MATERIAL E MÉTODOSlabs.icb.ufmg.br/lbcd/grupo7/monografia real.doc · Web viewGranulócitos humanos (1x106 células em solução salina de Hank’s pH 7.4) incubados ou não na presença

Introdução

1

No Brasil o tipo de colonização e povoamento geraram locais

satisfatórios para o desenvolvimento de várias doenças (Koshiba &

Pereira, 1991).

As doenças parasitárias são vistas, ainda, como um problema

sem solução, principalmente nas áreas onde o desenvolvimento é

precário. Estas doenças podem afetar tanto o homem quanto os

animais, causando-lhes alterações sistêmicas devido a facilidade de

transmissão e desenvolvimento desses parasitas (Brunet et al.,

1998).

Dentre os principais helmintos de interesse médico e

veterinário está o Schistosoma mansoni, responsável pela

transmissão da esquistossomose mansônica (Hagan et al., 1998;

Brunet et al., 1998).

O Schistosoma mansoni é um trematoda digenético da família

Schistomomatidae, causador de uma doença parasitária endêmica

que afeta 8 milhões de pessoas no Brasil (Hagan et al., 1998).

Entretanto, um declínio no número de pessoas atingidas foi

observado devido ao sistema de quimioterapia adotado pelo PECE

(Programa Especial de Controle da Esquistossomose). Contudo, a

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esquistossomose continua sendo uma doença peri-urbana em

rápida expansão devido a abundância de água, fator essencial para

o ciclo dessa doença. (Hagan et al, 1998).

Esta espécie foi descrita por Sambon em 1907, baseando-se

na morfologia dos ovos, e por Silva em 1908, pelas características

do verme adulto. Portadores de esquistossomose mansônica

apresentam vermes adultos acasalados capazes de produzir de 150

a 3000 ovos/ dia por casal sexualmente ativo (Coelho, 1970). A

deposição de ovos do Schistosoma mansoni no fígado, intestino e

pulmões no hospedeiro induz ao aparecimento de uma reação

granulomatosa com subsequente fibrose (Warren, 1972a; 1978 e

Nash et al., 1982). O granuloma hepático pode apresentar um

volume até cem vezes maior que o ovo, bloqueando o fluxo

sanguíneo local e provocando hipertensão portal (Warren 1973;

1978).

Deste modo, verificamos que a esquistossomose mansônica é

uma doença cuja patologia está basicamente associada às reações

do hospedeiro ao ovo do parasita.

Um outro helminto de interesse clínico e científico é a

Syphacia obvelata. Este parasita é um nematodeo da família

Oxyuridae capaz de parasitar, também, homens e camundongos. É

considerado não patogênico por não causar danos macroscópicos e

sua presença só é detectada após a expulsão de ovos pelas fezes

(Neves, 1997).

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O ciclo de vida da Syphacia obvelata é direto e dura de 8 a 15

dias. Após a ingestão de ovos pelo hospedeiro, a larva cresce e se

modifica, tornando-se sexualmente madura entre 6 e 7 dias. Após a

fecundação, o macho morre e é eliminado pelas fezes. As fêmeas

grávidas migram do intestino para o reto e depositam os ovos na

região perianal morrendo logo em seguida. Os ovos depositados

tornam-se infectantes em poucas horas (Neves, 1997).

Durante a infecção por Syphacia obvelata é observada uma

defesa humoral, com presença de IgG específica contra o verme,

contribuindo para a modulação do sistema imune do hospedeiro.

Além disso, a parasitose por este helminto pode predispor,

transmitir ou favorecer o desenvolvimento de doenças bacterianas

e virais, e suprimir ou aumentar o crescimento tumoral (Sato et al.,

1995, Nakagawa et al., 1984).

Assim, de posse dessas informações, parece existir uma

relação hospedeiro-parasita bastante complexa nestas duas

parasitoses, devido a exposição contínua a antígenos. Dentro deste

contexto, o estudo e a compreensão de fatores que regulam ou

exarcerbam os processos inflamatórios e, ainda, dos fatores que

controlam o estabelecimento e a manutenção de mecanismos

imunorreguladores constituem aspectos essenciais a uma melhor

compreensão destas parasitoses.

Acredita-se que as linfocinas exerçam um papel fundamental

em inúmeros fenômenos inflamatórios e imunorregulatórios.

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Algumas destas linfocinas já foram descritas como sendo

importantes na esquistossomose:

- fator promotor da estimulação de eosinófilos – ESP (Kazura

et al., 1975)

- fator quimiotático para granulócitos (Dabes, 1985)

- fator inibidor da migração de leucócitos (Rouviex et al.,

1985)

- fator mitogênico – MF (Gazzineli et al., 1983)

Em nosso laboratório foi descrito por Noguiera-Machado et al.,

1983 um fator solúvel derivado de células mononucleares do

sangue periférico de portadores de esquistossomose mansônica em

fase crônica. Os autores observaram que este fator era capaz de

inibir a citotoxicidade de granulócitos humanos contra

esquistossômulos in vitro, em um ensaio dependente de

complemento (Nogueira-Machado et al., 1983). Os autores ainda

demostraram que o GIF (Fator Inibidor da Citotoxicidade de

Granulócitos) era capaz de modular a formação de granuloma de

fase aguda em camundongos entre 6 e 9 semanas de infecção,

parecendo, assim, estar envolvido nos fenômenos de

imunomodulação observados durante a esquistossomose

(Nogueira-Machado et al., 1988). Entretanto, a presença de GIF em

outras parasitoses causadas ou não por outros helmintos ainda não

foi estudada.

Recentemente, o papel de outras linfocinas nos processos de

imunorregulação tem sido descrito. A IL-10 inibe a produção de NO

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por macrófagos ativados com IFN (Gazzinelli et al., 1992, Cunha et

al., 1992, Bodgan et al., 1991). A capacidade da IL-10 em inibir a

produção de óxido nítrico e a morte de parasitas, como

Schistosoma mansoni e Leishmania, parece estar associado a

inibição da produção de TNF provocada por esta interleucina

(Moore et al., 1993). Sabe-se também que a sensibilização de

camundongos com ovos de parasitas e a presença de IL-12 antes

da infecção limita o tamanho do granuloma e reduz a fibrose

hepática (Cheever et al., 1998; Brunet et al., 1998). A IL-5 e IL-4 são

responsáveis pela eosinofilia e elevados índices de IgE observados

durante as infecções por helmintos, incluindo o Schistosoma

mansoni (Sher et al., 1991). Neste contexto, Brunet et al., 1998

verificaram que a neutralização ou ausência de IL-5 durante a

infecção aguda evita a eosinofilia, mas não afeta o tamanho do

granuloma e a fibrose, demonstrando que a IL-5 tem apenas um

papel secundário na patogênese da esquistossomose.

O IFN é um poderoso agente ativador de macrófagos para a

fagocitose de partículas. Também é ativador de neutrófilos, capaz

de exarcerbar nestes o “burst” respiratório (Abbas et al., 1995).

Além disso, já foi demonstrado que o IFN pode limitar a fibrose em

camundongos infectados por Schistosoma mansoni, sem contudo

afetar o tamanho do granuloma (Brunet et al., 1998).

A participação de células nos mecanismos de

imunorregulação também têm sido alvo de estudos. Sabe-se que

mudanças no metabolismo das células envolvidas nos processos de

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combate ao parasita ocorrem no intuito de reduzir a infecção, por

exemplo, por Escherichia coli (Nonoshiba et al., 1993). Entretanto,

pouco se sabe da participação de granulócitos nos circuitos

imunorregulatórios presentes nas parasitoses.

Os granulócitos são células fagocíticas capazes de gerar altos

níveis de ROS durante os processos inflamatórios ou

imunorregulatórios (Chaves at al, 1996). Dentre estes radicais, sob

o ponto de vista citotóxico, os mais importantes são o oxigênio

“singlet” e o radical hidroxil por participarem da peroxidação

lipídica e oxidação de proteínas.

Estas espécies reativas de oxigênio, denominadas ROS,

podem ser produzidas em um sistema dependente ou não de

enzimas. As vias não enzimáticas ocorrem por radiação ionizante

(Altman et al., 1970), fotólise (Pryor, 1976) e reações do oxigênio

com compostos orgânicos (Mead, 1976). As reações enzimáticas

incluem o citocromo P-450 (Sato e Omura,1978), reações da cadeia

respiratória (Nohl et al, 1979) e através da explosão respiratória de

células fagocíticas (Harman,1981; Babior, 1994; Chanock et

al.,1994).

Durante a fagocitose por granulócitos ocorre uma explosão

respiratória culminando com o aumento da metabolização da

glicose. No processo de obtenção de energia através deste açúcar

ocorre a formação de NADPH+H+, que será utilizado pela NADPH-

oxidase para a formação de espécies reativas de oxigênio. Esta

enzima possui parte de sua estrutura localizada na membrana e

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parte no citoplasma. Quando há uma transferência dos

componentes do citoplasma para a membrana ocorre a dissociação

de um dos componentes da membrana, tornando a enzima ativa

(Chanock et al., 1994; Babior, 1994). Depois de ativada esta enzima

catalisa a transformação de O2 em .O2- (Babior, 1994).

Apesar de ser uma espécie reativa, o superóxido é pouco

danoso quando comparado com as outras espécies reativas de

oxigênio que este pode gerar. (Cheeseman e Slater, 1993). Em pH

fisiológico o superóxido rapidamente se transforma em peróxido de

hidrogênio ou ainda em hidroxil, sob condições especiais como

presença de metais de transição através da reação de Haber-Weiss

(Rosen et al., 1995).

REAÇÃO DE HABER-WEISS

Além das espécies reativas de oxigênio (ROS), os granulócitos

também são capazes de gerar espécies reativas de nitrogênio

(RNS).

A formação de espécies reativas de nitrogênio (RNS) também

está envolvida na defesa do organismo contra patógenos. Esta

geração ocorre através de um complexo enzimático denominado

óxido nítrico sintase (NOS) (Bryant et al., 1992; Chen e Mehta,

1996). Durante a sua formação o nitrogênio é retirado da porção N-

8

.O2- + .O2- + 2H+ H2O2 + O2

.O2- + Fe3+ Fe2+ + O2

Fe2+ + H2O2 HO. + HO- +Fe3+

terminal da L-arginina de acordo com a reação abaixo (Knowles e

Moncada, 1994):

Apesar de ser gasoso, na última década, o óxido nítrico vem

ganhando importância tanto na área imunológica quanto na de

neurotransmissão. Propõem-se enormes e variadas funções a esta

pequena molécula de apenas 40Da (Appleton et al., 1996).

A produção de NO dá-se pela óxido nítrico sintase, que possui

três isoformas: a neuronal (nNOS), a endotelial (eNOS) e a indutível

(iNOS). A nNOS recebeu esta denominação por ter sido

primeiramente observada no sistema nervoso (Bredt et al., 1991;

Nakane et al., 1993), porém agora já é encontrada em células

musculares, neutrófilos, ilhotas pancreáticas, endométrio e epitélio

gastrointestinal (Nathan e Xie, 1994).

Do mesmo modo a eNOS recebeu esta denominação: por ter

sido descrita primeiramente no endotélio, sendo que, atualmente,

também já é observada em outras células como plaquetas (Lamas

et al., 1992; Sessa et al., 1992).

A iNOS recebe esta nomenclatura porque sua expressão é

dependente de um estímulo, ou seja, a célula capaz de expressar

9

H2N NH

NH

H2N+ COO-

+ N-OH

NH

H2N+ COO-

+H2N O

NH

H2N+ COO-

+H2N

+ NONADPH

O2

NADPH

O2

L-arginina Ng-hidroxi-L-arginina citrulina óxido nítrico

esta isoforma necessita de um sinal capaz de promover a

transcrição do gene responsável pela mensagem da iNOS. Ela foi

primeiramente descrita em macrófagos (Xie et al., 1992), não

sendo porém restrita a essa linhagem celular: também é

encontrada em outras células do sistema imune como

polimorfonucleares, por exemplo (Appleton et al., 1996).

Apesar da homologia existente entre as NOS (cerca de 90%),

elas possuem modos de ação diferentes. Assim, as isoformas nNOS

e eNOS são chamadas de constitutivas (cNOS). Essas formas

constitutivas dependem de calmodulina e Ca2+ para produzirem

óxido nítrico. A forma indutível, iNOS, é independente de Ca2+ pois

já possui a calmodulina ligada. Todas as isoformas necessitam de

co-fatores como nucleotídeo de adenina-flavina, mononucleotídeo

falvina, nicotidamida adenina de nucleotídeo fosfato e

tetrahidropterina. (Appleton et al., 1996).

Recentemente, uma nova abordagem tem sido feita para se

avaliar o balanço entre as espécies reativas de oxigênio (ROS) e

nitrogênio (RNS).

O óxido nítrico provém da óxido nítrico sinatase e está

envolvido na paralização da peroxidação lipídica (Darley-Usmar et

al., 1995). As espécies reativas de oxigênio são produzidas,

basicamente, de quatro maneiras: respiração mitocondrial, NADPH-

oxidase, xantina oxidase e oxidação de biomoléculas endógenas

(Rosen et al., 1995). Quando há um desequilíbrio na produção de

ROS, estas espécies reagem com o óxido nítrico e produzem

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peróxido nitrito. Este, por sua vez, é instável, capaz de formar

espécies ainda mais danosas as células que as RNS e ROS

separadamente (Ignarro et al., 1993, Van der Vliet et al., 1994,

Crow et al., 1995).

Assim, uma produção aumentada de espécies reativas, tanto

do oxigênio quanto do nitrogênio, pode causar lesões no organismo

(Chaves et al., 1996). Portanto, alterações metabólicas observadas

em algumas patologias podem ser decorrentes de uma não

compensação satisfatória do poder redutor celular, já que o

organismo em condições normais tende a manter-se em equilíbrio.

(Nogueira-Machado et al., 1995;Chaves et al., 1998).

O poder redutor celular é composto por sistemas enzimático e

um não enzimático, capazes de neutralizar os efeitos das espécies

reativas por utilização do sistema redox, pela transferência de

elétrons (Cadenas, 1995).

Dentre os principais compostos não enzimáticos estão, por

exemplo, o -tocoferol), ácido ascórbico e -caroteno (Cadenas,

1995).

O -tocoferol é conhecido como vitamina E. Está presente nas

membranas celulares, portanto, é um importante antioxidante

envolvido no controle da peroxidação lipídica. (Martinez-Cayuela,

1995). Todavia, esta neutralização gera um outro composto reativo,

o tocoferil, que é neutralizado pelo ácido ascórbico-GSH. O ácido

ascórbico parece também estar envolvido na neutralização de

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compostos reativos derivados de nitrogênio, como o óxido nítrico e

peroxidonitrito. (Van der Vliet et al., 1994).

A GSH (glutationa reduzida) pode ser oxidada por ação direta

com ROS, tornando-se oxidada (GSSH) (Proctor e Reynolds, 1984;

Cadenas, 1989), mas também parece estar envovida na

neutralização de óxido nítrico (Clancy et al, 1994; Kröncke et al.,

1997).

Dentre as enzimas envolvidas na neutralização de ROS estão

as superóxido desmutase, as catalases e as peroxidases, que em

sua maioria necessita de metais como manganês, sódio ou ferro

(Niwa et al., 1993).

Apesar de suas ações já serem bem estudas para a

neutralização de ROS, recentemente têm-se observado avanços nos

estudos do envolvimento destas proteínas na neutralização de RNS.

A catalase e a peroxidase, por exemplo, são capazes de neutralizar

H2O2, impedindo assim a formação de íons ainda mais danosos às

células. A expressão das catalases ainda é indutível pelo óxido

nítrico, demonstrando que esta enzima pare estar envolvida em

sistemas antioxidantes contra este óxido (Kröncke et al., 1997).

A superóxido desmutase, enzima capaz de neutralizar o

superóxido, também pode ter sua expressão induzida por óxido

nítrico. Ela também possui um papel importante na neutralização

deste óxido pois sua ação compromete a formação de peroxinitrito

(Nunoshiba et al, 1995; Sano et al, 1996, Kröncke et al., 1997).

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Torna-se pertinente ainda destacar que para o avanço dos

estudos sobre os mecanismos imunorreguladores presente nas

parasitoses, o auxílio de um modelo experimental em animais é

uma ferramenta de grande valia. Estes estudos podem contribuir

para um melhor entendimento das alterações observadas no

hospedeiro, decorrentes da ação dos parasitas.

Neste contexto, nosso trabalho tentará verificar,

primeiramente, se a produção de GIF (fator inibidor da

citotoxicidade de granulócitos) é exclusiva de células

mononucleares humanas ou células mononucleares de

camundongos infectados por Schistosoma mansoni também podem

reproduzir o GIF. Além disso, verificaremos se este fator pode ser

detectado em outras helmintoses. Como passo adicional,

tentaremos correlacionar o efeito do GIF (produzido por células

mononucleares de camundongos infectados por Schistosoma

mansoni e Syphacia obvelata) sobre o balanço ROS/RNS e

ROS/RNS/CRP (poder redutor celular)devido ao envolvimento de

linfocinas, granulócitos e de espécies reativas de oxigênio e

nitrogênio nos mecanismos de inflamação e imunorregulação.

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Objetivos

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Objetivo Geral

Avaliar o efeito do GIF produzido por células mononucleares

de camundongos infectados por Schistosoma mansoni e Syphacia

obvelata em granulócitos humanos

Objetivos específicos

Avaliar se células mononucleares de camundongos infectados

por Schistosoma mansoni são capazes de produzir o GIF

Avaliar se o GIF pode ser produzido por células

mononucleares de camundongos infectados por Syphacia obvelata

Avaliar, comparativamente, o efeito do GIF produzido por

células mononucleares de camundongos infectados por

Schistosoma mansoni ou Syphacia obvelata na produção de

espécies reativas de oxigênio (ROS) por granulócitos humanos,

através de quimoluminescência.

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Schistosoma mansoni ou Syphacia obvelata na produção das

espécies reativas de nitrogênio (RNS) por granulócitos humanos,

avaliado pela reação de Griess.



Schistosoma mansoni ou Syphacia obvelata no poder redutor de

granulócitos humanos (CRP), avaliado pela metabolização de MTT.

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Material e Métodos

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1-Reagentes

1- Monopaque- BION Ltda

2- Leukopaque- BION Ltda

3- MTT - 3-(4,5 dimethyazol-2yl)-2,5 diphenyltetrazolium

bromide - Sigma

4- Isopropanol - Vetec

5- Ácido clorídrico - Merk

6- Azul de Trypan - Sigma

7- RPMI 1640 - Sigma

8- Luminol (5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalozinedione) - Sigma

9- Sulfanilamida - Sigma

10- Naftiletilenodiamida - Sigma

11- Ácido fosfórico 85% - Sigma

12- Liquemine – Roche

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2- Obtenção de células

2.1- Células Humanas

Os granulócitos humanos foram obtidos através da

separação, descrita por Bicalho et al., 1981, do sangue periférico de

doadores selecionados pela Fundação HEMOMINAS.

2.2- Células de Camundongo

As células de camundongos foram obtidas de duas maneiras.

As células do sangue periférico (células mononucleares e

granulócitos) foram retiradas através de punção subclávica

enquanto o camundongo era mantido sob o efeito anestésico do

éter. Após a sua morte, o baço foi retirado para a futura obtenção

de células mononucleares deste órgão.

3- Separação de células humanas

O sangue, 4 ml, foi empilhado sobre o gradiente de dupla

densidade de Ficoll-Hypaque (densidade= 1,08 e 1,12,

respectivamente), 6mL, e submetido à centrifugação por 30

minutos a 100G. Feito isso, ocorreu uma separação dos

componentes do sangue, ficando o plasma na porção superior,

enquanto as hemácias permaneceram depositadas no fundo. Entre

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essas duas fases formaram-se dois anéis: um mais próximo do

plasma, rico em células mononucleares, e outro mais próximo às

hemácias, rico em granulócitos.

Os anéis foram retirados separadamente e colocados em

tubos de ensaio siliconizados para lavagem com solução salina

balanceada de Hank´s, pH=7,4. Ambos foram submetidos à

centrifugação por 30 minutos a 50G. Após este procedimento foi

retirado o sobrenadante e o material depositado foi ressuspenso

para nova centrifugação, por 15 minutos a 100G. Após as lavagens,

as células foram ressuspensas em 1,0 mL da solução salina

balanceada de Hank´s, pH=7,4, para os ensaios de

quimioluminescência e MTT; ou 1,0 mL de RPMI, pH=7.4, para a

dosagem de óxido nítrico. A viabilidade celular foi avaliada através

de exclusão por Azul de Trypan, mostrando-se, sempre, superior a

95%.

4-Separação de células de camundongo

4.1- Granulócitos

O sangue periférico (700L) foi colocado sobre 700L de

gradiente de dupla densidade Ficoll-Hypaque e, a partir desse

ponto, a separação deu-se do mesmo modo que em células

humanas.

20

4.2- Células mononucleares

O baço foi esmagado sob uma peneira com poros de 1mm.

Esta peneira foi lavada para a retirada das células com 5mL de

solução salina NaCl 0.15M, para cada baço de camundongo

utilizado. Os 5Ml foram, então, empilhados sobre gradiente

monopaque para a separação das células mononucleares

presentes no baço. Após a centrifugação por 15 min a 100G, foi

retirado o anel rico em mononucleares. Esse anel foi lavado com

solução salina de Hank’s, pH 7.4, por 30 min a 50G. Após este

procedimento o sobrenadante foi retirado e as células foram

ressuspenssas em solução salina de Hank’s, pH 7.4, e centrifugadas

por 15 min a 100G. O “pellet” foi ressupenso em 1ml de solução

salina de Hank’s, pH 7.4. A viabilidade celular fio avaliada por

exclusão com Azul de Trypan e, sempre, se manteve superior à

95%.

5- Obtenção de GIF (Fator Inibidor da Citotoxicidade de

Granulócitos)

Células mononuclerares foram obtidas, tanto do sangue

periférico quanto do baço de camundongos, conforme descrito

anteriormente.

Pérolas de poliacrilamida conjugadas com SEA (Soluble Eggs

Antigen) ou SWAP (Soluble Worm Adult Proteins) de Schistosoma

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mansoni e antígeno de Syphacia obvelata foram incubadas com

células mononucleares, na proporção de 200 “beads” para 1x106

células, para produção de GIF. Essas células com “beads” foram

mantidas por 24h em estufa 5% de CO2 a 37ºC. Após a incubação, o

sobrenadante rico em GIF foi retirado após ter sido centrifugado por

15 minutos a 100G.

6- Ensaio de quimioluminescência

O volume de células obtidas na separação foi acertado para

1x106 granulócitos/100L. Uma solução de luminol 10-4M (500L) foi

acrescentado a 100L de granulócitos sendo colocado no

luminômetro.

As espécies reativas de oxigênio reagem com o luminol (5-

amino-2,3-dihidro-1,4phtalozinedione) produzindo um ânion

instável, o -aminoftalato, que libera um fóton de luz quando

retorna à sua forma eletrônica estável. A luz é diretamente

proporcional à quantidade de espécies reativas de oxigênio

produzidas. Essa reação ocorre no interior do aparelho (1250-

Luminometer, Bio Orbit) que é dotado de um sistema de catôdo e

ânodo, o qual permite a leitura dos fótons emitidos no comprimento

de onda de 425nm. O aparelho é dotado de impressora que faz o

registro de leitura de 1 em 1 minuto.

Após 10 minutos de leitura basal no luminômetro, o GIF

(200L) foi acrescentado aos granulócitos, no experimento teste,

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enquanto que no experimento controle foi acrescentado 200L de

solução salina balanceada de Hank´s pH=7,4, de modo que o

volume final fosse 700L. A leitura foi feita por mais 30 minutos, em

intervalos de 1 minuto, e os valores expressos em Unidade Relativa

de Luz/ segundo (RLU/s).

7- Ensaio de quantificação de óxido nítrico

A avaliação da produção de óxido nítrico foi feita através da

dosagem de nitrito, que é o metabólito estável desta produção

(Ignarro et al., 1993; Crow e Beckman, 1995). A dosagem de nitrito

foi feita através da Reação de Griess (Griess, 1864 e 1879).

Os granulócitos (1x106 em RPMI pH=7,4) foram incubados

com 200L de GIF (experimento teste), ou sem GIF (experimento

controle), por 24h em estufa de CO2 a 37ºC em tubos siliconizados.

Em todos os ensaios o volume final foi de 500L, ajustado com RPMI

pH=7,4. O sobrenadante foi retirado após centrifugação, 15

minutos a 100G, e distribuído em placas de 96 poços, 100L por

poço, em triplicata. O “pellet” foi ressuspenso em 200l de RPMI

pH=7,4 para análise imediata da viabilidade celular.

Aos 100L de sobrenadante dispostos na placa foi

acrescentado 100L de solução de Griess, formada por

sulfanilamida 1% em 2,5mL de ácido fosfórico e

nafitiletilenodiamida 0,1% em 2,5% de ácido fosfórico, na

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proporção de 1:1. A leitura da produção de nitrito foi feita em leitor

de ELISA, no comprimento de onda de 540nm.

A concentração de nitrito foi calculada por regressão linear,

usando-se a curva padrão obtida a partir da diluição seriada de

uma solução de nitrito de sódio 1mM em RPMI. Nesta curva padrão

r2, sempre, se mostrou superior a 0,98 (figura 1).

Figura 1- Curva padrão típica utilizada para cálculo da concentração de nitrito

nos experimentos de dosagem de óxido nítrico

A partir da curva padrão e dos valores de absorbância obtidos no leitor de ELISA a 570nm, a concentração de nitrito dos sobrenadantes dos granulócitos humanos, após 24 h de incubação, foi estimada através de regressão linear. Cálculos feitos no software MicroCal Origin 3.0.

24

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25-0 ,2

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

1 ,2

1 ,4

1 ,6

Abso

rbân

cia

(540

nm)

Co ncentração de nitr ito

8- Avaliação da capacidade redutora celular

Este ensaio foi avaliado através da metabolização de MTT [3-

(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazollium bromide], um sal

de tetrazílo, segundo Malaquias et al.,1991, Silva-Teixeira, 1990 e

Gomez et al.,1994.

Nesse ensaio a redução do sal de tetrazólio requer a

participação de desidrogenases que utilizem o NADPH ou FADH2

como cofatores. Essa redução baseia-se no principio de colorimetria

onde o sal oxidado possui coloração amarela. Quando este sal é

reduzido por essas desidrogenases adquire coloração variando de

castanho a azul, dependendo da intensidade da metabolização

celular.

Granulócitos humanos (1x106 células em solução salina de

Hank’s pH 7.4) incubados ou não na presença de GIF, produzido por

células mononucleares tanto do sangue periférico quanto do baço

de camundongos, foram colocados em banho-maria a 37ºC por 30

minutos. Após essa primeira incubação, a solução de MTT (5mg/mL)

foi acrescentada (20L) e as células permaneceram por mais 2

horas na mesma incubação para a devida metabolização do sal.

Após 2 horas foi acrescentada uma solução de

Isopropanol/HCl 0,04N para que as células fossem rompidas e a

metabolização paralizada. Fez-se, então, uma homogeinização

através de vortex para que os cristais de formazan, derivados da

25

metabolização do MTT, fossem dissolvidos para a leitura em

espectrofotômetro (ausJENA) no comprimento de onda de 570nm.

9- Análise parasitológica

Os intestinos dos camundongos foram retirados e submetidos

a análises parasitológicas, pelo método de Hoffaman, para que só

fossem utilizados os sobrenadantes provenientes de células de

camundongos que não possuíssem parasitas ou que possuíssem

somente Schistosoma mansoni ou Syphacia obvelata.

10- Avaliação da viabilidade celular

A viabilidade dos granulócitos foi avaliada através do teste de

exclusão pelo Azul de Trypan (Oliveira-Lima e Dias da Silva,1970).

11- Análises estatísticas

O teste estatístico usado foi o Teste “t” Student, que é

normalmente utilizado em situações onde se deseja determinar o

nível de significância de um tratamento em relação a um grupo dito

controle. Essa teste é usado em casos de amostras pequenas onde

a distribuição é, presumidamente, normal.

26

Resultados

27

I- EFEITO DO GIF PRODUZIDO POR CAMUNDONGOS

INFECTADOS POR Schistosoma mansoni e Syphacia obvelata

SOBRE GRANULÓCITOS HUMANOS: AVALIAÇÃO DA

CAPACIDADE CITOTÓXICA E PRODUÇÃO DE ESPÉCIES

REATIVAS DE OXIGÊNIO (ROS)

28

O GIF (fator inibidor da citotoxicidade de granulócitos) é um

fator solúvel, derivado de células mononucleares sob estimulação

antigênica, que foi primeiramente estudado em células humanas.

Esse fator foi capaz de inibir a citotoxicidade de granulócitos

humanos contra esquistossômulos in vitro na dependência de

complemento. Com o objetivo de melhor caracterizá-lo, resolvemos

avançar nossos estudos utilizando o modelo experimental em

camundongos.

Nosso primeiro passo foi verificar se células mononucleares

de camundongos eram capazes de sintetizar o GIF e se este teria o

mesmo efeito biológico do sintetizado pelas células humanas.

Células mononucleares (sangue periférico e baço) de

camundongos infectados por Schistosoma mansoni foram

incubadas por 24 h com “beads” recobertas com SWAP ou SEA em

estufa 5% de CO2 a 37ºC. Após esse período, as células foram

centrifugadas e os sobrenadantes, isentos de células e antígenos,

foram recolhidos e testados. Para melhor atendermos ao nosso

29

objetivo inicial de comparação do efeito do GIF humano com o de

camundongo, reproduzimos o ensaio utilizado para o GIF humano, a

saber: ensaio citotóxico dependente de complemento.

Os resultados da figura 2 mostram que o sobrenadante de

células mononucleares tanto do sangue periférico quanto do baço

de camundongos infectados por Schistosoma mansoni foram

capazes de inibir significativametne (P<0.05) a capacidade

citotóxica de granulócitos de camundongos (painel A).

Entretanto, sobrenadantes de células mononucleares de

camundongos não infectados por Schistosoma mansoni não foram

capazes de inibir significativamente (P>0.05) a citotoxicidade de

granulócitos de camundongos (figura 2, painel B).

30

Figura 2- Efeito do GIF sobre a capacidade citotóxica de granulócitos de

camundongos infectados por Schistosoma mansoni contra esquistossômulos in

vitro.

NS= não significativo quando comparado ao controle*P<0,05 pelo Teste “t” Student quando comparado ao controleOs valores represemtam a média de três experimentos em triplicata + desvio padrãoE=esquistossômulos; Cci=complemento de camundongo inativado, Cc=complemento de camundongo, G=granulócitos de camundongo, Sp=sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico de camundongos em ausência de GIF, Sb=sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos em ausência de GIF, Sp*GIF= sobrenadante de células

31

E+Cci E+Cc E+Cc+G G+Sp*GIF G+Sb*GIF0

10

20

30

40

50%

de

larv

as

mor

tas

E+Cci E+Cc E+Cc+G G+Sp G+Sb0

10

20

30

40

50

% d

e la

rvas

m

orta

sA

B

* *

NSNS

mononucleares do sangue periférico de camundongos rico em GIF, Sb*GIF= sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos rico em GIF

32

A partir desses resultados resolvemos testar se o GIF

produzido por células mononucleares de camundongos atuaria em

granulócitos humanos. Esse fato nos traria vantagens tanto no

manuseio como na maior facilidade de obtenção dos granulócitos.

Nossos resultados mostram que o GIF produzido por células

mononucleares de camundongos infectados por S. mansoni foi

capaz de inibir, significativamente (P<0,05), a citotoxicidade de

granulócitos humanos (figura 3, painel A).

Entretanto, sobrenadantes de células mononucleares de

camundongos não infectados por Schistosoma mansoni, não foram

capazes, também, de inibir significativametne (P>0.05) a

citotoxicidade de granulócitos humanos (figura 3, painel B). Esses

resultados nos mostram que a ação do GIF não é espécie específica.

Com base nestes achados, o nosso estudo, a partir deste momento,

consistirá em verificar o efeito do GIF produzido por células

mononucleares de camundongos em granulócitos humanos.

33

Figura 3- Efeito do GIF (sintetizado por células mononucleares de camundongos

infectados por Schistosoma mansoni) sobre a capacidade citotóxica de

granulócitos humanos contra esquistossômulos in vitro

NS= não significativo quando comparado ao controle*P<0,05 pelo Teste “t” Student quando comparado ao controleOs valores represemtam a média de três experimentos em triplicata + desvio padrãoE=esquistossômulos; Cci=complemento de camundongo inativado, Cc=complemento de camundongo, G=granulócitos de camundongo, Sp=sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico de camundongos em ausência de GIF, Sb=sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos em ausência de GIF, Sp*GIF= sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico de camundongos rico em GIF, Sb*GIF= sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos rico em GIF

34

E+chi E+ch E+ch+G G+Sp*GIF G+Sb*GIF0

10

20

30

40

50%

de

larv

as

mor

tas

E+chi E+ch E+ch+G G+Sp G+Sb0

10

20

30

40

50

% d

e la

rvas

m

orta

sA

B

* *

NSNS

Outro ponto tornava-se passível de estudo. Verificamos,

através das análises parasitológicas, que muitos camundongos

considerados controle estavam infectados por outro parasita:

Syphacia obvelata, que, como o Schistosoma mansoni, é um

helminto. Resolvemos verificar, então, se células mononucleares de

camundongos infectados por Syphacia obvelata eram capazes de

produzir o GIF.

Nossos resultados mostram que o sobrenadante de células


foi capaz de inibir significativamente (P<0.05) a citotoxicidade de

granulócitos humanos (figura 4, painel A). Novamente,

sobrenadantes de células mononucleares de camundongos não

infectados por Syphacia obvelata não foram capazes, também, de

inibir significativamente (P>0.05) a citotoxicidade de granulócitos

humanos (figura 4, painel B).

35

Figura 4- Efeito do GIF produzido por camundongos infectados por Syphacia

obvelata sobre a capacidade citotóxica de granulócitos humanos in vitro.

NS= não significativo quando comparado ao controle*P<0,05 pelo Teste “t” Student quando comparado ao controleOs valores represemtam a média de três experimentos em triplicata + desvio padrãoE=esquistossômulos; Cci=complemento de camundongo inativado, Cc=complemento de camundongo, G=granulócitos de camundongo, Sp=sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico de camundongos em ausência de GIF, Sb=sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos em ausência de GIF, Sp*GIF= sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico de camundongos rico em GIF, Sb*GIF= sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos rico em GIF

36

E+chi E+ch E+ch+G G+Sp G+Sb0

10

20

30

40

50

% d

e la

rvas

m

orta

s

E+chi E+ch E+ch+G G+Sp*GIF G+Sb*GIF0

10

20

30

40

50

% d

e la

rvas

m

orta

s

A

B

**

NS NS

Entretanto, o sobrenadante produzido pelas células


foi obtido através de estimulação com antígeno de verme adulto

(SWAP) ou ovo (SEA) do Schistosoma mansoni. Resolvemos, então,

estimular essas células com “beads” de poliacrilamida recobertas

com antígeno de Syphacia obvelata para verificarmos se este

também era capaz de inibir a reatividade de granulócitos. Assim,

células mononucleares (sangue periférico e baço) de camundongos

infectados por Syphacia obvelata foram incubadas com antígenos

de Syphacia obvelata por 24h a 37ºC e 5% de CO2. Após decorrido

este tempo, as células foram centrifugadas e os sobrenadantes

(isentos de células e antígenos) foram testados no ensaio de

quimioluminescência.

A figura 5 mostra que granulócitos incubados com

sobrenadantes ricos em GIF, produzidos tanto por células

mononucleares do sangue periférico (painel B) quanto do baço de

camundongos (painel C) infectados por Syphacia obvelata, foram

capazes de inibir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS)

quando comparados com o controle. Para quantificarmos as

diferenças observadas na produção dessas espécies reativas

utilizamos o pico máximo da reação (RLU/s).

Nossos resultados mostram que granulócitos incubados com

sobrenadante rico em GIF de células mononucleares do sangue

periférico e do baço de camundongos, infectados por Syphacia

obvelata, foram capazes de inibir significativamente (P<0.05) a

37

produção de espécies reativas de oxigênio quando comparados

com o controle pelo Teste “t” de Student. (tabela 1).

Figura 5- Curva típica do efeito do GIF produzido por células mononucleares de

camundongos infectados por Syphacia obvelata e estimuladas com antígeno de

Syphacia obvelata sobre a produção de ROS de granulócitos humanos

G= granulócitos humanosHank’s= solução salina balanceada pH 7.4Sp*GIF= sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico de camundongos infectados por Syphacia obvelata rico em GIFSb*GIF= sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos infectados por Syphacia obvelata rico em GIFRLU/s= unidade relativa de luz/segundo

38

10 20 30 400

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

pico

máx

imo

(RLU

/s)

tempo (min)

10 20 30 400

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

pico

máx

imo

(RLU

/s)

tempo (min)10 20 30 40

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

pico

máx

imo

(RLU

/s)

tempo (min)

C

A

B

G+Hank’s

G+Sp*GIFG+Sb*GIF

39

II- EFEITO DO GIF PRODUZIDO POR CAMUNDONGOS

INFECTADOS POR Schistosoma mansoni e Syphacia obvelata

SOBRE O BALANÇO ROS/RNS E ROS/RNS/CRP EM

GRANULÓCITOS HUMANOS

40

Neste bloco de resultados os nossos estudos avaliarão,

comparativamente, o efeito do sobrenadante produzido por células

mononucleares de camundongo infectados por Schistosoma

mansoni e por Syphacia obvelata sobre o balanço ROS/RNS em

granulócitos humanos. A nosso ver, este estudo se faz pertinente

pois o envolvimento dessas espécies oxidantes (ROS e RNS) nos

mecanismos imunorregulatórios e inflamatórios é de grande

relevância, assim como é o papel de linfocinas e interleucinas na

regulação desses sistemas.


mononucleares tanto do sangue periférico quanto do baço de

camundongos infectados por Schistosoma mansoni foi capaz de

inibir a produção de ROS significativamente, pelo Teste “t” de

Student (P<0.05), pelos dois parâmetros analisados, pico máximo

da reação (Unidade relativa de luz/ segundo - RLU/s) e a produção

total de ROS (área da integral sob a curva em cm2), como pode ser

observado na figura 6.

41

Figura 6- Efeito do GIF (camundongos infectados por Schistosoma mansoni)

sobre a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) por granulócitos

humanos

*P<0,05, pelo Teste “t” de Student, quando comparado ao controleOs valores representam três experimentos em triplicata + desvio padrãoG=granulócitos humanosSp*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do sangue periférico de camundongos infectados por Schistosoma mansoniSb*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do baço de camundongos infectados por Schistosoma mansoni

42

G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

prod

ução

tota

l de

ROS


1000

2000

3000

4000

5000

6000

pico

máx

imo

(RLU

/s)

A

B

**

* *

O GIF produzido por células mononucleares do sangue

periférico e do baço de camundongos infectados por Syphacia

obvelata também foi capaz de inibir significativamente (P<0,05) a

produção de ROS pelos dois parâmetros analisados (figura 7- painel

A e B).

Assim, após termos observado o efeito do GIF sobre a

geração de ROS, passamos então ao estudo das outras espécies

oxidantes, já que capacidade oxidante é formada por espécies

reativas derivadas do oxigênio (ROS) e do nitrogênio (RNS). Para

tal, avaliamos também a produção de RNS através da dosagem do

seu metabólito estável, o nitrito.

Diferente do observado com a produção de espécies reativas

de oxigênio (ROS), nossos resultados mostram que o GIF produzido

por células mononucleares, tanto do baço quanto do sangue

periférico, de camundongos infectados por Schistosoma mansoni,

foi capaz de aumentar, siginificativamente (P<0,05), a produção de

RNS pelo Teste “t” de Student quando comparado com os níveis

basais (figura 8). A figura 9 mostra que o GIF produzido por

camundongos infectados por Syphacia obvelata foi, também, capaz

de aumentar significativamente (P<0.05) a produção de nitrito

quando comparado ao controle.

43

Figura 7- Efeito do GIF (células mononucleares de camundongos infectados por

Syphacia obvelata) sobre a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) por

granulócitos humanos.

*P<0,05, pelo Teste “t” de Student, quando comparado ao controle

Os valores representam três experimentos em triplicata + desvio padrãoG=granulócitos humanos

Sp*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do

sangue periférico de camundongos infectados por Syphacia obvelata

Sb*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do

baço de camundongos infectados por Syphacia obvelata

44


1000

2000

3000

4000

5000

6000

pico

máx

imo

(R

LU/s)

**


20000

40000

60000

80000

100000

120000

prod

ução

tota

l de

ROS

**

A

B


Schistosoma mansoni) sobre a produção de espécies reativas de nitrogênio

(RNS) por granulócitos humanos.




sangue periférico de camundongos infectados por Schistosoma mansoni


baço de camundongos infectados por Schistosoma mansoni

A pré incubação dos granulócitos com L-NAME e posteriormente com GIF

provocou uma inibição de aproximadamente 48% quando comparado com o

controle contendo apenas GIF, em estudos preliminares

45


5

10

15

20

25

conc

entra

ção

de n

itrito

(uM

)

*

*


Syphacia obvelata) sobre a produção de espécies reativas de nitrogênio (RNS)

por granulócitos humanos.







A pré incubação dos granulócitos com L-NAME e posteriormente com GIF

provocou uma inibição de aproximadamente 50% quando comparado com o

controle contendo apenas GIF, em estudos preliminares

46

*

*


5

10

15

20

25

conc

entra

ção

de n

itrito

(uM

)

Assim, na análise do balanço ROS/RNS, observamos que o GIF

(produzido tanto por células mononucleares de camundongos

infectados por Schistosoma mansoni como por Syphacia obvelata)

provocou um aumento da produção de RNS e uma queda em ROS,

o que ocasionou uma alteração neste balanço, favorecendo a

produção de óxido nítrico (figura 10).

47

Figura 10- Avaliação do balanço ROS/RNS em granulócitos humanos na

presença ou ausência de GIF produzido por células mononucleares de

camundongos infectados por Schistosoma mansoni ou Syphacia obvelata

Schistosoma mansoni Syphacia

obvelata


Os valores representam três experimentos em triplicata + desvio padrão

G=granulócitos humanos


sangue periférico de camundongos infectados por Schistosoma mansoni ou por

Syphacia obvelata

48


1000

2000

3000

4000

5000

6000

pico

máx

imo

(RLU

/s)


5

10

15

20

25

conc

entra

ção

de n

itrito

(uM

)


1000

2000

3000

4000

5000

6000

pico

máx

imo

(R

LU/s)

* *

*

*

*


5

10

15

20

25

conc

entra

ção

de n

itrito

(uM

)

**

*

ROS ROS

RNS RNS


baço de camundongos infectados por Schistosoma mansoni ou por Syphacia

obvelata

49

Nosso próximo passo foi analisar a atuação do GIF sobre o

poder redutor celular (CRP). Nossos resultados mostram que

granulócitos incubados com GIF produzido por células

mononucleares tanto do sangue periférico quanto do baço de

camundongos infectados por Schistosoma mansoni foram capazes

de inibir significativamente (P<0.05) o CRP quando comparado ao

controle (figura 11). O GIF produzido por células mononucleares

(sangue periférico e baço) de camundongos infectados por

Syphacia obvelata também foi capaz de inibir significativamente

(P<0.05) o CRP de granulócitos humanos (figura 12).

Assim, tendo em vista a hipótese do equilíbrio

oxidante/redutor proposto por Nogueira-Machado et al., 1995 e

Chaves et al., 1996, realizamos a análise do efeito do GIF sobre o

balanço ROS/RNS/CRP (poder redutor celular).

Na análise conjunta do balanço oxidante (ROS/RNS)/redutor

(CRP) verificamos uma diminuição significativa, P<0,05, de ROS e

CRP e um aumento significativo, P<0,05, da produção de RNS

(tabela 2). Esses resultados nos mostram um favorecimento da

relação ROS/RNS/CRP a favor de RNS que poderia indicar a atuação

do GIF como um agente imunomodulador e, também,

antinflamatório.

50

Figura 11- Análise do poder redutor celular (CRP) de granulócitos humanos sob

o efeito do GIF produzido por células mononucleares de camundongos infectados

por Schistosoma mansoni

*P<0.05, pelo Teste “t” de Student, quando comparado ao controle




sangue periférico de camundongos infectados por Schistosoma mansoni


baço de camundongos infectados por Schistosoma mansoni

51

G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

D.O.

(570

nm)

**

Figura 12-Análise do poder redutor celular (CRP) de granulócitos humanos sob o

efeito do GIF produzido por células mononucleares de camundongos infectados

por Syphacia obvelata

*P<0.05, pelo Teste “t” de Student, quando comparado ao controle







52


0,05

0,10

0,15

0,20

D.O

.(57

0nm

)


0,05

0,10

0,15

0,20

0,25D.

O.(5

70nm

)

* *

53

54

Discussão

55

O termo helminto não designa um único grupo ou filo do reino

animal refere-se, porém, a dois grandes ramos ou filos: o dos

56

platelmintos, ou vermes chatos, e dos nematelmintos, ou vermes

cilíndricos (Smyth, 1969; Pessôa & Vianna-Martins, 1977).

Tanto o homem quanto os animais sofrem helmintoses

intestinais e somáticas. A grande importância dessas doenças é

devido a variedade de parasitas capazes de provocá-las e, ainda,

pela vasta disseminação dos mesmos (Pessôa & Vianna-Martins,

1977).

Neste contexto, o entendimento dos fatores que regulam as

reações ocasionadas por esses parasitas têm tomado grande

impulso na literatura. A utilização de modelos experimentais em

camundongos tem sido de grande valia na compreensão desses

fatores, uma vez que esses animais também são susceptíveis a

parasitoses. O camundongo é um bom hospedeiro para o estudo da

resistência adquirida da patologia, já que mostra um amplo

espectro de mudanças induzidas pelos antígenos dos parasitas

(Smyth, 1969).

O controle da intensidade da reação inflamatória estabelecida

durante a fase de cronificação das parasitoses depende de vários

fatores, dentre eles: o genótipo do indivíduo infectado (Abdel-Salam

et al., 1979,1981 e 1986; Bina et al., 1978; Lima-Pereira et al.,

1979), a atuação de linfócitos B e seus componentes solúveis no

soro (Ohta et al., 1991), o tipo de células inflamatórias mobilizadas

(células mononucleares fagocíticas, linfócitos T e B e granulócitos)

(Ottensen, 1979; Todd et al., 1979; Rocking et al., 1980) e

linfocinas (Pearce et al., 1991; Grzych et al., 1991; Xu et al., 1991).

57

Linfocinas são substâncias polipeptídicas produzidas por

linfócitos ativados que participam de uma variedade de reações

imunes. Elas regulam a ativação, crescimento e diferenciação de

várias populações de linfócitos e células inflamatórias (fagócitos

mononucleares, granulócitos e células NK) (Abbas et al., 1995). As

linfocinas agem sobre diferentes tipos celulares e frequentemente

em cooperação, uma influenciando a síntese ou ação da outra. A

sua ação é iniciada pela ligação a receptores específicos na

superfície de células alvo que podem ser as próprias células que as

secretaram (ação autócrina), células vizinhas (ação parácrina) ou

células distantes (ação endócrina). Desse modo, as linfocinas são

moléculas efetoras da imunidade mediada por células e são

também responsáveis por comunicações entre as células do

sistema imune (Arai et al., 1990, Balkwill et al., 1989, Nicola et al.,

1989).

Assim, a ação conjunta de granulócitos e linfocinas, nos

processos inflamatórios decorrentes das parasitoses, tem sido alvo

de inúmeros estudos. Dentre as linfocinas que atuam sobre

granulócitos podemos citar:

Fator promotor da estimulação de eosinófilos – ESP

(Kazura et al., 1975);

Fator inibidor da agregação de leucócitos (Rouveix et al.,

1985);

Fator inibidor da migração de leucócitos – LIF (Lima et al.,

1985);

58

Fator inibidor da aderência de leucócitos – LAIF (Nogueira-

Machado et al., 1985);

Fator quimiotático para granulócitos (Dabés et al., 1985);

Interferon gama - IFN ( Chaves et al., 1996);

Interleucina 10 – IL10 (Chaves et al., 1996);

Inteleucina 8- IL8 (Egan et al., 1996; Faccioli et al., 1998);

Inteleucina 1- IL1 (Chensue et al., 1989; Bresson-Hadni et

al., 1994);

Fator de necrose tumoral - TNF (Egan et al., 1996;

Bresson-Hadni et al., 1994).

Além desses, em nosso laboratório foi descrito por Nogueira-

Machado et al., 1983 um fator solúvel capaz de inibir a

citotoxicidade de granulócitos contra a larva do Schistosoma

mansoni in vitro, em um mecanismo dependente de complemento,

e por isto denominado GIF. Este fator foi primeiramente observado

em sobrenadantes de células mononucleares humanas

estimuladas com antígenos do Schistosoma mansoni (SEA, SWAP e

esquistossômulos).

De posse desses dados, o nosso estudo avaliará se células


mansoni são capazes de produzir o GIF e se este tem o mesmo

efeito biológico apresentado pelo GIF sintetizado por células

humanas. Nossos estudos ainda serão estendidos afim de

averiguarmos se camundongos infectados por um outro helminto,

Syphacia obvelata, são capazes de produzir o GIF. Este estudo, ao

59

nosso ver, se faz pertinente pela frequência de infecção desses

animais por este parasita.

Assim, para atendermos ao nosso objetivo inicial de

comparação do GIF humano com o produzido por células

mononucleares de camundongos, reproduzimos o ensaio utilizado

na descoberta do GIF humano, a saber: o ensaio citotóxico

dependente de complemento.

Nossos resultados mostram que células mononucleares do

sangue periférico e do baço de camundongos infectados com

Schistosoma mansoni foram capazes de produzir o GIF. O efeito do

GIF foi avaliado pela inibição significativa (P<0.05) da capacidade

citotóxica de granulócitos de camundongos (figura 2 – painel A).

Utilizamos como controle camundongos não infectados e

verificamos que o sobrenadante das células mononucleares desses

animais não foram capazes de inibir a citotoxicidade de

granulócitos de camundongos (figura 2 – painel B). Esses resultados

estão de acordo com os resultados encontrados por Soares, 1991,

que verificou que o GIF só é produzido por estimulação antígeno

dependente.

A partir desses resultados, avaliamos se o GIF sintetizado por

células mononucleares de camundongos poderia atuar em

granulócitos humanos. A possibilidade desta hipótese nos traria

grandes avanços nos estudos desse fator solúvel devido à maior

facilidade na obtenção de granulócitos, além de permitir inferências

diretas do efeito do GIF sobre a função destas células nos processos

60

inflamatórios e imunorreguladores presentes na esquistossomose

humana.


mononucleares (sangue periférico e baço) de camundongos

infectados por Schistosoma mansoni foi capaz de inibir

significativamente (P<0.05) a citotoxicidade de granulócitos

humanos (figura 3- painel A). Esses resultados estão de acordo com

os encontrados por Nogueira- Machado et al., 1983 avaliando o

efeito do GIF produzido por células mononucleares humanas sobre

granulócitos humanos. Estes dados nos permitem, ainda, confirmar

a nossa hipótese de que a ação do GIF não é espécie específica.

Então, de posse dos dados das figuras 2 e 3, passamos a

realizar nossos estudos sobre o GIF produzido por células

mononucleares de camundongos em granulócitos humanos.

Contudo, ao prosseguirmos nossos estudos, verificamos que

muitos camundongos considerados controles eram infectados por

um outro parasita a Syphacia obvelata que, como o Schistosoma

mansoni, é um helminto. Diante deste fato, resolvemos verificar se

células mononucleares de camundongos infectados por Syphacia

obvelata eram capazes, também, de produzir GIF.

Os resultados da figura 4 mostram que o sobrenadante de

células mononucleares (sangue periférico e baço) de camundongos

infectados por Syphacia obvelata foi capaz de inibir

significativamente (P<0.05) a citotoxicidade de granulócitos

humanos.

61

A análise conjunta das figuras 2, 3 e 4 nos mostra que, além

do GIF não ser espécie específica, o ele pode ser sintetizado por

camundongos infectados por outro helminto, Syphacia obvelata.

No entanto, um outro ponto se torna passível de discussão. A

produção de GIF por células mononucleares de camundongos

infectados por Syphacia obvelata foi obtido pela estimulação destas

com antígenos do verme adulto (SWAP) ou ovo (SEA) de

Schistosoma mansoni, ou seja, a produção de GIF, neste caso, deu-

se, possivelmente, através de uma reação cruzada (figura 4).

Assim, nosso próximo passo foi verificar se antígenos de Syphacia

obvelata eram capazes de provocar a produção de GIF por células

mononucleares de camundongos infectados por Syphacia obvelata.

A figura 5 mostra curvas típicas da produção de espécies

reativas de oxigênio (ROS) em ausência (painel A) ou presença de

GIF (painéis B e C). Para quantificarmos as diferenças observadas

na produção de ROS utilizamos o pico máximo da reação (RLU/s).

Nossos resultados mostram que o sobrenadante produzido por

células mononucleares de camundongos infectados por Syphacia

obvelata foi capaz de inibir significativamente (P<0.05) a produção

de ROS quando comparado com o controle (tabela 1). Verificamos

ainda que não existe diferença significativa entre as percentagens

de inibição quando comparamos o GIF produzido por camundongos

infectados por Schistosoma mansoni ou Syphacia obvelata (tabela

1).

62

Comparando os resultados das figuras 2, 3 e 4 e tabela 1

verificamos que a ação do GIF sobre granulócitos se mostrou

sempre inibitória, tanto pela análise da capacidade citotóxica

quanto pela produção de ROS.

Prosseguindo nossos estudos sobre a ação do GIF, produzido

por células mononucleares de camundongos infectados por

Schistosoma mansoni e Syphacia obvelata, avaliamos agora seu

efeito sobre o balanço entre as espécies reativas de oxigênio (ROS)

e as espécies reativas de nitrogênio(RNS).

Achamos que o estudo correlacionado entre o efeito do GIF

sobre o equilíbrio ROS/RNS pode nos trazer informações relevantes

quanto ao efeito biológico deste fator solúvel, uma vez que a

disponibilidade das espécies reativas de oxigênio (ROS) pode ser

um fator determinante na ação do óxido nítrico como molécula

citotóxica ou citoprotetora.

Neste contexto, os granulócitos formam um dos mais

importantes mecanismos de defesa contra infecções (Nagel et al.,

1986). Essas células, sendo fagocíticas, estão envolvidas na defesa

inespecífica e na inflamação, sofrendo alterações morfológicas e

bioquímicas que permitem o controle da infecção. Dentre as

alterações metabólicas decorrentes desse processo, a explosão

respiratória tem um papel fundamental pois leva à produção de

espécies reativas de oxigênio (Babior, 1994). O aumento da

produção dessas espécies altamente tóxicas pode levar ao

comprometimento da resposta inflamatória. Nesse contexto, Gallin,

63

1981, descreveu alterações da resposta quimiotática decorrentes

do aumento da produção de radicais livres. Ainda, o aumento da

produção de ROS pode estar envolvido na deficiência do sistema de

defesa do hospedeiro.

Nossos resultados mostram que, em granulócitos humanos, o

GIF produzido por células mononucleares de camundongos

infectados por Schistosoma mansoni foi capaz de inibir

significativamente (P<0.05) a produção das espécies reativas de

oxigênio pelos dois parâmetros analisados: produção total de ROS

(integral sob a área da curva em cm2) (figura 6- painel A) e o pico

máximo da reação (figura 6 – painel B).

Os granulócitos humanos também tiveram sua produção de

espécies reativas de oxigênio inibida significativamente (P<0.05)

pelo GIF produzido por células mononucleares de camundongos

infectados por Syphacia obvelata, pelos dois parâmetros

analisados: produção total de ROS (integral sob a área da curva em

cm2) (figura 7-painel A) e pico máximo da reação (RLU/s)(figura 7 –

painel B).

Nossos resultados demonstram que o GIF foi capaz de inibir a

produção de ROS podendo, então, minimizar os danos causados por

estas espécies oxidantes. Com esses resultados, acoplados aos

trabalhos de Nogueira-Machado et al., 1983 e1988, no qual os

autores verificaram que o GIF é um fator solúvel encontrado na fase

crônica da esquistossomose e que este é capaz de modular o

granuloma de fase aguda, podemos sugerir o envolvimento do GIF

64

nos processos de modulação das reações inflamatórias através da

sua ação inibitória sobre a produção de ROS.

Porém, o estudo da produção de espécies reativas de

oxigênio revela somente em parte o poder oxidante celular, já que

este é composto de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Os

mecanismos que envolvem o óxido nítrico, desde a sua produção

até sua atuação, têm envolvido inúmeros estudos.

A toxicidade do óxido nítrico é dependente da sua

concentração e do microambiente no qual ele é produzido. Embora

seja considerado por muitos autores como uma molécula pouco

reativa, o óxido nítrico é capaz, assim como o íon superóxido, de

gerar moléculas de maior reatividade, conhecidas como espécies

reativas de nitrogênio, que, assim como o próprio óxido nítrico,

desempenham importante papel nas reações inflamatórias e no

combate às infecções por bactérias, fungos e parasitas atuando

como moléculas citotóxicas (Crow & Beckman, 1995).

O óxido nítrico é capaz de reagir com o oxigênio molecular

levando à formação de um poderoso oxidante, o dióxido de

nitrogênio (.NO2). O .NO2 gerado em soluções aquosas aeróbicas, ao

contrário do observado na fase gasosa, não se decompõe em

quantidades iguais de NO2- (nitrito) e NO3- (nitrato) (Fukuto et al.,

1995). Na ausência de substratos oxidáveis, o dióxido de nitrogênio

é capaz de se combinar com o óxido nítrico levando à formação de

N2O3, o qual é capaz de “nitrosar” a água levando à liberação de

dois moles de nitrito (Crow & Beckman, 1995). Isto faz do nitrito o

65

principal produto da oxidação do óxido nítrico (Ignarro et al., 1993),

sendo assim amplamente utilizado como indicador indireto dos

níveis da produção do óxido nítrico (Green et al., 1982; Ignarro et

al., 1993; Marzinzig et al., 1997).

Nossos resultados mostram que, diferentemente do ocorrido

com a produção de ROS (figura 6 e 7), o GIF produzido por células

mononucleares, tanto do sangue periférico quanto do baço, de

camundongos infectados por Schistosoma mansoni foi capaz de

aumentar significativamente (P<0.05) a produção de RNS,

comparado com os níveis basais (figura 8), pelo Teste “t” de

Student. O GIF produzido por camundongos infectados por Syphacia

obvelata também foi capaz de aumentar significativamente

(P<0.05) a produção de nitrito quando comparado com o controle

(figura 9).

A geração de espécies reativas de nitrogênio é, na maioria

das situações, decorrente da interação do próprio óxido nítrico com

moléculas que tenham caráter de radical. Dentre estas moléculas,

passíveis de reação com o óxido nítrico, o oxigênio molecular e

seus intermediários reativos são particularmente importantes.

Logo, a disponibilidade de espécies reativas de oxigênio pode ser

um fator determinante na ação do óxido nítrico como molécula

citotóxica, sugerindo a possibilidade de um balanço entre as

espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio. A relação entre óxido

nítrico e espécies reativas de oxigênio deve ser considerada um

importante parâmetro nas reações que potencialmente envolvam

66

tais moléculas. Uma relação 1:1 de .O2- e .NO leva à produção de

peroxidonitrito e induz à peroxidação lipídica. Por outro lado, um

excesso de .NO pode inibir a peroxidação lipídica por neutralizar os

radicais peroxil (Darley-Usmar et al., 1995). Torna-se evidente que

o balanço entre o óxido nítrico e as espécies reativas de oxigênio,

especialmente o superóxido, nos sítios de injúria, pode afetar ou

até mesmo determinar se o resultado do desafio imunológico segue

para o reparo ou para a inflamação.

Neste contexto, os resultados da figura 10 mostram que o

GIF, produzido por células mononucleares tanto de camundongos

infectados por Schistosoma mansoni como por Syphacia obvelata,

aumentou a produção de RNS em relação a ROS, alterando o

balanço ROS/RNS por favorecer a produção de óxido nítrico.

Assim, nossos resultados sugerem que o GIF, em decorrência

da alteração dos sistemas oxidantes ( ativação de RNS e inibição de

ROS), estabeleceu um desequilíbrio favorável às reações de

neutralização da citotoxicidade das células, atuando como

modulador da ação citotóxica do óxido nítrico, podendo agir, assim,

como um agente imunomodulador e um potente antinflamatório

fisiológico.

Entretanto, esse aumento de RNS em relação a ROS poderia

estar sendo compensado por um aumento simultâneo da

capacidade redutora celular. Portanto, estas inferências a respeito

do balanço ROS/RNS só se fazem pertinentes caso a capacidade

redutora destas células se mostre ineficiente na neutralização

67

dessas espécies oxidantes. Assim, a avaliação dos efeitos dos

radicais livres deve levar em consideração tanto a reatividade

destas moléculas como também o potencial de defesa e reparo

celular (Nogueira-Machado et al., 1995; Chaves et al., 1996).

Para avaliarmos o poder redutor dos granulócitos utilizamos,

neste trabalho, o ensaio de metabolização de MTT (um sal de

tetrazólio). Os sais de tetrazólio fazem parte de um grande grupo

de compostos orgânicos heterocíclicos que podem ser reduzidos.

Em geral, quando esses sais são reduzidos formam-se cristais

geralmente insolúveis denominados cristais de formazan. Os sais

de tetrazólio foram inicialmente preparados em 1894 e desde então

são importantes indicadores tanto do sistema redox biológicos

como de viabilidade celular (Altman, 1976). Mosman, 1983, foi o

pioneiro na descrição da utilização desses sais em ensaios de

viabilidade e proliferação celular.

Embora ainda não estejam completamente elucidados, os

mecanismos de redução biológica dos sais de tetrazólio envolvem

componentes mitocondriais e não mitocondriais. A descoberta do

envolvimento de componentes mitocondriais foi proposta por Slater

et al., 1963 que utilizaram um sistema dependente de succinato,

inibindo especificamente a cadeia transportadora de elétrons. O

envolvimento de desidrogenases não mitocondriais ou flavinas

oxidases na metabolização de MTT foi proposto por Altman, 1976 e

por Burdon et al., 1993. Foi ainda demonstrado que NADH e NADPH

são melhores substratos que o succinto, e que o inibidor da cadeia

68

de transporte de elétrons, rotenone, não afeta a redução do MTT.

Assim, existem propostas atuais para que a metabolização de MTT

ocorra em outros compartimentos celulares que não sejam

exclusivamente mitocondriais. Liu et al., 1997 demostraram que,

além da mitocôndria, vesículas perinucleares podem reduzir MTT

(algumas destas vesículas foram identificadas como

lisossomos/endossomos).

Além de ser amplamente usado como avaliador do estado

funcional de leucócitos polimorfonucleares, o ensaio de

metabolização do MTT também pode ser usado na avaliação do

estado funcional de granulócitos, já que a capacidade de reduzir

estes sais reflete o grau de estimulação de vários agentes.

Baehner et al., 1976, afirmaram que a metabolização desses sais

está diretamente associada à atividade redutora de granulócitos.

Existem indícios de que em granulócitos o MTT é também

metabolizado em vacúolos fagocíticos (Natan et al., 1969) ou no

retículo liso (Humbert et al., 1973)

Neste estudo a metabolização de MTT foi utilizada para

avaliarmos o poder redutor celular (CRP) de granulócitos humanos,

segundo a técnica desenvolvida em nosso laboratório por Silva-

Teixeira e Nogueira-Machado, 1990.

Na análise do CRP de granulócitos humanos, nossos

resultados mostram que tanto o GIF produzido por células

mononucleares (sangue periférico e baço) de camundongos

infectados por Schistosoma mansoni (figura 12) quanto por

69

Syphacia obvelata (figura 13) foi capaz de inibir significativamente

(P<0.05) o CRP de granulócitos.

A necessidade da manutenção do equilíbrio entre os sistemas

oxidante e redutor foi primeiramente sugerido por Nogueira-

Machado et al., 1995, no estudo de três patologias. Seus resultados

mostraram que tanto na esquistossomose humana (infecção

helmíntica imunomodulada), como no pênfigo foliáceo sul

americano (patologia virótica autoimune com lesão tissular grave) e

na periodontia juvenil (doença provocada por bactérias) a

modificação no teor de ROS formados correspondeu à modificação

na capacidade redutora celular, mantendo em todos os casos

estudados um equilíbrio metabólico.

Chaves et al., 1996, avaliaram o balanço metabólico entre a

produção de ROS e a capacidade redutora celular de granulócitos

de doadores (não portadores de doenças) utilizando mediadores

farmacológicos (linfocinas, zimozan e éster de forbol (PDB)). Seus

resultados mostraram que granulócitos estimulados por zimozan,

PDB e IFN- apresentaram um aumento concomitante das

capacidades oxidante e redutora. Entretanto quando granulócitos

foram incubados em presença de aminofilina (bloqueador da

fosfodiesterase do AMP cíclico) e IL-10 (interleucina 10) foi

verificada uma diminuição da geração de espécies oxidantes.

Entretanto, esta foi acompanhada pela diminuição do poder

redutor.

70

Nossos resultados estão de acordo com os encontrados por

Nogueira-Machado et al., 1995. Observamos que o GIF foi capaz de

inibir a produção de ROS e CRP não alterando assim a relação

ROS/CRP encontrada pelos autores na esquistossomose (tabela 2).

Se compararmos ainda nossos resultados com os encontrados por

Chaves et al., 1996, podemos inferir que o GIF atuaria da mesma

maneira que a IL-10, inibindo simultaneamente a produção de ROS

e CRP, não alterando também o balanço ROS/CRP (tabela 2).

Todavia, nossos resultados diferem do estudo de Nogueira-

Machado et al., 1995 e Chaves et al., 1996 pela inclusão de outro

compartimento oxidante, as espécies reativas de nitrogênio (RNS).

Assim, na avaliação conjunta do balanço ROS/RNS/CRP, verificamos

um desequilíbrio nesta relação favorecendo a produção de RNS em

detrimento a ROS e CRP (tabela 2). Contudo, este desequilíbrio

provocado pelo GIF se torna extremamente favorável para a

manutenção da integridade celular e tecidual, pois sabe-se que o

aumento de RNS em relação a ROS e CRP faz com que estas

espécies passem a atuar como moléculas citoprotetoras. Assim,

podemos sugerir, através destes estudos, que o GIF, tanto

produzido por camundongos infectados por Schistosoma mansoni

quanto por Syphacia obvelata, seja um fator solúvel que atue

como um agente imunomodulador, além de poder, futuramente,

ser um agente antiinflamatório fisiológico.

71

Resumo

72

Doenças parasitárias são tidas como um dos principais

problemas na sociedade atual, principalmente nos países em

desenvolvimento como o Brasil.

A esquistossomose atinge cerca de 8 milhões de brasileiros. É

uma doença bastante estudada e caracterizada, mas um problema

longe do fim.

Parasitoses também atingem animais. No meio científico um

helminto bastante disseminado é a Syphacia obvelata. Sua infecção

é dita assintomática e, por isto, de difícil diagnóstico.

Este estudo trata da influencia de um fator solúvel, o GIF

(fator inibidor da citotoxicidade de granulócitos), no balanço

oxidante/redutor de granulócitos humanos.

O GIF foi descrito por Nogueira-Machado et al., 1983. Além de

inibir a citotoxicidade, os autores também relataram que o GIF era

capaz de inibir a formação do granuloma de fase aguda em

camundogos. Para esse estudo o GIF foi produzido por células


mansoni ou Syphacia obvelata.

Os resultados obtidos permitem influir que o GIF pode ser

produzido durante a infecção por esses dois parasitas. Esse fator

solúvel foi capaz de inibir a produção das espécies reativas de

oxigênio e aumentar a produção de espécies reativas de nitrogênio.

Na avaliação conjunta do balanço oxidante (ROS/RNS)/redutor,

observamos que houve uma diminuição de ROS e do poder redutor

73

e um aumento de RNS. Esse aumento de RNS seria um indicador de

ação citoprotetora.

Podemos então sugerir que o GIF posa atuar como agente

imunomodulador e, futuramente, ser um agente antinflamatório.

74

Bibliografia

75

ABBAS, A.K., LICHTMAN, A.H., POBER, J.S. Cellular and Molecular

Immunology. 3ªed. 1995. Philadelphia. W.B. Saunders.

ABDEL-SALAM, E., ABDEL-KHALIC, A., ABDEL-MEGUID, A., BARAKAT,

W., MAHMOUD, A.A.F. Association of HLA class I antigens (A1,

B5, B8, and CW2) with disease manifestations and infection in

human schistosomiasis mansoni in Egypt. Tiss Antigens,

27:142-147,1986.

ABDEL-SALAM, E., HIGASHI, G.I., KAMAL, K.A., ISHAAC, S. Cell

mediated immune assay in children with Schistomoma

heamatobium and the effects of niridazole therapy. Transact

Royal Soc Trop Med Hygien, 75:207-211,1981.

ABDEL-SALAM, E., ISHAAC, S., MAHMOUD, A.A.F. Histocompatibility-

linked susceptibility for hepatosplenomegaly in human

schistosomiasis. J Immunol, 123:1829-1831,1979.

ALTMAN, F.P. Tetrazolium salts and formazans. Prog Histochem

Cytochem, 9:1-56,1976.

ALTMAN, K.I., GERBER, G.B., OKADA, S. In Radiation Biochemistry.

Vol 1e 2. New York: Academic Press, 1970.

APPLETON, I., TOMLINSON, A., WILLOUGHBY, D.A. Induction of cyclo-

oxygenase and nitric oxide syntase in inflammation. Adv

Pharmacology. Vol 35. p.27-78. 1996.

76

ARAI K, NISHIDA J, HAYASHIDA K, HATAKE K, KITAMURA T, MIYAJIMA

A, ARAI N, YOKOTA T. Coordinate regulation of immune and

inflammatory responses by cytokines. Rinsho Byori,

38(4):347-53, 1990.

BABIOR, B.M. Activation of the respiratory burst oxidase. Environ.

Health Perspect., 102(suppl 10):53-56,1994.

BAEHNER, R.L., BOXER, L.A., DAVIS, J. The biochemical base of

nitrobule tetrazolium reduction in normal human and chronic

granulomatous disease polymorphonuclear leucocytes. Blood,

48(2):309-313,1976.

BALKWILL FR, BURKE FThe cytokine network. Immunol

Today,10(9):299-304, 1989.

BECKMAN, J.S., KOPPENOL, W.H. Nitric Oxide, superoxide and

peroxinitrite: the good, the bad and the ugly. Am. J.

Phisiol.271:C1424-C1437,1996.

BICALHO, H.M.S., GONTIJO, M.C., NOGUEIRA-MACHADO,J.A. A simple

techinique for simultaneous human leuckocytes separation. J.

Imunol. Eth. , 40:115-116,1981.

BINA, J.C., TAVARES-NETO, J., PRATA, A., AZEVEDO, E.S. Greater

resistense to development of severe schistosomiases in

Brasilian negroes. Human Biolog, 50:41-49,1978.

BODGAN, C., VODOVOTZ, Y., NATHAN, C. Macrophage deactivation

by interleukin-10. J. Exp. Med, 174:1549-1555, 1991.

BREDT, D.S., HWANG, P.M., GLATT, C.E., LOWENSTEIN, C., REED,

R.R., SNYDER, S.H. Cloned and expressed nitric oxide

77

synthase structurally resembles cytochrome P-450 redutase.

Nature (London),351:714-718,1991.

BRESSON-HADNI, S., PETITJEAN, O., MONNOT-JACQUARD, B., HEYD,

B., KANTELIP, B., DESCHASEAUX, M., RACADOT, E., VUITTON,

D.A. Cellular localisations of interelukin-1 beta, interleukin-6

and tumor necrosis factor-alpha mRNA in a parasitic

granulomatous disease of the live, alveolar echinococcosis.

Eur Cytokine Netw, 5(5):461-468,1994.

BRUNET, L.R., DUNNE, D.W., PEARCE, E.J. Cytokyne interaction and

immune responsess during Schistosoma mansoni infection.

Parasitol Today, 14:422-427, 1998.

BRYANT, J.L., METHA, O., VON DER PORTEN, A., METHA, J.L. Co-

purification of 130 kD nitric oxidase syntase and a 22kD link

protein from human neutrophils.Biochem. Biophys.

Res.Commun., 189:558,1992.

BURDON, R.H., GILL,V., RICE-EVANS, C. Reduction of tetrazolium salt

and superoxide generation in human tumor cells (HeLa). Free

Radic Res Commun, 18:369-380,1993.

CADENAS, E. Biochemistry of oxigen toxicity. Annu. Rev. Biochem.,

51:79-110, 1989.

CADENAS, E. Mecanisms of oxygen activation and reactive oxygen

species detoxification. In: SAMI, A. Oxidative stress and

antioxidant defenses in biology. New York: Capman & Hall,

1995. 457p.

78

CHANOCK, S.J., BENNA, J.E., SMITH, R.M., BABIOR, B.M. The

respiratory burst oxidase. J. Biol. Chem., 269:24519-

24522,1994.

CHAVES, M.M., ROCHA-VIEIRA, E., LIMA-e-SILVA, R., REIS, A.P.,

NOGUEIRA-MACHADO, J.A. Host defenses in aged: evaluation

of the balance between oxidizing species generation and

reducing power in phagocyting human granulocytes. Mech

Ageing Develop 104:103-109,1998.

CHAVES, M.M., SILVESTRINI, A.A., SILVA-TEIXEIRA, D.N., NOGUEIRA-

MACHADO, J.A. Effect in vitro of gamma interferon and

interleukin-10 on generation of oxidinzing species by human

granulocytes. Inflamm Res 45:313-315,1996.

CHEESEMAN, K.H., SLATER, T.F. Na introduction of free radical

biochemistry. Bri. Med. Bul., 49(3):481-493,1993.

CHEEVER AW, JANKOVIC D, YAP GS, KULLBERG MC, SHER A, WYNN

TA. Role of cytokines in the formation and downregulation of

hepatic circumoval granulomas and hepatic fibrosis in

Schistosoma mansoni-infected mice. Mem Inst Oswaldo Cruz.,

93 Suppl 1:25-32, 1998.

CHEN, L.Y., METHA, J.L. Variable effects of L-arginine analogs on L-

arginine-nitric oxide pathway in human neutrophis and

platelets may relate to different nitric oxide isoforms. J.

Pharmacol. Exper. Therap., 276:253-257,1996

CHENSUE, S.W., OTTERNESS, I.G., HIGASHI, G.I., FORSCH, C.S.,

KUNKEL., S.L. Monokine producition by hypersensivity

79

(Schistosoma mansoni egg) and forein body (Sephadex bead)-

type granuloma macrophages. Evidence for sequential

production of IL-1 and tumor necrosis factor. J Immunol,

42(4):1281-1286,1989.

CLANCY, R.M., LEVRTOVSKY, D., LESZCYNSKA-PIZIAK, J., YEGRUDIN,

J., ABRAMSON, S.M. Nitric oxide reacts with intracellular

glutathione and actives the hexose monphosphate shunt in

human neutrophils: evidence for S-nitrosoglutathione as

bioactive intermediary. Proc Natl Acad Sci USA.91(9):3680-

3684,1994.

COELHO, L.F. Comparative study of hydropic degeneration and

glycogen accumulation in human gingival epithelium. Arq

Cent Estud Fac Odontol UFMG (Belo Horiz), 7(1):71-

7,1970

CROW, J.P., BECKMAN, J.S. reactions between nitric oxide,

superoxide and peroxynitrite: footprints of peroxynitrite. In

Ignarro L and Murad F. Nitric oxide: biochemistry, molecular

biology and terapeutic implications. Advances in

pharmacology,34:17-40,1995.

CUNHA, F.Q., MONCADA, S., LIEW, F.Y. Interleukin 10 (IL-10) inhibits

the induction of nitric oxide syntase by interferon-in

murine macrophages. Biochem Biophys Res Commun,

182:1155-1159,1992.

80

DABES TM, GARCIA AA, COLLEY DG, RAMALHO-PINTO FJ Lymphokine

production by blood or spleen mononuclear cells from

patients with schistosomiasis mansoni.

Am J Trop Med Hyg, 40(3):273-81, 1989.

DARLEY-USMAR, V., WISEMAN, H., HALLIWELL, B., Nitic oxide and

oxygen radicals; a question of balance. FEBS Lett., 369:131-

135,1995.

EGAN, P.J., KIMPTON, W., SEOW, H.F., BOWLES, V.M., BRANDON,

M.R., NASH, A.D. Inflammation-induced changes in phenotype

and cytokine profile of cells migrating through skin and

aferent lymph. Immunol, 89(4):539-546, 1996.

FACCIOLI, L.H., MEDEIROS, A.I., MALHEIRO, A., PIETRO, R.C.,

JANUARIO, A., VARGAFTIG, B.B. Interleukin 5 modulates

ainterleukin 8 secrection in eosinophilic inflammation.

Mediators Inflamm, 7(1): 41-47,1998.

FUKUTO, J.M. Chemistry of nitric oxide: biological relevant aspects.

In: IGNARRO L & MURAD F. Nitric oxide: biochemistry,

molecular biology and therapeutic implications. Advances in

Pharmacology, 34:1-13,1995.

GALLIN, J.I. Abnormal phagocyte chemotaxis: phatophisiology,

clinical manifestaations and management of patients. Rev

Infect Dis, 3:1196-1220,1981.

GAZZINELLI G, KATZ N, ROCHA RS, COLLEY DG. Immune responses

during human schistosomiasis mansoni. X. Production and

standardization of an antigen-induced mitogenic activity by

81

peripheral blood mononuclear cells from treated, but not

active cases of schistosomiasis.

J Immunol., 130(6):2891-5, 1983.

GAZZINELLI, R.T., OSWALD, I.P., JAMES, S.L., SHER, A. IL-10 inhibits

parasite killing and nitric oxide production by IFN--activated

macrophages. J. Immunol, 148:1792-1796, 1992.

GOMEZ, R.S., COSTA, J.A., LORENTZ, T.M., ALMEIDA-GARROCHO, A.,

NOGUEIRA-MACHADO, J.A. Chemiluminescence generation

and MTT dye reduction by polymorphonuclear leuckocytes

from periodontal disease patiens. J. Periodont. Res., 29:109-

112,1994.

GRENN, L.C., WAGNER, D.A., GLOGOSKI, J., SKIPPER, P.L. WISHNOK,

J.S., TANNENBAUM, S.R. Analysis of nitrite, nitrate and

[15N]nitrate biological fluids. Annal Biochem, 126:131-

138,1982.

GRIESS, J.P. Phil. Trans. R. Soc. London, 154:667-731,1864.

GRIESS, P. Ber. Dtsch. Ges.,12:426-428,1879.

GRYCH, J.M., PEARCE, E.J, CHEEVER, A., CAULADA, Z.A., CASPAR, P.,

HEINY, S., LEWIS, F.A., SHER, A. Egg deposition is the major

stimulus for the production of TH2 cytokines and in murine

schistosomiasis mansoni. J Immunol, 146:1322-1328,1991.

HAGAN P., EL MELEIGY M., TRAORE M. Schistosomiasis Research:

the ending and the beginning. Parasitol Today 14:392-

394,1998.

82

HAGAN P., NDHLOVU P.D., DUNNE D.W. Schistosome immunology:

more questions and answers. Parasitol Today 14:407-

412,1998.(2).

HARMAN, D. The aging process. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7124-

7128,1981.

HUMBERT, J.R., GROSS, G.P., VATTER, A., HATHAWAY, W.E. Nitrobule

tetrazolium reduction by neotrophils of newborn infants.

Pediatrics, 45:125, 1973.

IGNARRO, L.J., FUKUTO, J.M., GRISCAVAGE, J.M., ROGER, N.E.,

BURNS, R.E. Oxidation of nitric oxide in aqueous solution to

nitrite but not nitrate: comparison with enzimatically formed

nitric oxide from L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

90:8103-8107,1993.

KAZURA JW, MAHMOUD AA, KARB KS, WARREN KS. The lymphokine

eosinophil stimulation promoter and human schistosomiasis

mansoni. J Infect Dis, 132(6):702-6, 1975.

KNOWLES, R.G., MONCADA, S. Nitric oxide syntases in mammals.

Biochem. J., 298:249-258, 1994.

KOSHIBA, L., PEREIRA, D.M.F. In: História do Brasil. 5ªed. 1991.

KRÖNCKE, K.D., FEHSEL, K., KOLB-BACHOFEN, V. Nitric oxide:

cytotoxicity versus citoprotection – how, why, when and

where? Nitric Oxide, 1(20:107-102,1997.

LAMAS, S., MADERSEN, P.A., LEE, W.Y., CLARCK, S.L. Endothelial

nitric oxide syntase: molecular cloning and characterization of

83

a distinct constitutive enzyme isoform. Proc Natl Acad Sci

USA, 89:6348-6352,1992.

LIMA MS, GAZZINELLI G, ROCHA RS, KATZ N, COLLEY DG.

Demonstration of leukocyte inhibitory factor in human

Schistosomiasis mansoni and its evaluation from patients in

an endemic setting. Clin Immunol Immunopathol, 37(3):351-

9, 1985.

LIMA-PEREIRA, F.E., BORTOLINI, E.R., CARNEIRO, J.L.A., MELLO DA

SILVA, C.R., NEVES, R.C. A, B, O blood groups and

hepatosplenic form of schistosomiases mansoni (Symmers’

fibrosis). Trans Royal Soc Trop Med Hyg, 73:238,1979.

LIU, Y., PETERSON, D.A., KIMURA, H., SCHUMBERT, D. Mechanism of

cellular 3-(4,5)dimethylthiazol-2-yl)-2,5 dipheniyltetrazolium

bromide (MTT) reduction. J Neurochem, 69:581-593,1997.

MALAQUIAS, L.C.C., GOLDERG, S.S., SILVA-PEREIRA, A.A.,

NOGUEIRA-MACHADO, J.A. Role of Trypanosoma cruzi

lipopolysaccharide on human granulocyte biological activities.

Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 86(4):469-470,1991.

MARTINEZ-CAYUELA, M. Oxigen free radicals and human disease.

Biochimie, 77:147-161,1995.

MARZINZIG, M., NUSLLER, A.K., STADLER, J., MARZINZIG, E.,

BARTHLEN, W., NUSSLER, N.C., BERGER, H.G., MORRIS, S.M.

Jr., BRÜCKNER, U.B. Improved methods to miasure end

products of nitric oxide in biological fluids: nitrite, nitrate and

S-nitrosothiols. Nitric Oxide, 1(2):177-189,1997.

84

McCORMICK M.L., METWALI A., RAILSBACK M.A., WEINTOCK J.V.,

BRITIGAN B.E. Eosinophils from schistome-induced hepatic

granulomas produce superoxide and hydroxyl radical. The J of

Immunol 157:5009-5015, 1996.

MEAD, J.F. Free radical mechanism of lipid damage and

consequences for cellular membranes. In: PRYOR, W.A. Free

radicals in biology. New York : Academic Press, 1976 vol 1,

p.51-56.

MOORE, K.W., O´GARRA, A., DE WALL MALEYFYT, R., VIEIRA, P,

MOSMANN, T.R. Interleukin-10. Annu Rev Immunol, 11:165-

190, 1993.

MOSMAN, T. Rapid calorimetric assay for cellual growth and

survival. Applications to proliferation and cytotoxicity assay. J

Immunol Meth, 65:55-63,1983.

NAGEL, J.E. HAN, K., COON, P.J., ADLER, W.H., BENDER, B.S. Age

differences in phagocytosis by polymorphonuclear leukocytes

measured by flow cytometry. J Leuk Biol, 39:399-407,1986.

NAKAGAWA, M., SAITO, M., SUZUKI, E., NAKAYAMA, K., MATSUBARA,

J., MUTO, T. Ten years-long survey on pathogen status of

mouse and rat breeding colonies. Jikken Dobutsu 33(1):115-

120,1984.

NAKANE, M., SCHIMIDT, H.H., POLLOCK, J.S., FÖRSTERMANN, U.,

MURAD, F. Cloned human brain nitric oxide synthase is highly

expressed in esqueletal muscle. FEBS Lett, 316:175-

180,1993.

85

NASH TE, HOFSTETTER M, CHEEVER AW, OTTESEN EA. Treatment of

Schistosoma mekongi with praziquantel: a double-blind study.

Am J Trop Med Hyg, 31(5):977-82, 1982.

NATAN, D.G., BAEHNER, E.L., WEAVER, D.K. Failure of nitro blue

tetrazolium reduction in phagocytic vacuolis in chronic

granulomatuos disease. J Clin Invest, 48,1969.

NATHAN, C., XIE, Q. Nitric oxide synthases: roles, tolls and controls.

Cell, 78:915-918,1994.

NEVES, D.P., MELO, A.L., GENARO, O., LINARDI, P.M. Parasitologia

Humana. 9ª ed. Belo horizonte. Atheneu. cap. 30, p.311.

NICOLA NA. Hemopoietic cell growth factors and their receptors.

Annu Rev Biochem, 58:45-77, 1989.

NIWA, Y., IIZAWA, Q., ISHIMOTO, K., AKAMATZU, H., KANOH, T. Age-

dependent basal level induction capacity of copper-zinc and

manganese superoxide dismutase and other scavenging

enzyme activities in leucocytes from yong and eldery adults.

Am. J. Pathol.,143:312-320,1993.

NOGUEIRA-MACHADO, J.A, GONTIJO, C.M., GAZZINELLI, G., KATZ,N.

Schistosoma mansoni: Inhibition of in vitro granulocyte

cytotoxicity against schistosomula by autologous

mononuclear cells from patients. Experim Parasitol, 56:180-

185, 1983.

NOGUEIRA-MACHADO, J.A., ANTUNES, L.J., ROCHA, O.A., DE SOUZA,

A.F., COELHO, L.F.S., OLIVEIRA, S.B., MOREIRA, M.C. Effect of

86

granulocyte inhibitory factor on granuloma formation in mice

infected with Schistosoma mansoni. Ann Trop Med Parasitol.,

82(4):377-382,1988.

NOGUEIRA-MACHADO, J.A., OLIVEIRA-LIMA, P., SILVA-TEIXEIRA, D.N.,

REIS, A.P. Avaliação simultânea da produção de radicais livres

e da capacidade redutora celular: uma necessidade? Revista

de Oxidologia. Março/Abril: 21-24, 1995.

NUNOSHIBA, T., DEROJAS-WALKER, T., WHISNOK, J., TANNENBAUM,

S.R., DEMPLE, B. Activation by nitric oxide of na oxidative-

stress response that defends Escherichia coli against

activated macrophages. Proc Natl Acad Sci USA, 90(21):9993-

9997,1993.

NUNOSHIBA, T., DEROJAS-WALKER, T., WHISNOK, J., TANNENBAUM,

S.R., DEMPLE, B. Activation by nitric oxide af an oxidative-

stress response that defends Escherichia coli against

macrophages. Proc Natl Acad Sci USA, 90(21):9993-9997,

1993.

OHTA, N., ASAHI, H., HOSAKA, Y., MINAI, M., ISHII, A. Regulation of

the human T-cell response to Schistosoma japonicum egg

antigen by concomitant cellular and humoral mechanisms in

vitro. Parasitological Res, 77:54-58,1991.

OLIVEIRA-LIMA, A., DIAS DA SILVA, W. Imunologia, imunopatologia,

alergia - métodos. 1ªed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,

p236,1970.

87

OTTENSEN, E.A. Modulation of the host response in human

schistosomiasis. I. Adherent suppressor cells that inhibit

limphocytes proliferation responses to parasit antigens. J

Immunol, 123:1639-16344,1979.

PEARCE, E.J., CASPAR, P., GRZYCH, J.M., LEWIS, F.A., SHER, A.

Downregulation of Th1 cytokine production accompanies

indution of Th2 responses by parasitic helmintic, Schistosoma

mansoni. J Exp Med, 173:159-165,1991.

PESSÔA, S.B., VIANNA-MARTINS, A. Pessôa, Parasitologia Humana.

10ª ed. Guanabara Koogan. Cap.27-31, 1977

PROCTOR, P.H., REYNOLDS, E.S. Free radicals and disease in man.

Physiol. Chem. Phys., 16:175-195, 1984.

PRYOR, W.A. Free radicals in biology. New York : Academic Press,

1976 vol 1, p.51-56.

ROCLING,R.E, BROWN, A.A., WARREN, K.S., PELLEY, R.P., HOUBA, V.,

SIONGOK, T.K.A., OUMA, J., STURROCK, R.F., BUTTERWORTH,

A.E. Factor that modify the cellular immune response in

patients infected by Schistosoma mansoni. J Immunol,

125:1916-1980,1980.

ROSEN. G.M., POU, S., RAMOS, C.L., COHEN, M.S., BRITIGAN, B.E.

Free radicals and phagocytic cells. Faseb J., 9:200-209,1995.

ROUVEIX B, DEROUIN F, LEVACHER M. Evaluation of cellular

immune response during chronic schistosomiasis in humans

by the leukocyte aggregation test and the leukocyte

88

migration inhibition test.

J Clin Microbiol, 21(4):649-51, 1985.

SANO, H., HIRAI, M., SAITO, H., NAKASHIMA, I., ISOBE, K. Nitric oxide

releasing reagent, S-nitroso-N-acetylpenicillamine, enhances

the expression of manganese superoxide dismutase mRNA in

ra vascular smooth muscle cells. J. Cell Biochem., 62(1);50-

55,1996.

SATO, R., OMURA, T. In: SATO, R., OMURA, T. Cytochrome P-450.

New York Academic Press, 1978.

SATO, Y., OOIH.K., OKU, Y., KAMIYA, M. Antibody production in

Syphacia obvelata infected mice. J. Immunol. 81(4):559-

562,1995.

SESSA, W.C., HARRISON, J.K., BARBER, C.M., ZENG, D., DURIEUX,

M.E., DANGELO, D.D., LYNCH, K.R., PEACH, M.T. Molecular

cloning and expression of a cDNA encoding endothelial cell

nitric oxide synthase. J. Biol. Chem.267:15274-15276,1992.

SHER, A., FIORENTINO, D., CASPAR, P., PEARCE, E., MOSMAN, T.

Production of IL-10 by CD4+ T lymphocytes correlates with

down-regulation of Th1 cytokine in helmintic infection. J

Immunol, 147:2713-2716,1991.

SILVA-TEIXEIRA, D.N. Reatividade de granulócitos na

esquistossomose mansoni humana. Belo Horizonte:

Universidade Federal de Minas Gerais, 1990, p.120 (Tese,

mestrado em Bioquímica e Imunologia).

89

SILVA-TEIXEIRA, D.N., NOGEUIRA-MACHADO, J.A. Fagocitose de

partículas opsonizadas por granulócitos: estudo comparativo

das técnicas de quimioluminescência e metabolização de sal

de tetrazólio (MTT). V Reunião Anual da FeSBE. Caxambú,

1990.

SLATER, T.F., SAWYER, B., STÄULI, U. Studies on succinate-

tetrazolium reductase system. III. Points of coupling of four

different tetrazolium salts. Biochem Biophys Acta, 77: 383-

393, 1963.

SMYTH, J.D. Physiology of the host-parasite relationship: I- tissue

reactions.. The physiology of cestodes. p.194-196, 1969.

TODD, C.W., GOODGAME, R. W., COLLEY, D.G. Imune responses

during human schistosomiasis mansoni. V. Suppression of

schistosome antigen-specific limphocite-blastogenesis by

adherent/phagocytic cells. J Immunol, 122(4):1440-

1448,1979.

VAN DER VLIET, A., SMITH, D., O’NEIL, A., KAUR, H., DARLEY-USMAR,

V., CROSS, C.E., HALLIWELL, B. Interactions of peroxynitrite

with human plasma and its constituents: oxidative damage

and antioxidant depletion. Biochem. J., 303:295-301,1994.

WARREN KS, BERRY EG Induction of hepatosplenic disease by single

pairs of the Philippine, Formosan, Japanese, and Chinese

strains of Schistosoma japonicum. J Infect Dis,126(5):482-

91,1972.

90

WARREN KS, GROVE DI, PELLEY RPImmunologic diagnosis of

schistosomiasis. II. Further studies on the sensitivity and

specificity of delayed intradermal reactions. Am J Trop Med

Hyg, 22(2):199-204,1973.

WARREN KS, SIONGOK TK, HOUSER HB, OUMA JH, PETERS PA.

Quantification of infection with Schistosoma haematobium in

relation to epidemiology and selective population

chemotherapy. I. Minimal number of daily egg counts in urine

necessary to establish intensity of infection. J Infect Dis,

138(6):849-55, 1978.

XIE, Q.W., CHO, H.J., CALAYCAY, J., MMUNFORD, R.A., SWIDEREK,

K.M., LEE, T.D., DING, A., TROSO, T., NATHAN, C. Cloning and

characterization of induzible nitric oxide synthase from mouse

macrophages. Science, 256:225-228,1992.

XU, Y., MACEDONIA, J., SHER, A., PEARCE, E., CHEEVER, A.W. A

dinamic analysis of splenic Th1 and Th2 lymphocyte functions

in mice infected with Schistosoma japonicum. Infect Immunit,

59:2934-2941,1991.

91

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MATERIAL E MÉTODOSlabs.icb.ufmg.br/lbcd/grupo7/monografia real.doc · Web viewGranulócitos humanos (1x106 células em solução salina de Hank’s pH 7.4) incubados ou não na presença