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sucesso da produção agrícoladepende fortemente do uso devariedades com desempenhosuperior e adaptadas aos am-bientes de cul t ivo. Na

inexistência de materiais gené- ticos superiores, não é possí-vel obter alta produtividade e

qualidade do produto. Desta forma, omelhoramento de plantas tem tido papelfundamental no desenvolvimento daagricultura, gerando novas variedadesem espécies de interesse agronômico. Oaumento na eficiência de seleção, omelhor conhecimento e caracterizaçãodo germoplasma e a maximização dosganhos genéticos têm sido objetivos demelhoristas de plantas do mundo inteiro.Novas formas de alcançar estes objetivos

têm sido constantemente perseguidas pelomelhoramento de plantas. Por isso ointeresse em tecnologias como as demarcadores de DNA ou moleculares.

Os melhoristas de plantas têm tradi-cionalmente selecionado variabilidadecom base no fenótipo (aparência de umindivíduo). Esta estratégia tem sido desucesso para características de altaherdabilidade (fenótipo reflete a consti-

tuição genética do indivíduo), mas nemsempre para características de baixaherdabilidade (fenótipo pode não refle-

tir o genótipo). Pelo fato de a maioria dascaracterísticas selecionadas no melhora-mento de plantas ser de natureza quan-

titativa, estratégias como teste de progê-nies e seleção em gerações avançadas

têm sido utilizadas para minimizar asdificuldades da seleção. Estas, contudo,não diminuem ou evitam os efeitos dainteração genótipo x ambiente, que po-dem mascarar o fenótipo. Este é a ex-pressão do genótipo (constituição gené-

tica de um indivíduo) sob condiçõesambientais específicas, e assim podemudar. Desta forma, selecionar o

fenótipo é como perseguir um alvo mó-vel, que muda com o ambiente. Umaforma de evitar este problema seria sele-

cionar indivíduos superiores com baseno genótipo, pois este independe doambiente e não muda durante o ciclo devida de um indivíduo. Embora isto pare-ça difícil, novas tecnologias estão dispo-

níveis que permitem ao melhorista acessare selecionar variabilidade a nível deDNA. O objetivo deste artigo é o deapresentar as diferentes tecnologias demarcadores moleculares e discutir comoestas podem auxiliar o melhoramento deplantas.

Tecnologias de marcadores

moleculares

Marcadores moleculares são carac- terísticas de DNA que diferenciam doisou mais indivíduos e são herdadas gene-

t icamente. Os dis t intos t ipos demarcadores moleculares hoje disponí-veis diferenciam-se pela tecnologia utili-zada para revelar variabilidade a nível deDNA, e assim variam quanto à habilida-de de detectar diferenças entre indivídu-os, custo, facilidade de uso, consistênciae repetibilidade. Os principais tipos demarcadores moleculares podem ser clas-sificados em dois grupos, conforme ametodologia utilizada para identificá-los:hibridização ou amplificação de DNA.Entre os identificados por hibridizaçãoestão os marcadores RFLP (RestrictionFragment Length Polymorphism; Botsteinet al., 1980) e minissatélites ou locosVNTR (Variable Number of TandemRepeats; Jeffreys et al., 1985). Já aquelesrevelados por amplificação incluem osmarcadores do tipo: RAPD (Random

Amplified Polymorphic DNA; Williams et al., 1990); SCAR (Sequence Characterized

Amplified Regions); STS (SequenceTagged Sites) (Paran & Michelmore, 1993);Microssatélite (Litt & Lutty, 1989); e AFLP(Amplif ied Fragment LengthPolymorphism; Vos et al., 1995). As prin-

cipais etapas requeridas para obtençãode resultados variam com o tipo demarcador molecular utilizado (tabela 1).

Aplicações no melhoramento de plantas

MARCADORES DE

DNA

Sandra C.K. Milach

UFRGS, Departamento de

Plantas de Lavoura

Sandra Millach é autora do Livro

"Marcadores Moleculares em Plantas" [email protected]



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Mais detalhes sobre as técnicas aquiapresentadas podem ser encontrados emMilach (1998a) e Ferreira & Gratapaglia(1995). As tecnologias de marcadoresmoleculares estão evoluindo rapidamentee modificações já existem para algumasdas técnicas acima mencionadas. Contu-do, os tipos de marcadores aqui listadossão ainda os mais utilizados em estudosgenéticos e programas de melhoramen-

to. Atributos como consistência e tem-

po para obtenção de resultados, nível depolimorfismo obtido, custo e facilidadede uso são importantes para aimplementação de marcadoresmoleculares na rotina de um programade melhoramento. A comparação dos

tipos de marcadores para essas caracte-rísticas encontra-se na tabela 2. Enquan-

to que marcadores de RFLP têm sidoutilizados em estudos de mapeamentocomparativo por causa da consistênciados resultados obtidos, estes tendem a

ser mais caros e mais difíceis deimplementar em programas de melhora-mento de plantas. Por outro lado,marcadores identificados por amplifica-ção, especialmente RAPDs, são mais fá-ceis de manipular e de custo menor,embora sejam de resultados menos con-sistentes. A conversão de marcadores deRFLP em STS e RAPD em SCAR tem sidoapontada como uma excelente opçãopara a seleção assistida por marcadoresmoleculares. Com exceção do tipo deprimer utilizado, SCAR e STS são muitosemelhantes à técnica de RAPD, com a

vantagem de serem mais consistentes e adesvantagem de envolverem o desenvol-vimento de primers, o que eleva o custo.Uma vez que os primers estejam dispo-níveis, estas técnicas apresentam custocomparável ao RAPD. Este fato, associa-do à consistência de SCAR e STS, incluiestas entre as técnicas mais promissoraspara implantação rotineira em progra-mas de melhoramento de plantas. Outrosmarcadores como microssatélites e AFLPrevelam mais polimorfismo e têm sido amelhor opção para espécies onde este élimitado. Muitos são os aspectos envol-

vidos na escolha do tipo de marcadormolecular a ser utilizado, por isso nãoexiste aquele que possa ser consideradosuperior para todos os atributos. Por estarazão, as opções disponíveis devem seranalisadas antes de ser decidido o tipode marcador a ser empregado.

Aplicações de marcadores de DNA

no melhoramento de plantas

As etapas fundamentais de um pro-grama de melhoramento de plantas são:obtenção da variabilidade genética; sele-ção de indivíduos superiores; e avalia-ção de materiais genéticos promissores

para lançamento comercial. Apesar deganhos genéticos significativos terem sidoobtidos na seleção de características deinteresse na maioria das espécies deimportância agronômica, a expectativade progresso genético e obtenção deindivíduos ainda melhores permanece.Por esta razão, os melhoristas de plantas

têm buscado formas de continuar obten-do ganhos genéticos, tornando cada vezmais eficiente cada uma das etapas doprograma. A essência deste progressoestá em o quanto o fenótipo de umindivíduo expressa o seu genótipo. Porisso que o uso de marcadores molecularespode auxiliar o melhoramento de plan-

tas, pois possibilita acessar diretamenteo genótipo de um indivíduo. Assim,entre as principais aplicações demarcadores de DNA em programas demelhoramento de plantas estão: omonitoramento e organização da varia-bilidade genética; a seleção assistida pormarcadores moleculares; e a proteçãode cultivares (Lee, 1995). Cabe salientar,contudo, que estas aplicações não de-vem ser generalizadas a todos os progra-mas de melhoramento, e não terão a

mesma importância em todas as espéciede plantas. Isso porque o modo dreprodução, as características de interesse, o valor da unidade de seleção, progresso genético já obtido e outroaspectos pertinentes variam grandemententre espécies e programas de melhoramento. Por isso, identificar as caracterí

ticas de interesse e estabelecer objetivoclaros para um programa de melhoramento são passos que precedem a ques

tão: como os marcadores de DNA podem auxiliar o programa? Como outra

tecnologias, os marcadores moleculare terão grande impacto e utilização ealgumas situações, mas não em toda

Assim, cabe aos melhoristas junto coos especialistas na área molecular decdirem caso a caso se devem ou nãutilizar esta tecnologia. Para tomar estdecisão, contudo, é necessário vislumbrar o potencial de aplicação dessa

técnicas, o qual discutiremos a seguirResponder a questão "como o

marcadores moleculares podem auxiliao melhoramento de plantas?" não é difcil. O difícil e nem sempre claro é responder "quando, em que situações, utlizar marcadores moleculares?". Vamoabordar uma questão de cada vez.

Em termos de variabilidade genétca, marcadores moleculares permitemcompreender e organizar a variabilidadgenética de um programa de melhoramento de forma única, isto é, acessandvariabilidade de DNA, que não é influenciado pelo ambiente como são, por exemplo, os caracteres morfológicos

fenotípicos em geral de uma planta. Aprimeira conseqüência disto é a possiblidade de planejar os cruzamentos dum programa de forma a maximizar adiferenças genéticas entre genótipos el

tes, diferenças essas que muitas veznão podem ser observadas a nível dfenótipo. A segunda é a possibilidade dorganizar o germoplasma do programem pools gênicos, facilitando a escolhe diminuindo o número de combinaçõea serem feitas pelo melhorista.

Em espécies alógamas como milhe girassol, os marcadores podem aind

auxiliar no estabelecimento de grupoheteróticos (Hongtrakul et al., 1997), dminuindo substancialmente o númerde cruzamentos-testes a serem avaliadoe posteriores combinações híbridaComo conseqüência do estudo da varabilidade genética, muitas vezes é possvel identificar o padrão molecular (ofingerprinting) de genótipos de interese, que pode ser posteriormente utilizado para a proteção do germoplasmaPara maior discussão sobre o uso dmarcadores moleculares na caracterização de cultivares ver Milach (1998bMarcadores moleculares podem ser empregados também na seleção de caracte



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rísticas de interesse. Neste caso, é neces-sário primeiro identificar marcadores as-sociados a essas características atravésdo mapeamento molecular (Milach,1998c). Uma vez que esta informaçãoesteja disponível, é possível selecionaros indivíduos com o marcador de inte-resse, sem que haja necessidade de ava-liar o fenótipo dos mesmos. Esta, tam-bém conhecida como seleção assistidapor marcadores moleculares (SAMM),pode ter grande impacto nos casos emque a característica de interesse é deavaliação difícil e cara. Também no casode espécies perenes, de ciclo longo,

quando houver necessidade de esperaralguns anos até que a característicafenotípica se expresse. O sucesso daSAMM dependerá do grau de associaçãoentre marcador e característica de inte-resse: quanto maior, menor a chance deocorrer recombinação entre marcador egene que controla a característica, emaior será a eficiência da seleção. Sali-entamos que o marcador, na maioria dasvezes, está associado à característica,não sendo o gene que controla a mesma.De acordo com Lee (1995), a expectativada maioria dos melhoristas de plantas

questionados em seu estudo em relaçãoà SAMM foi do uso desta para reduzir o

tempo necessário na transferência de

genes de interesse, especialmente transgenes, por retrocruzamento. Nestecaso, os marcadores podem ser utiliza-dos de duas formas: para selecionar osindivíduos com o maior número demarcadores semelhantes àqueles do pairecorrente e que possuam o transgenede interesse.

Os exemplos de SAMM ainda sãoescassos na literatura, especialmenteporque as informações de programas demelhoramento de empresas privadas, quesão hoje, possivelmente, os principaisexecutores de SAAM, não estão disponí-veis. Além disso, o limitado uso de SAAM

em programas de melhoramento podeser conseqüência do custo e os procedi-mentos elaborados da maioria dosmarcadores disponíveis. Mesmo assim,alguns exemplos publicados, como é ocaso da transferência de genes favorá-veis de espécies selvagens para cultivadapara aumento de tamanho de fruto em

tomate (Tanksley et al., 1996; Tanksley &McCouch, 1997), indicam o grande po-

tencial da SAAM para o melhoramen- to de plantas. Também utilizando ummarcador associado à característica debaixa absorção de cádmio em Triticum

durum (Penner et al., 1995a), o grupo doDr. Penner avaliou em 1996/1997 duasmil linhagens avançadas de trigo duro

no Canadá, selecionando as com menorcapacidade de absorção deste metal(Penner, comunicação pessoal). A pos-s ibi l idade de conver ter t ipos demarcadores mais elaborados e caros,como RFLP, em mais simples, como STS(Penner et al., 1995b), indica que o usodestes para seleção indireta tende a cres-cer nos próximos anos. Por fim, o co-nhecimento do padrão molecular degenótipos poderá ser utilizado, além daproteção legal, para garantir a purezagenética dos mesmos durante os anos deavaliação, bem como após o lançamentocomercial. Em relação à pergunta "em

que circunstâncias utilizar marcadoresmoleculares no programa de melhora-mento de plantas?", acreditamos que omelhorista deva resolver este aspectocom base na resposta a outras perguntasque agora formulamos. Em termos devariabilidade genética: i) quão difícil épara o melhorista escolher os genótiposgenitores e decidir que combinaçõesfazer em número razoável? Se muitodifícil em função do grau de parentescodos genótipos elites do programa,marcadores podem auxiliar; ii) a variabi-l idade genética disponível entre

genótipos adaptados é suficiente ou hánecessidade de buscar variabilidade emoutras espécies (selvagens)? Se espécies



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selvagens forem alvo de interesse,marcadores podem auxiliar a transferên-cia de alelos favoráveis destas espécies ena redução de genes desfavoráveis liga-dos aos mesmos. Em termos de seleção:i) irá a SAMM levar a ganhos genéticossuperiores se comparada à seleção feitacom base no fenótipo? A regra geral é amesma para a seleção indireta, isto é,

baseada na equação:ii) os fatores tempo, custo e eficiên-

cia da seleção favorecem a SAMM, emvez da seleção com base no fenótipo? iii)

em relação ao tempo, qual é a necessida-de de diminuir consideravelmente o nú-mero de anos para colocar um novocultivar no mercado? Se muito grande, aSAMM pode ser fundamental. Em termosde avaliação e lançamento de varieda-des: há necessidade de proteção legal dogermoplasma do programa? Se a respos-

ta for sim, marcadores podem auxiliar.Muitas outras perguntas pertinentes po-deriam ainda ser formuladas, cujas res-postas dependerão da realidade do pro-grama de melhoramento, da espécie, edos recursos financeiros, físicos e huma-

nos em questão. A mensagem principalque gostaríamos de deixar após a discus-são aqui apresentada é que: marcadoresmoleculares representam, sem dúvida,uma ferramenta poderosa que já está

tendo e ainda terá grande impacto nomelhoramento de plantas. A decisão douso desta ferramenta nos diversos pro-gramas de melhoramento depende, con-

tudo, da avaliação cautelosa da situaçãodos mesmos e das circunstâncias em quese pretende aplicá-los. Glossário

Alógamas: espécies com reprodu-ção por fecundação cruzada.

Eletroforese: metodologia utilizada paraseparação de moléculas com tamanho e

carga distintas. Fenótipo: aparência deum indivíduo. Genótipo: constituiçãogenética característica de um indivíduo.Germoplasma: conjunto de genótipos deuma espécie. Herdabilidade: porção davariação fenotípica devido à constitui-ção genética. Hibridização: pareamentode fitas complementares de DNA. Poolsgênicos: grupos de genótipos com ca-racterísticas comuns dentro de uma es-pécie. Primer: seqüência de DNA comdez ou mais pares de bases, utilizada

para iniciar a amplificação de DNA Son-da molecular: fragmento de DNA de maisou menos 1.000 pares de bases de exten-são, ut i l izado na hibr idização.Termociclador: aparelho utilizado para

amplificação de DNA. Teste de progênie:avaliação de um indivíduo com base no

comportamento de sua progênieTransgenes: genes transferidos para umgenótipo através da transformação gené

tica.

Referências bibliográficas

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