema imunológico,

induzindo células imunocompetentes à apoptose (Kassouf &Thornhill, 2008).

A capacidade de células SCC9 de invadir o Matrigel foi modulada positivamente

pela OPN. De fato, observou-se, para os 2 grupos de SCC9, sobre-expressão

diferencial de genes envolvidos no processo de degradação da MEC para invasão

tumoral, incluindo os que codificam as MMPs 7 e 10, TIMP 3, heparanase e catepsinas

L e K. Aumento significativo da expressão das MMPs 7 e 10 foi detectado com o

cocultivo com osteoblastos durante o pico de expressão de OPN. As MMPs pertencem

a uma família de enzimas proteolíticas dependentes de zinco, envolvidas na

remodelação e degradação da MEC em vários tecidos, incluindo o tecido ósseo (Chang

& Werb, 2001; Paiva & Granjeiro, 2014), e em tecidos neoplásicos (Thomas et al.,

1999; Patel et al., 2007; Pereira et al., 2012; Li H et al., 2014; Moro et al., 2014),

quando sua sobre-expressão pode estar associada a níveis teciduais elevados de OPN

(Ogbureke et al., 2006; Chen et al., 2009; Chen et al., 2011; Yang et al., 2011; Tilli et

al., 2012; Liu et al., 2014). Tem-se demonstrado que a expressão das MMPs 1, 3, 7 e

10 correlaciona-se com o processo de metástase e redução da sobrevida de pacientes

com CEC oral (Chiang et al., 2008), sendo que a expressão de MMP 7 está associada

a uma maior invasão do tumor, incluindo a óssea, bem com à presença de metástases

cervicais ocultas e a estágios avançados da doença (Chuang et al., 2008; Li & Cui,

2013; Mäkinen et al., 2014). A MMP 10 também está associada ao processo de

invasão do CEC oral, sendo expressa principalmente no fronte tumoral, região

caracterizada por complexas interações moleculares que afetam a progressão das

neoplasias (Mashhadiabbas et al., 2012).

Os TIMPs são inibidores endógenos de MMPs e, consequentemente,

importantes reguladores da remodelação da MEC (Brew & Nagase, 2010). No presente

estudo, níveis elevados de TIMP 3 foram detectados em células SCC9 cocultivadas

com SAOS-2 durante o pico de expressão de OPN. Contudo, o potencial efeito inibidor

de TIMP 3 sobre a atividade de MMPs não foi suficiente para impedir a invasão celular

no Matrigel, que foi significativamente maior para esse grupo. Estudos recentes têm

demonstrado elevação concomitante nos níveis de MMPs e TIMPs no CEC oral (Gao et

al., 2005; Singh et al., 2010; Singh et al., 2011; Pérez-Sayáns García et al., 2012;

53

Bodnar et al., 2014; Li M et al., 2014) e reduzida capacidade inibidora sobre MMPs de

TIMP 3 em comparação aos demais (Brew & Nagase, 2010). Adicionalmente, a OPN

atua como substrato para MMPs e os fragmentos produzidos por sua clivagem

poderiam potencializar a capacidade de invasão de células neoplásicas (Agnihotri et

al., 2001; Gao et al., 2004). Paralelamente ao reconhecido efeito inibidor sobre MMPs,

diversos estudos destacam o papel da TIMP 3 na modulação, positiva ou negativa, de

atividades de células neoplásicas associadas ao desenvolvimento e progressão de

tumores (Miyazaki et al., 2004; Brew & Nagase, 2010; Kornfeld et al., 2011; Das et al.,

2014).

A presença de outras enzimas, além das MMPs, também poderia estar

relacionada à maior invasão das células SCC9 do grupo Cocultura. De fato, a maior

invasão do Matrigel correspondeu a um aumento significativo nos níveis de expressão

de RNAm para heparanase e catepsinas. No desenvolvimento do CEC oral, a

expressão de heparanase aumenta com a progressão da lesão, sendo os níveis de

expressão maiores em carcinomas in situ ou em CECs orais invasivos em comparação

ao epitélio normal ou displásico (Nagatsuka et al., 2012; Leiser et al., 2014). Em um

modelo de xenoenxerto de CEC oral, Kurokawa et al. (2003) demonstraram que a

degradação da membrana basal associada à invasão do CEC oral correlacionava-se

com um aumento da expressão de RNAm para heparanase. Resultados semelhantes

foram descritos por Ikuta et al. (2001), que observaram uma correlação positiva entre

os níveis de RNAm e a atividade enzimática da heparanase em células neoplásicas

derivadas de CEC oral. Alguns parâmetros clínicopatológicos do CEC oral, como

tamanho do tumor (T3-T4), envolvimento de linfonodos regionais (N1-N3), metástases

à distância (M1) e estágio da doença (III-IV) correlacionam-se significativamente com a

expressão de heparanase (Xia et al., 2014). Além disso, a heparanase é capaz de

liberar MMPs que estão ligadas à proteoglicanas de heparan sulfato, como a MMP 7,

potencializando assim o processo de invasão das neoplasias (Yu & Woessner, 2000).

As catepsinas são enzimas lisossomais que atuam na degradação da MEC.

Essas proteases são classificadas de acordo com sua estrutura e com o substrato

sobre o qual atuam (Nomura & Katunuma, 2005; Kuester, 2008; Turk et al., 2012). No

epitélio oral displásico, a expressão de catepsina L parece não estar relacionada com o

54

desenvolvimento do epitélio neoplásico (Smith et al., 2009). Por outro lado, no CEC

oral, a catepsina L está envolvida nos processos de invasão e metástase para

linfonodos cervicais (Erdem et al., 2007; Nakashima et al., 2012). Por sua vez, a

catepsina K é expressa predominantemente em células osteoclásticas, quando está

envolvida na degradação do colágeno I durante a remodelação óssea (Goto et al.,

2003; Wilson et al., 2009; Gruber, 2014), além de estar associada ao processo de

invasão de diferentes neoplasias (Yan et al., 2011; Ren et al., 2012; Ishida & Okabe,

2013). Recentemente, Bitu et al. (2013) demonstraram que a diminuição da expressão

de catepsina K reduzia a invasão de células derivadas de CEC de língua em um

modelo in vitro tridimensional. Pela análise imunoistoquímica de tumores, no entanto,

os autores demonstraram que a quantidade de catepsina K em células neoplásicas não

estava associada ao prognóstico do paciente e que no microambiente tumoral, parecia

ter um efeito protetor sobre o complexo fenômeno de invasão do CEC de língua. Em

um modelo in vivo de câncer de mama, o bloqueio da catepsina K em células

neoplásicas reduz significativamente as lesões osteolíticas de metástases (Duong et

al., 2014).

O experimento para avaliar os efeitos das induções recíprocas em coculturas

SAOS-2 e SCC9 sobre osteoclastos permitiu identificar a expressão de citocinas

ligadas à reabsorção do tecido ósseo promovida pelo CEC oral (Deyama et al., 2008;

Kayamori et al., 2010; Hwang et al., 2012). As IL 6 e IL 8 promovem o aumento da

atividade osteoclástica pela ligação, respectivamente, aos receptores IL-6R (via de

sinalização gp130) e CXR1 ou pelo aumento da expressão de RANKL (Bendre et al.,

2003; Kudo et al., 2003; Kwan Tat et al., 2004). Independentemente da presença ou

não de OPN nas culturas SAOS-2, o cocultivo com SCC9 resultou no aumento da IL 8

em ambas as linhagens celulares, enquanto que níveis significativamente maiores de IL

6 foram detectados apenas em SCC9. Uma tendência a valores mais altos de IL 6 e IL

8 em SCC9 cocultivadas com SAOS-2 durante o pico de expressão de OPN

correspondia à maior atividade de reabsorção de fosfato de cálcio pelas células

osteoclásticas. A possibilidade de uma adsorção diferencial de OPN ao substrato de

fosfato de cálcio (Gilbert et al., 2000; Gilbert et al., 2003; Pietak et al., 2006) ter

exercido algum efeito sobre osteoclastos deve ser descartada, considerando que não

55

houve diferenças significativas entre os grupos SAOS-2/Cocultura e SAOS-

2/Cocultura+RNAi para a atividade reabsortiva. Sugere-se, assim, que a OPN

secretada por osteoblastos promove o aumento da reabsorção óssea mediada por

osteoclastos induzida por células epiteliais neoplásicas, intensificando a invasão do

CEC oral no tecido ósseo.

Em conclusão, apesar das limitações do método de cocultura utilizado, com três

linhagens representativas de subpopulações de células epiteliais neoplásicas,

osteoblásticas e osteoclásticas, os resultados do presente estudo reforçam a

importância do papel de células não neoplásicas e de MEC não derivada da neoplasia,

presentes no estroma tumoral, como moduladores da agressividade das células

neoplásicas (Kellermann et al., 2008; Sobral et al., 2011a; Sobral et al., 2011b; Shevde

& Samant, 2014), corroborando o conceito que se tem atribuído à OPN como fator

prognóstico de neoplasias. Os efeitos atribuídos à OPN derivada de osteoblastos sobre

células SCC9 assemelham-se àqueles já descritos para a OPN produzida pelo

parênquima tumoral. Adicionalmente, as observações in vitro de induções recíprocas

entre células epiteliais neoplásicas e osteoblásticas contribuem para a sobre-expressão

de OPN que ocorre, in vivo, em neoplasias mais agressivas. A interação com

osteoblastos promove a expressão de citocinas pelas células neoplásicas, que por sua

vez, ativam osteoclastos, tornando-os competentes para digestão de componentes da

matriz óssea, o que permite explicar a ocorrência de áreas ativas de reabsorção óssea

no microambiente tumoral.

56

57

7 CONCLUSÃO

Os resultados do presente estudo permitem concluir que:

1. Em sistemas de coculturas com membrana Transwell®, a OPN secretada por

células osteoblásticas da linhagem SAOS-2 afeta o fenótipo de células epiteliais

neoplásicas SCC9, estimulando os fenômenos celulares de adesão, proliferação

e invasão;

2. O cocultivo de SAOS-2 e SCC9 resulta em induções recíprocas que levam ao

aumento progressivo da secreção de OPN por ambas as culturas;

3. Durante o pico de expressão de OPN em culturas SAOS-2, os mecanismos que

promovem os aumentos de adesão, proliferação e invasão de células SCC9 no

Matrigel envolvem a modulação da expressão de genes relacionados a esses

processos, induzida ou não por OPN extracelular;

4. A migração de células SCC9 não se altera pela presença de SAOS-2 e pela

OPN derivada de osteoblastos;

5. O cocultivo com SAOS-2, principalmente durante o pico de expressão de OPN,

resulta na sobre-expressão das citocinas IL 6 e IL 8 por SCC9 e aumenta a

capacidade reabsortiva de células osteoclásticas;

6. A OPN derivada de osteoblastos afeta as interações entre células epiteliais

neoplásicas malignas, osteoblastos e osteoclastos in vitro, o que possivelmente

contribui para a progressão de lesões ósseas do CEC oral.

58

59

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96

97

APÊNDICE 1

Resultados das análises de integridade do RNA

A integridade do RNA foi verificada previamente aos ensaios de Real Time PCR

pela visualização de duas subunidades ribossômicas características de células

eucarióticas (18S e 28S). Essa análise foi realizada por meio do aparelho 2100

Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), de acordo com as

instruções do fabricante. Foram consideradas amostras viáveis para realização do Real

Time PCR aquelas que apresentavam valores de RIN superiores a 8 (escores variando

de 0 a 10).

Integridade do RNA para análise do perfil de expressão de OPN em células

SAOS-2 e SCC9

Figura 21. Ensaio de integridade do RNA ribossômico extraído aos 3, 5, 7 e 10 dias de culturas

de células SAOS-2 e SCC9.

98

Integridade do RNA para análise do perfil de expressão de OPN em coculturas

SAOS-2/SCC9

Figura 22. Ensaio de integridade do RNA ribossômico extraído aos 3, 5, 7 e 10 dias de coculturas

SAOS-2/SCC9.

99

Integridade do RNA para o ensaio de silenciamento do transcrito do gene da OPN

por RNAi

Figura 23. Ensaio de integridade do RNA ribossômico extraído aos 10 dias de culturas controles de

células SAOS-2 e de culturas de células SAOS-2 silenciadas para expressão de OPN e GAPDH aos 5 e

7 dias.

100

Integridade do RNA para o ensaio de PCR Array

Figura 24. Ensaio de integridade do RNA ribossômico de células SCC9 cocultivadas com SAOS-2.

101

APÊNDICE 2

Resultados do silenciamento do transcrito do gene da OPN por RNAi

Imunolocalização de OPN por imunofluorescência indireta

Nos grupos Controle e Controle Negativo, o ensaio de fluorescência revelou

marcação positiva para OPN em região perinuclear, compatível com sua localização

majoritária no complexo de Golgi, aos 5 e 7 dias (Figura 25). Contudo, nos grupos em

que foi realizado o silenciamento, notou-se redução da marcação para OPN,

particularmente para as células silenciadas aos 5 dias (Figura 25, compare C com F).

Figura 25. Epifluorescência de culturas de células SAOS-2 aos 10 dias, após o silenciamento para OPN

aos 5 e 7 dias. Vermelho indica marcação para OPN, cinza, o citoesqueleto de actina, e azul, os núcleos

celulares. Notem-se abundante marcação para OPN em região perinuclear para os grupos Controle (A e

D) e Controle Negativo (B e E) e marcação reduzida nos grupos em que a expressão de OPN foi

silenciada (C e F), particularmente no 5o dia (C). Barra de escala = 100 µm.

102

Expressão de OPN por Real Time PCR

Aos 10 dias, verificou-se que o silenciamento realizado aos 5 e 7 dias resultou

em redução significativa do RNAm para OPN (Kruskal-Wallis, p < 0,05) em relação aos

controles, com inibição de 99% e 97% de sua expressão, respectivamente (Figura 26).

O silenciamento no 5o dia foi significativamente maior do que aquele no 7o dia (p <

0,05).

Figura 26. Expressão relativa de RNAm para o gene OPN aos 10 dias em culturas de células SAOS-2

controles e após o silenciamento ao 5o ou ao 7

o dia. Note-se redução expressiva dos níveis de RNAm

para OPN nas culturas submetidas ao silenciamento, particularmente no 5o dia. Os dados foram

normalizados pelo gene constitutivo GAPDH e calibrados pelo Controle. Barras que apresentam letras

semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são apresentados como

média ± desvio padrão.

Como controle positivo da transfecção foi avaliado o silenciamento do gene

constitutivo GAPDH. De acordo com o fabricante, a transfecção deve ser considerada

adequada quando o silenciamento desse for superior a 97%. No presente estudo, em

todos os ensaios realizados foi observada inibição dos transcritos para GAPDH

superior a 98% (Figura 27).

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Controle ControleNegativo

OPN -RNAi


OPN -RNAi

5º dia 7º dia

Exp

ressão

rela

tiv

a d

e R

NA

m

Expressão de OPN

a a

b

a

c

d

103

Figura 27. Expressão relativa de RNAm para o gene constitutivo GAPDH aos 10 dias em culturas de

células SAOS-2 controle e após o seu silenciamento ao 5o ou ao 7

o dia. Note-se redução importante dos

níveis de RNAm para GAPDH em comparação ao controle. Os dados foram normalizados pelo próprio

GAPDH e calibrados pelo controle. Barras que apresentam letras semelhantes não são


padrão.

Quantificação de OPN por ELISA

Culturas SAOS-2 silenciadas para o gene da OPN aos 5 e 7 dias exibiram

redução da expressão da proteína aos 10 dias em comparação aos grupos controles,

sendo os menores níveis observados em culturas silenciadas aos 5 dias (Kruskal-

Wallis, p < 0,05, Figura 28).

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

GAPDH -Controle

GAPDH - RNAi GAPDH -Controle

GAPDH - RNAi

5º dia 7º dia

Exp

ressão

rela

tiv

a d

e R

NA

m

Expressão de GAPDH

a

b

a

b

104

Figura 28. Quantificação de OPN aos 10 dias em sobrenadantes de culturas de células SAOS-2

controles e após o seu silenciamento ao 5o ou ao 7

o dia. Note-se redução importante de OPN nas

culturas submetidas ao silenciamento, particularmente no 5o dia. Barras que apresentam pelo menos

uma letra semelhante não são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são

apresentados como média ± desvio padrão.

0

4

8

12

16


RNAi Controle ControleNegativo

RNAi

5º dia 7º dia

pg

/10

4célu

las

Quantificação de OPN extracelular

a b

c

d a,e

f

105

ANEXO

Tabela 2. Relação de genes envolvidos no processo de invasão e metástase presentes na placa de PCR

Array (SuperArray)

Posição Número/Acesso Símbolo Descrição

A01 NM_000038 APC Adenomatous polyposis coli

A02 NM_015399 BRMS1 Breast cancer metastasis suppressor 1

A03 NM_006273 CCL7 Chemokine (C-C motif) ligand 7

A04 NM_000610 CD44 CD44 molecule (Indian blood group)

A05 NM_004360 CDH1 Cadherin 1, type 1, E-cadherin (epithelial)

A06 NM_001797 CDH11 Cadherin 11, type 2, OB-cadherin (osteoblast)

A07 NM_004932 CDH6 Cadherin 6, type 2, K-cadherin (fetal kidney)

A08 NM_000077 CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits CDK4)

A09 NM_001273 CHD4 Chromodomain helicase DNA binding protein 4

A10 NM_001846 COL4A2 Collagen, type IV, alpha 2

A11 NM_003650 CST7 Cystatin F (leukocystatin)

A12 NM_001328 CTBP1 C-terminal binding protein 1

B01 NM_001903 CTNNA1 Catenin (cadherin-associated protein), alpha 1, 102kDa

B02 NM_000396 CTSK Cathepsin K

B03 NM_001912 CTSL Cathepsin L1

B04 NM_000609 CXCL12 Chemokine (C-X-C motif) ligand 12

B05 NM_003467 CXCR4 Chemokine (C-X-C motif) receptor 4

B06 NM_003677 DENR Density-regulated protein

B07 NM_004442 EPHB2 EPH receptor B2

B08 NM_001986 ETV4 Ets variant 4

B09 NM_005243 EWSR1 Ewing sarcoma breakpoint region 1

B10 NM_005245 FAT1 FAT tumor suppressor homolog 1 (Drosophila)

B11 NM_002011 FGFR4 Fibroblast growth factor receptor 4

B12 NM_002020 FLT4 Fms-related tyrosine kinase 4

C01 NM_002026 FN1 Fibronectin 1

C02 NM_014164 FXYD5 FXYD domain containing ion transport regulator 5

C03 NM_000825 GNRH1 Gonadotropin-releasing hormone 1 (luteinizing-releasing hormone)

C04 NM_032551 KISS1R KISS1 receptor

C05 NM_000601 HGF Hepatocyte growth factor (hepapoietin A; scatter factor)

C06 NM_006665 HPSE Heparanase

C07 NM_005343 HRAS V-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog

C08 NM_006410 HTATIP2 HIV-1 Tat interactive protein 2, 30kDa

C09 NM_000618 IGF1 Insulin-like growth factor 1 (somatomedin C)

C10 NM_001562 IL18 Interleukin 18 (interferon-gamma-inducing factor)

C11 NM_000576 IL1B Interleukin 1, beta

C12 NM_001557 CXCR2 Chemokine (C-X-C motif) receptor 2

D01 NM_002206 ITGA7 Integrin, alpha 7

D02 NM_000212 ITGB3 Integrin, beta 3 (platelet glycoprotein IIIa, antigen CD61)

D03 NM_002231 CD82 CD82 molecule

D04 NM_002256 KISS1 KiSS-1 metastasis-suppressor

D05 NM_004985 KRAS V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog

D06 NM_002295 RPSA Ribosomal protein SA

D07 NM_006500 MCAM Melanoma cell adhesion molecule

D08 NM_002392 MDM2 Mdm2 p53 binding protein homolog (mouse)

D09 NM_000245 MET Met proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor)

D10 NM_006838 METAP2 Methionyl aminopeptidase 2

D11 NM_002410 MGAT5 Mannosyl (alpha-1,6-)-glycoprotein beta-1,6-N-acetyl-glucosaminyltransferase

D12 NM_002425 MMP10 Matrix metallopeptidase 10 (stromelysin 2)

E01 NM_005940 MMP11 Matrix metallopeptidase 11 (stromelysin 3)

106


Posição Número/Acesso Símbolo Descrição

E02 NM_002427 MMP13 Matrix metallopeptidase 13 (collagenase 3)

E03 NM_004530 MMP2 Matrix metallopeptidase 2 (gelatinase A, 72kDa gelatinase, 72kDa type IV collagenase)

E04 NM_002422 MMP3 Matrix metallopeptidase 3 (stromelysin 1, progelatinase)

E05 NM_002423 MMP7 Matrix metallopeptidase 7 (matrilysin, uterine)

E06 NM_004994 MMP9 Matrix metallopeptidase 9 (gelatinase B, 92kDa gelatinase, 92kDa type IV collagenase)

E07 NM_004689 MTA1 Metastasis associated 1

E08 NM_014751 MTSS1 Metastasis suppressor 1

E09 NM_002467 MYC V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)

E10 NM_005376 MYCL V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog 1, lung carcinoma derived (avian)

E11 NM_000268 NF2 Neurofibromin 2 (merlin)

E12 NM_000269 NME1 Non-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed in

F01 NM_002512 NME2 Non-metastatic cells 2, protein (NM23B) expressed in

F02 NM_005009 NME4 Non-metastatic cells 4, protein expressed in

F03 NM_006981 NR4A3 Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 3

F04 NM_002659 PLAUR Plasminogen activator, urokinase receptor

F05 NM_002687 PNN Pinin, desmosome associated protein

F06 NM_000314 PTEN Phosphatase and tensin homolog

F07 NM_000321 RB1 Retinoblastoma 1

F08 NM_006914 RORB RAR-related orphan receptor B

F09 NM_003011 SET SET nuclear oncogene

F10 NM_005901 SMAD2 SMAD family member 2

F11 NM_005359 SMAD4 SMAD family member 4

F12 NM_005417 SRC V-src sarcoma (Schmidt-Ruppin A-2) viral oncogene homolog (avian)

G01 NM_001050 SSTR2 Somatostatin receptor 2

G02 NM_003177 SYK Spleen tyrosine kinase

G03 NM_005650 TCF20 Transcription factor 20 (AR1)

G04 NM_000660 TGFB1 Transforming growth factor, beta 1

G05 NM_003255 TIMP2 TIMP metallopeptidase inhibitor 2



G08 NM_003810 TNFSF10 Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10

G09 NM_000546 TP53 Tumor protein p53

G10 NM_002420 TRPM1 Transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 1

G11 NM_000369 TSHR Thyroid stimulating hormone receptor

G12 NM_003376 VEGFA Vascular endothelial growth factor A

H01 NM_004048 B2M Beta-2-microglobulin

H02 NM_000194 HPRT1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1

H03 NM_012423 RPL13A Ribosomal protein L13a

H04 NM_002046 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

H05 NM_001101 ACTB Actin, beta

H06 SA_00105 HGDC Human Genomic DNA Contamination

H07 SA_00104 RTC Reverse Transcription Control



H10 SA_00103 PPC Positive PCR Control



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LUCAS NOVAES TEIXEIRA - repositorio.unicamp.brrepositorio.unicamp.br/jspui/bitstream/REPOSIP/288466/1/Teixeira_Lucas... · isoladamente foram usadas como controles. Após 24 h de