MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

CROMATOGRAFIA : CHROM (COR) / GRAPHE (ESCREVER) DESCOBERTO: MIKHAEL S. TSWETT (1906) - SEPARAÇÃO DE PIGMENTOS DE FOLHAS CaCO3 ( FASE FIXA)/ ÉTER DE PETRÓLEO (FASE MÓVEL).

MÉTODO: SEPARAÇÃO PURIFICAÇÃO QUANTIFICAÇÃO IDENTIFICAÇÃO

CONCEITO A SEPARAÇÃO DE UMA MISTURA EM VÁRIAS FRAÇÕES PELA DISTRIBUIÇÃO ENTRE DUAS FASES: UMA FASE ESTACIONÁRIA E UMA MÓVEL.

SISTEMA CROMATOGRÁFICO É O CONJUNTO FORMADO PELA MISTURA A SER ANALISADO (M), PELA FASE MOVEL (FM) E FASE ESTACIONÁRIA OU FIXA (FE/FF).

CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Cromatografia

Planar Coluna

F.M. Líquida

C.CamadaDelgada

C.Papel

F.M. Gasosa F.M. Líquida

C. Gasosa CLAECCC

CCC-Cromatografia em Coluna Clássica.

CLAE-Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.

CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÂO

EQUÍLIBRIO DE ADSORÇÃO & DESSORÇÃO ENTRE OS COMPONENTES NA SUPERFÍCIE DA FASE ESTACIONÁRIA E DISSOLVIDA NA FASE MÓVEL. ADSORÇÃO DEPENDE: POLARIDADE DAS MOLÉCULAS ATIVIDADE DO ADSORVENTE COMPOSIÇÃO QUÍMICA TAMANHO DAS PARTÍCULAS POROSIDADE DAS PARTÍCULAS POLARIDADE DA FASE MÓVEL

TIPOS DE CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO

1- CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA OU FINA (Thin layer chromatograghy)

2- CROMATOGRAFIA EM COLUNA

VANTAGENS: FÁCIL COMPREENSÃO E EXECUÇÃO SEPARAÇÕES EM CURTO ESPAÇO DE TEMPO VERSATILIDADE GRANDE REPRODUTIBILIDADE BAIXO CUSTO ANALÍTICA E PREPARATIVA

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA OU FINA

ADSORVENTES (FASE FIXA)

SILICA (SiO2 ): AC. SILICICO AMORFO, ALTAMENTE POROSO, CARATER FRACAMENTE ACIDO. G ou H: presença de aglutinantes (10-15% de gesso / 1-3% amido/ talco) P: uso em camada preparativa F 254: presença de substâncias fluorescentes+ comprimento de onda F 254+ 366 : presença de substâncias fluorescentes+ comprimento de onda USADA: SEPARAR SUBSTÂNCIAS LIPOFÍLICAS ( aldeídos, cetonas, fenois, ácidos graxos, alcalóides, terpenos e esteróides).

-ALUMINA ( Al2O3 ) : CARACTERÍSTICAS ALCALINAS USADA: SEPARAR SUBSTÂNCIAS LIPOFÍLICAS ( alcalóides, hidrocarbonetos policíclicos, aminas e vitaminas liposolúveis) CLASSIFICAÇÃO DA ALUMINA ( ESCALA BROCKMANN & SCHADDER)

QUANTIDADE DE H2O/CAPACIDADE DE ADSORVER CORANTES AZÓICOS - ALUMINA ATIVIDADE GRAU I: É A MAIS ATIVA, 4000 C ( 4h), - ALUMINA ATIVIDADE GRAU II: 2- 3% H2O - ALUMINA ATIVIDADE GRAU III: 5-7% - ALUMINA ATIVIDADE GRAU IV: 9-11% - ALUMINA ATIVIDADE GRAU V: 15%

- CELULOSE: USADA: SEPARAR ACIDOS CARBOXILICOS, AMINOÁCIDOS, CARBOIDRATOS, CATIONS INORGÂNICOS E FOSFATOS - POLIAMIDA USADA: SEPARAR FENOIS E ÁCIDOS CARBOXÍLICOS. POLIAMIDA 11- ácido poliaminoundecanoico (Nylon 11) POLIAMIDA 6 – aminopooiprolactama (Perlon)

SOLVENTES OU ELUENTES (FASE MOVEL)

DETERMINAR A PUREZA DE SUBSTÂNCIAS ORGÂNICAS;

UTILIZAR COMO MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO (PADRÕES);

MONITORAR O ANDAMENTO DE UMA REAÇÃO QUÍMICA.

OBSERVAR NUMERO E CONCENTRAÇÃO DE

CONSTITUINTES DE UMA MISTURA;

UTILIZAÇÃO CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD )

PREPARAÇÃO DAS PLACAS PREPARADAS POR ESPALHAMENTO - MANUAIS - ESPALHADORES

1) PREPARAÇÃO DAS PLACAS:

2) ATIVAÇÃO DAS PLACAS: Sílica, alumina: 105-1100 C, 1h Celulose: 1050 C máximo 10 min

3) APLICAÇÃO DA AMOSTRA:TÉCNICA DE APLICAÇÃO

• PONTO- ANÁLISE QUALITATIVA

• FAIXA- ANÁLISE QUANTITATIVA E PREPARATIVA.

4) Desenvolvimento:

5) REVELAÇÃO:PROCEDIMENTOS QUÍMICOS, FÍSICOS, OU BIOLÓGICOS

APLICADOS AO CROMATOGRAMA PARA TORNAR VISÍVEL AS MANCHAS DAS SUBSTÂNCIAS SEPARADAS POR CROMATOGRAFIA.

A- PROCEDIMENTOS FÍSICOS:

- Luz ultravioleta (256 e 366nm).

B- PROCEDIMENTOS QUÍMICOS:

APLICAÇÃO DE UM REATIVO QUÍMICO PARA FORMAR UM DERIVADO COLORIDO OU FLUORESCENTE.

- IODO RESSUBLIMADO

- SULFATO CERRICO

- REAGENTES CROMOGENICOS (REAGENTES p/ ALCALÓIDES; FENOLICOS)

C- PROCEDIMENTOS BIOLÓGICOS E ENZIMÁTICOS:

- ANTIBIÓTICOS, ENZIMAS E SUBSTRATOS.

D-RADIOATIVIDADE:

- MARCADORES RADIOATIVOS (13C).

RESOLUÇÃO DA CCD

DISTÂNCIA DO PONTO CENTRAL DO SPOT A ORIGEM DO MATERIAL Rf =------------------------------------------------------------------------------- DISTÂNCIA PERCORRIDA PELA FASE MÓVEL

a Rf = ----- b

a= distância de migração da substância a origem do material b = distância percorrida pela fase móvel, a partir do ponto de saída

2- CROMATOGRAFIA EM COLUNA

ESQUEMA DE UMA COLUNA DE ADSORÇÃO A= RESERVATÓRIO DA FASE MÓVEL B= FASE MÓVEL

C= COLUNA DE VIDRO D= ADSORVENTE E= CHUMAÇO DE LÃ DE VIDRO OU ALGODÃO F= FRASCO COLETOR G= AMOSTRA

H= CAMADA DE AREIA OU DE RECHEIO, COLOCADA APÓS A APLICAÇÃO DA AMOSTRA

ATIVIDADE CROMATOGRAFICA DA FASE ESTACIONÁRIA ( SÓLIDA)

POLARIDADE

- COOH> - OH> - NH > -CHO > C=O > - COO R> -OCH3 > - CH = CH-

FASE ESTACIONÀRIA

REAÇÕES NA COLUNA CROMATOGRAFICA SOLIDOS (FE): CATALIZADORES DE REAÇÕES - ALUMINA ALCALINA : CONDENSAÇÃO DE ALDEÍDOS E CETONAS ACETONA FASE MÓVEL( NÃO USAR) - CARVÃO ATIVO : DECOMPOSIÇÃO QUIMICA - SÍLICA: ISOMERIZAÇÃO DE TERPENOS E ESTERÓIDES ENCHIMENTO DA COLUNA - UNIFORME: MAIOR EFICIÊNCIA - EVITAR FORMAÇÃO DE AR : VIBRAÇÃO DA COLUNA 1/3 FASE MÓVEL , PASTA DO ADSORVENTE+FASE MOVEL.

ELUIÇÃO

- FIXAR EM POSIÇÃO VERTICAL - ELUIÇÃO AÇÃO DA GRAVIDADE

- AUMENTAR GRADUALMENTE A FASE MÓVEL

COMPLETA SEPARAÇÃO A FASE MÓVEL DEVE:

- SER FRACAMENTE ADSORVIDA PELA FASE ESTACIONÁRIA

- NÃO SER AFETADA QUIMICAMENTE

- POSSIBILITAR O DESENVOLVIMENTO DE UMA CORRIDA CROMATOGRAFICA/ GRAU DE ADSORÇÃO.

Fig 03- ELUIÇÃO DE UMA MISTURA

RESOLUÇÃO CROMATOGRAFICA CROMATOGRAFIA EM COLUNA

- DIAGRAMA DE CONCENTRAÇÃO / PESO DAS FRAÇÕES