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Metodologias para traçabilidade da dieta de ruminantes e sua importância para a cadeia produtiva da carne no Brasil: revisão.

Methodologies for traceability of ruminants diets and their importance to meat production in Brazil: a review.

Lisandre de Oliveira1*, Thais Devincenzi1, Carlos Nabinger1, Paulo C.F. Carvalho1, Gilberto V. Kozloski2, Sophie Prache3

1Programa de Pós-graduação em Zootecnia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Avenida Bento Gonçalves, 7712, 91501-970, Porto Alegre, RS, Brasil.

2Programa de Pós-graduação em Zootecnia (PPGZ), Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil.3Institut National de la Recherche Agronomique – INRA. Clermont-Ferrand-Theix. França.

*Correspondence: [email protected]. Telefone e fax +555532208355

Resumo: A preocupação dos consumidores com a origem dos alimentos é crescente. No setor pecuário, o tema traçabilidade adquire importância cada vez maior, especialmente no Brasil, que é hoje o maior exportador de carne bovina do mundo. Este artigo revisa o conhecimento atual no que diz respeito à traçabi-lidade da dieta dos animais a partir de seus produtos, apresentan-do os potenciais traçadores envolvidos na temática. Marcadores de plantas (e.g. carotenóides, terpenos e compostos fenólicos) e ácidos graxos, são potenciais traçadores na carne. Já a origem geográfica tem sido identificada com sucesso através de méto-dos espectrais ou com base na análise de isótopos estáveis na carne. Em síntese, cada técnica em particular possui indicações próprias de uso de modo que, provavelmente, o futuro da traça-bilidade incluirá a utilização concomitante de diversas técnicas. O tema, portanto, constitui-se em objeto de alto impacto tecno-lógico que necessita ser incluído na pauta de pesquisa no Brasil.

Summary: The consumer concerns about the origin of their food are rising. In this regard, the traceability acquires increas-ing relevance in the livestock sector, especially in Brazil, which is the biggest beef exporter in the world. This paper reviews the current knowledge regarding the traceability of the animals feed-ings using their products, showing the potential markers con-cerned in the issue. Plant biomarkers (e.g. carotenoids, terpenes and phenolic compounds) and fatty acids are potential tracers in the meat. Geographical origin has been successfully identified by spectroscopy or stable isotopes. In conclusion, each technique has particular indications for own use, so that, probably the fu-ture of traceability includes concomitant use of several tech-niques. Thus, the issue represents a target of high technological impact that needs to be included in the research agenda in Brazil.

Introdução

A bovinocultura de corte é um dos setores primários mais importantes para a economia brasileira, uma vez que o Brasil detém um dos maiores efetivos bovinos e é um dos maiores exportadores de carne do mundo. Con-

tudo, o mercado consumidor de carne, particularmente dos países desenvolvidos, se modificou na última déca-da no sentido de aumentar suas exigências em relação à segurança alimentar, sob seu aspecto sanitário e à qua-lidade do produto, sob seus aspectos organolépticos e nutracêuticos. Por esta razão, as indústrias alimentícias e os sistemas de produção, originalmente focados no quantitativo, têm se esforçado em atender essas novas demandas de qualidade e segurança. Nesse contexto, a identificação de origem através da traçabilidade dos produtos pode ser útil. O conceito de traçabilidade diz respeito às origens dos produtos, refere-se, portanto, à identidade animal, raça e origem geográfica. Também pode se referir a traçabilidade dos processos de produ-ção, incluindo o uso de dietas (Prache, 2009).

Além de garantir segurança na inocuidade dos ali-mentos, a traçabilidade pode ser utilizada como for-ma de resgate e valorização do patrimônio genético ou cultural, pois o território, o “saber-fazer” e a tradição conferem ao produto aspectos e percepções hedônicas peculiares que lhe conferem valor comercial aditivo. Exemplo são os Cordeiros franceses Pré-Salé (pré-sal-gado) do Mont-Saint Michel. A carne destes animais é diferenciada, pois se alimentam de espécies herbá-ceas adaptadas à salinidade, uma vez que os solos são constantemente cobertos pelo mar. No sul do Brasil pode-se citar o exemplo da Associação dos Produtores da carne do Pampa Gaúcho da Campanha Meridional (APROPAMPA). Ela detém a chancela da Indicação de Procedência Carne do Pampa Gaúcho da Campanha Meridional, a qual é produzida maioritariamente em pastagens naturais que possuem em sua composição ampla variedade de espécies de elevado valor forragei-ro. Em todos estes casos, a origem e o modo de pro-dução estão especificados em regulamentos técnicos e a utilização de métodos de traçabilidade pode ser útil

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como ferramenta de controle e fiscalização dos mes-mos, tanto por órgãos associados à indústria, ao poder público ou mesmo ao consumidor.

Outro potencial uso de métodos de traçabilidade é a autentificação de sistemas de produção, particu-larmente em relação ao seu impacto ambiental ou ao bem estar animal. Sistemas de produção de carne a pasto, com menor utilização de insumos, bem como sistemas de produção que utilizam a biodiversidade natural como base alimentar dos ruminantes são bem-vistos pelos consumidores e podem ser autenticados por meio de métodos analíticos, proporcionando van-tagens competitivas e de valoração na comercializa-ção do produto (Prache et al., 2009; Monahan et al., 2010). Por exemplo, as pastagens naturais do Bioma Pampa são ecossistemas pastoris onde a atividade pecuária é a melhor forma de utilização sustentável desse recurso (Nabinger et al., 2009). A consequên-cia da diversidade vegetal na dieta dos animais nesse sistema resulta em carne com sabor e aroma caracte-rísticos, e com perfil de ácidos graxos diferenciado na gordura, mais adequado para a saúde humana (Devin-cenzi et al. 2012; Freitas, 2010).

Diversos tipos de marcadores de traçabilidade têm sido propostos e estudados: (i) marcadores diretos, provenientes diretamente da dieta, incluindo isótopos estáveis; (ii) marcadores indiretos, que sofrem altera-ções pelo metabolismo animal; e (iii) caracterização espectral óptica dos tecidos e produtos de origem ani-mal (adaptado de Prache et al., 2005b). O objetivo desta revisão é apresentar conceitos fundamentais, indicando o potencial e as limitações do uso desses marcadores como ferramenta de controle de origem da carne no Brasil.

Marcadores diretos

Os marcadores diretos são substâncias presentes em componentes da dieta e que tem como principal característica, não serem sintetizados pelo metabo-lismo do animal. Parte destes compostos após inge-ridos podem ser metabolizados noutras substâncias, no entanto, uma porção poderá ser depositada dire-tamente nos tecidos e produtos. Alguns exemplos são os pigmentos carotenoides, os polifenois, os compostos voláteis (Prache, 2009) além de isótopos estáveis.

Pigmentos carotenoides

Pigmentos carotenoides, tais como xantofila, caro-teno e licopeno, estão envolvidos nos processos fo-tossintéticos das plantas e das algas superiores. Eles são responsáveis pelas colorações amarela, laranja e vermelha, respectivamente (Nozière et al., 2006a). Além de serem amplamente distribuídos nas plantas, não podem ser sintetizados “de novo” pelos animais, mas podem ser convertidos em outros carotenoides

(Cardinault et al., 2006a). De Oliveira et al., (2012) demonstraram que os pigmentos carotenoides podem ser identificados no plasma de ovinos a partir de 24 primeiras horas após a ingestão de forragens verdes, cuja concentração se eleva até o sexto dia onde então, atinge o platô.

Pigmentos carotenoides contribuem para a cor e as características nutricionais da carne de herbívoros (Prache et al., 1990; Priolo et al., 2002a; Dunne et al., 2006; RöhrleE et al., 2011). São potenciais mar-cadores para autenticação de produtos baseados em forragens verdes, tanto para ovinos (Prache e Theriez, 1999; Priolo et al., 2002b; Dian et al., 2007) quan-to para bovinos (Serrano et al., 2006; Röhrle et al., 2011).

Animais alimentados com dietas exclusivas de con-centrado podem ser discriminados pela ausência (ou baixas concentrações) dos pigmentos carotenoides no plasma e tecidos. Cereais, tubérculos e seus deriva-dos apresentam nenhuma ou baixa concentração de luteína (Wolter, 1988), único pigmento depositado por ovinos (Yang et al., 1992; Prache et al. 2003b; a). A zeaxantina, por sua vez, carotenóide abundante no milho, não é armazenada na carne dos ovinos (Prache et al., 2003a) ou bovinos (Röhrle et al. 2011).

Vale a pena ressaltar que todos os processos de con-servação de forragem alteram a concentração de caro-tenoides (i.e. variando entre 60% e 90% conforme o método Wolter, 1988). A utilização de pigmentos carotenoides para a traçabilidade no Brasil esbarra, portanto, em limitações da técnica, pois os sistemas mistos (recria a pasto e terminação com suplementa-ção concentrada ou confinamento) são os mais comu-mente praticados e ainda não são capazes de serem traçados (Prache et al., 2009; Röhrle et al., 2011).

Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são um grupo diversificado de fitoquímicos derivados da fenilalanina e tirosina (Naczk e Shahidi, 2004), definidos como substâncias possuidoras de anel aromático com um ou mais subs-tituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcio-nais (Lee et al., 2005). Abarcam fenóis simples, áci-do hidroxibenzóico e derivados do ácido cinâmico, flavonoides, taninos e cumarinas. São originados do metabolismo secundário das plantas, sendo essenciais para o seu crescimento e reprodução (Naczk e Shahidi, 2004).

Forragens são ricas em compostos fenólicos (flavo-nóides e outros) com potencial para autenticação de dietas (Prache et al., 2005a). Eles podem ser separados em quatro grupos: ácidos fenólicos, ligninas, estilbe-nos e flavonoides. Sua ocorrência em tecidos animais provém invariavelmente do alimento ingerido (Ho-cquette et al., 2005). No entanto, após a ingestão da forragem, ocorrem diversas transformações dos poli-fenois, tanto no rúmen como no fígado. Dependendo da via de metabolização, as moléculas encontradas no


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leite ou carne podem ser similares ou muito diferentes daquelas ingeridas (Prache, 2007).

Besle et al. (2005) identificaram 54 diferentes com-postos fenólicos no leite utilizando cromatografia lí-quida de alto desempenho e isto permitiu a diferencia-ção entre leites provenientes de pastagem natural ou de dieta rica em concentrado.

Pratesi et al. (2008) estudaram os compostos fenó-licos visando a traçabilidade de um queijo local na Itália. Relataram que diversas forrageiras possuem compostos passíveis de serem usados como marcador. No entanto, as espécies mais representativas na dieta (Bromussterilis, Loliumperenne e L. multiflorum) con-têm poucos compostos traçáveis.

Compostos fenólicos possuem potencial utilização para traçar a carne brasileira produzida sob pastagens naturais mistas o que permitirá a valorização da produ-ção a “baixo impacto e insumos”, no entanto, questões como o metabolismo dos compostos (Prache, 2009) e as técnicas mais indicadas para a identificação do mar-cador não estão completamente elucidados.

Compostos voláteis

Compostos voláteis são moléculas orgânicas lipolí-ticas praticamente insolúveis em água (Vasta e Priolo, 2006) e de origem quase exclusivamente vegetal (Pra-che et al., 2007). Em pastagens naturais existe gran-de diversidade de terpenos (voláteis) que podem ser usados como traçadores da região de origem (Cornu et al., 2001). Estes compostos têm reconhecias pro-priedades aromáticas e são componentes majoritários dos óleos essenciais (Martin et al., 2005).

Os compostos voláteis da carne são responsáveis pelo sabor. A concentração desses compostos, bem como seu o perfil, varia de acordo com a diversidade das famílias botânicas presentes na dieta (Mariaca et al., 1997): Apiaceae, Asteraceae e Lamiaceae con-têm grandes quantidades e uma gama larga de ter-penos, inversamente a Poaceae (Cornu et al., 2001). Por exemplo, Vasta et al. (2011) identificaram o ter-penoide germacrene D no músculo de bovinos ali-mentados a pasto, não sendo detectado naqueles que recebiam concentrado e palha.

Assim, a utilização de compostos voláteis mostra-se promissora (carne brasileira produzida à base de pastagens diversificadas). No entanto, variações sazonais (Calderón et al. 2006), diurnas (Vasta et al. 2012) ou o efeito do metabolismo sobre estes compostos ainda não estão esclarecidos e podem ser fator de confundimento. Além disso, terpenos podem ser extraídos e concentrados em óleos essen-ciais, podendo ser adicionados à ração concentrada (e.g., aditivos fitogênicos) e ocasionar dificuldade na diferenciação das dietas. Calderón et al. (2006) sugerem investigações sobre possível complementa-ridade entre as análises de pigmentos carotenoides e de terpenos para melhor diferenciar os sistemas de produção.

Composição Isotópica

A análise de isótopos por espectrometria de massa é outra metodologia que tem sido utilizada para au-tenticar regimes alimentares ou origem geográfica da carne. O conteúdo de elementos-traço e isótopos em animais é afetado pela dieta, qualidade da água, pre-sença de contaminantes ambientais, composição do solo, entre outros (Ballin, 2010).

A determinação da origem geográfica do leite e queijos tem sido estimada com sucesso a partir da medida das relações de isótopos estáveis de oxigênio (δ18O, ou seja, 18O/16O) na água do leite, assim como do nitrogênio (δ15N, ou seja, 15N/14N) e carbono (δ13C, ou seja, 13C/12C) (RENOU et al., 2004). A proveni-ência da carne de cordeiros de diferentes regiões da Europa também foram identificadas adequadamente (Piasentier et al., 2003).

Os tecidos provenientes de animais alimentados com forragens de ciclo metabólico C

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apresentem maiores concentrações de 13C do que ani-mais alimentados com forragens de ciclo metabólico C

3 (e.g. pastos de azevém). Essa diferenciação nas

concentrações de 13C é decorrente da rota metabólica utilizada pela planta e sendo assim, permite identifi-car animais oriundos de sistemas de terminação que utilizam grão e silagem de milho em confinamentos ou de pastagem (Deniro e Epstein, 1978).

Renou et al. (2004) demonstraram que os valores da δ18O no leite e carne também são afetados pela latitu-de e altitude do local de produção, permitindo discri-minar leite e carne produzidos em áreas montanhosas daquelas produzidas em regiões baixas, ou mesmo, o tipo de dieta ingerida pelos animais. Animais alimen-tados com dietas concentradas normalmente recebem água previamente armazenada e tratada enquanto que animais a pasto ingerem água de reservas naturais, com maior concentração de 18O devido à maior eva-poração do 16O.

Diferenças na proporção 15N/14N também estão re-lacionadas com a forragem consumida e, dessa for-ma, podem fornecer informações sobre o nível de intensificação dos sistemas de produção (Schmidt et al., 2005). Leguminosas são menos ricas em 15N, pois utilizam o nitrogênio do ar como fonte nitrogenada. Já a aplicação de fertilização com N, aumenta os teo-res de 15N nas plantas (Kriszan et al., 2009).

A variação do rácio dos isótopos de oxigênio (18O/16O) e, a relação entre o deutério e o hidrogênio da água nos tecidos animais também pode ser utili-zada como ferramenta para identificar a origem ge-ográfica do produto cárneo. Contudo, seu uso pode ser limitado devido à variação sazonal da composição isotópica das fontes de água. A concentração do deu-tério na água armazenada se modifica em função do volume de chuva, da altitude, latitude, distância do mar e entre estações do ano. O uso de múltiplos isó-topos pode melhorar a fiabilidade da informação ou da identificação de origem (Boner e Förstel, 2004).


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Em conclusão, a análise da composição de isótopos estáveis em tecidos e produtos animais, realizada por espectrometria de massa, tem o potencial de fornecer informações relevantes sobre a dieta do animal e ori-gem geográfica. No entanto, deve-se considerar que animais podem consumir dietas mistas, modificarem sua dieta ao longo do tempo ou podem estar sujeitos à troca de ambiente ou região geográfica, limitando ou tornando mais complexo o uso da técnica isotópica de traçabilidade (Prache, 2009).

Marcadores indiretos

São aqueles marcadores que são transformados pelo metabolismo do animal.

Ácidos Graxos

Em monogástricos, o perfil de ácidos graxos depo-sitados na gordura é reflexo direto da composição de ácidos graxos da dieta. Em ruminantes, como ovinos e bovinos, ácidos graxos insaturados estão sujeitos à biohidrogenação pela microflora ruminal, sendo de-positados como gorduras saturadas. Desse modo, a composição de ácidos graxos dos produtos cárneos de ruminantes é somente parcialmente dependente da dieta (Sheath et al., 2001).

o entanto, parte dos ácidos graxos insaturados da dieta pode escapar da biohidrogenação ruminal e, dessa forma, influenciar a composição dos ácidos graxos dos produtos (Nuernberg et al., 2005; Enser et al., 1998; Nozière et al., 2006a).

Nozière et al. (2006b), demonstraram que mesmo dietas não muito contrastantes (i.e., silagem vs. feno da mesma gramínea) resultaram em diferenças ana-liticamente perceptíveis no perfil de ácidos graxos no leite. Quando houve a troca alimentar de silagem para o feno, a proporção dos ácidos graxos cáprico (C10:0), mirístico (C14:0) e linoleico (C18:2) na gor-dura do leite aumentaram e do esteárico (C18:0) e li-nolênico (C18:3) diminuíram. Contudo, vários fatores podem modificar o metabolismo ruminal dos ácidos graxos poli-insaturados e por consequência, influen-ciar o perfil de ácidos graxos que são depositados na carne (Chilliard et al., 2007), incluindo composição da dieta ou tipo e nível de suplementação. Enser et al. (1998) e Nuernberg et al. (2005) observaram que carne de animais alimentados com pasto tem menor relação n-6/n-3, e seriam, portanto mais saudáveis do que a carne de animais que consomem grão. Adi-cionalmente, Demeyer e Doreau (1999) observaram que dietas baseadas em concentrado diminuem o pH ruminal, o que reduz a lipólise e a biohidrogenação, resultando em carne com perfil lipídico mais insatu-rado.

Em conclusão, a composição dos ácidos graxos da gordura da carne tem potencial de ser utilizada para identificar o padrão dietético, porém com limitações.

Por exemplo, para uma mesma dieta base, a adição de óleo vegetal na ração pode dificultar a discriminação dos sistemas alimentares ao qual foram submetidos os animais (Scollan et al., 2001).

Métodos globais baseados nas propriedades ópticas

A identificação dos marcadores diretos é feita através de métodos químicos de análise laboratorial, os quais são normalmente de alto custo, demandam a utilização de reagentes químicos e preparação laboriosa de amostras. A utilização dos métodos globais parte do pressuposto de que a alimentação dos animais ocasiona diferenças na composição de seus tecidos, fezes e fluídos, que por consequência causam alterações nas suas propriedades ópticas, as quais podem ser utilizadas para autentificar a dietas de ruminantes. Embora este método físico deman-de equipamento de alto custo inicial, tem a vantagem de realizar a análise sem utilização de reagentes químicos e a preparação das amostras é menos laboriosa.

Um exemplo da utilização das propriedades ópti-cas dos compostos como traçadores foi reportado por Prache e Theriez (1999). Esses autores foram os pio-neiros a demonstrar que a capacidade de absorção de luz por pigmentos carotenoides podem ser utilizadas como biomarcadores de dietas, através da chamada es-pectroscopia no espectro de luz visível (VIRS - Visible and infrared scanner). Esta técnica consiste na emis-são de luz visível na amostra e na análise do padrão de comprimentos de onda refletidos (i.e. assinatura), utilizando um espectrofotômetro, o qual vai variar em função dos comprimentos de onda absorvidos. Basea-dos nesse princípio propuseram um método que esti-ma o tipo de dieta ingerida pelos animais em função do grau de absorção de luz na faixa entre os 450 e os 510 nm, que corresponde aos comprimentos de onda absorvidos pelos carotenóides. Esta técnica pode ser associada a outras medidas de cor proporcionadas pelo espectrofotômetro para identificação de origem do pro-duto. Por exemplo, bovinos criados extensivamente a pasto geralmente apresentam gordura mais amarelada do que os bovinos criados intensivamente, com ali-mentação concentrada, e isso é causado por carotenoi-des ingeridos com a dieta. A cor amarelada reduz se ocorre a troca de dieta de pastagens para concentrado, em situações, por exemplo, de terminação em confi-namento (Dunne et al., 2009). Dessa forma, dados de cor (como o índice de amarelo b*) podem ser úteis na discriminação.

A espectroscopia no infravermelho próximo (NIRS - Near-infrared spectroscopy) se diferencia do VIRS por ler o espectro de luz refletido nos comprimentos de onda entre os 400 e os 2500 nm e também tem o po-tencial de identificar características da carne (Prache, 2009). No entanto é um método laboratorial que exige preparação das amostras e um grande número de pa-


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drões lidos para a obtenção de uma curva de calibração com boa precisão e sensibilidade. Um dos principais requesitos para a boa detecção do espectro é respeitar o prazo máximo de três meses para a leitura da amostra, pois substâncias como os carotenoides, ácidos graxos e compostos fenólicos são passíveis de oxidação durante o armazenamento.

Os métodos espectrais tem o potencial de estimar não somente o tipo de dieta ingerida pelos animais (Cozzoli-no et. al., 2002), mas também outras informações como, por exemplo, a predição da tenrura da carne (Prieto et al., 2009), a detecção do uso de promotores de cresci-mento (Berzaghi et al., 2006) ou mesmo a indicação da idade dos animais. Contudo, como reportado por Röhrle et al. (2011) e Prache (2009), os métodos espectrais são hábeis para discriminar dietas contrastantes, por exem-plo, forragem verde vs. concentrado, mas são limitados para identificar sistemas mistos em que animais são criados a pasto e terminados em confinamento.

Considerações Finais

Um modelo conceitual é apresentado na Figura 1, indicando que vários marcadores podem ser usados na traçabilidade da carne, cada qual com seus potenciais e limitações em identificar o sistema alimentar e/ou a origem geográfica. Por exemplo, dietas mistas são mais difíceis de serem identificadas através de marcadores do que dietas únicas e/ou contrastantes (i.e. forragem vs. concentrado). Já a origem geográfica tem sido iden-tificada com sucesso através de métodos espectrais ou com base na análise de isótopos de oxigênio e hidro-gênio na carne. Em síntese, cada técnica em particular possui indicações próprias de uso de modo que, pro-vavelmente, o futuro da traçabilidade incluirá a utili-zação concomitante de diversas técnicas. De qualquer maneira, constitui-se em objeto de alto impacto tecno-lógico que necessita ser incluído na pauta de pesquisa no Brasil.

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Figura 1 - Modelo conceitual para Traçabilidade da Dieta e Origem de produtos cárneos de ruminantes. O sucesso da identificação do sistema alimentar é relativo à dieta ofertada. Dietas mistas são até o momento mais difíceis de serem identificadas do que dietas únicas e/ou contrastantes (forragem x concentrado). Já a origem geográfica tem sido identificada com sucesso através de métodos espectrais e isótopos de oxigênio e hidro-gênio. No entanto, todas as técnicas possuem suas indicações (retângulos com linhas duplas) e limitações (retângulos tracejados).


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Abordagem diagnóstica e terapêutica das principais afecções uterinas em cadelas

Diagnosis and therapeutic management of the main canine uterine disorders.

Gisele A.L. Veiga1*, Ricardo H. Miziara1, Daniel S.R. Angrimani1, Fernanda M. Regazzi1, Liege C.G. Silva1, Cristina F. Lúcio1 e Camila I. Vannucchi1

1Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo (USP)

Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva, 87,

05508-270, São Paulo, Brasil.

*Correspondência: [email protected]

Resumo: As afecções uterinas que constituem o complexo Hi-perplasia Endometrial Cística – Piometra (HEC-Piometra) são alterações comumente vivenciadas na clínica de pequenos ani-mais. Entretanto, as divergentes teorias em relação à classifica-ção clínica e histológica desta afecção dificultam a realização de um diagnóstico preciso e precoce, predispondo o médico veteri-nário a tratamentos, muitas vezes, errôneos. Não é raro o clínico optar por conduta terapêutica radical, tal como a esterilização cirúrgica, uma vez que o diagnóstico definitivo é realizado tar-diamente e a saúde sistêmica do animal, na grande maioria dos casos, está severamente comprometida.

Palavras-chave: diagnóstico, tratamento, hiperplasia endome-trial cística, piometra, cadela

Summary: The uterine disorders that constitute the Cystic En-dometrial Hyperplasia - Pyometra (CEH-Pyometra) complex are commonly presented in the small animal practice. However, the di-vergent theories regarding the clinical and histological classification of the disease impairs the accurate and early diagnosis, inducing veterinarians to often erroneous treatments. Frequently, veterinar-ians choose to conduct a radical therapy for this disease, such as sur-gical sterilization, since the diagnosis is lately achieved and the sys-temic health of the animal, in most cases, is severely compromised.

Keywords: diagnosis, treatment, cystic endometrial hyperplasia, pyometra, bitch

Introdução

A Hiperplasia Endometrial Cística-Piometra (HEC-piometra) é uma afecção uterina prevalente em cadelas adultas e não castradas, caracterizada por inflamação e infecção, associadas ou não a alterações sistêmicas sig-nificativas e potencialmente fatais (Borrensen, 1980). Muitos pesquisadores consideram a HEC como a fase inicial para o desenvolvimento da piometra, enquanto trabalhos mais recentes sugerem que a HEC e a piome-tra são afecções que ocorrem de forma independente (Dow, 1958; De Bosschere et al., 2001).

Estudos retrospectivos demonstram que fatores pre-disponentes, tais como a idade, a raça e o número de gestações estão relacionados com o desenvolvimento da HEC-Piometra (Egenvall et al., 2001; Fukuda, 2001; Hagman et al., 2011). Embora muitos fatores sejam considerados de risco, tais como o pseudocio, idade ao primeiro cio, duração e intervalo entre períodos de cio, hormonioterapia, infecções prévias do trato urinário e neoplasias mamárias, não há até o momento estudos científicos que comprovem a interação entre tais fatores e o desenvolvimento do complexo HEC-Piometra.

Nesta revisão bibliográfica, serão abordados fatores relacionados com a etiopatogenia, classificação, ava-liação clínica e laboratorial associada à utilização de métodos de imagem como ferramenta diagnóstica na diferenciação das afecções uterinas que constituem o complexo HEC-Piometra, bem como os tratamentos passíveis de serem realizados na espécie canina. Pre-tende-se contribuir para a atualização e fomentar novas perspectivas clínicas para umas das afecções do siste-ma reprodutivo mais frequente na atividade médico-cirúrgica de pequenos animais.

Etiopatogenia

Há décadas, diversas conjecturas divergem na ten-tativa de decifrar os mecanismos desencadeadores da HEC-Piometra. A estimulação hormonal associada à infecção bacteriana, a hormonioterapia, além da ação de fatores de crescimento tecidual são alguns dos prin-cipais focos de pesquisa direcionada a esta afecção uterina na espécie canina.

A HEC-Piometra é uma síndrome aguda ou crôni-ca, que envolve a ação conjunta dos hormônios este-roidais, estrógeno e progesterona (De Bosschere et al., 2002). Acredita-se que a cada ciclo estral, a exposição sucessiva do endométrio à estimulação estrogênica, seguida por um intervalo prolongado de dominância progestacional, particular da fase de diestro, seja res-

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ponsável por alterações morfológicas descritas como inflamação e exsudação epitelial, tornando o útero sus-cetível à ação de agentes bacterianos (Fig.1) (Niskanen e Thrusfield, 1998; Johnston et al., 2001).

Figura 1 - Esquema ilustrativo das principais modificações fisioló-gicas de acordo com as diferentes fases do ciclo estral nas cadelas.

Geralmente, o desenvolvimento da HEC-Piometra em cadelas jovens está relacionado à hormonioterapia, indicada quer na indução, quer na supressão do estro, por administração de estrógenos ou progestagénios de longa ação (Smith, 2006; Whitehead, 2008). A espé-cie canina apresenta maior sensibilidade ao tratamento com estrógenos quando comparada às outras espécies animais (Hart, 1990). Adicionalmente, a administração de combinações de estrógeno-progesterona ou estróge-nos durante o diestro, aumenta a vulnerabilidade uterina à HEC-Piometra, uma vez que o estrógeno amplifica a ação da progesterona no endométrio (Bowen et al., 1985; Attia, 1989).

A Escherichia coli é uma bactéria predominantemen-te isolada no útero de cadelas com HEC-Piometra (Dow, 1958; Fransson et al., 1997; Dhaliwal et al., 1999). Tal agente é classificado como uma bactéria gram-negativa, e a sua destruição resulta em liberação de endotoxinas, por meio da ação direta ou indireta de mediadores infla-matórios, provocando lesão endometrial (Noakes et al., 2001). Considera-se que a contaminação uterina ocorra por via ascendente, sendo o trato urinário ou a genitália externa, os locais de origem (Vandeplassche et al., 1991; Fransson et al., 1997).

Estudos recentes evidenciam o envolvimento de fato-res de crescimento tecidual, os quais podem desencade-ar e/ou exacerbar a lesão uterina, bem como conduzir às alterações sistêmicas associadas à HEC-Piometra. Atu-almente, é reconhecida a ação de fatores como o TGF-α na indução do crescimento das glândulas endometriais em cadelas (Tamada et al., 2005). Kida et al., (2010) caracterizaram sobrexpressão do RNAm para o receptor do fator de crescimento epidermal (EGF-R) nas células epiteliais do endométrio de cadelas com HEC-Piometra. Da mesma forma, foi evidenciado que a sobrexpressão do TGF-α nas células inflamatórias pode contribuir para

o crescimento exacerbado das glândulas endometriais, mediante o aumento da expressão do EGF-R no endo-métrio. Portanto, atualmente, acredita-se que estes fa-tores estejam envolvidos no desencadeamento da HEC-Piometra.

Classificação

Muitas são as sinonímias e os critérios de classifica-ção para o complexo HEC-Piometra. De acordo com o estado do cólo uterino, esta afecção pode ser classificada como piometra aberta (Fig. 2), com consequente drena-gem do conteúdo intra-luminal; ou piometra fechada (Fig. 3), sendo o conteúdo restrito ao útero e, portan-to, trata-se de afecção de caráter de emergência (Smith, 2006). Estudos recentes elucidam que cadelas com pio-metra aberta apresentam maior infiltrado neutrofílico, resultando na produção da enzima colagenase, a qual degrada o colágeno e promove aumento da permeabili-dade tecidual e, consequentemente, relaxamento da cér-vix. Os mesmos autores demonstraram que, em cadelas com piometra, não é possível estabelecer relação entre o relaxamento cervical e a expressão dos receptores de estrógeno e progesterona (Kunkitti et al., 2011).

Figura 2 - Piometra aberta, com drenagem via vaginal de con-teúdo intrauterino de aspecto purulento.

Figura 3 - Piometra fechada e ausência de corrimento vaginal, caracterizando a secreção restrita ao lúmen uterino.

As alterações histológicas encontradas no útero per-mitem classificar a HEC e a Piometra como diferentes


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estágios de desenvolvimento da doença ou como enti-dades nosológicas de ocorrência independentes (Dow, 1957; De Bosschere et al., 2001). Com base nos acha-dos histológicos, Dow classificou a Piometra como uma sequência de eventos conforme demonstrado no Quadro 1.

Quadro 1 – Classificação histológica das afecções uterinas segundo Dow (1957)

Em 2001, De Bosschere e colaboradores, numa ava-liação mais detalhada dos tecidos uterinos, sugeriram a classificação: HEC-mucometra e endometrite-piometra. Para os referidos autores, as duas entidades patológicas ocorrem de maneira independente e não representam uma sequência de eventos, conforme inicialmente pro-posto por Dow (1957). Embora a aparência histológica de tais afecções seja semelhante, o que as diferencia é o processo inflamatório presente na endometrite-piome-tra. Desta maneira, a HEC-mucometra pode ser classi-ficada em HEC moderada, HEC severa e mucometra, enquanto a endometrite-piometra pode ser dividida em endometrite, piometra hiperplásica e piometra atrófica.

Na HEC-mucometra (Fig. 4A e B), as cadelas apre-sentam-se clinicamente saudáveis e as alterações histo-lógicas são representadas por um aumento do número e do tamanho das glândulas, além da variação do tama-nho dos cistos, presença de edema estromal, congestão vascular e pequenos focos de hemorragia. Os achados de De Bosschere et al. (2001) corroboram estudos prévios, os quais demonstram que as cadelas clinica-mente saudáveis podem apresentar lesões uterinas de grau moderado a severo, e correlacionam a HEC com infertilidade (Barton, 1992; Feldman e Nelson, 1996).

Figura 4 - HEC-Mucometra. A – Aspecto macroscópico: endo-métrio hiperplasiado, presença de estrutura cística (setas pretas) e conteúdo intra-uterino (area circular preta). B – Fotomicrogra-fia da HEC-Mucometra: cistos pequenos e em pequena quantida-de, com células epiteliais achatadas, ausência de alteração estro-mal e conteúdo hialino no lúmen glandular (seta preta). Presença de pequenos focos hemorrágicos. H.E. – 100x

A endometrite-piometra foi evidenciada em cadelas que apresentavam sintomatologia clínica decorrente do processo inflamatório instalado. Na endometrite, o en-dométrio encontra-se repleto de neutrófilos, linfócitos e células plasmocitárias, além de ocorrer proliferação de fibroblastos no estroma e edema evidentes. A pio-metra hiperplásica (Fig. 5) é caracterizada por um se-vero infiltrado inflamatório, com grande quantidade de neutrófilos, macrófagos, linfócitos e células plasmoci-tárias, presentes em proporções variáveis no lúmen ute-rino, nas glândulas endometriais, no estroma epitelial e miometrial. Ocasionalmente, observa-se moderada a severa proliferação de fibroblastos no estroma, presen-ça de úlceras (Fig. 6A), necrose, hemorragia, abscesso (Fig. 6B) e metaplasia escamosa (Fig. 7) na superfície do epitélio endometrial. Já a piometra atrófica (Fig. 8 e 9) é relatada por atrofia significativa do endométrio, com pouca evidência de cistos, estroma e glândulas, enquanto o miométrio encontra-se hiperplásico.

Figura 5 - Aspecto macroscópico da Piometra hiperplásica. Pre-sença de conteúdo intraluminal purulento (seta preta), evidente espessamento do endométrio (círculo preto).

Figura 6 - Piometra hiperplásica. A – Fotomicrografia de ulce-ração com debris celulares no lúmen uterino (seta). H.E. 100x. B – Abcesso glandular (seta). H.E. 200x

Figura 7 - Fotomicrografia de metaplasia escamosa da superfí-cie endometrial (seta). H.E. 200x


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Figura 8 - Aspecto macroscópico da Piometra atrófica. Presença de conteúdo intraluminal purulento (seta preta) e evidente atrofia do endométrio (asterisco preto).

Figura 9 - Fotomicrografia de piometra atrófica. Ausência de glândulas endometriais (seta). H.E. 50x

Diagnóstico

Frequentemente, as cadelas com HEC-Piometra são apresentadas com histórico de cio há no mínimo duas semanas ou aciclicidade, principalmente em ca-delas idosas, devido à senescência reprodutiva (Smith, 2006). É importante ressaltar que para além da avalia-ção clínica, os exames complementares de laboratório e, principalmente, de imagem são indispensáveis para a confirmação diagnóstica desta afecção.

Comumente, as cadelas com HEC não complicada ou mucometra não apresentam sintomatologia clínica evidente. Em alguns casos, pode-se notar distensão uterina pelo acúmulo de fluido, em outros casos, as alterações endometriais podem resultar em falhas na concepção e infertilidade (Prestes et al., 1997).

Na piometra aberta, o achado mais comum é a pre-sença de secreção vaginal, variando de sanguínea a mucopurulenta e, frequentemente, apresenta odor fé-tido (Dow, 1957; Dow, 1958; Ewald, 1961; Hardy e Osborne, 1974). Entretanto, na piometra fechada não há evidências de secreção vaginal, o que resulta em distensão abdominal proporcional ao diâmetro uterino

(Pretzer, 2008). Em ambas as situações, a liberação de endotoxinas na corrente sanguínea, durante a pro-liferação ou destruição do agente infeccioso, resulta em alterações sistêmicas caracterizadas por letargia, depressão, inapetência, poliúria e polidipsia, vômito e diarréia. No entanto, tais sinais são mais severos na piometra fechada e podem evoluir para desidratação, toxémia, hipotensão e choque (Hardie, 1995; Panciera et al., 2003).

Em razão do processo infeccioso, as cadelas com HEC-Piometra comumente apresentam leucocitose, mais pronunciada em cadelas com a cérvix fechada (Feldman e Nelson, 1989; Gandotra et al.,1994). O processo inflamatório associado à infecção resulta em neutrofilia, com valores frequentemente superiores a 25.000 células/mm3 (Feldman e Nelson, 1996). Com a cronicidade e severidade da infecção, é notório o des-vio à esquerda, com presença de granulações tóxicas nos neutrófilos. Entretanto, nos casos de endotoxémia, a neutropenia é a alteração hematológica frequente (Ayyappan et al., 1992). Os achados do hemograma revelam alterações como anemia normocítica e nor-mocrômica não regenerativa em aproximadamente 25% das cadelas com HEC-Piometra (Wheaton et al., 1989).

A cronicidade do processo inflamatório na HEC-Piometra é acompanhada por disfunção tubular e/ou glomerular (Heiene et al., 2007; Maddens et al., 2010). A taxa de filtração glomerular é o método diagnóstico de maior eficiência para avaliar a função renal (Levey, 1989). Considera-se a azotemia pré-renal como um processo secundário à estimulação crônica do sistema imune pelos antígenos da Escherichia coli, pois tais imuno-complexos precipitam nos glomérulos e resul-tam em glomerulonefrite (Newman et al., 2006). Se uma cadela desidratada ou azotêmica apresenta-se com baixa densidade específica da urina (<1.030), sugerin-do diminuição da capacidade de concentração, pode-se concluir que está ocorrendo disfunção renal primária. As concentrações séricas de creatinina e de nitrogênio derivado da uréia podem refletir tanto a afecção renal primária, quanto a desidratação pré-renal e a hipovolé-mia (Stone et al., 1998).

Ocasionalmente, a HEC-Piometra resulta no aumen-to dos níveis séricos de fosfatase alcalina (FA) e de aspartato amino-transferase (AST), ambas as enzimas com origem hepática. Tais alterações ocorrem como resultado de danos hepatocelulares causados pelo qua-dro de septicémia e/ou diminuição da circulação hepá-tica secundária à hipóxia celular em cadelas desidrata-das (Feldman e Nelson, 1996).

A avaliação radiográfica do abdómen não é consi-derada um exame valioso para o diagnóstico da HEC-Piometra, uma vez que os resultados obtidos podem revelar a presença de uma estrutura tubular contendo fluido denso, localizada em região ventro-caudal do abdómen e deslocamento de segmentos das ansas in-testinais para a região crânio-dorsal. Tais achados po-


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dem ser igualmente encontrados durante a gestação, previamente a calcificação do esqueleto fetal e, por esta razão, o exame radiográfico não é importante para o diagnóstico definitivo da HEC-Piometra (Stone et al., 1998).

Considera-se o exame ultra-sonográfico bidimensio-nal transabdominal uma eficiente ferramenta diagnós-tica não invasiva, pois permite confirmar o aumento de volume uterino, a espessura do endométrio e a presen-ça de estruturas císticas na HEC-Piometra (Fig. 10). Adicionalmente, este exame caracteriza o conteúdo in-traluminal, geralmente homogêneo, embora a presen-ça de um fluido com ecogenicidade reduzida também possa ser evidenciada (Nyland e Mattoon, 2002).

Figura 10 – A - Imagem ultrasonográfica no modo-B. B - Em corte transversal do corno uterino, evidente hiperplasia endo-metrial, igualmente observada no aspecto macroscópico do útero (B).

Em 2004, Bigliardi e colaboradores correlacionaram os achados ultra-sonográficos de 45 cadelas que apre-sentavam sintomatologia sugestiva de piometra com os achados do exame histológico do útero. As alterações relativas à integridade do endométrio, presença ou au-sência de exsudato e hiperplasia das glândulas foram avaliadas por imagiologia. De acordo com tais pesqui-sadores, a ultra-sonografia pode ser considerada uma ferramenta diagnóstica de grande importância, por permitir diferenciar a HEC-Piometra de graus III e IV, segundo a classificação de Dow (1957); bem como a mucometra, piometra hiperplásica e atrófica, de acordo com a classificação de De Bosschere et al. (2001).

Em Medicina Veterinária, apesar da caracterização ultra-sonográfica do trato reprodutivo estar bem esta-belecida, pouca atenção tem sido atribuída à avaliação do suprimento vascular do útero (Stowater et al., 1989; Root e Spaulding, 1994; Alvarez-Clau e Liste, 2005). A análise das artérias uterinas por meio do exame ul-tra-sonográfico por Doppler tem grande aplicabilidade clínica em obstetrícia, bem como na ginecologia em mulheres e em várias espécies animais (Taylor e Que-dens-Case, 1995; Bollwein et al., 2004). Atualmente, a ultra-sonografia Doppler passou a ser empregue no acompanhamento da gestação e na monitorização da viabilidade fetal em cadelas e gatas (Nautrup, 1998; Di Salvo et al., 2006; Scotti et al., 2008; Miranda e Do-mingues, 2010; Brito et al., 2010). Ademais, tal técnica é utilizada para caracterizar a circulação das artérias uterinas e ovarianas em cadelas nas diferentes fases do ciclo estral (Köster et al., 2001; Freitas et al., 2002;

Alvarez-Clau e Liste, 2005). A dopplervelocimetria em cadelas revelou valores elevados do índice de re-sistência (RI) das artérias uterinas durante o anestro e diestro (Alvarez-Clau e Liste, 2005). Recentemente, a ultrasonografia Doppler foi utilizada no diagnóstico diferencial entre a HEC-mucometra e a Endometrite-Piometra, e observou-se que quanto maior a severidade da afecção uterina, maiores os índices de velocidade de fluxo sanguíneo para o útero (Veiga, 2012). Considera-se que tal característica pode contribuir para a elimina-ção do agente através de mecanismos compensatórios do organismo. Portanto, para as pacientes com doença uterina sem sintomatologia clínica e com diagnóstico inconclusivo na avaliação ultra-sonográfica bidimen-sional, os índices de dopplervelocimétricos podem ser uma ferramenta diagnóstica pontual e promissora para o diferencial das afecções uterinas, principalmente por seu caráter não invasivo (Fig. 11 e 12) (Veiga, 2012).

Figura 11 - Velocimetria na HEC-mucometra. Onda de alta re-sistência e baixa pulsatilidade.

Figura 12 - Velocimetria na Piometra. Onda de baixa resistência e pulsatilidade.

Tratamento

A ovariohisterectomia é o tratamento de escolha para cadelas de qualquer idade que apresentam piometra fe-chada ou alterações sistêmicas significativas. Tal esco-


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lha terapêutica deve ser bem esclarecida ao proprietá-rio já que, posteriormente, o animal será incapaz de se reproduzir (Fieni, 2006). Previamente ao procedimento cirúrgico, a fluidoterapia endovenosa é instituída para correção das alterações hidro-eletrolíticas e equilíbrio ácido-base. Desta forma, é possível melhorar as con-dições clínicas da paciente para a realização do pro-cedimento anestésico. Entretanto, em casos severos, a realização da cirurgia não deve ser postergada (Smith, 2006). Em 1999, Fantoni e colaboradores demonstra-ram que a combinação de solução salina hipertônica e dextran 70 apresentam efeitos superiores à utilização de solução salina isotônica no tratamento de choque em cadelas com piometra.

Adicionalmente, a terapia de suporte preconiza a uti-lização de antibióticos de amplo espectro no pré-ope-ratório e sua continuidade por 7 a 10 dias do período pós-operatório (Feldman e Nelson, 1996). A monitora-ção da função renal e hepática é considerada um fator prognóstico da evolução da doença e deve ser realiza-da também no período pós-operatório, uma vez que o procedimento anestésico pode sobrecarregar o funcio-namento hepático e renal (Wanke e Gobello, 2006).A exclusão da terapia cirúrgica e emprego do tratamento medicamentoso estão indicados nas cadelas que apre-sentam piometra aberta e ausência de alterações sistê-micas, além de ser o tratamento de escolha para fêmeas de alto valor genético, pois mantém sua capacidade re-produtiva (Gilbert et al., 1989). Muitos são os proto-colos descritos na literatura, a grande maioria utiliza medicamentos como a prostaglandina F2α (PGF2α) e seus análogos, bem como o aglepristrone.

A PGF2α é um agente com propriedades luteolítica e uterotônica, que atua na lise do corpo lúteo e, por con-seguinte, promove diminuição das concentrações séri-cas de progesterona. Quando administrada em doses repetidas, também atua no aumento da contratilidade miometrial, relaxamento da cérvix e, consequentemen-te, auxilia na expulsão do conteúdo uterino (Johnston et al., 2001; Smith, 2006). Os efeitos colaterais des-ta droga incluem náusea, vômito, diarréia, salivação, aumento da frequência cardíaca e respiratória, obser-vados no período de 5 a 60 minutos após sua adminis-tração. No entanto, tais efeitos podem ser minimizados caso a cadela seja submetida a caminhadas com dura-ção de 20 a 40 minutos após a aplicação do medica-mento (Memon e Mickelsen, 1993; Fieni, 2006). Na tentativa de minimizar os efeitos adversos, recomenda-se que a aplicação da PGF2α seja realizada em doses crescentes, iniciando-se com 50 µg/kg e aumentando gradualmente até 250 µg/kg. Muitos são os protocolos descritos na literatura e, as doses recomendadas variam de 10 a 500 µg/kg, administradas por via subcutânea, durante o período de 3 a 5 dias ou até a total diminui-ção do diâmetro uterino (Rudd e Kopcha, 1982; Wallen et al., 1986; ; Meyers- Gilbert et al., 1989; Feldman e Nelson, 1996). A probabilidade de recidiva da afecção após o tratamento é elevada, exceto se houver a gesta-

ção. No entanto, as taxas de concepção após a terapia diminuem, principalmente, por morte embrionária e aborto (Meyers-Wallen et al., 1986).

O cloprostenol, prostaglandina de origem sintética, também pode ser utilizado para o tratamento da HEC-Piometra. A dose recomendada é de 10 µg/kg, adminis-trada por via subcutânea, duas vezes ao dia durante 9 a 15 dias (Gabor et al.,1999). Os efeitos colaterais cau-sados por este agente são semelhantes aos da PGF2α natural e sua eficácia é de aproximadamente 60% (Fa-zale et al., 1995).

Recentemente, diversos estudos demonstram a uti-lização do aglepristone, um agente bloqueador dos receptores de progesterona, no tratamento da HEC-Piometra, com uma eficácia de aproximadamente 77% (Trasch et al., 2003). A vantagem do aglepristone é sua indicação para a piometra fechada. A expulsão do conteúdo intra-uterino, posteriormente a abertura da cérvix, pode ocorrer em 48 a 72 horas após a adminis-tração do medicamento. Nestes casos, a melhoria da condição clínica da cadela é expressiva (Wehrend et al., 2003; Fieni, 2006). Em associação ao cloproste-nol, a eficácia do aglepristone eleva-se para 84,4%. O bloqueio dos receptores de progesterona, associado à lise do corpo lúteo e à diminuição das concentrações séricas da progesterona, resultam em diminuição signi-ficativa do diâmetro uterino (Fieni, 2006). As taxas de recidiva variam de 9 a 21% de acordo com a duração do tratamento e podem ocorrer após 12 a 14 meses do tratamento (Hoffmann et al; 2001; Trasch et al., 2003; Gobello et al., 2003).

Conclusões

Considerações importantes a respeito da etiopatoge-nia, diagnóstico e tratamento das afecções uterinas fo-ram abordados na presente revisão bibliográfica. Ade-mais, as informações relatadas visam contribuir para que seja possível adotar uma estratégia de diagnóstico e tratamento eficiente da HEC-piometra na espécie ca-nina. A complexidade relacionada ao diagnóstico dife-rencial das afecções que constituem o complexo HEC-Piometra exige futuros estudos acerca da aplicabilida-de de uma ferramenta diagnóstica precisa e não inva-siva, permitindo que terapias conservativas possam ser instituídas com o objetivo de manter a viabilidade da função reprodutiva das cadelas comprometidas.

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Mastitis vaccination in dairy cattle: a meta-analysis of field case-control trials

Vacinação contra a mastite em vacas leiteiras: uma metanálise de ensaios clínicos de campo com controlo

Fernando Mata1*

1School of Agriculture, Food and Rural Development, Newcastle UniversityNewcastle upon Tyne, NE1 7RU, United Kingdom

*Correspondence: [email protected]: +44(0) 1912086870

Resumo: A mastite é a primeira causa de perdas económicas no sector leiteiro. A eficácia das vacinas existentes contra a mastite é questionada por diversos autores. É o objectivo deste estudo, contribuir para o esclarecimento desta questão. Uma metanálise foi efectuada em 15 ensaios clínicos de campo, in-cluindo um total de 7941 vacas (4317 vacinadas e 3624 usadas como control). Um modelo de efeitos aliatórios foi ajustado com uma significância de P<0,01. A unidade considerada foi o rácio (entre vacas vacinadas e usadas como controlo) da razão entre vacas com mastite e normais. Este foi calculado como tendo um valor de 0,604 com um intervalo de confiança a 95% de [0,373; 0,979] depois da correcção do enviezamento de publi-cação. Conclui-se que a vacinação para o controlo de mastites traz alguns resultados positivos, mas a vantagem económica do seu uso depende do balanço entre custos e benefícios. Como tal, as medidas preventivas tradicionais continuam a desem-penhar um papel fundamental no controlo da mastite; a vacina contra a mastite pode ser utilizada como um complemento no combate à mastite, mas não como um substituto de todas as outras medidas preventivas.

Palavras-chave: mastite, mamite, vacas leiteiras, vacina, metanálise

Summary: Mastitis is the first cause of economic loss in the dairy sector. The efficacy of the existing vaccines against mas-titis is questioned by several authors. It is the aim of this pa-per to shed some light on this question. A meta-analysis was conducted on 15 field research trials, which included a total of 7941 cows (4317 vaccinated and 3624 used as control). A random-effects model was adjusted and found significant (P<0,01). The unit used was the rate ratio between vaccinated cows and controls and was found to have a value of 0,604 with a 95% confidence interval of [0,373; 0,979], after correction for publication bias. It was concluded that vaccination to con-trol mastitis has a slight advantage, but the economics of its use depends on the weighting between its cost and its benefit, and therefore traditional preventive measures still have an im-portant role to play; Mastitis vaccines can be used as a comple-ment of all the other preventive measures but not as a substitute of these.

Keywords: mastitis, dairy cow, vaccine, meta-analysis

Introduction

Mastitis is the first cause of economic loss by disease in dairy cattle in developed countries worldwide (Nielsen et al., 2010). These include losses in actual and poten-tial production, shortening of productive life, losses in milk quality, medicine costs, costs of veterinary care (Hogeveen et al., 2011) and potential implications in the general health of the animal including reproductive performance (Dobson et al., 2008). Mastitis is charac-terised by an inflammation in one or more quarters of the udder and can have an infectious or a traumatic origin (Kudi et al., 2009). The most frequent agents of infection in dairy cattle are Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus uberis and Streptococcus dysgalac-tiae (Schukken and Kremer, 2001). Mastitis caused by the first of these agents is classified as contagious, and by the others environmental (Tyler and Ensminger, 2006).

The research into vaccines against Staphylococcus au-reus started in the early 1990s (Michie, 2002), and with regards to mastitis, several vaccines have been tested and advances have been made (e.g. González et al., 1989) but there are doubts with regards to the efficacy of the com-mercially available vaccines (Leitner et al., 2003). There are several types of vaccines that have been tested, and with regards to S. aureus these include whole organism (cellular lysates, inactive and attenuated vaccines) and sub-units (toxins, surface proteins and polysaccharides) (Wallemacq, 2010). Mono and polyvalent vaccines have been tested: S. aureus, E. coli, S. aureus / E. coli, S. au-reus / Streptocccci (e.g. Yoshida et al., 1984; Gonzalez et al., 1989; Giraudo et al., 1997; March et al., 2010); these were tested in adult cows exposed before to the disease and in heifers not exposed to the disease (e.g. Calzolari et al., 1997, Moromoto et al., 2011); and also different inoculation protocols were followed using, none, one or two boosters (e.g. Nordhaug et al., 1994; Watson et al., 1996).

The difficulties with the development of a vaccine against mastitis were identified a long time ago; Mellen-

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berger (1977) states that these difficulties are related to the large number of different organisms involved in the pathology and with the fact that when the pathogen re-mains in the duct and alveoli as subclinical infection, it is not attacked by the humoral antibodies, which happens only in clinical mastitis cases, when the pathogens penetrate the mucous membrane. Denis et al. (2011) who has recently done a review of the state of the art in mastitis vaccination, recognises the doubts regarding the efficacy of the existing vaccines and points several po-tential directions to follow in future developments; these authors conclude that the design of an effective vaccine is challenging, as the immune response in the mammary gland is unique. Bovine mastitis is an evolving disease and different pathogens have shown to have different levels of importance in the development of the disease through time (Bradley, 2002).

The aim of this study is to make a meta-analysis of exis-ting clinical case-control trials, to bring to light important knowledge regarding the efficacy of the mastitis vaccines.

Material and methods

The literature search was extensively performed with the use of Google scholar for English, French, Span-ish and the Portuguese languages: http://scholar.google.co.uk, http://scholar.google.fr, http://scholar.google.es, http://scholar.google.com.br, and also all the databases assessed by the University of the West of England library search engine of the Animal and Land sciences subject, which include: CAB Abstracts, Cambridge Journals On-line, Directory of Open Access Journals, EBSCO Host Electronic Journals Service, Emerald, MEDLINE, Nexis, PubMed, SAGE Journals Online, ScienceDirect, Taylor & Francis, Willey Online Library, UWE e-journals at OVID and Zetoc. Simple and multiple combinations of the following key words were translated into the languag-es considered and used in the search: mastitis, vaccine, trial, case control, cow, dairy, cattle, and immunisation. Inclusion and exclusion criteria were defined as follows: Animals were considered to have mastitis when clinical mastitis was identified; some trials report their results considering number of quarters infected, which is im-possible to convert into number of animals infected and were, therefore, excluded; the minimum period of obser-vations considered after vaccination was 3 months, but no maximum was considered; experimental trials where the animals were challenged with pathogens were not consid-ered; only independent studies without conflict of inter-ests were considered.

The outcome measure considered in the analysis was the logarithm of the risk ratio (RR). The residual hetero-geneity (τ2) was estimated with the restricted maximum-likelihood estimator and found to be 0,576 with a Wald 95% confidence interval of [0,249; 2,088]. The homoge-neity of the data was tested with the Cochran’s Q-test, and was found to be significant (Q=80,32, df=14, P<0,001).

As the data was shown to be heterogeneous an initial mixed effects model was used. The covariate modera-tors used were: “absolute latitude of the location of the trial” (to add for climatic effect); “year of publication of the communication” (to add for genetic and technological gains); and “duration” (to add for the temporal effect due to different durations of the trials). The factor moderators used were: “vaccine agent” (Staphylococcus aureus, Es-cherichia coli, and multiple), “booster” (no booster, 1 or 2) and “exposed” (trials using heifers never exposed to mastitis or undifferentiated age pre exposed). As none of the moderators was found to be significant (P>0,05), a random effects model was finally used in detriment of a fixed effects model to add for the heterogeneity observed. After the random effects model a radial plot was pro-duced to analyse the sensitivity of the model by looking at the source of heterogeneity and the extent of heterogene-ity due to each study. The publication bias was evaluated via a funnel plot and tested via a regression test (weighted regression with multiplicative dispersion). The normality assumption was evaluated via Q-Q normal plot, and as seen in Figure 1, the assumption can be made once all the studies fall in the pseudo confidence envelop.

Figure 1 – Q-Q plot and respective 95% pseudo confidence enve-lope for assumption of normality after the random effects model.

The statistical analysis was performed with the free-ware R CRAN for Windows® version 2.15.0. platform x86_64-pc-mingw32/x64 (64-bit) (Comprehensive R Archive Network , http://cran.r-project.org/). The specific meta-analysis package “metaphor” (author: Wolfgang Viechtbauer) was used.

Results

The meta-analysis was performed with 15 studies (Ta-ble 1) that met the criteria set in the methodology. These studies took place between 1984 and 2011 in several places around the world. A total of 7941 cows were used

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in the trials, 4317 were vaccinated and 3624 were used as controls.

The outcome measure considered in this study was the relative risk (RR) or risk ratio and is calculated as risk if vaccinated divided by the risk if not vaccinated. The ran-dom effects model adjusted was found to be significant (P<0,01) and the estimated log value is -0,644 [-0,207; -1,082] of the RR that after exponentiation gives the 0,50 [0,34; 0,81] value observed in the forest plot (Figure 2). The model is estimated to have a total amount of hetero-geneity of τ2 = 0,576 [0,249; 2,088], and the percentage of total variability due to heterogeneity is I2 = 91,7% [82,9; 97,3]. This heterogeneity was found to be significant after the Q test (P<0,001).

Figure 2 – Forest plot showing the results of the 15 studies exa-mining the effectiveness of the mastitis vaccine. The relative risk ratio (RR) of mastitis infection favours the vaccine if lower than 1. The RR are presented with 95% confidence intervals, and are based on the adjusted random effects (RE) model.

Figure 3 – Radial plot for the adjusted random effects model.

Figure 4 – Trim and fill funnel plot, highlighting 3 missing stu-dies and a publication bias.

Trial # cows Duration (month) Vaccine agent # boost exposed absolute latitude

Yoshida et al., 1984 253 6 S.aureus 1 yes 33o

Gonzalez et al., 1989 431 18 E. coli 0 no 38o

Cullor, 1991 473 10 E. coli 2 yes 39o

Nordhaug et al., 1994 108 10 S.aureus 0 no 60o

Mc Clure et al., 1994 1419 5 E. coli 1 yes 33o

Watson et al., 1996 1820 10 S.aureus 1 yes 37o

Calzolari et al., 1997 1076 4 Multi 1 no 31o

Giraudo et al., 1997 120 9 Multi 1 no 33o

Tenhagen et al., 2001 321 3 S.aureus 1 yes 38o

Leitner et al., 2003 452 10 S.aureus 2 no 32o

Wilson et al., 2007 761 20 E. coli 1 yes 42o

Keskin et al., 2007 267 7 Multi 1 yes 40o

Pol et al., 2008 337 7 E. coli 1 yes 32o

Slobodanka et al., 2010 40 8 S.aureus 0 yes 45o

Morimoto et al., 2011 480 10 E. coli 1 yes 34o

Total 7941

Table 1 – The 15 studies considered in this meta-analysis and the variables used as moderators. The number of vaccinated and control cows, together with the number of observed negative and positive to mastitis can be found in Figure 1.

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The amount of overall heterogeneity due to each study is evaluated with the radial plot shown in Figure 3, and as can be observed all the studies considered fall in the confidence envelop, with a small exception. The RR of the different studies, having different preci-sions, show therefore to be consistent. This plot also shows some evidence of existence of publication bias, which can be even better observed through the trim and fill funnel plot (Figure 4), with the number of missing studies being estimated as 3, being 2 of them in the right hand bottom corner of the plot. This positioning gives evidence of small trials publication missing when results obtained contradict the expected positive effect of the vaccine. The rank correlation test for asymme-try (Kendall’s Τ) was found to be significant (P<0,05), and therefore a publication bias was found present. The new Overall RR after fill and trim for correction of asymmetry is 0,60 with a 95% CI of [0,37; 0,98].

Discussion

The history of mastitis vaccine is connected with the search for protection against the microorganisms caus-ing it, and therefore started in the beginning of the last century (Michie, 2002; Wilson and González, 2003). The search of a bacterin to combat environmental patho-gens (mainly Escherichia coli, but also Klebsiella spp, Enterobacter spp and Pseudomonas spp) is the aim of researchers since 1910, but not until the late 1980s was some efficacy reported (Wilson and González, 2003). The main antigen bacterin used for the production of anti-coliform vaccines is known as J5, but RE-17 mu-tant Samonella typhimurium bacterin toxicoid is also used. There are several of these vaccines available on the market, such as Pfizer Animal Health, Upjohn J-5 Bacterin®; Bayer MastiguardTM; Merial, J-Vac®; IM-MVAC Endovac-Dairy®; Novartis Animal Health J-5 ShieldTM.

The vaccination against Staphylococcus aureus has also been attempted from the beginning of last century, including attenuated, fixed or lysed organisms. Also in the 1960s polysaccharides from the capsule were used, and later in the 1970s enterotoxins were also used as antigenic components (Michie, 2002). More recently experimental DNA recombinant protein and recom-binant protein alone vaccines are being tested (Denis et al., 2011). In present times one vaccine specific for S. aureus mastitis is available in the market, namely Boe-hringer Ingelheim, Lysigin® Somato-Staph®. Since the 1980s attempts have also been made to design a vaccine against Streptococcus uberis but this is still not available commercially (Denis et al., 2011).

HIPRA, Startvac®, is a vaccine commercially available and fights both E. coli and S. aureus through inactivated E. coli J5 and inactivated S. aureus (CP8) SP 140 strains.

From these vaccines, Startvac®, is the only one used in the UK and all the others are used in the USA. The

meta-analysis did not identify any significant modera-tor, including the vaccine agent (including E. coli, S. aureus and multi agent), and therefore it was not found that a mixture of agents in the vaccine would improve its efficiency. Accordingly to the results of this study, all these types of vaccines will have the same degree of efficiency, and therefore the choice (where possible) should be done having in mind the application protocol and the final price for following the protocol.

The RR after fill and trim for correction of asymme-try was found to be 0,60 with a 95% CI of [0,37; 0,98], showing the exclusion of the value 1 in the CI and therefore an advantage on the use of vaccines against mastitis. Considering, however, the upper limit of the CI, full advantage is not completely evident when con-sidering the cost of the vaccines.

The efficacy achieved so far with the vaccines existing in the market is still relatively low, and therefore on-going discussions are taking place between scientists regarding the best strategy, while experimentation is also giving new clues about how to defeat mastitis (e.g. Leigh et al., 2010). Transgenic resistant cows have al-ready been engineered, capable of expressing an an-tibacterial endopeptidase in their mammary glands, which specifically targets the cell wall of S. aureus (Rainard, 2005). Sordillo (2011) summarised some of the reviews done in the past decade and highlights some directions that research is taking to explore ways of improving vaccination efficiency: for example the need to develop protocols that enhance mucosal cel-lular immunity and trafficking of memory T cells to the mammary gland as a strategy to develop effective im-munization; and the use of marker assisted technology to identify genes and chromosomal regions of interest. DNA vaccination is a recent strategy, where plasmids are introduced in the animal to lead to the activation of both humoral and cellular immune responses to the antigen (Talbot and Lacasse, 2005).

Other moderators considered in the model were the absolute latitude to test an eventual effect of climate; year to test the evolution of the technology in the 27 years spread of trials used; the duration of the trial to consider the time effect, the number of boosters and the use of heifers or previously exposed groups of ani-mals, but none of these was found to be significant. The moderator year is also not significant and therefore there is no evidence of developments in the efficacy of the vaccines used today when compared with those used 25 years ago.

This study shows an advantage on the use of vac-cines to control mastitis that is not completely conclu-sive and agrees with the conclusions of the majority of independent authors writing about mastitis vaccination efficiency. A mastitis rate ratio for vaccinated versus control cows of 0,604 after correction for asymmetry, favours the vaccination, but with a 95%CI of [0,373; 0,979], this advantage is small. The advantage of the use of mastitis vaccines needs to be weighed between

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the costs of not using them with the costs of using them, but the use of the traditional preventive measures are still of fundamental importance. As indication Nielsen et al. (2010) has calculated the cost of a clinical mastitis case in Sweden in €278 when considering withdrawn of milk, lower prices due to high somatic cell counts, veterinary fees, drugs and increased risk due to recur-rent cases; extra labour was not considered. The cost of a full vaccination programme with boosters and conferring protection for 1 year was reported to be be-tween £7 and £9 by Balsom (2011).

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Contaminação por Cryptosporidium spp. em esterco utilizado como adubo em hortas urbanas

Contamination with Cryptosporidium spp. in manure used as fertilizer in urban gardens

Adriana J. Almeida1, Verônica S. Lima2, Ana B.F. Rodrigues1, Paula A. Di Filippo1

1Laboratório de Clínica e Cirurgia Animal (LCCA), Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA), Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF). Av. Alberto Lamego, 2000,

Parque Califórnia, Campos dos Goytavazes, RJ, CEP 28013-602. 2Bio Bichos Clínica Veterinária, Rua São Paulo, 2253, Itoupava Seca, Blumenau, SC.

CEP 8903-000.

Resumo: Esta pesquisa teve como objetivo a detecção de Cryp-tosporidium spp., um protozoário entérico, do qual algumas espécies podem apresentar caráter zoonótico, em esterco uti-lizado como adubo em hortas urbanas localizadas em Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil, assim como determinar possíveis fatores de risco para a contaminação do esterco. Foram esco-lhidas 15 hortas urbanas que adicionam compostos orgânicos de origem bovina ao solo após a técnica de compostagem para o plantio. Foram coletados 200 g de esterco em três pontos: ápice, interior e base do montante de esterco. As amostras fo-ram fixadas em solução de formol a 10%, concentradas através da Técnica de Ritchie modificada, e coradas pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada para observação dos oocistos. Os resultados obtidos demonstraram que 53% das hortas esta-vam contaminadas por Cryptosporidium spp., e que diferentes condições de higiene, origem do esterco e do abastecimento hídrico, e o processo de compostagem não foram capazes de eliminar o parasito do adubo.

Palavras-chave: Contaminação ambiental, Cryptosporidium, hortaliça, diarréia.

Summary: This research aimed the detection of Cryptospo-ridium spp., a zoonotic enteric protozoan, in manure used as fertilizer in urban gardens located in Campos dos Goytacazes, RJ, Brazil, and to determine possible risk factors for manure contamination. There were chosen 15 urban gardens that usu-ally add organic compounds to the ground after the composting technique for planting. About 200 g of manure were collec-ted at three points of the manure amount: apex, interior and base. The samples were fixed in formalin 10%, concentrated by modified Ritchie technique, and stained by Ziehl-Neelsen modified technique for oocysts observation. Results obtained showed that 53% of the gardens were positive for Cryptospo-ridium spp., and that different conditions of hygiene, manure source and water supply, and the composting process have not been able to eliminate the parasite from the fertilizer.

Keywords: Environmental contamination, Cryptosporidium, vegetables, diarrhea.

Introdução

Protozoários do gênero Cryptosporidium são reco-nhecidos por serem causa de diarréia em pessoas, sen-do os casos mais graves detectados em crianças, espe-cialmente em países em desenvolvimento. Os sintomas incluem vômitos, náuseas e dor abdominal e a forma assintomática da doença é relatada com freqüência (Chalmers e Davies, 2010).

Acredita-se que a contaminação através da ingestão de água e alimentos contendo oocistos do parasito pos-sa ser a maior fonte de infecção da doença, aumentan-do a sua importância em saúde pública (Bouzid et al., 2008).

Em indivíduos portadores do vírus HIV, a criptos-poridiose manifesta-se de forma intensa, com quadros altamente espoliativos, podendo levar à desidratação e evoluir para a síndrome da má-absorção intestinal e caquexia (Pantenburg et al., 2009). A doença também é capaz de causar diarréia persistente, febre e dor ab-dominal (Ribeiro et al., 2004).

A presença de oocistos de C. parvum em fezes de bovinos implica necessariamente na contaminação ambiental por estes parasitos (Mawdsley et al., 1996), inclusive quando há a utilização de esterco para a adu-bação de solos a serem usados para o cultivo de horta-liças, técnica utilizada com o objetivo de obtenção de melhorias nas propriedades físicas e químicas do solo (Kuczynska et al., 2005).

A importância da adubação orgânica em hortaliças é amplamente reconhecida, principalmente nas folhosas, visando compensar as perdas de nutrientes ocorridas durante seu cultivo, havendo aumento na produção ao utilizar-se esterco bovino (Kimoto, 1993). Para tal, torna-se conveniente a fermentação e/ou compostagem destes resíduos objetivando a estabilização do material orgânico, redução dos riscos de disseminação de pató-

*Correspondência: [email protected]; [email protected]: (22) 2748-6072, (22) 2748-6056

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genos e aumento da disponibilidade de nutrientes para as culturas (Sediyama et al., 2000). Após este processo, o material orgânico é adicionado ao solo, podendo ser-vir como meio de exposição à população humana, in-clusive através da conseqüente contaminação da água, refletindo em grave problema em saúde pública. Já foi demonstrado que oocistos do gênero Cryptosporidium são capazes de permanecer em diversos tipos de solos (Mawdsley et al., 1996), resistindo a variações de tem-peratura e pH (Fayer e Nerad, 1996). Estes parasitos são capazes de continuarem infectantes no ambiente por períodos de até 18 meses, particularmente quando estão associados ao material fecal (Yang et al., 1996).

As fontes de contaminação de águas e alimentos por oocistos de Cryptosporidium spp. no Brasil são desco-nhecidas devido à carência de estudos epidemiológicos no país. Todavia, a rota de transmissão do oocisto do animal para os sistemas de abastecimento hídricos e para o alimento através do ambiente deve ser determi-nada, para que medidas estratégicas de controle sejam implementadas, visando a prevenção da contaminação destes sistemas.

Este trabalho teve como objetivo a detecção de Cryp-tosporidium spp. em esterco utilizado como adubo em hortas urbanas localizadas em Campos dos Goytaca-zes, RJ, Brasil, assim como determinar possíveis fato-res de risco para a contaminação do esterco.

Material e métodos

Foi realizado um estudo preliminar para o levanta-mento das hortas localizadas na área urbana da cidade de Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro através de listagem fornecida pela Prefeitura Municipal. Foram escolhidas 15 hortas urbanas que adicionam compos-tos orgânicos de origem bovina ao solo após a técnica de compostagem para o plantio. Este estudo foi reali-zado através de saídas para geo-referenciamento dos locais escolhidos.

Foram coletados 200 g de esterco após o processo de compostagem. As coletas foram feitas em três pontos: superfície, meio e base do montante de esterco, sendo coletados 200 g de cada ponto. As amostras foram co-locadas em tubos cônicos, identificados e refrigerados. As mesmas foram levadas ao Laboratório de Sanidade Animal, do Centro de Ciências e Tecnologias Agrope-cuárias para a continuidade dos procedimentos.

Os responsáveis pelas propriedades foram entrevis-tados, com intuito de avaliar o tipo de cultivo, a fonte de água utilizada para irrigação, as condições de higie-ne e a proveniência do esterco. Para as condições de higiene foram utilizados parâmetros como livre aces-so de animais domésticos e/ou seus dejetos às hortas, presença de tocas de roedores e presença de lixo ou entulhos no local.

Cerca de 1g de cada amostra foi fixado em solução de formol a 10% em tubos cônicos. As amostras fo-

ram concentradas através da Técnica de Ritchie modi-ficada (Allen e Ridley, 1970), e coradas pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada (Henriksen e Pohlenz, 1981). Após secagem, as lâminas foram observadas ao microscópio óptico, em objetiva de 100x (imersão).

Os resultados foram analisados estatisticamente atra-vés do Teste de Fisher (Fisher Exact Test), com 95% de intervalo de confiança, utilizando-se o programa Gra-phPad InStat (1996).

Resultados e discussão

Foram identificados oocistos do gênero Cryptospo-ridium nas amostras de esterco em oito hortas, sendo que, em todos os montantes positivos, tanto o ápice quanto a base e o interior apresentaram oocistos do protozoário. Portanto 24 (53,3%), das 45 amostras foram consideradas positivas. As localizações apro-ximadas das hortas, bem como as hortas positivas e negativas para o protozoário podem ser visualizadas na Figura 1.

Figura 1 - Localização aproximada das 15 hortas urbanas em Campos dos Goytacazes - RJ utilizadas para a colheita do ester-co e entrevistas. As setas indicam locais onde houve positividade para Cryptosporidium spp.

As origens da contaminação de alimentos por proto-zoários geralmente são as fezes, solo e água contendo materiais fecais e desprovidos de tratamento (Smith, 1998). A contaminação indireta por oocistos de Cryp-tosporidium inclui a utilização de esterco para aduba-ção do solo, e a distribuição do gado, fatos que podem ser agravados por chuvas fortes, levando os parasitos até lençóis de água subterrâneos e demais fontes de água (Carvalho, 2009) e, consequentemente, a diversos hospedeiros em diferentes regiões. Surtos em humanos


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relacionados à água superficial foram descritos, e as origens de contaminação foram atribuídas ao despejo de esgoto e ao escoamento de águas provindas de áreas agrícolas, principalmente pastagens ou locais em que o esterco contaminado havia sido aplicado ao solo (Fri-cker et al., 2002).

Já foi demonstrado que o adubo de origem fecal adi-cionado ao solo é capaz de fazer com que a área se torne um fator de risco para a criptosporidiose em hu-manos, e que trabalhadores rurais, possuem maior pro-babilidade de desenvolver a doença (Lake et al., 2007).

A contaminação do esterco e posteriormente da água ainda possui alguns agravantes: as densidades de con-taminação ambiental infectantes são suficientes para poluir o ambiente aquático, e os oocistos são bastante pequenos para atravessarem as barreiras físicas utiliza-das no processo de tratamento da água além de serem resistentes aos desinfetantes comumente empregados em seu tratamento (Smith, 1998).

Através das entrevistas realizadas com os responsá-veis pelas hortas foi observado que os locais dos culti-vos são terrenos cedidos pela prefeitura do município de Campos dos Goytacazes – RJ. O esterco utilizado é obtido tanto através da prefeitura, quanto de particu-lares, geralmente carroceiros, que coletam o esterco e vendem para os produtores.

Em relação ao cultivo, 100% das hortas plantavam alface, agrião, cebolinha, cheiro-verde, couve chinesa, chicória, salsa e espinafre, e o destino deste plantio era para consumo próprio, comercialização no próprio lo-cal e/ou pequenos comércios e uma parte da plantação era enviada para algumas creches da prefeitura.

O abastecimento fluvial em cinco das 15 hortas ocor-ria através de poços no próprio local da horta, já nas de-mais hortas, a água era oriunda da companhia de água.

Analisando a Tabela 1, nota-se que não houve dife-rença significativa entre a positividade para Cryptos-

poridium spp. em adubos utilizados para o cultivo de hortaliças e para o cultivo de leguminosas, havendo portanto, contaminação em ambos os tipos de planta-ções, sendo p = 0,11.

Adicionalmente, pode-se observar que não houve diferença significativa para a positividade de Cryptos-poridium spp. nas hortas as quais utilizavam diferentes fontes de água, já que p = 0,11, demonstrando que exis-te a contaminação do esterco independente da fonte de água utilizada. Em pesquisa desenvolvida no Canadá, bezerros cuja principal fonte de água provém de poço estão associados com menores concentrações de oo-cistos eliminados nas fezes, ao contrário de animais com acesso a fontes de água tratada parada (Heitman et al., 2002).

Oocistos de Cryptosporidium podem permanecer viáveis na água por mais de 140 dias. Nos EUA exis-tem relatos de contaminação por oocistos em cerca de 90% das águas superficiais, como rios e lagos (Sim-mons III et al., 2001), assim como existem diversos relatos de presença de oocistos do gênero Cryptospo-ridium em águas de rio e nascentes no Japão (Tiang-tip e Jongwutiwes, 2001), Taiwan (Watanabe et al., 2005), Brasil (Farias et al., 2002), entre outros.

Com relação à origem do esterco utilizado na horta, foi demonstrado que não houve diferença significati-va entre o esterco de origem conhecida e desconhe-cida, sendo p=0,31. O produto, quando de origem desconhecida, era adquirido através de vendedores ambulantes, que costumam levar o esterco até a horta.

Hoar et al. (1999), pesquisaram a prevalência de Cryptosporidium no esterco de bovinos confinados e em amostras coletadas no ambiente, e concluíram que 0,17% estavam positivos. Estes resultados são semelhantes ao estudo realizado por Walker et al. (2001) em que 0,18% das amostras coletadas pos-suíam oocistos do protozoário. Quando a pesquisa

Resultado Variável Total Valor de p1

Fonte de água Poço Tratada

Positivo 1 7 80,11

Negativo 4 3 7

Produto cultivado Hortaliças Leguminosas

Positivo 1 7 8 1,00

Negativo 1 6 7

Origem do esterco Prefeitura/Particular Desconhecida

Positivo 5 3 80,31

Negativo 2 5 7

Higiene do local Boa Ruim

Positivo 8 0 80,20

Negativo 5 2 7

Tabela 1 - Risco relativo da presença de Cryptosporidium spp. em amostras de esterco de 15 hortas urbanas em relação às variáveis analisadas

1Fisher’s Exact Test (CI=95%)


26

foi feita com fezes frescas, o resultado foi seis vezes maior, sugerindo que o material fecal, após deposita-do no ambiente, pode sofrer influências ambientais que reduziriam a carga efetiva do parasito no esterco (Walker et al., 2001). Estes dados demonstram que o tempo e as influências ambientais não foram capazes de eliminar os oocistos do material fecal.

A maioria das hortas visitadas possuía condições de higiene consideradas boas (86,7%) e em outras, cujas condições de higiene foram consideradas ruins, havia a presença de animais como cães, roe-dores, galinhas, gatos, além de ausência na proteção de poços e de locais de armazenamento da água uti-lizada para irrigação. Observando-se ainda os dados da Tabela 1, pode-se notar que não houve diferença significativa a positividade para Cryptosporidium entre hortas com condições de higiene boas e em outras cujas condições de higiene foram considera-das ruins, p = 0,20.

Almeida et al. (2008) não observaram diferenças significativas na positividade para este parasito entre criações de bovinos com condições de higiene consi-deradas boas (41%) e em outras cujas condições de higiene foram consideradas ruins (20%). Da mesma maneira, Maldonado-Camargo et al. (1998), não ob-servaram diferenças significativas entre a eliminação de oocistos e as práticas higiênicas em animais de produção, o que nos leva a sugerir que os protozoá-rios estão presentes nos animais e no ambiente, inde-pendentemente das condições de higiene encontradas nas diferentes propriedades rurais e urbanas.

As amostras de esterco foram coletadas de três pon-tos diferentes do montante de esterco: ápice, interior e base, e foram detectadas 24 amostras positivas e 21 negativas.

Com relação aos pontos de coleta, o gênero Cryptos-poridium esteve presente em todo o montante de ester-co independente de sua altura e armazenamento. Ou seja, mesmo quando o ápice e a base tiveram em maior contato com a luz solar, os oocistos persistiram.

Conclusão

Observou-se contaminação por Cryptosporidium spp. em grande parte das hortas urbanas em Campos dos Goytacazes – RJ. Diferentes condições de higie-ne, origem do esterco e do abastecimento hídrico, o processo de compostagem e a localização do ponto de coleta no monte de esterco não foram capazes de eliminar o parasito do adubo.

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29

RPCV (2013) 108 (585-586) 29-38

Relationship between HACCP controls, pathogen reduction program and meat quality during cattle slaughter process: One year survey in a Brazilian exporting abattoir

Relação entre os controles da APPC, programa de redução de patógenos e qualidade da carne no abate de bovinos: um ano de pesquisa em um abatedouro-frigorífico de exportação brasileiro

*Kelly Caselani1 , Luiz F. Prata1, Camila B. Prata1, Paula A. Bizari2, Gener T. Pereira1

1UNESP Univ Estadual Paulista, Jaboticabal, Brasil.2Minerva Dawn Farms, Barretos, Brasil.

*Correspondência: [email protected] Tel: (16) 3209-2624.

Resumo: Os procedimentos do plano APPCC - Análise de Peri-gos e Pontos Críticos de Controle no Brasil são recentes e restri-tos às indústrias internacionais de comércio. Este trabalho teve por finalidade avaliar as relações entre os controles microbioló-gicos, a qualidade de higiene dos ambientes de processamen-to, da carcaça e sua segurança sanitária, pela monitorização de Salmonella spp. e E. coli O157:H7. Com duração de um ano, a pesquisa foi desenvolvida em abatedouro-frigorífico habilita-do à exportação localizado no Estado de São Paulo, Brasil. Os resultados da Contagem Bacteriana Total (CBT) em superfícies de contato com alimentos estiveram frequentemente próximos àqueles encontrados na literatura. Diferenças estatísticas foram encontradas quando fatores como meses, estações, diferentes áreas do frigorífico e amostras de superfícies foram analisadas. Os fatores mais críticos foram respectivamente, meses quentes e chuvosos, época das chuvas, sala de abate e aventais, todos com um alto índice de resultados inaceitáveis. Um número elevado de amostras ambientais foi positivo para Listeria spp. e L. mo-nocytogenes. As contagens na carcaça para E. coli mostraram-se bastante satisfatórias e inferiores às encontradas na maioria dos trabalhos pesquisados. Embora a CBT em carcaças tenha sido menor à encontrada na literatura, nenhum dos resultados foram classificados como insatisfatórios. E. coli O15:H7 e Salmonella spp. não foram identificadas em nenhuma amostra de carcaça. Os achados manifestaram-se favoravelmente à eficácia dos con-troles higiênico-sanitários e confirmaram a escolha acertada de procedimentos no âmbito do programa APPCC, impedindo que importantes patógenos alcancem as superfícies das carcaças.

Palavras-chave: Bovino, APPCC, segurança alimentar, Escheri-chia coli enterotoxigênica, Salmonella, Listeria monocytogenes

Summary: HACCP procedures in Brazil are still recent and restricted to international trade industries. This investigation evaluates the relationships between microbiological controls, the hygienic quality of processing environments, the quality of carcasses and their safety by monitoring Salmonella spp. and E. coli O157: H7 contamination. During one year, the research

was developed in a slaughterhouse, enabled to export, located in the state of São Paulo, Brazil. Total Viable Count (TVC) results in food-contact surfaces were often close to those found in the litera-ture. Statistical differences were found when factors such as specific months, seasons, different abattoir areas or abattoir and surfaces sampled were analyzed. The most critical factors were, respectively, hot and rainy months, wet season, slaughter-room and aprons, each with high unacceptable results. A high rate of environment samples was positive for Listeria spp. and L. monocytogenes. The carcass counts for E. coli are shown to be largely satisfactory and lower than rates registered in most studies. Although TVC rates in carcasses were lower than those found in the literature, no results were rated as unsatisfactory. E. coli O157: H7 and Salmonella spp. were not identified in any carcass sample. The findings favorably manifest ef-ficacy in hygienic-sanitary controls and confirm the right choice of procedures within the HACCP plan which prevent important patho-gens to reach carcasses’ surface.

Keywords: Bovine, HACCP, food safety, Enterotoxigenic Es-cherichia coli, Salmonella, Listeria monocytogenes

Introduction

The problems involving meat consumption safety during recent decades are still a concern for consum-ers. Owing to the issue’s serious consequences, strict-ness and even new relationships between cause and ef-fect exert great impact on consumers’ acceptance, on the global food trade, and especially on scientific com-munity, to the point that they impose new paradigms for food supply, such as Safe Food Program.

Coupled to meat inspection, the new model imposed a series of routinely check-ups applied to the process of cattle slaughter and meat producing. It is expected that the endorsement of these practices provides the timely implementation of corrective measures to correct po-tential problems before they become serious. Results

Caselani K et al. RPCV (2013) 108 (585-586) 29-38

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should be divulged and freely shared as experiences that deepen scientific knowledge on the epidemiology of food-borne diseases, in accordance with the princi-ples of Risk Analysis.

Meat and meat by-products are considered to be a major source of food-borne diseases and the most im-portant link between food-producing animals and hu-mans (Mayerhofer et al., 2004). According to Gracey et al. (1999), from the European point of view, the major source of carcass contamination in the meat industry is the live animal, particularly during the winter months when animals are confined and have dirty bodies. Skin and hair, dirty with feces, may carry millions of bacte-ria to slaughtering and meat-processing environments.

Since bacterial contamination on the carcass surface is an inevitable consequence of the skinning and other slaughtering processes, special care before, during and after slaughter may reduce to a minimum the initial lev-el of carcass contamination. Care must be the hallmark during the entire meat process, namely, during refrig-eration, boning, processing, storage, transportation, dis-tribution, including treatment at the consumers’ home (Minihan et at., 2003; Pardi et al., 2006). Most food is potentially hazardous only after the principles of hy-giene, cleaning and disinfection have been trespassed. On the other hand, if food is submitted to conditions that permit the entry and the multiplication of infectious or toxigenic organisms, it will surely be a vehicle for the transmission of diseases (ICMSF, 2000).

Control practices under the Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP) system are the most effective measures in preventing microbial contami-nation of carcasses during slaughter (Bolton et al., 2001). In fact, when applied during all the stages of meat processing against all plausible risks of carcass contamination, they reduce the risk of food-borne ill-ness. Nevertheless, since routine monitoring of each pathogen is expensive, time consuming and difficult, the use of indirect techniques, such as appropriate in-dicator organisms, is more convenient and practical. In fact, data provided by Arthur et al. (2004) showed the co-relationship between the presence of indicator micro-organisms and that of E. coli O157: H7, which is precisely what, may be expected of a good indicator.

After analyzing 800 cattle carcasses from high-capac-ity abattoirs in Switzerland, Zweifel et al. (2005) report-ed TVC mean rates ranging between 2.1 and 3.1 log

10

CFU. cm2. Tergney and Bolton (2006) sampled 180 cat-tle carcasses during the process of skinning and gutting and registered TVC mean of 3.0 log

10 CFU.cm2. When

McCleery et al. (2008) analyzed the effect of skin hair removal before and after the slaughtering process, they reported mean TVC rates of 3.1 log

10 CFU.cm2 in the

case of naturally clean animals, 3.2 for animals shaved after slaughtering, and 3.0 for those shaved before slaughter. Zweifel et al. (2008) analyzed 535 cattle car-casses from small abattoirs and registered TVC scores ranging between 2.7 and 3.8 log

10 CFU.cm2.

In their discussion on warm beef carcass Martínez et al. (2010) reported a population mean of 3.91 log

10

CFU.cm2 for viable microorganisms. Whereas Gill and McGinnis (2000) found aerobic bacteria populations ranging between 1 and 8 log

10 /glove in all stainless

steel gloves sampled in Canada. Shale et al. (2006) in South Africa reported viable bacteria over 104 CFU.cm2 in all boning room sampled areas. Eustace et al. (2007) analyzed knives, which had been used by workers dur-ing the slaughter process, immediately after washing, and detected TVC rates between 1.78 and 2.18 log

10

CFU.cm2 on surfaces which had any contact with food.Scanty news exists with regard to Brazilian produc-

tion mainly due to two well-defined and different mo-ments: the slaughter of animals finished on pasture and the slaughter of cattle from feedlots. Current study evaluates results from operational and environment controls routinely applied to the slaughter of cattle and their relationship with carcass quality through the em-ployment of microbiological indicators and the search for specific pathogens (E. coli O157:H7, Salmonella spp., Listeria spp. and L. monocytogenes) throughout a one-year period.

Material and methods

Current investigation was undertaken in an abattoir located in the state of São Paulo, Brazil, qualified for national and international trade, with a slaughtering capacity of 850 animals per day. The experiment lasted from November 2008 to October 2009.

Sampling of the environment

Contact surfaces - Following a randomized pro-cedure, samples from variable sites and objects were taken for Total Bacterial Count or Total Viable Count (TVC). Samples, retrieved by a sterile swab moistened with 10mL of buffered peptone water, were collected before the start of industrial production and immedi-ately after rinsing. A sterile template was used (20cm2) on flat surfaces over which the swab was firmly rubbed 10 times upwards (bottom to top) and at a 45-degree inclination. Swab stems were broken on the inside edge of the tube and immersed in the culture medium (Silva et al., 2001).

Listeria sp. isolation - Samples from surface drains, floors, coolers, conveyors, tables, saws and products were obtained with sterile cellulose sponges which were moistened and then rubbed 10 times upwards (from bot-tom to top) across the surface. Samples from places of difficult access were the primarily focused for retrieval. The sponges were placed in sterile plastic bags contain-ing 10mL broth BAX® System Listeria. Such monitor-ing, comprising at least six (6) sampling points, was part of a weekly routine plan (Dupont, 2005).


31

Choice of sites and objects (equipment or installa-tion) to be sampled was randomized so that results with regard to the several industrial environments would not be masked. One or more repetitions were required when tests were positive so that the effectiveness of corrective actions taken would be checked. Consequently, number of samples from each site was left undetermined.

Samples from carcass surfaces - The samples were collected by a non-destructive method, following Euro-pean Commission Regulation (EC) No 2073/2005 (CE, 2005). Sterile cellulose sponges were moistened and rubbed on a slope of approximately 45°, 10 times hori-zontally and 10 times vertically, on an area of 100cm2 (10cm x 10cm), surrounded by a metal template, com-prising 4 regions of the warm carcass, namely, neck, chest, flank and rump; and on 3 regions of the cold carcasses, namely, neck, flank and rump.

Sponges were placed in sterile plastic bags (Nasco) containing 10mL of buffered peptone water (BPW) to estimate Total Viable Count (TVC), total coliform (TC) and E. coli. Random samples were retrieved once a week, forming a complete year cycle, for the evaluation of TVC on the surface of the hot carcass (after clean-ing and before chilling). There were 114 and 86 samples from carcasses of animals respectively finished on pas-ture and in feedlots. Since search for Coliform (Total coliform) was not comprised within routine operational controls, its sampling was limited to 100 carcasses, or rather, 50 for each type of termination. For the detec-tion of E. coli in chilled half-carcasses, 675 samples, averaging 56.3 samples per month, were collected and analyzed during the above-mentioned period.

Further, 90mL of BPW, completing 100mL, were added to bags with the sponges for TVC estimates. In the case of total coliform and E. coli counting, 15mL were added, totaling 25mL. Homogenization was undertaken in a stomacher, during 1 minute, at 200 rpm. PetrifilmR techniques were used according to AOAC Official Methods, or rather, Petrifilm AC (ISO 4833:2003) was used for TVC and Petrifilm EC (ISO 21528-2:2004) for counting total coliform and E. coli.

The search for Salmonella spp. in surfaces of cold car-casses was carried out in cycles of 82 samples, with at least a random sample per day. After collection, samples were mixed with 50mL BPW in plastic bags, completing 60mL. For the detection of E. coli O157: H7, 90mL TSB were added to samples, completing 100mL. These sam-ple bags were homogenized in a stomacher for 1 minute, at 200 revolutions per minute (rpm), and incubated in an

oven at 36 ± 1°C for 18 to 24 hours. An automated PCR technique (BAX® System – DuPont Qualicon) was used to detect Salmonella spp. and E. coli O157:H7.

For the detection of Listeria spp., 25mL of broth BAX® System Listeria were added to bags, to complete 35mL. Bags were then homogenized in a stomacher for 1 minute, at 200 rpm, and incubated in an oven at 30±1°C for 22 to 26h. After applying the automated PCR technique (BAX® System), positive samples were tested for L. monocytogenes. Aliquots of 0.1mL of pre-enrichment medium were transferred to 10mL vials with screw caps and 9.9mL of a second enrichment medium (MOPS-bleb) were added. The tubes were then incubated at 36 ± 1°C for 18 to 24 hours.

BAX® System (DuPont Qualicon) (Dupont, 2005) - After pre-enrichment, samples were analyzed by PCR reaction, namely, BAX® System. A 5μL-aliquot of each sample was added to tubes with 200μL lyses-protease. Tubes were first taken to the 1st block heater at 55°C for 60 min for analysis of Listeria spp. and L. monocytogenes. Tubes were afterwards transferred to the 2nd block heater at 95°C for 10 min. and then placed on the cooling block for about 5 min. Aliquots of 50μL were transferred to tubes containing PCR inserts, housed in a rack. Finally, the rack containing the tubes was taken to the PCR ther-mocycler for subsequent detection of the pathogen.

Along with the samples and when changes of kit batches occurred, positive control tests were performed with bacterial strains acquired from the Adolfo Lutz Institute (IAL, SP); tests for E. coli O157:H7 were undertaken with a strain provided by Oswaldo Cruz Foundation (Fiocruz, RJ).

Criteria for the interpretation of results - Although there are many variations in the literature and in dis-tinctions between hygienic criteria, employed to assess whether operations are being carried out properly, and food safety criteria, used to evaluate consumption se-curity, uniform criteria established by the Food Stand-ards Agency, UK (Table 1) were adopted as interna-tional standards (FSA, 2010). In the case of sampling with swabs or sponges on carcass surfaces, test results were divided into three categories: satisfactory, fulfill-ing complete or adequate quality status; Acceptable, an intermediate result understood to be of marginal quality; Unsatisfactory, results are below appropriate or expect-ed standard, featuring unhealthy conditions. Decision 2001/471/EC (EC, 2001) for verification of cleaning and disinfection established only two categories in the case of TVC: acceptable and unacceptable.

Table 1 - Interpretation schedule of results for different methods of analysis according to international standards established by the Food Standards Agency - UK, 2005.

Method Interpretation / Unit Analysis Satisfactory Acceptable Unsatisfactory

TVC - Surface CFU.cm2 ≤10 --- >11TVC - Carcass Log10 CFU.cm2 ≤ 2.8 > 2.8 and ≤ 4.3 > 4.3

Coliform Log10 CFU.cm2 ≤ 0.8 > 0.8 and ≤ 1.8 > 1.8E. coli Log10 CFU.cm2 ≤ 0.8 > 0.8 and ≤ 1.8 > 1.8


32

Results and Discussion

Control of Food Contact Surfaces

Total Viable Count – Figure 1 shows the com-parison of monthly acceptable and unacceptable (or unsatisfactory) results for TVC bacteria in different contact surfaces. Table 2 comparatively shows ac-ceptable and unacceptable results in percentages for each of the main sections of the abattoir. The aver-age value for TVC was 7.75x10 ± 1.14 x102 CFU.cm2 (1.9 ± 2.1 log10 CFU.cm2), ranging between 0 and 4.6 x102 CFU.cm2 (2.7 log

10), with differences between

months and between industrial sections sampled (p <0.0001). Results showed acceptable hygienic con-dition in 609 samples (51.1%). The remaining 583

samples (48.9%) showed unacceptable results and re-quired interventions by corrective actions.

Figure 1 - Comparative results of conditions of all contact sur-faces sampled monthly and determined by the TVC method, du-ring the period of one year.

Figure 2 combines monthly data of all sampling sites and highlights seasonal constraints linked to climatic factors such as the rainy or dry season and temperature variations, excluding other causes of variation. It may be observed that during the rainy and hot season, from No-vember to February, the percentage of unacceptable re-sults was systematically higher than the acceptable one. On the other hand, the reverse has been observed dur-ing the July-October period with dry weather and warm temperatures, or rather, acceptable results are more fre-quent. The average population of microorganisms in the wet season (9.92 x10 ± 1.21 x102 CFU.cm2) was higher and statistically different (p <0.0001) than that found in the dry season (6.3 x10 ± 1.06 x102 UFC.cm2), with 195 (41.5%) acceptable and 275 (58.5%) non-acceptable, and 414 (57.3%) acceptable and 308 (42.6%) non-acceptable results for the rainy and dry seasons respectively.

Figure 2 - Comparison of acceptable and unacceptable results for bacteria TVC on contact surfaces of total samples with re-gard to rainy and dry seasons.

In the United States, Eisel et al. (1997) reported TVC results between 2.2 and 3.7 log

10 CFU.cm2, showing

slightly higher rates than found in current study, with highest rates in the abattoir mats. According to the au-thors, the contact surfaces were probably not important sources for this kind of contamination. However, effec-tive cleaning, sanitation programs and procedures for safe handling are important to ensure a high quality product.

Among the areas sampled, the aprons had the high-est rate of unacceptable results, amounting to 70.5%, followed by samples from equipment (saws / slicers / grinders) with 51.8%. The above is an operational prob-lem with dire need for corrective measures. Moreover, samples from the surface of utensils, such as knives and hooks, were acceptable at 63.5%, with significant differences between them (p <0.0001).

In Australia, Eustace et al. (2007) analyzed knives used by operators in the slaughter process, immediate-ly after cleaning, and obtained a TVC average ranging between 1.78 and 2.18 log

10 CFU.cm2, similar to the

overall average observed in our study. Gill and McGin-nis (2000) found populations of aerobic bacteria in all stainless steel gloves sampled in Canada, with rates between 1 and 8 log

10 /glove and, in the case of less

used rubber gloves, with rates <2 log10

. With regard to equipment, high estimates of >6 log

10 / sample were

detected in most debris found in areas that remained unclean after the cleaning process.

In the slaughter sector, 37.1% (79) of samples were classified acceptable and 62.9% (134) unacceptable.

Table 2 - Total Viable Count in samples of various surfaces in different sectors of the slaughterhouse, according to EC Decision 2001/471/EC, Jaboticabal SP Brazil, 2010.

Interpretation Slaughter Cuts AbattoirBoning

SectionsOffal Canning Portioned Total

Acceptable 79 109 107 154 61 99 609

% 37.1 58.3 48.0 68.4 41.8 50.0 51.1

Unacceptable 134 78 116 71 85 99 583

% 62.9 41.7 52.0 31.6 58.2 50.0 48.9

Total 213 187 223 225 146 198 1,192


33

Unacceptable results higher than acceptable ones were consistent in 10 out of the 12 months under analysis. The highest levels of acceptable results in the carcass cutting section were verified between July and October. Excepting March, results for the remaining months of the trial produced more unac-ceptable results than acceptable ones. In the case of results from the boning room, acceptable and unacceptable ones alternated throughout the whole period. In the edible offal section, only November showed acceptable results consistently lower than those not acceptable.

During May 2009 there was no sampling in the canning sector. The highest rates of unacceptable results occurred between November and April. Ac-ceptable results were higher than unacceptable ones only during July and August. Whereas most of the unacceptable results for the portioned meat section occurred during the December 2008-April 2009 pe-riod, most of the acceptable results were met with between July and October.

Listeria spp. – The search for Listeria spp. in the environment was undertaken in 411 samples, of which 84.9% (349) were negative and 15.1% (62) were positive, the latter with a relatively high sample rate (Figure 3). Similarly high rates and relative per-sistence occurred in the abattoir sections, with 5.1% (21) of total samples positive for Listeria monocy-togenes. Except for April, July, August and Septem-ber 2009, L. monocytogenes was detected in at least one sample during all the other months of the period.

Figure 3 - Monthly results of the occurrence of Listeria spp. and Listeria monocytogenes in environment samples from the abat-toir sections during the period under analysis.

Although legal criteria do not limit estimates for Listeria spp. and L. monocytogenes, positive results (more than two) for Listeria spp. retrieved from the environment require testing of the final product to as-sess its safety. Thus, high values, such as those found in current study, make the evaluation of prevention programs mandatory by seeking why contamination was absent in the final product (beef carcass).

According to the chi-square test, the presence of Listeria spp. differed significantly from month to month (p = 0.0002), even though there no difference (p = 0.2051) in its occurrence when rates for the dry and wet seasons are compared. Twenty-two out of

176 samples analyzed (12.5%) during the wet season were positive for Listeria spp. This rate was simi-lar to that found for the dry season, with 40 (17.0%) positive samples out of 235 surveyed. Gudbjornsdót-tir et al. (2004) reported similar results by analyz-ing 1,689 samples collected from the environment in meat, seafood and poultry processing plants, with lack of seasonality in the frequency of L. monocy-togenes.

Rates close to those of current study were described by Samelis and Metaxopoulos (1999) in Greece, with Listeria spp. in 14.3% of sampled equipment. How-ever, L. monocytogenes, indicating low efficiency in disinfection procedures, was reported in 68.8% of samples. Results were somewhat lower than those reported by Gudbjornsdóttir et al. (2004) for abat-toir environment samples in Europe, whose L. mono-cytogenes incidence rate amounted to 11.9%, with a high percentage (65.8%) originating from equip-ment, conveyors, bins and other carriers. These au-thors showed that even after cleaning, 11.5% of the samples were still contaminated with Listeria spp. and 8.3% with L. monocytogenes, indicating inad-equate cleaning procedures. In Brazil, Barros et al. (2007) found higher Listeria spp. levels than those previously reported, or rather, 51.4% and 35.4% of samples respectively from equipment surfaces and environments.

Statistical difference between tested surfaces (p <0.0001) has also been reported. In fact, the floor was the most contaminated surface with 30 (18.5%) positive samples for Listeria spp. and 8 for L. mono-cytogenes, followed by drains with 22 and 8 positive samples respectively.

Listeria spp. was detected in the slaughter room of the abattoir only during June and August, when climate conditions were dry and cold. In this case, out of the 56 samples analyzed throughout the year, 2 samples (3.6%) were positive. When the refrigera-tion chambers were investigated, Listeria spp. was reported during December and February, May to July, and October, with 9 positive samples (14.1%) out of 64 samples collected and analyzed. The month of June showed the highest rate of positive results, with 3 samples, albeit none was L. monocytogenes. During all the months analyzed, except in April, Lis-teria spp. was detected in the boning room section in at least one sample. There were 21 (18.4%) positive results from 114 analyzed samples. Further, there were 8 (14.5%) positive samples for Listeria spp. out of the 55 samples collected and analyzed in the can-ning section.

Ten (18.9%) samples out of 53 collected in the carcass cutting section resulted positive for Listeria spp. but none for L. monocytogenes. In Argentina, Marzocca et al. (2004) isolated L. monocytogenes in 6.7% of samples.

E. coli – E. coli counting was undertaken in 675 cold carcasses, with an average of 56.3 tests per


34

month or more than two samples per working day (Figure 4). Thus, 605 (89.6%) were classified sat-isfactory; 19 (2.8%) acceptable and 51 (7.6%) un-satisfactory, with significant differences between months (p<0.001). The average population of E. coli was 0.21±0.51 log

10 CFU.cm2, ranging from 0 to 1.81

log10

CFU.cm2 and an incidence of 147 (0.22%) posi-tive samples.

Figure 4 - Monthly results of E. coli counting method for sam-ples from chilled carcasses during the period of one year, classi-fied as Satisfactory, Acceptable and Unsatisfactory.

Figure 4 shows that the unsatisfactory results were re-stricted to the warmer and humid months of the year, from November to March, with the exception of July and Octo-ber, with 1 sample each. In contrast, acceptable results were concentrated between June and October, when tempera-tures were milder and the weather drier. Satisfactory re-sults were observed in 228 (81.7%) samples during the wet season, with 2 (0.7%) acceptable samples and 49 (17.6%) unsatisfactory ones and a mean of 0.38 ± 0.68 log

10 CFU.

cm2; during the dry season, 377 (95.2%) were classified satisfactory, 17 (4.3%) acceptable and 2 (0.5%) unsatisfac-tory, with an average of 0.10 ± 0.28 log

10 CFU.cm2.

Skinning operations were considered primary sources of fecal contamination of cattle carcasses by Tergney and Bolton (2006). E. coli counts were relatively low and, according to the authors, this fact represented a re-duced risk for food safety since this group included seri-ous pathogens such as Salmonella and E. coli O157: H7.

Comparative Finishing Samples - Pasture x Feedlot

TVC and Coliform – Results for a total of 200 carcass samples undertaken with the TVC bacteria method were satisfactory in 177 samples (88.5%), ac-ceptable in 23 samples (11.5%) and unacceptable in 0 samples (0%). Further, in the case of coliform bacteria (Total Coliform), 84 samples (84.0%) were satisfac-tory and 11 acceptable, while the other five samples were classified as unsatisfactory

Two hundred samples of hot carcasses were analyzed for bacteria TVC (UFC/cm2), specifically, 114 samples from cattle bred and finished on pasture, with 98 (86%) satisfactory and 16 (14%) acceptable results. When samples from 86 carcasses from cattle terminated in feedlots were analyzed, 79 (91.9%) were classified sat-isfactory and 7 (8.14%) acceptable (Figure 5).

Figure 5 - Comparison of results of bacteria TVC in chilled car-casses of cattle according to criteria of classification and groups of samples by cattle finishing systems.

Although no significant differences (p = 0.4583) occurred between the two groups, satisfactory results from feedlot were slightly higher than those from cat-tle raised on pasture. The average population of mi-croorganisms found was 1.67 ± 0.65 log

10 CFU.cm2

for carcasses of cattle finished on pasture and 1.28 ± 0.63 log

10 CFU.cm2 for termination in feedlots, ranging

from 0.40 to 3.18 log10

CFU.cm2 and 0.18 to 2.80 log10

CFU.cm2, respectively, for pasture and feedlot.

After skinning, the data obtained by Jardim et al. (2006) showed average rates slightly higher than those found in our study. Sumner et al. (2003), in Australia, using Petrifilm, reported mean of 1.72 log

10 CFU.cm2,

while Pearce and Bolton (2005), in Ireland, found aver-age ranges between 1.80 and 1.90 log

10 CFU.cm2 for sam-

ples retrieved by cellulose swab acetate and polyurethane sponge, respectively. Hutchison et al. (2005), using the swab technique, reported an average value of 1.40 log

10

CFU.cm2 for TVC, and Gill and Badoni (2010), conduct-ing a survey in Canada, with 25 cattle carcasses sampled by people with and without experience, reported values ranging from 1.20 to 1.60 log

10 CFU.cm2.

Gill et al. (1998) showed higher rates than those given in current study after washing of carcasses in slaughterhouses in Canada, with TVC average values ranging between 2.78 and 3.70 log

10 CFU.cm2. Simi-

lar results were observed in Belgium by Ghafir et al. (2008), with averages ranging between 2.88 and 3.19 log

10 CFU.cm2; Martínez et al. (2009) in Spain, reveal-

ing levels of total count of viable microorganisms be-tween 3.10 and 4 log

10 CFU.cm2 and by Martínez et

al. (2010), also in Spain, whose average rate was 3.91 log

10 CFU.cm2.

Taking into consideration the strict criteria recom-mended by the Food Standards Agency - UK (FSA, 2010), no sample from carcasses in current study ex-ceeded the limit of 2.0x104 CFU.cm2, and therefore, no result was classified as unsatisfactory. This is mainly due to the elasticity of the range of acceptable level which varies from 6.31x102 to 2.0x104 CFU.cm2 (2.8 to 4.3 log

10). In spite of the wide variation in estimates

within the group of cattle finished on pasture and in feedlot described above, it may be affirmed that sam-


35

ples were obtained in better hygienic conditions for the proper execution of operational controls and good manufacturing practices than those in other researches.

When samples of chilled carcass were subjected to TC counting (Figure 6), the results ranged between 0 and 1.26 log

10 CFU.cm2 for pasture cattle, and be-

tween 0 and 1.88 log10

CFU.cm2 for feedlots, with an average of 0.13 ± 0.31 log

10 and 0.39± 0.59 log

10 CFU.

cm2, respectively and a statistical difference between the types of cattle finishing system (p=0.0197). A nu-merical reverse occurred in E. coli counting (Figure 7), or rather, higher values for carcasses finished on pasture (0.38 ± 0.68 log

10 CFU.cm2) when compared to

those from feedlots (0.31 ± 0.61 log10

CFU.cm2), albeit without any statistical difference (p=0.8989). In both feeding systems, the range was 0 to 1.81 log

10 CFU.

cm2. These results agreed with those found by Fegan et al. (2004a), by Jardim et al. (2006) and McEvoy et al. (2004). According Gill et al. (1998), Coliform and E. coli counting may be used for the identification of Critical Control Points as well as for procedure control.

Figure 6 - Comparison of results of Total Coliform count in chil-led carcasses of cattle according to criteria of classification and groups of samples by cattle finishing systems.

Figure 7 - Comparison of results for E. coli count in chilled car-casses of cattle according to criteria of classification and groups of samples by cattle finishing systems.

According to the criteria of the Food Standards Agen-cy, UK (FSA, 2010), 45 (90%) and 39 (78%) were con-sidered satisfactory for Total Coliform counts; 5 (10%) and 6 (12%) were acceptable for cattle finished respec-tively on pasture and in feedlot. Unsatisfactory samples were detected only in confined animal carcasses, total-ing 10% (5) and without statistical difference between cattle finishing systems (p = 0.0633). The results of E. coli count were rated as satisfactory in 122 (81.9%) samples, acceptable in one (0.7%) sample and unsatis-factory in 26 (17.4%) samples from cattle finished on pasture. Similar results, with no significant differences (p = 0.3722), were described for termination in feedlots, with 138 (85.2%) samples considered satisfactory, 3 (1.8%) acceptable and 21 (13%) unsatisfactory.

Following the standards adopted by the European Commission (CE, 2005), 100% (50) of samples from cattle finished on pasture were classified as satisfactory for Coliform count, 46 (92%) and 4 (8%) were classi-

Table 3 - Results of different methods of analysis according to international standards established by the Food Standards Agency - UK, 2005, Jaboticabal SP Brazil, 2010.

Methods Criteria Finishing on PastureSamples (n) Results %

Finishing in FeedlotsSamples (n) Results %

TVC 114 86

Satisfactory 98 86.0 79 91.9

Acceptable 16 14.0 7 8.1

Unacceptable 0 0.0 0 0.0

Coliform Count 50 50




E. coli 149 162




E. coli O157:H7 50 Absence 50 Absence

Salmonella spp. 196 Absence 68 Absence


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fied as satisfactory and acceptable respectively, for cattle in feedlot, with significant differences between feeding systems (p = 0.0218). This difference contradicts the Food Standards Agency classification, probably due to a greater range for satisfactory results (≤ 1.5 log

10 CFU.

cm2). When results from E. coli samples are taken into account, 123 carcasses (82.6%) from animals raised on pasture and 141 carcasses (87%) from animals raised in confinement were found satisfactory. Samples were ac-ceptable in 17.4% (26) of samples from pasture cattle and 13% (21) of samples from cattle feedlot, with no statistical difference between the groups (p = 0.2698).

Table 3 shows that in 100 samples of chilled car-casses, 50 from each group, none was positive either for E. coli O157: H7 or for Salmonella spp. The latter result originated from 196 samples of animals raised on pasture and 68 from animals of feedlots. Results are consistent with those found in the estimates of TVC, Coliform and E. coli counting, considered to be sat-isfactory at 88.5%, 84% and 83.6%, respectively, and according to those found in recent literature (Brichta-Harhay et al., 2008; Fegan et al., 2004b; Madden et al., 2001; Meichtri et al., 2004; Rigobelo et al., 2006).

Conclusions

TVC results in food-contact surfaces were often close to those found in the literature. A relatively large number of samples did not comply with acceptable hygienic standards and indicated the need for imple-mentation of corrective actions, even though distinc-tion between standard criteria was very close. Statisti-cal differences were found between months of the year, seasons, different areas or abattoir sections and surfac-es sampled. The most critical situations under analysis were, respectively, the hot and rainy months, the wet season, the slaughter-room and the aprons, featuring higher unacceptable results.

A relatively high number of samples from the ab-attoir environment were positive for Listeria spp. and L. monocytogenes, with no statistical differences for months, sectors and areas sampled. The floors and drains, mainly in the boning room section, had the highest incidence. Since there was no significant dif-ference between the seasons, the relative persistence of these microorganisms in the environment of slaughter is obvious.

The carcass counts of E. coli are largely satisfactory and lower than those in most studies. Albeit with dif-ferences for months and seasons, unsatisfactory results were more concentrated during the wet season. No significantly differences were found when systems of cattle finishing were compared, although high counts and poor results in animals from pasture were reported. TVC results in carcasses were lower than those found in the literature, with no results rated as unsatisfactory. However, higher scores were registered in carcasses

of cattle finished on pasture. The scores for Colif-orm count were significantly different when finishing systems were taken into account, with higher counts in carcasses of cattle from feedlot. Nevertheless, col-iform counts were systematically lower than those found in the literature and with unsatisfactory re-sults only for carcasses from feedlot animals. E. coli O157: H7 and Salmonella spp. were not identified in any carcass sample. These findings, associated with high rates of satisfactory rates with regard to TVC, Coliform and E. coli counting, allow a favorable con-clusion to the efficacy of hygienic-sanitary controls during slaughter operations. The above confirms the right procedures within the HACCP plan since they prevent important pathogens from reaching carcass surfaces.

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Resistência a antibióticos em isolados de Salmonella enterica em alimentos de origem animal

Antimicrobial resistance of Salmonella enterica isolated from food of animal origin

Rui Figueiredo1, Ana Henriques2, Rui Sereno2, Nuno Mendonça1, Gabriela J. da Silva1*

1Centro de Estudos Farmacêuticos*, Laboratório de Microbiologia e Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra,

Pólo das Ciências da Saúde, Azinhaga de Sta Comba, 3000-548 Coimbra, Portugal2ControlVet, SA, Tondela, Portugal

Resumo: A resistência a antibióticos é um assunto de grande interesse para a saúde pública. O uso de antibióticos na pro-dução animal pode conduzir ao aparecimento de estirpes bac-terianas resistentes a antibióticos, nomeadamente Salmonella enterica, um agente patogénico colonizador do trato digesti-vo animal, sendo necessário uma monitorização restrita para evitar a entrada deste agente na cadeia alimentar. No presente trabalho, entre junho de 2011 e março de 2012, recolheram-se 163 isolados de S. enterica de amostras alimentares e de produção, de aves (n=94), suínos (n=60) e bovinos (n=9). A identificação foi feita de acordo com a norma ISO 6579/A1. A avaliação da suscetibilidade aos antibióticos foi realizada pelo método de microdiluição. Foram identificados 10 seróti-pos, sendo S. Typhimurium o mais frequente (em aves, suínos e alimentos processados), seguido de S. Enteritidis, este último não encontrado em suínos. Estudos anteriores realizados em Portugal denotam o serótipo Enteritidis como prevalente em aves. Oitenta e sete porcento dos isolados mostravam resistên-cia a pelo menos um antibiótico. A maior taxa de resistência foi observada para a tetraciclina (49%), seguido da ampicili-na (37%). Observou-se uma baixa taxa de resistência às flu-oroquinolonas. De acordo com a origem das amostras, 82% e 65% dos isolados de suínos apresentaram resistência a estes antibióticos, respetivamente, enquanto em isolados de aves foi observado uma frequência de resistência de 31% e 21%, e em bovinos 22% e 11%. Os isolados de aves mostraram resis-tência também à colistina (22%) e moxifloxacina (13%), e os de suínos ao cloranfenicol (25%). Nos isolados de alimentos processados para consumo, observou-se maior frequência de resistência à tetraciclina (68%), ampicilina (54%) e mezlocili-na (52%). Em conclusão, os isolados de suínos apresentavam uma maior taxa de resistência aos antimicrobianos testados. Os resultados deste estudo, comparativamente com outros reali-zados anteriormente em Portugal, sugerem que as medidas de controlo da disseminação de Salmonella em aves instituídas no país são efetivas, mas que têm que ser estendidas aos suínos, onde o serótipo Typhimurium é prevalente, e também o mais resistente aos antibióticos.

Palavras-chave: Antibióticos, Salmonella, β-lactâmicos, fluoro-quinolonas.

Summary: Antibiotic resistance is an issue of great importan-ce for public health. The use of antibiotic in animal production may lead to the emergence of resistant microorganisms, namely Salmonella enterica, an invasive pathogen that usually coloni-zes animal digestive tract, being necessary to establish several control measures to avoid the entrance of this pathogen in food chain. In this study, 163 isolates of S. enterica were recovered from alimentary and production samples of poultry (n=94), swine (n=60) and cattle (n=9), from June 2011 to March 2012. The identification was performed according ISO 6579/A1 gui-delines. Antimicrobial susceptibility was tested by microdilution method. Ten serotypes were identified, S. Typhimurium being the most frequent (poultry, swines, processed food), followed by S. Enteritidis, though not found in swines. Eighty seven percent of the isolates were resistant to at least one antibiotic. The highest frequency of resistance was found for tetracycline (49%) and amoxicillin (37%). Accordingly to animal samples origin, 82% and 65% pork isolates were resistant to these antibiotics, respec-tively, while in poultry isolates the frequency of resistance was 31% and 21%, and in cattle 22% and 11%. Poultry isolates sho-wed also resistance to colistin (22%) and moxifloxacin (13%), while pork isolates presented more resistance to chloramphe-nicol (25%). Processed food isolates showed major resistance to tetracycline (68%), ampicillin (54%) and mezlocillin (52%). Overall, the isolates from swine showed the highest frequency of resistance to the antimicrobials tested. These results, in compa-rison with previous studies performed in Portugal, suggest that measures to control the spread of Salmonella in poultry institu-ted in the country are effective, but must have to be extended to swines, where serotype Typhimurium is prevalent, and also more resistant to antibiotics.

Introdução

Em Portugal, o uso de antibióticos na terapêutica ani-mal ascendeu aproximadamente às 180 toneladas em 2010, segundo a Direção Geral de Veterinária (DGV, 2010). A resistência antimicrobiana é considerada atualmente um problema de saúde pública, incluindo microrganismos que se disseminam através da cadeia alimentar. A capacidade de aquisição de resistência antimicrobiana de microrganismos patogénicos cujos

*Centro de Neurociências e Biologia CelularCorrespondência: [email protected] ; [email protected]: +351 239 488460

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reservatórios são animais de consumo, como é o caso de Salmonella spp., diminui a eficácia terapêutica dos anti-bióticos, com implicações clínicas relevantes.

O género Salmonella está dividido em duas espécies, S. enterica e S. bongori (Brenner et al., 2000). A espé-cie S. enterica está subdividida em 6 subespécies, uma das quais, S. enterica subs. enterica possui mais de 2500 serótipos, que colonizam principalmente aves, suínos, e ruminantes de médio porte. S. enterica é uma bactéria Gram-negativo com capacidade de invadir a mucosa in-testinal, e provocar no Homem uma gastrenterite, deno-minada salmonelose, caracterizada por diarreia, náuseas, dor abdominal, e por vezes, febre (McGhie et al., 2009).

A nível europeu, a salmonelose é a segunda zoonose mais frequente em humanos, afetando cerca de 100.000 mil indivíduos por ano (EFSA, 2012). Em Portugal, foi considerada a segunda doença de declaração obrigató-ria, e a doença infeciosa intestinal mais comum em 2008 (DGS, 2010). Normalmente, a infeção ocorre através da ingestão de alimentos ou água contaminados com dejetos intestinais de animais. Embora a salmonelose seja normalmente uma doença infeciosa auto-limitante, por vezes é necessário recorrer a antibioterapia devi-do ao carácter invasivo da bactéria, especialmente em crianças, idosos ou doentes imunodeprimidos. O trata-mento é muitas vezes feito com o recurso a antibióticos β-lactâmicos e fluoroquinolonas (Foley e Lynne, 2008). O uso de antibióticos no tratamento de animais de con-sumo pode levar ao aumento da resistência de microrga-nismos patogénicos zoonóticos (Mølbak, 2005), e com-prometer a eficácia clínica destes fármacos, quer a nível animal como humano.

Com o presente estudo pretendemos identificar os se-rótipos presentes em animais e produtos alimentares de origem animal, e determinar a suscetibilidade a diferen-tes classes de agentes antimicrobianos, usados na prática veterinária e clinica humana.

Materiais e métodos

Isolamento e identificação bacteriana

Entre junho de 2011 e março de 2012, na região centro de Portugal, foram recolhidos 163 isolados de Salmo-nella spp. de amostras de aves (n=94), suínos (n=60) e bovinos (n=9). Os isolados foram recolhidos de amostras biológicas (n=93) como sangue, peles de pescoço, fíga-do, carcaças e fezes, assim como de alimentos processa-dos (n=70) como carne picada, hamburgers ou enchidos. O isolamento foi feito de acordo com métodos padro-nizados (ISO 6579/A1, 2007). Sucintamente, 10 g de amostra foram suspensos em água peptonada tamponada (BPW Merck, Darmstadt, Germany) (1:10). A suspensão foi homogeneizada e incubada a 37 ºC. Após 18 h foram inoculados 0,1 ml e 1 ml em caldo Rappaport-Vassiliadis contendo peptona de soja (caldo RVS, Oxoid, Cambrid-ge, UK) e em caldo Muller-Kauffmann tetrationato/no-vobiocina (caldo MKTTn, Merck, Darmstadt, Germany),

respetivamente. As suspensões em RVS foram incubadas a 41,5 ºC ±1ºC durante 24h ± 3h, e as de MKTTn incuba-das a 37ºC ± 1ºC durante 24h ± 3h. Numa segunda fase, uma ansa de cultura dos caldos foi inoculada nos meios seletivos Hektoen e xilose-lisina-desoxicolato (XLD) (Oxoid, Cambridge, UK). As colónias presuntivamente identificadas como Salmonella foram confirmadas por métodos bioquímicos, e o serótipo determinado de acor-do com o esquema Kauffmann-White, para pesquisa dos antigénios O e H (Grimont e Weill, 2007).

Determinação da suscetibilidade aos antimicrobianos

A suscetibilidade aos agentes antibacterianos foi avaliada pelo sistema de microdiluição em MicroScan (Dade Behring, West Sacramento, CA, USA), cujas pla-cas contêm os seguintes antibióticos: ampicilina, mezlo-cilina, amoxicilina/ácido clavulânico, tetraciclina, colis-tina, ciprofloxacina, moxifloxacina, levofloxacina, gen-tamicina, cloranfenicol e trimetroprim/sulfametoxazole. O valor da concentração mínima do antibiótico que inibe o crescimento microbiano (concentração mínima inibi-tória, CMI) foi usado para classificar os isolados como suscetíveis, intermédios ou resistentes, de acordo com as normas do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2010), exceto para a colistina e moxifloxacina cujas CMIs foram interpretadas de acordo com as nor-mas do The European Committee on Antimicrobial Sus-ceptibility Testing (EUCAST, 2011), uma vez que não se encontram no CLSI.


O maior número de isolados de S. enterica foi re-colhido de aves, seguido de suínos e alimentos pro-cessados (Tabela 1). Foram identificados 10 serótipos, sendo o Typhimurium o mais frequente, maioritaria-mente isolado em amostras de aves e suínos, seguido do serótipo Enteritidis. Este último não foi identificado em suínos (Tabela 1). Ambos representam 46% dos se-rótipos identificados. Estes serótipos são os mais fre-quentemente associados a infeção humana (Humphrey, 2000; EFSA, 2010a).

Nos isolados de aves estes dois serótipos represen-tavam 42%, enquanto num estudo com isolados de produtos de origem animal recolhidos em 2003/04, estes dois serótipos somavam 59% das ocorrências em Portugal (Da Silva e Carneiro, 2006; Da Silva e Car-neiro, 2005), sendo o serótipo Enteritidis representado em 44% dos isolados de aves em 1999, e em 78% em 2003/04 (Antunes et al., 2003; Da Silva e Carneiro, 2006; Da Silva e Carneiro, 2005). No presente estudo, verificou-se uma diminuição da prevalência do seróti-po Enteritidis em aves em relação a anteriores estudos (Antunes et al., 2003; Da Silva e Carneiro, 2006; Da Silva e Carneiro, 2005), facto que poderá estar rela-cionado com a implementação em Portugal do Plano Nacional de Controlo de Salmonelas (PNCS, 2012).


41

Nos isolados de suínos, o serótipo Typhimurium repre-sentou 46% dos casos, contrastando com os 34,5% de 113 isolados de um estudo prévio (DGV, 2007).

Neste estudo, verificou-se ainda o aparecimento dos serótipos Infantis e Virchow, não notificados em 2007 pela Direção Geral de Veterinária (DGV, 2007). De re-alçar, que o serótipo Infantis foi encontrado maioritaria-mente em produtos de origem suína, alguns dos quais poderão ser ingeridos crus ou mal cozinhados. Sendo o quarto serótipo mais frequente neste trabalho, estudos futuros poderão revelar a importância da emergência deste serótipo, visto ter sido recentemente associado a casos de gastrenterites em humanos (Najjar et al., 2012). Note-se que, alguns dos serótipos considerados menos comuns, como Infantis, Mbandaka, Virchow, Derby e Agona, estão referenciados a nível europeu, e associados como indutores de gastroenterite em vários animais não relacionados (EFSA, 2012a).

A resistência pelo menos a um antibiótico foi registada em 87% dos isolados. Os isolados mostravam maior re-sistência à tetraciclina (49%) e ampicilina (37%) (Figura 1), o que pode estar relacionado com o facto de serem os dois antibióticos mais utilizados na terapêutica animal em Portugal (DGV, 2010).

Os isolados de amostras de aves (n=94) apresentavam maior resistência à tetraciclina (31%), à colistina (22%) e à ampicilina (21%), sendo 13% resistentes à moxifloxa-cina, e apenas 1% à levofloxacina e ciprofloxacina. A ele-vada frequência de resistência à tetraciclina em isolados de aves foi também documentada em estudos anteriores, onde se verificou valores de resistência de 36% (Antunes et al., 2003).

Nos isolados de suínos (n=60), observou-se uma maior frequência de resistência para a tetraciclina (82%), ampi-cilina (65%) e cloranfenicol (25%). Estas percentagens de resistência são um pouco mais baixas que as regista-

das em isolados de suínos recolhidos em 2006/07, em que se documentou 100% de resistência à tetraciclina, 93% à ampicilina e 37% ao cloranfenicol (Antunes et al., 2011). Embora o uso de cloranfenicol tenha sido banido da prática veterinária de animais de produção, continua a observar-se resistência a este agente antimi-crobiano em alguns isolados. A abolição de determi-nados antibióticos na produção animal nem sempre se traduz num total reverter da resistência para suscetibi-lidade, sendo que algumas estirpes poderão continuar a manter-se em determinados nichos ecológicos, o que realça a necessidade do controlo do uso de antibióti-cos. A resistência às fluoroquinolonas não foi registada neste grupo.

Os isolados de bovinos (n=9) apenas apresentavam resistência à tetraciclina (22%), ampicilina (11%) e mezlocilina (11%). De realçar, que foi o grupo onde se isolou o menor número de S. enterica.

Relativamente aos isolados de alimentos processados para consumo (n=63) observou-se maior frequência de resistência à tetraciclina (68%), ampicilina (54%) e mezlocilina (52%), sendo a resistência à ciproflo-xacina e levofloxacina pouco frequente (2%). Dentro dos produtos processados, recolheram-se 14 isolados de produtos prontos para consumo, nomeadamente en-chidos ou barras de torresmos, alimentos normalmente não sujeitos a cozedura, e consequentemente, uma pos-sível fonte de infeção para o consumidor final. Destes isolados, 64% apresentavam resistência à tetraciclina e 50% à ampicilina. É importante salientar, a elevada resistência à tetraciclina e ampicilina, também repor-tada anteriormente em Portugal (Antunes et al., 2011; Caleja et al., 2011). Uma vez que todos os isolados se mostraram suscetíveis às fluoroquinolonas, isto sugere que, em caso de infecção, e necessidade de antibiotera-pia, as fluoroquinolonas podem ser uma opção.

SerótipoAves

Nº (%)SuínosNº (%)

BovinosNº (%)

Alimento ProcessadoªNº (%)

Totalb

Nº (%)

Typhimurium 23 (24) 35 (62) 1 (11) 32 (51) 59 (36)

Enteritidis 17 (18) - - 3 (5) 17 (10)

Havana 13 (14) - 1 (11) - 14 (8)

Infantis 1 (1) 7 (12) 2 (22) 6 (10) 10 (6)

Mbandaka 9 (10) - - - 9 (5)

Derby 2 (1) - - - 2 (1)

Virchow 2 (1) - - - 2 (1)

London 1 (1) - - - 1 (1)

Agona 1 (1) - - - 1 (1)

Patel 1 (1) - - - 1 (1)

Não determinado 24 (28) 18 (26) 5 (56) 22 (34) 47 (30)

Total 94 60 9 63 163

Tabela 1 – Prevalência dos serótipos de Salmonella nos diferentes tipos de amostra

ª Isolados recolhidos de amostras processadas de aves, suínos e bovinos.b Soma de isolados de aves, suínos e bovinos.


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AMP – Ampicilina; MEZ – Mezlocilina; AMC – Amoxicilina/ácido cla-vulânico; GEN – Gentamicina; LEV – Levofloxacina;CIP – Ciprofloxacina; MOX – Moxifloxacina; CLOR – Cloranfenicol; TET – Tetraciclina; SXT – Trimetroprim/Sulfametoxazole;COL – Colistina.

Figura 1 – Resistência aos antibióticos dos isolados de amostras de aves, suínos, bovinos e alimentos processados.

Os padrões de resistência aos agentes antimicrobia-nos em função do serótipo encontram-se na tabela 2. S. Typhimurium, para além de ser o serótipo mais comum em amostras de aves e suínos, é também o que apre-senta maior frequência de resistência, nomeadamente à tetraciclina (83%) e ampicilina (76%), assim como, o maior número de isolados multirresistentes. A multir-resistência é um problema emergente. A aquisição de resistência a agentes antimicrobianos de várias classes (pelo menos a três) garante à estirpe bacteriana uma elevada capacidade de sobrevivência face a diferentes terapêuticas, possibilitando a disseminação destas es-tirpes entre animais, e animais e humanos. Várias con-sequências podem advir da multirresistência. A escolha terapêutica do clínico é substancialmente reduzida, e a eficácia clínica de antibióticos é comprometida, com consequente aumento da morbilidade do hospedeiro,

e eventual morte (Angulo et al., 2004). Observou-se ainda que os suínos constituem um reservatório impor-tante de isolados de S. enterica resistentes, em especial Typhimurium. Na generalidade, a maioria dos seróti-pos encontrados não apresenta resistência aos antibió-ticos testados. Contudo, o seu número é muito menor quando comparado com S. Typhimurium. Estes dados são consistentes com os da literatura, que descreve este serótipo como o mais frequente e resistente aos antibi-óticos (EFSA, 2010a). De realçar, a resistência à tetra-ciclina, e o facto de ter sido isolado maioritariamente em suínos e alimentos processados, muitos derivados de carne suína, que poderão ser consumidos crus ou não completamente cozinhados (Tabela 2).

Em forma de conclusão, no presente trabalho veri-ficou-se uma maior diversidade de serótipos em isola-dos de aves quando comparada com registos anteriores (PNCS, 2012), incluindo o aparecimento do serótipo Infantis identificado em todos os grupos de amostras, tal como o Typhimurium (o mais prevalente), uma ele-vada taxa de resistência à tetraciclina e ampicilina, e uma baixa taxa de resistência a fluoroquinolonas. Ob-servou-se uma diminuição na incidência de resistência às fluoroquinolonas comparativamente à resistência observada em finais do século XX após a legalização do uso destes antibióticos no uso veterinário (Threlfall et al., 1997; Malorny et al., 1999). No entanto, verifica-se que, mesmo após a proibição do uso de antibióticos nas rações de animais para consumo humano em 2006 nos países da União Europeia (Guardabassi e Courva-lin, 2006), continuam a surgir salmonelas resistentes aos antibióticos. Tal facto mostra que, as medidas de controlo instituídas na União Europeia ao nível do uso de agentes antimicrobianos em rações poderão ser in-suficientes para minimizar o aparecimento de estirpes

Serótipo (n.º)N.º (%) de isolados por perfil de resistência aos agentes antimicrobianosª

Amp Mez AMC Gen Lev Cip Mox Clor Tet SXT Col

Typhimurium (59) 45 (76) 44 (76) 2 (3) 1 (2) 0 (0) 0 (0) 5 (9) 19 (32) 49 (83) 3 (5) 5 (8)

Enteritidis (17) 3 (18) 2 (12) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (6) 0 (0) 1 (6) 0 (0) 16 (94)

Havana (13) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 4 (31) 1 (8) 0 (0) 0 (0) 0 (0)

Infantis (10) 1 (10) 2 (20) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (10) 4 (40) 2 (20) 0 (0)

Mbandaka (9) 1 (11) 1 (11) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (11) 0 (0) 1 (11)

Virchow (2) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (50) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)

Derby (2) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (50) 0 (0) 0 (0)

Agona (2) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)

Patel (1) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)

London (1) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)

ND (48) 10 (21) 6 (13) 1 (2) 1 (2) 1 (2) 1 (2) 2 (4) 6 (13) 24 (50) 5 (10) 2 (4)

Tabela 2 – Perfis de suscetibilidade a vários antibióticos em função do serótipo de Salmonella enterica

ª Agentes antimicrobianos: Amp, ampicilina; Mez, Mezocilina; AMC, amoxicilina com ácido clavulânico; Gen, Gentamicina; Lev, Levofloxacina; Cip, Ciprofloxacina; Mox, Moxifloxacina; Clor, Cloranfenicol; Tet, Tetraciclina; SXT, trimetoprim/sulfametoxazole; Col, colistina.

b Não Determinado.c Multiresistência.


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resistentes, e que, tal como em terapêutica humana, deverá haver uma avaliação cuidada da necessidade de antibioterapia em animais e uma criteriosa escolha dos antibióticos, sendo importante conhecer os perfis de susceptibilidade das estirpes que circulam em Portu-gal. O Programa Nacional de Controlo de Salmonella em aves parece ser efetivo, e parece estar a contribuir para a redução da incidência do serótipo Enteritidis, reportado geralmente como o mais frequente neste grupo de animais. Contudo, observou-se um aumen-to de S. Typhimurium em aves relativamente a estudos anteriores, um serótipo normalmente associado a suí-nos, sugerindo que este serótipo ubíquo e responsável pela maioria das salmoneloses poderá estar a ocupar um novo nicho biológico. De destacar que, o serótipo Typhimurium é também o que apresenta maior frequên-cia e diversidade de resistência aos antibióticos, como demonstrado neste estudo, o que é preocupante, visto ser um serótipo com capacidade de adaptação a vários hospedeiros, e de aquisição de resistência aos antibióti-cos. Os resultados obtidos neste estudo, e comparativa-mente com dados anteriores, sugerem que as medidas de controlo da disseminação de Salmonella em aves ins-tituídas em Portugal são efetivas, mas que têm que ser estendidas aos suínos, onde o serótipo Typhimurium é prevalente, e também o mais resistente aos antibióticos.

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RPCV (2013) 108 (585-586) 45-52

Perigos microbiológicos em cozinha vegetarianaestudo de Caso: restaurante de cozinha vegetariana

Microbiological hazards in vegeterian foodcase study: vegetarian cuisine restaurant

Maria Guimarães1, Marta Castel-Branco2, Carlos Brandão3

1 Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril, Mestre em Segurança e Qualidade Alimentar em Restauração.2Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril Laboratório de Microbiologia Alimentar.

*Correspondence: [email protected], 210040700, ext. 157

Resumo: Com o objectivo de identificar factores de risco mi-crobiológicos, associados à cozinha vegetariana, fez-se avalia-ção microbiológica de refeições, superfícies de preparação de alimentos e qualidade do ar de um restaurante de cozinha vege-tariana. Foram recolhidas 34 amostras de refeições, 32 de tábuas de corte e 32 de ar.Quanto às refeições, no que respeita a contagens totais a 30oC (CT) e coliformes totais verificou-se uma média de 6,36×106 ufc/g (DP=1,98×107) e 3,48×105 ufc/g (DP=9,15×105), respe-tivamente. As amostras foram classificadas em termos de acei-tabilidade em “não satisfatórias” (NS), “aceitáveis” (A) e “sa-tisfatórias” (S). Em relação a CT observaram-se, 59% (n=20) de amostras NS, 29% (n=10) A e 12% (n=4) S. Considerando os coliformes totais, observaram-se 85% (n=29) de amostras NS, 9% (n=3) A e 6 % (n=2) S. Quanto à E. coli, 24% (n=8) das amostras foram classificadas como NS e 76 % (n=26) S. No que respeita a Bacillus cereus, verificou-se que 20,6% (n=7) das amostras eram NS, 2,9% (n=1) potencialmente perigosas, 14,7% (n=5) A e 61,8% (n=21) S.No que respeita à avaliação microbiológica das tábuas de corte e considerando as CT, registaram-se 56% (n=9) de amostras NS a meio do dia de laboração e 38% (n=6) no fim do dia. Em relação aos coliformes, observaram-se 88% (n=14) de NS a meio do dia de laboração e 87% (n=13) no fim do dia. A qualidade do ar da vitrina foi avaliada apenas em relação às CT. Observou-se que 75% (n=12) das amostras eram S, 12.5% (n=2) A e 12.5% (n=2) NS. No ambiente da cozinha as amostras S corresponderam a 56.25% (n=9), 31,25% (n=5) A e 12.5% (n=2) NS.

Palavras chave: vegetariana, risco, microbiológico, qualidade, ar

Summary: Aiming to identify microbiological risk factors as-sociated with vegetarian cuisine, microbiological evaluation of meals, food preparation surfaces and air quality, has been made.We have collected the following samples: 34 of food, 32 of cut-ting boards and 32 of air.As for the meals, and with respect to CT and coliforms, was found that the average values observed were 5,7 Log cfu/g (SD=2,06) and 4,14 Log cfu/g (SD=1,56), respectively. The sam-ples were classified in terms of acceptability as “unsatisfactory” (NS), “acceptable” (A) or “satisfactory” (S). It was been found

for TC that 59% (n = 20) of the samples were NS, 29% (n = 10) A and 12% (n=4) S. Considering coliforms were observed 85% (n=29) NS 9% (n=3) of A and 6% (n=2) S. As to E. Coli, 24% (n=8) of the samples were classified as NS and 76% (n=26) S. As regards Bacillus cereus, it was found that 20.6% (n=7) samples were NS, 2.9% (n=1) potentially hazardous, 14.7% (n=5) and 61 8% (n=21) S.Regarding the cutting boards and the CT, have been registered 56.% (n=9) NS at midday and 38% (n=6) at the end of the day. Regarding Coliforms, there were 88% (n=14) NS at midday and 87% (n=13) later in the end of the day.For the air quality in the food display casers 75% (n=12) were S, 12.5% (n=2) and 12.5% (n=2) NS. In the kitchen air S corresponded to 56.25% (n=9), A to 31.25% (n=5) and NS to 12.5% (n=2) NS.

Keywords: vegetarian, risk, microbiological quality, air.

Introdução

Dada a transversalidade da Segurança Alimentar a todos os consumidores, decidiu-se efetuar um estu-do para identificação de fatores de risco microbioló-gico associado à confecção de refeições vegetaria-nas. Para tal foi escolhido como estudo de caso um restaurante de cozinha vegetariana situado na região de Lisboa.

Estima-se que existam cerca de 1 bilião e meio de vegetarianos no mundo, dos quais 75 milhões por op-ção, mas este número tem tendência a aumentar gradu-almente. Os outros 1450 milhões são vegetarianos por necessidade (Leahy et al., 2010).

Alguns estudos referem que o vegetarianismo é uma tendência crescente em todo o mundo. Excluin-do a Índia, estima-se que cerca de 1% da população mundial não ingere carne, aves ou peixe. Um estudo realizado em 2008 estimou que 3,2% da população adulta dos E.U.A. (7,3 milhões de pessoas) é vegeta-riana. Na Europa ocidental o número de vegetarianos varia entre 2% e 4% e na Europa oriental entre 0,3% e 1,9%. A Índia é o pais com a maior população de ve-

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getarianos no mundo, estimando-se que mais de 400 milhões de indianos são vegetarianos (Eaton, 2010). Com o aumento da procura de refeições vegetarianas, verifica-se um acréscimo no consumo de vegetais e frutas frescas com o mínimo de processamento (Aba-dias et al., 2008).

A quantidade de microrganismos à superfície dos frutos e vegetais é em regra elevada, variando com a temperatura ambiente, qualidade das águas de rega e práticas de colheita, transporte e posterior manipula-ção e processamento (Garg et al., 1990; Francis et al., 1999; SCF, 2002). Diversos estudos têm demonstrado claramente uma relação entre a ocorrência de doenças de origem alimentar, com o consumo de alimentos à base de produtos vegetais não processados ou com processamento térmico mínimo (SCF, 2002; Ward et al., 2002; Eni et al., 2010;). Os perigos frequentemen-te associados a surtos com origem em vegetais e fruta fresca, são bactérias, como Salmonella spp. e E. coli, vírus, como vírus de Norwalk e vírus da hepatite A e parasitas, como Cryptosporidium e Cyclospora (Tauxe et al., 1997; SCF, 2002).

Os vários surtos descritos na América e Europa, estão muito associados ao consumo de legumes e vegetais, sobretudo alface (Frost et al., 1995; Ward et al., 2002).

Material e métodos

Este trabalho consiste num estudo preliminar onde é efetuada uma análise descritiva de um conjunto de da-dos relativos a parâmetros microbiológicos avaliados em alimentos, tábuas de corte e ar, num restaurante de cozinha vegetariana.

Foram colhidas 34 amostras de alimentos prontos a comer do Grupo II, de acordo com a classificação constante nos Valores Guia para avaliação da qualidade microbiológica de alimentos prontos a comer prepara-dos em estabelecimentos de restauração - VG (Santos et al., 2005): Refeições/Sandes/Bolos/Sobremesas do-ces cozinhadas adicionadas de ingredientes crus e/ou com microbiota específica própria. De referir assim, tratarem-se de alimentos /refeições confecionadas com tratamento térmico, mas com adição de alimentos crus, e por isso classificados como pertencentes ao grupo 2 (Tabela 1). As amostras foram colhidas durante os meses de Maio, Junho e Julho de 2010 (19 amostras colhidas em Maio, 12 em Junho e 3 em Julho). Os pa-râmetros microbiológicos avaliados foram: contagens totais a 30oC (CT), coliformes, Escherichia coli, Ba-cillus cereus, Enterococcus, Staphylococcus coagula-se positiva, esporos de Clostridium sulfito-redutores e Salmonella spp.

Para as CT foram efetuadas propagações por incor-poração em Plate Count Agar (Biokar, BK144HA), in-cubadas a 30ºC durante 72 horas (ISO 4833:2003). No que respeita à contagem de bactérias coliformes, utili-zou-se o meio de cultura VRBL (Biokar, BK152HA)

para a realização de propagações por incorporação, incubadas a 37ºC por 24 horas (ISO, 4832:2006). A contagem de E. coli foi feita em meio de TBX Agar (Biokar, BK146HA), efetuando-se propagações por incorporação, incubadas a 44ºC durante 24 horas (ISO 16649-2:2001). A contagem de Bacillus ce-reus realizou-se por sementeira à superfície em meio Bacillus cereus agar (base acc. to Mossel) (Biokar, BK116HA), suplementado com emulsão de gema de ovo e Polimixina B (Biokar, BS05508) e incubado a 30ºC, 24 a 48 horas (ISO 7931:2004). No que se re-fere à contagem de Staphylococcus coagulase posi-tiva utilizou-se o meio de cultura Baird Parker Agar (Biokar, BK055HA), suplementado com RPF (Bio-kar, BS05508), para a realização de propagações à superfície incubadas a 37ºC durante 48 horas (ISO 688-1:1999, Amd. 2003). A contagem de Enterococ-cus foi efetuada de acordo com o método descrito por Devriese e colaboradores (1995), com propagações realizadas em meio de Kanamicina Esculina Azida Agar base (Oxoid, CM591) suplementado com Kana-micina (Oxoid, SR092E) e incubadas a 42ºC durante 24 horas. O método utilizado para pesquisa de espo-ros de Clostridium sulfito-redutores foi o descrito na NP 2262:1986, tendo-se efectuado propagações em meio Sulfadiazina Polomixina Sulfito Agar, em tubo, de 10ml (1g) e 1ml (0,1g) de uma solução de 1:10 de inoculo. A incubação foi realizada em anaerobio-se a 42,5ºC por 5 dias. A pesquisa de Salmonella, foi efectuada de acordo com a ISO 6579:2002, com pré-enriquecimento em Água Peptonada Tamponada (Biokar, BK131HA) a 37ºC - 24h, seguida de um du-plo enriquecimento selectivo a 37ºC em Rappapport vassiliadis (Biokar, BK136HA) e Muller Kauffmann Tetrationato (Biokar, BK169HA). Posteriormente efetuaram-se propagações duplas para XLD Agar (Biokar, BK168HA) e para Verde Brilhante Agar (Biokar, BK091HA).

Foram ainda analisadas um total de 32 amostras de tábuas de corte para preparação de alimentos, colhidas durante 16 dias, em Julho de 2010. Em cada dia foram colhidas 2 amostras, uma a meio e outras no final do dia. Todas as colheitas foram após as operações de hi-gienização. Os parâmetros avaliados foram contagens totais a 30oC e coliformes. As amostras foram colhi-das através de placas de Petri de contacto 67x15mm (NUNC, 240541).

Finalmente foram colhidas, em Julho de 2010, 16 amostras para avaliação da qualidade do ar da vitrine de exposição de legumes crus e sobremesas e 16 amos-tras para avaliação da qualidade do ar da cozinha. Em cada dia foi colhida uma amostra de ar da vitrine e uma amostra de ar da cozinha. O parâmetro avaliado foi apenas contagens totais a 30oC. Foram colhidas amos-tras de 1 m3 de ar, por impactação, através de disposi-tivo de amostragem de ar (Spin Air, IUL Instruments).

A análise descritiva dos dados foi realizada com re-curso ao Software estatístico R, versão 2.14.2.


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Nº da Amostra Nome do prato Categoria

1 Migas de feijão Azuki com salada de alface, couve-roxa, cenoura, nabo e milho Prato principal

2 Tarte de cebola caramelizada com queijo em cama de Chicória e morangos Entrada

3 Moqueca de tofu com arroz basmati, brócolos escaldados, salada de alface e beterraba Prato principal

4 Tagliatelle salteado com espinafres e passas, bolinhas de cereais e molho de nozes com saladinha de courgette e pêra Prato principal

5 Delicia de Banana e chocolate Sobremesa

6 Bajhias de cebola nova e feijão verde, com saladinha quente de boulgour, alface, cenoura e nabo Prato principal

7 Bifinhos de tofu com legumes doces assados com pesto aromático de coco, brócolos escaldados e salada de alface e cenoura Prato principal

8 Delicia de manga Sobremesa

9 Tagliatelle com rolinhos de beringela, molho de tomate, alface, cenoura e beterraba Prato principal

10 Rissoto de legumes com bruchetta e saladinha de tomate, cebola roxa e mozzarela Prato principal

11 Tofu com broa com salada de alface, beterraba e cebola roxa Prato principal

12 Tirinhas de seitan salteadas com molho de ameixas em cama de legumes crus com bolinhas de arroz e salada de alface, cenoura e beterraba Prato principal

13 Panquecas de feijão verde com saladinha tropical e coulis de laranja com cous-cous e salada de alface, cenoura, couve roxa e beterraba Prato principal

14 Tofu madeirence com arroz selvagem, banana, cebolada, brócolos, salada de alface e beterraba Prato principal

15 Ratatouille com tarte de cebola, boulgour e salada de alface e beterraba Prato principal

16 Crepe de legumes com molho de sésamo, arroz integral de limão e feijão verde escaldado em cama de alface e beterraba Prato principal

Nº da Amostra Nome do prato Categoria

17 Gratinado de legumes de verão com pão de ervas finas e salada de cevada e agrião, aipo e cenoura em cama de alface e beterraba Prato principal

18 Barrinhas de tofu com amêndoa arroz de especiarias, salada de alface e nabo ralado e feijão verde e cenoura com alhinho Prato principal

19 Pudinzinho de ervilhas com pesto de hortelã em cama de folhas verdes salteadas com cenouras doces, arroz selvagem e salada de alface e nabo ralado Prato principal

20 Bahjias de legumes verdes com arroz de açafrão, passas e amendoins e salada de alface, cenoura e nabo Prato principal

21 Hambúrguer de courgette com queijo e tomate com tagliatelle de espinafres e passas e salada de alface e cenoura Prato principal

22 Pastelinhos de legumes com arroz de tomate e salada de alface, cenoura e couve roxa com molho de coentros Prato principal

23 Coroa de cous-cous com bifinhos de seitan com saladinha quente de courgette e beringela com salada de alface, cenoura e beterraba Prato principal

24 Caril de manga com arroz basmati, salada de alface e beterraba com molho de iogurte Prato principal

25 Tofu com maçã e ananás com arroz selvagem, salada de legumes quentes e beterraba Prato principal

26 Massa salteada com nabiças, bolinhas de cereais com molho de noz, brócolos escaldados e salada de alface e beterraba Prato principal

27 Duo de massa gratinada com salada de alface, cenoura e nabo Prato principal

28 Tirinhas de seitan salteadas com molho de ameixa em cama de legumes cruz, com bolinhas de arroz, brócolos e cenoura Prato principal

29 Bifinhos de tofu com batata nova, molho de vinagrete tropical, cenoura, cebola roxa, alface e brócolos Prato principal

30 Empadão de lentilhas castanhas e laranjas com molho de frutos silvestres, cous-cous, alface e nabo ralado Prato principal

31 Caril de manga com arroz basmati, chicória e beterraba Prato principal

32 Salada de feijão frade com batatinha nova cozida, ovo em cubos, pimento picado, salsa e cebola roxa picada. Com alface e tomate Prato principal

33 Tofu com maçã e ananás, com cous-cous de legumes, alface e brócolos Prato principal

34 Tirinhas de seitan com molho de ameixa em cama de legumes crus, bolinhas de arroz e queijo com alface e beterraba Prato principal

Tabela 1 – refeições/alimentos amostrados.


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Foram avaliadas potenciais associações entre al-guns dos parâmetros microbiológicos na amostra. Os diagramas de dispersão apresentados na figura 2 ilus-tram a relação de associação entre contagens totais a 30oC e coliformes totais e entre coliformes totais e E. coli. Através da análise dos gráficos podemos obser-var uma tendência linear positiva entre as variáveis.

O valor do coeficiente de correlação Spearman para CT vs. coliformes totais é 0,59, sugerindo a

existência de uma correlação fraca a moderada. O coeficiente de correlação de Spearman para coli-formes totais vs. E. coli é 0,28, sugerindo uma cor-relação fraca, embora se possa observar através da análise gráfica que, excluindo as amostras com au-sência de E. coli, as restantes mostram, em média, que valores mais elevados de E. coli correspondem, tendencialmente, a valores mais elevados de colifor-mes.

Resultados

Avaliação da qualidade microbiológica dos alimentos:

Os resultados obtidos na avaliação microbiológica dos alimentos amostrados constam na tabela 1 e figura 1. A pesquisa de Salmonella spp., Staphylococcus coagulase positiva e de esporos de Clostridium sulfito-redutores foi negativa nas 34 amostras.

Tabela 1 – Medidas de estatística descritiva para as contagens dos vários parâmetros avaliados nas n=34 amostras de alimentos do grupo II. Unidade: Log

10 (ufc/g)

* Logaritmo (base 10) da média aritmética das 32 amostras (ufc/g); ** Logaritmo (base 10) do desvio padrão das 32 amostras (ufc/g).

Quartis

MínimoLog

(ufc/g)

1ºQuartilLog (ufc/g)

MedianaLog (ufc/g)

3ºQuartilLog (ufc/g)

MáximoLog (ufc/g)

Log média* Log DP**

CT < 1 4,26 5,73 6,47 7,99 6,80 7,30

Coliformes < 1 3,50 4,16 5,36 6,65 5,54 5,96

E. coli < 1 < 1 < 1 < 1 4,59 3,15 3,83

B. cereus < 1 < 1 < 1 2,95 5,00 3,65 4,24

Enterococcus < 1 < 1 < 1 2,40 4,65 3,17 3,89

Figura 1 – Diagramas de extremos e quartis (box-plot) relativos a contagens totais a 30oC, coliformes, E. coli, Bacillus cereus e Enterococcus nas 34 amostras de alimentos. Unidade: Log ufc/g. Os pontos correspondem a outliers.


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Relativamente à classificação dos alimentos em ter-mos de aceitabilidade, as amostras analisadas foram classificadas em “satisfatório”, “aceitável” e “não sa-tisfatório” tendo em conta as contagens totais a 30oC, coliformes, E. coli e Bacillus cereus, de acordo com os VG (Santos et al., 2005). A classificação final dos alimentos em termos de aceitabilidade é feita com base na classificação da totalidade dos parâmetros re-feridos. Os resultados constam na tabela 2.

Avaliação da qualidade das operações de limpeza e desinfeção das tábuas de corte de legumes crus:

As amostras analisadas foram classificadas em “sa-tisfatório” (<10 ufc/cm2), “aceitável” (entre 10 e 20

ufc/cm2) e “não satisfatório” (>20 ufc/cm2) para as contagens totais a 30oC. No que respeita à classifi-cação de acordo com as contagens de coliformes, os valores considerados foram: “satisfatório” (<1 ufc/cm2), “aceitável” (1 ufc/cm2) e “não satisfatório” (>1 ufc/cm2) (Harrigan, 1998). Os resultados constam na tabela 3.

Através da análise dos resultados relativos às conta-gens totais a 30ºC apresentados na figura 3, podemos observar que 60% do total de resultados não satisfató-rios correspondem a colheitas efetuadas a meio do dia e 40% correspondem a amostras colhidas no final do dia, após as operações de limpeza e desinfeção. Observa-se ainda que a maioria dos resultados satisfatórios (64%) correspondem a amostras colhidas ao final do dia.

CT Coliformes E. coli B. cereus Classif. final

Satisfatório 4 (12%) 2 (6%) 26 (76%) 21 (61,8%) 1 (3%)

Aceitável 10 (29%) 3 (9%) ___ 5 (14,7%) 2 (6%)

Não satisfatório 20 (59%) 29 (85%) 8 (24%) 7 (20,6%) 30 (88%)

Pot. Perigoso ___ ___ ___ 1 (2,9%) 1 (3%)

Figura 2 – Diagramas de dispersão: contagens totais a 30oC (MVT) vs. coliformes e coliformes vs. E. coli. Unidade Log ufc/g.

Tabela 2 – classificação de n=34 amostras de alimentos, de acordo com vários parâmetros microbiológicos (frequências absoluta e relativa).

e no final da laboração.

Figura 3 – Distribuição dos resultados em termos de aceitabilida-de, de acordo com o parâmetros avaliados para as tábuas de corte (contagens totais a 30oC – CT e coliformes totais), a meio e no final da laboração.

Tabela 3 – classificação das tábuas de corte de acordo com vá-rios MVT e coliformes (frequências absoluta e relativa).

CT (30ºC) Coliformes

Meio do dia Fim do dia Meio do dia Fim do dia

Não satisfatório

9 (56%) 6 (38%) 14 (88%) 13 (87%)

Aceitável 2 (12%) 1 (6%) 0 0

Satisfatório 5 (31%) 9 (56%) 2(12%) 2 (13%)

OBS: os resultados de coliformes ao final do dia apresentam um valor omisso. As % foram calculadas excluindo o valor omisso.


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No que respeita aos resultados relativos aos colifor-mes, apresentados na mesma figura, observa-se que 52% dos resultados não satisfatórios correspondem a colheitas efetuadas a meio do dia e 48% correspon-dem a amostras colhidas no final do dia. Quanto aos resultados satisfatórios eles distribuem-se igualmente entre as amostras colhidas a meio (50%) e no final da laboração (50%).

Avaliação da qualidade do ar:

Foram analisadas 32 amostras para avaliação da qua-lidade do ar (16 da vitrine de exposição de legumes crus e sobremesas e 16 da cozinha). O parâmetro uti-lizado para a avaliação foi CT. As amostras analisadas foram classificadas em “não satisfatório” (≥ 300 ufc/m3), “aceitável” (≥ 100 e < 300 ufc/m3) e “satisfatório” (< 100 ufc/m3) (Al-Dagal M e Fung D, 1993; Fung D, 2002; Fung D, 2008). Os resultados constam nas tabe-las 4 e 5 e na figura 4.

Figura 4 – Contagens totais a 30oC, para o ar da vitrine e da cozinha; unidade: ufc/m3.

Discussão

O elevado teor de amostras de alimentos prontos a consumir considerados não satisfatórios (88%) de acor-do com os VG apresentados pelo INSA (Santos et al., 2005), demonstra claramente uma baixa qualidade mi-crobiológica final, deste tipo de preparações culinárias.

É de salientar uma elevada percentagem de amostras não satisfatórias relativas a coliformes totais (85%), parâmetro microbiológico que não tem uma forte co-notação como indicador de contaminação fecal, pois existem múltiplos reservatórios e modos de transmis-são para estes microrganismos, podendo ser encon-trados na água, no solo, em alimentos e também no trato intestinal (Environment Agency, 2002). Este pa-râmetro pode, no entanto, fornecer valiosas indicações sobre a eficácia do processo tecnológico de tratamento térmico e de desinfecção e lavagem dos produtos, so-bretudo dos destinados a serem consumidos crus. Os valores elevados de não satisfatório encontrados para Coliformes e Contagens Totais podem assim ser con-siderados indicadores de más práticas de higiene e de fabrico, nomeadamente operações de limpeza e desin-feção, processamento térmico insuficiente e eventuais contaminações cruzadas (Benevides e Lovatti, 2004).

Foram identificadas 28% de amostras não satisfató-rias para E. coli, agente também indicador de conta-minação fecal. Esta é uma situação, que aponta clara-mente para uma baixa qualidade sanitária, que pode assentar tanto em problemas ao nível das matérias primas, como de praticas de fabrico deficientes, no-meadamente de contaminações cruzadas. Este valor é significativamente mais elevado que o encontrado por Que-King e colaboradores (2006).

Os legumes de folhas verdes estão envolvidos em surtos de intoxicações alimentares nos EUA. Os ali-mentos associados são espinafres e alface, dois alimen-

Quartis

Mínimo(ufc /m3)

1ºQuartil(ufc /m3)

Mediana(ufc /m3)

3ºQuartil(ufc /m3)

Máximo(ufc /m3)

Média(ufc /m3)

Desv. pad.(ufc /m3)

CT vitrine 0 3,5 5,5 69,5 338 63,1 113,2

CT cozinha 5 54 91 169 669 147,2 171,1

Tabela 4 –Contagens totais a 30oC - CT (ufc /m3) em amostras de ar da vitrine de exposição de legumes e da cozinha.

Tabela 5 – Classificação de acordo com as contagens totais e 30oC (CT) em amostras de ar da vitrine de exposição de legumes e da

cozinha.

Contagens Totais (CT 30ºC)

Vitrine de exposição Cozinha

Satisfatório 12 (75%) 9 (56,25%)

Aceitável 2 (12,5%) 5 (31,25%)


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tos frequentemente utilizados nas refeições analisadas num estudo efetuado por Weissinger e colaboradores (2000). Também no presente estudo, a presença deste tipo de vegetais nas preparações é muito frequente, o que pode contribuir para explicar os níveis elevados de contaminação fecal encontrados.

Os elevados teores encontrados para Enterococcus devem ser interpretados com precaução quando se tra-ta de alimentos. Estes adquirem no entanto especial importância como indicador de contaminação fecal em águas. Esta é uma situação que pode ter ocorrido neste estudo, atendendo a que os produtos vegetais podem ter sido contaminados com águas de rega e ao fato de não existir possibilidade de contaminação cruzada, a partir de produtos de origem animal. Esta conotação, enfatiza a necessidade de uma eficiente lavagem e de-sinfeção dos produtos vegetais, sobretudo quando des-tinados a serem consumidos crus (McGowan, 2006; Ibenyassine et al., 2007).

Os valores encontrados para Bacillus cereus, com 29% de não satisfatórios, apesar de mais elevados que os indicados por outros estudos (Valero et al., 2007), não surpreendem, uma vez que estes alimentos, para além de terem frequentemente cereais na sua com-posição, também são constituídos por alimentos com contacto telúrico. Foi encontrada uma amostra, consi-derada potencialmente perigosa face aos teores apre-sentados para B. cereus, o que reforça a importância da manutenção dos alimentos a temperaturas seguras (Altayar e Sutherland, 2006).

Analisando outros critérios para a classificação dos alimentos em termos de aceitabilidade, observam-se algumas diferenças em relação aos valores guia utili-zados. No entanto estes critérios nem sempre são com-paráveis, porque também diferem na organização dos alimentos em grupos. Os valores guia adotados neste estudo, apresentam de um modo geral valores micro-biológicos de aceitabilidade mais baixos e assim mais exigentes, comparativamente a outros valores guia/cri-térios microbiológicos e, desta forma, as percentagens de não aceitabilidade observadas, são genericamente mais elevadas do que as que seriam encontradas com base noutros critérios. A título de exemplo, os valores guia da Agência de Proteção da Saúde (Health Pro-tetion Agency HPA, 2009) para alimentos prontos a comer colocados no mercado, referem como micror-ganismos indicadores de higiene as enterobactérias, E. coli e Listeria. Os valores relativos a enterobactérias não se aplicam a frutos frescos e vegetais crus, pelo que não se adaptam às refeições consideradas. No que respeita a E. coli, a HPA indica como valor a partir do qual se considera o alimento não satisfatório 102 ufc/g, consideram satisfatórios os alimentos com valo-res inferiores a 20 e aceitáveis aqueles que apresentam valores entre os dois referidos. Considerando os VG (Santos et al., 2005), os alimentos/refeições do grupo 2 devem ser considerados não satisfatórios se apresen-tarem valores de E. coli superiores a 10 ufc/g. No que

respeita a contagens totais, os limites indicados pelos VG adotados para alimentos para consumo imediato (103 e 105 ufc/g) são semelhantes aos indicados pela HPA para alimentos cozinhados imediatamente antes da venda ou consumo.

Foi ainda analisada a contaminação das superfícies preparação dos alimentos com base em contagens to-tais a 300C e coliformes. No que respeita à avaliação das operações de limpeza e desinfeção das superfícies de corte de alimentos com base nas CT e coliformes, é possível constatar que a seguir ao período da prepa-ração do almoço, a eficácia do processo é mais baixa que a verificada ao final do dia. Tal situação, poderá dever-se à falta de procedimentos específicos para esta operação. Na globalidade, a percentagem de amostras não satisfatórias aponta para uma necessidade impe-riosa de se implementaram boas práticas a este nível, uma vez que poderá estar presente um fator de risco em termos de contaminações cruzadas (Walker et al., 1997). Os valores observados por outros autores são de difícil comparabilidade porque a diversidade meto-dológica é grande, nomeadamente no que respeita ao método de colheita das amostras e à forma de apresen-tação dos resultados.

Mesquita e colaboradores (2006) referem ausência de coliformes logo após higienização e valores entre 3 e 460 ufc/20 cm2 durante as operações de preparação de alimentos. Neste estudo observámos que 88% das amostras colhidas a meio do período de laboração e após as operações de higienização tinham valores de coliformes superiores a 1 ufc/cm2 (não satisfatórias), podendo ter constituído um fator de contaminação cru-zada para os alimentos.

No que respeita a CT Souza e colaboradores (2004) encontraram valores médios de 2,5x102 ufc/cm2 e Neth e colaboradores (2008) referem valores médios de 1,3x104 ± 2x104 ufc/25 cm2. Neste estudo, consideran-do as contagens totais a meio do período de laboração e após as operações de higienização, observa-se que 56% das amostras têm valores superiores a 20 ufc/cm2 (não satisfatórias).

Quanto à avaliação da qualidade microbiológica do ar e à possibilidade de o mesmo agir como veículo de contaminação de alimentos e superfícies, 12% de não satisfatórios parece-nos um valor aceitável, mas não negligenciável. De facto outros autores referem valo-res mais elevados de não conformidade em ambientes de restauração (Melina e Brandão, 2011). No entanto e com base no reduzido número de amostras colhidas, não nos parece plausível retirar mais elações.

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Microminerais orgânicos e vitamina C nas rações de poedeiras semipesadas em região de clima quente

Mineral trace organic and vitamin C in the rations of semi-heavy laying hens in hot climate area

Débora P. Passos1, Mônica P. Maciel1, Diogo de M. Cardoso2, Sidnei T. dos Reis1, Cláudio L.C. Arouca1, Adelio N. Dias*1

1Universidade Estadual de Montes Claros (UNIMONTES) –Campus Janaúba - MG2Instituto Federal do Norte de Minas Gerais (IFET) – Campus de Arinos - MG

*Correspondência: [email protected] Tel: (31)-75169119

Resumo: O experimento foi conduzido para avaliar os efeitos da associação de microminerais orgânicos com a vitamina C, sobre o desempenho e qualidade dos ovos de poedeiras comer-ciais semipesadas, numa região de clima quente. Os tratamentos consistiam em 5 dietas, T1 - dieta controle com 1,0 kg/t de mi-crominerais na forma 100% inorgânica e sem suplementação de vitamina C; T2 - 1,0 kg/t de microminerais na forma de comple-xo orgânico e sem suplementação de vitamina C; T3 - 1,0 kg/t de microminerais na forma de complexo orgânico e 300 ppm de vitamina C; T4 - 1,5 kg/t de microminerais na forma de comple-xo orgânico e sem suplementação de vitamina C; T5 - 1,5 kg/t de microminerais na forma de complexo orgânico e 300 ppm de vitamina C. Utilizaram-se 400 poedeiras semipesadas da li-nhagem Hysex Brown, com idade inicial de 33 semanas e peso de 1.800 ± 100g. Foi utilizado um delineamento inteiramente casualizado, com 5 tratamentos, 8 repetições e 10 aves por uni-dade experimental. Não houve diferenças significativas (P>0,05) entre os tratamentos para características da qualidade do ovo e desempenho. Os tratamentos com suplementação de vitamina C e o uso de 1,5 kg/t de microminerais orgânicos levaram à pro-dução de ovos mais leves em relação a dieta controle (P<0,05). Conclui-se que a suplementação de vitamina C e microminerais orgânicos nas doses usadas na ração não melhora o desempenho e a qualidade dos ovos de poedeiras semipesadas em ambiente de alta temperatura.

Summary: The experiment was carried out in order to evalu-ate the association effects of organic micro minerals with the vitamin C on the performance and egg quality of commercial semi-heavy laying hens, in a hot climate area. The treatments were composed by 5 diets: T1 – control-diet with 1,0 kg/t micro minerals in the form 100% inorganic, without vitamin C sup-plementation; T2 - 1,0 kg/t micro minerals in the form of organic complex and without vitamin C supplementation; T3 - 1,0 kg/t micro minerals in the form of organic complex and 300 ppm of vitamin C; T4 - 1,5 kg/t micro minerals in the form of organic complex and without vitamin C supplementation; T5 - 1,5 kg/t micro minerals in the form of organic complex and 300 ppm of vitamin C. 400 semi-heavy laying hens, Hysex Brown, with initial age of 33 weeks and weight of 1.800 ± 100g were feed. A completely randomized design was performed, with 5 treat-ments, 8 replicates and 10 birds for experimental unit. There

were not significant differences (P>0,05) among the treatments, for characteristics of egg quality and performance. The treat-ments with vitamin C supplementation and the use of 1,5 kg/t of organic micro minerals lead the production of lighter eggs, in relation to control-diet (P <0,05). It’s concluded that the vitamin C supplementation and organic micro mineral at the tested con-centrations does not improve performance and eggs quality of semi-heavy laying hens in high temperature environment.

Introdução

A importância econômica da avicultura de postura para o Brasil é incontestável. O país é o sétimo maior produtor, e o nono maior exportador mundial de ovos. No entanto, o Brasil possui uma grande diversidade climática. Algumas regiões apresentam temperaturas muito elevadas, que exercem impacto negativo sobre a produção das aves. Em altas temperaturas, o consu-mo voluntário de ração diminui consideravelmente e as aves, muitas vezes, não consomem a quantidade de nutrientes necessários para um máximo desempenho. Adicionalmente, pesquisas têm demonstrado que aves em situação de estresse térmico não absorvem mine-rais e vitaminas da dieta de forma eficiente.

Segundo Hai et al. (2002), durante o estresse pelo calor, ocorre ainda uma redução na eficiência de con-versão dos alimentos, devido a queda na digestibilida-de, fato que pode contribuir para uma diminuição nas quantidades de nutrientes disponíveis para a produção e crescimento.

Atualmente, existe a necessidade de se avaliar al-ternativas para atenuar os efeitos da alta temperatura ambiental sobre as respostas fisiológicas e produtivas das aves. Dentre as alternativas disponíveis, destaca-se o manejo nutricional.

A associação de microminerais orgânicos e vitamina C na dieta das aves poderá trazer benefícios importan-tes para o desempenho e qualidade dos ovos de poe-

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deiras sob estresse térmico. No entanto, são escassas as pesquisas sobre os efeitos desta associação.

Os microminerais são considerados de grande im-portância na nutrição das aves, pois participam uma sé-rie de processos bioquímicos corporais, essenciais ao crescimento, desenvolvimento e formação óssea. Atu-almente, fontes de microminerais na forma orgânica tem sido avaliadas, e em alguns casos tem apresentado resultados positivos pelo fato de serem mais biodis-poníveis para as aves em relação as fontes inorgânicas comumente utilizadas.

Os minerais orgânicos ou quelatados são definidos por Leeson e Summers (2001) como sendo uma mistu-ra de elementos minerais que são ligados a algum tipo de transportador, o qual pode ser um aminoácido ou polissacarídeo, que possui a capacidade de se unir ao metal por ligações covalentes, através de grupamentos aminos ou oxigênio, formando assim uma estrutura cí-clica.

Hudson et al. (2004) registraram aumento na gravi-dade específica do ovo, redução no percentual de ovos trincados e aumento na concentração de zinco no ovo ao fornecerem dietas suplementadas com zinco orgâni-co para matrizes pesadas. Xavier et al. (2004) também observaram benefícios como melhorias nos índices de desempenho e qualidade dos ovos de poedeiras semi-pesadas com a inclusão de Se, Zn e Mg sob a forma de complexo orgânico. Em contrapartida, Sechinato et al. (2006) não observaram benefícios sobre o desempenho de poedeiras ao avaliarem uma fonte orgânica de mi-crominerais contendo Zn, Mn, I, Se, Cu e Fe.

Payne et al. (2005) avaliando fontes orgânicas e inor-gânicas de selênio, observaram uma maior deposição de selênio na gema com a fonte orgânica. Entretanto, as aves que receberam a fonte orgânica apresentaram uma maior porcentagem de ovos quebrados.

A vitamina C é classificada como hidrossolúvel, e assim como praticamente todas as vitaminas deste grupo, participa como cofator enzimático de muitas reações metabólicas. Além da deficiência na absorção da vitamina C da dieta, aves em situação de estresse por calor reduzem a síntese da mesma. Apesar de haver muitos resultados contraditórios, algumas pesquisas têm demonstrado efeito positivo da suplementação de vitamina C em aves sob estresse térmico.

Zapata e Gernat (1995), trabalhando com quatro diferentes concentrações de vitamina C (0, 100, 250 e 500 ppm), observaram um aumento na produção de ovos e no peso da casca com 250 e 500 ppm de vitamina C. Também Faria et al. (2001), avaliando o desempenho e qualidade dos ovos de poedeiras suple-mentadas com vitamina C em ambientes de alta tem-

peratura, verificaram um aumento na porcentagem de casca com a suplementação. Já Puthpongsiriporn et al. (2001), não observaram efeito sobre o ganho de peso, porcentagem de gema, albúmen e casca com o uso da vitamina C na dieta de poedeiras sob estresse térmico.

Devido ao exposto, objetivou-se com esta pesqui-sa avaliar os efeitos da associação de microminerais orgânicos com a vitamina C nas rações de poedeiras comerciais semipesadas em região de clima quente do Brasil.

Material e métodos

O experimento foi conduzido no Setor de Avicultura do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia (IFET), Campus Guanambi – BA, durante os meses de março a junho de 2009, sendo o período experimental de 12 semanas.

Foram utilizadas 400 poedeiras semipesadas da li-nhagem Hysex Brown, com idade inicial de 33 sema-nas e peso de 1.800 ± 100 g. As poedeiras foram alo-jadas em número de duas por gaiola com densidade de 600 cm2/ave em galpão convencional de postura, com comedouros tipo calha e bebedouros tipo “nipple” Foi instalado no centro do galpão um termo-higrômetro para registro da temperatura e umidade relativa do ar (UR) que tiveram variação média de 36 a 20 0C e 84 a 42% respectivamente, durante o período experimental.

Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado com 5 tratamentos, 8 repetições e 10 aves por unidade experimental. Os tratamentos experimentais consisti-ram numa dieta-controle e quatro dietas com adição de diferentes níveis de vitamina C e microminerais orgânicos, que foram ser assim esquematizados: Trata-mento 1 - dieta controle com 1,0 kg/t de microminerais na forma 100% inorgânica e sem suplementação de vi-tamina C; Tratamento 2 - 1,0 kg/t de microminerais na forma de complexo orgânico e sem suplementação de vitamina C; Tratamento 3 - 1,0 kg/t de microminerais na forma de complexo orgânico e 300 ppm de vitamina C; Tratamento 4 - 1,5 kg/t de microminerais na forma de complexo orgânico e sem suplementação de vita-mina C; Tratamento 5 - 1,5 kg/t de microminerais na forma de complexo orgânico e 300 ppm de vitamina C.

As rações, formuladas à base de milho e farelo de soja, eram isoenergéticas e isonutritivas, exceto para os nutrientes em estudo (microminerais e vitamina C). A formulação foi feita segundo as recomendações nutri-cionais do Manual da linhagem Hisex brown (2006). A composição e níveis nutricionais calculados das rações experimentais estão expostos na Tabela 1.


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As características da qualidade dos ovos, como peso específico (g/cm3), porcentagem de casca e espessura da casca (mm) foram medidas nos ovos colhidos nos três últimos dias de cada período de 21 dias.

Avaliou-se ainda, as características de desempenho como peso dos ovos (g), consumo de ração (g/ave/dia), produção de ovos (%), conversão alimentar (gramas de ração consu-mida/gramas de ovos produzidos) e perdas de ovos (%).

Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância. As médias dos tratamentos foram compara-das pelo teste Scott-Knott (5%), utilizando-se o pro-grama computacional SISVAR (Sistemas para Análi-ses de Variância), desenvolvido por Ferreira (2000).


Os resultados referentes ao desempenho das aves ali-mentadas com as diferentes dietas experimentais estão apresentados na Tabela 2.

Não houve influência significativa (P>0,05) da su-plementação de microminerais orgânicos e adição da

vitamina C na dieta sobre a produção de ovos (PROD), consumo de ração (CR), conversão alimentar (CA) e perdas de ovos (PERD).

As médias de desempenho foram inferiores ás en-contradas no Manual da linhagem Hisex Brown (2006). Isso provavelmente, se deve ao fato de que durante a maior parte do período experimental, as temperaturas estavam acima da zona de conforto térmico das aves, que segundo Ferreira (2005), não deve ultrapassar os 28 °C. De acordo com Faria et al. (2001), em ambiente de alta temperatura, a ave reduz o consumo de alimen-to e seu desempenho cai.

Os resultados obtidos estão de acordo com Puthpon-gsiriporn et al. (2001), que não observaram benefícios da suplementação de vitamina C sobre o desempenho de poedeiras em situação de estresse térmico. Discor-dam, no entanto, dos resultados publicados por Zapata e Gernat (1995), que obtiveram um aumento na produ-ção de ovos com 250 e 500 ppm de vitamina C na dieta das aves. Em relação ao uso microminerais organicos, os resultados corroboram os descritos por Xavier et al. (2004) que observaram melhorias nos índices de de-

Ingredientes T1 T2 T3 T4 T5

Milho 66,466 66,466 66,466 66,466 66,466

Farelo de soja 22,100 22,100 22,100 22,100 22,100

Calcário calcítico 8,630 8,630 8,630 8,630 8,630

Fosfato Bicálcico 1,400 1,400 1,400 1,400 1,400

Óleo de soja 0,580 0,580 0,580 0,580 0,580

Sal comum 0,410 0,410 0,410 0,410 0,410

DL-Metionina(99%) 0,134 0,134 0,134 0,134 0,134

Premix vitamínico* 0,100 0,100 0,100 0,100 0,100

PremixMineral-MI**/CO*** 0,100 0,100 0,100 0,150 0,150

Vitamina C (15%) 0,000 0,000 0,030 0,000 0,030

Inerte**** 0,080 0,080 0,050 0,030 0,000

TOTAL 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00

Composição calculada

EMAn (kcal/kg) 2.800 2.800 2.800 2.800 2.800

Proteína Bruta (%) 15,60 15,60 15,60 15,60 15,60

Lisina digestível (%) 0,690 0,690 0,690 0,690 0,690

Metionina+Cistina (%) 0,600 0,600 0,600 0,600 0,600

Cálcio (%) 3,700 3,700 3,700 3,700 3,700

Fósforo disponível (%) 0,350 0,350 0,350 0,350 0,350

Sódio (%) 0,180 0,180 0,180 0,180 0,180

* Premix vitamínico fornece (por kg do suplemento): vitamina A, 8000000 UI; vitamina D3,

2000000UI; vitamina E, 15000 mg; vitamina K3,

2000 mg; vitamina B2 4000 mg; vitamina B6, 1000 mg; vitamina B12, 10000 mg; niacina,19900 mg; ac.pantotênico, 5350 mg; Ac.fólico, 200 mg; colina, 140000; antioxidante, 100000 mg. ** Micromineral inorgânico (MI) fornece (por kg do suplemento): manganês,75000 mg; zinco, 70000 mg; ferro, 50000 mg; cobre, 8500 mg; iodo,1500 mg; selênio, 250 mg; cobalto, 200mg. *** Complexo orgânico (CO): manganês, 52000; ferro, 25000 mg; zinco, 44400 mg; cobre, 15400 mg; iodo, 1040 mg; selênio,180; cobalto, 100 mg.**** Inerte: caulim

Tabela 1 – Composição percentual e níveis nutricionais calculados das rações experimentais.


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sempenho de poedeiras semipesadas, com a adição de microminerais orgânicos.

Os diferentes tratamentos influenciaram o peso dos ovos (P<0,05). Dietas com suplementação da vitamina C ou uso de 1,5 kg/t de microminerais na forma orgâ-nica (T3, T4 e T5), tiveram efeito negativo sobre peso dos ovos. Conforme Leeson e Summers (2001), uma suplementação extra de minerais pode causar efeitos prejudiciais, podendo levar à redução da biodisponibi-lidade de outros minerais da dieta e causar, no limite, poluição ambiental. Já o uso de 1 kg/t de micromine-rais orgânicos na dieta sem adição da vitamina C (T2) não teve influência sobre o peso dos ovos em ralação à dieta controle.

Tabela 2 - Produção de ovos (PROD), consumo de ração (CR), peso dos ovos (PO), conversão alimentar (CA) e perdas de ovos (PERD), segundo as dietas experimentais.

1Tratamento PROD (%)

CR (g/ave/dia) PO (g) CA

(g/g) PERD (%)

T1 78,42 107,55 56,34*1 2,43 6,65

T2 77,97 105,73 56,95*1 2,38 7,06

T3 79,90 108,05 55,44*2 2,43 6,27

T4 79,26 104,35 55,23*2 2,38 6,98

T5 78,78 105,40 55,57*2 2,40 7,05

Média 78,86 106,22 55,90 2,40 6,80

CV 7,22 % 6,13% 4,36 % 8,04 % 29,59 %1T1 (Dieta-controle) = 1,0 kg/t de microminerais (MM) na forma 100% inorgânica e sem suplementação de vitamina C; T2 = 1,0 kg/t de MM na forma de complexo orgânico e sem suplementação de vitamina C; T3 = 1,0 kg/t de MM na forma de orgânico e 300 ppm de vitamina C; T4 = 1,5 kg/t de MM na forma de complexo orgânico e sem suplementação de vitamina C; T5 = 1,5 kg/t de MM na forma de complexo orgânico e 300 ppm vitamina C.

Os resultados referentes à qualidade dos ovos estão apresentados na Tabela 3. Não houve influência signi-ficativa (P>0,05) da suplementação de microminerais orgânicos e adição da vitamina C na dieta, sobre as características de qualidade dos ovos.

O peso específico é uma característica altamente correlacionada com a qualidade da casca do ovo. Mi-crominerais como o zinco, manganês e cobre partici-pam da formação da casca dos ovos e estão associados com a qualidade externa. No entanto, os níveis de mi-crominerais orgânicos utilizados neste estudo não de-monstraram vantagens em relação à fonte inorgânica nas características de qualidade da casca. Isso demons-tra a necessidade da realização de mais pesquisas que avaliem outros níveis de suplementação para esta fase de postura. Sendo que, alguns autores afirmam que os microminerais orgânicos podem substituir as fontes inorgânicas em níveis mais baixos, sem prejudicar o desempenho e a qualidade da casca, devido a sua maior biodisponibilidade.

Os resultados diferem dos encontrados por Faria et al. (2001) que observaram um aumento na porcenta-gem de casca com a suplementação de 200 ou 400 ppm

de vitamina C na dieta de poedeiras. Com relação ao uso de microminerais orgânicos, Xavier et al. (2004) observaram melhorias na qualidade dos ovos de poe-deiras semipesadas com a inclusão de Se, Zn e Mg sob a forma orgânica, diferindo da presente pesquisa.

Tabela 3 - Porcentagem de casca (PC), espessura da casca (EC) e peso específico (PE), segundo as dietas avaliadas.

1Tratamento PC (%) EC (mm) PE (g/cm3)

T1 8,765 0,456 1,0834

T2 8,898 0,463 1,0829

T3 8,802 0,446 1,0828

T4 8,945 0,467 1,0835

T5 8,716 0,445 1,0826

Média 8,825 0,455 1,0831

CV 5,80% 8,64% 0,22 %1T1 (Dieta-controle) = 1,0 kg/t de microminerais (MM) na forma 100% inorgânica e sem suplementação de vitamina C; T2 = 1,0 kg/t de MM na forma de complexo orgânico e sem suplementação de vitamina C; T3 = 1,0 kg/t de MM na forma de complexo orgânico e 300 ppm de vitamina C; T4 = 1,5 kg/t de MM na forma de complexo orgânico e sem suple-mentação de vitamina C; T5 = 1,5 kg/t de MM na forma de complexo orgânico e 300 ppm vitamina C.

Conclusão

A suplementação da vitamina C e o uso de micro-minerais orgânicos na dieta não melhoram a qualidade dos ovos nem o desempenho de poedeiras semipesadas da linhagem Hysex Brown, nas concentrações testadas, em ambiente de alta temperatura.

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Sistema integrado de Anomalocardia brasiliana e Gracilaria birdiae no tratamento de efluentes do cultivo de Litopenaeus vannamei em sistema heterotrófico em laboratório

Integrated system of Anomalocardia brasiliana and Gracilaria birdiae in the treatment of Litopenaeus vannamei culture effluents in a heterotrophic system in laboratory

Tereza Paiva Santos1*, Sérgio Catunda Marcelino1, William Severi1, Luis Otavio Brito2 e Alfredo Olivera Gálvez1

1Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Pesca e Aqüicultura. Av. Dom Manuel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, Recife, Pernambuco, Brasil, CEP 52171-900.

2Instituto Agronômico de Pernambuco, Departamento de Extensão Rural e Assistência Técnica. Av. General San Martin 1371, Bongi, Recife, Pernambuco, Brasil, CEP 50761-000.

Resumo: A eficiência de um sistema de tratamento integrado para melhorar a qualidade da água de efluentes de viveiros de camarão em sistema heterotrófico foi avaliada através de variáveis físico-químicas, utilizando o processo de filtração por Anomalocardia brasiliana e ab-sorção por Gracilaria birdiae. Foram utilizadas seis unidades, sendo três controle apenas com aeração e outras três com A. brasiliana (5 ind./L) permanecendo de 0 a 48 horas e G. birdiae (2g/L) de 48 a 96 horas, sem aeração. A redução do nitrogênio amoniacal (64%) e nitra-to (0,63%) pela macroalga G. birdiae demonstrou que a mesma pode ser utilizada para tratamento de compostos nitrogenados. Entretanto, o sistema integrado de filtração (A. brasiliana) e absorção (G. birdiae) parece não ser uma eficiente ferramenta na remoção de compostos fosfatados no tratamento de efluentes provenientes de cultivo de ca-marões marinhos em sistemas heterotróficos.

Summary: The efficiency of a system of integrated treatment to im-prove the quality of shrimp culture effluent in heterotrophic system was evaluated through physical-chemical variables, using processes of filtration by Anomalocardia brasiliana and uptake by Gracilaria birdiae. Six units were used, being three controlled with aeration and another three with A. brasiliana (5 ind. L-1) remaining from 0 to 48 hours and G. birdiae (2g L-1) from 48 to 96 hours without ae-ration. The reduction of ammonia (64%) and nitrate (0.63%) by the seaweed G. birdiae showed that it can be used to treat nitrogenous wastes. However, the integrated filtration (A. brasiliana) and uptake (G. birdiae) procedure does not seem to be an efficient tool in the removal of phosphorous compounds in the treatment of effluents from shrimp farming in heterotrophic systems.

Introdução

Após período de reorganização do setor da carcini-cultura no Brasil devido aos problemas enfrentados com o surgimento de doenças, como o vírus da mio-

necrose infecciosa (IMNV), vírus da mancha bran-ca (WSSV) e o processo antidumping realizado pela Aliança Sulista de Pescadores de Camarão (SSA, sigla em inglês) dos Estados Unidos, pode-se observar um aumento na produção no país. Segundo ABCC (2012), a produção brasileira de camarão marinho no ano de 2011 atingiu 69.571 toneladas.

Apesar das expectativas positivas, não se pode dei-xar de reconhecer que a carcinicultura apresenta riscos significativos do ponto de vista ambiental (Ramos et al., 2008). Segundo Nunes et al. (2005), no Estado do Ceará, uma das principais regiões produtoras de ca-marão marinho do Brasil, apenas 32,6% das fazendas fazem algum tipo de tratamento de afluentes ou efluen-tes, sendo a retenção por telas a principal metodologia empregada.

Os problemas mais frequentes ocasionados pela car-cinicultura são: a poluição dos corpos de águas natu-rais com nutrientes, o aumento dos níveis de clorofila-a, matéria orgânica e de sólidos em suspensão, que se encontram na forma particulada ou dissolvida na água. Os materiais particulados são detritos orgânicos, como fezes de camarão, restos de ração não consumida e fertilizante, em sua maioria (Paez-Osuna et al., 1997; Nunes, 2002; Nunes et al., 2005).

Os sistemas de produção semi-intensivo ou intensivo utilizados influenciam no volume e na quantidade dos efluentes produzidos, tendo relação com o manejo e layout da fazenda (Silva-Neto et al., 2012). Aspectos como a proteção dada aos diques e taludes, o posicio-namento dos aeradores, a profundidade dos viveiros, as práticas de manejo alimentar e a digestibilidade da ra-ção, influenciam diretamente na quantidade de sólidos *Correspondência: [email protected]

Santos TP et al. RPCV (2013) 108 (585-586) 59-64

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em suspensão e de excreta dos animais (Paez-Osuna et al., 1997; Nunes, 2002). Entre 52-95% do nitrogênio e 85% do fósforo que entra via ração nos sistemas de aqui-cultura tradicional são perdidos no ambiente, podendo causar eutrofização (Xu et al., 2008). Nos sistemas de aqüicultura, a maior parte do nitrogênio e fósforo pre-sente é proveniente das rações e fertilizantes utilizados, além da excreção animal, que geralmente estão dispo-nível sob a forma de amônio (NH

4) e ortofosfato (PO

4)

(Matos et al., 2006). Uma alternativa viável para o tratamento dos efluen-

tes provenientes da aqüicultura é o uso de organismos como biofiltro. A remoção biológica de matéria orgâ-nica e inorgânica pode ser feita mediante a utilização de moluscos filtradores (Jones e Preston, 1999; Lefe-bvre et al., 2000; Olivera e Brito, 2005; Modesto et al., 2010), algumas espécies de macroalgas (Carmo-na et al., 2006; Zhou et al., 2006; Matos et al., 2006; Marinho-Soriano et al., 2009 e 2011; Alencar et al., 2010; Abreu et al., 2011; Skriptova e Miroshnikova, 2011; Al-Hafedh et al., 2012; Robledo et al., 2012) ou mesmo sistemas integrados (Jones et al., 2001 e 2002; Junior et al., 2005; Shimoda et al., 2006; Rocha et al., 2008; Ramos et al., 2010).

A espécie Anomalocardia brasiliana (Gmelin, 1791), pertencente à família Veneridae, é conhecida popular-mente no Brasil por marisco, búzio, vôngole e berbigão, sendo um dos moluscos bivalves marinhos mais explo-rados comercialmente (Boehs et al., 2010). Já as macro-algas do gênero Gracilaria são algas vermelhas do filo Rhodophyta e têm alto valor econômico, pois são maté-ria prima de vários produtos comerciais, além de fonte de alimento para os seres humanos (Neori et al., 2004).

O objetivo desta pesquisa foi avaliar a utilização integrada de Anomalocardia brasiliana e Gracilaria birdiae no tratamento dos efluentes do cultivo hetero-trófico de Litopenaeus vannamei em laboratório.

Material e métodos

O experimento foi realizado no Laboratório de Ma-ricultura Sustentável (LAMARSU) do Departamento de Pesca e Aqüicultura na Universidade Federal Rural de Pernambuco, Brasil, através de um delineamento inteiramente casualizado, com dois tratamentos e três repetições. O Tratamento I considerado como contro-le foi realizado só com aeração, e o Tratamento II foi composto por um sistema integrado de Anomalocardia brasiliana (0 a 48 horas) e Gracilaria birdiae (48 a 96 horas), sem aeração.

Os indivíduos de A. brasiliana foram provenientes da praia de Mangue Seco, situada no litoral Norte de Per-nambuco – Brasil (07°49’44,19’’ S e 035°50’03,06’’ W) transportados em sacos plásticos com água do mar do local de coleta. No laboratório, os animais foram aclimatados em tanques de 200 L contendo água sob areação constante e, em seguida, alimentados com as

microalgas (30 x 104 cel. mL-1) Chaetoceros calcitrans, Isochrysis galbana e Tetraselmis tetrathele, durante 48 horas.

A biomassa de G. birdiae foi obtida de um cultivo localizado na praia de Pau Amarelo, situada no lito-ral Norte de Pernambuco – Brasil (07º54’54.74¨S, 034º49’12.07¨W), transportada em caixas de isopor com água do mar do local de coleta. No laboratório, os exemplares foram aclimatados em tanques de 200 L, fertilizados com NO

3Na (0,04 g/L) e areação constan-

te, durante 48 horas.Os efluentes utilizados neste experimento foram

provenientes de um cultivo em meio heterotrófico de Litopenaeus vannamei (densidade de estocagem 200 PL. m-3, tempo de cultivo 82 dias) em laboratório. Ini-cialmente, o efluente foi armazenado em uma caixa d’água com volume de 1. 500, L, por um período de três dias. Posteriormente, a água foi homogeneizada e distribuída nas unidades experimentais, representadas por seis tanques com 200 L de volume útil e salinidade de 35. A densidade de estocagem para A. brasiliana foi de 5 ind/L e de G. birdiae de 2 g/L de material úmido.

Foram realizadas coletas de água a cada 6 horas. As análises foram realizadas no Laboratório de Limnolo-gia do Departamento de Pesca e Aqüicultura na Uni-versidade Federal Rural de Pernambuco. As variáveis foram analisadas de acordo com os seguintes métodos: turbidez - com um turbidímetro de bancada, amônia (Koroleff, 1976), nitrito (Golterman et al., 1978), ni-trato (Macherett et al., 1978), fósforo total, fosfato to-tal dissolvido e fosfato inorgânico (Eaton et al., 1995) e clorofila-a (Nusch, 1980). No momento da coleta também foi realizada a aferição do pH, com potencio-metro de Modelo pH Meter TEC-2.

Os dados foram submetidos aos testes de Kolmogorov-Smirnov e Bartlett para avaliação da normalidade e ho-mogeneidade das variâncias. Observando-se que os dados não tiveram homogeneidade da variância nem apresenta-ram distribuição normal, foi utilizado o teste não paramé-trico de Kruskall-Wallis (p < 0,05), a fim de avaliar o grau de significância em relação à redução de nutrientes.


As variáveis nitrogênio amoniacal, fosfato inorgâni-co, fosfato total, fósforo total, turbidez e pH da água do efluente foram significativamente diferentes entre o tratamento controle e aquele com A. brasiliana (0 a 48 horas) (Tabela 1). Já entre o tratamento controle e aquele com G. birdiae (48 a 96 horas) foram obser-vadas diferenças significativas para nitrogênio amo-niacal, nitrato, nitrito, fosfato inorgânico, fosfato total, clorofila-a e turbidez (Tabela 2).

Nitrogênio amoniacal, nitrito e nitrato

Nos dois tratamentos estudados ocorreu um aumento


61

da concentração de nitrogênio amoniacal. Entretanto, no tratamento II este aumento foi significativo, devido à excreção de compostos nitrogenados por A. brasi-liana (Figura 1). Este incremento está de acordo com os resultados encontrados por Jones et al. (2001), Shimoda et al. (2006) e Modesto et al. (2010). En-tretanto, Jones e Preston (1999), Junior et al. (2005) e Rocha et al. (2008) encontraram uma redução sig-nificativa na concentração destes compostos com a utilização de ostras e macroalgas, provavelmente devido à biomassa estocada e à menor concentração inicial de nitrogênio amoniacal dos efluentes.

No tratamento II, quando a água dos efluentes passou do sistema com bivalves para aquele com macroalgas ocorreu uma redução significativa das concentrações de nitrogênio amoniacal, de modo semelhante ao reportado por Carmona et al. (2006), Zhou et al. (2006), Alencar et al. (2010), Abreu et al. (2010), Marinho-Soriano et al. (2011) e Robledo et al. (2012).

O tratamento I foi eficiente em relação à variável nitrito dos efluentes do cultivo heterotrófico, oca-sionando uma redução de 98,14%, devido à ação das bactérias nitrificantes sob aeração, enquanto no tratamento II sem aeração houve um incremento de 55,55% no período de 96 horas (Figura 2). Olivera e Brito (2005) relatam que a ostra Crassostrea rhizo-phorae não consegue reduzir o nitrito da água, resul-

tados semelhantes àqueles observados para A. bra-siliana. As macroalgas também não tiveram efeito positivo na redução de nitrito, provavelmente devido à maior facilidade das macroalgas do gênero Graci-laria em absorver o nitrogênio nas formas amoniacal e de nitrato (Hanisak, 1983; Glenn et al., 1999; Jones et al., 2001 e 2002).

Está maior facilidade de absorção ocasionou uma redução de 6,13% (Figura 3). Redução de nitrato também foi encontrada por Modesto et al. (2010), com a utilização de ostras, e por Marinho-Soriano et al. (2009 e 2011) com G. birdiae e G. caudata. No tratamento I houve um incremento de 9,21% após o período de 96 horas.

Neste estudo, considerando a utilização de A. bra-siliana e G. birdiae num mesmo tratamento, pode-se observar que a concentração de nitrogênio amoniacal total aumentou nas primeiras 48 horas e sofreu uma redução no restante do experimento (96 horas). A concentração de nitrato sofreu redução com a utiliza-ção conjunta de A. brasiliana e G. birdiae, enquanto a de nitrito permaneceu estável nas primeiras 48 ho-ras e sofreu um aumento no restante do experimen-to. Estes dados revelam que A. brasiliana não é um eficiente biofiltro para compostos nitrogenados, en-quanto Gracilaria demonstrou ser capaz de reduzir as concentrações de nitrogênio amoniacal e nitrato no período analisado (48 horas).

Tabela 1 – Dados da eficiência de redução (red) do tratamento controle comparado ao tratamento com Anomalocardia brasiliana (0 a 48 horas) (Kruskall Wallis controle x A. brasiliana).

Variáveis/Tratamentos Controle Anomalocardia Controle x A. brasiliana

NH4+ + NH3 (red) - - p=0,0001

PO4- inorgânico (red) 10,26% - p=0,0001

PO4- total (red) 3,23% - p=0,0010

Ptotal (red) - - p=0,0340

Turbidez (red) 66,31% - p=0,0001

pH (red) 0,66% 1,53% p=0,0001

NH4

+ + NH3 – nitrogênio amoniacal, PO

4- inorgânico - fosfato inorgânico, PO

4- total - fosfato total, P

total – fósforo total.

Tabela 2 – Dados da eficiência de redução (red) do tratamento controle comparado ao tratamento com Gracilaria birdiae (48 a 96

horas) (Kruskall Wallis controle x Gracilaria birdiae).

Variáveis/Tratamentos Controle Gracilaria Controle x Gracilaria

NO3-(red) - 0,63%, p=0,0001

NO2-(red) 97,71% - p=0,0001

NH4+; NH3 (red) 24,17% 64,64% p=0,0001

PO4- inorgânico (red) 19,49% - p=0,0001

PO4- total (red) - - p=0,0020

Ptotal (red) 14,51% 3,12%, p=0,0018

Clorofila-a (red) - 50% p=0,0001

Turbidez (red) - 82,65% P=0,0003

NH4+ + NH3 – nitrogênio amoniacal, PO4

- inorgânico - fosfato inorgânico, PO4- total - fosfato total, Ptotal – fósforo total.


62

Figura 1 – Concentração de nitrogênio amoniacal durante a fase experimental para os tratamentos I (controle) e II (Anomalocar-dia brasiliana e Gracilaria birdiae).

Figura 2 – Concentração de nitrito durante a fase experimental para os tratamentos I (controle) e II (Anomalocardia brasiliana e Gracilaria birdiae).

Figura 3 – Concentração de nitrato durante a fase experimental para os tratamentos I (controle) e II (Anomalocardia brasiliana e Gracilaria birdiae).

Figura 4 – Concentração de fosfato inorgânico durante a fase experimental para os tratamentos I (controle) e II (Anomalocar-dia brasiliana e Gracilaria birdiae).

Figura 5 – Concentração de fosfato total durante a fase expe-rimental para os tratamentos I (controle) e II (Anomalocardia brasiliana e Gracilaria birdiae).

Figura 6 – Concentração de fósforo total durante a fase expe-rimental para os tratamentos I (controle) e II (Anomalocardia brasiliana e Gracilaria birdiae).

Figura 7 – Concentração de clorofila-a durante a fase experi-mental para os tratamentos I (controle) e II (Anomalocardia bra-siliana e Gracilaria birdiae).

Figura 8 – Concentração da turbidez durante a fase experimen-tal para os tratamentos I (controle) e II (Anomalocardia brasilia-na e Gracilaria birdiae).


63

Fosfato inorgânico, fosfato total e fósforo

O tratamento I proporcionou uma redução de 27,88% da concentração de fosfato inorgânico dos efluentes de cultivo heterotrófico, enquanto no tratamento II houve um incre-mento de 39,37% no período de 96 horas (Figura 4). Em relação ao fosfato total, nos tratamentos I e II houve um incremento respectivo de 16,45% e 45,45%, no período de 96 horas (Figura 5). Já em relação ao fósforo total, não fo-ram observadas diferenças entre as concentrações iniciais e finais no tratamento I, enquanto no tratamento II houve um incremento de 17,20% no período de 96 horas (Figura 6).

O tratamento I demonstrou ser adequado para a redu-ção de fosfato inorgânico e fósforo total, porém não foi eficiente para fosfato total. Os resultados encontrados no tratamento II em relação aos compostos fosfatados foram diferentes daqueles obtidos por Olivera e Brito (2005) e Modesto et al. (2010), que registraram uma redução na concentração destes compostos apenas com a utilização de ostras. Com a utilização das macroalgas G. vermicu-lophyla (Skriptova e Miroshnikova, 2011) e G. arcuata (Al-Hafedh et al., 2012) foram observadas reduções de 34 e 41%, respectivamente, da concentração de fosfato. A. brasiliana e G. birdiae não demonstraram ser biofiltros eficientes na redução dos compostos fosfatados.

Clorofila-a e turbidez

O tratamento II proporcionou uma redução de 90,32% na concentração de clorofila-a dos efluentes de cultivo heterotrófico, enquanto no tratamento I houve um in-cremento de 62,5% no período de 96 horas (Figura 7). Ambos os tratamentos ocasionaram uma redução na concentração da turbidez dos efluentes (Figura 8). Jones et al. (2001), Shimoda et al. (2006) e Rocha et al. (2008) também encontraram redução na turbidez e na concen-tração de clorofila-a quando da utilização de ostras e macroalgas. O incremento da clorofila-a no tratamento I pode ser atribuído à elevação da concentração de nitra-to, que possivelmente favoreceu a proliferação de algas. Modesto et al. (2010) relata que as ostras podem chegar a reduzir em média 6,85% do fitoplâncton dos efluentes.

Conclusões

A reduzida absorção dos compostos nitrogenados e fosfatados pelas macroalgas provavelmente está re-lacionada à reduzida iluminação, pois o experimento foi conduzido em laboratório, onde a incidência solar era limitada por telha transparente, na medida em que macroalgas do gênero Gracilaria têm preferência pela luz solar direta para uma absorção mais eficiente dos nutrientes. Além disso, o período de 48 horas demons-trou ser insuficiente para a absorção dos nutrientes pe-las macroalgas, provavelmente resultando numa menor eficiência. Já em relação aos mariscos, os mesmos não foram eficientes isoladamente na redução dos compos-tos nitrogenados e fosfatados.

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RPCV (2013) 108 (585-586) 69-91

XVIII Meeting of the Portuguese Society of Animal Pathology - International Meeting of Leporidae Pathology

Editorial

The Portuguese Society of Animal Pathology (SPPA) is a small non-profit organization and a “daughter” So-ciety of the Portuguese Society of Veterinary Science (SPCV), which normally holds an annual meeting in the institutions from which its members belong (e.g. universities or government laboratories with activities in the field of Pathology).

In an effort to decentralize their meetings, a tradition already started before, and both to aim at involving the community of teachers and students of the research in-stitutions that host the annual meeting and also to di-versify the main subject of its meetings, SPPA targeted new, younger and broader audiences, as well as new sectors and knowledge fields, trying to cover the pa-thology of a wide animal species range. Hence, to the present meeting we have chosen leporideae pathology as the main subject and a necropsy workshop, open to students and technicians - XVIII Meeting of the Por-tuguese Society of Animal Pathology. International Meeting of Leporidae Pathology, 9 and 10th of May 2013.

Also, continuing the journey, already begun, of aiming evermore towards internationalization, this meeting will have reputable national and internation-al speakers, to whom above all I acknowledge their presence and immediate acceptance. Moreover, the scientific committee with national and international members, the three official languages, and the wid-est dissemination among technicians and students, will certainly make this meeting more open, more in-volved and more attractive. So we hope, so we wish, so we worked for!

Our special guests will include an international ex-pert, who will share with us his scientific knowledge, Prof. Dr. Daniel Fernandez de Luco Martinez, profes-sor at the University of Zaragoza in the Department of Animal Pathology, Faculty of Veterinary Science. Graduated in Veterinary Medicine by the University of Zaragoza in 1985 and obtained a PhD by the same institution in 1991. He has developed his research in pathology of wildlife and wildlife hunting health con-trol in the region of Aragon in Spain. He has dozens of publications in international peer-review journals and was a guest speaker at dozens of conferences. He is responsible for several research projects, having juried several doctoral theses.

Also, not forgetting nationals with high value and enriching practical experience in the field, an Europe-an expert, Dr. José Manuel Monteiro Azevedo. He has earned his degree in Veterinary Medicine in the Uni-versity of Tras-os-Montes and Alto Douro in 1999, and is currently a Veterinarian for Coren, Spain, being the Head of Industrial Rabbit Farming and the responsible for the Industrial Cuniculture in the Iberian Peninsula. His professional activity, since graduation, has been dedicated to rabbits having taken several positions at national and international companies. He collaborated in teaching several courses at the University of Trás-os-Montes and Alto Douro.

We will have the opportunity to share and exchange experiences on animal pathology, results of research projects, discuss pathological diagnosis of difficult or rare cases, as well as the recent scientific advances in this field in Europe, which is undoubtedly the largest professional enrichment we could obtain. For the 18th time this small scale but dynamic meeting, constitutes an enrichment both scientifically, technically and pro-fessionally, and will allow us to grow a bit more pro-fessionally. Moreover, this will be also an excellent op-portunity to meet again our colleagues and friends and to discover Evora, one of the most interesting, beauti-ful and pleasant cities to visit in Portugal.

The success of this meeting is already notorious by the number of members who decided to join us. Thank you for believing in this project, thank you for being here!

In the name of SPPA and the Organizing Commit-tee, I want to acknowledge all those who contributed to make this event possible, namely the University of Évora, in the person of its Rector Ex º Sr. Prof. Dr. Carlos Alberto dos Santos Braumann and of its Vice-Rector, Prof. Dr. Marta Silvério, for immediately wel-coming this endeavor, namely for all the logistical sup-port provided and specially the generous availability in providing their facilities. I would like to acknowledge the Portuguese Society of Veterinary Sciences who provided an important assistance in the financial man-agement, and all those who helped us, teachers, stu-dents, staff and sponsors.

The President of SPPA

Helena Maria Vala Correia

SUPLEMENTO RPCV (2013) 108 (585-586) 69-91

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Common gross lesions in farmed rabbits

Fernández de Luco D. *

Departamento de Patología Animal. Facultad de Vete-rinaria. Universidad de Zaragoza. C/ Miguel Servet 177. 50013 Zaragoza. Spain.

* [email protected]

Introduction: The identification of rabbit gross le-sions by systems and organs in association with a dis-ease, syndrome, aetiology or unknown cause is very important for veterinary practitioners.

Material and methods: Necropsy has been made in several farmed rabbits with mainly respiratory or di-gestive problems, as well as delayed growth.

Results: Dermatitis associated to myxomatosis, ringworm, mange or staphylococci are common.

The respiratory system problems are localized in the nasal cavity and lungs mainly associated to Pasteurella multocida and Bordetella bronchiseptica. Young rab-bits are especially sensitive to acute and chronic pneu-monia. Haemorrhages can be seen in cases of rabbit calicivirus disease.

Probably, digestive processes are the most important problems in growing rabbits. Epizootic rabbit enterop-athy, with still unknown aetiology, is a relatively recent process that has become the main cause of mortality in farmed rabbit. Other enteritis processes are princi-pally associated to coccidia, E. coli, Clostridium spp., C. spiroforme, C. piliforme (Tyzzer’s disease), Salmo-nella spp., as well as nematodes (Passalurus spp.). In-flammation and necrosis of the liver can be observed as small white spots associated to Eimeria stiedae (hepatic coccidiosis), Salmonella spp., C. piliforme, Cysticercus pisiformis, etc. Necrosis with karyorrhexis of the hepatocytes is a common finding in rabbit cali-civirus disease.

Testis, uterus and mammary gland are the main or-gans affected in the reproductive system, as well as dystocia in pregnant rabbits. Processes and agents mainly involved are mixomatosis, syphilis (Treponema cuniculi), P. multocida, Staphylococcus spp., etc

Finally, encephalitozoonosis by Encephalitozoon cuniculi is present in many rabbitries. Nervous signs, granulomatous encephalitis and interstitial nephritis are present in the affected animals.

Situações de urgência em cunicultura industrial

Monteiro J.M.1*, Alegria N.2, Coelho A.C.2

1 Sumicor Portugal Lda; Coren S. C. G.2 Dept. de Ciências Veterinárias, CECAV, Universidade

de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD)

* josé[email protected]

Introdução: O médico veterinário durante a sua atividade contribui para a redução das perdas associa-das à morbilidade e mortalidade em cunicultura, para a melhoria dos resultados produtivos, atuando como consultor e orientando o produtor nos investimentos.

O presente trabalho teve como objetivo reportar a atuação do médico veterinário na sua vertente clínica, dando ênfase às principais situações de emergência em cunicultura.

Material e métodos: Procedeu-se à realização de um estudo observacional retrospetivo da actividade clínica na Península Ibérica, durante os anos de 2009 a 2012.

Foi efectuado o exame clínico dos animais prove-nientes de 76 explorações, tendo-se procedido à rea-lização de necrópsias, com recurso a exames laborato-riais e elaboração dos respetivos registos que serviram de base ao presente estudo.

Resultados: Determinou-se que a maioria das cha-madas de urgência, se deveram às condições clínicas de enteropatia mucóide, colibacilose, pasteurelose, po-dodermatite, mixomatose e enterotoxemia cujas lesões anatomopatológicas foram documentadas.

As explorações com maternidade e engorda no mes-mo pavilhão, mau maneio, sem controlo ambiental e sujeitas a variações climáticas, situações potencialmen-te geradoras de maior stresse e consequente redução da imunidade, apresentaram aumento da morbilidade e menor produtividade, enquanto as explorações com ambiente controlado e bom maneio, revelaram menos situações de emergência clínica e boa produtividade.

Conclusão: Foi possível verificar que as explorações onde as medidas de bem-estar animal e de controlo am-biental rigoroso já se encontravam implementadas, apre-sentaram melhores resultados produtivos e menor mor-bilidade em todas as fases de produção. Os resultados sugerem que a actuação do médico veterinário deverá in-cidir também nas vertentes atrás referidas, pois só assim se conseguirá aumentar a rentabilidade das explorações.

Emergency Situations in Industrial Rabbit Farming

Introduction: The veterinary doctor in the course of his activities contributes to the reduction of losses as-

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sociated with morbidity and mortality, by improving the results of production, acting as a consultant, and orienting the producer in his investments.

The present paper has as its objective to report on the performance of the veterinary doctor in the clini-cal aspect of his work, giving emphasis to the princi-pal emergency situations in rabbit farming.

Material and methods: A retrospective observa-tional study was carried out of the clinical activity in the Iberian Peninsula during the years 2009 to 2012.

The clinical examination of animals from 76 inves-tigations was carried out, subsequent to the realization of autopsies, with the use of laboratory tests whenever necessary and the elaboration of the respective regis-ters which served as a base for the present study.

Results: It was found that the majority of emergency calls, resulted from the clinical conditions of mucoid enteropathy, colibacillosis, pasteurellosis, foot pad der-matitis, myxomatosis and enterotoxaemia, of which the

anatomopathological injuries were documented.Farms with maternity and fattening stages in the same

building, poor handling, without environmental control and subjected to climatic variations, all of which were potential generators of major stress and consequently reduction in immunity, showed an increase in morbidity and lower productivity, while the farms with environ-mental control and good handling revealed less clinical emergency situations and good productivity.

Conclusion: It was possible to verify that the farms where the animal welfare measures being and rigor-ous environmental control had already been imple-mented showed better results in production and less morbidity in all the phases of production. The re-sults suggest that the activity of the veterinary doctor should also occur in the aspects previously referred; as it is only in this way that it will be possible to in-crease the profitability of the farms.

Controlo de pragas em parques Zoológicos: repercussões parasitárias, patológicas e de Saúde Pública

Crespo, A.P.1,2*, Lapão, N.1, Correia, J. 2, Gomes, L. 2, Vaz, Y.2 Madeira de Carvalho, L.M.2

1 Jardim Zoológico de Lisboa, Estrada de Benfica, 158-160, 1549-004 Lisboa;

2 CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universi-dade Técnica de Lisboa, Av. da Universidade Técnica de Lisboa, 1300-477 Lisboa, Portugal ([email protected]);

* [email protected]

Introdução: A ligação próxima entre animais, Homem e pragas em zoos ou parques zoológicos, constitui um risco na transmissão de muitos agentes de doença, alguns dos quais ocasionando doenças zoonóticas, podendo afectar não só os animais da colecção zoológica, como também trabalhadores do zoo e visitantes.

Material e métodos: Integrado num estudo so-bre controlo de pragas no Jardim Zoológico de Lis-boa, efectuou-se um rastreio parasitológico em 100 roedores (50 Mus musculus e 50 Rattus norvegicus). Os endoparasitas adultos foram coligidos após de-cantações dos conteúdos gastrintestinais e esfregaços por aposição do fígado (coloração pelo Giemsa) e de fezes (coloração pelo Ziehl-Neelsen), efectuando-se análises coprológicas por flutuação (método de Wil-lis) e de sedimentação espontânea. Os fígados foram submetidos a análise histológica, fragmentos do fí-

gado foram fixados durante 24 horas, procedeu-se ao corte dos blocos de parafina e as amostras foram fixadas e coradas pela coloração da Hematoxilina e Eritrosina.

Resultados: Dos roedores observados, 82 apresen-taram formas de endoparasitas, com prevalências de 84,0% para R. norvegicus e de 80,0% para M. muscu-lus. Das espécies de roedores, Rattus norvegicus rep-resentou maior importância na transmissão dos para-sitas assinalados. Identificaram-se um total de cinco espécies de endoparasitas com potencial zoonótico: Hymenolepis diminuta (16,0%), Cysticercus fasciola-ris (12,0%), Syphacia obvelata (37,0%), Calodium hepaticum (32,0%) e Cryptosporidium sp. (5,0%).

Conclusão Deste conjunto de parasitas, C. hepati-cum, que já foi detectado após a morte de primatas não humanos com consequências patológicas no fí-gado daqueles hospedeiros. Além da perda de ani-mais, o risco zoonótico de transmissão de parasitas, bactérias e vírus aos trabalhadores e visitantes do Jardim Zoológico de Lisboa, deve ser sempre con-siderado como um problema de grande importância e impacto em Saúde Pública.

Pest control in Zoos: parasitic, pathologi-cal and Public Health repercussions

Introduction: The close connection between ani-mals, humans and pests, poses a risk for the transmis-sion of many agents, some of them causing zoonotic diseases, affecting not only the animals in the zoo-logical collection, as well as, zoo workers and visitors themselves.

Oral communications

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Material and methods: Following a pest control study at the Lisbon Zoo, a survey on endo and ectopar-asites was performed on 100 commensal rodents (50 Mus musculus and 50 Rattus norvegicus). Endopara-sites were collected from the gastrointestinal contents by a decanting process (adult specimens). Smears by liver apposition (Giemsa staining) and by extension feces (Ziehl-Neelsen staining), together with copro-logical exams by Willis flotation and spontaneous sedi-mentation techniques, were performed. The livers sub-jected to histological analysis of liver fragments were fixed for 24 hours, proceeded to cut the paraffin blocks and the samples were fixed and stained by Hematoxy-lin staining and Erythrosine.

Results: From the total number of studied rodents, 82 were positive for endoparasites, with prevalence rates of 84.0% for R. norvegicus and 80.0% for M.

musculus. Concerning the role of rodent species in parasite transmission, Rattus norvegicus represented the greater importance. Five species of endoparasites with zoonotic potential were identified: Hymenolepis diminuta (16.0%), Cysticercus fasciolaris (12.0%), Syphacia obvelata (37.0%), Calodium hepaticum (32.0%) and Cryptosporidium sp. (5.0%).

Conclusion: Of this set of parasites, C. hepaticum constitutes an extreme example, since its presence was already detected after death in non-human primates, with severe consequences for these hosts liver. Beside the loss of animals, the risk of transmission of zoonotic parasites, bacteria and viruses to workers and visitors of the Lisbon Zoo should always be considered as a problem of great importance and impact on Public Health.

Um caso de intoxicção por cebola (Allium cepa) em bovinos

Monteiro M. 1*, Mendonça P. 1, Carvalho P.1, Maria-no I.2

1 Laboratório de Patologia/INIAV;2 Laboratório Veterinário de Montemor-o-Novo

* [email protected]

Introdução: A anemia hemolítica resultante do consumo prolongado de cebolas, Allium cepa, tem sido descrita em várias espécies animais nomeada-mente em cães, bovinos e caprinos; o princípio tóxico presente na cebola é o n-propil-dissulfito responsável por alterações da hemoglobina.

Os Autores descrevem vários casos de mortes em bovinos adultos que eram alimentados com pastagem natural e recebiam um suplemento de silagem de des-perdício de tomate misturada com cebolas e alhos.

Caso clínico: Os animais apresentavam anemia, hemoglobinúria e em alguns casos, icterícia.

Foram realizadas as necrópsias de dois animais; a abertura do cadáver revelou um intenso cheiro a ce-bolas; observaram-se alterações hepáticas e renais.

Discussão: Microscopicamente havia extensas zo-nas de necrose hepática centrolobular e necrose dos tubos renais simultaneamente com acumulação dum material compatível com hemoglobina.

Os exames efectuados em animais coabitantes, para diagnóstico diferencial com doenças que podem apre-sentar sinais clínicos idênticos, resultaram negativos para leptospirose sendo detectada, em apenas um ani-mal, uma pequena infecção de Theileria annulata.

Conclusão: As lesões microscópicas são sugestivas de uma anemia hemolítica tendo a sua associação ao suplemento alimentar em causa, permitido concluir

que se trata dum caso de intoxicação por cebolas; acresce-se ainda que, após ter sido retirado o referido suplemento e administrada uma terapêutica de supor-te, os animais que estavam doentes recuperaram e não houve mais mortalidade.

A case of onion (Allium cepa) intoxication in cattle

Introduction: In domestic animals the prolonged ingestion of onion (Allium cepa) has long been asso-ciated with the emergence of hemolytic anemia. This toxicity is due to the presence of n-propil- disulphide.

In this presentation the authors describe the occur-rence of several cases of toxicity in a grazing bovine herd due to ingestion of silage containing tomato, on-ion and garlic by-products.

Clinical case: The affected animals showed ane-mia, haemoglobinuria and, occasionally, jaundice leading to death in some severe cases.

Three animals were submitted to necropsy and the most prominent feature was a marked onion odor. The kidneys were dark brown and the liver slightly orange. Microscopically extensive areas of centrolobular liver necrosis as well as renal tubular necrosis with accu-mulation of hemoglobin-like material were seen.

Differential diagnostic testing excluded leptopiro-sis and revealed one Theileria annulata infected ani-mal.

Conclusion: The symptoms and the lesions ob-served were strongly suggestive of a haemolytic ane-mia. Taken together with the feed supplementation these facts enabled us to conclude for onion toxicity. Furthermore, after the discontinuation of the referred silage supplement and upon implementation of sup-portive care, the affected animals began to recover and no further deaths occurred.

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Um caso raro de neoplasia retrobulbar

Vala H1,2*, Mega A1,2, Santos C1,2, Cruz R1,2, Nóbrega C1,2, Mesquita JR1,2, Esteves F1,2, Vieira F3, Ferraz A4

1Escola Superior Agrária de Viseu, Instituto Politécni-co de Viseu, Portugal;2Centro de Estudos em Educação, Tecnologias e Saúde, Instituto Politécnico de Viseu, Portugal;3Histocit, Portugal;4Clínica Veterinária Planeta Animal, Aveiro, Portugal.

* [email protected]

Introdução: Neoplasias envolvendo o nervo ótico são raras. O meningioma intraorbitário, a neoplasia mais comum sediada no nervo ótico, constitui apenas 3% de todos os meningiomas em cães, razão pela qual existem poucos estudos para permitir prever os seus sintomas e comportamento biológico.

Objetivos: Os autores descrevem e submetem à dis-cussão, um caso raro de meningioma retrobulbar, em particular para apreciação da graduação histológica e o prognóstico.

História Clínica: Um Labrador Retriever de 10 anos de idade, foi apresentado com queixas de edema e descarga purulenta do olho direito. Apresentava exof-talmia, protusão da terceira pálpebra, quemose, úlcera profunda da córnea e ausência de reflexo pupilar à luz, no mesmo olho. O exame físico, oftálmico e ecográ-fico permitiu diagnosticar exoftalmia devido a massa retrobulbar.

Material e Métodos: A amostra foi fixada em for-mol tamponado a 10 %, processada de acordo com o protocolo de rotina, tendo igualmente sido realizados estudos imunohistoquímicos, usando o método do Complexo Estreptavidina-biotina-peroxidase.

Resultados: O exame macroscopico revelou uma massa cónica, localizada na porção retrobulbar do ner-vo ótico, adjacente à porção posterior do globo ocular, apresentando coloração esbranquiçada, aspeto homo-géneo, lobulado e consistência firme.

O exame microscopico revelou células fusiformes, com núcleo redondo a oval, cromatina em padrão pon-tilhado, citoplasma eosinofílico, moderado, organizadas em ninhos, em torno de capilares, separados por feixes interlaçados, com estroma muito vascularizado e escasso.

Conclusão: Os autores sugerem o diagnóstico de meningiomado tipo transicional, tendo em conta as ca-raterísticas histopatológicas e os resultados do estudo de imunohistoquímica.

Agradecimentos: FCT e CI&DETS (PEst-OE/CED/UI4016/2011)

A rare case of retrobulbar neoplasia

Introduction: Neoplasms involving the optic nerve are rare. Intraorbital meningiomas, the most common tumour of the optic nerve, represent only 3% of all meningiomas in dogs, so few data exists to predict its symptoms and biologic behaviour.

Objectives: The authors describe and submit for discussion, a rare case of retrobulbar meningioma, in particular for assessment of histological grade and prognosis.

Medical History: A 10 year old Labrador Retriever male dog was presented for complaints of swelling and purulent discharge of the right eye. The animal had ex-ophthalmos, protrusion of the third eyelid, chemosis, deep corneal ulceration and no pupillary light reflex. Exophthalmos due to a retrobulbar mass was diagnosed after physical, ophthalmic and ultrasound examination.

Material and Methods: The sample was fixed in 10 % buffered formalin solution, processed for routine histopathological diagnosis and a standard Streptavi-din-Biotin Complex technique for immunohistochemi-cal evaluation was also performed.

Results: Macroscopic examination revealed a conic mass, located in the retrobulbar portion of the optic nerve, adjacent to the posterior aspect of the globe with homogeneous, lobulated and whitish appearance and firm consistency.

Microscopic examination revealed spindled cells, with round-to-oval, finely stippled nuclei, small or indistinct nucleoli, moderate amount of eosinophilic cytoplasm, arranged in concentric whorls around cap-illaries, separated by interlacing fascicles, with small amount of well vascularized, collagenous stroma.

Conclusion: The authors suggested the diagnosis of transitional meningioma, based on the histopathologi-cal diagnosis and immunohistochemistry results.

Acknowledgments: FCT and CI&DETS (PEst-OE/CED/UI4016/2011)

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Ocorrência de parasitismo externo em coelhos de companhia

Almeida, C.1*, Henriques C. 1, Bernardino, M. 1,2, Ma-deira de Carvalho, L.M. 2

1 Exoclinic, R. Dom António Ribeiro nº1 loja B, 1495-145 Algés, Portugal

2 CIISA, Fac Med Vet, Univ Tecn Lisboa, Av. da Univer-sidade Técnica de Lisboa, 1300-477 Lisboa, Portugal

* [email protected]

Introdução: Em Portugal, tal como sucedeu ante-riormente noutros países como Inglaterra, Estados Unidos e Alemanha, o coelho doméstico tem revelado crescente popularidade como animal de companhia, devido à sua grande inteligência e interessante intera-ção com a família.

Durante o período de doze meses (Jan-Dez 2012) foram consultados 98 coelhos na “Exoclinic” sobre-tudo por problemas de sobrecrescimento dentário, problemas gastrointestinais e manifestações derma-tológicas.

Material e métodos: Dos 25 casos de manifestações cutâneas, para além do exame físico foram submeti-dos a raspagem cutânea e citologia direta das lesões. Foram identificados 16 coelhos positivos a parasitismo externo: Psoroptes cuniculi (69%) e Scarcoptes sca-biei (31%). Dos animais afetados, 81% apresentavam menos de seis meses de idade, verificando-se casos po-sitivos em machos e fêmeas e nas raças Fuzzy-Lop, Lion Head e Mini Holandês.

O tratamento sugerido foi de injeções subcutâneas de ivermetina (200µg/kg) repetindo ao fim de 14 dias, 28 dias, sugerindo uma quarta injeção e quinta injeção até desaparecimento total de sinais clínicos. Em alter-nativa, utilizou-se em metade dos casos, selametina so-lução tópica cutânea 15mg, repetindo-se ao fim de 28 dias, sugerindo uma terceira aplicação se necessário.

Resultados: Em termos de desaparecimento das le-sões cutâneas e crescimento do pêlo nas zonas de alo-pécia os resultados obtidos foram bem sucedidos ao fim de 28 dias de tratamento e com eficácia equivalente com ambos os protocolos.

Em simultâneo foram aplicadas medidas de melhor maneio e higienização das instalações do animal, bem como o alerta do potencial zoonótico de alguns tipos de sarna. Ainda assim, verificou-se a presença de dois episódios de manifestações cutâneas de sarna no pro-prietário, já instaladas aquando do início tratamento do animal.

Conclusão: De acordo com a nossa experiência, o clínico deve estar apto para a correta identificação dos agentes causais de problemas dermatológicos em coelhos. O aumento da casuística destes pacientes re-presenta também novas perspetivas de diagnóstico e

novos desafios terapêuticos. É na nossa opinião uma oportunidade para instituir boas práticas veterinárias de prevenção e profilaxia destas doenças, pois o bom estado geral de saúde está condicionado pela correta informação e educação do proprietário.

Occurrence of external parasitism in pet rabbits

Introduction: In Portugal, as happened previously in other countries like England, Germany and the United States, the domestic rabbit has shown increas-ing popularity as a pet, due to its great intelligence and interesting interaction with the family.

During a twelve month period (Jan-Dec 2012) 98 rabbits were consulted in “Exoclinic”, mainly due to dental problems, gastrointestinal diseases and derma-tological manifestations.

Material and methods: Of 25 cases of cutaneous manifestations, in addition to the physical examina-tion, they were subjected to scrape and direct cytol-ogy of cutaneous lesions. We identified 16 rabbits positive for external parasitism: Psoroptes cuniculi (69%) and Scarcoptes scabiei (31%). Of the affected animals, 81% were less than six months old, with pos-itive cases in both males and females and in Fuzzy-Lop, Lion Head and Mini Dutch breeds.

The suggested treatment was subcutaneous injec-tions of ivermectin (200µg/kg) repeating after 14 days and 28 days, suggesting a fourth and a fifth injection until total disappearance of clinical signs. Alterna-tively, in half the cases was used a topicalolution of selamectin 15mg, repeating the treatment 28 days af-ter the first one, suggesting a third application if nec-essary.

Results: In terms of disappearance of skin lesions and hair growth in areas of alopecia, results were suc-cessful after 28 days of treatment, with equivalent ef-ficacy for both protocols.

Simultaneously were applied measures for a better handling and hygiene of the animal facilities, as well as the alert for the zoonotic potential of some types of mange. Still, there was the presence of two episodes of cutaneous manifestations of scabies in the owners, already onset before initiating the animal treatment.

Conclusion: According to our experience the clini-cian must be able to correctly identify the causative agents of skin problems in rabbits. The increase of these patients casuistic as pets also opens new pros-pects for diagnosis and new therapeutic challenges. It is in our opinion, an opportunity to establish good veterinary practice prevention and prophylaxis of these diseases, since the good general health is con-ditioned by proper education and information of the owner.

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Identificação de Parasitas de Peixes em Cortes Histológicos

Ramos, P.1*, Carvalho, R.1α, Rosa, F.2

1 Laboratório de Patologia dos Animais Aquáticos. Ins-tituto Português do Mar e da Atmosfera, IPMA, I.P. Avenida de Brasília, 1449-006 Lisboa, Portugal

2 Instituto de Investigação Científica Tropical, IICT. Rua da Junqueira nº 14, 1300-343 Lisboa, Portugal

1α Já não se encontra a trabalhar na Instituição* Autor correspondente. Tel.: + 00351 213027000 Fax: + 00351 962467682

* [email protected]

Introdução: A identificação de parasitas de peixes em cortes histológicos poderá apresentar alguma difi-culdade, sobretudo quando as características morfoló-

gicas usadas na sua identificação não são observáveis. Material e Métodos: Apresentam-se três casos de

infecção parasitária: peritoneu de safio, Conger con-ger, com aspecto nodular; músculo de faneca, Trisop-terus luscus, com cor negra e coração de perca sol, Le-pomis gibbosus, envolvido por quistos de cor branca. Os tecidos foram fixados em formol salgado a 10% e processados histologicamente.

Resultados: A estrutura nodular de peritoneu cor-respondia a um aglomerado de larvas enquistadas. A ausência de proglótides indicou tratar-se de espécimes imaturos. Nuns cortes, o parênquima larvar apresen-tava aspecto de tecido laxo, sem estruturas morfoló-gicas e noutros, observou-se o escólex com botrídeas e quatro tentáculos retrácteis armados com ganchos, bem como corpúsculos calcáreos correspondendo a larvas plerocercóides de Trypanorhyncha. No mesmo tecido foram observadas larvas filiformes, com corpo

Um caso de localização exclusivamente gástrica de Spirocerca lupi numa raposa (Vulpes vulpes) em Portugal

Silva J.F.*, Madeira de Carvalho L., Moreira A.S.

CIISA - Faculdade de Medicina Veterinária (Universi-dade Técnica de Lisboa), Av. da Universidade Técnica (Polo Universitário Alto da Ajuda), 1300-477 Lisboa

* [email protected]

Introdução: O Spirocerca lupi localiza-se caracte-risticamente na parede esofágica de Canídeos. Ferran-telli et al.(2010) e Diakou et al.(2012), assinalaram a presença deste Nemátode na parede gástrica de raposas.

Material e métodos: O cadáver de uma raposa adul-ta, sexo masculino, pesando 5,85 kg foi necropsiado e colhido material, que foi processado segundo a técnica histológica de rotina. A identificação dos Nemátodes em cortes histológicos foi feita de acordo com o artigo de Chitwood e Lichtenfels (1972) e tendo em conta as-pectos bioecológicos e epidemiológicos.

Resultados: Na parede do estômago observaram-se dois nódulos coalescentes, com diâmetros respectiva-mente de 1,2 cm e 1,8 cm. Estes apresentavam super-fície de corte branca, uma cavidade contendo material necrótico e um Nemátode enrolado sobre si próprio, de cor avermelhada, com cerca de 1 mm de espessura. O exame microscópico dos nódulos revelou uma cápsu-la de tecido conjuntivo fibroso envolvendo Nemátodes adultos. Estes apresentavam musculatura celomiária e polimiária, cordões laterais proeminentes, útero encer-rando ovos não operculados de casca fina, que conti-nham uma larva. O intestino apresentava um epitélio simples cúbico com microvilosidades alongadas.

Conclusão: As características histológicas, bioe-cológicas e epidemiológicas do Nemátode permitem

classificá-lo como Spirocerca lupi, pelo que este é um caso de localização gástrica deste Nemátode em raposa em Portugal.

A case of location exclusively in the gastric wall of Spirocerca lupi in a fox (Vulpes vulpes) in Portugal

Introduction: One of the Spirocerca lupi current lo-cations is the oesophagic wall in Canidae. Ferrantelli et al. (201) and Diakou et al. (2012) reported the gastric wall location of this Nematode in foxes.

Material and methods: An adult male fox weight-ing 5.85 kg was necropsied and samples were col-lected, which were processed according to the routine histological technique. The identification of Nematode specimens in histological sections was based in the pa-per by Chitwood and Lichtenfels (1972) and consider-ing bioecological and epidemiological aspects.

Results: In the gastric wall were observed two coa-lescent nodules, which diameters were, respectively; 1.2 cm and 1.8 cm. Their cut surface was white, with a cavity containing necrotic material and a red Nema-tode coiled over itself, with 1 mm thick. The micro-scopic exam of the nodules revealed a capsule of dense connective tissue surrounding adult Nematoda. These worms possessed muscle cells of the coelomyarian and polymyarian types, prominent lateral chords, and an uterus containing thin-shelled, non-operculated ova, with a larva inside. The intestinal wall consisted of a simple cuboidal epithelium with long microvilli.

Conclusion: The histological, bioecological, and epidemiological characteristics of this Nematode al-lowed us to classify it as Spirocerca lupi. The present case relates to an exclusively gastric location of this Nematode in a Portuguese fox.

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circular em corte transversal, esófago de aspecto simé-trico radial e lúmen triradial, correspondendo a larvas de nematodos.

No músculo de faneca identificaram-se ovos bioper-culados, morulados ou castanhos embrionados, bem como porções de larvas ou adultos com corpo cilín-drico localizados entre as fibras musculares e dentro delas, resultando numa infecção parasitária por nema-todos Trichosomoididae, Huffmanella spp.

No coração da perca sol, os quistos continham uma larva não segmentada, com dois cecos, uma ventosa oral e outra ventral, do trematode digenético, Postho-diplostomum minimum centrarchi.

Conclusão: Na identificação dos parasitas foi im-portante observar os caracteres morfológicos, mas o conhecimento do peixe parasitado, o seu habitat e os tecidos afectados, auxiliaram o diagnóstico.

Identification of Fish Parasites in Stained Tissue Samples

Introduction: In stained tissue sections prepared for light microscopy, taxonomic features may not be present, thus making parasite identification difficult. Three cases of parasite infection were described: Euro-pean conger, Conger conger peritoneum with nodular appearance; pouting, Trisopterus luscus with abnormal dark colour muscle and pumpkinseed sunfish, Lepomis gibbosus heart, surrounded by white colour cysts.

Material and Methods: Tissues were fixed in 10% buffered neutral formalin and processed using standard methods.

Results: The nodular peritoneum consists of multi-tude of encysted and clustered larvae. The absence of complete segmentation into proglottis identifies this specimen as immature. In sections, the body larvae vary from loosely parenchyma to prominent scolex features with bothridia and four tentacles armed with hooks. The larvae were identified as Trypanorhynchean plerocercoid. In this nodular peritoneum, filiform lar-vae were also present showing a round body surface in cross-section and the histological features of the oesophagus with its radial symmetry and triradiate lu-men which allowed classifying them as nematodes.

The histopathological findings of the pouting mus-cle, revealed bioperculated eggs, immature and embry-onated brown eggs. The eggs and portions of larvae or adult nematodes Trichosomoididae of the genus Huff-manella were observed in either intracellular or extra-cellular locations.

The heart of pumpkinseed sunfish was found infected by Posthodiplostomum minimum centrarchi larvae. The larvae were differentiated by the absence of the body segmentation and by an addition sucker, the ventral one.

Conclusion: The morphological characters are im-portant in parasites identification but the knowledge on infected fish species, their habitat and infected tissues also provide additional information to the parasite’s identification.

Caracterização de um surto da nova variante da Doença Hemorrágica Viral (DHV) em coelhos bravos (Oryctolagus cuniculus algi-rus), Barrancos, Sudeste de Portugal

Melo P.1*, Abrantes J.2,3, Ramada M. 1, Lopes A.M. 2,3,4, Alves P.C. 2,4, Esteves P.J. 2,5, Correia J.J. 6

1 VETNATURA, Lisboa, Portugal *[email protected] CIBIO/UP, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos/Universidade do Porto, InBio, Laboratório Associado, Campus Agrário de Vairão, Vairão, Portugal

3 INSERM, U892, Université de Nantes, Nantes, Fran-ce

4 Departamento de Zoologia e Antropologia, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, Porto, Portugal

5 CITS, Centro de Investigação em Tecnologias da Saú-de, IPSN, CESPU, Gandra, Portugal

6 CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária - Universi-dade Técnica de Lisboa, Portugal

Introdução: A doença hemorrágica viral (DHV) do coelho tem como agente etiológico um calicivírus e causa elevada mortalidade em coelhos domésticos e

bravos. Na Península Ibérica, a DHV foi descrita em 1989 e todas as estirpes virais isoladas pertenciam ao genogrupo 1. Em 2011 detectou-se em Espanha uma nova variante deste vírus, descrita anteriormente em França, diferenciando-se por originar mortalidade em juvenis (<2 meses) e adultos vacinados.

Caso clínico: Entre Dezembro de 2012 e Janeiro de 2013, ocorreu um surto atípico de DHV em Barran-cos, afectando coelhos bravos jovens não vacinados e adultos vacinados, registando uma taxa de mortalidade de 42%.

Efectuou-se a necrópsia a sete cadáveres, com reco-lha de pulmão, fígado, timo, traqueia, rim e baço. A detecção de RNA viral foi efectuada por RT-PCR e os casos positivos foram sequenciados. Para a análise fi-logenética foram incluídas estirpes de cada genogrupo e estirpes da nova variante.

Resultados: As lesões macroscópicas foram maiori-tariamente epistaxis, hemorragia do pulmão e traqueia, congestão do rim, baço, timo. Os fígados apresentavam predominantemente coloração pálida e em alguns ca-sos congestão. Os animais vacinados apresentavam le-sões menos severas. As lesões histopatológicas foram hemorragias do pulmão e traqueia e a nível hepático, congestão e hepatite necrosante.

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Principais dificuldades encontradas na aplicação das técnicas de deteção de apoptose em tecidos animais

Garcia C1*, Cruz R1,2, Mega A1,2, Oliveira AL3, Teixeira de Lemos E1,2,5, Ferreira D4, Reis F5, Vala H1,2

1 Escola Superior Agrária de Viseu, Instituto Politécni-co de Viseu, Portugal;

2 Centro de Estudos em Educação, Tecnologias e Saú-de, Instituto Politécnico de Viseu, Portugal

3 Universidade de Léon, Léon, Espanha4 Laboratório de Farmacologia e Terapêutica Experi-mental, IBILI, Faculdade de Medicina da Universida-de de Coimbra, Coimbra, Portugal

5 CICV- Centro de Investigação em Ciências Veteriná-rias, Universidade Lusófona de Humanidades e Tec-nologia, Lisboa, Portugal

* [email protected]

Introdução: A aplicação de metodologias capazes de identificar células apoptóticas constitui uma valiosa ferramenta em vários estudos biomédicos. Muito do conhecimento adquirido acerca dos mecanismos regu-ladores da apoptose deriva de observações em células isoladas. No entanto, as propriedades demonstradas por estes ensaios nem sempre se aplicam ao estudo de amostras tecidulares. Para deteção da apoptose em tecidos, muitos investigadores recomendam o método

TUNEL. Contudo, outros métodos estão disponíveis para avaliação da apoptose, devendo a sua escolha ser criteriosamente avaliada, tendo em conta as alterações morfológicas que se pretendem detetar. O presente tra-balho pretende, como principal objetivo, partilhar as dificuldades encontradas na implementação de dois diferentes métodos para deteção de células apoptóticas em tecidos animais.

Material e métodos: Foram utilizados tecidos de dife-rentes animais (rato, porco e cão), fixados em formalina a 10% e incluídos em parafina, os quais foram submetidos a técnicas imunohistoquímicas com recurso ao método TUNEL (Kit In situ cell death, Roche) e aos anticorpos policlonais Bax e Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology).

Resultados: Após um longo período de testes e de custos, em que se obtiveram reações inespecíficas, bem como vários artefactos - obstáculos que, para serem superados, requerem persistência, todos os métodos provaram ser eficazes na deteção de apoptose, tendo sido as diferenças de marcação observadas relaciona-das com o tipo de tecidos testados.

Conclusão: Os métodos imunohistoquímicos cons-tituem uma abordagem a considerar no que respeita à deteção da apoptose em tecidos animais, sendo que as dificuldades encontradas representam um desafio su-perável. Partilhar esta esperiência poderá, certamente, evitar testes e custos desnecessários à sua implementa-ção noutras unidades laboratoriais.

Agradecimentos: FCT e CI&DETS (PEst-OE/CED/UI4016)

A análise filogenética demonstrou que as estirpes isoladas agrupam com a nova variante com elevado suporte estatístico.

Conclusões: Este estudo confirma a presença da nova variante em Portugal e levanta questões quanto à conservação e sustentabilidade das populações natu-rais de coelho bravo. Recomendam-se medidas adicio-nais de gestão nas unidades de criação.

Characterization of an outbreak of the newly identified variant of rabbit haemor-rhagic disease virus (RHDV) in wild rabbits (Oryctolagus cuniculus algirus), Barrancos, Southeast of Portugal

Introduction: Rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) is a calicivirus that causes a highly fatal dis-ease in wild and domestic adult European rabbits. In Iberian Peninsula, the first description of RHDV dates from 1989 and all isolated strains clustered within ge-nogroup 1. In 2011 a new variant of RHDV was detect-ed in Spain, already described in France, that differs by causing mortalities in young rabbits (<2 months old) and in vaccinated adult rabbits.

Clinical case: Between December of 2012 and Janu-ary of 2013, an atypical RHDV outbreak was detected in Barrancos, where unvaccinated young and vacci-nated adult wild rabbits were fatally susceptible, with a mortality rate of 42%.

Necropsies of seven cadavers were performed and samples of lungs, liver, thymus, trachea, kidneys and spleen were collected. Detection of viral RNA was per-formed by RT-PCR and when positive, products were sequenced. For the phylogenetic analysis, strains from each genogroup and of the new variant were included.

Macroscopic lesions were mostly epistaxis, hemor-rhage in the lungs and trachea, congestion in the kid-ney, spleen and thymus. Livers were predominantly pale and in some congested. Vaccinated animals had less severe lesions. Histopathological lesions were he-morrhages in the lungs and trachea and congestion and necrotizing hepatitis in the liver.

Phylogenetic analysis clustered the isolates with the newly described variant with high bootstrap support.

Conclusions: This study confirms that the new vari-ant of RHDV is circulating in Portugal and raises con-cerns regarding the conservation of the natural popu-lations of European rabbit. Additional management measures are recommended in breeding facilities.

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Otimização da imunodeteção do recetor HER2 em tumores mamários de cadela

Beselga, A. 1, Soares, M. 1, Carvalho, S. 1, Matos, J. 2, Cabeçadas, J. 2, Correia, J. 1, Peleteiro, M. 1, Ferreira, F. 1*

1 CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Univer-sidade Técnica de Lisboa. Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal

2 IPOFG-EPE, Serviço de Anatomia Patológica, 1099-023 Lisboa, Portugal

* [email protected]

Introdução: O recetor para o fator de crescimento epidérmico de tipo 2 (HER2) apresenta-se sobrex-presso em 15-30% dos tumores mamários na mulher, mostrando um elevado valor prognóstico e terapêuti-co. Na cadela, o papel oncogénico do HER2 perma-nece duvidoso devido, em parte, à falta de padroniza-ção da técnica de imunohistoquímica.

Material e métodos: Vinte e uma amostras de tumores mamários caninos (TMC) foram colhidas e fixadas de acordo com as indicações da American Society of Clinical Oncology (ASCO). Após classi-ficação histopatológica, as amostras foram sujeitas a diferentes protocolos imunohistoquímicos, tendo-se feito variar o método de recuperação antigénica e o anticorpo primário usado: TAB250, diluição 1:250 (Zymed); SP3, 1:100 (Zytomed); CB11, 1:60 (Invi-trogen); 4B5, pronto a usar (Ventana). A interpreta-ção dos resultados foi realizada de acordo com os critérios da ASCO.

Resultados: Os melhores resultados foram obtidos

com o anticorpo CB11 quando associado ao méto-do de recuperação antigénica por panela de pressão. Com este protocolo, 42,9% dos tumores analisados mostraram sobrexpressão do recetor HER2. Todos os anticorpos testados mostraram marcação membranar específica no tecido mamário de cadela, à exceção do clone TAB250.

Conclusão: A variabilidade dos resultados obtidos demonstra a necessidade de padronização da técni-ca de imunohistoquímica para deteção do HER2 em Medicina Veterinária. Neste estudo, 42,9% dos TMC analisados mostraram sobreexpressão do HER2, um percentagem superior à descrita na Mulher, reforçan-do a possível importância deste biomarcador em On-cologia Veterinária.

Optimization of HER2 receptor immuno-detection in canine mammary tumours

Introduction: The epidermal growth factor type-2 receptor (HER2) is overexpressed in 15-30% of breast tumors in women, presenting a prognostic and high therapeutic value. In the bitch, the role of the HER2 oncogene remains doubtful due to the lack of immunohistochemistry technique standardization.

Material and methods: Twenty-one canine mam-mary tumors (CMT) were collected and fixed in agreement to the American Society of Clinical On-cology (ASCO) guidelines. After histopathological classification, the samples were subjected to different immunohistochemical protocols, varying the recov-ery antigen method and the primary antibody used: TAB250, dilution 1:250 (Zymed); SP3, 1:100 (Zy-tomed); CB11, 1:60 (Invitrogen); 4B5, ready-to-use

Main difficulties encountered in implemen-tation of techniques for apoptosis detection in animal tissues

Introduction: The implementation of methodolo-gies capable of identifying apoptotic cells is a valu-able tool in many biomedical studies. Much of the knowledge acquired about the mechanisms regulat-ing apoptosis comes from observations in isolated cells; however, the properties shown by these assays do not always apply to the study of tissue samples. For detection of apoptosis in tissues, many investi-gators recommend the TUNEL method, nonetheless, other methodologies are available, and their choice must be carefully evaluated, taking into account the morphologic alterations which they intend to detect. The main goal of this work is to share difficulties encountered in the implementation of two different methods for the detection of apoptotic cells in animal tissue.

Material and methods: Tissues from different ani-mals (rat, pig and dog) tissues, fixed in 10% neutral-buffered formalin and paraffin embedded were sub-mitted to immunohistochemical techniques using the TUNEL method (In situ Cell Death Kit, Roche) and polyclonal Bax and Bcl-2 antibodies (Santa Cruz Bio-technology).

Results: After a long period of performed tests and expenses made, in which unspecific reactions, as well as several artifacts were obtained - obstacles that re-quired persistence to be overcome, all methods have proven to be effective in the detection of apoptosis, with differences probably related to the tissues tested.

Conclusion: Immunohistochemical methods are a good approach to consider in the detection of apoptosis in animal tissues. Sharing the challenging difficulties found in our work, might obviate many tests and expens-es in its implementation in other laboratory facilities.

Acknowledgments: FCT and CI&DETS (PEst-OE/CED/UI4016)

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(Ventana). Results interpretation was performed ac-cording to the ASCO criteria.

Results: The best results were obtained when the antibody CB11 was coupled with the pressure cooker as antigen retrieval method. With this protocol, 42.9% of the analyzed tumors showed HER2 overexpression. All antibodies tested show specific immunostaing of the cytoplasmic membrane, except the clone TAB250.

Conclusion: The variability of the results obtained demonstrates the need of immunohistochemistry standardization for HER2 evaluation in Veterinary Medicine. In this study, 42.9% of TMC analyzed showed HER2 overexpression, a higher percentage than the one described in women, reinforcing the possible importance of this biomarker in Veterinary Oncology.

Linfoma intestinal do tipo B com diferen-ciação em células de Mott num gato.

Pedro Faísca1,2*; Maria João Costa3, Rita Pontes3, Dul-ce Carujo3, Matilde Gonçalves4, Marli Anágua1, Inês Carvalho2

1 Faculdade de Medicina Veterinária da ULHT2 DNATech3 Clínica veterinária de Telheiras4 Serviço de Anatomia Patológica – Centro Hospitalar de Setúbal

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Introdução: Gato, macho, 11 anos de idade, que se apresentou à consulta para vacinação anual. No exa-me físico detetou-se massa abdominal, não dolorosa e firme.

Materiais e métodos: Realizou-se ecografia abdo-minal que confirmou massa intestinal.

Posteriormente foi realizada a sua remoção por en-terectomia.

Resultados: Macroscopicamente, ao nível do jeju-no, identificou-se neoformação ulcerada, não esteno-sante, com 9x5x4,5 cm; em secção era branca amarela-da, brilhante, homogénea, envolvendo toda a espessura da parede intestinal.

Histologicamente observou-se proliferação difusa de células linfoides desde a mucosa até à serosa. As-sociado aos linfócitos identificam-se inúmeras células grandes e redondas, entre 20 a 30 µm, com núcleo em-purrado para a periferia e citoplasma preenchido por glóbulos eosinofílicos e hialinos, positivos com ácido periódico de Schiff, compatíveis com células de Mott. Os linfócitos apresentaram imunomarcação positiva para Pax5 (Leica NCL-L-PAX-5 1/80), CD79alphacy (Dako M7051, 1/50) e imunomarcação negativa para CD3 (Dako A0452, 1/50); as células de Mott demons-traram positividade para CD79alphacy, cadeias leves lambda (Ventana 760-2515) e negatividade para Pax5, CD3 e cadeias leves kappa (Ventana 760-2514). De-monstrou-se índice mitótico baixo (0-2 mitoses por campo com objetiva de 40x) e índice de proliferação

celular superior a 30% com o anticorpo Ki-67 (Dako M7240 1/50).

Conclusão: Com base nos achados morfológicos, histoquímicos e imunohistoquímicos, o diagnóstico histológico é compatível com linfoma intestinal de tipo B, com diferenciação em células de Mott.

Feline intestinal B-cell lymphoma with Mott cell differentiation.

Introduction: An 11–year-old, male cat, was present for the annual vaccination booster without any abnor-mal clinical signs. On clinical examination, a firm, non-painful abdominal mass was palpated.

Materials and methods: An abdominal ecography confirmed the presence of an intestinal mass, which was posteriorly extirpated by enterectomy.

Results: The jejunum presented a 9x5x4,5 cm, ho-mogenous, bright whitish-yellow mass surrounding the intestinal lumen and invading all intestinal layers.

Histologically, there was a diffuse non-capsulated proliferation of round cells, disposed in dense sheets through all intestinal layers. The neoplastic cells were of lymphoid type associated with large (20-30um) round cells with cytoplasmatic eosinophilic, periodic acid–Schiff positive, globules compatible with Mott cells.

The lymphoid cells presented positive immunostain-ing for CD79alphacy (Dako M7051, 1/50), and Pax5 (Leica NCL-L-PAX-5 1/80), and negative immunos-taining for CD3 (Dako A0452, 1/50); the Mott cells presented positive immunostaining for CD79alphacy and lambda light-chain (Ventana 760-2515 ready to use), and were negative for Pax5, CD3 and kappa light-chain (Ventana 760-2514 ready to use). The mitotic figures were rare (0–2 per 40x field of view), and the Ki 67 proliferation index was higher than 30% (Dako M7240 1/50).

Conclusion: On the basis of histopathology, histo-chemistry and immunohistochemistry, a B-cell lym-phoma with Mott cell differentiation was diagnosed.

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Adenocarcinoma do endométrio em gatas com menos de um ano de idade: descrição de quatro casos

Pires M.A.1*, Saraiva A.L. 1,2, Santos T.3, Vilhena H.4, Sousa A.5, Santos C.1, Payan-Carreira R.1

1 CECAV, University of Trás-os-Montes and Alto Dou-ro, P.O. Box 1013, 5001-801 Vila Real, Portugal.

2 EUVG – Escola Universitária Vasco da Gama, 3040-714 Castelo Viegas, Coimbra, Portugal.

3 Veterinary Teaching Hospital (HVUTAD), University of Trás-os-Montes and Alto Douro, P.O. Box 1013, 5001-801 Vila Real, Portugal.

4 Hospital Veterinário do Baixo Vouga, 3750-742 Águeda, Portugal

5 Policlínica Veterinária de Aveiro - Vetsanus, 3800-118 Aveiro, Portugal.

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Introdução: As neoplasias uterinas de origem epi-telial são raras em todas as espécies animais, exceto em vacas e coelhas. Nas gatas, o adenocarcinoma do endométrio (AEG) é, geralmente descrito em fêmeas com idade superior a 8 anos, ainda que, esporadica-mente, possa ser observado em idades compreendidas entre os 2 e os 4 anos.

Material e métodos: foram enviados ao Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da UTAD 4 peças de ovariohisterectomia (OVH) de gata, provenientes de diferentes Hospitais Veterinários. Os órgãos, fixa-dos em formol tamponado a 10% foram processados por rotina para parafina e corados com hematoxilina e eosina.

Resultados: A sintomatologia observada foi variá-vel, desde a ausência até à presença de corrimento he-morrágico acastanhado,, facilmente confundidos com piómetra ou aborto.

Macroscopicamente os úteros apresentavam-se dis-tendidos, firmes, com parede espessada, dilatações e irregularidade dos cornos uterinos em diferentes graus. Microscopicamente observou-se proliferação papilar do endométrio, com invasão do miométrio em dois dos casos. O diagnóstico foi de AEG de tipo papilar seroso.

Conclusão: Embora as neoplasias de origem epi-telial do útero sejam raras nos animais domésticos, o nosso grupo nos últimos anos tem registado mais AEG

do que o documentado. Embora esta neoplasia seja mais frequente em animais velhos, nos últimos 2 anos tivemos 4 casos de AEG em gatas de idade inferior a um ano no momento da cirurgia.

Esta situação clínica pode ser confundida com abor-to ou piómetra, pelo que se recomenda a análise siste-mática de todas as peças de OVH, seja qual for a idade ou diagnóstico clínico.

Feline Endometrial Adenocarcinoma in fe-males under one year-old: A description of four cases

Introduction: Uterine neoplasms of epithelial origin are rare in all domestic animals, except for cows and rabbits. In female cats, endometrial adenocarcinoma (FEA) is usually described in females over 8 years-old. Yet, sporadically it may be found in younger females of age of 2-4 years.

Material and methods: 4 ovariohysterectomy surgi-cal specimens from queens aged under one year old, at the time of surgery, were submitted from different practices to the Laboratory of Histology and Anatomi-cal Pathology, at UTAD. The organs were fixed in 10% buffered formalin, processed to paraffin embed tissue, and stained with haematoxylin and eosin.

Results: Different clinical symptoms were observed in these animals, ranged from absent to a haemorrhagic or brownish discharge, easily confused with pyometra or abortion.

Macroscopic outcomes revealed a distended and firm uterus, with wall thickness, dilatations and irregularity along both uterine horns, at different grades. Micro-scopic findings revealed a papillary proliferation of the endometrium with myometrium invasion in two cases. The final diagnosis was FEA of the papillary type.

Conclusion: Although uterine neoplasms of epithe-lial origin are rare in domestic animals, in the last years our group has recorded more FEA than documented in the literature. Despite this neoplasia to be related with older animals, in less than two years, we untypically diagnosed 4 FEA in queens aged under one year-old at time of surgery that could be clinically mistaken for pyometra or abortion. For this reason, we strongly rec-ommend histopathological analysis of all ovariohys-terectomy surgical specimens, despite animal’s age or clinical diagnose.

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Abate de Lagomorfos nos Matadouros Portugueses: Estudo Descritivo (2011-2012)

Jesus J.1, Santos S.1*, Lamela M.2

1 Centro de Investigação em Ciências Veterinárias

(CICV) - FMV- ULHT, Lisboa, Portugal2 Chefe de Divisão na Direcção de Serviços de Segu-rança Alimentar da Direcção Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV)

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Introdução: Este trabalho dá a conhecer os volumes de abate actuais de lagomorfos e as principais causas de reprovação sanitária nos matadouros portugueses.

Material e métodos: Analisou-se a totalidade de abates de lagomorfos entre 1 de Janeiro de 2011 e 31 de Dezembro de 2012, registados no Sistema de Infor-mação do Plano de Aprovação e Controlo dos Estabe-lecimentos (SIPACE), plataforma informática da Dire-ção Geral de Alimentação e Veterinária, utilizada por todos os inspetores sanitários desde Outubro de 2010.

Resultados: Foram apresentados para abate regular 10 901 526 lagomorfos. Desses, 321 (≈0,03‰) foram rejeitados ante-mortem e 93 665 (≈8,6‰) post-mortem. De entre os principais tipos de processos patológicos observaram-se lesões fibrino-purulentas, abcessos e caquexia. Registaram-se 20 497 mortes no transporte.

Conclusão: No período em análise, o volume de abate manteve-se estável e não apresentou sazonali-dade, sugerindo assim um consumo regular desta car-ne ao longo do ano. As lesões fibrino-purulentas e os abcessos foram as principais causas de reprovação. A identificação das causas de reprovação é fundamental

para possibilitar a implementação de medidas preven-tivas.

Slaughtering of Lagomorphs in the Portu-guese Slaughterhouses: Descriptive Study (2011-2012)

Introduction: The present study was conducted to evaluate lagomorphs´s slaughtering data such as the current number of slaughtered animals and the major causes to condemnation in Portugal.

Material and methods: This study includes the total number of lagomorphs slaughtered between 1st January 2011 and 31st December 2012. The data were obtained from Informatiom System of Establishments Approval and Control Plan (SIPACE) software, be-longing to Directorate General of Food and Veterinary (DGAV), where all veterinary inspectors insert the records since October 2010.

Results: Out of 10 901 526 slaughtered lagomorphs, 321 (≈0,03‰) were rejected ante-mortem and 93 665 (≈8,6‰) were rejected post-mortem. The majority of injuries were fibrinopurulent lesions, abscesses and cachexia. Deaths in the transport accounted 20 497 animals.

Conclusion: In the past two years the number of slaughtered lagomorphs remained stable and no sea-sonality in the number of slaughtered animals was noted, meaning that this type of meat is consumed regularly over the year. Fibrinopurulent lesions and abscesses were the most frequent causes of condemna-tion. Preventive actions can only be taken after identi-fication of the prevalent injuries, proving that studies like this are useful.

Caracterização da população linfocitária em lesões granulomatosas de javali (Sus scrofa) com diagnóstico presuntivo de tu-berculose

Matos A.C1., Andrade S.2, Pires M.A.2*, Coelho A.C.2, Pinto M.L.2

1 Instituto Politécnico de Castelo Branco, Castelo Branco, Portugal

2 CECAV - Centro de Ciência Animal e Veterinária; ECAV- Escola de Ciências Agrárias e Veterinárias, Vila Real, Portugal

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Introdução: A tuberculose é doença infeciosa que ameaça a vida de milhões de pessoas, quer em países

em desenvolvimento, quer em países desenvolvidos, sendo também responsável por elevadas perdas econó-micas em animais de espécies pecuárias. A patogénese da tuberculose bovina, causada por Mycobacterium bo-vis e da tuberculose humana, cujo agente principal é o microrganismo da espécie Mycobacterium tuberculo-sis, são as que se encontram melhor caracterizadas. No entanto, a tuberculose também afeta outras espécies de animais, sendo estes muitas vezes os responsáveis pelo contágio às espécies pecuárias e ao Homem. Em par-ticular, o estudo da tuberculose nas espécies selvagens pode elucidar a forma como esta doença se mantém e se transmite.

Material e métodos: Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a resposta inflamatória crónica em animais selvagens com diagnóstico presuntivo de tuberculose, em que se procurou investigar a expres-são dos anticorpos anti-CD3 e anti-CD79α em lesões

Poster presentations

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Estudo Preliminar sobre a Descalcificação de Tecido Ósseo em Micro-ondas

Anágua M.*, Faísca P.

Centro de Investigação em Ciências Veterinárias- Fa-culdade de Medicina Veterinária - Universidade Lusó-fona de Humanidades e Tecnologias

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Introdução: A análise histopatológica de tecido ós-seo exige uma etapa de descalcificação, que possibilite a microtomia. O método mais comum consiste na imersão das amostras em soluções ácidas, mas para além de pro-vocarem danos tecidulares, o processo é muito prolon-gado, o que atrasa significativamente o diagnóstico. A utilização de micro-ondas acelera a descalcificação, mas não deve comprometer a imagem microscópica.

O objetivo deste trabalho consistiu na diminuição da duração da descalcificação, mantendo a qualidade da imagem microscópica.

Material e métodos: Foram testadas amostras de osso compacto e esponjoso, provenientes de caprinos, com dimensões que pretenderam simular casos de bi-ópsias e casos de peças cirúrgicas ou necrópsias. Re-alizou-se a descalcificação pelo método convencional

e pelo método em micro-ondas, através da adaptação de um protocolo conhecido. Utilizou-se ácido nítrico a 5% e 10%.

Resultados: Nos fragmentos de maiores dimensões, o protocolo foi interrompido após 4 horas com ácido nítrico a 10% em micro-ondas, por não se conseguir uma descalcificação completa e estar a ocorrer destrui-ção do osso compacto. Nos fragmentos de osso espon-joso, verificou-se uma redução de cerca de 25 horas relativamente ao método convencional. Nas biópsias, houve uma redução de aproximadamente 10 horas, uti-lizando ácido nítrico a 5%. Com ácido nítrico a 10% houve destruição tecidular. Nos casos em que se obteve uma descalcificação completa, a imagem microscópica apresenta fraca qualidade.

Conclusão: A utilização de micro-ondas na descal-cificação com ácido nítrico a 5% ou 10%, aplicando o protocolo deste estudo em amostras de caprinos, reduz a duração do processo, mas compromete significativa-mente a imagem microscópica, o que se torna inviável para diagnóstico.

Preliminary Study about Microwave De-calcification of Bone Tissue

Introduction: Histological analysis of bone tissue

granulomatosas dos gânglios mesentéricos de javalis (n=30), pela técnica de imuno-histoquímica.

Resultados: Pela análise imuno-histoquímica ob-servou-se marcação citoplasmática das células lin-focitárias em 11 gânglios mesentéricos (36,6%) para o anticorpo anti-CD79α, e em 15 gânglios mesenté-ricos (50%) para o anticorpo anti-CD3. A quantifica-ção dessas mesmas células permitiu agrupar as lesões consoante a percentagem de células linfocitárias que exibiam.

Conclusão: As lesões em estudo apresentam percen-tagens relativamente semelhantes de linfócitos T e B, sugerindo assim uma resposta celular e humoral com igual participação na resposta imunitária, desencadea-da pelo organismo face à entrada do agente patogénico.

Lymphocyte population in the granuloma-tous lesions of wild-boars (Sus scrofa) sus-pected of tuberculosis.

Introduction: Tuberculosis is an infectious disease that threatens the lives of millions of people both in developing and developed countries and is responsible for important economical losses in farm animals. The pathogenesis of bovine tuberculosis due to Mycobac-terium bovis and human tuberculosis mainly caused by the microorganism of the species Mycobacterium

tuberculosis are more extensively characterized. How-ever, tuberculosis also affects other animal species and these are often responsible for the contamination of cattle and humans. In particular, an overview of the wildlife hosts will provide insight into how these reser-voirs maintain and spread the disease.

Material and methods: This study was conducted to evaluate the chronic inflammatory response in wild animals with a presumptive diagnosis of tuberculosis. In order to better understand the pathogenesis of the disease and further characterize its lesions, it was our aim to investigate the expression of antibodies anti-CD3 and anti-CD79α in the granulomatous lesions of wild boars’ mesenteric lymph nodes (n=30) through the immunohistochemistry technique.

Results: Immunohistochemical analysis allowed us to observe the lymphocyte cells population in 11 me-senteric nodes (36.6%) for the anti-CD79α antibody, and in 15 mesenteric nodes (50%) for the anti-CD3 an-tibody. The quantification of these same cells allowed grouping of lesions depending on the percentage of lymphocyte cells that they exhibit.

Conclusion: The lesions of this study showed rela-tively similar percentages of B and T lymphocytes, thus suggesting a cellular and humoral response and a similar immune response triggered by the organism against the entry of the pathogen.

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Necrópsia em equinos. Descrição de um caso de doença granulomatosa disseminada

Miranda I.*, Tilley P., Pomba C., Pissarra H., Correia J.J., Peleteiro M.C.

Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Univer-sidade Técnica de Lisboa. Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal

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Introdução: Tendo em conta a importância de ava-liar a prevalência das situações ocorridas e a capacida-de de emissão de diagnósticos definitivos, procedeu-se à identificação das causas de morte dos casos de ne-crópsia de cavalos registados no Laboratório de Anato-mia Patológica da Faculdade de Medicina Veterinária, da Universidade Técnica de Lisboa. De entre os casos identificados foi dado particular relevo a um de doença granulomatosa disseminada (DGD), atendendo à rari-dade do processo, à complexidade da evolução clínica e aos diagnósticos diferenciais envolvidos.

Material e métodos: Foram analisados os registos compreendidos entre Janeiro de 2009 e Janeiro de 2013, num total de 38 necrópsias. No caso da DGD, o diagnóstico baseou-se na análise histopatológica de ór-gãos fixados em formol e submetidos a processamento histológico de rotina. As colorações efetuadas foram H&E e Ziehl Neelsen. Foi ainda realizada análise bac-teriológica.

Resultados: Dos 39 casos de necrópsia analisados, apenas um foi inconclusivo. Os restantes foram divi-didos em seis grupos: Doença Infeciosa Sistémica (5), Doença Cardiorrespiratória (5), Doença Renal (1), Do-ença Gastrointestinal (21), Doença Neurológica (3), Doença Ortopédica/Trauma (3). Os exames comple-mentares realizados foram análise histopatológica (24) e análise bacteriológica (10).

O diagnóstico de doença granulomatosa dissemina-da compatível com sarcoidose equina baseou-se nas le-sões identificadas na necrópsia e na análise histopato-lógica de lesões granulomatosas presentes em diversos órgãos, ricas em células gigantes de Langhans e negati-vas para a presença de bacilos álcool-ácido resistentes.

Conclusão: Como conclusão, pode referir-se que re-alização de necrópsia permite, na grande maioria dos casos, identificar a causa da morte em equinos, pre-ferencialmente com recurso a outros exames comple-mentares de diagnóstico.

Necropsy in horses. A case of disseminated granulomatous disease

Introduction: With the objective of estimating the prevalence of the occurrences and the capability to is-sue definitive diagnosis, an evaluation of the various causes of death in horses was performed based on the necropsy cases registered in the Laboratory of Pathol-ogy, Faculty of Veterinary Medicine, Technical Univer-sity of Lisbon. Among the cases identified, particular emphasis was given to a case of disseminated granu-lomatous disease (DGD), due to the rarity of the pa-thology, complexity of the clinical evolution and the differential diagnosis involved.

Material and methods: The reports from January 2009 to January 2013 were analyzed, and a total of 39 necropsies recovered. In the case of DGD the conclu-sion was based on the histopathology of the organs fixed in 10% formalin and subject to regular histologi-cal processing. H&E and Ziehl Neelsen stains were performed. Bacteriology was also performed.

Results: Out of 39 cases of necropsy analyzed, only one was inconclusive. The remainders were divided into six groups: Systemic Infectious Disease (5), Car-diopulmonary Disease (5), Kidney Disease (1), Gas-trointestinal Disease (21), Neurological Disease (3) and Trauma/Orthopedic Disease (3). Complementary

requires a decalcification process. The most common method consists on sample’s immersion in acidic so-lutions. However, it causes tissue damage and is time consuming, delaying the diagnosis. The use of mi-crowaves accelerates the decalcification process, but shouldn’t compromise the histological image.

The aim of this work was to reduce the decalcification time, maintaining the quality of the histological image.

Material and methods: Goat compact and spongy bone, with dimensions that intended to simulate bi-opsies and surgical or necropsies specimens, were used. Decalcification was performed by conventional method and microwave method with an adaptation on a known protocol, using 5% and 10% nitric acid.

Results: For larger fragments, the protocol was dis-

continued after 4 hours of microwave cycles** with 10% nitric acid, because the decalcification was in-complete, in spite of evident compact bone destruc-tion. In the fragments of spongy bone, there was a reduction of approximately 25 hours, comparing with conventional method. In biopsies, there was a reduc-tion of approximately 10 hours using 5% nitric acid. With 10% nitric acid, there was tissue destruction. The cases with complete decalcification had a poor quality of the histological image.

Conclusion: The use of microwave decalcification with 5% or 10% nitric acid, applying the protocol of this study on goats samples, reduces the process time but compromises the histological image, which is im-practical for diagnosis purpose.

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Processos patológicos prevalentes em carnívoros silváticos mortos em acidentes rodoviários

Matos A.C1., Figueira L1., Martins M.1, Matos M.2, Ál-vares S.1, Mendes A.1, Pires M.A.3, Coelho A.C.3, Pinto M.L.3*

1 Instituto Politécnico de Castelo Branco, Castelo Branco, Portugal

2 Centro de Genética e Biotecnologia, Instituto de Bio-tecnologia e Bioengenharia, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal

3 CECAV - Centro de Ciência Animal e Veterinária; ECAV- Escola de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal

* [email protected]

Introdução: As doenças que afetam os animais selvagens têm sido alvo de um interesse crescente,

uma vez que se demonstrou que, para além das impli-cações relacionadas com a conservação das espécies, podem ter um impacto significativo na saúde animal e humana. Devido ao seu comportamento furtivo, os carnívoros selvagens constituem uma população difícil de monitorizar e a investigação de doença nestas es-pécies resulta geralmente do exame de animais que são encontrados mortos.

Material e métodos: Este estudo foi realizado em carnívoros selvagens vítimas de acidentes de viação, em Portugal, entre 2009 e 2012, e inclui 3 famílias e 6 espécies diferentes (n=72). Os animais foram submeti-dos a exame post-mortem e foram efetuadas colheitas, sendo os tecidos fixados em formol tamponado a 10%, processados para inclusão em parafina e corados com hematoxilina-eosina.

Resultados: As lesões pulmonares foram as mais prevalentes, (15/72; 20,8%), especialmente em ra-posas (Vulpes vulpes, 8/49; 16,3%) e saca-rabos (Herpestes ichneumon, 7/15; 46,6%). As pneumonias parasitárias, sugestivas de infestação por Crenosoma vulpis ou Angiostrongylus vasorum foram observadas

Fibromatosis in Iberian hare Lepus granat-ensis. Preliminary data.

Arnal MC, Martínez-Durán D, Revilla M, Fernández de Luco D *

Departamento de Patología Animal. Facultad de Vet-erinaria. Universidad de Zaragoza. C/ Miguel Servet 177. 50013 Zaragoza. Spain.

* [email protected]

Introduction: Hare fibromatosis is a rare and trans-missible viral disease, caused by a Leporipoxvirus, antigenically more related to the Shope fibroma virus than myxoma virus. The disease is characterized by single or multiple skin tumours on ears, head and legs. The affected animals appear in late summer and au-tumn with high morbidity and low mortality. Fibroma-tosis has been described in wild and farmed brown hare Lepus europaeus in Europe (France, Germany, Italy, U.K.). African hare fibromatosis is a very similar disease caused by an unclassified Poxvirus affecting Cape hare Lepus capensis in Kenya. Recently, another

similar disease has been reported in mountain hare Le-pus timidus in Finland, where gross and microscopic lesions resembled to be associated to a Poxvirus infec-tion.

Material and methods: We describe here two natu-ral cases in wild Iberian hares Lepus granatensis in Aragon region (Spain). Both hares were adults female and male hunted in the autumn period in 1998 and 2006, respectively.

Results: Noticeable swelling eyelids were observed in both animals and the male also showed small nodu-lar lesions in nose and lips, swelling prepuce and an irregular swelling of scrotum skin. The dermis histopa-thology of skin gross findings consisted in fibroblast cells proliferation and oedema, whereas the epidermis showed swelling and vacuolated cells with intracyto-plasmic eosinophilic inclusion bodies. Infiltration of plasma cells and lymphocytes were observed in the dermis. Neutrophils were present in the dermis and epidermis, probably by secondary bacterial infections.

Conclusion: The observed lesions could be associat-ed to “hare fibromatosis” in Iberian hare Lepus granat-ensis, in Spain.

exams were histopathological examination (24) and bacteriological analysis (10).

The diagnosis of disseminated granulomatous dis-ease consistent with equine sarcoidosis was based on the gross morphology at necropsy and histopathology of granulomatous lesions with Langhans giant cells

present in different organs that were negative for the presence of acid-fast bacilli.

Conclusion: It can be concluded that, in most cases, necropsy allows for the identification of the cause of death in horses, preferentially using other complemen-tary exams to achieve a correct and complete diagnosis.

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Doença vírica hemorrágica (DVH) – uma nova variante?

Vala H1,2*, Coelho C1,2, Nóbrega C1,2, Mesquita JR1,2, Oliveira J1,2

1 Escola Superior Agrária de Viseu, Instituto Politécni-co de Viseu, Portugal;2 Centro de Estudos em Educação, Tecnologias e Saú-de, Instituto Politécnico de Viseu, Portugal

* [email protected]

Introdução: A doença vírica hemorrágica (DVH), causada por um RNA vírus (género Lagovírus, família Caliciviridae), é uma doença fatal que afeta coelhos do-mésticos e selvagens. Estudos anteriores a 1984, demons-traram a existência de anticorpos específicos para DVH em coelhos saudáveis de várias regiões europeias e ainda a possibilidade de estes animais apresentarem alguma re-sistência contra a DVH conferida por uma imunidade cru-zada com calicivírus benignos, fazendo com que a doença exibisse um quadro clínico menos severo. A doença foi controlada em cuniculturas graças à vacinação, mas é ain-da uma ameaça nas populações selvagens não vacinadas.

Uma nova variante desta doença, descrita em 2010 na Península Ibérica, afeta principalmente animais jo-vens, que exibem hemorragias no coração, traqueia, timo, pulmões, fígado, rins, intestino, assim como

CID, icterícia, esplenomegália e enterite catarral.Objetivos: Descrever um surto de elevada morta-

lidade numa cunicultura, principalmente em animais jovens, com lesões típicas de DVH.

Material e métodos: Foram colhidas amostras de co-elhos vacinados e não vacinados, alvo de morte súbita. As amostras foram fixadas em formalina a 10% (48 ho-ras), embebidas em parafina e processadas seguindo os procedimentos de rotina para avaliação histopatológica

Resultados: Principais lesões observadas: opistó-tonus; congestão e edema pulmonar; icterícia severa; esplenomegália; úlceras gástricas punctiformes; con-gestão renal bilateral, petéquias (timo).

Conclusão: Embora esta infeção seja mais comum em animais adultos, as lesões observadas são consis-tentes com DVH. A presença concomitante de lesões associadas à nova variante de DVH (CID, icterícia, esplenomegália, enterite catarral) leva-nos a suspeitar da sua presença em Portugal, ressalvando o facto da necessidade de estudos mais aprofundados.


Rabbit haemorrhagic disease (RHD) – a new variant?

Introduction: Rabbit haemorrhagic disease (RHD) is an acute fatal disease of domestic and wild Euro-

em 6 raposas. A adiaspiromicose, provocada por Em-monsia crescens, foi a lesão pulmonar mais comum em saca-rabos (4/15, 26,6%). A nefrite intersticial crónica e a linfadenite macrofágica afetaram, respetivamente, 10/72 (13,8%) e 6/72 (8,3%) animais das famílias Ca-nidae e Mustelidae.

Conclusão: De acordo com este estudo, as pneu-monias parasitárias e micóticas encontram-se entre as lesões mais prevalentes em carnívoros selvagens e podem ter um impacto significativo na saúde destas es-pécies, quer devido à magnitude das lesões observadas, quer devido ao aumento da susceptibilidade a outros agentes infeciosos.

Disease processes identified in road killed wild carnivores

Introduction: Wildlife diseases have been considered increasingly important due to their potential effect upon human health, veterinary medicine, wildlife, and con-servation biology. Since wild carnivores are elusive ani-mals, the occurrence of disease in these species has been typically investigated by identification of pathological processes in carcasses that are found incidentally.

Material and methods: This study was conducted in wild carnivores found death on the roads in Portu-

gal, from 2009 to 2012 (n=72), representing 3 families and 6 different species. Post mortem examination was performed and multiple tissues were fixed in 10% neu-tral buffered formalin, processed for routine paraffin embedding and stained with hematoxylin and eosin for histopathological examination.

Results: Lung lesions were the most prevalent find-ing (15/72, 20.8%), particularly in fox (Vulpes vulpes, 8/49, 16.3%) and Egyptian mongooses (Herpestes ichneumon, 7/15, 46.6%). Six foxes showed lesions of parasitic pneumonia suggestive of Crenosoma vul-pis or Angiostrongylus vasorum infestation. In Egyp-tian mongooses adiaspiromycosis due to Emmonsia crescens were the most common lung lesions (4/15, 26.6%). Chronic interstitial nephritis was registered in 10/72 (13.8%) animals, while in 6/72 (8.3%) macro-phage lymphadenitis was observed, both conditions af-fecting members of the Canidae and Mustelidae.

Conclusion: According to our study, parasitic and mycotic lung pneumonias are amongst the most preva-lent lesions in wild carnivores. Although parasites and fungus may often be regarded as a burden that has little or no impact on the animals, our findings suggest that they can severely affect animal health by the magni-tude of their lesions and by making turning the host more susceptible to other infectious agents.

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Timo de Coelho – um potencial marcador para técnicas de deteção de apoptose

Vala H1,2*, Santos C1,2, Cruz R1,2, Nóbrega C1,2, Ortiz AL3, Mesquita JR1,2, Esteves F1,2, Mega A1,2,

1 Escola Superior Agrária de Viseu, Instituto Politéc-nico de Viseu, Portugal;

2 Centro de Estudos em Educação, Tecnologias e Saúde, Instituto Politécnico de Viseu, Portugal

3 León University, León, Spain

* [email protected]

Introdução: As técnicas de determinação de apop-tose têm sido preconizadas para fins de diagnóstico, designadamente para determinação das caraterísticas biológicas das neoplasias e, indiretamente, determi-nação do prognóstico.

A implementação de uma nova técnica num labo-ratório pressupõe o uso de um controlo positivo efi-caz para aferição da mesma. Muitas das publicações da especialidade sobre o tema não indicam, de modo claro, os controlos positivos usados e não divulgam os resultados dos mesmos.

O objetivo deste trabalho consistiu na implemen-tação de três métodos de deteção de apoptose, utilizan-do três amostras de tecidos de cão: neoplasia mamária - carcinoma in situ, timo e plasmocitoma; e uma amos-tra de tecidos de coelho – timo.

Material e métodos: Os métodos de imunohis-toquímica incluíram a deteção de proteínas pro- e anti-apoptóticas, respetivamente, Bax e Bcl-2 (1:100; Santa Cruz, Biotechnology) e o método de TUNEL, com o kit de deteção de apoptose in situ (1:2,5; Roche).

Resultados: O plasmacitoma revelou reação posi-tiva moderada com todos os métodos testados. O car-

cinoma in situ revelou reação positiva moderada com os anticorpos pro-apoptóticos e mais intensa com o anticorpo anti-apoptótico. O timo de cão revelou reação positiva moderada nos timócitos do córtex com os anticorpos pró-apoptóticos e débil nos da medular. Com o anticorpo anti-apoptótico revelou reação débil na medular e negativa no córtex. Idênticos resultados foram obtidos no timo de coelho, tendo sido, contudo, mais forte a intensidade das respetivas reações.

Conclusão: O timo de coelho revelou a reação mais específica dos tecidos estudados, sendo assim reco-mendado como um bom controlo positivo para estudos de apoptose.


Rabbit thymic tissue – a potential marker for apoptosis techniques

Introduction: Apoptosis methods have been pro-posed for diagnostic purposes, in particular for deter-mining the biological characteristics of tumours and, indirectly, their prognosis.

Implementation of a new technique requires the use of an effective positive for correct assessment.

Most specialty publications on the subject, do not indicate the positive controls used and do not disclose the obtained results therein.

Objective: The aim of this work was to implement three different methods for the detection of apoptosis, using three canine tissue samples, consisting of breast cancer - carcinoma in situ, thymus and plasmacytoma; and a sample of rabbit tissues - thymus.

Material and methods: Immunohistochemistry was performed, using pro- and antiapoptotic proteins, respectively, Bax and Bcl2 (1: 100; Santa Cruz, Bio-

pean rabbits caused by a RNA virus (genus Lagovirus, family Caliciviridae). Prior to 1984, healthy rabbits in European regions had RHDV-specific antibodies and their infection with benign rabbit caliciviruses con-ferred them a low degree of cross-protective immunity against RHD, determining less severe clinical courses. Vaccination allowed to control the disease in the rab-bit industry, but RHD still threatens non-vaccinated wild populations. A new variant of this disease is be-ing described since 2010 in Iberian Peninsula. It af-fects mainly young rabbits that exhibit haemorrhages in heart, trachea, thymus, lungs, liver, kidneys and gut, as well as DIC, jaundice, splenomegaly and catarrhal enteritis.

Objectives: To describe a case of high mortality rate on a rabbitry, mostly in young rabbits, with typical le-sions of RHD.

Material and methods: Samples from domestic

vaccinated and non vaccinated rabbits which died sud-denly were taken and fixed in 10% neutral-buffered formalin for 48 hours and embedded in paraffin. 3µm sections were stained for routine histopathological di-agnosis (H&E) and examined by light microscopy.

Results: Main macroscopic lesions observed: opisthotonos, oedema and pulmonary congestion, se-vere jaundice, splenomegaly, gastric punctiform ul-cers, bilateral renal congestion and thymic petechiae,

Conclusion: Macroscopic lesions in infected young’s, consistent with RHD infection usually ob-served only in adult rabbits, and the presence of le-sions mostly associated to the new variant of RHD (DIC, jaundice, splenomegaly, catarrhal enteritis), led us to consider the presence of the new variant of RHD in Portugal, although further studies are needed.


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Um caso de hemangiosarcoma cardíaco em cão

Pires M.A.1,2*, Pinheiro D. 1, Silva N.3, Montenegro L.3

1 CECAV, University of Trás-os-Montes and Alto Dou-ro, P.O. Box 1013, 5001-801 Vila Real, Portugal.

2 ECAV, University of Trás-os-Montes and Alto Douro, P.O. Box 1013, 5001-801 Vila Real, Portugal.

3 Veterinary Montenegro Hospital (HVM), 4200 - 447 Porto, Portugal.

* [email protected]

Introdução: Segundo a literatura, o hemangiossar-coma cardíaco é uma situação comum nos cães Pastor Alemão, comumente associado a lesão esplénica.

Os autores descrevem um caso de hemangiossarco-ma cardíaco sem envolvimento esplénico, com parâ-metros clínicos e imagens macroscópicas, associado a metástases pulmonares.

Material e métodos: Foram remetidos ao Laborató-rio de Histologia e Anatomia Patológica da UTAD, o coração e pulmão de um Pastor Alemão, macho, de 11 anos de idade. Os órgãos fixados em formol tampona-do a 10%, foram processados por rotina e corados com hematoxilina e eosina.

Resultados: O historial do animal indicava ausência de vacinação e desparasitação, fraqueza extrema, disp-neia e choque. Ao RX a silhueta cardíaca apresentava-se arredondada e com imagens de efusão torácica e pericárdica, confirmada por ecografia.

Foi solicitada a eutanásia, tendo a necrópsia revelado hemotórax e hemopericárdio, lesão papilar exofitica na aurícula direita, vilosa, de 3 cm de diâmetro que inva-dia o miocárdio, até ao pericárdio com 6x3x4,5cm. O pulmão apresentava múltiplas pequenas lesões redondas e negras, a maior com 0,9 cm de diâmetro. Não se ob-servaram outras lesões macroscópicas dignas de registo.

O coração apresentava proliferação de células fuso-celulares, com elevado pleomorfismo e células atípicas, com 4 a 5 mitoses/40x, com disposição estoriforme e fendas com eritrócitos. O pulmão apresentava múlti-plas metástases com células e disposição semelhantes ao observado no coração, algumas intimamente ade-

rentes aos vasos sanguíneos. Todo o tecido adiposo ad-jacente ao coração apresentava proliferação de células neoplásicas.

Conclusão: O diagnóstico foi de hamangiossarcoma da aurícula direita com metástases pulmonares, sem envolvimento esplénico.

A case of heart hemangiosarcoma in a dog

Introduction: The consulted literature, referred that hear hemangiosarcoma, a common condition in Ger-man Shepherd dog, generally associated with spleen hemangiosarcoma.

The authors report a case of heart hemangiosarcoma without spleen implication, with clinical parameters and macroscopic images, associated with lung metastasis.

Material and methods: an heart and lung from an eleven years old male German Shepherd dog was to the Laboratory of Histology and Anatomical Pathology, at UTAD. The organs were fixed in 10% buffered formalin, and processed and stained with haematoxylin and eosin.

Results: The clinical history indicated absence of vaccination or dewormed medication, generalized weakness, dyspnoea and shock. At x-ray the cardiac silhouette is rounded with pleural and pericardial effu-sion confirmed by ultrasonography.

Euthanasia was requested and at necropsy an abun-dant hemothorax, and hemopericardium was recorded. The right auricle presents a papillary villous exofitic proliferation with 3cm of diameter, that invaded the myocardium until the pericardial wall with overall dimensions 6x3x4.5cm. The lung presented multiple black round nodules, the larger with 0.9 cm diameter. There were no other gross lesions noteworthy.

The histology of the heart lesion revealed fusocel-lular proliferation with high pleomorphic and atipic cells, with 4-5 mitosis for HPF. The neoplasia had a storiform pattern with clefts with erythrocytes. The lung had multiple metastases with similar cells, some of them within vascular structures. All adipose tissue around the heart had neoplasic cells.

Conclusion: The final diagnosis was hemangiosar-coma of the right auricle with lung metastasis, without spleen implication.

technology) and the TUNEL technique (1: 2,5; Roche), using the in situ cell death detection kit.

Results: Canine plasmacytoma revealed moderate positive reaction with all methods. Canine carcinoma in situ showed moderate positive reaction with pro-ap-optotic antibodies and more intense with anti-apoptotic antibody. Dog’s thymus showed moderate positive re-action in cortical thymocytes with pro-apoptotic anti-bodies and weak in the medullary thymocytes. With the anti-apoptotic antibody, medullary thymocytes

showed weak reaction and negativity in the cortex. Identical results were obtained in rabbit’s thymus, but with stronger intensity.

Conclusion: The rabbit thymus showed the most specific reaction of the tissues studied, by which the authors recommended it as a viable positive control for apoptosis studies.

Acknowledgments: FCT and CI&DETS (PEst-OE/CED/UI4016)

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Hérnia de Bexiga associada a Angioleio-miossarcoma Cutâneo em Coelho

Santos S.1*, Patrício. R.1,2

1 CICV - FMV- ULHT, Lisboa, Portugal2 AlcabidecheVet – Clínica Veterinária, Cascais, Por-tugal

* [email protected]

Introdução: Em Agosto de 2012 um coelho de es-timação com 6 anos de idade, macho esterilizado foi submetido a cirurgia para extirpação de uma massa subcutânea ulcerada, localizada na região inguinal e associada a uma hérnia de bexiga.

Material e métodos: Após a cirurgia a massa foi enviada para análise histopatológica, fixando-se o te-cido em formol tamponado a 10% para coloração com hematoxilina & eosina (H&E). Realizou-se imunohis-toquímica com α-actina (clone, 1A4 DAKO; 1\180)

e desmina (clone DE-R-11, DAKO; 1\50) utilizando intestino e estômago de cão como controlo positivo.

Resultados: A H&E revelou uma neoplasia subcutâ-nea, não capsulada e infiltrativa constituída por células fusiformes anaplásicas organizadas em feixes compac-tos e ninhos. As células neoplásicas apresentavam-se intimamente relacionadas com as estruturas vasculares parcendo proliferar da camada média dos vasos san-guíneos dérmicos os quais apresentavam a camada mé-dia esclorosada. Foi observado pleomorfismo intenso, índice mitótico elevado (0-4 mitoses por campo 40x) e focos de necrose.

Os anticorpos foram fortemente positivos em aproxi-madamente 90% das células neoplásicas.

Discussão: Trata-se de uma neoplasia maligna, rara em coelhos, sobre a qual existe pouca informação re-ferente aos estudos imunohistoquímicos e comporta-mento biológico esperado. Enfatiza-se a eficácia dos anticorpos utilizados e a não reincidência.

Conclusão: Angioleiomiossarcoma cutâneo.

Prolapso da cloaca associado a um adeno-carcinoma intestinal em cobra-falsa-coral (Lampropeltis triangulum)

Martinho F.1, Faísca P.1, Santos S.1, Carvalho I.2, Aná-gua M.1

1 CICV- Faculdade de Medicina Veterinária - ULHT, Lisboa, Portugal7

2 DNATech

Caso clínico: Uma cobra-falsa-coral fêmea, com 4 anos de idade, apresentou-se com anorexia e prolapso da cloaca recorrente. Com ecografia celómica visuali-zou-se massa na parede do terço final do cólon, à qual se seguiu uma enterectomia da zona afetada.

Macroscopia: Parede intestinal com 2 x 1 x 1 cm, que apresenta nódulo ulcerado, branco homogéneo, com limites bem definidos.

Microscopia: Histologicamente, corresponde a um fragmento de intestino grosso, ulcerado que apresenta uma proliferação celular não capsulada com origem na mucosa e que invade as restantes camadas intestinais até à serosa. As células são colunares altas intercala-das por células caliciformes dispostas em quistos, áci-nos e lóbulos num estroma desmoplásico. As células apresentam citoplasma acidófilo e um núcleo no polo basal redondo com a cromatina finamente ponteada e um nucléolo evidente. No lúmen das estruturas epite-liais e no estroma envolvente observa-se a deposição de mucinas. O índice mitótico é baixo.

As células epiteliais apresentaram imunomarcação positiva para CK AE1/AE3 (Dako M3515).

Conclusão: Com base nos achados histológicos, o

diagnóstico é de um adenocarcinoma intestinal muci-noso. Os autores consideram que se deveria incluir nas etiologias de prolapsos da cloaca em cobras, os adeno-carcinomas intestinais.

Cloacal prolapse associated with an intestinal adenocarcinoma in a milk snake (Lampro-peltis triangulum)

Clinical case: A 4 years old, female, milk snake, was presented with anorexia and recurrent rectal prolapse. By ultrasound, an intestinal mass in the final third of the colon was identified, and an enterectomy was per-formed.

Macroscopically: Intestinal wall with 2 x 1 x 1 cm, presenting an ulcerated, well demarcated, white, ho-mogenous nodule.

Microscopically: A section of colon, focally ulcerat-ed, presented epithelial cell proliferation originating in the mucosa and invading the adjacent intestinal layers. The neoplastic cells were tall, columnar, interspersed with goblet cells, and were disposed in cysts, acini and lobules in a desmoplastic stroma. The cells presented acidophilic cytoplasm, and a round, basally located, nuclei with stippled chromatin and distinct nucleoli. The lumen of the epithelial structures was filled with mucin. Mitotic index was low.

Epithelial cells presented positive immunostaining for CK AE1/AE3 (Dako M3515).

Conclusion: In the basis of the histological findings, the diagnosis is mucinous adenocarcinoma of the co-lon. In the author’s opinion, colon adenocarcinomas should be included in the differential diagnosis of cloa-cal prolapses in snakes.

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Bladder Hernia associated to a Cutaneous Angioleiomyosarcoma in a Rabbit

Introduction: A 6 year-old neutered male pet rabbit presented on August 2012 with a bladder hernia asso-ciated to an ulcerated subcutaneous neoplasm in the inguinal area.

Material and methods: After the surgery the mass was submitted for histopathology. Tissue samples were fixed in 10% neutral buffered formalin and stained with hematoxylin and eosin (H&E). We used antibod-ies against α-smooth-muscle actin (clone, 1A4 DAKO; 1\180) and desmin (clone DE-R-11, DAKO; 1\50) for immunohistochemical studies. Dog´s intestine and stomach samples were used as a positive control.

Results: The H&E revealed an unencapsulated and infiltrative neoplasm in the subcutaneous tissue, com-

posed of anaplastic spindle cells arranged in compact bundles and whorls. The neoplasm cells were closely connected with vascular structures and seemed to proliferate from the tunica media of the subcutane-ous blood vessels which presented sclerosis of tunica adventitia. It was observed an intense pleomorphism, higher mitotic index (0-4 mitotic figures by fields at 40x) and foci of necrosis.

Around 90% of the neoplastic cells were strongly positive for antibodies.

Discussion: This case presents a rare malignant neo-plasm in rabbits and there is little information about immunohistochemical studies and neoplastic behav-iour. It is important to share the effectiveness of the used antibodies and the not recurrence of this neo-plasm.

Conclusion: Cutaneous angioleiomyosarcoma.

Caracterização do índice apoptótico em mastocitomas caninos

Paiva D1*, Cruz R1,2, Mega A1,2, Vala H1,2

1 Escola Superior Agrária de Viseu, Instituto Politéc-nico de Viseu, Portugal;2 Centro de Estudos em Educação, Tecnologias e Saú-de, Instituto Politécnico de Viseu, Portugal

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Introdução: Encontram-se descritos estudos de apoptose em várias neoplasias. A apoptose é um pro-cesso biológico de morte celular programada que, de-vido ao seu importante papel na oncogénese, poderá elucidar alguns aspetos.

Objetivo: Deteção da apoptose em mastocitoma canino, procurando determinar a sua relação com a classificação histológica, índice apoptótico, e prog-nóstico.

Material e métodos: 12 casos de mastocitoma ca-nino, do ficheiro de análises do Laboratório de Ana-tomia Patológica da ESAV. Os métodos de imunohis-toquímica foram implementados, utilizando proteínas pro- e anti-apoptóticas Bax e Bcl (Santa Cruz, Biote-chnology).

Resultados: Todos os mastocitomas incluídos no estudo revelaram reação positiva aos anticorpos tes-tados, verificando-se uma reação mais intensa com o anticorpo pró-apoptótico Bax em relação ao anticor-po anti-apoptótico Bcl-2. Enquanto a expressão de Bax foi mais intensa nos mastocitomas de grau I, o Bcl-2 evidenciou maior expressão nos mastocitomas de grau III, apresentando ambos uma reação mais fra-ca no grau II.

Conclusão: A diminuição de Bax e aumento de Bcl-2, segundo o grau histológico, sugere um prolon-

gamento da vida e do número das células tumorais e, consequentemente, progressão tumoral.

Os mastocitomas caninos revelam sensibilidade com os marcadores Bax e Bcl-2, podendo estes ser aplicáveis em estudos de apoptose nestas neoplasias de modo a consolidar o prognóstico em relação à sua graduação histológica.


Characterization of the apoptotic index in canine mastocytomas

Introdution: Studies on apoptosis have been de-scribed in several neoplasias. Apoptosis is a biologi-cal process of programmed cell death that, due to its important role in oncogenesis, may elucidate some aspects.

Objective: Detection of apoptosis in canine masto-cytoma to determine its relationship with histologic grading, apoptotic index and prognosis.

Material and methods: 12 cases of canine masto-cytoma, from the analytic files of the Laboratory of Anatomical Pathology of ESAV. Immunohistochemi-cal methods were implemented, targeting pro- and anti-apoptotic proteins, Bax and Bcl (Santa Cruz, Bio-technology).

Results: All mastocytomas included in this study revealed a positive reaction to the tested antibodies, a more intense reaction was found to pro-apoptotic an-tibody Bax in comparison to the anti-apoptotic anti-body Bcl-2. While Bax expression was more intense in grade I mastocytomas, Bcl-2 had a higher expression in grade III mastocytomas, and both, had a weaker ex-pression in grade II.

Conclusion: The decrease of Bax and increase of Bcl-2 expression in accordance with increasing histo-

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Fibrosarcoma Cutâneo em Robalo, Dicen-trarchus labrax de Tanque de Terra

Ramos, P.1*, Grade, A.1, Branco, S.2

1Laboratório de Patologia dos Animais Aquáticos. Ins-tituto Português do Mar e da Atmosfera, IPMA, I.P. Avenida de Brasília, 1449-006 Lisboa, Portugal2Instituto de Ciências Agrárias e Ambientais Mediter-rânicas, Universidade de Évora. Apartado 94, 7002-554 Évora, Portugal

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Introdução: Os tumores espontâneos em peixes são morfologicamente semelhantes e em muitos casos, idênticos aos que ocorrem em várias espécies animais, incluindo o homem. Assim, o seu estudo é importante não só do ponto de vista da patologia comparada mas também pela escassez de registos.

Material e métodos: Num robalo proveniente de um tanque de terra foi observada a presença de duas for-mações nodulares localizadas na face lateral esquerda.

Amostras do nódulo maior foram fixadas em formol salgado a 10%. Obtiveram-se cortes com 3µ que foram corados com hematoxilina & eosina e Van Gieson.

Resultados: O nódulo maior encontrava-se na face lateral esquerda, próximo da base da barbatana dorsal e tinha aproximadamente 2,7 cm de diâmetro. Este nó-dulo, de cor amarela, apresentava superfície ulcerada e ligeira congestão. Ao corte, tinha consistência branda. O segundo nódulo com cerca de 1 cm de diâmetro foi observado abaixo da linha média. A imagem histológi-ca do nódulo permitiu observar a presença de células com morfologia fibroblástica, fusiformes, com disposi-ção em feixes, num estroma bem vascularizado e rico em colagénio, entrecruzando-se com feixes de células com núcleo redondo em áreas com aspecto mixoma-toso. A neoplasia invadia o tecido muscular adjacente. Na derme, observou-se reacção inflamatória com infil-tração de macrófagos e formação de granulomas. Fo-ram identificados melanócitos ao longo da membrana basal, dispersos na derme ou em centros melanoma-crofágicos. O estroma abundante em colagénio corou positivamente com o Van Gieson.

Conclusão: Com base nas imagens histológicas e na

reacção positiva ao Van Gieson, diagnosticou-se um fibrosarcoma.

Cutaneous Fibrosarcoma in Earth Pond Reared European Seabass, Dicentrarchus labrax

Introduction: The spontaneous neoplasms in fishes are morphologically similar and, in many cases identi-cal, to those found in several animal species, includ-ing man. Thus their study is valuable not only from the standpoint of comparative pathology but also by the scarcity of the records.

Material and methods: A european bass in a earth pond culture was discarded because of the presence of two nodules on the left side of the body surface. Por-tion of the largest tumour was collected, fixed in 10% neutral buffered formalin and sections 3µ thick were stained with both haematoxilyn & eosin and Van Gie-son.

Results: The largest nodule was located on the left flank, near the dorsal fin and measures approximately 2,7 cm in diameter. In appearance, its surface was yel-lowish, with superficial congested ulcerations and soft consistency. The second one was a little round nodule with 1,2 cm diameter, ventral and bellow the medial line. The histological appearance of the tumour was a well vascularized, no encapsulate dermal mass of spindle-shaped cells, forming dense whorls in a col-lagen rich stroma. Adjacent less cellular areas contain-ing stellate cells with criss-crossed fibrils and loosely organized, suggested a myxomatous area. These spin-dle-shaped cells were seen infiltrating the subcutane-ous tissue and invading the adjacent muscle tissue. In-filtration of inflammatory cells and granulomas could be observed within the dermis. Melanophores were scattered along the basement membrane and dermis or forming melanomacrophage centres. The histochemi-cal reactions of the stroma were positive with the spe-cific coloration of Van Gieson.

Conclusion: The diagnosis of fibrosarcoma was based on the examination of elongated fibroblasts and dense collagenous fibres that stains positively with Van Gieson.

logic grade, suggests an extension in the life of tumor cells, an increase their number and, consequently, tu-moral progression.

Canine mastocytomas revealed sensitivity with Bax and Bcl-2 markers and may be applied to apoptotic

studies in such tumors to consolidate prognosis in rela-tionship to histologic grading.


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Imortalização de linhas celulares caninas primárias de tumores mamários: optimi-zação de protocolo

Luís R Raposo1,2, Susana Santos1,2,3,4, Joaquim Henri-ques5, Pedro Faisca5, Margarida Alves5, André Besel-ga6, Jorge Correia6, Alexandra R Fernandes1,2, 4*

1 Centro de Química Estrutural, Complexo I, Instituto Superior Técnico, Universidade Técnica de Lisboa, Lisbon, Portugal,

2 Escola de Engenharia, Universidade Lusófona de Hu-manidades e Tecnologias, Lisbon, Portugal,

3 Department of Biochemistry and Human Biology, Faculty of Pharmacy, University of Lisbon, Lisbon, Portugal,

4 Departamento de Ciências da Vida, Faculdade de Ci-ências e Tecnologias, Universidade Nova de Lisboa, Caparica, Portugal,

5 Centro de Investigação em Ciências Veterinárias, Fa-culdade de Medicina Veterinária - Faculdade de Me-dicina Veterinária- Universidade Lusófona de Huma-nidades e Tecnologias, Lisbon, Portugal,

6 Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa, Lisbon, Portugal * [email protected]

Introdução: Os tumores mamários caninos (CMTs) são o tipo de tumor mais frequente nas cadelas, corres-pondendo a 52% de todas as suas neoplasias. Para as va-riantes malignas de CMT, a cirurgia é a única opção de sucesso, uma vez que a quimioterapia, não aumenta sig-nificativamente o tempo de sobrevivência. Por esta ra-zão, é crucial desenvolver modelos celulares por forma a testar novos compostos com actividade anti-tumoral para os CMTs. As linhas celulares imortalizadas deriva-das de CMTs poderão, ainda, constituir uma ferramenta importante na investigação dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à tumorigénese dos CMTs.

Material e métodos: Para a imortalização das linhas celulares derivadas de CMT, as amostras das biópsias são lavadas, maceradas e incubadas com tripsina durante uma hora a 37ºC em vez da incubação em gelo descrita na bi-bliografia. As células individuais são recolhidas e semea-das em meio DMEM suplementado. As células crescem até atingir uma monocamada confluente sendo, de segui-da, tripsinizadas e colocadas em frascos maiores (5x105 células são colocadas a crescer em frascos de 75cm2).

Resultados: A nossa metodologia permitiu-nos obter monocamadas de células confluentes para todas as amos-tras das biópsias. Microscopicamente, a morfologia das células é compatível com uma origem epitelial. Actual-mente, temos três linhas celulares que foram tratadas com tripsina 10 vezes, sugerindo uma possível capacidade para originarem linhas derivadas de CMT imortalizadas. Uma das linhas celulares é derivada de um carcinoma ma-mário simples (tipo mucinoso) de grau II e as restantes de carcinomas mamários complexos de grau II.

Conclusão: O presente trabalho descreve um proto-colo optimizado para a imortalização de linhas celula-res desenvolvido pela nossa equipa. Foi possível obter consistentemente monocamadas confluentes de células para todas as amostras processadas até à data. Estas monocamadas de células são compostas por células com morfologias diferentes (algumas mais fusiformes, outras mais cuboidais) e tamanhos diferentes indepen-dentemente do grau de malignidade e do tipo de tumor que lhe deu origem. Com as tripsinizações, as células tendem a tornar-se mais homogéneas, com uma forma mais cuboidal e mais pequenas.

Immortalization of primary canine cell lines from mammary tumors: a protocol optimization

Introduction: Canine mammary tumors (CMTs) are the most common tumor type in female dogs, compris-ing 52% of all neoplasms. For malignant CMT vari-ants, surgery is the only successful treatment option since chemotherapy has not radically increased overall survival time. In this regard it is a key issue to develop cellular models to validate new therapeutic compounds for CMT treatment. Immortalized CMT cell lines may also be a valuable tool that will allow achieving a better knowledge on the cellular and molecular mechanisms underlying CMT tumorigenesis.

Material and methods: For CMT cell line immor-talization, intra operative tumour samples were ob-tained, washed, minced and incubated with trypsin for one hour at 37ºC instead of cooling as described in the bibliography. Individual cells were then collected and seeded in supplemented DMEM medium. The cells are allowed to grow until a confluent primary cell monol-ayer is formed followed by trypsinization and seeded in larger flasks (5x105 cells are grown in 75cm2 flasks) than in the previous protocol.

Results: Our changes in the original methodology allowed us to growth primary cell monolayers from all biopsy samples. Microscopically, the cell morphology is compatible with their epithelial origin. Currently we achieved three CMT cell lines that have been trypsinised for 10 times, suggesting a potential capacity to originate immortalized primary CMT cell lines. One of the cells lines was established from a grade II mammary simple carcinoma (mucinous type) and the remaining from grade II mammary complex carcinomas.

Conclusion: An optimized protocol for cell lines immortalization was developed by our team. Until now, we were able to establish a primary cell monolay-er for all processed samples. These cell monolayers are composed of cells with different morphologies (some more fusiform other more cuboidal) and different sizes regardless the tumour type or grade that originated the monolayer. With trypsinizations the cell populations tend to become more homogenous, with a more cuboi-dal shape and smaller size.

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FlockReprod: novos métodos para o controlo da sazonalidade e a indução do estro em caprinos

FlockReprod: new methods to control seasonality and estrus induction in goats

S Cavaco-Gonçalves, JP Barbas, MC Baptista, R Mascarenhas

INIAV I.P. - UEBRG

As Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis nos últimos anos, tem aumentado a preocupação dos consumidores para consumirem produtos animais pro-venientes de sistemas que minimizam ou evitam o uso de químicos ou hormonas e que não comprometem o bem-estar dos animais. Estas novas exigências dos consumidores obrigam ao desenvolvimento de novas práticas reprodutivas que reduzam ou mesmo elimi-nem o uso de hormonas.

Assim, em Dezembro de 2009 foi iniciado um pro-jecto de R&D (FLOCKREPROD – Hormone-free non-seasonal or seasonal goat reproduction for a sus-tainable European goat milk market), que tem como objectivo o desenvolvimento de tecnologias que permi-tam a produção e leite de cabra durante todo o ano sem o uso de hormonas exógenas, assegurando a sustenta-bilidade económica e ambiental da indústria europeia de lacticínios de cabra, e dando-lhe a capacidade para responder à crescente procura dos seus produtos, in-cluindo produtos biológicos. O projecto, co-financiado pelo 7º Programa-Quadro (Capacidades, Investigação para Associações de PME), tem a participação de 7 instituições de investigação e 8 associações de criado-res de 7 Países Europeus. Envolve as seguintes raças de caprinos: Alpine e Saanen em França, Capra-Prisca, Damascus e Scopelos na Grécia, Murciano-Granadina e Malagueña em Espanha, Saanen na Croácia, Sarda em Itália, Serrana em Portugal e White-of-Banat e Car-pathian na Roménia.

As acções de Investigação e Desenvolvimento Tec-nológico foram realizadas desde o início do projecto até Novembro de 2012. O efeito-macho e diferentes tratamentos fotoperiódicos combinando dias longos e dias curtos artificiais (ou implantes de melatonina) para induzir ovulações sincronizadas foram testados tanto na estação de anestro como na de reprodução. Os resultados obtidos estão na base da criação de 3 protocolos sem-hormonas para inseminação artificial que estão actualmente a ser validados.

A estação de reprodução da raça Serrana estende-se de Setembro até Fevereiro. Durante este período, 90-100 % das cabras estão cíclicas. O uso de efeito-macho, durante o período de anestro (Maio) e sem pré-vio tratamento fotoperíódico, foi avaliado. A resposta ovulatória e a sincronização da ovulação revelaram-se pouco eficientes. Também os resultados após o uso dum protocolo de inseminação artificial sem progesta-génios baseado numa administração de prostaglandina e sem tratamento fotoperiódico prévio foram pouco prometedores, sugerindo que o tratamento prévio com dias longos, seguido por um período de dias curtos (ou implantes de melatonina), tanto em machos como em fêmeas, é necessário para melhorar estes resultados. Contudo, nas nossas condições de campo, isto pode constituir um problema, uma vez que a maior parte das explorações não têm as condições necessárias para aplicar aqueles tratamentos fotoperiódicos.

Agradecimento: Esta investigação foi financia-da pela CE (7º P-Q: FLOCKREPROD, Contrato nº 243520)

Over the last years, consumers concern on the con-sumption of animal products coming from systems that minimize or avoid the use of chemicals or hor-mones and that do not compromise the welfare of the animals has been increasing. These new demands from consumers compel the development of new reproduc-tive practices that reduce or even avoid the use of hor-mones.

Thus, it has began in December 2009 the R&D project FLOCKREPROD (Hormone-free non-sea-sonal or seasonal goat reproduction for a sustainable European goat milk market), which aims the develop-ment of technologies that allow goat’s milk produc-tion throughout the year without the use of exogenous hormones, ensuring the economic and environmental sustainability of the dairy goat industry in Europe, and enabling it to respond to the growing demand for its

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products, including organic products. The project co-funded by the 7th Framework Programme (Capacities, Research for SME Associations), has the participation of seven research institutes and eight breeders associa-tions from seven European countries. It involves the breeds Alpine and Saanen in France, Capra-Prisca, Da-mascus and Skopelos in Greece, Murciano-Granadina and Malagueña in Spain, Saanen in Croatia, Sarda in Italy, Serrana in Portugal, and White of Banat and Car-pathian in Romania.

The Research and Technological Development Work Packages were carried out from the beginning of the project to November 2012. Male effect and differ-ent photoperiodic treatments combining long days to short days (or melatonin implants) to induce synchro-nized ovulations were tested both during anestrous and breeding season. The results obtained are the base of three progestagen-free artificial insemination protocols that are now being validated.

Breeding season of Serrana breed goes from Sep-tember until February. During this period 90-100% of goats are cyclic. It was evaluated the use of the male effect during anestrous period (May), without a previ-ous photoperiodic treatment. Ovulatory response and synchronization were not very efficient. Also, results after the use of a progestagen-free artificial insemina-tion protocol based on one administration of prostag-landin and without a photoperiodic treatment were not very promising, suggesting that a previous treatment of long days, followed by a period of short days (or mela-tonin implants), to both males and females, is needed to optimize the results. However, in our field condi-tions this might be a problem, since most farms have not the conditions needed to perform those photoperi-odic treatments.

Acknowledgement: This research was funded by EC (FP7: FLOCKREPROD, Grant Agreement 243520)

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Genes e proteínas do tipo priónico, na reprodução masculina

Prion-like genes and proteins, and their effects in male reproduction

Jorge Pimenta

DVM, PhD - DGAV

As Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis são doenças neurodegenerativas fatais que incluem, entre outras, o scrapie nos ovinos e caprinos, e a Ence-falopatia Espongiforme Bovina. Este grupo de doenças apresenta características singulares, entre as quais se destacam a existência de um agente causal não conven-cional e altamente resistente, denominado prião.

Neste trabalho, pretendeu-se dar a conhecer uma outra vertente de genes desta família priónica, que apresentam uma função de relevo ao nível da fisiologia reprodutiva, com particular ênfase na reprodução mas-culina. De entre estes, destaca-se o gene prnd, que co-difica uma glicoproteína designada por Doppel e cuja expressão incide sobre o tecido testicular no adulto, apresentando um papel relevante ao nível da integrida-de do acrosoma e na motilidade dos espermatozoides.

Este gene foi estudado em 8 raças autóctones de ovi-nos, identificado o polimorfismo existente nessas raças e avaliada a sua relação com genótipos de resistên-cia ao scrapie e com características reprodutivas. Foi igualmente determinada a conformação tridimensional adquirida pela região proteica que encerra o referido polimorfismo, o que permitiu avaliar o seu comporta-mento em estudos de docking proteína-proteína.

Recentemente foi também identificado um outro gene, denominado prnt, que se pensava tratar-se ape-nas de um pseudogene, sem expressão proteica. No entanto, foi possível confirmar através de técnicas de imunofluorescência e imunohistoquímica, o padrão de localização da proteína Prt em células germinativas no decurso da espermatogênese, e em espermatozoides ejaculados em animais de raças ovinas autóctones.

Finalmente, foi efetuada uma revisão da presença das proteínas expressas pelos genes sprn e prnp (gene priónico), ao nível do sistema reprodutivo masculino.

Palavras-chave: Doppel, espermatogénese, ovinos, polimorfismo, prião, prnd, prnp, prnt, Prt, sprn, raças autóctones, reprodução masculina.

Transmissible Spongiform Encephalopathies are fatal neurodegenerative diseases that include, among others, scrapie in sheep and goats, and bovine spongi-form encephalopathy. This group of diseases have special features, among which we highlight the exist-ence of an unconventional and highly resistant agent, termed prion.

In this work, we pretended to give insights into an-other aspect of the prion genes family, namely the prominent roles they can exert at the level of repro-ductive physiology, with particular emphasis on male reproduction. Among these, the prnd gene, which en-codes a glycoprotein called Doppel and whose expres-sion focuses on the testicular tissue in the adult, with a role at the level of the acrosome integrity and sperm motility.

This gene was studied in 8 native breeds of sheep; its polymorphism identified and evaluated the relation-ship with scrapie resistance genotypes and reproduc-tive traits. The three-dimensional conformation was also established, which allowed us to assess its behav-iour in protein-protein docking studies.

Recently, another prion-like gene was identified, termed prnt, which was previously described as being a pseudogene, with no protein expression. However, it was possible to confirm through immunofluorescence and immunohistochemistry, the location pattern of Prt protein in germ cells during spermatogenesis and ejac-ulated sperm, of native breeds of sheep.

Finally, a review was made concerning the role of sprn and prnp prion family genes, in male reproductive physiology.

Keywords: Doppel, male reproduction, native breeds, polymorphism, prion, prnd, prnp, prnt, Prt, sheep, spermatogenesis, sprn.

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