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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E CULTURA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ZINCO SÉRICO E PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS NA DETERMINAÇÃO DO
ESTADO CORPORAL DE ZINCO EM CRIANÇAS
SANCHA HELENA DE LIMA VALE
Natal – RN
2013
i
SANCHA HELENA DE LIMA VALE
ZINCO SÉRICO E PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS NA DETERMINAÇÃO DO
ESTADO CORPORAL DE ZINCO EM CRIANÇAS
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
como requisito para a obtenção do título de
Doutor em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. José Brandão Neto
Coorientadora: Profa. Dra. Lúcia Dantas Leite
NATAL/RN
2013
ii
ii
CATALOGAÇÃO NA FONTE
V149z
Vale, Sancha Helena de Lima.
Zinco sérico e parâmetros farmacocinéticos na determinação
do estado corporal de zinco em crianças / Sancha Helena de Lima
Vale. – Natal, 2013.
45f. : il.
Orientador: Prof. Dr. José Brandão Neto.
Coorientadora: Prof.ª Dr.ª Lúcia Dantas Leite.
Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências
da Saúde. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do
Rio Grande do Norte.
1. Zinco – Tese. 2. Suplementação oral de zinco – Crianças –
Tese. 3. Administração venosa de zinco – Tese. 4. Clearance de
zinco – Tese. I. Brandão Neto, José. II. Título.
RN-UF/BS-CCS CDU: 615.32-034.5(043.2)
iii
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenadora do Programa de pós-graduação em Ciências da Saúde:
Profa. Dra. Ivonete Batista de Araújo
iv
iv
SANCHA HELENA DE LIMA VALE
ZINCO SÉRICO E PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS NA DETERMINAÇÃO DO
ESTADO CORPORAL DE ZINCO EM CRIANÇAS
Aprovada em 13/06/2013
Banca examinadora:
Presidente da Banca:
Prof. Dr. José Brandão-Neto
Membros da Banca:
Prof. Dr. Alcides da Silva Diniz (UFPE)
Profa. Dra. Maria José de Carvalho Costa (UFPB)
Profa. Dra. Severina Carla Vieira Cunha Lima (UFRN)
Profa. Dra. Karine Cavalcanti Mauricio de Sena Evangelista (UFRN)
v
v
À Sofia e Raquel,
minhas filhas e
inspiração.
vi
vi
AGRADECIMENTOS
À Roberto, por ser meu grande incentivador.
A Odete e Joaquim, meus pais, que me legaram a educação. À Érico, Sancha Adélia,
Márcio e Adriana, minha pequena família com grande capacidade de me apoiar em todos
os momentos. À Daniela, Sofia, Camila, Raquel, Larissa, Pedro e Gabriel, por me fazerem
sorrir e esperar o futuro.
Aos meus amigos Bruna e Saulo que compartilharam suas experiências recentes de pós-
graduação e escutaram as minhas, e Camila que me acompanhou de perto nesta
empreitada. À Marília e Karina que tiveram paciência e entenderam minha objetividade.
À Profa. Dra. Lúcia Leite pelos seus ensinamentos tão valiosos, pela sua amizade e por
ter me inserido no grupo do Professor Dr. José Brandão-Neto a quem agradeço
especialmente pela confiança, pelo estímulo, pela presença na minha vida acadêmica e
por sempre tentar me ensinar a fazer ciência (espero um dia aprender!).
À Célia Márcia, Clélia, Nely, Ângela, Sandra, Larissa e Silvano pela torcida. Às Profas.
Severina Carla e Karine Sena pela valiosa contribuição e arguição na minha qualificação,
aos demais membros da banca Profa. Maria José Costa e Prof. Alcides Diniz, que se
dispuseram a participar da finalização desta etapa.
À Betinho, Lariça e Marcelo que me ensinaram a correr e superar os meus limites.
A todas as crianças anônimas que aceitaram colaborar com nosso grupo e passavam
horas nos contando suas histórias.
vii
vii
“É preciso ser leve como um pássaro, e não como a pluma”.
Paul Valéry
viii
viii
RESUMO
O zinco é um micronutriente fundamental para as funções vitais de qualquer organismo
vivo e sua deficiência em humanos pode causar alterações na expressão gênica,
crescimento e desenvolvimento infantil, e proteção antioxidante. Devido à sua
importância, as concentrações corporais de zinco são estritamente controladas por
processos homeostáticos complexos. Este controle reflete no fato da deficiência grave de
zinco ser detectada apenas após privação crônica. Embora se estime que a deficiência
leve seja comum, os métodos existentes para avaliação individual do estado corporal de
zinco são limitados e pouco eficazes. O objetivo deste trabalho foi avaliar o zinco sérico
basal e os parâmetros farmacocinéticos na determinação do estado corporal de zinco em
crianças, estabelecendo relação entre esses índices. O estudo foi aprovado pelo Comitê
de Ética em pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (CEP-HUOL) e 129
crianças, eutróficas e aparentemente saudáveis, entre 6 e 9 anos de idade, foram
avaliadas antes e após a suplementação oral de zinco (5 mg Zn/dia) durante 3 meses. No
início e fim do período houve a administração venosa de zinco (0,06537 mg de Zn/kg de
peso) em 40 destas crianças para avaliação dos parâmetros farmacocinéticos por meio de
três diferentes fórmulas de clearance de zinco. Os limites do CI (95%) para o zinco sérico
basal variaram entre 0,94 – 1,00 e 0,91 – 0,98 μg/mL em meninas e meninos,
respectivamente. Em relação aos parâmetros farmacocinéticos, a fórmula específica para
um compartimento apresentou correlação positiva com o zinco sérico após a
suplementação e foi efetiva em detectar mudanças no estado corporal de zinco.
Palavras-chave: Zinco sérico; Clearance de zinco; Suplementação oral de zinco;
Administração venosa de zinco.
ix
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ƶ, constante de eliminação;
ANOVA, analysis of variance (ánalise de variância);
AUC, area under curve (área sob a curva);
CCr, clearance de creatinina;
Cn, intercepto Y;
Co, concentração basal de zinco sérico;
Cp, concentração teórica de zinco sérico;
CZn, clearance de zinco;
D, quantidade da dose;
DNA, deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico);
F, fração da dose absorvida;
GFR, glomerular filtration rate (taxa de filtração glomerular);
IMC, índice de massa corporal;
i.v., intravenoso;
Kel, constante de eliminação do zinco sérico;
OZnS, oral zinc supplementation (suplementação oral de zinco);
RNA, ribonucleic acid (ácido ribonucleico);
SCr, serum creatinine (creatinina sérica);
SZn, serum zinc (zinco sérico);
T1/2, tempo de meia-vida do zinco sérico;
TRZn, tubular reabsorption of zinc (reabsorção tubular de zinco);
x
x
UCr, urinary creatinine (creatinina urinária);
UFRN, Universidade Federal do Rio Grande do Norte;
UZn, urinary zinc (zinco urinário);
V, fluxo de urina;
Vd, volume de distribuição;
ZnSO4.7H2O, sulfato de zinco heptahidratado;
ΔCo, diferença entre Cp e Co.
xi
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ilustração da filtração glomerular, secreção, reabsorção, e excreção renal de
zinco em crianças, sob condições fisiológicas.
Figura 2 – Desenho experimental da suplementação oral de zinco.
Figura 3 – Esquema da administração intravenosa de zinco para avaliar os parâmetros de
clearance de zinco em crianças com idade entre 6 e 9 anos.
xii
xii
SUMÁRIO
RESUMO ............................................................................................................................................ viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ............................................................................................. ix
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................................... xi
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 14
2 OBJETIVOS .................................................................................................................................... 17
2.1 Objetivo geral ........................................................................................................................... 17
2.2 Objetivos específicos ............................................................................................................... 17
3 JUSTIFICATIVA .............................................................................................................................. 18
4 MÉTODOS ...................................................................................................................................... 19
4.1 Sujeitos ..................................................................................................................................... 19
4.2 Critérios de inclusão e exclusão .............................................................................................. 19
4.3 Desenho experimental ............................................................................................................. 19
4.4 Avaliação antropométrica......................................................................................................... 20
4.5 Suplementação oral de zinco ................................................................................................... 20
4.6 Administração venosa de zinco ............................................................................................... 21
4.7 Abordagem renal ...................................................................................................................... 21
4.8 Aplicação de fórmulas .............................................................................................................. 22
4.8 Materiais biológicos .................................................................................................................. 24
4.9 Procedimentos biológicos e análises ....................................................................................... 25
4.10 Análise estatística .................................................................................................................. 25
5 ARTIGOS PRODUZIDOS ............................................................................................................... 27
5.1 Zinc pharmacokinetics parameters in the detection of body zinc state in children ................. 27
5.2 Reference ranges for the concentration of zinc in serum in Brazilian children ....................... 29
6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES ............................................................................ 31
REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 34
APÊNDICES ...................................................................................................................................... 37
Apêndice 1 – Different Methods of clearance for diagnosing zinc deficiency in prepubertal
children. .......................................................................................................................................... 38
Apêndice 2 – Zinc supplementations on growth and hormonal secretion of GH, IGF1 and
IGFBP3 in prepubertal children. ..................................................................................................... 39
Apêndice 3 – Cognitive function of elementary school children improved by oral zinc
suplementation. .............................................................................................................................. 40
Apêndice 4 – Association of PPAR-Gamma2 Polymorphism on Lipid Profile in Berardinelli-Seip
Syndrom. ........................................................................................................................................ 41
xiii
xiii
Apêndice 5 – Positive effects of zinc supplementation on growth, GH, IGF1, and IGFBP3 in
eutrophic children. .......................................................................................................................... 42
Apêndice 6 – Kinetics of zinc status and zinc deficiency in Berardinelli-Seip syndrome. ............ 43
Apêndice 7 – Influence of basal energy expenditure and body composition on bone mineral
density in postmenopausal women. ............................................................................................... 44
Apêndice 8 – Oral zinc supplementation may improve cognitive function in schoolchildren ....... 45
14
1 INTRODUÇÃO
O zinco é um micronutriente essencial à vida humana por atuar na síntese e
degradação de DNA e RNA, expressão gênica, proliferação e diferenciação celular,
apoptose, estabilização de membranas e componentes celulares, sistema imunológico e
hormonal, crescimento e desenvolvimento, entre outros1,2. Além disso, é constituinte
estrutural, regulador e catalítico de várias enzimas e proteínas. Possui ação antioxidante,
protegendo estruturas biológicas da ação de radicais livres3. Considerando sua
multiplicidade de funções vitais, sua deficiência pode causar sérios problemas à saúde
humana4.
No organismo humano, o zinco sofre um forte controle homeostático envolvendo
processos de absorção e excreção. Sua taxa de excreção renal é relativamente baixa.
Como está amplamente ligado à proteínas plasmáticas, sua passagem através dos
glomérulos é ínfima5. Desse modo, o zinco urinário é oriundo quase exclusivamente da
porção ultra filtrável do zinco plasmático, e aproximadamente 95% a 99% da amostra
filtrável é reabsorvida pelos túbulos distais6-8 (Fig. 1).
Fig. 1 Ilustração da filtração glomerular, secreção, reabsorção,
e excreção renal de zinco em criança, sob condição fisiológica.
Fatores como a taxa de produção de urina, excreção de creatinina e
ingestão/absorção de zinco, influenciam a quantidade desse mineral que é excretada na
urina. Estima-se que o zinco excretado na urina de pessoas saudáveis seja na ordem de
300 a 600 µg/24h9. Entretanto, pessoas adultas privadas de zinco (0,28 mg/dia) diminuem
15
esses valores para 140 µg/24h10. Nesse sentido, percebe-se que o estado corporal de
zinco influencia proporcionalmente sua excreção. Esse fato é comprovado pela influência
da administração venosa de zinco sobre a excreção urinária deste mineral. A administração
venosa de zinco aumenta tanto a excreção urinária como o clearance de zinco. Esse fato
foi observado em pessoas saudáveis11-13, e também, em crianças com diabetes mellitus
tipo 113,14.
Em populações mundiais, a deficiência primária grave de zinco não é comum,
embora, a deficiência leve desse mineral seja bastante prevalente15,16. A deficiência leve de
zinco ainda não possui um método diagnóstico fidedigno. Alterações fisiológicas ou
teciduais não são evidentes com o declínio da concentração sérica de zinco.
Apesar das limitações, o zinco sérico é o marcador bioquímico mais utilizado para
avaliar o estado corporal de zinco, principalmente em nível populacional17,18. A esse
respeito, há propostas do uso da cinética de zinco14,19,20 e marcadores moleculares18.
Existem relatos da relação entre os testes de clearance urinário e a concentração
plasmática de zinco21. Outros estudos realizados posteriormente comparando crianças com
baixa estatura versus controles, também demonstraram correlação entre esses dados19,22.
O clearance de uma determinada substância é o volume de plasma completamente
removido da substância por unidade de tempo, e é um dos principais fatores que
influenciam o perfil farmacocinético idade-dependente23. Existem diversas fórmulas
matemáticas para quantificar o clearance corporal de zinco, e podemos citar a descrita por
Nakamura et al. (1993) que considera o produto entre a constante de eliminação do zinco e
o seu volume de distribuição, e a utilizada em um programa computacional que considera a
área sob a curva dos valores de zinco determinados em momentos sequenciados24. O
clearance de zinco também pode ser determinado considerando apenas a passagem renal,
e vem sendo calculado considerando o zinco sérico e o zinco urinário em um período de
tempo conhecido25.
O ajuste na excreção renal de zinco é um mecanismo homeostático em resposta à
modificações significativas dos níveis sanguíneos de zinco, oriundo da ingestão oral ou da
administração venosa. Embora venha sendo bastante estudada, a regulação da excreção
urinária de zinco ainda não é completamente entendida. É possível que esse mecanismo
seja um ajuste do transporte tubular renal26. Por exemplo, foi relatado que aumentos na
excreção urinária de zinco, no clearance de zinco, e na relação de clearance de
16
zinco/clearance de creatinina indicam hiperzincúria em pacientes diabéticos, embora os
valores da reabsorção tubular não tenham exibido variações biológicas significativas entre
doentes diabéticos e controles8,12.
Como premissa encontramos na literatura relatos de que o clearance de zinco pode
detectar a deficiência marginal de zinco mediante o emprego de diferentes fórmulas
matemáticas, além disso existia a necessidade de estabelecer valores de referência de
zinco sérico basal. Neste contexto, realizamos este estudo com a finalidade de investigar
qual das fórmulas seria a mais efetiva em detectar alterações no estado corporal de zinco e
estabelecer valores de referência para a população estudada.
17
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar as concentrações de zinco sérico e a relação com os parâmetros
farmacocinéticos na determinação do estado corporal de zinco em crianças eutróficas e
saudáveis, submetidas à suplementação de zinco.
2.2 Objetivos específicos
Estabelecer os valores de referência de zinco sérico basal para a população
estudada;
Avaliar os parâmetros farmacocinéticos relacionados ao estado corporal de zinco;
Relacionar as concentrações séricas de zinco com os parâmetros
farmacocinéticos;
Indicar o melhor método farmacocinético para aplicação na investigação clínica.
18
3 JUSTIFICATIVA
No momento, não há um indicador confiável, rápido e específico do estado corporal
de zinco, o que dificulta o diagnóstico de sua deficiência leve. Considerando o uso
difundido do zinco sérico e a existência de diferentes métodos cinéticos que podem ser
aplicados para a determinação do clearance de zinco, observou-se a necessidade de
determinar um valor de referência para a população estudada e comparar os métodos
cinéticos com o objetivo de verificar se eles estariam ou não em consonância entre eles, e
ainda qual deles seria mais sensível na detecção de pequenas mudanças no estado
corporal de zinco.
19
4 MÉTODOS
4.1 Sujeitos
Foram selecionadas por amostragem não probabilística de conveniência 215
crianças de ambos os sexos, com idades entre 6 a 9 anos, em três escolas municipais da
Cidade de Natal – Brasil, entre os anos 2008 e 2011. Após aplicação dos critérios de
inclusão/exclusão e tentativas de contatos com os pais ou responsáveis, foram avaliadas
129 crianças para determinação do zinco sérico basal. As 45 crianças selecionadas no
ano de 2011, iniciaram a etapa de administração venosa de zinco no estudo de avaliação
dos parâmetros farmacocinéticos, e após 5 desistências o estudo foi finalizado com 40
crianças.
O consentimento escrito foi obtido de todos os pais ou responsáveis, além da
concordância da criança em participar do estudo. Os protocolos (nº 005/06 e 542/11)
foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre
Lopes (CEP-HUOL) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Brasil.
4.2 Critérios de inclusão e exclusão
Foram incluídas no estudo crianças aparentemente saudáveis (sem doenças agudas
ou crônicas), entre 6 e 9 anos de ambos os sexos e que após avaliação médica foram
categorizadas no estágio I de Tanner27,28. Quanto ao estado nutricional, foram incluídas
crianças classificadas como eutróficas para o índice IMC/idade. Foram excluídas aquelas
que tiveram pubarca precoce, telarca ou menarca, doenças infecciosas ou inflamatórias
agudas, submetidos à cirurgia, utilizando qualquer suplemento vitamínico e mineral ou
que desistiram de participar do estudo.
4.3 Desenho experimental
Foi determinado o zinco sérico basal de 129 crianças e destas, 45 foram submetidas
à administração venosa de zinco em dois momentos, antes e após a suplementação oral
com 5 mg do elemento zinco por dia. A suplementação oral teve duração de três meses
(Figura 2). A idade das crianças foi registrada e a altura e peso foram aferidos para
20
avaliação antropométrica. Foram determinadas as concentrações bioquímicas de zinco
sérico, creatinina sérica, zinco urinário e de creatinina urinária.
Fig. 2. Desenho experimental da suplementação oral de zinco.
4.4 Avaliação antropométrica
O peso corporal (kg) e a altura (cm) foram aferidos utilizando-se uma balança
eletrônica (Balmak, BK50F, São Paulo, Brasil) e um estadiômetro (Estadiômetro
Professional Sanny, American Medical do Brasil, São Paulo, Brasil), respectivamente.
Para aferição do peso, a criança permaneceu em pé sobre a balança vestindo roupas
leves e sem calçados. Para aferição da altura, a criança permaneceu em pé, sem
calçados, com os calcanhares juntos e o corpo o mais reto possível. Os calcanhares,
glúteo, ombros e cabeça tocaram a superfície vertical do equipamento de medida. Os
procedimentos foram realizados pela mesma nutricionista.
4.5 Suplementação oral de zinco
As crianças foram suplementadas 5 mg de Zn/dia, durante 3 meses, sob a forma de
solução de sulfato de zinco heptahidratado (ZnSO4.7H2O, Merck, Darmstadt, Alemanha).
Os xaropes foram preparados no Laboratório de Farmacotécnica do Departamento de
Farmácia da UFRN. Cada gota do xarope continha 1 mg de zinco elementar. Cinco gotas
de xarope foram adicionadas a um alimento líquido servido todos os dias, no desjejum. A
escolha deste alimento ficou à critério dos pais e crianças a fim de evitar interferências
nas opções individuais e garantir maior adesão dos participantes. A ingestão foi
monitorada pelo mesmo observador, por telefone, a cada duas semanas.
21
A dose suplementada (5 mg de Zn/dia) ultrapassou em 1 mg a EAR (4 mg de Zn/dia)
para a faixa etária entre 6 e 8 anos, mas dentro dos limites da RDA (5 mg de Zn/dia) para
esta faixa. Para as crianças com 9 anos completos, a dose ficou aquém da EAR e da
RDA (7 e 8 mg de Zn/dia, respectivamente). Para todas as crianças o somatório entre
zinco suplementado e o zinco proveniente da alimentação29 (dados publicados
anteriormente) não ultrapassou a UL (12 e 23 mg de Zn/dia, para crianças entre 6 e 8
anos e crianças com 9 anos, respectivamente)30. Portanto, a dose escolhida foi
considerada segura e fisiológica.
4.6 Administração venosa de zinco
O teste foi iniciado às 7 da manhã, após um jejum de 12 h, e concluído às 10 horas.
Cada criança foi mantida em decúbito dorsal durante o procedimento. Uma veia
antecubital do antebraço foi puncionada e foi infundida solução salina (livre de zinco)
durante todo o ensaio. Uma dose de 0,06537 mg de Zn/kg de peso corporal (1 μmol
ZnSO4.7H2O) foi injetado no tempo 0 min, em bolus. Cada ampola continha 5 mL = 40
mol ZnSO4.7H2O. Essas ampolas foram preparadas pela Injectcenter (Manipulação de
Injetáveis, Ribeirão Preto, Brasil). As amostras de sangue foram colhidas aos tempos 0
(antes da administração de zinco), 30, 60, 90, e 120 minutos (após a administração de
zinco), como mostrado na Figura 3. Seringas de plástico polipropileno foram utilizadas em
todas as coletas de sangue.
4.7 Abordagem renal
As crianças esvaziaram suas bexigas antes das 7 horas, e a urina foi descartada.
Quatro mililitros de água ultrapura/kg de peso corporal (Milli-Q Plus, Millipore, Billerica,
MA, EUA) foi ingerida no meio de teste, para facilitar a coleta posterior de urina (Figura 2).
As amostras de urina foram colhidas no final do ensaio para mensuração das
concentrações de zinco e creatinina.
22
Fig. 3. Esquema da administração intravenosa de zinco para
avaliar os parâmetros de clearance de zinco em crianças com
idade entre 6 e 9 anos.
4.8 Aplicação de fórmulas
Os métodos cinéticos de clearance de zinco foram:
1) CZn-Fórmula A. Clearance do zinco corporal total baseada na área trapezoidal sob a
curva (AUC), considerando aplicação i.v. Usamos as fases de eliminação e de
distribuição24. Esta é a fórmula geral usada para todos os modelos farmacocinéticos de
compartimentos:
Onde,
CZn = Clearance de zinco,
F = fração da dose absorvida, para doses i.v. F=1.
D = quantidade da dose,
CZn (área) = FD / AUC (∞)
23
AUC (∞) = AUC total calculado a partir da combinação de AUC(0-t), com um valor
extrapolado. AUC (∞) = AUC(0-t) + Cn/ƶ, Cn, Cn representa o intercepto Y e ƶ a
constante da taxa de eliminação.
2) CZn-Fórmula B. Clearance de zinco corporal total. Fórmula usada para modelos
farmacocinéticos de um compartimento, calculada a partir da seguinte equação31:
Onde,
Kel = constante de eliminação do zinco sérico,
Vd = volume de distribuição.
Kel e Vd foram calculados da seguinte forma:
Kel = 0.693/ T1/2
Vd = dose i.v./ ΔCo,
Onde, ΔCo = diferença entre Cp e Co. Cp = concentração teórica de zinco imediatamente
depois da injeção de zinco, calculado a partir da concentração sérica versus período de
tempo. Co = concentração basal de zinco. T1/2 = tempo de meia-vida do zinco sérico
calculado diretamente a partir da concentração de zinco sérico versus período de tempo.
Dose i.v. = quantidade de zinco administrada.
3) CZn-Fórmula C. Clearance renal de zinco, determinado a partir da equação25:
Onde,
CZn = clearance renal de zinco
UZn = zinco urinário (μg/mL)
CZn = Kel x Vd
CZn = [UZn x V]/ SZn
24
V = fluxo de urina (mL/min)
SZn = zinco sérico (μg/mL)
Também foram determinados o clearance renal de creatinina e a reabsorção tubular
de zinco, calculadas como segue25:
Onde,
CCr = clearance de creatinina
Ucr = creatinina urinária (mg/mL)
V = fluxo de urina (mL/min)
SCr = creatinina sérica (mg%)
Onde,
TRZn = reabsorção tubular de zinco
GFR = taxa de filtração glomerular (mL/min)
SZn = zinco sérico
UZn = zinco urinário (μg/mL)
V = fluxo de zinco (mL/min)
m2 = área da superfície corporal
4.8 Materiais biológicos
As amostras de sangue para análises de zinco foram coletados em tubos Vacutainer
Becton Dinckson (Trace Element, Soro, BD Franklin Lakes, NJ, EUA), e as de sangue
para análises bioquímicas foram coletados em tubos Vacuette Z com soro ativador
coágulo (Greiner Bio-One, Monroe, NC, EUA). As amostras de zinco foram armazenados
CCr = [Ucr x V]/ SCr
TRZn = [GFR x SZn] – [UZn x V] 1.73 m²
25
em uma estufa de aço inoxidável adequada para metais (Orion, Fanem, São Paulo, SP,
Brasil). As amostras de urina foram colhidas em provetas livres de metais e cubas de
plástico (Nalgon, Itupeva, SP, Brasil). As soluções salinas (livres de metais) foram
adquiridas de Gaspar Viana S/A (Fortaleza, CE, Brasil) e seringas de polipropileno de
Becton Dinckson (Hercules, CA, EUA). Ponteiras de plástico e tubos (livres de metal)
foram obtidos de BioRad Laboratories (Hercules, CA, EUA).
4.9 Procedimentos biológicos e análises
As amostras de sangue foram colhidas por punção de uma veia do antebraço sem
uso de torniquete. As amostras de zinco foram armazenadas à temperatura ambiente em
uma estufa para metais durante 2 horas e em seguida foram centrifugadas a 2500 rpm
por 6 minutos a fim de se obter soro. Amostras hemolisadas foram descartadas, uma vez
que os eritrócitos são ricos em zinco32. As amostras de soro e urina foram armazenadas
a -20 ºC, para posterior mensuração.
O zinco sérico e urinário foi medido por espectrofotometria de absorção atômica
(SpectrAA-200, Varian, Victoria, Austrália). O aparelho foi previamente calibrado, após
estabelecimento de uma curva de linearidade (r²>0,999) a partir de concentrações
crescentes (0–1,0 mg/L em ppm) solução-padrão versus absorbância. A solução-padrão
de zinco (1000 mg/mL) foi obtida por diluição de Titrisol Zinc Standard (Merck, Darmstadt,
Germany) em água ultra pura. A sensibilidade foi de 0,01 μg/mL, o coeficiente de variação
intra-ensaio foi de 2,37%, e os valores de referência foram 70-110 μg/dL16. Creatinina
sérica e urinária foi determinada, usando métodos padrão do laboratório clínico e as
análises realizadas por meio do analisador semiautomático RA-50 (Bayer Diagnostics,
Dublin, Irlanda). Todos os procedimentos relacionados com a manipulação de amostras
de zinco foram realizados de acordo com normas internacionais17.
4.10 Análise estatística
A normalidade dos dados foi avaliada utilizando-se os testes Kolmogorov-Smirnov
para análise de zinco sérico basal e Shapiro-Wilk para análises farmacocinéticas.
Utilizou-se o teste t de Student para dados pareados, e a regressão linear e correlação
para analisar a relação entre parâmetros antes e após a suplementação. Ademais,
26
aplicou-se ANOVA para medidas repetidas para comparar as medidas dos três
clearances obtidos de cada amostra. O GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software. Inc.,
San Diego, Estados Unidos) foi usado e p < 0,05 aceito como significante.
27
5 ARTIGOS PRODUZIDOS
5.1 Zinc pharmacokinetics parameters in the detection of body zinc state in children
O artigo Zinc pharmacokinetics parameters in the detection of body zinc state in children
foi enviado para publicação no periódico European Journal of Clinical Nutrition que possui
fator de impacto 2.462 e Qualis B1 da CAPES para área Medicina II.
28
29
5.2 Reference ranges for the concentration of zinc in serum in Brazilian children
O artigo Reference ranges for the concentration of zinc in serum in Brazilian children está
sendo finalizado e será enviado para publicação no periódico BMC Pediatrics que possui
fator de impacto 1,89 e Qualis B1 da CAPES para área Medicina II.
30
Sancha Helena de Lima Vale, Camila Xavier Alves, Karina Marques Vermeulen, Márcia
Marília Gomes Dantas, Lúcia Dantas Leite, José Brandão-Neto
Abstract
Background: Zinc is considered an essential micronutrient for the development and
maintenance of life, and its deficiency can cause many problems in humans. This
micronutrient has diverse biological functions in enzymatic catalysis, redox regulation,
cellular signal transduction, the immune system, and neurons. The global prevalence of
zinc deficiency is variable and depends on the feeding and nutrition of the population. For
this reason, it is important that different countries and regions establish its own reference
values for a healthy population. Objectives: To determine the reference values for basal
serum zinc concentration in apparently health Brazilian children aged 6–9 years, both
sexes, from municipal schools in Natal between 2008 and 2012. Design and methods:
Blood samples were collected in fasting and basal serum zinc concentration was
measured by flame atomic absorption spectrometry in 129 children. Reference values for
serum zinc were determined according to the International Federation of Clinical
Chemistry guidelines. The normality of data was assessed using the Kolmogorov–Smirnov
test and reference intervals were based on the central 95% of the data considering 95%
confidence intervals. Results: The distribution of serum zinc concentrations was normal in
both sexes, and CI (95%) reference values for serum zinc concentrations were 0.94–1.00
and 0.91–0.98 μg/mL in girls and boys, respectively. These concentrations were not
significant different between the sexes (p=0.884). Conclusions: This study provides
pediatric reference values of the order of 0.91-1.0 μg/mL, which can guide the diagnosis
and follow up of children with zinc deficiency.
Keywords: Serum zinc; reference range; children.
31
6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES
O anteprojeto inicial tinha como finalidade a comparação entre três métodos
cinéticos de medida do zinco quanto à sensibilidade analítica, precisão, acurácia e
mensuração. A metodologia não pôde ser realizada tal como planejado, pois ao iniciar
estudos mais aprofundados sobre o tema, surgiu a necessidade de relacionar os
parâmetros cinéticos aos valores de zinco sérico. Esta nova situação se mostrou
desafiadora à medida que houve a necessidade de estabelecer valores de referência de
zinco sérico para a população de crianças que vem sendo estudada nos últimos anos pelo
nosso grupo.
Esta foi a primeira vez que um novo desenho metodológico, com a participação multi
e interdisciplinar de nutricionistas, médicos e farmacêuticos, foi aplicado para observar o
estado de zinco corpóreo, avaliando o zinco sérico e utilizando métodos de depuração de
zinco em crianças. A este respeito, estes resultados proporcionaram novas informações
para compreender os marcadores de zinco bem como a cinética deste micronutriente, e
sua publicação, certamente, será muito importante para a comunidade científica.
Ao ingressar no Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, tinha como
meta não só a obtenção do título de Doutor, mas o fortalecimento e divulgação científica
das pesquisas realizadas pelo nosso grupo. Com este intento, tivemos os seguintes
trabalhos publicados em congressos científicos:
Vale SHL; Dantas MMG, Alves CX, Brito NJN, Leite LD, Brandão-Neto J. Different
methods of clearance for diagnosing zinc deficiency in prepubertal children. In:
International Conference on Growth and Nutrition, 2012, Paris. International
Conference on Growth and Nutrition, 2012. (Apêndice 1)
Alves CX, Vale SHL, Brito NJN, Dantas MMG, Maia AA, Leite LD, Brandão-Neto
J. Zinc supplementations on growth and hormonal secretion of GH, IGF1 and
IGFBP3 in prepubertal children. In: International Conference on Growth and
Nutrition, 2012, Paris. International Conference on Growth and Nutrition, 2012.
(Apêndice 2)
Moura JE, Dantas MMG, Alves CX, Vale SHL, Araújo DM, Leite LD, Brandão-Neto
J. Cognitive function of elementary school children improved by oral zinc
supplementation. In: International Conference on Growth and Nutrition, 2012,
Paris. International Conference on Growth and Nutrition, 2012. (Apêndice 3)
32
Baracho MFP, Leite LD, Vale SHL, Aalves CX, Santos MGN, Farjado CM, Hirata
MH, Brandão-Neto J. Association of PPAR-gamma2 polymorphism on lipid profile
in Berardinelli-Seip syndrome. In: 6th Congress of the International Society of
Nutrigenetics / Nutrigenomics, 2012, São Paulo. 6th Congress of the International
Society of Nutrigenetics / Nutrigenomics, 2012. (Apêndice 4)
Também foram publicados e submetido para publicação artigos em jornais de
circulação internacional categorizadas no Qualis B da CAPES, como:
Alves CX, Vale SHL, Dantas MMG, Maia AA, França MC, Marchini JS, Leite LD,
Brandão-Neto J. Positive effects of zinc supplementation on growth, GH, IGF1,
and IGFBP3 in eutrophic children. Journal of Pediatric Endocrinology &
Metabolism, v. 9-10, p. 813-1049, 2012. (Apêndice 5);
Santos MGN, Baracho MFP, Vale SHL, Leite LD, Rocha EDM, Brito NJN, França
MC, Almeida MG, Chiquetti SC, Marchini JS, Brandão-Neto, José. Kinetics of zinc
status and zinc deficiency in Berardinelli-Seip syndrome. Journal of Trace
Elements in Medicine and Biology, v. 26, p. 7-12, 2012. (Apêndice 6);
Quirino MAB, Modesto-Filho J, Vale SHL, Alves CX, Leite LD, Brandão-Neto,
José. Influence of basal energy expenditure and body composition on bone
mineral density in postmenopausal women. International Journal of General
Medicine, p. 909-915, 2012. (Apêndice 7);
Moura JE, Moura ENO, Alves CX, Vale SHLV, Dantas MMG, Silva AA, Almeida
MG, Leite LD, Brandão-Neto J. Oral zinc supplementation may improve cognitive
function in schoolchildren. Biological Trace Elements Research. (submetido para
publicação – Apêndice 8).
Foi recém-finalizada a etapa experimental da pesquisa desenvolvida por nosso
grupo “Efeito do zinco sobre o crescimento e marcadores ósseos de crianças eutróficas”,
com abordagem de composição corporal, avaliação hormonal e expressão de proteínas
relacionadas ao metabolismo ósseo, que em breve, após avaliação dos resultados, será
elaborado o texto para divulgação científica.
Adicionalmente, iniciamos a etapa experimental de uma outra pesquisa intitulada
“Dematina eritrocitária como biomarcador do estado de zinco corporal em pacientes
diabéticos”, da qual também esperamos resultados que possam contribuir para a
evolução dos conhecimentos sobre o zinco corporal.
33
Além da minha inserção no grupo de pesquisa como aluna, durante o primeiro
semestre do doutorado fui aprovada no concurso para professora substituta na área de
Nutrição do Departamento de Nutrição da UFRN assumindo no semestre letivo 2011.2 os
componentes curriculares: Nutrição Aplicada à Saúde (para o curso de Medicina),
Nutrição Aplicada à Educação Física (para o curso de Educação Física) e Processos e
Interações Nutricionais (para o curso de Enfermagem). Experiências que se somaram à
minha atuação anterior ao ingresso no doutorado como professora substituta, da área de
Nutrição Clínica nos componentes curriculares: Dietoterapia e Estágio Supervisionado em
Nutrição Clínica (nos períodos letivos 2008.1 a 2010.1) no Departamento e Instituição
supracitados, as quais me propiciaram coorientações de trabalhos de conclusão de curso
e participação em bancas de defesa.
Tive ainda a oportunidade de ser bolsista do Programa CAPES/REUNI, ação que me
proporcionou a participação do curso de Formação para a Docência e três semestres de
Estágio à Docência, sendo dois no componente curricular Genética para a Nutrição e
outro em Dietoterapia II, ambos oferecidos pelo curso de graduação em Nutrição da
UFRN.
Em relação à docência, esta me permitiu a participação como professora no Curso
de Especialização em Nutrição Clínica, oferecido pela Universidade Potiguar, resultando
na orientação de dois trabalhos de conclusão nesta área, e ainda a participação como
palestrante em cursos e congressos regionais na área de Nutrição.
Atuando como Nutricionista voluntária do Ambulatório Multidisciplinar de Esclerose
Lateral Amiotrófica do Hospital Universitário Onofre Lopes (ELA/HUOL), pude me
envolver no projeto de extensão: “Ambulatório multidisciplinar para atendimento de
portadores de DNM/ELA” que tem a participação de professores e alunos da UFRN, além
de profissionais voluntários de várias outras áreas da saúde, visando dar suporte aos
pacientes com esta doença.
A multidisciplinaridade tem sido uma experiência enriquecedora e prazerosa nestes
anos à medida que se nos descortinavam novos saberes e enfrentamentos de problemas
de saúde e métodos de pesquisa, deixando em mim o desejo de, após a conclusão desta
etapa de formação, dar continuidade aos estudos ora iniciados, aprofundando a temática
“micronutrientes e nutrigenômica”, vislumbrando, assim, na carreira acadêmica, a
possibilidade de desenvolver pesquisa, ensino e extensão.
34
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37
APÊNDICES
38
Apêndice 1 – Different Methods of clearance for diagnosing zinc deficiency in
prepubertal children.
39
Apêndice 2 – Zinc supplementations on growth and hormonal secretion of GH, IGF1
and IGFBP3 in prepubertal children.
40
Apêndice 3 – Cognitive function of elementary school children improved by oral
zinc suplementation.
41
Apêndice 4 – Association of PPAR-Gamma2 Polymorphism on Lipid Profile in
Berardinelli-Seip Syndrom.
42
Apêndice 5 – Positive effects of zinc supplementation on growth, GH, IGF1, and
IGFBP3 in eutrophic children.
43
Apêndice 6 – Kinetics of zinc status and zinc deficiency in Berardinelli-Seip
syndrome.
44
Apêndice 7 – Influence of basal energy expenditure and body composition on bone
mineral density in postmenopausal women.
45
Apêndice 8 – Oral zinc supplementation may improve cognitive function in
schoolchildren
