Marcelo Lazzaron Lamers

Concentração elevada de glicose e interação célula-matriz

extracelular: Efeitos sobre a homeostase de glândulas salivares,

adesão e migração celular

Tese apresentada ao Instituto de

Ciências Biomédicas da Universidade de

São Paulo, para a obtenção do título de

Doutor em Ciências (Biologia Celular e

do Desenvolvimento).

São Paulo

2008

Marcelo Lazzaron Lamers

Concentração elevada de glicose e interação célula-matriz

extracelular: Efeitos sobre a homeostase de glândulas salivares,

adesão e migração celular

Tese apresentada ao Instituto de

Ciências Biomédicas da Universidade de

São Paulo, para a obtenção do titulo de

Doutor em Ciências.

Área de concentração: Biologia Celular e

do Desenvolvimento

Orientador: Profa. Dra. Marinilce

Fagundes dos Santos

São Paulo

2008

RESUMO

LAMERS, M.L. Concentração elevada de glicose e interação célula-matriz extracelular: efeitos sobre a homeostase de glândulas salivares, adesão e migração celular. 2008. 126f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e do Desenvolvimento) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.

Diabetes mellitus (DM) é um grupo de desordens metabólicas caracterizada por

hiperglicemia crônica que ocasiona severas alterações celulares e teciduais. Este

trabalho primeiramente focou nos efeitos do diabetes sobre a hipofunção salivar

de ratos e num segundo momento analisou o comportamento migratório in vitro

de fibroblastos e células epiteliais expostas a elevadas concentrações de glicose

similares às observadas no DM. Foi observado que DM aumenta a deposição de

proteínas da matriz extracelular na glândula parótida através de um mecanismo

que envolve aumento da expressão e sinalização do fator de crescimento TGFβ2,

o que poderia contribuir significativemente no processo de secreção salivar. Na

análise do comportamento migratório, foi observado que elevadas concentrações

de glicose influencia diretamente a polaridade celular, a velocidade e a

direcionalidade de migração, a persistência e a estabilidade dos eventos

protrusivos, bem como o processo de maturação de adesões. Estas alterações

estão relacionadas a ativação da GTPase Rac1 através de um mecanismo

originado pelo quadro de estresse oxidativo destas células.

Palavras-chave: Diabetes, glândula salivar, TGF-β, migração celular, estresse

oxidativo

ABSTRACT

LAMERS, M.L. Concentração elevada de glicose e interação célula-matriz extracelular: efeitos sobre a homeostase de glândulas salivares, adesão e migração celular. 2008. 126f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e do Desenvolvimento) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.

Diabetes mellitus (DM) is a group of metabolic disorders characterized by chroni

hyperglycemia, which leads to dramatic changes on cell and tissue behavior.

Initially, this work focused in the effects of DM in the rat salivary hypofunction and,

in a second moment, we analized in vitro the migratory behavior of fibroblasts and

epithelial cells cultivated under high glucose concentrations, similar to those

observed in diabetic patients. It was observed that DM increases the deposition of

extracellular matrix proteins on the parotid gland of rats, in a mechanism that

involves the increase in the expression and signalling of the growth factor TGFβ2,

which could significally contibute to the salivary secretion process. The analyze of

migratory behavior, it was observed the high glucose concentrations, can directly

impairs cell polarity, migration velocity and directionality, the persistence and

stability of prtrusive events as well as the adhesion maturation process, in a

mechanism that involves activation of the Rac1 GTPase probably by the oxidative

stress.

Keywords: Diabetes, salivary gland, TGF-β, cell migration, oxidative stress

1. INTRODUÇÃO

1.1 Considerações Gerais

Diabetes Mellitus é uma doença crônica que atualmente acomete mais de

170 milhões de pessoas em todo o mundo, sendo que o Brasil encontra-se entre

os dez países com maior incidência desta patologia. Independentemente de sua

etiologia, Diabetes é considerada um grupo de desordens metabólicas

caracterizada por hiperglicemia crônica, a qual pode levar a sérias disfunções

teciduais, que variam de acordo com o tipo celular e a sua função. Pacientes com

pobre controle glicêmico apresentam uma série de complicações importantes

como aumento da freqüência e da severidade de patologias da cavidade oral - a

maioria delas relacionadas à diminuição do fluxo salivar observado nestes

pacientes – bem como a presença de feridas crônicas causadas por defeitos no

processo cicatricial.

1.2 Captação e metabolismo da glicose

Glicose é a principal fonte de energia utilizadas pelas células. Através de

uma série de reações catalizadas por diferentes enzimas, a glicose é

metabolizada, com liberação de energia. A captação da glicose não envolve

gasto energético (difusão facilitada) e é mediada principalmente por uma família

de proteínas transmembrana denominadas transportadores de glicose (GLUT).

Após a ligação da glicose na porção extracelular, estes transportadores sofrem

uma mudança conformacional que resulta no transporte desta molécula de glicose

para o meio intracelular. A fim de manter uma baixa concentração intracelular de

glicose, com conseqüente transporte contínuo desta molécula, a glicose é

fosforilada inicialmente pela enzima hexoquinase, que gera glicose-6-fosfato. Esta

molécula pode ser utilizada em diferentes vias metabólicas, como por exemplo a

glicólise e a via das pentoses.

A maior parte da glicose-6-fosfato gerada é utilizada na glicólise, a qual

consiste de uma seqüência de 10 reações onde, para cada molécula de glicose,

gera-se duas moléculas de piruvato, ATP e oxida-se NAD+ para NADH. Em um

ambiente anaeróbico (privado de oxigênio), o piruvato é convertido em lactato

pela enzima lactato desidrogenase e o NADH é reduzido a NAD+. Em uma

situação aeróbica, piruvato é convertido em acetil CoA dentro da mitocôndria,

sendo completamente oxidado a CO2 e H2O através do ciclo do ácido cítrico e da

cadeia transportadora de elétrons. A glicólise pode também ativar vias

metabólicas paralelas como a via das hexosaminas (frutose-6-fosfato gera N-

acetil-glicosamina como produto final) e a geração de diacilglicerol (DAG – gerado

a partir do gliceraldeído-3-fosfato).

1.3 Efeitos causados pelo aumento da captação de glicose

Em diferentes tipos celulares, a hiperglicemia crônica estimula o aumento

da captação da glicose pelas células, podendo gerar alterações de vias

metabólicas. Já foi relatado que um aumento da ativação da via dos polióis

(enzima aldose redutase transforma glicose em sorbitol) leva à diminuição do

NADH disponível na célula (Brownlee, 2001). Como este cofator é utilizado na

regeneração de glutationa, um antioxidante intracelular, a diminuição do NADH

acarreta uma maior susceptibilidade a estresse oxidativo na célula. Já foi

demonstrado que o uso de inibidores de aldose redutase previne a neuropatia em

casos de diabetes (Handelsman e Turtle, 1981; Yue et al., 1982; Gonzalez,

Sochor e McLean, 1983).

O aumento da atividade glicolítica pode resultar em aumento da via das

hexosaminas e na formação de DAG. A ativação da via das hexosaminas resulta

na geração de N-acetil-glicosamina, a qual pode se associar a resíduos serina e

treonina de diferentes proteínas, resultando em alteração da função. Já foi

demonstrado que quando esta interação ocorre com fatores de transcrição o

resultado é a alteração da expressão gênica. O aumento de DAG pela glicólise

pode levar à ativação de PKC com conseqüente modificação na expressão

gênica, bem como alteração de diferentes vias de sinalização (Xia et al., 1995;

Brownlee, 2001). O uso de inibidores de PKC em situações de diabetes foi capaz

de reverter alterações iniciais na retina e no rim (Dunlop, Keogh e Larkins, 1983;

Studer, Craven e DeRubertis FR, 1993).

Um aumento da captação de glicose também resulta em aumento da

atividade mitocondrial, com conseqüente hiperativação da cadeia de transporte de

elétrons. Esta hiperativação geralmente é acompanhada da geração de íons

superóxido e de espécies reativas de oxigênio (ROS), que ocasionam uma

diminuição na atividade da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GADPH

– enzima da via glicolítica envolvida na formação de 1,3-bifosfoglicerato a partir

de gliceraldeído-3-fosfato). A inibição de GADPH leva a um acúmulo dos

subprodutos das reações anteriores, os quais são substratos para a via dos

polióis, via das hexosaminas e para a formação de DAG, podendo levar à

ativação destas vias (Figura 1) (Du et al., 2000; Nishikawa et al., 2000; Du et al.

2003; Kiritoshi et al., 2003; Vincent et al. 2004).

Figura 1- Potencial mecanismo pelo qual a superprodução de superóxido

mitocondrial induzida pela hiperglicemia ativa 4 vias que potencializam o dano

celular: via do poliol, via das hexosaminas, via da PKC e formação de produtos

finais de glicação (AGEs). O superóxido inibe parcialmente a enzima GAPDH,

favorecendo a ativação destas vias paralelas devido ao acúmulo de metabólitos

na via glicolítica (Brownlee, 2001).

1.4 Complicações do Diabetes

As alterações metabólicas causadas pela hiperglicemia são responsáveis

pelo desenvolvimento de complicações crônicas importantes que variam de

acordo com o tipo e a função celular. Entre as estruturas mais susceptíveis à ação

da hiperglicemia estão os vasos sangüíneos (arterioesclerose, microangiopatia) e

neurônios (neuropatia). Adicionalmente, diversos órgãos são afetados pelo

diabetes de maneira diferenciada, como por exemplo o rim e a retina (nefropatia e

a retinopatia diabética, respectivamente).

Além destas complicações, pacientes diabéticos com pobre controle

glicêmico apresentam alterações importantes na cavidade oral como atrofia da

mucosa, maior susceptibilidade à candidíase e maior severidade de doença

periodontal. Apresentam também sintomas como xerostomia (sensação de boca

seca) e alterações no paladar. A maioria destas modificações está relacionada a

uma severa diminuição no fluxo salivar observada nestes pacientes (Mata et al.,

2004). Entretanto, os mecanismos pelos quais a hiperglicemia leva à hipofunção

das glândulas salivares ainda não foram elucidados.

Outra disfunção importante observada não apenas na cavidade oral de

pacientes diabéticos é o retardo no processo cicatricial com a geração de feridas

crônicas, resultando em uma diminuição significativa na qualidade de vida dos

pacientes. Apesar da sua importância, a literatura carece de trabalhos que

foquem no papel da hiperglicemia em eventos-chave do processo cicatricial, como

a função de fibroblastos.

1.5 Efeitos da hiperglicemia crônica na glândula salivar

A maioria dos sinais e sintomas da cavidade oral de pacientes diabéticos

são secundários à diminuição do fluxo salivar, já que a saliva exerce funções

importantes na lubrificação da mucosa, digestão, paladar, controle da microbiota

oral, reparação de lesões, fonação e deglutição (Amerongen, 2002). As glândulas

salivares são as principais responsáveis pela formação da saliva, e são divididas

em glândulas salivares menores e maiores. As glândulas salivares menores

encontram-se espalhadas pela cavidade oral, secretam um fluido

predominantemente mucoso e são responsáveis por 5% da saliva produzida. Os

95% restantes são produzidos pelas glândulas salivares maiores (parótida,

submandibular e sublingual) as quais são compostas por unidades secretoras

terminais (ácinos serosos e túbulos mucosos) e um sistema de ductos (intercalar,

excretor e estriado). As unidades secretoras produzem um fluido denominado

saliva primária, o qual vai sendo modificado pelo sistema de ductos até

desembocar na cavidade oral.

Em humanos e em ratos diabéticos, a secreção basal e estimulada nas

glândulas parótida e submandibular está diminuída (Conner, Iranpour e Mills,

1970; Anderson, 1987; Anderson e Garret, 1994). Na glândula parótida observou-

se redução na atividade da amilase, menor quantidade de proteínas, DNA e RNA

e alterações de vias bioquímicas e do sistema antioxidante (Anderson, 1983;

Szczepanski, Mednieks e Hand, 1998; Nicolau et al., 2005; Nogueira et al., 2005).

Alterações celulares como a vacuolização do citoplasma foram observadas,

muitas vezes resultando na morte celular e substituição do parênquima por tecido

conjuntivo (Takai, Yashioda e Kakudo, 1983; High, Sutton e Hopper, 1985).

Hand e Weiss (1984) mostraram que, após dois meses de diabetes, células

acinares e ductais da parótida de ratos apresentavam um espessamento da

membrana basal, o qual era acompanhado de múltiplas irregularidades. Caldeira

et al. (2005) demonstraram que camundongos NOD (Non-Obese Diabetic)

apresentavam aumento de componentes fibrilares da matriz extracelular na

parótida. Embora explorados em menor magnitude, esses resultados são

semelhantes aos observados na nefropatia diabética, onde a hiperglicemia

crônica resulta na expressão aberrante de fatores de crescimento pelas células

mesangiais, resultando em um acúmulo de diferentes proteínas da matriz

extracelular no mesângio e na membrana basal do glomérulo e ocasionando

disfunção do órgão. Entre os fatores de crescimento alterados na nefropatia

diabética encontra-se a família de proteínas Transforming Growth Factor β

(TGFβ), os quais são responsáveis por induzir uma resposta pró-fibrótica em

diferentes tipos celulares.

Já foram identificadas 3 isoformas de TGFβ (TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3) em

mamíferos (Derynck et al., 1985), embora não se tenha conhecimento das ações

diferenciais entre estas isoformas. Durante a síntese, TGFβ é parcialmente

clivado do seu pró-peptídeo de origem (Latency Associated Protein – LAP), mas

mantém-se associado a ele através de interações covalentes formando

“pequenos complexos de TGFβ latente” (SLC). Estes SLCs são comumente

ligados através de pontes dissulfeto à outra proteína (Latent TGFβ Binding Protein

– LTBP). LTBP é responsável pela deposição de TGFβ na matriz extracelular e

acaba desempenhando um papel importante na modulação da ativação deste

fator de crescimento (Annes et al., 2003; Hyytiainen et al., 2004; Todorovic et al.,

2005). Já foi demonstrado que alterações do microambiente, atividade de

proteases, geração de radicais livres e altas concentrações de glicose podem

levar à dissociação do complexo LTBP e TGFβ e à sua conseqüente

ativação/sinalização (Shankland et al., 1994, Park et al., 1997; Saharinen et al.,

1999; Koli et al., 2001; Zhu e Burgess, 2001,).

Em células de mamíferos a resposta ao TGFβ é mediada pelos receptores

tipo I (TβRI) e tipo II (TβRII). A molécula de TGFβ liga-se ao TβRII, o qual fosforila

TβRI, e este complexo desencadeia uma cascata de sinalização através de

proteínas Smads (R-Smads) (Massagué, 2000; Attisano e Wrana, 2002). As R-

Smads 2 e 3, quando fosforiladas por TβRI, se associam a Smad4, sendo

translocadas para o núcleo onde acabam regulando a transcrição gênica (Ignotz e

Massagué, 1986; Heldin et al., 1997; Shi e Massagué, 2003). Smads 2 e 3 são as

principais R-Smads envolvidas no estímulo pró-fibrótico associado a TGFβ.

Pouco se sabe sobre a expressão de TGFβ nas glândulas salivares, tanto

em condições fisiológicas quanto patológicas. Já foi demonstrada a presença de

TGFβ1 no compartimento ductal da glândula salivar de humanos, de TGFβ2 em

ductos intercalares e de TGFβ3 em ácinos mucosos (Kizu et al., 1996; Kusafuka

et al., 2001; Dillard et al., 2001). Na glândula submandibular de ratos, TGFβ1 foi

observado exclusivamente no compartimento ductal (Amano et al., 1991),

enquanto as outras isoformas de TGFβ e seus receptores foram descritas durante

o desenvolvimento de glândula submandibular de camundongos (Jaskoll et al.,

1994; Jaskoll e Melnick 1999). Embora não tenha sido descrita a distribuição

deste fator de crescimento na glândula parótida, já foi demonstrado que

camundongos NOD apresentam um aumento na secreção de TGFβ na saliva

(Yamachika et al., 2000), sugerindo que a hiperglicemia pode modular a

expressão deste fator de crescimento na glândula salivar.

1.6 Efeitos da hiperglicemia no processo cicatricial

Outra complicação importante do diabetes é a deficiência na cicatrização,

ocasionando feridas crônicas que acometem em torno de 15% dos pacientes

diabéticos com pobre controle glicêmico (Yach et al., 2006). O processo cicatricial

envolve uma série de ações coordenadas como angiogênese, proliferação celular,

deposição e remodelação do colágeno, contração da ferida e migração de células

para o local da injúria. Estes processos envolvem diferentes tipos celulares,

especialmente fibroblastos/miofibroblastos e células epiteliais (queratinócitos e

células endoteliais) (Martin, 1997). Já foram descritos diferentes mecanismos de

ação da hiperglicemia no processo cicatricial, mas a maioria dos trabalhos têm

focado na angiogênese e na remodelação da matriz extracelular (Braiman-

Wiksman et al, 2007). Pelo fato de fibroblastos desempenharem papel essencial

na cicatrização e reparação de tecidos lesados, qualquer impedimento na sua

função poderia afetar negativamente a cicatrização. Entretanto, apesar de sua

importância, poucos trabalhos mostram qual o papel da hiperglicemia sobre

fibroblastos. Loots et al. (1999, 2002) demonstraram que fibroblastos derivados de

úlceras crônicas de pacientes diabéticos proliferam menos que aqueles derivados

de pacientes normoglicêmicos e respondem diferentemente a fatores de

crescimento mitogênicos como o Platelet-derived Growth Factor (PDGF),

Epidermal Growth Factor (EGF), Insulin-like Growth Factor-I (IGF-I) e basic

Fibroblast Growth Factor (bFGF). Mais recentemente, Lerman et al. (2003)

mostraram que a migração de fibroblastos provenientes de camundongos

diabéticos foi diminuída em torno de 75% quando comparados a ratos

normoglicêmicos, o que sugere que a hiperglicemia poderia desempenhar um

papel direto na migração celular.

A atividade migratória é um fenômeno cíclico que requer a ativação

coordenada de moléculas estruturais e de sinalização, as quais vão determinar

uma assimetria espacial, gerando uma morfologia polarizada. Quando a migração

é iniciada, ocorre polimerização de actina na porção frontal da célula (leading

edge), promovendo a formação de grandes projeções de membrana

(lamelipódios) e o estabelecimento de novas adesões ao substrato. Algumas

destas adesões nascentes amadurecem e se ancoram em feixes contráteis de

actina-miosina II (fibras de estresse), o que gera forças contráteis que facilitam o

movimento do corpo celular na direção determinada. O ciclo se encerra com a

liberação das adesões na porção posterior da célula (Lauffenburger e Horwitz,

1996; Horwitz e Webb, 2003; Webb e Horwitz, 2003).

Cada etapa da migração celular é regulada por GTPases de baixo peso

molecular pertencentes à família Rho (de Ras-homology), que desempenham um

papel fundamental nesse processo. Estas proteínas ciclam entre um estado

inativo (ligadas a GDP) e um estado ativo (ligadas a GTP). Quando ativadas,

exercem seus efeitos por meio de uma vasta quantidade de proteínas efetoras.

Entre as GTPases mais expressas encontra-se a proteína Rac1, que está

principalmente envolvida na formação de lamelipódios e complexos focais

(adesões imaturas), enquanto RhoA está envolvida principalmente na formação

das fibras de estresse e na maturação de adesões (Ridley e Hall, 1992; Ridley et

al., 1992). O balanço recíproco entre estas duas GTPases determinaria a

morfologia celular e comportamento migratório (Herbrand e Ahmadian, 2006).

Adicionalmente, a atividade de Rac1 em fibroblastos parece estar relacionada

com migração randômica, já que uma redução desta atividade alterou o

comportamento migratório de randômico para direcionado e persistente (Czuchra

et al., 2005; Pankov et al 2005).

A ativação de GTPases Rho (troca de GDP por GTP) é mediada por

fatores de troca de nucleotídeos de guanina (GEFs), ativados por diferentes vias

sinalizadoras originadas por receptores da superfície celular, enquanto a

inativação é facilitada por proteínas ativadoras da atividade GTPase intrínseca de

Rho (GAPs), que catalizam a hidrólise de GTP. A regulação por GEFs e GAPs

inclui interações proteína-proteína, proteína-lipídeos, ligação a segundos

mensageiros (por exemplo DAG) e modificações pós-transcricionais. Dentre os

efetores de GTPases Rho potencialmente afetados pela hiperglicemia está o

complexo NADPH oxidase, regulado por Rac, que é responsável pela geração de

ROS (Radisky et al., 2005; Hordijk et al., 2006).

Aparentemente, a geração de ROS por Rac1/NADPH oxidase exerce um

papel fisiológico durante a migração celular. Moldovan et al. (2006) demonstraram

a geração de ROS em regiões de protrusão de células endoteliais, enquanto que

Nimnual et al. (2003) demonstraram que esta geração fisiológica de ROS por

Rac1 é capaz de inibir localmente a ativação de RhoA em fibroblastos. Chiarugi et

al. (2003) mostraram que ROS são gerados na sinalização de integrinas, sendo

importantes para a adesão e espraiamento de fibroblastos via inibição de uma

fosfatase de tirosina que inativa a Focal Adhesion Kinase (FAK), importante

enzima na sinalização de integrinas. Desta forma, ROS surgem não apenas como

moléculas potencialmente danosas para as células, mas também como moléculas

sinalizadoras que participam fisiologicamente de vias estimuladas por integrinas e

fatores de crescimento. Acredita-se que suas propriedades sinalizadoras estão

relacionadas à oxidação reversível de proteínas sensíveis a redox, especialmente

fosfatases (Chiarugi et al., 2003).

Apesar da importância do Diabetes Mellitus para a população e do grande

número de complicações a longo prazo que diminuem significativamente a

qualidade de vida dos indivíduos portadores desta doença, diversos aspectos

celulares e moleculares relativos ao desenvolvimento destas complicações são

ainda pouco conhecidos. Neste estudo pretendemos avaliar aspectos

relacionados a duas complicações importantes: a redução da secreção salivar e a

cicatrização deficiente.

2 CONCLUSÕES

A hiperglicemia crônica aumenta a expressão de laminina, fibronectina,

colágenos III, IV e V na glândula parótida de ratos, de maneira tempo-

dependente. Este aumento é acompanhado do aumento da expressão e

sinalização de TGFβ2 na glândula, mas não de TGFβ1, sugerindo que este

fator de crescimento possa estar envolvido na regulação da expressão de

proteínas de matriz extracelular.

A concentração elevada de glicose prejudica a migração de diferentes tipos

celulares, reduzindo a velocidade e direcionalidade de migração,

diminuindo a polaridade celular, prejudicando a maturação de adesões e

consequentemente induzindo instabilidade de protrusões. Estes efeitos

podem ser atribuídos à ativação da GTPase Rac1 pela glicose, através de

um mecanismo que envolve o estresse oxidativo. Os efeitos sobre a

migração são acompanhados de ligeira inibição da proliferação, sem

alteração de morte celular.

3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Amano O. et al. Expression of Transforming Growth Factor β1 in the submandibular gland of the rat. J Histochem Cytochem.1991;39:1707-11. Amerongen AV.et al. Saliva: the defender of the oral cavity. Oral Dis.2002;8:12-22. Anderson LC. Effects of alloxan diabetes and insulin in vivo on rat parotid gland. Am J Physiol.1983;245:G431-7. Anderson LC. Parotid gland function in streptozotocin-diabetic rats.J Dent Res.1987;66:425-9. Anderson LC, Garrett JR. The effects of streptozotocin-induced diabetes on norepinephrine and cholinergic enzyme activities in rat parotid and submandibular glands. Arch Oral Biol.1994;39:91-7. Annes JP.et al. Making sense of latent TGF beta activation.J Cell Sci.2003;116:217-24. Annes JP.et al. Integrin alphaVbeta6-mediated activation of latent TGF-beta requires the latent TGF-beta binding protein-1. J Cell Biol. 2004;165:723-34. Arthur WT. et al. Rap1 promotes cell spreading by localizing Rac guanine nucleotide exchange factors. J Cell Biol. 2004;167:111-22. Aruoma OI. et al. The antioxidant action of N-acetylcysteine: its reaction with hydrogen peroxide,hydroxyl radical, superoxide, and hypochlorous acid.Free Radic Biol Med. 1989;6:593-7. Attisano L, Wrana JL. Signal transduction by the TGF-β superfamily. Science.2002;296: 1646-47. Braiman-Wiksman L. et al. Novel insights into wound healing sequence of events. Toxicol Pathol.2007;35:767-79. Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature. 2001;414:813-20. Caldeira EJ. et al. Stereology and ultrastructure of the salivary glands of diabetic Nod mice submitted to long-term insulin treatment. Anat Rec. 2005; 286:930-937. Chen S. et al. The key role of the transforming growth factor-beta system in the

pathogenesis of diabetic nephropathy. Ren Fail.2001;3:47-481. Cheng, C.et al. Expression profiling of endogenous secretory receptor for advanced glycation end products in human organs. Modern Pathol.2005;18:1385–96. Chiarugi P. et al. Reactive oxygen species as essential mediators of cell adhesion: the oxidative inhibition of a FAK tyrosine phosphatase is required for cell adhesion. J Cell Biol.2003;161:933-44. Conner S, Iranpour B, Mills J. Alteration in parotid salivary flow in diabetes mellitus. Oral Surg Oral Med Oral Pathol.1970;30:55-9. Czuchra A. et al. Cdc42 is not essential for filopodium formation, directed migration, cell polarization, and mitosis in fibroblastoid cells. Mol Biol Cell. 2005;16:4473-84. Dallas SL. et al. Proteolysis of latent transforming growth factor-beta (TGF-beta)-binding protein-1 by osteoclasts. A cellular mechanism for release of TGF-beta from bone matrix. J Biol Chem.2002;277:21352-360. Dallas SL.et al. Fibronectin regulates latent transforming growth factor-beta (TGF beta) by controlling matrix assembly of latent TGF beta-binding protein-1. J Biol Chem. 2005;280:18871-80. Derynck R. et al. Human transforming growth factor-beta complementary DNA sequence and expression in normal and transformed cells. Nature.1985;316:701-5. Dillard DG. et al. High tumor grade in salivary gland mucoepidermoid carcinomas and loss of expression of transforming growth factor beta receptor type II. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2001;127:683-6. Du X. et al. Inhibition of GAPDH activity by poly(ADP-ribose) polymerase activates three major pathways of hyperglycemic damage in endothelial cells. J Clin Invest. 2003;112:1049-57. Du XL. et al. Hyperglycemia-induced mitochondrial superoxide overproduction activates the hexosamine pathway and induces plasminogen activator inhibitor-1 expression by increasing Sp1 glycosylation. Proc Natl Acad Sci.2000.24;97:12222-6.

Dunlop M, Keogh R, Larkins RG. Fibronectin-induced increase in mesangial cell prostaglandin release. Effect of hyperglycemia and PKC inhibition. Diabetes. 1993;42:183-90. Forbes JM .et al. Role of advanced glycation end products in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol.2003;4:S254-S8. Forbes JM et al. Oxidative stress as a major culprit in kidney disease in diabetes.Diabetes.2008;57:1446-54. Gonzalez AM, Sochor M, McLean P. The effect of an aldose reductase inhibitor (Sorbinil) on the level of metabolites in lenses of diabetic rats. Diabetes.1983;32:482-5. Ha H, Lee HB.et al. Reactive oxygen species and matrix remodeling in diabetic kidney. J Am Soc Nephrol.2003;14:S246-S9. Hand AR, Weiss RE. et al. Effects of streptozotocin-induced diabetes on the rat parotid gland. Lab. Invest. 1984;51:429-40. Handelsman DJ, Turtle JR. Clinical trial of an aldose reductase inhibitor in diabetic neuropathy.Diabetes.1981;30:459-64. Hartner A.et al. Dynamic expression patterns of transforming growth factor-β2 and transforming growth factor-β receptors in experimental glomerulonephritis. J Mol Med.2003;81:32-42. Herbrand U, Ahmadian MR. et al. p190-RhoGAP as an integral component of the Tiam1/Rac1-induced downregulation of Rho. Biol Chem.2006;387:311-7. Heldin CH.et al. TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature.1997;390:465-71. High AS, Sutton J, Hopper AH. A morphometric study of submandibular salivary gland changes in streptozotocin-induced diabetic rats. Arch Oral Biol.1985;30:667-71. Hill C.et al.The renal expression of transforming growth factor-β isoforms and their receptors in acute and chronic experimental diabetes in rats.

Endocrinology.2000;141: 1196-208. Hill C.et al. Transforming growth factor-β antibody attenuates fibrosis in the experimental diabetic rat kidney. J Endocrinol.2001;170:647–51. Hinz B, Alt W, Johnen C, Herzog V, Kaiser HW.Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Exp Cell Res. 1999 Aug 25;251(1):234-43 Hordijk PL. et al. Regulation of NADPH oxidases: the role of Rac proteins. Circ Res. 2006;98:453-62. Horwitz R, Webb D. Cell migration. Curr Biol. 2003;13:756-9 Hyytiainen M.et al. Latent TGF-beta binding proteins: extracellular matrix association and roles in TGF-beta activation. Crit Rev Clin Lab Sci. 2004;41:233-64. Ignotz RA, Massagué J. Transforming growth factor-beta stimulates the expression of fibronectin and collagen and their incorporation into the extracellular matrix. J Biol Chem.1986;261:4337-45. Jaskoll T, Melnick M. Submandibular gland morphogenesis: stagespecific expression of TGF-β, EGF, IGF, TGF-α, TNF, and IL-6 signal transduction in normal embryonic mice and the phenotypic effects of TGF-β2,TGF-β3, and EGF-R null mutations. Anat Rec. 1999;256:252-68. Jaskoll T. et al. Glucocorticoids, TGF-β, and embryonic mouse salivary gland morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol.1994;14:217-30. Kiritoshi S. et al. Reactive oxygen species from mitochondria induce cyclooxygenase-2 gene expression in human mesangial cells: potential role in diabetic nephropathy. Diabetes. 2003;52:2570-7. Kizu Y.et al. Immunohistochemical analysis of tumor growth factor beta1 expression in normal and inflamed salivary glands. J Clin Pathol.1996;49:728-32. Kolavennu V. et al. Targeting of RhoA/ROCK signaling ameliorates progression of diabetic nephropathy independent of glucose control. Diabetes.2008;57:714-23. Koli K.et al. Latency, activation, and binding proteins of TGF-beta. Microsc

ResTech. 2001;15:354-62. Kusafuka K .et al. Immunohistochemical localization of members of the transforming growth factor (TGF)-beta superfamily in normal human salivary glands and pleomorphic adenomas. J Oral Pathol Med. 2001; 30: 413-20. Lauffenburger DA, Horwitz AF. Cell migration: a physically integrated molecular process.Cell.1996;84:359-69. Lee HB.et al. Reactive oxygen species regulated signaling pathways in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol.2003;14:S241-5. Lee HB. et al. Radical approach to diabetic nephropathy. Kidney Int Suppl. 2007:S67-70. Lee SB. et al. Link between mitochondria and NADPH oxidase 1 isozyme for the sustained production of reactive oxygen species and cell death. J Biol Chem. 2006;281:36228-35. Lerman OZ. et al. Cellular dysfunction in the diabetic fibroblast: impairment in migration, vascular endothelial growth factor production, and response to hypoxia. Am J Pathol.2003;162:303-12. Lin G. et al. Acute inhibition of Rho-kinase improves cardiac contractile function in streptozotocin-diabetic rats. Cardiovasc Res. 2007;75:51-8. Liu X.et al. Therapeutic strategies against TGF-β signaling pathway in hepatic fibrosis. Liver Int. 2006;26:8-22. Loots MA. et al.Cultured fibroblasts from chronic diabetic wounds on the lower extremity (non-insulin-dependent diabetes mellitus) show disturbed proliferation. Arch Dermatol Res. 1999;291:93-9. Loots MA. et al. Fibroblasts derived from chronic diabetic ulcers differ in their response to stimulation with EGF, IGF-I, bFGF and PDGF-AB compared to controls. Eur J Cell Biol. 2002;81:153-60. Mahay S.et al. Streptozotocin-induced type 1 diabetes mellitus alters the morphology, secretory function and acyl lipid contents in the isolated rat parotid salivary gland. Mol Cell Biochem. 2004;261:175-81.

Martin P. Wound healing-aiming for perfect skin regeneration. Science.1997;276:75-81. Massagué J. How cells read TGF-β signals. Nat Rev Mol Cell Biol.2000;1:169-78. Massagué J.et al. Smad transcription factors. Gen Dev.2005;19:2783-810. Mata AD.et al. Effects of diabetes mellitus on salivary secretion and its composition in the human. Mol Cell Biochem. 2004;261:137-42. Moldovan L. et al. Reactive oxygen species in vascular endothelial cell motility. Roles of NAD(P)H oxidase and Rac1. Cardiovasc Res. 2006;71:236-46. Morris PA.et al. Lipid analysis of the major salivary glands in streptozotocin-diabetic rats and the effects of insulin treatment. Arch. Oral Biol.1992;37:489-94. Murrah VA.et al. Parotid gland basement membrane variation in diabetes mellitus. J Oral Pathol.1985;14:236-46. Nakajima Y.et al. Immunolocalization of latent transforming growth factor-beta binding protein-1 (LTBP1) during mouse development: possible roles in epithelial and mesenchymal cytodifferentiation. Cell Tissue Res.1999;295:257-67. Nicolau J .et al. Altered glycogen metabolism in the submandibular and parotid salivary glands of rats with streptozotocin-induced diabetes. J Oral Sci.2005;47:111-6. Nimnual AS. et al. Redox-dependent downregulation of Rho by Rac. Nat Cell Biol.2003;5:236-41 Nishikawa T. et al. Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage. Nature.2000;404:787-90. Nogueira FN.et al. Antioxidant parameters and lipid peroxidation in salivary glands of streptozotocininduced diabetic rats. Clin Chim Acta. 2005;353:133-9. Paravicini TM, Touyz RM. NADPH oxidases, reactive oxygen species, and hypertension: clinical implications and therapeutic possibilities. Diabetes Care. 2008;31:S170-80. Park IS.et al. Expression of transforming growth factor-beta and type IV collagen in early streptozotocin-induced diabetes. Diabetes.1997;46:473-80.

Pankov R . et al. A Rac switch regulates random versus directionally persistent cell migration.J Cell Biol.2005;170:793-802. Peng F. et al. RhoA/Rho-kinase contribute to the pathogenesis of diabetic renal disease. Diabetes.2008;57:1683-92. Qi W.et al. Transforming growth factor-beta1 differentiallymediates fibronectin and inflammatory cytokine expression in kidney tubular cells. Am J Physiol Renal Physiol ol.2006;291:1070-77. Radisky DC. et al. Rac1b and reactive oxygen species mediate MMP-3-induced EMT and genomic instability. Nature.2005;436:123-7. Ridley AJ . et al. The small GTP-binding protein rac regulates growth factor-induced membrane ruffling. Cell.1992;70:401-10. Ridley AJ, Hall A. et al. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell.1992;70:389-99. Ridley AJ. et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science.2003;302:1704-9. Sáenz-Morales D. et al. Requirements for proximal tubule epithelial cell detachment in response to ischemia: role of oxidative stress. Exp Cell Res.2006;312:3711-27 Saharinen J.et al. Latent transforming growth factor-beta binding proteins (LTBPs)-structural extracellular matrix proteins for targeting TGF-beta action. Cytokine Growth Factor Rev.1999;10:99-117. Schrijvers BF.et al. From hyperglycemia to diabetic kidney disease: the role of metabolic, hemodynamic, intracellular factors and growth factors/cytokines. Endocr Rev.2004;25:971-1010. Shankland SJ.et al. Expression of transforming growth factor-beta 1 during diabetic renal hypertrophy. Kidney Int.1994;46:430-42. Shi Y, Massagué J.et al. Mechanisms of TGF-β signaling from cell membrane to the nucleus. Cell.2003;113:685-700.

Shiga N. et al. Long-term inhibition of RhoA attenuates vascular contractility by enhancing endothelial NO production in an intact rabbit mesenteric artery. Circ Res. 2005;96:1014-21. Sivakumar P.et al. New insights into extracellular matrix assembly and reorganization from dynamic imaging of extracellular matrix proteins in living osteoblasts. J Cell Sci. 2006;119:1350-60. Slupsky JR. et al. Central role of protein kinase Cepsilon in constitutive activation of ERK1/2 and Rac1 in the malignant cells of hairy cell leukemia. Am J Pathol. 2007;170:745-54. Studer RK, Craven PA, DeRubertis FR. Role for protein kinase C in the mediation of increased fibronectin accumulation by mesangial cells grown in high-glucose medium. Diabetes.1993;42:118-26. Szczepanski A, Mednieks MI, Hand AR. Expression and distribution of parotid secretory proteins in experimental diabetes. Eur J Morphol.1998;36:240-6. Tang J. et al. Increased RhoA translocation in aorta of diabetic rats. Acta Pharmacol Sin.2006;27:543-8. Takai N, Yoshida Y, Kakudo Y.Secretion and re-absorption of glucose in rat submandibular and sublingual saliva. J Dent Res.1983;6210:1022-5. Terada LS. Specificity in reactive oxidant signaling: think globally, act locally. J Cell Biol. 2006;174:615-23. Todorovic V.et al. Latent TGF-beta binding proteins. Int J Biochem Cell Biol.2005;37:38-41. Ushio-Fukai M. Localizing NADPH oxidase-derived ROS. Sci STKE.2006;2006(349):re8 Vecchione C.et al. Selective Rac-1 inhibition protects from diabetes-induced vascular injury. Circ Res. 2006;98:218-25.

Vincent AM. et al. Uncoupling proteins prevent glucose-induced neuronal oxidative stress and programmed cell death.Diabetes.2004;53:726-34. Xia P. et al. Identification of the mechanism for the inhibition of Na+,K(+)-adenosine triphosphatase by hyperglycemia involving activation of protein kinase C and cytosolic phospholipase A2. Clin Invest.1995;96:733-40. Yach D. et al. Epidemiologic and economic consequences of the global epidemics of obesity and diabetes.Nat Med. 2006 Jan;12(1):62-6. No abstract available. Erratum in: Nat Med. 2006;12:367. Yamachika S.et al. Aberrant proteolytic digestion of biglycan and decorin by saliva and exocrine gland lysates from the NOD mouse model for autoimmune exocrinopathy. Clin Exp Rheumatol.2000;18:233-40. Yue DK, Hanwell MA, Satchell PM, Turtle JR. The effect of aldose reductase inhibition on motor nerve conduction velocity in diabetic rats.Diabetes.1982;31:789-94. Wang W.et al. Essential role of smad3 in angiotensin II-induced vascular fibrosis. Circ Res.2006;98:1032-9. Webb DJ. et al. Adhesion assembly, disassembly and turnover in migrating cells -- over and over and over again. Nat Cell Biol.2002;4:97-100. Webb DJ, Horwitz AF. New dimensions in cell migration. Nat Cell Biol. 2003;5:690-2. Zhou G.et al. Advanced glycation end-products induce connective tissue growth factor-mediated renal fibrosis predominantly through transforming growth factor β-independent pathway. Am J Pathol. 2004;165:2033-43. Zhu HJ, Burgess AW. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Mol Cell Biol Res Commun.2001;4:321-30.