Mancini Mc Me Jabo

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JLIO DE MESQUITA FILHO FACULADE DE CINCIAS AGRRIAS E VETERINRIAS

CAMPUS DE JABOTICABAL

MAPEAMENTO GENTICO E IDENTIFICAO DE MARCADORES AFLP, MICROSSATLITES GENMICOS E FUNCIONAIS ASSOCIADOS A

PARMETROS AGROINDUSTRIAIS EM CANA-DE-ACAR.

Melina Cristina Mancini Biloga

JABOTICABAL - SO PAULO - BRASIL

Maro de 2010

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JLIO DE MESQUITA FILHO FACULADE DE CINCIAS AGRRIAS E VETERINRIAS

CAMPUS DE JABOTICABAL



Melina Cristina Mancini

Orientador: Prof. Dr. Dilermando Perecin

Co-orientadora: Dr Luciana Rossini Pinto

JABOTICABAL - SO PAULO - BRASIL

Maro de 2010

Dissertao apresentada Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte das exigncias para a obteno do ttulo de Mestre em Agronomia (Gentica e Melhoramento de Plantas).

DADOS CURRICULARES DA AUTORA

MELINA CRISTINA MANCINI Nasceu em 18 de junho de 1983, no municpio de Araraquara- So Paulo. Em novembro de 2006 concluiu a graduao

em Cincias Biolgicas, modalidade Licenciatura e em novembro de 2008, obteve o

ttulo de Bacharel em Cincias Biolgicas, ambas pela Universidade Estadual

Paulista Jlio de Mesquita Filho, Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias de

Jaboticabal, So Paulo. Realizou estgio curricular para a Monografia no

Departamento de Produo Vegetal da mesma Universidade.

A meus pais Solange e Jos Carlos;

minha irm Thalita;

Pelo amor incondicional e pelo incomensurvel apoio.

AGRADECIMENTOS

A Deus que me deu fora e persistncia para seguir meu caminho.

A Universidade Estadual Paulista UNESP/FCAV pela oportunidade

oferecida de desenvolver este trabalho.

Ao Prof. Dr. Dilermando Perecin, pela orientao, confiana, apoio e

oportunidade em realizar este trabalho.

A Dr. Luciana Rossini Pinto, pela co-orientao. Muito obrigada pelo

ensinamento, incentivo e pela grande contribuio no meu crescimento cientfico.

A todos os mestres da UNESP/FCAV pelo conhecimento transmitido e pela

amizade adquirida.

Ao CNPQ pelo apoio financeiro no projeto.

A todos os funcionrios do Centro de Cana do Instituto Agronmico de

Campinas pela valiosa ajuda durante a conduo do experimento.

Aos meus amigos do laboratrio Thais, Flvia, Cibele e Daniel pelo agradvel

convvio e apoio durante a realizao deste trabalho.

Aos meus amigos Adriana Ibrahim, Claudia Demtrio, Fernanda Paganelli,

Jacqueline Paiva, Juliana De Antonio, Marcelo Costa e Viviane Morita pela constante

amizade.

A minha famlia que me deu carinho, compreenso, incentivo e confiana em

todos os momentos da minha vida.

A todos que direta ou indiretamente contriburam na execuo deste trabalho.

vSUMRIO Pgina

LISTA DE TABELAS.................................................................................. viiLISTA DE FIGURAS................................................................................... ixRESUMO..................................................................................................... xiii ABSTRACT................................................................................................. xiv 1. INTRODUO........................................................................................ 1 2. REVISO DE LITERATURA.................................................................. 3 2.1 Classificao botnica da cana-de-acar........................................ 3

2.2 Aspectos relacionados ao melhoramento gentico da cana-de-

acar.......................................................................................................... 4

2.3 Marcadores moleculares................................................................... 7

Marcadores moleculares baseados em AFLP................................... 8

Marcadores moleculares baseados em microssatlites.................... 10

2.4 mapeamento gentico em cana-de-acar....................................... 12

2.5 Deteco e mapeamento de QTLs.................................................... 16

3. MATERIAL E MTODOS....................................................................... 20 3.1 Populao de mapeamento............................................................... 20

3.2 Avaliaes fenotpicas....................................................................... 21

3.2.1 Anlise dos dados.................................................................... 22

3.3 Avaliaes com Marcadores Moleculares......................................... 23

3.3.1 Extrao e quantificao do DNA genmico............................ 23

3.3.2 Marcadores microssatlites...................................................... 23

3.3.3 Avaliao com marcadores AFLP............................................ 24

3.3.4 Anlise da segregao de marcadores.................................... 25

3.3.5 Construo do mapa de ligao............................................... 25

3.3.6 Anlise de marcas simples....................................................... 25

4. RESULTADOS........................................................................................ 27 4.1 Anlise dos dados fenotpicos........................................................... 27

4.1.1 Herdabilidade........................................................................... 31

4.1.2 Correlao entre caractersticas............................................... 32

vi

4.2 Anlise de segregao dos marcadores moleculares....................... 34

4.3 Mapa de ligao................................................................................ 39

4.4 Identificao funcional dos ESTs...................................................... 46

4.5 Anlise de marcas simples e localizao dos QTAs (Quantitative

Trait Allele) no mapa de ligao.................................................................. 48

4.5.1 Dimetro do colmo................................................................... 54

4.5.2 Peso do colmo.......................................................................... 58

4.5.3 Altura do colmo......................................................................... 60

4.5.4 Nmero de perfilhos................................................................. 61

4.5.5 TCH.......................................................................................... 62

4.5.6 Fibra......................................................................................... 63

4.5.7 Brix........................................................................................... 64

4.5.8 Pol%Cana................................................................................. 65

5. DISCUSSO........................................................................................... 67 6. CONCLUSES....................................................................................... 72 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS....................................................... 73 8. ANEXO.................................................................................................... 85

vii

LISTA DE TABELAS Tabela 1. Mapas de ligao publicados para cana-de-acar ................... 13 Tabela 2. Deteco de QTLs para cana-de-acar ................................... 18 e 19 Tabela 3. Quadrados mdios da anlise de varincia para dimetro, peso, altura, nmero de perfilhos (NC), TCH, Fibra, Brix e Pol%Cana dos

220 clones em cana planta (P) e cana soca (S), e significncia pelo

Teste F ....................................................................................................... 28

Tabela 4. Estimativas dos componentes de varincia ( 2g ) e ambiental

( 2e ) e herdabilidade (h2) no sentido amplo dos parmetros dimetro,

peso, altura do colmo, nmero de perfilhos, TCH, calculados para quatro

repeties e Brix, Fibra e Pol%Cana, calculado para duas repeties,

dos 220 clones de cana-de-acar............................................................. 32

Tabela 5. Estimativas de correlaes fenotpicas, sendo que as que envolvem caractersticas de produo (dimetro, peso, altura do colmo,

nmero de perfilhos e TCH) foram calculadas com quatro repeties, e

as que envolvem parmetros de qualidade (Fibra, Brix e Pol%Cana)

foram calculadas considerando apenas duas repeties. Acima da

diagonal esto as correlaes para cana planta, abaixo as para cana

soca e na diagonal as entre anos ............................................................... 33

Tabela 6. Segregaes referentes as 15 combinaes de AFLP, 35 SSRs genmicos e 71 EST-SSRs nos 220 clones de cana-de-acar

derivados do cruzamento entre IACSP95-3018 e IACSP93-3046,

baseadas no teste qui-quadrado a p

viii

mltiplas (R2 total) para as caractersticas dimetro, peso e altura do

colmo, nmero de perfilhos, TCH, fibra, Brix e Pol%Cana em cana planta

e cana soca para marcadores do tipo AFLP .............................................. 49 e 50

Tabela 11. Efeito de marcas simples e de associaes (R2%) parciais e mltiplas (R2 total) para as caractersticas dimetro, peso e altura do


e cana soca para marcadores do tipo SSRs genmicos ............................ 51

Tabela 12. Efeito de marcas simples e de associaes (R2%) parciais e mltiplas (R2 total) para as caractersticas dimetro, peso e altura do


e cana soca para marcadores do tipo EST-SSRs ...................................... 52 e 53

ix

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Freqncia de distribuio dos valores fenotpicos para dimetro, peso, altura, nmero de perfilhos, TCH, Fibra, Brix e

Pol%Cana dos 220 clones de cana-de-acar em cana planta e cana

soca. P1: IACSP95-3018; P2: IACSP93-3046 ........................................... 30

Figura 2. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre Fibra e Pol%Cana em cana planta e cana soca. 34

Figura 3. Polimorfismo obtido com: A) microssatlite EST-SCB 27 e B) combinao ACT/CTG. Esquerda para direita: V) variante somaclonal do

genitor IACSP93-3046, P1) genitor IACSP95-3018, P2) genitor

IACSP93-3046 e amostra de indivduos da populao de mapeamento ... 34

Figura 4. Distribuio da freqncia de segregao das 185 e 198 marcas presentes no genitores IACSP95-3018 e IACSP93-3046,

respectivamente, entre as 15 combinaes seletivas de AFLP, os 35

SSRs genmicos e os 71 EST-SSRs avaliados nos 220 clones de cana-

de-acar .................................................................................................... 38

Figura 5. Distribuio da freqncia de segregao das 327 marcas presentes em ambos os genitores IACSP95-3018 e IACSP93-3046,

entre as 15 combinaes de AFLP, os 35 SSRs genmicos e os 71 EST-

SSRs nos 220 clones de cana-de-acar .................................................. 39

Figura 6. Mapa de ligao de cana-de-acar obtido para o cruzamento IACSP95-3018 e IACSP93-3046. Os nmeros superiores referem-se ao

grupo de ligao (GL) que pertencem as marcas. Os nmeros

esquerda so as distncias em centiMorgans (cM) entre as marcas. Os

nomes das marcas esto direita, seguidos pela sigla D1 (presente no

IACSP95-3018), D2 (presente no IACSP93-3046) ou C (presente em

ambos os genitores). Os GL foram reagrupados com base na presena

de alelos derivados de um mesmo microssatlite (loco definido pelo par

de primers que flanqueia o microssatlite) formando assim os grupos de

homologia (GH), I ao X ...............................................................................

40, 41,

42, 43 e

44

Figura 7. Freqncia de distribuio dos efeitos mdios positivos e

xnegativos dos QTAs identificados no cruzamento para dimetro, peso e

altura do colmo, nmero de perfilhos, TCH, fibra, Brix e Pol%Cana,

medidos entre cana planta e cana soca .....................................................

56, 57 e

58

Figura 8. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre dimetro e peso do colmo em cana planta e

cana soca ................................................................................................... 85

Figura 9. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre dimetro e altura do colmo em cana planta e

cana soca ................................................................................................... 85

Figura 10. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre dimetro e nmero de colmo em cana

planta e cana soca ..................................................................................... 86

Figura 11. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre dimetro e TCH em cana planta e cana

soca ............................................................................................................ 86

Figura 12. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre dimetro e Fibra em cana planta e cana

soca ............................................................................................................ 87

Figura 13. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre dimetro e Brix em cana planta e cana

soca ............................................................................................................ 87

Figura 14. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre dimetro e Pol%Cana em cana planta e

cana soca ................................................................................................... 88

Figura 15. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre peso e altura do colmo em cana planta e

cana soca ................................................................................................... 88

Figura 16. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre peso e nmero de colmos em cana


Figura 17. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre peso e TCH em cana planta e cana soca 89

xi

Figura 18. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre peso e Fibra em cana planta e cana

soca ............................................................................................................ 90

Figura 19. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre peso e Brix em cana planta e cana soca. 90

Figura 20. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre peso e Pol%Cana em cana planta e

cana soca ................................................................................................... 91

Figura 21. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre altura e nmero de colmos em cana


Figura 22. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre altura e TCH em cana planta e cana

soca ............................................................................................................ 92

Figura 23. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre altura e Fibra em cana planta e cana

soca ............................................................................................................ 92

Figura 24. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre altura e Brix em cana planta e cana soca 93

Figura 25. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre altura e Pol%Cana em cana planta e

cana soca ................................................................................................... 93

Figura 26. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre nmero de colmos e TCH em cana


Figura 27. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre nmero de colmos e Fibra em cana


Figura 28. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre nmero de colmos e Brix em cana planta

e cana soca ................................................................................................ 95

Figura 29. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220

xii

clones de cana-de-acar entre nmero de colmos e Pol%Cana em cana


Figura 30. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre TCH e Fibra em cana planta e cana

soca ............................................................................................................ 96

Figura 31. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre TCH e Brix em cana planta e cana soca. 96

Figura 32. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre TCH e Pol%Cana em cana planta e

cana soca ................................................................................................... 97

Figura 33. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre Fibra e Brix em cana planta e cana soca. 97

Figura 34. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre Brix e Pol%Cana em cana planta e cana

soca ............................................................................................................ 98

xiii



RESUMO O objetivo deste trabalho foi construir um mapa de ligao e identificar marcadores associados aos componentes de produo (dimetro, peso,

altura, nmero de perfilhos e TCH) e parmetros de qualidade (Fibra, Brix e

Pol%Cana), em uma prognie derivada cruzamento entre o clone IACSP95-3018 e a

cultivar IACSP93-3046, desenvolvidas pelo Programa de Melhoramento Cana IAC.

Para tanto, foram utilizados marcadores moleculares do tipo AFLP e microssatlites

genmicos e derivados de ESTs. A prognie mostrou grande variabilidade gentica

tanto para os componentes de produo quanto aos parmetros de qualidade. O

mapa de ligao foi composto por 231 marcadores segregando em dose nica,

distribudos em 72 grupos de ligao (GL) que deram origem a dez grupos de

homologia, com cobertura de 2436 centiMorgans (cM) e distncia mdia entre

marcadores de 10,55 cM, com distribuio irregular ao longo do cromossomo. O

comprimento dos GLs variou de 1 a 96 cM. Os marcadores em dose nica foram

utilizados na anlise de marcas simples para a identificao de provveis QTLs

associados s caractersticas fenotpicas obtidas em cana planta e cana soca. Um

total de 155 associaes marcador/caracterstica foi encontrado a p

xiv

GENETIC MAPPING AND INDENTIFICATION OF AFLP, GENOMIC AND FUNCTIONAL MICROSATELLITES ASSOCIATED TO TECHNOLOGYCAL

PARAMETERS IN SUGARCANE

SUMMARY - The objective of this study was to construct a linkage map and identify markers associated with yield components (diameter, weight, height, stalk

number and productivity) and quality parameters (Brix, Fiber and Pol%Cana), in a

progeny derived from a cross of the elite clone IACSP95-3018 and the variety

IACSP93-3046, both developed from the IAC Sugarcane Breeding Program. We

used molecular markers AFLP and genomic and derived from ESTs microsatellites.

The progeny showed high genetic variability for both yield components and quality

parameters. The genetic map was composed by 231 single markers dose, distributed

onto 72 linkage groups (LG) which resulted in ten homology groups, with coverage

2436 centiMorgans (cM) and average distance between markers of 10.55, with

irregular distribution along the chromosome. The length of the LG raging from 1 to 96

cM. Single marker trait association analysis was performed with the single dose

markers to identify putative QTLs associated with the phenotypic measures obtained

at cane plant and ratoon cane. A total of 155 marker/trait association was detected at

p

11. INTRODUO

A cultura de cana-de-acar exerce uma grande influncia econmica para o

Brasil. Segundo dados divulgados pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica

(IBGE), o Produto Interno Bruto (PIB) em 2008 foi de 2,9 trilhes de reais, sendo que a

agropecuria participa com 163,5 bilhes de reais (5,66%), e a cana-de-acar com 86

bilhes (3,6%). O seu desempenho bastante favorvel, estados dependentes dessa

cultura aparecem com os valores do PIB aumentados. No acumulado de 2008, o

aumento de 5,8% no PIB da agropecuria foi influenciado em 19,2% pela cultura (IBGE,

2009).

O Brasil o maior produtor mundial, seguido por ndia, Tailndia e Austrlia. A

quantidade de cana-de-acar processada pelas usinas brasileiras (milhes de

toneladas), produo de acar (milhes de toneladas) e lcool (milhes de litros) na

safra de 1992/1993 saltou de aproximadamente 176, 7 e 10 para 505 e 27 e 25 na atual

safra 2008/2009, respectivamente, na regio Centro-Sul. Esse aumento representou um

crescimento de 93,5%, 143% e 75% em 16 safras para essas caractersticas. J na

regio Nordeste, adotando os mesmos parmetros e as mesmas safras o salto notado

foi de aproximadamente 47, 3 e 1,5 para 64, 4 e 2,5. Em 16 safras houve um aumento

percentual de 17, 17 e 33 para produo de cana-de-acar, acar e lcool,

respectivamente (UNICA, 2009).

A principal estratgia para aumentar a produtividade da cana-de-acar o uso

de variedades melhoradas geneticamente, mas o alto nvel de ploidia aliado a

aneuploidia (HOARAU et al., 2001) dificultam o melhoramento gentico. O processo de

obteno de nova variedade longo e laborioso, exigindo cerca de 12 a 15 anos para

sua obteno (LANDELL et al., 1999).

A fim de diminuir o tempo despendido para obteno de novas variedades de

cana-de-acar, os marcadores moleculares se tornam valiosas ferramentas. A partir

2deles, pode-se mapear e identificar caractersticas agronmicas de interesse, assim

como praticar a seleo assistida (CAIXETA et al., 2009), a qual consiste na seleo

indireta de gentipos superiores por marcadores moleculares.

Atualmente existem diversos tipos de marcadores moleculares, tais como AFLP

(VOS et al., 1995), microssatlites genmicos, que so provenientes de bibliotecas

genmicas e os microssatlites ESTs (Expressed Sequence Tag), provenientes de

banco de dados de sequncias expressas, do projeto SUCEST (Sugarcane Espressed

Sequence Tag). Os marcadores obtidos a partir de sequncias expressas, ESTs, nos

permitem a construo de mapas funcionais, j que utilizam genes cuja funo

conhecida.

O mapeamento gentico de organismos poliplides s tornou-se possvel atravs

da anlise de segregao dos marcadores em dose nica (MDUs), descrita por WU et

al (1992). A partir dos mapas de ligao possvel conhecer a organizao do genoma

e identificar os marcadores que esto ligados a caractersticas que so

agronomicamente importantes, permitindo uma maior clareza sobre a influncia

(positiva ou negativa) que os genes exercem sobre estas caractersticas e

possivelmente detectar provveis QTLs (Quantitative trait loci).

Desta forma, este trabalho teve por objetivo construir um mapa de ligao e

identificar marcadores associados a caractersticas de interesse agronmico em

prognie do cruzamento entre duas cultivares de cana-de-acar, utilizando

marcadores moleculares do tipo AFLP e microssatlites genmicos e derivados de

ESTs.

32. REVISO DE LITERATURA

2.1 Classificao botnica da cana-de-acar

A classificao taxonmica descrita por CRONQUIST (1981) determina que a

cana-de-acar pertence diviso Magnoliophyta, classe Liliopsita, ordem Cyperales,

famlia Poaceae, tribo Andropogoneae, subtribo Saccharininae, gnero Saccharum,

contendo seis espcies: Saccharum officinarum (2n=80), S. barberi (2n=81-124), S.

robustum (2n=60-250), S. spontaneum (2n=40-128), S. sinensis (2n=111-120) e S.

edule (2n=60-80).

MURKHERJEE (1957) em estudos realizados em geobotnica definiu o

Complexo Saccharum que foi aprimorado posteriormente por DANIELS et al. (1975).

Nestes estudos foram constatados que os gneros Erianthus, Sclerostachya, Narenga e

Miscanthus formavam um grupo de intercruzamento muito prximo, estando

possivelmente envolvidos na origem da cana-de-acar.

A origem da variabilidade gentica da cana-de-acar pode ser dividida em trs

pontos: cultivares tradicionais, selvagens e modernas. As cultivares tradicionais

pertencem a espcie S. officinarum, que acumulam altos nveis de sacarose, colmos

grossos e com teor de fibra adequado moagem. J as cultivares selvagens englobam

as espcies S. spontaneum e S. robustum que so praticamente desprovidas de

sacarose, seus colmos so finos e fibrosos, com abundante perfilhamento. As cultivares

modernas so derivadas de hibridaes entre espcies tradicionais e selvagens,

seguidas por vrios retrocruzamentos com S.officinarum, processo denominado de

nobilizao, para recorrer caracterstica agronmica de alta produo de acar

(STEVENSON, 1965). Aproximadamente 80% do seu genoma contribuio da S.

officinarum, enquanto 10 a 15% so contribuies da espcie selvagem S. spontaneum

4e apenas 5 a 10% so provenientes de recombinaes cromossmicas (DHONT et al.,

1996), comprovando a estreita base gentica das cultivares modernas.

Quase todos as cultivares tradicionais desapareceram do cultivo, mas

permanecem como importantes genitores das cultivares modernas e como potencial

fonte de caractersticas para futuro melhoramento.

2.2 Aspectos relacionados ao melhoramento gentico da cana-de-acar

O melhoramento convencional da cana-de-acar inicia-se pela obteno de

variabilidade gentica adequada para a seleo, a qual obtida pela hibridao entre

dois (cruzamentos bi-parentais) ou mais clones (policruzamentos). Em geral, as

populaes utilizadas para seleo so derivadas do cruzamento de variedades

comerciais ou clones pr-comerciais. Os programas de melhoramento de plantas

buscam utilizar em seus cruzamentos indivduos que sejam divergentes, com bons

atributos agronmicos e resistentes s principais doenas, objetivando assim, aumentar

a variabilidade gentica da gerao segregante, aumentando a probabilidade de

identificar indivduos superiores (CRUZ et al., 2004).

Como a cana-de-acar uma espcie algama, poliplide e de propagao

vegetativa, os clones envolvidos nos cruzamentos so altamente heterozigticos, o que

proporciona variabilidade gentica na primeira gerao de cruzamento (gerao F1).

Devido propagao vegetativa, h uma fixao do potencial gentico individual do

clone, no havendo uma alterao gentica ao longo das geraes (BORM &

MIRANDA, 2005).

Os indivduos originrios de sementes sexuadas (seedlings), obtidos na fase de

gerao de variabilidade, so avaliados para um grande nmero de caracteres. Cada

clone representado por uma nica planta (poucos colmos em uma touceira) repetido

apenas uma vez em um nico ambiente. Nesta fase, efetua-se seleo individual para

5caracteres de baixa herdabilidade com eliminao dos indivduos (clones) cujos

caracteres esto abaixo dos nveis exigidos. Aqueles selecionados so multiplicados via

clonagem atravs dos colmos, o que permite a transmisso integral do gentipo e sua

avaliao em experimentos com repeties. O nmero de clones a ser avaliado diminui

ao longo do processo seletivo, aumentando de forma gradativa o nmero de repeties,

locais de avaliao e o tamanho das parcelas, ou seja, da preciso experimental, de

forma que nas avaliaes finais, a preciso experimental alta suficiente para

identificar e selecionar o gentipo superior (SOUZA JNIOR, 1989; SOUZA JNIOR,

1995; BRESSIANI, 2001). Desse modo, a obteno de uma variedade de cana-de-

acar exige longo tempo, normalmente 12 a 15 anos, desde a escolha dos parentais

at o plantio em escala comercial (LANDELL et al., 1999).

Em relao aos principais caracteres envolvidos no melhoramento da cana-de-

acar, a produo de acar por hectare (TAH ou TPH) constitui a mais importante. A

produo de acar por hectare envolve os componentes: tonelagem de cana por

hectare (TCH) e teor de acar da cana (POL da cana). O componente TCH

subdividido em nmero de colmos por hectare e peso por colmo o qual composto pelo

dimetro, altura e densidade. A brotao rpida, vigorosa e prolongada da soqueira, a

tolerncia ao frio e a seca, hbito ereto e a ausncia de florescimento dos colmos, tipo e

teor de fibra e adaptabilidade colheita mecnica tambm so caractersticas

desejveis na cultura. Outro ponto importante, diz respeito resistncia a doenas, a

qual constitui o principal fator de substituio das variedades (BRESSIANI, 2001).

Os parmetros tecnolgicos Brix%, Pol% Cana e Fibra so tambm os mais

importantes para indicar a qualidade da cana-de-acar (SILVA, 1996). O pagamento

da cana-de-acar, por exemplo, feito com base no teor de sacarose contido no caldo

da cana. O Brix, parmetro mais utilizado na indstria do acar e do lcool, expressa a

porcentagem peso/peso dos slidos solveis contidos em uma soluo pura de

sacarose (FERNANDES, 2000). Este parmetro, medido em refratmetro, a unidade

de escala que pelo ndice de refrao da luz, expressa a porcentagem em peso dos

slidos dissolvidos em uma soluo aucarada a 200 (LOPES, 1986; SILVA, 1996).

Entretanto, no Brix so expressos, no apenas a sacarose, mas todos os slidos

6solveis (acares e no acares) presentes no caldo. Por outro lado, o Pol, definido

como a quantidade em peso de sacarose em 100 ml de soluo, a qual medida pelo

desvio tico provocado pela soluo, no plano de uma luz polarizada (LOPES, 1986,

SILVA, 1996), reflete a concentrao de sacarose presente na cana.

A Fibra % Cana refere-se matria insolvel em gua contida no colmo da cana-

de-acar. Ela inclui toda a matria estranha que acompanha os colmos. A quantidade

de fibra exerce influncia direta na moagem da cana, uma vez que altas porcentagens

de Fibra refletem em uma baixa quantidade de caldo extrado e, portanto, baixa

produo de acar. Por outro lado, baixos contedos de fibra esto associados ao

aumento do acamamento e quebramento. Em geral, os caracteres Fibra e Pol

apresentam-se negativamente correlacionados, entretanto existe variao quanto ao

grau de correlao destes caracteres entre diferentes materiais, o que pode permitir a

seleo de variedades com altos nveis de Pol e valores adequados de Fibra.

Atualmente, h um interesse crescente no aumento da produo do bagao para a co-

gerao de energia, como a utilizao da fibra no processo de hidrlise (enzimtica ou

cida) na produo de etanol.

O sucesso de um programa de melhoramento depende, entre outros fatores, da

herdabilidade dos caracteres em questo. Brix e Pol apresentam alta herdabilidade, tal

que estes caracteres, respondem positivamente a seleo. Segundo HOGARTH &

CROSS (1987), a caracterstica teor de sacarose, medida como Brix, aparentemente,

no apresenta depresso por endogamia sendo que a maior parte da varincia gentica

tem sido apontada como aditiva. Na etapa de seedlings os coeficientes de herdabilidade

considerando plantas individuais so baixos devendo-se a seleo de plantas

individuais ser feita apenas para os caracteres de alta herdabilidade como, por

exemplo, o Brix. Por outro lado, Fibra % Cana tem mostrado baixa herdabilidade.

A tonelagem de cana por hectare (TCH), tambm apresenta baixa herdabilidade.

Na maioria dos programas de melhoramento de cana-de-acar, na fase de seedlings,

a seleo visual praticada de forma indireta baseando-se nos caracteres secundrios

para selecionar o carter principal, ou seja, em respostas correlacionadas produo.

Desta forma, nesta fase a seleo feita sobre os componentes de produo, tais

7como, a altura da planta, dimetro e nmero de perfilhos como tambm o Brix

(BRESSIANI, 2001).

O conhecimento das relaes entre os componentes de produo de acar

pode aumentar a eficincia de seleo para produo de acar (AITKEN et al., 2008).

Recentemente, um aumento na produo de acar tem sido atingido principalmente

pelo aumento dos componentes de produo da cana-de-acar do que propriamente

pelo teor de acar da cana-de-acar (JACKSON, 2005).

2.3 Marcadores moleculares

Marcadores moleculares so fragmentos de DNA que permitem a distino de

indivduos geneticamente diferentes (BORM & SANTOS, 2004). Dentre suas

aplicaes no melhoramento vegetal, est a seleo assistida de caractersticas de

importncia agronmica. Uma vez mapeadas e identificadas, tais caractersticas podem

ser selecionadas indiretamente por marcadores moleculares diretamente ligados a elas

atravs da seleo assistida por marcadores (SAM). A identificao da ligao entre

marcador e a caracterstica de interesse um pr requisito para a aplicao da SAM

(DEMEKE et al., 1997; MOHAN et al., 1997; MILACH, 1998; GRUPTA et al., 1999;

MORGANTE & SALAMINI, 2003; CHARCOSSET & MOREAU, 2004, PINTO et al.,

2009).

Considerando que um programa de melhoramento de cana-de-acar leva no

mnimo 10 anos para lanar uma nova cultivar, os marcadores moleculares podem

representar uma importante ferramenta j que reduzem o tempo de lanamento de

novas cultivares com caractersticas agronmicas desejveis (PINTO et al., 2009).

8 2.3.1 Marcadores moleculares baseados em AFLP

Os marcadores gerados pela anlise de polimorfismos de comprimento de

fragmento amplificado (AFLP), descrita por VOS et al. (1995), associam a

especificidade, resoluo e poder de amostragem da digesto com enzimas de

restrio com a velocidade e praticidade de deteco dos polimorfismos via PCR

(FERREIRA E GRATTAPAGLIA, 1998).

O DNA genmico total da planta clivado por enzimas de restrio, originando

um nmero extremamente elevado de fragmentos. Esses fragmentos so conseguidos

a partir da digesto do DNA total com duas enzimas de restrio: uma de corte raro,

com stio de restrio contendo seis a oito bases (EcoRI: um corte a cada 2- 2,5 kb em

Arabidopsis sp) e uma de corte freqente, com stio de restrio contendo quatro bases

(MseI: um corte a cada 300-400 pb em Arabidopsis sp) (LISCUM & OELLER, 2000).

O uso de duas enzimas de restrio para a digesto do genoma resulta em trs

tipos de fragmentos de DNA: aqueles onde as duas extremidades foram clivadas

somente com a enzima de corte freqente, os que foram clivados apenas pela enzima

de corte raro e os que sofreram a ao das duas enzimas. VOS et al. (1995)

constataram que 90% dos fragmentos gerados pelas enzimas de restrio eram os que

continham as duas extremidade clivadas pela enzima de corte freqente (MseI), mas os

fragmentos predominantemente amplificados so aqueles que foram clivados pelas

duas enzimas de restrio. Este fato explicado porque o primer- MseI, complementar

ao stio de restrio da MseI, apresenta uma temperatura de anelamento menor,

fazendo com que a amplificao desses fragmentos sejam menos eficientes. Alm

disso, os fragmentos MseI- MseI ou EcoRI-EcoRI, possuem regies invertidas em suas

extremidades, o que pode ocasionar um pareamento das mesmas, criando uma

competio com o primer (VOS et al., 1995; CAIXETA et al., 2009).

9Uma vez feita a digesto, oligonucleotdeos (25-30 pb) adaptadores so ligados

s extremidades de cada fragmento. Esse passo faz-se necessrio para que no haja

uma restaurao no stio original da enzima, devido mudana de base na sequncia

do adaptador, impedindo a ocorrncia de uma nova clivagem depois que a ligao

tenha sido concluda. Esta estratgia de reao simultnea permite que a digesto e a

ligao ocorram no mesmo tubo (CAIXETA et al., 2009; BLEARS et al., 1998).

A seguir uma amplificao seletiva realizada com dois iniciadores

complementares a ambos os adaptadores. Um complementar ao adaptador da enzima

de corte raro seguido de um ou trs nucleotdeos aleatrio na extremidade 3 e outro

complementar ao adaptador da enzima de corte freqente acrescido por um ou trs

nucleotdeos na extremidade 3. O uso desses dois iniciadores seletivos reduz a

quantidade de fragmentos de DNA, j que apenas os que contm os nucleotdeos

seletivos flanqueando o stio de restrio sero amplificados (CAIXETA et al., 2009;

BLEARS et al., 1998).

Embora haja a possibilidade de utilizar diferentes quantidades de nucleotdeos

seletivos VOS et al. (1995) demonstraram a necessidade de utilizao de trs bases

seletivas para obteno de padro de bandas desejvel e tambm constataram que a

cada base seletiva adicionada o nmero de fragmentos amplificados reduzido em

aproximadamente quatro vezes. Entretanto, eles observaram que a amplificao

realizada diretamente com iniciadores contendo trs nucleotdeos seletivos resultava

em produtos com amplificaes no especfica, o que causava um grande arraste no

gel. A fim de liquidar esse problema, desenvolveram uma estratgia baseada em duas

amplificaes. A primeira, denominada de pr-amplificao, utiliza iniciadores com um

ou nenhum nucleotdeo seletivo. Esses produtos pr-amplificados so utilizados como

DNA molde para a segunda reao de amplificao realizada com trs nucleotdeos

seletivos (VOS et al., 1995).

Por fim, os fragmentos amplificados so separados por eletroforese em gel de

poliacrilamida desnaturante de alta resoluo, sendo que o polimorfismo identificado

pela presena ou ausncia de bandas.

10

A tcnica AFLP tem as vantagens de ser relativamente barata, fcil, rpida e

tambm analisar o genoma completo da espcie o que lhe confere a capacidade de

gerar centenas de marcadores genticos informativos. Porm apresenta a desvantagem

de ser dominante, no possibilitando a identificao de indivduos heterozigticos

(FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998; MUELLER & WOLFENBARGER, 1999).

2.3.2 Marcadores moleculares baseados em microssatlites

O DNA microssatlite tambm conhecido como Simple Sequence Repeat (SSR),

consiste de pequenas sequncias de DNA, com um a quatro nucleotdeos repetidos em

tandem, cerca de oito vezes ou mais. Em genomas de eucariotos, estas sequncias

simples so muito freqentes e distribudas ao acaso, alm de constiturem locos

genticos altamente polimrficos (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).

Os microssatlites so muito atrativos aos melhoristas vegetais, pois eles

combinam vrias vantagens, como: 1) natureza codominante e multiallica; 2)

altamente polimrficos, permitindo discriminaes precisas, mesmo de indivduos

altamente relacionados; 3) distribuio abundante e uniforme em todo o genoma de

plantas; 4) podem ser analisados pela PCR; 5) a genotipagem por SSR pode ser semi-

automatizada em ensaios multiplex, utilizando-se iniciadores marcados por

fluorescncia; 6) a informao do marcador, baseada nas seqncias dos iniciadores,

pode ser facilmente publicada e trocada entre laboratrios, melhorando os esforos

cooperativos em pesquisa e desenvolvimento (BRONDANI et al., 1998).

Existem dois tipos de marcadores microssatltes: os tradicionais que so

provenientes de bibliotecas genmicas, denominados de SSRs genmicos, e os que

so oriundos de banco de dados de sequncias expressas (Expressed Sequence Tags)

e portanto, denominados de EST-SSRs.

Os microssatlites genmicos so obtidos a partir da clivagem total do DNA

genmico. Os fragmentos so selecionados quanto ao tamanho (300-700 pb) e ligados

11

a um vetor. O conjunto vetor-inserto transformado, e milhares de clones

recombinantes so produzidos e selecionados por hidridizaes com sondas,

selecionando aqueles que contenham microssatlites. Os insertos das colnias

positivas so seqenciados e analisados para confirmar a presena dos microssatlites.

Por fim, iniciadores flanqueando os microssatlites so desenhados (CAIXETA et al.,

2009).

Os EST-SSRs so derivados de sequncias expressas (ESTs) armazenadas em

bancos de dados, e que representam sequncias transcritas do genoma. Elas

apresentam homologia a genes envolvidos em diferentes vias metablicas das plantas

como, por exemplo os genes responsveis pelo desenvolvimento, estresse bitico e

abitico, regulao gnica e protenas essenciais (ARRUDA, 2001). Por serem

derivados de regies codificantes do genoma, os EST-SSRs so mais conservados que

as sequncias no-codificantes (TEMNYKH et al., 2001; MORGANTE et al., 2002),

apresentando menores polimorfismos e maiores chances de marcarem caractersticas

de interesse.

O desenvolvimento dos EST-SSRs feito atravs da minerao de sequncias

contendo microssatlites de dentro de bancos de dados.. Esta estratgia dispensa o

seqenciamento de DNA sendo uma forma simples, rpida e econmica de obter

iniciadores flanqueando as regies microssatlites, comparado ao SSRs obtidos das

bibliotecas de DNA genmico (ZANE et al., 2002).

Um total de 2005 clusters contendo microssatlites foram encontrados no

SUCEST (Sugarcane EST), que o maior e mais completo banco de dados de

sequncias expressas para cana-de-acar. A maioria destes clusters mostrou

homologia a algumas protenas, incluindo protenas que se ligam ao RNA e DNA,

protenas relacionadas defesa e regulao, entre outras (PINTO et al., 2004).

Devido abrangncia de regies conservadas, atualmente, os EST-SSRs, so

bastante utilizados em estudos de transferibilidade. Esse processo faz com que os

marcadores SSRs apresentem um grande potencial no mapeamento comparativo (YU

et al., 2004) bem como na clonagem de genes especficos e no estabelecimento de

perfis nicos fingerprint para proteo varietal.

12

Os microssatlites tm sido teis para integrao de mapas genticos e mapas

fsicos e tem provido os melhoristas e geneticistas com uma ferramenta eficiente para

associar variao gentica e fenotpica (GUPTA & VARSHNEY, 2000).

2.4 Mapeamento gentico em cana-de-acar

A construo de um mapa de ligao depende da estrutura gentica, tamanho e

complexidade da populao a ser mapeada. Devido complexidade, ao grande

tamanho e alto nvel de poliploidia do genoma da cana-de-acar, o seu mapeamento

muito complicado e laborioso, em comparao ao mapeamento de espcies diplides.

No mapeamento da cana-de-acar, h necessidade de utilizar maior nmero de

marcadores moleculares e prognies maiores (EDEM et al., 2006) devido a existncia

de mais de dois alelos para um mesmo loco, com presena de alelos segregando

individualmente em nmeros variados, alm da aneuploidia (HORAU et al., 2001;

OLIVEIRA et al., 2007).

O mapeamento gentico em organismos poliplides tornou-se possvel atravs

da anlise da segregao de marcadores em dose nica (MDU). Neste mtodo, o

marcador em dose nica est presente em uma nica cpia, em apenas um dos dois

genitores envolvidos em um cruzamento, apresentando segregao na prognie na

proporo de 1:1 (WU et al., 1992). Marcadores em dose nica em ambos os genitores

segregando na prognie na proporo 3:1, embora menos informativos, tambm podem

ser utilizados no mapeamento.

Os primeiros mapas genticos em cana-de-acar foram construdos para se

conhecer a organizao do seu genoma, bem como buscar tipo de populaes que

aumentem o surgimento das doses nicas. Esse fato pode ser confirmado observando

o pequeno tamanho das prognies que foram utilizadas nos trabalhos de AL-JANABI et

al. (1993) e GRIVET et al. (1996) (Tabela 1). Embora essas populaes fossem

pequenas, elas atendiam a proposta feita por WU et al. (1992), sendo que para detectar

13

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14

marcadores em dose nica a populao de mapeamento utilizada deveria ser maior

que 75 indivduos.

A tabela 1 mostra alguns dos mapas genticos publicados para cana-de-

acar, com os respectivos cruzamentos, tamanho da prognie, tipo de marcadores

utilizados, dose analisada (simples ou dupla), nmero de marcas ligadas, grupos de

ligao formados e a cobertura do mapa obtido, em centiMorgans.

No mapeamento gentico da cana-de-acar trs estratgias so utilizadas

para obter maior nmero de locos informativos. A primeira delas a utilizao de um

dos genitores duplo-haplide. Neste caso, a maioria dos locos esto em homozigose

e quando cruzado com um genitor heterozigoto, a prognie segregar na proporo

de 1:1, como um cruzamento teste. Esta estratgia foi utilizada por AL-JANABI et al.

(1993) e DA SILVA et al. (1993). A segunda a utilizao da autofecundao,

aproveitando-se das doses nicas 3:1, utilizadas nos trabalhos de GRIVET et al.

(1996) e HOARAU et al. (2001) para a construo do mapa da variedade R570. A

ltima estratgia consiste em realizar cruzamentos interespecficos, tais como as

populaes de mapeamento geradas a partir do cruzamento entre S. spontaneum

(IND 81-146 e PIN 84-1) com S. officinarum (Green German e Muntok Java),

realizados por MING et al. (2002) e tambm na introgresso de genes, apresentada

por AITKEN et al. (2005), RABOIN et al. (2006), EDEM et al. (2006), AITKEN et al.

(2007) e ALWALA et al. (2008). Todas as estratgias citadas maximizam o

surgimento dos marcadores em dose nica que poderiam segregar na prognie, o

que imprescindvel na construo de mapas de ligao.

Cruzamentos bi-parentais envolvendo variedades comerciais ou clones elites

de cana-de-acar tambm tm sido utilizados para a construo de mapas de

ligao (GARCIA et al. 2006; OLIVEIRA et al. 2007). A utilizao de clones elites

assim como de variedades envolvidas nas campanhas de cruzamento dos

programas de melhoramento podem permitir a identificao de alelos favorveis,

uma vez que os genitores envolvidos nos cruzamentos j passaram por processos

de seleo. O primeiro mapa funcional em cana-de-acar foi publicado por

OLIVEIRA et al. (2007) utilizando populao derivada do cruzamento entre dois

clones elites. Esse tipo de mapa pode facilitar a identificao de marcadores

15

associados as caractersticas de interesse agronmico, tornando pea fundamental

na deteco dos QTLs.

Marcadores em dose nica esto presentes em altas freqncias no genoma

da cana, aproximadamente 70% a 84% (AITKEN et al., 2005; DA SILVA et al.,

2005). Entretanto, mapeando somente essas doses, os mapas de ligao publicados

at o presente momento, ainda apresentam uma cobertura limitada do genoma,

sendo que em mdia cerca de 16% a 30% das marcas ainda continuam no ligadas,

isto , esto segregando em outras doses (AITKEN et al., 2005; DA SILVA et al.,

2005). O mapa mais saturado publicado at o momento em cana-de-acar foi feito

por AITKEN et al. (2005) que representa cerca de metade do seu genoma, seguido

pelo mapa feito por HOARAU et al. (2001), com cobertura aproximada de um tero

do genoma.

A utilizao de marcadores que esto presentes em mais de uma cpia em

apenas um dos genitores (multidoses) podem aumentar a cobertura do mapa em

regies do genoma que apresentam baixo nvel de marcadores em dose nica,

fazendo com que o nmero de marcadores no ligados diminua, assim como

demonstrado por AITKEN et al. (2007) e EDEM et al. (2006).

AITKEN et al. (2007) incorporando os marcadores em doses duplas em seu

mapa de ligao teve um aumento no nmero de grupos de ligao de 47 para 123

e, consequentemente, a cobertura do mapa de 2441 cM, somente utilizando

marcadores em doses simples, passou para 4906 cM com ambas as doses.

EDEM et al. (2006), alm de utilizarem os marcadores em dose nica, 1:1

(simplex), utilizaram tambm aqueles que segregam em dose dupla, 3:1, 11:3 e 7:2

(duplex, presente em duas cpias em um dos genitores), em dose tripla, 13:1, 15:1 e

11:1 (triplex, presente em trs cpias em um dos genitores) e em dose qudrupla,

64:1 e 69:1 (quadriplex, presente em quatro cpias em um dos genitores), sendo

que 78% segregaram nos modelos Mendelianos propostos e 22% apresentaram

distoro de ligao.

16

2.5 Deteco e mapeamento de QTLs

A maioria das caractersticas de interesse agronmico em plantas so

controladas por vrios genes. Nesse caso, os fentipos resultantes apresentam uma

variao contnua ao invs de classes fenotpicas discretas. Os genes ou locos

cromossmicos que controlam essas caractersticas quantitativas so denominados

de QTL (Quantitative Trait Loci) (FACONER & MACKAY, 1996).

O mapeamento de QTLs envolvidos na manisfestao de diversos caracteres

de interesse se d com base entre as relaes fenotpicas e genotpicas (atravs de

marcadores moleculares), podendo estar associado a um efeito positivo ou negativo

na caracterstica.

Entretanto, os testes estatsticos so viezados, porque existe uma confuso

entre efeito de QTL e a distncia do marcador, resultando em um baixo poder de

detectar quando as marcas no esto completamente cobertas pelo genoma ou

quando uma pequena amostra considerada (DOERGE et al., 1997; DOERGE,

2002). Existem vrios softwares que so capazes de detectar QTLs em cana-de-

acar, entre eles, o MAPMAKER/QTL e o SAS usados por MING et al. (2001) e

MING et al. (2002), bem como o QTL Cartografer, usado por AITKEN et al. (2008).

O mapeamento de QTLs de suma importncia uma vez que pode aumentar

o conhecimento das relaes existentes entre a influncia dos genes com a

produo de acar e as caractersticas relacionadas, facilitando a determinao e

manipulao dessas caractersticas para o desenvolvimento de variedades

superiores de cana-de-acar (MING et al., 2002).

Os caracteres quantitativos so altamente influenciados pelo ambiente e

expressam distintos graus da interao gentipo x ambiente, isto , aquele(s)

gentipo(s) que tem um desempenho diferenciado em distintos ambientes

(FACONER & MACKAY, 1996). Por isso importante estudar as caractersticas

quantitativas em diferentes ambientes (anos), pois se um QTL detectado para

17

ambos, a chance dele estar ligado ao valor genotpico do indivduo maior do que

estar expressando apenas o fentipo, apresentando maiores possibilidades de

ligao com a caracterstica avaliada e utilizao na seleo assistida. Estudos de

deteco de QTLs em distintos anos foram feitos por HOARAU et al. (2002), AITKEN

et al. (2006), AITKEN et al. (2008) e PINTO et al. (2009) (Tabela 2).

A tabela 2 apresenta alguns resultados publicados de mapeamento de QTLs

em cana-de-acar, identificando o tipo de prognie que foi utilizado bem como os

marcadores moleculares, as caractersticas relacionadas com os respectivos nveis

de significncia, o efeito que as marcas detectadas apresentam sobre as variaes

fenotpicas das caractersticas e o coeficiente de regresso (R2), como sendo a

porcentagem da variao fenotpica atribuda ao QTL.

O fato dos efeitos dos QTLs serem baixos atribudo a condio de

poliploidia da cana-de-acar, sendo que a presena de vrios alelos exercendo

influncia sobre a mesma caracterstica resulta em vrios alelos com baixo efeito

individual (AITKEN et al, 2008).

18

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ra d

o co

lmo

22*

(25*

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,74

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96 a

12,

18)

1 a

5%

(2 a

6%

)

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de c

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38

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96 a

2,6

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1 a

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(2 a

5%

)

Brix

10

* (1

2*)

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1 a

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0,4

5)

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TKEN

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l. (2

006)

Po

l 20

* (1

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2 a

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1,78

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%)

IJ76

-514

x Q

165A

1 AF

LP e

SSR

Peso

do

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o 22

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2*)

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8 a

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%)

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(200

8)

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23

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6%

)

19

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(-1,

02 a

1,2

7)

2 a

9%

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4%

)

Altu

ra d

o co

lmo

16*

(13*

) -1

2,28

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(-

9,41

a 1

0,11

) 2

a 6%

(2

a 7

%)

TCH

22

* (1

1*)

-13,

72 a

12,

78

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71 a

8,1

9)

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7%

(2 a

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)

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-180

x S

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4966

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a 15

* (1

2*)

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0,76

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0,90

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99 a

10,

9%

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9,8%

)

PIN

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t al.

(200

9)

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11

* (1

8*)

-31,

29 a

12,

67

(-32

,29

a 12

,62)

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a

18,1

2%

(4,1

4 a

7,85

%)

Pol

19*

(15*

) -1

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a 0,

71

(-0,

76 a

0,8

1)

4,48

a 8

,89%

(3

,98

a 12

,60%

)

TPH

13

* (1

7*)

-3,4

8 a

2,17

(-

3,19

a 2

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4,36

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0,1%

(4

,03

a 9,

82%

) N

vel

de

sign

ific

ncia

ent

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ass

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o

da m

arca

com

a c

arac

ters

tica

aval

iada

: *p

20

3. MATERIAL E MTODOS

3.1 Populao de mapeamento

A populao de mapeamento foi constituda de 200 indivduos tomados ao

acaso de uma prognie derivada de um cruzamento bi-parental entre o clone elite

IACSP95-3018 (genitor feminino) e a cultivar IACSP93-3046 (genitor masculino),

realizado no ano de 2004 na estao experimental do Centro de Tecnologia

Canavieira (CTC) em Camamu (BA). O clone IACSP95-3018 bastante utilizado

como genitor em programas de melhoramento e apresenta suscetibilidade

ferrugem, enquanto a cultivar IACSP93-3046 apresenta altos nveis de sacarose,

bom perfilhamento, colmos eretos sendo recomendada para colheita mecanizada e

com resistncia ferrugem.

O experimento foi conduzido na fazenda Nova Aliana no municpio de Salles

Oliveira-SP, nos anos agrcolas de 2007/08 e 2008/09. O delineamento experimental

utilizado foi de blocos ao acaso, com quatro repeties. Cada bloco foi formado por

quatro linhas de 118 metros, espaadas 1,5 metros e as parcelas de dois metros

lineares alocadas nessas linhas. Os blocos foram formados com os 220 clones, mais

quatro repeties das duas variedades utilizadas como padres, SP81-3250 e

RB835486, e dos dois genitores. Cada bloco teve como bordadura a IAC86-2480

(infectora da ferrugem marrom) alm de mais uma bordadura no experimento todo

com a IAC86-2210 (infectora do mosaico). A prognie apresenta variabilidade para

os componentes de produo percentual de Brix, perfilhamento e altura de colmos e

tambm para resistncia a doenas como, por exemplo, a ferrugem.

21

3.2 Avaliaes fenotpicas

Depois de decorrido 12 meses do plantio em ambos os anos (cana planta e

cana soca), amostras de 10 canas-de-acar foram coletadas de cada clone e

genitores e avaliadas para os componentes de produo e os parmetros de

qualidade. Foram estimados, para as quatro repeties nos dois anos, os

componentes de produo:

a) dimetro do colmo, amostrando-se dez colmos seguidos na linha,

mensurado com paqumetro no meio do entren localizado no

comprimento mdio do colmo;

b) peso dados em kilos (kg) do feixe constitudo de 10 colmos

c) altura do colmo, medido da base insero da folha +3, estimado nos

mesmos dez colmos;

d) nmero de colmos estimado com a contagem dos colmos no sulco de 2m

e) TCH (Toneladas de cana por hectare) valor estimado com base no

nmero de colmos da parcela (NC) e no peso do feixe de 10 colmos (P),

atravs da equao

TCH= NC x P x 0,667

Os parmetros de qualidade, Fibra, Brix e Pol%Cana tambm foram

mensurados de amostras de 10 canas-de-acar coletadas de cada clone e

genitores, de acordo com os mtodos descritos no guia CONSECANA (2006).

Devido aos altos custos que essas anlises requerem, somente dois dos quatro

blocos foram avaliados. Brix refere a estimativa do total de slidos solveis que

esto presentes no caldo, enquanto Pol%Cana definido como a quantidade de

sacarose presente em 100ml da soluo e Fibra refere-se a matria insolvel em

gua que est presente no colmo.

22

3.2.1 Anlise dos dados

As dez caractersticas avaliadas foram submetidos a anlise de varincia pelo

programa estatstico SAS (SAS, 1990) e comparado os nveis de significncia entre

blocos, entre os clones, entre genitores. Tambm foi calculado o coeficiente de

variao do experimento (CV%), o erro, atravs do resduo do quadrado mdio, bem

como a mdia dos genitores e dos clones.

A anlise de varincia foi calculada para cada caracterstica de cada ano da

cultura, baseada no modelo abaixo:

ijiij g+b+=Y +j ,

Onde, igb ,, j e ij so a mdia geral, efeito de bloco, efeito do gentipo e efeito do

erro, respectivamente. Os efeitos de gentipos foram separados em efeitos de

clones, de genitores e de padres, com auxlio de variveis que as identificavam.

Herdabilidade no sentido amplo ( 2h ) para cada caracterstica em cada ano foi

determinada por (FALCONER & MACKAY, 1996)

222 pgh = ,

Onde, 2 g = varincia genotpica e

2 p = varincia fenotpica, sendo que esta

determinada por:

regp222 += ,

Onde, 2 e = varincia do erro e r = nmero de repeties.

A correlao fenotpica entre as caractersticas X e Y, foi determinada por:

23

Cor(x,y)= (Cov (x,y) / (V(x). V(y))1/2 ,

Onde, Cov (x,y)= componentes da covarincia entre os caracteres X e Y; V(x) e

V(y)= varincia dos caracteres X e Y, respectivamente.

Todas as anlises estatsticas dos dados fenotpicos foram calculadas atravs

do programa estatstico SAS (1990).

3.3 Avaliaes com Marcadores Moleculares

3.3.1 Extrao e quantificao do DNA genmico

O DNA genmico total foi extrado utilizando o interndio +1 da cana-de-

acar (primrdios foliares), conforme o mtodo de AL-JANABI et al. (1999). O DNA

de cada indivduo foi quantificado na presena de um padro de DNA do fago de quantidades conhecidas em gel de agarose 0,8% (p/v) corado com brometo de

etdio.

3.3.2 Marcadores microssatlites

Foram utilizados 35 microssatlites genmicos (gSSRs) (CORDEIRO et al.,

2000) previamente mapeados na populao do Centro de Tecnologia Canavieira

(SOUZA, 2003) e 71 microssatlites funcionais provenientes das etiquetas de

seqncias expressas (EST-SSRs) do banco de dados do SUCEST, os quais vm

sendo desenvolvidos no Laboratrio de Biologia Molecular de Plantas (Centro de

Biologia Molecular e Engenharia Gentica - CBMEG/UNICAMP). Grande parte

destes EST-SSRs apresentam homologia a genes de interesse.

24

As reaes de PCR foram efetuadas em um volume final de reao de 25 l

contendo 40 ng do DNA molde, 0,2M de cada par de primer (forward e reverse),

100 M de cada dNTP, 2,0 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, e 0,5 unidades de Taq DNA polimerase. O programa de amplificao constou de uma desnaturao

inicial 940C por 5 minutos, seguida de 30 ciclos, cada ciclo contendo uma etapa de

desnaturao 940C por 30s, temperatura de anelamento especfica para cada par

de primer (forward/reverse) por 30s, extenso 730C por 30s, e um ciclo final 730C

por 3 minutos. Os produtos da amplificao foram misturados com tampo

formamida (contendo 98% formamida; 10 mM EDTA; 0,025% azul de bromofenol;

0,025% xilene cyanol) na proporo (2 tampo:1 amostra) e desnaturados 950C

por 5 minutos. As amostras foram separadas por eletroforese em gel de

poliacrilamida desnaturante a 5% utilizando ladder de 10 bp como marcador de peso

molecular. As bandas foram reveladas pela colorao com prata de acordo com o

protocolo estabelecido por CRESTE et al. (2001).

3.3.3 Avaliao com marcadores AFLP

Os marcadores AFLPs foram obtidos segundo o mtodo de Vos et al. (1995).

Para a obteno dos marcadores AFLP, 300ng de DNA genmico foram digeridos

duplamente com as enzimas de restrio EcoRI e MseI e os fragmentos obtidos

ligados a adaptadores especficos. Os produtos da digesto ligao foram diludos 6

vezes em gua miliQ antes da pr-amplificao com primers de uma base seletiva.

Os produtos da pr-amplificao foram diluidos 10 vezes em gua miliQ e utilizados

nas reaes da amplificao seletiva compostas por combinaes de primers

(EcoRI/MseI) de trs bases seletivas (AAC/CAA, AAC/CAC, AAC/CAT, AAG/CAG,

AAG/CAT, ACC/CTC, ACG/CAG, ACG/CTT, ACT/CAG, ACT/CAT, ACT/CTG,

ACT/CTT, AGA/CTG, AGC/CAG, AGC/CTC). Aos produtos amplificados foram

adicionados tampo formamida a 98% (v/v) contendo 10 mM EDTA, 0,025% (p/v) de

azul de bromofenol e 0,025% (p/v) de xileno cianol (2:1). Aps desnaturao 900C

por 4 minutos foram separados em gel de poliacrilamida desnaturante a 6% e

25

revelados pela colorao com prata segundo protocolo descrito por CRESTE et al.

(2001).

3.3.4 Anlise da segregao de marcadores

A partir dos resultados observados nos gis, procedeu-se anlise da

segregao dos marcadores, sendo que os indivduos da prognie de mapeamento

e os genitores foram genotipados com base na presena (1) e ausncia (0) do

marcador. A cada marcador foi aplicado o teste estatstico qui-quadrado (2) para avaliar a distoro de segregao em relao s propores dos marcadores em

dose nica (MDU) 1:1 (presente em apenas um dos genitores) e 3:1 (presente em

ambos os genitores) ao nvel de significncia p

26

A anlise de marcas simples e simultneas foi calculada pelo SAS (1990) pela

anlise de marcas simples entre os marcadores em dose nica (MDUs) e o valor

fenotpico atribudo a cada clone individualmente, atravs de associaes mltiplas e

simples, seguindo a descrio feita por GILMOUR (2007) com algumas adaptaes.

Foi realizada uma primeira anlise de regresso linear mltipla envolvendo

todos os MDUs. Foi adotado como padro de seleo a sada da primeira marca

com contribuio para a variao da caracterstica, desta forma, eliminou as marcas

que eram muito dependentes ou ligadas, obtendo o poder explicativo (R2) mltiplo de

cada caracterstica.

A partir das marcas pr-selecionadas, usando modelos de regresso linear

simples, foram determinados os efeitos de marca simples de cada caracterstica

para cada marca, ou seja, o aumento ou a diminuio fenotpica esperada predita,

pela presena da marca e seu respectivo (R2) simples, sem isolar influncias

simultneas de outras marcas.

27

4. RESULTADOS

4.1 Anlises dos dados fenotpicos

Os resultados gerais das anlises de varincias realizados entre os genitores

e clones em cana planta e cana soca esto resumidos na tabela 3. Foi detectada

uma forte influncia de bloco (p

28

Tabe

la 3

. Q

uadr

ados

md

ios

da a

nlis

e de

var

inc

ia p

ara

dim

etro

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ra,

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ero

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(NC

), TC

H,

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s 22

0 cl

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em

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ncia

pel

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Al

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Fi

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Brix

Po

l%C

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P

S P

S P

S P

S P

S P

S P

S P

S

Bloc

o 0,

39**

0,

76**

38

,26*

* 37

,88*

* 23

042,

03**

10

802,

91**

51

,31*

56

,39*

76

22,0

6*

4062

,53*

* 1,

13N

S

13,0

8**

41,1

9**

23,3

7**

18,3

8**

7,67

*

Clo

nes

0,20

**

0,24

**

19,4

4**

11,5

2**

2049

,63*

* 13

60,4

1**

15,1

2*

41,1

8**

1755

,03*

* 16

81,5

5**

1,81

**

1,74

**

2,49

**

1,91

**

1,90

**

1,74

**

Gen

itore

s 0,

41*

0 43

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0,

04N

S

1104

,50N

S

361,

54N

S

12,5

0NS

134,

84*

393,

79N

S

6559

,35*

4,

51*

0,90

NS

0,74

NS

0,14

NS

0,01

NS

2,10

NS

CV

8,

07

8,89

19

,21

19,8

9 12

,63

10,5

6 28

,69

25,7

8 37

,25

33,6

4 7,

14

5,27

3,

62

4,18

5,

41

5,32

QM

res

0,

05

0,05

4,

54

2,80

66

8,25

37

6,93

12

,06

9,69

11

16,0

1 53

1,39

0,

84

0,46

0,

57

0,78

0,

71

0,73

M G

enito

res

2,86

2,

62

13,4

7 10

,52

218,

43

191,

92

11,6

8 12

,41

104,

57

87,2

7 12

,82

12,2

9 20

,91

21,6

8 15

,76

16,9

3

M C

lone

s 2,

72

2,46

10

,97

8,28

20

3,55

18

2,92

12

,12

12,2

1 88

,82

68,2

8 12

,84

12,8

8 20

,82

21,0

7 15

,62

16,0

3

*Sig

nific

ativ

o ao

nv

el d

e 5%

(p

29

Para as outras caractersticas, isto , as que so dependentes do estande do

campo, valores de at 12% do coeficiente de variao indicam uma alta preciso

experimental (PERECIN et al., 2004), sendo que apenas dimetro em cana planta e

cana soca (8,07 e 8,89) e altura em cana soca (10,56) se enquadram nos valores

recomendados. Outra classificao feita por PIMENTEL GOMES (1985) enquadra a

faixa de variao da ordem de 10 a 20%, como apresentando ainda uma boa

preciso experimental, classificando peso (19,21 e 19,89, cana planta e cana soca)

e altura (12,63 cana planta) como boas referncias de conduo experimental. As

caractersticas nmero de perfilhos (28,69 e 25,78) e TCH (37,25 e 33,64), cana

planta e cana soca, respectivamente, apresentam valores de baixa preciso

experimental, concluindo que grande parte da sua variao atribuda ao ambiente.

A mdia geral das caractersticas estudadas entre genitores e clones no

apresentaram grande diferenas. Ao compar-las pode constatar-se que houve uma

pequena depresso nos valores dos genitores para os clones. Isto se atribui

depresso endogmica que ocorre no cruzamento entre plantas algamas,

observadas pela diminuio das mdias dos valores fenotpicos. Alm disso, os

genitores que foram utilizados no cruzamento para obteno dos clones,

apresentam alto padro de qualidade e, na meiose, quando ocorre a recombinao

allica, alguns genes favorveis podem no serem transmitidos s prognies,

havendo um pequeno decrscimo nas mdias de suas caractersticas fenotpicas.

A freqncia de distribuio dos valores fenotpicos dos clones e os valores

fenotpicos mdios dos genitores em cana planta e em cana soca podem ser

observadas na figura 1. Com exceo do dimetro do colmo, os valores fenotpicos

dos genitores para todas as caractersticas avaliadas, tanto em cana planta como

em cana soca, mostraram-se diferentes, contribuindo para a variao fenotpica

observada entre os clones. A variao dos valores fenotpicos dos clones

(amplitude) foi maior do que a diferena encontrada entre os genitores para todas as

caractersticas e para os dois ciclos avaliados, evidenciando a ocorrncia de

segregao transgressiva da prognie.

As distribuies fenotpicas aliadas s mdias obtidas entre os clones indicam

um maior desempenho das prognies derivadas de cana planta para dimetro, peso

e altura do colmo e TCH, podendo ser notado pela distribuio direita dos grficos

30

Dimetro do colmo (cm)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1,75

1,85

1,95

2,05

2,15

2,25

2,35

2,45

2,55

2,65

2,75

2,85

2,95

3,05

3,15

3,25

3,35

3,45

Cana plantaCana soca

P2 (2,75 2,62)

P1 (2,97 2,62)

Peso do colmo (Kg)

0

5

10

15

20

25

30

35

4,50

5,50

6,50

7,50

8,50

9,50

10,50

11,50

12,50

13,50

14,50

15,50


P1 (14,64 10,48)

P2 (12,30 10,56)

Altura do colmo (cm)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260


P2 (212,56 188,50)P1 (224,31 195,34)

Nmero de perfilhos

0

4

8

12

16

20

24

28

2 4 6 7,5 8,5 9,5 10,5

11,5

12,5

13,5

14,5

15,5

16,5

17,5 18


P1 (11,06 10,33)

P2 (12,31 14,50)

TCH

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140


P2 (101,08 101,82)

P1 (108,08 72,72)

Fibra

0

5

10

15

20

25

30

35

10,75

11,25

11,75

12,25

12,75

13,25

13,75

14,25

14,75

15,25

15,75


P1 (12,33 12,05)

P2 (13,30 12,54)

Brix

0

5

10

15

20

25

30

18,3

18,5

18,8 19

19,3

19,5

19,8 20

20,3

20,5

20,8 21

21,3

21,5

21,8 22

22,3

22,5

22,8 23


P1 (20,75 21,78)

P2 (21,07 21,58)

Pol%Cana

0

5

10

15

20

25

30

1313

,313

,513

,8 1414

,314

,514

,8 1515

,315

,515

,8 1616

,316

,516

,8 1717

,317

,517

,8


P1 (15,78 15,74) P2 (16,31 16,56)

Figura 1. Freqncia de distribuio dos valores fenotpicos para dimetro, peso, altura, nmero de perfilhos, TCH, Fibra, Brix e Pol%Cana dos 220 clones de cana-de-acar em cana planta e cana soca. P1: IACSP95-3018; P2: IACSP93-3046.

31

e dos maiores valores das mdias dos clones. Essas condies que afetaram

positivamente o vigor da planta foram mais desfavorveis para o seu

amadurecimento, constatado pelo menor desempenho entre os clones para Brix e

Pol%Cana em relao cana soca, e confirmado pelo posicionamento dos grficos

esquerda, bem como pelos menores valores mdios dos clones. Resultados

semelhantes foram relatados por HOARAU et al. (2002) que tambm encontraram

oposio entre vigor e amadurecimento da planta em diferentes ciclos da cultura de

cana-de-acar. Em ambas as situaes h indicativas que as variaes dessas

caractersticas se devem ao efeito da interao do gentipo com o ambiente.

4.1.1 Herdabilidade

A herdabilidade no sentido amplo encontrada entre os 220 clones de cana-de-

acar para todas as caractersticas avaliadas variou de 0,24 (nmero de perfilhos)

a 0,78 (peso do colmo) em cana planta e de 0,59 (Pol%Cana) a 0,80 (dimetro do

colmo) em cana soca, indicando que estas so as partes da variao fenotpica

atribudas ao gentipo.

De acordo com a classificao descrita por RESENDE (2002) a herdabilidade

pode ser considerada como de baixa magnitude quando h2 < 0,15, mdia magnitude

entre 0,15 < h2 < 0,50 e alta magnitude com h2 > 0,50. Conforme a Tabela 4, apenas

as caractersticas nmero de perfilhos (0,24) e TCH (0,39), ambas em cana planta,

apresentaram baixa herdabilidade, refletindo uma grande interferncia do ambiente

na variao de suas caractersticas, confirmado pelo alto valor do coeficiente de

variao.

Observa-se tambm que as demais herdabilidades foram consideradas de

moderadas a altas, possivelmente indicando um bom controle ambiental. Esses

moderados valores evidenciam que as caractersticas avaliadas apresentam uma

expressiva herana gentica, mas que ainda so sensveis a variao do ambiente.

Valores de herdabilidade moderados a altos tambm foram reportados para

dimetro e altura do colmo e nmero de perfilhos (HOARAU et al., 2002, AITKEN et

32

al., 2008), peso do colmo (AITKEN et al., 2008), TCH e fibra (PINTO et al., 2009) e

Brix e Pol%Cana (BADALOO & RAMDOYAL, 2003, AITKEN et al., 2006), todos

apresentando em comum as prognies derivadas de um cruzamento bi-parental.

Tabela 4. Estimativas dos componentes de varincia ( 2g ) e ambiental (2e ) e

herdabilidade (h2) no sentido amplo dos parmetros dimetro, peso, altura do colmo, nmero de perfilhos, TCH, calculados para quatro repeties e Brix, Fibra e Pol%Cana, calculado para duas repeties, dos 220 clones de cana-de-acar.

Cana planta Cana soca 2g

2e h2 2g

2e h2

Dimetro do colmo 0,04 0,05 0,77 0,05 0,05 0,80 Peso do colmo 3,86 4,32 0,78 2,25 2,76 0,77 Altura do colmo 355,40 655,12 0,68 247,66 387,01 0,72

Nmero de perfilhos 0,78 11,97 0,24 7,69 9,84 0,76 TCH 173,89 1078,60 0,39 292,46 509,14 0,70 Fibra 0,39 0,77 0,50 0,66 0,45 0,75 Brix 0,42 0,56 0,62 0,58 0,76 0,60

Pol%Cana 0,34 0,68 0,50 0,52 0,72 0,59 2g =varincia gentica,

2e =varincia do ambiente, h2=herdabilidade no sentido

amplo.

4.1.2 Correlao entre as caractersticas

As estimativas de correlao fenotpicas das caractersticas em cana planta

(rp), cana soca (rs) e entre cana planta e cana soca (rps) esto expostas na tabela 5.

Foram encontrados valores baixos e positivos, tanto em cana planta quanto em cana

soca, da correlao fenotpica para dimetro do colmo com altura do colmo (rp=0,11

e rs=0,06), TCH (rp=0,36 e rs=0,19) e Pol%Cana (rp=0,19 e rs=0,18), entre o peso do

colmo com Brix (rp=0,13 e rs=0,21) e com Pol%Cana (rp=0,23 e rs=0,34), da altura do

colmo com nmero de perfilhos (rp=0,10 e rs=0,31), TCH (rp=0,40 e rs=0,53), fibra

(rp=0,03 e rs=0,07), Brix (rp=0,08 e rs=0,13) e Pol%Cana (rp=0,06 e rs=0,18), do

nmero de perfilhos com fibra (rp=0,02 e rs=0,27) e com Brix (rp=0,01 e rs=0,28) e do

TCH com Brix (rp=0,08 e rs=0,31) e com Pol (rp=0,11 e rs=0,34).

33

Moderadas correlaes fenotpicas entre dimetro e peso do colmo (rp=0,60 e

rs=0,60), entre o peso com a altura do colmo (rp=0,53 e rs=0,53) e com o TCH

(rp=0,66 e rs=0,65), bem como altas correlaes fenotpicas entre nmero de

perfilhos e TCH (rp=0,74 e rs=0,80), brix e Pol%Cana (rp=0,87 e rs=0,91) foram

encontrados em cana planta e cana soca. Enquanto valores baixos e negativos de

correlaes fenotpicas entre fibra com dimetro do colmo (rp=-0,28 e rs=-0,35), com

peso do colmo (rp=-0,22 e rs=-0,13) e com pol (rp=-0,34 e rs=-0,03) foram obtidos

tambm em ambos os ciclos.

Tabela 5. Estimativas de correlaes fenotpicas, sendo que as que envolvem caractersticas de produo (dimetro, peso, altura do colmo, nmero de perfilhos e TCH) foram calculadas com quatro repeties, e as que envolvem parmetros de qualidade (Fibra, Brix e Pol%Cana) foram calculadas considerando apenas duas repeties. Acima da diagonal esto as correlaes para cana planta, abaixo as para cana soca e na diagonal as entre anos.

CP/ CS DC PC AC NP TCH Fibra Brix Pol%Cana DC 0,007NS 0,60** 0,11* -0,03NS 0,36** -0,28** 0,06NS 0,19** PC 0,60** 0,10* 0,53** 0,03NS 0,66** -0,22** 0,13* 0,23** AC 0,06NS 0,53** -0,01NS 0,10* 0,40** 0,03NS 0,08NS 0,06NSNP -0,22** 0,14* 0,31** 0,04NS 0,74** 0,02NS 0,01NS -0,02NS

TCH 0,19** 0,65** 0,53** 0,80** 0,16* -0,13* 0,08NS 0,11* Fibra -0,35** -0,13NS 0,07NS 0,27** 0,12* 0,04NS -0,3NS -0,34** Brix 0,02NS 0,21** 0,13NS 0,28** 0,31** 0,26** 0,10* 0,87**

Pol%Cana 0,18* 0,34** 0,18* 0,23** 0,34** -0,03NS 0,91** 0,09* CP=cana planta, CS=cana soca, DC=dimetro do colmo, PC=peso do colmo, AC=altura do colmo, NP= nmero de perfilhos, TCH=toneladas de cana por hectare.

A correlao obtida das caractersticas entre os anos mostrou-se de baixa

significncia, sendo que apenas peso do colmo, TCH e Brix foram significativos

(p

34

Fibra e Pol%Cana

13

14

15

16

17

18

10 11 12 13 14 15 16

Fibra

Pol%

Can

a Cana plantaCana socaCana plantaCana soca

Figura 2. Estimativa de disperso das mdias individuais dos 220 clones de cana-de-acar entre Fibra e Pol%Cana em cana planta e cana soca.

4.2 Anlise de segregao dos marcadores moleculares

Analisando os perfis de bandas obtidos no gel dos genitores e dos clones, os

mesmos foram genotipados com base na presena (1) e ausncia (0) das marcas

(Figura 3).

Figura 3. Polimorfismo obtido com: A) microssatlite EST-SCB 27 e B) combinao ACT/CTG. Esquerda para direita: V) variante somaclonal do genitor IACSP93-3046, P1) genitor IACSP95-3018, P2) genitor IACSP93-3046 e amostra de indivduos da populao de mapeamento.

V P1 P2 Populao

P1 P2 Populo

A B

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