PCR MARCADORES MOLECULARES

Prof. Dr. Jos Luis da C. Silva

Histrico da PCRKornberg (1960) Isolou e caracterizou a DNA polimerase. O isolamento desta enzima possibilitou o desenvolvimento da sntese in vitro de cadeias de DNA. Em poucos anos, o sequenciamento e a sntese de oligonucleotdeos tornaram-se rotina nos laboratrios de pesquisa; Karl Mullis (1983) Tcnica de PCR polymerase chain reaction possibilita a amplificao in vitro de cidos nuclicos. O advento da PCR acelerou os estudos de genomas de vrios organismos, pois possibilitou a clonagem e o sequenciamento de DNA. Karl Mullis (1987) Patenteou a tcnica e vendeu para a empresa Hoffmann-La Roche em 1991.

Kary Mullis 1983 (Prmio Nobel 1993)

Princpios da tcnica de PCR

Sntese enzimtica in vitro de cpias de DNA a partir da seqncia alvo; A especificidade dada pelo uso de primers (iniciadores) especficos para o gene ou regio do DNA de interesse; A utilizao de dois primers delimitam o alvo e a repetio dos ciclos da PCR d origem a bilhes de cpias do alvo.

Amplificao de seqncias pela Reao em cadeia da polimerase (PCR)

Uma DNA polimerase resiste a temperatura, a Taq polimerase, da bactria

Thermus

aquaticus usada para catalisar o crescimentoa partir de primers de DNA. Pares de primers em filamentos opostos so ampliados um em cada direo ao outro. Aps o trmino da replicao do segmento entre dois primer (um ciclo), dois novos dplices so desnaturados por aquecimento para gerar moldes unifilamentares.

Etapas da PCR1) Desnaturao abertura da dupla fita do DNA (94 C/100 C) 2) Anelamento (hibridizao) dos primers em T C mais baixa 3) Reao de polimerizao (sntese) da fita complementar pela Taq DNA polimerase Repetio por 30 a 40 ciclos animao

Reao de PCR em Termociclador

Eletroforese em gel de agarose visualizao dos amplicons (fragmentos amplificados)

Variaes da PCR

RT-PCR Nested-PCR PCR Multiplex RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Real time PCR ( PCR em tempo real)

RT PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

RT PCR

RT PCR

Cycle threshold Limiar da fase exponencial

Fluorforos: absorvem e emitem luz em especfico

Taq-Man (Fluorforo + Quencher)

Taq-Man

Molecular Beacon : primers em estrutura secundria Diferentes cores

Marcadores moleculares

Marcador molecular todo e qualquer fentipo molecular oriundo de um gene expresso (como em isoenzimas) ou de um segmento especfico de DNA (expresso ou no).

Marcadores genticos so unidades herdveis

Quando o comportamento do marcador segue as leis de herana de Mendel (quando analisado o seu comportamento em uma populao segregante), ele pode adicionalmente ser definido como um marcador gentico.

A molcula de DNA sofre alteraes (mutaes). As mutaes so mais toleradas quando acontecem em regies nocodificantes, e as mutaes tornam-se estveis, sendo transmitidas aos seus descentes. Como muito grande a variao no nmero e no tipo de mutaes estveis do DNA fenmeno conhecido como polimorfismo gentico possvel identificar uma pessoa com base no seu padro de polimorfismo. Para reconhecer os locos (stios) onde ocorrem essas mutaes, h diferentes tcnicas.

marcadores cromossoma

Origem do Polimorfismo Molecular

1. Mutaes pontuais - SNPsA. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT ATCTCGTGATTATAGTCGTA TAGAGCACTAATATCAGCAT ex. Stio EcoRI B.

2. Pequenas delees e/ou inseres - InDelsA. ATCTCGTCTAGTCGTA TAGAGCAGATCAGCAT ATCTCGT---GTCGTA TAGAGCA---CAGCAT B.

Classificao de Marcadores Moleculares

Marcadores de DNA (moleculares)

Vantagens: - No objeto de influncias ambientais; - Potencialmente ilimitado em nmero; Desvantagem: Maior desvantagem a necessidade de tcnicas e equipamentos mais complexos.

Marcadores moleculares Hibridao RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Minissatlites VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) Amplificao de DNA (Tcnica de PCR) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) Microssatlites SSR (Simple Sequence Repeats) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)

RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism

RFLP examina diferena em tamanho de fragmentos de restrio de DNA especficos Polimorfismo deriva de mutao pontual, insero, deleo Utiliza-se DNA celular total Requer DNA puro de alto peso molecular

Polimorfismo evidenciado pela fragmentao do DNA com enzimas de restrio e observado pela hibridizao de sondas marcadas de DNA (Southern blots) com radioatividade ou compostos que desencadeiam uma reao luminescncia.

Para que o polimorfismo seja detectado, necessrio que as seqncias de nucleotdeos nas fitas de DNA de dois ou mais indivduos comparados sejam distintas.

Metodologia de RFLP1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos 2. Separao dos fragmentos por gel eletroforese 3. Transferncia de fragmentos de DNA para filtro

Metodologia de RFLP4. Visualizao dos fragmentos de DNA

sondas marcadas (32P) ou a frio

5. Anlise dos resultados

bandas analisadas para alelos e/ou presena/ausncia diferenas em padro de bandas reflete diferenas genticas

A escolha de sonda/enzima de restrio crucial

Digesto de DNA Genmico e Separao em Geldigesto 2 3 4 1 1 2 3 4 5 5

DNASeparao em gel

Eletroforese

Transferncia para Membrana de Nylon ou Nitrocelulose2 3 1 4

5

MARCAO DA SONDA (EX.: MATERIAL RADIOATIVO [32P] ATP,[32P] dNTP)

Hibridizao com sondas radioativas em Nylon ou Nitrocelulose

Exposio em filme de Raios-X

Hibridizao com sonda marcada

Aplicao dos RFLPs na medicina forense

Interpretao de resultados1 1 2 3 4 2 3 4 5 6

5 Stio alvo para sonda 6 Stio de restrio Insero

Marcador RFLP na anemia falciforme

Anlise de Diversidade e Filogenia por RFLP13 5 6 2 8 Kb A B C 13 8 6 5 2 11 9 A B C

4

RAPD - Random Polymorphic DNA Amplificao Randmica de DNA Polimrfico

Utiliza um nico primer ao invs de um par de primers. O primer nico tem seqncia arbitrria, e portanto sua seqncia alvo desconhecida. Uma caracterstica fundamental dos marcadores RAPD o fato deles se comportarem como marcadores dominantes. Dominncia do ponto de vista da interpretao relativa entre gentipo e fentipo de um indivduo.

Embora a grande maioria dos marcadores RAPD possuam comportamento "dominante", existe a possibilidade de se amplificar marcadores co-dominantes , ou seja, amplificar ambos os alelos de um loco.

Caractersticas do RAPD:

Obteno

de

"fingerprinters'

(impresses

digitais)

genmicos de indivduos, variedades e populaes.

Anlise estrutural e diversidade gentica em populaes de melhoramento e bancos de germoplasma. Estabelecimento de relacionamentos filogenticos entre diferentes espcies. Construo de mapas genticos de alta cobertura genmica econmico. e a localizao de genes de interesse

Base gentica dos marcadores RAPD

600 pb -

RAPD inter-especfico de Eimeria

J-20

- escada 100 pb - E. acervulina - E. tenella - E. maxima - E. praecox - E. mitis - E. brunetti - E. necatrix - Conrrole

VNTR - Variable Number of Tandem Repeats Nmero varivel de repeties seriadas

Caractersticas do VNTR: Seqncias repetitivas agrupadas ou espalhadas ao longo do genoma. So constitudas por blocos cujo nmero de repetitivas varivel, gerando polimorfismos. Blocos de unidades repetitivas formadas por 1 a 4 pb no locus hipervarivel so conhecidas como microssatlites. Unidades de 5 a cerca de 100 pb so denominadas minissatlites. unidades

Caractersticas do VNTR:

So observados atravs de digestes do DNA genmico seguidas de ensaios de Southern blot com sondas homlogas s regies do minissatlite. Obtm-se um padro de mltiplas bandas devido ao carter multilocus. Os padres de mltiplas bandas constituem os chamados DNA fingerprints e permitem discriminar indivduos e estabelecer graus de parentesco e consanginidade.

Caractersticas do VNTR:

So obtidos atravs de PCR de loci especficos. Cada "ilha" microssatlite, independente do elemento repetido (CA, TG, ATG etc.) constitui um loco gentico altamente varivel, multiallico, de grande contedo informativo. A anlise de vrios loci permite estabelecer relaes de paternidade e identificao personalizada, atravs dos alelos encontrados nos indivduos. No requerem Southern blots. A anlise consiste no PCR de vrios loci, eletroforese em gel e interpretao.

Vantagens e limitaes dos marcadores microssatlites A expresso co-dominante e o multialeslismo, os marcadores SSR (seqncias simples repetidas = microssatlites) so os que possuem o mais elevado contedo de informaes de polimorfismo na terminologia de marcadores moleculares. Os SSR so muito mais freqentes e distribudos ao acaso, permitindo a mais completa cobertura de qualquer genoma eucarioto. A maior limitao da tecnologia microssatlite a grande quantidade de trabalho necessrio para o desenvolvimento prvio dos marcadores.

ModelosEletroforese em gel Anlise de casos moleculares Seminrios