MIRIAM FONTES ARAUJO SILVEIRA

MIRIAM FONTES ARAUJO SILVEIRA

FILME ANTIMICROBIANO INCORPORADO COM ÁCIDO SÓRBICO NA

CONSERVAÇÃO DE MASSA DE PASTEL

VIÇOSA MINAS GERAIS – BRASIL

2005

Tese apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, para obtenção do título de “Doctor Scientiae”

MIRIAM FONTES ARAUJO SILVEIRA

FILME ANTIMICROBIANO INCORPORADO COM ÁCIDO SÓRBICO NA


APROVADA: 25 de janeiro de 2005.

Prof. Nélio José de Andrade Prof. Afonso Mota Ramos (Conselheiro) (Conselheiro) Prof. Renato Cruz Dr. Robson Maia Geraldine Profa. Nilda de Fátima Ferreira Soares (Orientadora)

Tese apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, para obtenção do título de “Doctor Scientiae”

Aos meus pais, Geraldo e Dalva.

Aos meus filhos, Rafael e Juliane.

Ao meu esposo, Julio.

Aos meus irmãos, Eduardo, Roberto e Cristina.

AGRADECIMENTO

A DEUS, pois sem ELE nada é possível.

À minha família, pelo amor, pela compreensão, pelo apoio e pelo incentivo em todos

os momentos.

À Universidade Federal de Goiás, em especial aos colegas da Escola de Agronomia e

Engenharia de Alimentos, pelo apoio.

À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Tecnologia de Alimentos,

pela oportunidade de realizar o curso.

À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

concessão da bolsa de estudo.

À Professora Nilda de Fátima Ferreira Soares, pela orientação, pela dedicação, pelo

apoio constante e pela grande amizade durante todo o curso.

Aos Professores Nélio José de Andrade e Afonso Mota Ramos, pelo aconselhamento e

pela atenção.

Ao Professor Renato Cruz, pelas sugestões e pela consideração.

Ao Dr. Robson Maia Geraldine, pela colaboração, pelo incentivo e pela amizade.

Aos meus amigos do laboratório de embalagem, pela amizade, pela união e pela

alegria, tornando o trabalho mais suave.

Aos colegas de pós-graduação, pela saudável convivência.

Aos professores e funcionários do Departamento de Tecnologia de Alimentos, pela

dedicação e pela amizade.

A todos que, de algum modo, contribuíram para o sucesso deste trabalho.

BIOGRAFIA

MIRIAM FONTES ARAUJO SILVEIRA, filha de Geraldo de Carvalho Araujo e

Dalva Fontes Araujo, nasceu em Viçosa, Minas Gerais, em 08 de setembro de 1958.

Graduou-se em Engenharia de Alimentos em agosto de 1980, pela Universidade

Federal de Viçosa.

Concluiu o curso de Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos na Universidade

Federal de Viçosa, em dezembro de 1984.

Desde abril de 1994 exerce o cargo de professora na Escola de Agronomia e

Engenharia de Alimentos da Universidade Federal de Goiás.

Em março de 2000, iniciou o curso de Doutorado em Ciência e Tecnologia de

Alimentos na Universidade Federal de Viçosa.

CONTEÚDO

Página

RESUMO........................................................................................................... vii

ABSTRACT....................................................................................................... ix

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................. 1

1.1. Segurança alimentar.............................................................................. 1

1.2. Conservação.......................................................................................... 3

1.3. Embalagens ativas.................................................................................. 6

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 11

CAPÍTULO 1:

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE FILME DE BASE

CELULÓSICA INCORPORADOS COM ÁCIDO SÓRBICO....................

16

RESUMO........................................................................................................... 16

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................. 17

2. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 18

2.1. Produção dos filmes antimicrobianos..................................................... 18

2.2. Análise das propriedades mecânicas dos filmes................................... 19

2.3. Experimentos de difusão........................................................................ 19

2.4. Análise estatística.................................................................................. 20

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................... 20

4. CONCLUSÕES............................................................................................. 27

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 27

Página

CAPÍTULO 2:

FILMES ANTIMICROBIANOS INCORPORADOS COM ÁCIDO SÓRBICO

NA CONSERVAÇÃO DE MASSA DE PASTEL..............................

31

RESUMO........................................................................................................... 31

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................. 32


2.1. Produção dos filmes antimicrobianos.................................................... 34

2.2. Preparação da massa de paste............................................................. 34

2.3. Montagem do experimento..................................................................... 35

2.4. Análises microbiológicas........................................................................ 35

2.5. Determinação da atividade de água e do teor de umidade da

massa....................................................................................................

36


3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 36

4. CONCLUSÕES............................................................................................. 40

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 41

CAPÍTULO 3:

EFICIÊNCIA ANTIMICROBIANA E MIGRAÇÃO DO ÁCIDO SÓRBICO DO

FILME ATIVO PARA A MASSA DE PASTEL....................................................

44

RESUMO.......................................................................................................... 44

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................. 45


2.1. Produção dos filmes antimicrobianos..................................................... 46

2.2. Preparação da massa de pastel............................................................ 46

2.3. Montagem do experimento..................................................................... 47

2.4. Análises microbiológicas........................................................................ 47

2.5. Extração e quantificação do ácido sórbico da massa............................ 47

2.6. Experimentos de difusão........................................................................ 48


3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 48

4. CONCLUSÕES.............................................................................................. 53

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 53

CONCLUSÃO GERAL...................................................................................... 56

RESUMO

SILVEIRA, Miriam Fontes Araujo, D.S., Universidade Federal de Viçosa, janeiro de 2005. Filme antimicrobiano incorporado com ácido sórbico na conservação de massa

de pastel. Orientadora: Nilda de Fátima Ferreira Soares. Conselheiros: Nélio José de Andrade e Afonso Mota Ramos.

A produção de filmes ativos antimicrobianos baseia-se na incorporação de

conservantes alimentares na estrutura do polímero. Esses filmes objetivam reduzir, inibir ou

retardar o crescimento da microbiota presente principalmente na superfície do alimento

embalado, onde a maior parte das reações de deterioração ocorre. Assim, este trabalho teve

como objetivos desenvolver filmes de base celulósica, por solubilização em solvente, com

efeito antimicrobiano, pela incorporação com ácido sórbico e avaliar suas propriedades

mecânicas e sua eficiência antimicrobiana, bem como avaliar a migração do antimicrobiano

da estrutura polimérica em sistema simulante do alimento e em massa de pastel. As

propriedades de resistência ao estouro e módulo de elasticidade dos filmes antimicrobianos

produzidos (25, 70 e 100µm com 3, 6 e 9% de ácido sórbico) aumentaram significativamente

(p<0,05) com o aumento da espessura do filme. A concentração de ácido sórbico apresentou

efeito significativo na propriedade de estouro, mas não afetou significativamente (p=0,05) o

comportamento da massa fracional do ácido liberada para o meio aquoso. Os expoentes

difusionais (n) alcançaram valores de 0,63 a 0,71, sugerindo um mecanismo de transporte

não-Fickiano. Os coeficientes de difusão do ácido sórbico, para todos os filmes, apresentaram

valores na ordem de 10-13m2.s-1. Independente da concentração de ácido sórbico, os filmes de

menor espessura apresentaram índices de migração maiores que os demais filmes.

Posteriormente, filmes de 25 e 70µm de espessura com 0, 1, 2, 3, 4, 5 e 6% de ácido sórbico

foram produzidos e intercalados em massa de pastel sem conservante para avaliar sua

eficiência antimicrobiana. Massas controle, contendo sorbato de potássio, foram intercaladas

com filmes de polietileno de baixa densidade (PEBD). Após 40 dias de estocagem a 8±1°C,

as massas com filmes de 70µm/3, 4, 5 e 6% de ácido sórbico apresentaram, estatisticamente,

crescimento microbiano menor ou igual ao da massa controle. Nas massas com filmes de

25µm/6% de ácido sórbico, a contagem de psicrotróficos foi inferior à da massa controle,

porém as contagens de mesófilos aeróbios e Staphyloccoccus spp. foram superiores em 1 ciclo

log. A atividade de água e o teor de umidade das massas não apresentaram diferenças entre

os tratamentos. Finalizando o trabalho, filmes de 25 e 70µm de espessura com 7 e 3% de

ácido sórbico, respectivamente, foram avaliados quanto à migração do antimicrobiano para a

massa de pastel e análises microbiológicas foram realizadas. Após 40 dias de estocagem, as

massas intercaladas com filmes de 25µm/7% de ácido sórbico apresentaram redução de 2

ciclos log na contagem de mesófilos aeróbios, porém, as contagens de psicrotróficos e

Staphylococcus spp. não apresentaram diferenças significativas (p=0,05), quando

comparadas com o tempo zero. Nas massas intercaladas com filmes de 70µm/3% de ácido

sórbico, observaram-se reduções nas contagens de mesófilos aeróbios e psicrotróficos em 2 e

1,5 ciclos log, respectivamente. Nas massas controle as contagens de mesófilos, psicrotróficos

e Staphylococcus spp. aumentaram em 1,5, 1 e 2 ciclos log, respectivamente. Os coeficientes

de difusão do ácido sórbico nos filmes a 8±1°C, quando intercalados em massa de pastel,

apresentaram valores na ordem de 10-18m2.s-1. Os índices de migração do ácido sórbico

nos filmes não diferiram entre si (p=0,05). A liberação máxima do conservante para a massa

de pastel do filme de 25µm/7% de ácido sórbico ocorreu no 20o dia de estocagem do produto,

atingindo apenas 0,07% e no filme de 70µm/3% de ácido sórbico no 9o dia de estocagem,

liberando 0,09%.

ABSTRACT

SILVEIRA, Miriam Fontes Araujo, D.S., Universidade Federal de Viçosa, January of 2005. Antimicrobial film of incorporated with sorbic acid on turnover dough conservation. Adviser: Nilda de Fátima Ferreira Soares. Committee members: Nélio José de Andrade and Afonso Mota Ramos.

Antimicrobial film production is based on incorporation of food additives in the

polymer. These films aim to reduce, inhibit or diminish the microorganism growth, mainly on

the packed food surface, where most of the deteriorative reactions occur. Therefore, the

objectives of this work were to develop cellulosic films using cast process, added with sorbic

acid that gives the antimicrobial characteristic and to measure its mechanical properties, as

well as to evaluate the sorbic acid migration from the polymer to the food simulant solution

and to the turnover dough. The bursting strength and Young modulus values of the film (25,

70 and 100µm added with 3, 6 and 9% of sorbic acid) increased significantly (p<0.05) as the

thickness increased. Sorbic acid concentration in the film showed significant effect on the

fractional mass of sorbic acid released to the aqueous solution. The diffusional exponent (n)

reached values from 0.63 to 0.71, suggesting a non Fickiano behaviour. The diffusion

coeficients of sorbic acid, for all films, presented values on the magnitude of 10-13m2.s-1.

Independent of sorbic acid concentration, the thinner films presented migration indexes

greater than the thicker films. In the second experiment, films with 25 and 70µm thick and

added with 0, 1, 2, 3, 4, 5 and 6% of sorbic acid were produced and intercalated between

turnover dough circles of 10 cm (without sorbic acid). The control used was turnover dough

circles with potassium sorbate in the dough and intercalated with low density polyethylene

film. These sandwiches were stored at 8±1oC and after 40 days the turnover dough in contact

with the films 70µm/3, 4, 5 and 6% of sorbic acid showed lower microorganism growth

compared to the control. In the turnover dough in contact with 25µm/6% of sorbic acid,

psychrotrophs countings were lower that the control turnover dough, however, mesophilic

aerobes and Staphylococcus spp. Countings were 1 log cycle higher. The water activity and

humidity amount showed no difference among the treatments. In the third experiment, films

25 and 70µm thick incorporated with 7 and 3% of sorbic acid, respectively, were evaluated

for migration of sorbic acid to the turnover dough and microbiological analyses were also

realized. After 40 days of storage the turnover dough intercalated with film 25µm/7% sorbic

acid presented 2 cycles log reduction for mesophilic aerobes, however, psychrotrophs and

Staphylococcus spp. showed no significant difference (p>0.05) when compared with the time

zero of storage. The turnover dough intercalated with the 70µm/3% of sorbic acid were

observed mesophilic aerobes and psychrotrophs countings reduction as 2 and 1.5 log cycles,

respectively. The sorbic acid diffusion coefficients, for both films, when used in contact with

turnover dough stored at 8±1oC, showed values in the magnitude of 10-18m2.s-1. The sorbic

acid migration indexes for the films did not showed statistical difference (p>0.05). The film

25µm/7% of sorbic acid reached maximum sorbic acid released from the film to the turnover

dough at 20º day in an amount representing 0,07% of the total incorporated, while in the film

70 µm/3% of sorbic acid the maximum was reached at 9º day of storage releasing 0.09%.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Segurança Alimentar

Os alimentos, quer sejam industrializados ou não, mantêm-se em constante atividade

biológica, manifestada por alterações de natureza química, física, microbiológica ou

enzimática, levando à perda de qualidade e redução da vida de prateleira. Destas alterações, a

mais preocupante em relação a segurança dos consumidores é a microbiológica.

Mais de 200 doenças são transmitidas através dos alimentos. Muitos dos patógenos,

que causam sérios problemas hoje, como por exemplo, Campylobacter jejuni, Escherichia coli

O157:H7 (PADHYE e DOYLE,1992), Listeria monocytogenes, Cyclospora cayetanensis, não

eram reconhecidos como causas de doenças veiculadas por alimentos, há 25 anos (MEAD et

al., 1999). Eles são conhecidos como microrganismos emergentes. Em 1996, 46% de casos

confirmados, reportados pelo Center for Disease Control (CDC) e Food and Drug

Administration (FDA), foram causados por espécies de Campylobacter, sendo seguidas, em

prevalência, por salmonelose (28%), shigelose (17%) e infecção por Escherichia coli O 157:H

7 (5%) (ALTEKRUSE et al., 1999). Os sintomas variam de uma moderada gastroenterite a

síndromes renais, hepáticas e neurológicas.

De 1995 a 1999, 22 países latino-americanos enviaram informações ao Sistema

Regional de Informação para a Vigilância Epidemiológica das Doenças Veiculadas por

Alimentos, indicando a ocorrência de 3.577 surtos, 113.349 casos e 210 mortes. Para os surtos

o alimento associado foi identificado em 2.540 ocorrências (74,5%). Os alimentos de origem

animal foram os que se apresentaram como maior fonte de contaminação (1.457 surtos), o que

representa 61,7% do total. Os agentes etiológicos foram identificados em 1.939 surtos, sendo

que Salmonella spp. e Staphylococcus aureus foram os que contribuíram em maiores

proporções (OPAS,2000).

Dados disponíveis pelo Sistema Único de Saúde (SUS), no período de 1998 a 2001,

mostram que entre 4,5% e 4,8% das internações hospitalares foram com diagnóstico de

infecções intestinais como cólera, febre tifóide, shigelose, amebíase, diarréia e gastroenterite

de origem infecciosa e outras doenças infecciosas intestinais. Foi o grupo de causas com

maior número de internações, em relação a outras doenças infecciosas como tuberculose,

malária, dengue ou AIDS.

É grande a responsabilidade das indústrias produtoras de alimentos e dos órgãos de

fiscalização sobre a qualidade e segurança dos produtos consumidos pela população. O

conhecimento dos fatores responsáveis pela deterioração dos alimentos é de suma

importância, visto que cada alimento está propício a um tipo de contaminação, que depende

da sua composição, do tipo de processamento, da temperatura de estocagem, entre outros.

As massas alimentícias, incluindo a do pastel, são muito consumidas no Brasil e em

diversos países. Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 2000), massa

alimentícia é o produto não fermentado, recheado ou não, obtido pelo empasto, amassamento

mecânico de farinha de trigo nas suas diferentes formas, adicionado ou não de outros

ingredientes e acompanhado ou não de temperos. Quanto ao teor de umidade, massa

alimentícia úmida ou fresca é o produto que pode ou não ser submetido a um processo de

secagem parcial, de forma que o produto final apresente umidade máxima de 35% b.u.

A contaminação de massas frescas pode ser proveniente dos ingredientes utilizados na

formulação. Estes incluem: farinha de trigo, ovos, água, entre outros. Os equipamentos, o

ambiente de processamento e os manipuladores também têm importante papel na

contaminação do produto final (MAYOU e MOBERG, 1992). Segundo MARÍN et al. (2003),

produtos de panificação, assim como massas frescas, estão sujeitos à contaminação por

fungos filamentosos, principalmente das espécies Eurotium, Aspergillus e Penicillium.

Quanto aos critérios microbiológicos para massa fresca, está em vigor a Resolução da

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 2001), que prevê limites para

estafilococos coagulase positiva de 5,0x103 UFC.g-1, coliformes a 45°C de 1,0x102 NMP.g-

1, Bacillus cereus de 5,0x103 UFC.g-1 e ausência de Salmonella sp./25g. A Portaria no451

(BRASIL,1997), revogada pela resolução anterior, previa também a contagem de fungos

filamentosos e leveduras. Hoje, a verificação do crescimento desses microrganismos é feita

apenas visualmente.

Em geral, os conservantes químicos, principalmente ácidos orgânicos e seus sais

(sorbatos, benzoatos e propionatos), são utilizados para inibir o crescimento microbiano e

aumentar a vida de prateleira de massas alimentícias frescas, juntamente com o uso do frio,

visto que esses produtos são embalados sem tratamento térmico. A Agência Nacional de

Vigilância Sanitária regulamenta o uso do ácido sórbico e seus sais na concentração máxima

de 0,1% como ácido sórbico (BRASIL, 1999), para utilização em massa fresca.

Conservantes de ácidos fracos não têm implicações tóxicas nas concentrações

recomendadas, porém, atualmente, há uma demanda da população no sentido de consumir

alimentos com menor concentração de aditivos (OLIVEIRA, 2004).

1.2. Conservação

Para redução da carga microbiana dos alimentos, a utilização de matérias-primas de

boa qualidade e a aplicação das boas práticas de fabricação devem ser observadas, juntamente

com a adequação do processo a ser utilizado (GIOVA, 1997). Em produtos industrializados,

os processos de conservação têm papel importante na redução e, ou inibição dos

microrganismos capazes de alterar o alimento, por meio da modificação de um ou mais

fatores intrínsecos e,ou extrínsecos que são essenciais para o crescimento dos

microrganismos, tornando o alimento menos propício ao desenvolvimento microbiano.

Alguns processos, como a esterilização e a pasteurização, agem diretamente,

destruindo total ou parcialmente a população microbiana; outros utilizam meios que

dificultam a proliferação, tais como o emprego do frio ou a redução do teor de umidade, que

pode ser obtido diretamente por meio de concentração, secagem e desidratação, ou

indiretamente com o emprego do sal e do açúcar. Outros processos, como a irradiação,

emprego de altas pressões, uso de substâncias antimicrobianas, entre outros, também são

empregados pelas indústrias de alimentos, como mecanismos de ação sobre a microbiota do

alimento (FENNEMA, 1996).

Há uma grande disponibilidade de substâncias aprovadas para serem utilizadas nos

alimentos e que atuam sobre os microrganismos. Porém, na escolha do antimicrobiano deve-

se considerar o tipo de alimento, método de processamento, armazenamento e microrganismo

envolvido, bem como outras propriedades, tais como, solubilidade, pKa (constante de

dissociação), níveis tóxicos e reatividade química do composto antimicrobiano (JAY, 1992).

Diferentes compostos de uma mesma classe podem diferir na atividade antimicrobiana, bem

como nas suas propriedades físicas e químicas. Freqüentemente, a forma salina dos ácidos

orgânicos é mais solúvel em água e é a forma preferida para situações em que a solubilidade

em água é importante (ARAÚJO, 1995).

Dentre os conservantes utilizados em alimentos, os ácidos orgânicos merecem

destaque, por possuírem maior solubilidade, baixa interferência no sabor e baixo nível de

toxicidade. Assim, os ácidos orgânicos de cadeia curta, tais como acético, benzóico, cítrico,

propiônico e sórbico, são muito utilizados como conservantes ou acidulantes (BAIRD-

PARKER, 1980), sendo aprovados como substâncias GRAS (Geralmente Reconhecidas como

Seguras) (DOORES, 1994; SOFOS e BUSTA, 1994; CHIPLEY, 1994).

A atividade antimicrobiana dos ácidos fracos é atribuída à sua forma não dissociada,

portanto o pKa é utilizado na predição de sua eficiência no alimento em determinado pH. Os

valores de pKa (pH no qual 50% da molécula se encontra na forma dissociada) da maioria dos

ácidos encontram-se na faixa de pH entre 3,0 e 5,0, portanto a concentração da forma não

dissociada aumenta com a elevação da acidez do alimento (ARAÚJO, 1995). A fração não

dissociada de certos ácidos orgânicos lipofílicos (sórbico, benzóico e propiônico) afeta o

microrganismo por ser prontamente solúvel na membrana celular, que é um fluido lipo-

protéico. Esses ácidos, difundindo através da membrana, ionizam no interior da célula,

acidificando o meio intra-celular.

Segundo BARBOSA-CÁNOVAS et al. (1999), quando uma molécula não dissociada

de ácido entra em uma célula viva, ela se dissociará devido ao pH interno ser normalmente

mais alto que o pKa do ácido. Para manter o pH da célula, se produz um transporte

compensatório de prótons para o exterior da célula. Alternativamente, a própria molécula de

ácido pode ser expulsa da célula por um transporte ativo. Uma saída constante de prótons da

célula pode causar uma diminuição da energia celular. A explicação para a ação

antibacteriana dos ácidos graxos de cadeia curta seria a interferência com o metabolismo

energético.

Outras propostas para explicar a ação inibitória destes ácidos têm sido sugeridas:

ruptura da membrana celular, inibição de reações metabólicas essenciais (KREBS et al., 1983)

e acúmulo de ânions tóxicos (EKLUND, 1985). Em leveduras, a ação destes conservantes

poderia ocorrer em função da indução de um estresse energético, reduzindo a quantidade de

energia disponível para o crescimento e outras funções da célula (Bracey et al., 1998, citados

por BRUL e COOTE, 1999).

O ácido sórbico (CH3CH=CHCH=CHCOOH; PM=112,13 e pKa=4,80) é o único

ácido orgânico não saturado normalmente permitido como conservante em alimento (BAIRD-

PARKER, 1980). É comumente usado sob a forma de sais de cálcio, sódio ou potássio cujas

solubilidades são muito maiores que a do ácido (ROBERTSON,1992). Sua metabolização no

organismo humano ocorre de forma idêntica à de outros ácidos graxos presentes em

alimentos, produzindo CO2 e H2O (BARUFFALDI e OLIVEIRA,1998).

Como os demais ácidos fracos, o ácido sórbico apresenta atividade antimicrobiana na

forma não dissociada, sendo geralmente ineficaz em alimentos com pH > 6,5. É mais eficiente

do que o ácido benzóico em pH entre 4,0 e 6,0. O pKa do ácido sórbico é 4,80, e em pH 4,0,

86% do composto está não dissociado, enquanto que em pH 6,0 somente 6% encontra-se

nessa forma (JAY, 1992).

Segundo BARBOSA-CÁNOVAS et al. (1999), os sorbatos são fundamentalmente

efetivos contra leveduras e fungos filamentosos. Entre as bactérias inibidas por sorbatos

incluem-se: Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Vibrio parahaemolyticus, coliformes e

bactérias psicrotróficas deteriorantes, como Pseudomonas spp. O sorbato também pode agir

sinergisticamente com outros conservantes, como em combinação com o nitrito de sódio,

retardando a produção da toxina botulínica.

O mecanismo de ação do ácido sórbico não está devidamente esclarecido, porém

várias propostas têm sido sugeridas. Segundo Ronning e Frank (1989) citados por SOFOS e

BUSTA (1994), em determinadas condições, sorbatos podem causar modificações na

morfologia de células microbianas. Em células de fungos filamentosos têm sido observados

formação de núcleo irregular, aumento do número e variação do tamanho de mitocôndria e

vacúolos. Outro mecanismo proposto inclui alterações nas funções da membrana celular e

inibição das funções de transporte e atividade metabólica. Também pode causar a redução da

assimilação de carbono de vários substratos, incluindo glicose, acetato, succinato, lactato,

entre outros (SOFOS e BUSTA, 1994).

O sorbato pode também inibir a atividade de vários sistemas enzimáticos, rompendo

processos vitais envolvidos nas funções de transporte, metabolismo celular, crescimento e

replicação. Enzimas como malato, isocitrato, α-cetoglutarato e succinato desidrogenase,

fumarase e aspartase são inibidas pelo sorbato (BARBOSA-CÁNOVAS et al., 1999).

Em fungos, estudos mostram que ocorre a inibição das desidrogenases, interferindo na

assimilação oxidativa (JAY, 1992). Vários estudos indicam que os sorbatos inibem a

germinação de esporos (SOFOS e BUSTA, 1994).

No Brasil, o ácido sórbico e seus sais podem ser adicionados a vários alimentos, como

coco ralado, bombons e similares, leite de coco, massas frescas, recheadas ou não, molhos,

néctares de frutas, entre outros; desde que o limite máximo esteja na faixa de 0,01 a 0,2%,

dependendo do alimento (BRASIL, 1988).

1.3. Embalagens ativas

A manutenção da qualidade dos produtos alimentícios está também relacionada com a

embalagem. A adequação da embalagem ao produto depende de fatores inerentes ao produto,

como teor de lipídeos, textura, pH, teor de umidade e da embalagem, tais como,

permeabilidade ao vapor d’água, transmitância a luz, selabilidade, entre outros.

Com a demanda crescente do mercado consumidor por produtos com processamento

mínimo, de conveniência e que mantenham as características sensoriais dos alimentos

próximos ao in natura, torna-se necessário o desenvolvimento de novas embalagens com

funções especiais. Assim, nos últimos anos, vem sendo realizado na área o desenvolvimento

das embalagens ativas com objetivo de estender a vida-de-prateleira e melhorar a segurança e

as propriedades sensoriais, enquanto mantém a qualidade do alimento, através de uma

interação desejável entre a embalagem e o alimento (ROONEY, 1995; VERMEIREN et al.,

1999; DEVLIEGHERE et al., 2004).

As mais importantes concepções de embalagens ativas são os polímeros

antimicrobianos (WENG e HOTCHKISS, 1993; HOTCHKISS,1995), os absorvedores de

oxigênio (BEREZON e SAGUY, 1998) e de etileno, os liberadores de CO2 e as enzimas

imobilizadas em suportes poliméricos, tais como lisozima (APPENDINI, 1996) e naringinase

(SOARES, 1998).

Embalagem antimicrobiana atua reduzindo, inibindo ou retardando o crescimento da

microbiota presente, principalmente na superfície do alimento embalado, onde a maior parte

das reações de deterioração ocorre. Essas embalagens podem apresentar-se de várias formas:

adição de sachês no interior de embalagens, contendo agentes antimicrobianos voláteis;

incorporação de agentes antimicrobianos voláteis e não voláteis diretamente no polímero;

adsorção de antimicrobianos na superfície do polímero; imobilização de antimicrobianos no

polímero por ligações iônica ou covalente e uso de polímeros com atividade antimicrobiana

(APPENDINI e HOTCHKISS, 2002).

O controle do crescimento microbiano pelos conservantes pode ser realizado por três

mecanismos: redução da taxa de crescimento dos microrganismos, aumento da fase lag ou

inativação por contato (QUINTAVALLA e VICINI, 2002).

O uso de filmes contendo agentes antimicrobianos apresenta vantagens sobre os

métodos tradicionais de adição direta dos conservantes nos alimentos, visto que podem ser

liberados de maneira controlada, estando, portanto, em menores quantidades no alimento e

atuando, principalmente, na superfície do produto. Também pode ocorrer inibição ou redução

da atividade do antimicrobiano, quando adicionado de forma tradicional, por diversas

substâncias do próprio alimento (QUINTAVALLA e VICINI, 2002). JUNG et al. (1992)

verificaram a interação de emulsificantes e ácidos graxos do leite com a nisina, reduzindo sua

atividade antimicrobiana sobre a Listeria monocytogenes. GUILBERT et al. (1997)

observaram que o ácido sórbico apresentou maior atividade antimicrobiana sobre o

crescimento de fungos, quando incorporado em filmes à base de

pectina/glúten/monoglicerídeos do que quando adicionado diretamente no alimento.

Pesquisas vêm sendo realizadas com o objetivo de incorporar diferentes substâncias

antimicrobianas a diferentes suportes poliméricos (WENG, 1992; HOTCHKISS,1995;

WENG e HOTCHKISS, 1993; BUONOCORE et al., 2003; CHOI et al., 2004; LEE et al.,

2004; GROWER et al., 2004), obtendo filmes ativos, para aumentar a segurança, manter a

qualidade e prolongar a vida de prateleira dos alimentos. Porém, cuidados devem ser

observados durante a produção desses filmes, como a temperatura de processamento, visto

que a substância antimicrobiana pode perder sua atividade após tratamento a altas temperatura

e pressão.

Filmes antimicrobianos podem ser obtidos mediante fusão ou solubilização em

solvente (processo cast) do composto antimicrobiano no suporte polimérico, sendo o método

por solubilização o mais indicado quando se trata de antimicrobianos sensíveis ao calor

(APPENDINI e HOTCHKISS, 2002). Estudos realizados com nisina mostram que sua

atividade antimicrobiana, em filmes à base de metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose,

carragenina e quitosana, obtidos pelo processo cast, é três vezes maior que em filmes

processados sob altas temperatura e pressão (CHA et al., 2001).

Do ponto de vista de segurança do alimento, as substâncias antimicrobianas utilizadas

no desenvolvimento de filmes ativos devem estar aprovadas para contato com alimento

(WENG et al., 1999). Assim, substâncias GRAS (geralmente reconhecidas como seguras) têm

sido incorporadas em polímeros para produção de embalagens antimicrobianas, como ácido

sórbico (CAGRI et al., 2001; LIMJAROEN, et al. 2003), ácido benzóico, ácido propiônico

(QUATTARA et al., 2000b; SOARES et al., 2002) e seus sais (OZDEMIR e FLOROS, 2001;

BUONOCORE et al., 2003; CHOI et al., 2004), nisina, (MELO, 2003; DAWSON et al.,

2003; LEE et al., 2004; GROWER et al., 2004), entre outras.

WENG e HOTCHKISS (1993) incorporaram 1% de anidro benzóico em filmes de

polietileno de baixa densidade, inibindo completamente o crescimento de Rhyzopus stolonifer,

Penicillium spp. e Aspergillus toxicarius em meio de cultura. Na concentração de 2,0% houve

uma inibição do crescimento dos fungos em queijo.

Dawson et al. (1997), citados por QUINTAVALLA e VICINI (2002), usaram nisina e

lisozima em filmes de proteína de soja e milho para inibir o crescimento de suspensões de

Lactobacillus plantarum e Escherichia coli. Os filmes contendo esses aditivos foram efetivos

na inibição de Lactobacillus plantarum. A adição de ácido etilendiaminotetracético (EDTA)

aumentou o efeito inibitório dos filmes sobre a E. coli, visto que o agente quelante altera a

membrana das bactérias gram-negativas, aumentando a permeabilidade celular (PADGETT et

al., 1998). No entanto, MELO (2003) não constatou diferença na ação antimicrobiana do

filme de base celulósica incorporado com nisina quando adicionou EDTA.

LIMJAROEN et al. (2003) observaram maior efeito antimicrobiano do ácido sórbico

sobre Listeria monocytogenes em filmes de copolímero de cloreto de polivinilideno, bem

como uma melhor distribuição desta substância na estrutura polimérica em relação ao sorbato

de potássio e nisina.

Outro fator importante é com relação à liberação das substâncias antimicrobianas para

o alimento, que não deve ultrapassar a concentração permitida pelas normas vigentes. A

difusão dos antimicrobianos na matriz polimérica pode ser reduzida pela adição de compostos

hidrofóbicos, como ácidos graxos. QUATTARA et al. (2000a) observaram que o ácido

acético incorporado em filmes de quitosana apresentou menor liberação quando foi

adicionado de ácido láurico.

As embalagens ativas vêm sendo utilizadas em uma variedade de produtos como pães,

bolos, biscoitos, pizza, massa fresca, queijo, carnes, frutas, entre outros. Cada um desses

produtos tem mecanismos diferentes de deterioração, que deverão ser entendidos para que se

possa definir uma embalagem ativa (VERMEIREN et al, 1999).

Substâncias antimicrobianas, ao serem incorporadas em materiais de embalagem,

podem afetar as propriedades físicas (HAN, 2000; QUINTAVALLA e VICINI; 2002) e

mecânicas (HAN, 2000) do filme obtido. Segundo APPENDINI e HOTCHKISS (2002), as

mudanças nestas propriedades são específicas para cada combinação antimicrobiano-

polímero. Quando filmes de copolímero de cloreto de polivinilideno foram incorporados com

1,5%, 2% e 3% de ácido sórbico, sorbato de potássio ou nisina, houve decréscimo nas

propriedades de força de tensão e barreira ao vapor d'água e ao oxigênio, porém não houve

mudança significativa na porcentagem de alongamento, em relação ao filme controle

(LIMJAROEN et al., 2003 ). HAN e FLOROS (1997) observaram um decréscimo na

transparência do filme de polietileno de baixa densidade com a adição de sorbato de potássio,

porém não houve mudança significativa nas propriedades de tensão. GROWER et al. (2004),

trabalhando com filme de polietileno de baixa densidade incorporado com nisina, observaram

aumento da força de tensão com o aumento da concentração de nisina no filme.

Polímeros sintéticos têm sido utilizados para produção de filmes antimicrobianos,

porém existe um interesse crescente pelos biodegradáveis, devido a fatores ambientais e

oportunidade de criar novos mercados. Para que um material seja chamado biodegradável, ele

deve ser degradado completamente por microrganismos em compostos naturais, como CO2,

água, metano, hidrogênio e biomassa (KROCHTA e DeMULDER-JOHNSTON, 1997).

As embalagens biodegradáveis têm recebido grande atenção nos últimos anos e

numerosas pesquisas estão sendo desenvolvidas nessa área, sobretudo tendo em vista que a

embalagem representa aproximadamente 30% do resíduo urbano municipal. Segundo a

Oficina de Avaliação Técnica do Congresso dos Estados Unidos, as embalagens geram

anualmente, em média, 60 milhões de toneladas de resíduos sólidos e, aproximadamente, 32

milhões correspondem a embalagem para alimentos (CHEN, 1995).

A produção de resíduo urbano no Brasil atinge 240.000 a 300.000 toneladas/dia, dos

quais o plástico representa 20% do total (SOTERO, 2000). Considerando que a maioria dos

plásticos não é biodegradável ou degrada lentamente, então isto torna o plástico um problema

ambiental, gerando volumes enormes de lixo e criando impactos ambientais negativos

(KLAHORST, 1999).

Os plásticos biodegradáveis podem ser obtidos diretamente de material natural, como

amido e celulose (polissacarídeos) e proteína do leite e germe de trigo (polipeptídeos).

SOARES e HOTCHKISS (1998) conseguiram reduzir o amargo do suco de grapefruit

com a imobilização da enzima naringinase em filmes base celulósica.

Lactato de sódio mostrou eficiência antimicrobiana em salsicha, quando incorporado

em filmes de base celulósica (MELO et al., 2002). Também SOARES et al. (2002),

trabalhando com propionato de sódio incorporado em filmes de base celulósica, observaram

uma inibição do crescimento microbiano em pães. MELO (2003) observou redução de 2

ciclos log na contagem de Staphylococcus sp. em queijo coalho coberto com filme

incorporado com nisina.

Segundo AHVENAINEN e HURME (1997), estudos são necessários sobre os efeitos

químicos, microbiológicos e fisiológicos dos vários modelos de embalagens ativas sobre os

alimentos, para resguardar sua qualidade e segurança.

Por ser um assunto promissor e inovador na área de embalagem de alimentos, com

excelentes perspectivas de interesse industrial, faz-se necessária a realização de pesquisas de

desenvolvimento de filmes e testes em sistemas alimentícios reais. Assim, este trabalho teve

como objetivos: desenvolver filmes antimicrobianos de base celulósica incorporados com

ácido sórbico em diferentes concentrações e espessuras; avaliar suas propriedades mecânicas

e eficiência antimicrobiana; avaliar a migração do antimicrobiano da estrutura polimérica em

sistema simulante do alimento e em massa de pastel.

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CAPÍTULO 1

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE FILMES DE BASE

CELULÓSICA INCORPORADOS COM ÁCIDO SÓRBICO

RESUMO

Desenvolveram-se filmes antimicrobianos incorporados com ácido sórbico e

avaliaram-se suas propriedades mecânicas, bem como, a migração do antimicrobiano da

estrutura polimérica em água. Os filmes foram produzidos com 25, 70 e 100µm de espessura,

contendo 3, 6 e 9% de ácido sórbico, pelo método cast (utilização de solvente). As

propriedades de resistência ao estouro e módulo de elasticidade dos filmes antimicrobianos

aumentaram significativamente (p<0,05) com aumento da espessura do filme. Porém, a

concentração de ácido sórbico apresentou efeito significativo (p<0,05) na propriedade de

estouro, mas não afetou o comportamento da massa fracional do ácido liberada para o meio

aquoso. Essa liberação apresentou um comportamento exponencial. Filmes com espessura de

100µm apresentaram em água um comportamento mais característico de filme ativo, ou seja,

uma liberação gradual e lenta do aditivo. Os expoentes difusionais (n) alcançaram valores de

0,63 a 0,71, sugerindo que o mecanismo de transporte tem um caráter não-Fickiano. Os

coeficientes de difusão do ácido sórbico nos filmes a 25°C apresentaram valores na ordem de

10-13m2.s-1. Independente da concentração de ácido sórbico, os filmes de menor espessura

(25µm) apresentaram índices de migração maiores que os demais filmes.

1. INTRODUÇÃO

Atualmente, o mercado consumidor tem exigido produtos com processamento

mínimo, de conveniência e que mantenham as características sensoriais e nutricionais dos

alimentos in natura, tornando-se, assim, necessário o desenvolvimento de novas tecnologias

para a produção e conservação desses produtos. Dessa forma, nos últimos anos, o segmento

de embalagens para acondicionar alimentos vem investindo no desenvolvimento de inovações

para atender a essa crescente demanda. Dentre esses desenvolvimentos, pode-se destacar as

embalagens ativas que objetivam interagir com o produto alimentício, modificando de forma

desejável as propriedades sensoriais, nutricionais e de segurança microbiológica do alimento,

estendendo assim, sua vida-de-prateleira e mantendo a sua qualidade (ROONEY, 1995;

VERMEIREN et al., 1999; DEVLIEGHERE et al., 2004).

As mais importantes concepções de embalagens ativas são os polímeros

antimicrobianos (WENG e HOTCHKISS,1993; HOTCHKISS,1995), os absorvedores de

oxigênio (BERENZON e SAGUY, 1998), os liberadores de CO2 e de etileno e as enzimas,

como a lisozima (APPENDINI, 1996) e a naringinase (SOARES, 1998).

Polímeros sintéticos têm sido utilizados para produção de filmes antimicrobianos,

porém existe um interesse crescente pelos biodegradáveis, devido a fatores ambientais e a

oportunidade de criar novos mercados. O acetato de celulose tem sido indicado como

alternativa ao polipropileno orientado (OPP) para processos de laminação de impressão

(EMBALAGEM MARCA, 2002).

Os alimentos, quer sejam industrializados ou não, mantêm-se em constante atividade

biológica, manifestada por alterações de natureza química, física, microbiológica ou

enzimática, podendo levar à perda de qualidade e redução da vida de prateleira. Destas

alterações, a mais preocupante em relação a segurança dos consumidores é a microbiológica.

O uso de substâncias antimicrobianas como mecanismo de ação sobre a microbiota do

alimento é um dos processos de conservação empregados pelas indústrias de alimentos

(FENNEMA, 1996).


no desenvolvimento de filmes ativos têm que constar na lista daquelas aprovadas pela

legislação (WENG et al., 1999). Assim, ácidos sórbico, benzóico, propiônico e seus sais têm

sido incorporados em polímeros para produção de embalagens antimicrobianas, por serem

considerados substâncias GRAS (Geralmente Reconhecidas como Seguras). Substâncias

antimicrobianas, ao serem incorporadas em materiais de embalagem, podem afetar as

propriedades físicas (HAN, 2000; QUINTAVALLA e VICINI; 2002) e mecânicas (HAN,

2000) do filme obtido. HAN e FLOROS (1997) observaram decréscimo na transparência do

filme de polietileno com a adição de sorbato de potássio, porém não houve mudança

significativa nas propriedades de tensão.

A difusão da substância antimicrobiana do material de embalagem para o alimento e a

partição na interface também são parâmetros que influenciam na potenc ialidade de aplicação

do sistema de embalagens ativas (Chung, 2000, citado por CHOI et al., 2001).

Por ser um assunto promissor e inovador na área de embalagem de alimentos, com

excelentes perspectivas de interesse industrial, faz-se necessária a realização de pesquisas de

desenvolvimento de embalagens antimicrobianas. Assim, o presente trabalho objetivou

desenvolver filmes antimicrobianos de base celulósica incorporados com ácido sórbico e

avaliar suas propriedades mecânicas, bem como a migração do composto antimicrobiano da

estrutura polimérica para água.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Embalagem do Departamento

de Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG.

2.1. Produção dos filmes antimicrobianos

Para produção dos filmes foram utilizados resina celulósica, doado pela Empresa

Rhodia, ácido sórbico e solvente, adquiridos da Merck.

Os filmes foram produzidos pelo método cast (utilização de solvente), segundo

metodologia descrita por SOARES (1998), com algumas modificações. Flocos celulósicos

foram dissolvidos em solvente, já contendo o ácido sórbico diluído na concentração de 3, 6 e

9%. A mistura foi homogeneizada, deixada em repouso por 30 minutos e espalhada em placas

de vidro, de forma a obter filmes com espessuras médias de 25, 70 e 100µm. As placas foram

tampadas e mantidas sob refrigeração (5 ± 1°C) por 1 hora. Posteriormente, foram mantidas

por 20 minutos à temperatura ambiente (25 ± 2°C), antes de serem destampadas. Após

completa evaporação do solvente, os filmes foram removidos das placas, separados por folhas

de papel branco (50 µm, 75 g.m-2 ) e estocados em temperatura ambiente para análises

posteriores. A espessura de cada filme foi obtida pela média de medidas tomadas em três

pontos dos filmes, ao acaso, utilizando micrômetro Mitutoyo (0-25 mm).

2.2. Análise das propriedades mecânicas dos filmes

Os filmes foram condicionados em temperatura de 23 ± 1°C e umidade relativa de 50

± 2%, durante 24 horas, segundo norma ABNT 6740 (1981).

A propriedade de módulo de elasticidade específica foi determinada segundo a Norma

ASTM-D882-00 (2001), utilizando o Aparelho Universal de Teste Instron (modelo 4204) e o

teste de estouro foi realizado no aparelho Mullen (modelo MTA-2.000).

2.3. Experimentos de difusão

Amostras dos filmes, com área de 25 cm2 e pesos conhecidos, foram colocadas em

100mL de água pura (18,2 ohm) sob agitação, na temperatura ambiente (25 ± 2°C). Nos

tempos de 0,33; 0,66; 1; 2; 4; 10; 30; 60; 180; 360 e 720 minutos foram retiradas alíquotas de

20µL e a concentração do ácido sórbico foi medida por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE), segundo metodologia descrita por CHOI et al. (2001). A quantificação foi

realizada em cromatógrafo SHIMADZU (modelo 10 AVP), coluna Shim-pack ODS (4,6µm,

4,6 x 150 mm) e sistema de detecção UV. Mistura de acetonitrila, água e ácido fosfórico

(0,1%), nas proporções de 60, 20 e 20%, respectivamente, foi utilizada como fase móvel e

fluxo de 1,0 mL.min-1, sendo a detecção realizada a 260 nm.

A massa fracional liberada foi determinada pela relação Mt/M∞ , sendo Mt a massa de

ácido liberada na solução em um tempo t e M∞ a massa de ácido liberada no tempo infinito

(valor de equilíbrio). Esses valores foram calculados e plotados em função do tempo.

Os coeficientes de difusão D (m2.s-1) do ácido sórbico dos diferentes filmes foram

calculados considerando o método de meia vida, dado pela seguinte equação (LIM e TUNG,

1997):

D=0,049h2/t0,5 (1)

onde h é a espessura do filme (m) e t0,5 o tempo (s) em que Mt = 0,5M∞.

Para investigar o mecanismo envolvido no processo de difusão de um sistema foi

ajustada a porção inicial da curva de liberação do ácido sórbico (Mt/M∞ < 0,60) ao seguinte

modelo de lei da força (RITGER e PEPPAS, 1987):

Mt /M∞=ktn (2)

onde Mt é a massa de ácido liberada no tempo t, M∞ a massa de ácido liberada no tempo

infinito, k a constante que caracteriza o sistema de rede macromolecular e n o expoente

difusional característico do mecanismo de liberação.

A massa de ácido sórbico migrada para o meio aquoso (Mm) e a retida no filme (Mr)

foram determinadas a partir dos valores da concentração do ácido quantificados pela

cromatografia líquida. O índice de migração (s ) do ácido sórbico foi calculado pela equação:

s= Mm/(Mm+Mr) (3)

2.4. Análise estatística

O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado com 3

repetições, sendo os resultados submetidos a análise de variância e teste de média (Tukey).

Quando pertinente, os dados foram analisados por regressão com auxílio do software Statistica

5.1.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A incorporação do ácido sórbico na matriz celulósica foi realizada até a concentração

de 9%, pois, a partir dessa concentração os filmes ficaram quebradiços e opacos. Os filmes

apresentaram formação de cristais na sua estrutura (Figura 1), devido à precipitação do ácido

sórbico. Assim, quanto maior a concentração do ácido no filme, maior a formação de cristais.

Figura 1 - Microfotografia do filme de base celulósica (70µm , 9% de ácido

sórbico), mostrando cristais do ácido formados no filme ativo durante o

processo de produção (aumento de 100 x).

As propriedades de resistência ao estouro e módulo de elasticidade dos filmes

antimicrobianos aumentaram significativamente (p<0,05) com a espessura do filme (Figuras

2A e 2B). Na espessura de 70µm, o filme com 6% de ácido sórbico apresentou valores de

480 KPa e 3,7 MN.m.Kg-1, para a resistência ao estouro e módulo de elasticidade,

respectivamente. A concentração de ácido sórbico apresentou efeito significativo (p<0,05)

somente na propriedade de estouro (Figura 2A). Provavelmente, a força aplicada ao filme

durante esse teste exerceu uma pressão sobre os cristais, forçando-os contra a matriz

polimérica. Isso causou a ruptura das cadeias poliméricas, reduzindo a resistência do filme ao

estouro à medida em que se aumentou a concentração de ácido. Durante o teste de módulo de

elasticidade, o estiramento das cadeias poliméricas possivelmente promoveu o acomodamento

dos cristais, sem que os mesmos afetassem a estrutura do filme.

HAN e FLOROS (1997) não observaram alterações significativas nas propriedades de

força de tensão em filmes de polietileno incorporados com sorbato de potássio. Quando

filmes de copolímero de cloreto de polivinilideno foram incorporados com ácido sórbico,

sorbato de potássio ou nisina, nas concentrações variando de 1,0 a 3,0%, LIMJAROEN et al.

(2003) observaram diminuição na força de tensão à medida em que se aumentou a

concentração dos aditivos incorporados, porém, não houve mudança significativa na

porcentagem de alongamento. Segundo APPENDINI e HOTCHKISS (2002), as mudanças

nessas propriedades são específicas para cada combinação antimicrobiano-polímero.

Figura 2 - Caracterização física dos filmes antimicrobianos, com diferentes espessuras e concentrações de ácido sórbico, quanto à Resistência ao Estouro (A) e Módulo de Elasticidade (B).

A concentração de ácido sórbico não afetou significativamente ( p=0,05) o

comportamento da massa fracional do ácido liberada para o meio aquoso. Essa liberação

apresentou um comportamento exponencial (Figura 3). Em geral isso é observado na difusão

de solutos em polímeros, com volume infinito de solvente (QUATARRA et al., 2000; CHOI

et al., 2001).

Figura 3 - Massa fracional de ácido sórbico liberada dos filmes antimicrobianos

com diferentes espessuras, em água pura (18,2 ohm) a 25oC.

A matriz polimérica celulósica tem grupos hidrofílicos em sua estrutura, podendo

facilmente interagir com a água e resultar em liberação controlada; portanto, a liberação do

ácido sórbico do filme de base celulósica imerso em água pode ser descrita pelo modelo de

expansão controlada (Malley et al., 1987, citados por QUATARRA et al., 2000). De acordo

com este modelo, a água penetra na matriz polimérica, dissolvendo parte do ácido sórbico,

que apresenta solubilidade em água à temperatura ambiente de 0,16g/100mL (ARAUJO,

1995), ocorrendo, em seguida, sua liberação do polímero. Isto explica a maior rapidez com

que o ácido sórbico foi liberado do filme de 25 µm, pois a água penetra com mais facilidade

nesse filme (Figura 3). Além disso, a molécula de água atua como um plastificante,

contribuindo para maior movimentação das cadeias poliméricas e, conseqüentemente, maior

liberação de moléculas de baixo peso molecular incorporadas na matriz polimérica

(ROBERTSON, 1992). O filme com espessura de 100µm apresentou, em água, um

comportamento mais característico de filme ativo, ou seja, uma liberação gradual e lenta do

aditivo, levando em torno 6 horas para liberação de 50% do ácido incorporado, quantidade

máxima liberada por esse filme. Essa velocidade de liberação do ácido para o meio aquoso

também está relacionada com a ação plastificante da água na matriz polimérica. É comum, em

vários sistemas hidrofílicos, este fenômeno de liberação controlada, tais como em filme à base

de álcool polivinil (KORSMEYER e PEPPAS, 1981), poliacrilamida (RAMARAJ e

RADHAKRISHNAN, 1994), éster de celulose (RANGA RAO e PADMALATHA DEVI,

1988), entre outros. Resultados obtidos nesse estudo confirmam os de QUATTARA et al.

(2000), onde a difusão do ácido aumentou com o aumento da penetração de água no filme,

alcançando um platô, quando a matriz polimérica ficou saturada com água. Vários autores

(LIM e TUNG, 1997; PEPPAS e BRANNON-PEPPAS, 1994; ARMAND et al., 1987)

reportam diferentes fatores que contribuem para a liberação de compostos incorporados em

matriz polimérica, tais como, interações entre o composto e a matriz, inchamento da matriz,

relaxamento dependente do tempo devido ao inchamento e difusão de líquidos no polímero.

Assim, supõe-se que a difusão do ácido para a superfície dos alimentos, onde o conteúdo de

água é limitado, seja menor.

Os expoentes difusionais da Eq. (2) foram calculados pela plotagem de ln (Mt/M∞)

versus ln (t) (Figura 4), havendo relação linear para Mt/M∞ menor que 0,6 e com coeficientes

de correlação (R2) de 0,99. Os expoentes difusionais (n) foram calculados pela inclinação das

retas e as constantes difusionais (k) foram obtidas pela função exponencial da interseção da

reta no eixo da ordenada. Os expoentes difusionais alcançaram valores de 0,63 a 0,71,

sugerindo que o mecanismo de transporte tem um caráter não-Fickiano. Este tipo de

comportamento também foi observado em vários estudos de liberação de compostos em

sistemas poliméricos (PEPPAS e FRANSON, 1983; BRASEL e PEPPAS, 1999; OZDEMIR e

FLOROS, 2001). Segundo Jacques et al. (1974), citados por OZDEMIR e FLOROS (2001),

o valor de n=0,5 mostra que a difusão Fickiana é observada e a taxa de liberação depende de

t0,5. Nesse caso, o coeficiente de difusão possui um valor finito e pode ocorrer a transferência

de componentes do filme para o meio. Entretanto, a camada- limite não muda com o tempo. O

valor de n sendo igual a 1 indica que a taxa de liberação está diretamente proporcional ao

tempo. Para os valores de 0,5 < n < 1,0, predomina um mecanismo de transporte não-

Fickiano, como obtido neste experimento. Valores de n >1 indicam liberação pronunciada nos

estágios finais do experimento, resultando em um transporte controlado mais rápido.

Os coeficientes de difusão do ácido sórbico nos filmes a 25°C apresentaram valores

na ordem de 10-13m2.s-1, conforme mostrados na Tabela 1. Os coeficientes de difusão

apresentaram uma tendência a aumentar com o aumento da concentração de ácido sórbico e

da espessura do filme. CHOI et al. (2004), trabalhando com sorbato de potássio incorporado

em filme ativo a base de carragena, encontraram valores de coeficiente de difusão na ordem

de 10-13m2.s-1, enquanto OZDEMIR e FLOROS (2001), em pesquisa realizada com filmes de

proteína de trigo incorporados com diferentes concentrações de sorbato de potássio (3,3%,

5%, 6,7% e 10%) e espessura de aproximadamente 198µm reportaram valores

aproximadamente de 10-11 m2.s-1 , ou seja, 100 vezes maiores que os obtidos nesse trabalho.

Em polímeros sintéticos, tal como polietileno de baixa densidade, os coeficientes de difusão

do sorbato de potássio, determinados por HAN e FLOROS (1998), foram na ordem de 10-12

m2.s-1 a 25°C.

Figura 4 - Valores de ln(Mt/M∞) versus ln(t) dos filmes com 25, 70 e 100 µm de

espessura, incorporados com diferentes concentrações de ácido sórbico (3, 6 e 9%) a 25oC.

Tabela 1 - Valores do coeficiente de difusão do ácido sórbico (D), da massa do ácido

sórbico retida no filme (Mr) e da migrada para a água (Mm) e do índice de migração do

conservante (s) relativos ao filme ativo em solução aquosa.

Tabela 1 - Valores do coeficiente de difusão do ácido sórbico (D), da massa do ácido sórbico

retida no filme (Mr) e da migrada para a água (Mm) e do índice de migração do conservante

relativos ao filme ativo em solução aquosa.

Ácido Sórbico Espessura D x 10-13 Mr Mm

(%) ( m) (m2.s-1) (mg) (mg)

3 25±2 1,67 a 0,56 1,60 0,74 cd

3 70±5 2,09 ab 1,59 2,72 0,63 bc

3 100±7 2,23 ab 2,99 3,50 0,54 ab

6 25±2 2,06 ab 1,30 5,26 0,80 d

6 70±5 2,45 ab 3,53 9,59 0,73 cd

6 100±7 2,74 ab 9,76 9,93 0,50 ab

9 25±2 2,01 ab 1,95 7,31 0,79 d

9 70±5 3,39 b 5,54 13,00 0,70 cd

9 100±7 3,47 b 15,38 12,42 0,44 a

Nas colunas, médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente entre si,

pelo teste de Tukey (p 0,05). Ácido Sórbico (%), Espessura (µm), D x 10-13(m2.s-1), Mr (mg),

Mm (mg)

Independente da concentração de ácido sórbico, os filmes de menor espessura (25µm)

apresentaram índices de migração maiores que os demais filmes (Tabela 1), devido à maior

facilidade com que a água penetra nesses filmes, dissolvendo parte do ácido e liberando-o

para o solvente. Nos filmes de 100 µm, aproximadamente metade da massa do ácido sórbico

incorporada no polímero foi liberada para a água, o que representa, no filme contendo 3% de

ácido sórbico, uma massa de ácido migrada de 3,50 mg . Para o filme de 70 µm/ 3% ácido

sórbico, a migração foi de 2,72 mg de ácido, representando, aproximadamente, 60% da

quantidade incorporado na matriz. Os resultados mostraram que o índice de migração

aumentou quando a espessura do filme diminuiu. Tal fato, provavelmente, deveu-se à

solubilidade do ácido sórbico na acetona, sendo que, durante o processo de produção do filme,

parte dele pode ter sido carreada para a superfície do filme, no processo de evaporação da

acetona. Assim, essa massa de ácido foi mais facilmente removida pela água, visto que na

parte mais interna do filme a penetração da água foi mais dificultada.

4. CONCLUSÕES

A matriz celulósica suportou a incorporação de até 9% de ácido sórbico para produção

de filmes ativos com propriedades que permitam o uso dos mesmos para acondicionamento de

alimentos. O ácido sórbico teve liberação máxima do filme antimicrobiano em um tempo que

variou de 0,5 a 6 horas, após imersão em água a 25°C. Filmes com espessura de 25, 70 e 100

µm permitiram uma migração, em média, de 78, 68 e 50% do ácido incorporado para água,

respectivamente. Tendo em vista a maior quantidade de ácido sórbico retido no filme de 100

µm e sua menor flexibilidade, dificultando, assim, a sua aplicação em alimentos, sugere-se a

continuidade do trabalho com os filmes de 25µm e 70µm, com diferentes concentrações de

ácido sórbico, utilizando-os num produto alimentício.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARAÚJO, J. M. A. Química de Alimentos: Teoria e Prática. Viçosa: Impr. Univ./UFV,

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CAPÍTULO 2

FILMES ANTIMICROBIANOS INCORPORADOS COM ÁCIDO SÓRBICO NA


RESUMO

Filmes de base celulósica com 25 e 70 µm de espessura incorporados com 0, 1, 2, 3, 4,

5 e 6% de ácido sórbico, foram produzidos e intercalados em massa de pastel sem conservante

para avaliar sua ação antimicrobiana. Massas controle, contendo sorbato de potássio, foram

intercaladas com filmes de polietileno de baixa densidade (PEBD). Os sanduíches

(filmes/massas) foram acondicionados em sacos de PEBD e estocados sob refrigeração

(8±1°C). Os resultados das análises microbiológicas, obtidas no tempo inicial para as massas

com ou sem conservante apresentaram-se dentro dos padrões da legislação vigente. Após 40

dias de estocagem, as massas com filmes de 70µm, contendo 3, 4, 5 e 6% de ácido sórbico,

apresentaram, estatisticamente, crescimento microbiano menor ou igual ao da massa controle.

Nas massas com filmes de 25µm, contendo 6% de ácido sórbico, a contagem de psicrotróficos

foi inferior à da massa controle, porém, as contagens de mesófilos aeróbios e Staphyloccoccus

spp. foram superiores em 1 ciclo log. A atividade de água e o teor de umidade das massas não

apresentaram diferenças entre os tratamentos, ao longo do tempo de estocagem.

1. INTRODUÇÃO

O conceito tradicional, de que a embalagem deve preservar a qualidade do produto

havendo interação mínima entre a embalagem e o produto, está superado frente às várias

tecnologias desenvolvidas nas últimas décadas, que têm por princípio justamente a interação

embalagem/produto (OLIVEIRA, 2004). Dentre essas tecnologias, pode-se destacar as

embalagens ativas que objetivam interagir com o produto alimentício, modificando de forma

desejável as propriedades sensoriais, nutricionais e de segurança microbiológica do alimento,

estendendo assim sua vida-de-prateleira e mantendo sua qualidade (ROONEY, 1995;

VERMEIREN et al., 1999; DEVLIEGHERE et al., 2004).

A embalagem ativa antimicrobiana atua reduzindo, inibindo ou retardando o

crescimento da microbiota presente, principalmente na superfície do alimento embalado, onde

a maior parte das reações de deterioração ocorre (DEVLIEGHERE et al., 2004). Essas

embalagens podem apresentar-se pela incorporação de agentes antimicrobianos voláteis e não

voláteis diretamente no polímero, pela adsorção de antimicrobianos na superfície do

polímero, pela imobilização de antimicrobianos no polímero por ligações iônica ou covalente

e pelo uso de polímeros com atividade antimicrobiana (APPENDINI e HOTCHKISS, 2002).

Esse tipo de embalagem permite uma redução no teor de conservante no alimento, atendendo

uma tendência atual do consumidor que é a busca por alimentos com processamento e teores

mínimos de aditivos.

De modo geral, o filme antimicrobiano deve ser efetivo em um largo espectro de

microrganismos, apresentar eficiência em baixas concentrações dos compostos incorporados,

não causar alterações nas características sensoriais do produto, ter um custo compatível e

atender à legislação vigente (BRODY, 2001).

Essas embalagens vêm sendo utilizadas em uma variedade de produtos como pães,

bolos, biscoitos, pizza, massa fresca, queijo, carnes, frutas, entre outros. Cada um desses

produtos tem mecanismo diferente de deterioração, que deverá ser entendido para que se

possa adequar uma embalagem ativa para cada um deles (VERMEIREN et al, 1999).


no desenvolvimento de filmes ativos, devido à sua migração, devem estar aprovadas para

contato com alimento (WENG et al., 1999). Assim, substâncias GRAS (Geralmente

Reconhecidas como Seguras) têm sido incorporadas em polímeros para produção de

embalagens antimicrobianas, como ácido sórbico (CAGRI et al., 2001; LIMJAROEN, et al.,

2003), ácido benzóico, ácido propiônico (QUATTARA et al., 2000b; SOARES et al., 2002) e

seus sais (OZDEMIR e FLOROS, 2001; BUONOCORE et al., 2003; CHOI et al., 2004)

nisina, (MELO, 2003; DAWSON et al., 2003; LEE et al., 2004; GROWER et al., 2004),

entre outras.

WENG e HOTCHKISS (1993) incorporaram 1% de anidro benzóico em filmes de

polietileno de baixa densidade, inibindo completamente o crescimento de Rhyzopus stolonifer,

Penicillium spp. e Aspergillus toxicarius em meio de cultura, sendo que a incorporação de

2,0% do antimicrobiano inibiu o crescimento de fungos em queijo. Lactato de sódio mostrou

eficiência antimicrobiana em salsicha, quando incorporado em filmes de base celulósica

(MELO et al., 2002). Também SOARES et al. (2002), trabalhando com propionato de sódio

incorporado em filmes de base celulósica, observaram uma inibição do crescimento

microbiano em pães. MELO (2003) observou uma redução de 2 ciclos log na contagem de

Staphylococcus sp. em queijo coalho coberto com filme incorporado com nisina.

As massas alimentícias, incluindo a do pastel, são muito consumidas no Brasil e em

diversos países. Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 2000), a

massa alimentícia úmida ou fresca é o produto que pode ou não ser submetido a um processo

de secagem parcial, de forma que o produto final apresente umidade máxima de 35% b.u.

A contaminação de massas frescas pode ser proveniente dos ingredientes utilizados na

formulação, que incluem farinha de trigo, ovos, água, bem como dos equipamentos, do

ambiente de processamento e dos manipuladores (MAYOU e MOBERG, 1992), caso não

sejam observadas as Boas Práticas de Fabricação.

Quanto aos critérios microbiológicos para este produto, está em vigor a Resolução da

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 2001), que prevê limites para

estafilococos coagulase positiva de 5,0x103 UFC/g, coliformes a 45°C de 1,0x102 NMP/g,

Bacillus cereus de 5,0x103 UFC/g e ausência de Salmonella sp./25g.

Em geral, os conservantes químicos, principalmente ácidos orgânicos e seus sais

(sorbatos, benzoatos e propionatos), são utilizados para inibir o crescimento microbiano e

aumentar a vida de prateleira de massas alimentícias frescas, juntamente com o uso do frio,

visto que esses produtos são embalados sem tratamento térmico.

O presente trabalho teve como objetivo desenvolver filmes antimicrobianos

incorporados com ácido sórbico e avaliar sua eficiência antimicrobiana em massas de pastel

sem conservante.









foram dissolvidos em solvente, já contendo o ácido sórbico diluído na concentração de 1, 2,

3, 4, 5 e 6%. A mistura foi homogeneizada, deixada em repouso por 30 minutos e espalhada

em placas de vidro, de forma a obter filmes com espessuras médias de 25 e 70µm. As placas

foram tampadas e mantidas sob refrigeração (5 ± 1°C) por 1 hora. Posteriormente, foram

mantidas por 20 minutos à temperatura ambiente (25 ± 2°C), antes de serem destampadas.

Após completa evaporação da acetona, os filmes foram removidos das placas, separados por

folhas de papel branco (50µm, 75 g.m-2) e estocados em temperatura ambiente para análises

posteriores. Também foram produzidos filmes sem ácido sórbico.

A espessura de cada filme foi obtida pela média de medidas tomadas em três pontos

dos filmes, ao acaso, utilizando micrômetro Mitutoyo (0-25mm). Todos os filmes foram

submetidos à luz ultra-violeta (Prodicil, 110V, 254nm), por 2 minutos em cada lado, para

posterior contato com as massas de pastel.

2.2. Preparação da massa de pastel

A massa de pastel foi produzida por uma empresa local de Viçosa-MG. `A farinha de

trigo, foram misturados gordura vegetal, cloreto de sódio, glutamato monossódico e água.

Como controle foi produzida uma massa contendo 0,18% de sorbato de potássio, conforme

utilizado pela empresa. As massas foram cortadas com 10 cm de diâmetro e conduzidas ao

Laboratório de Embalagem, sob resfriamento, em caixas de isopor.

2.3. Montagem do experimento

Filmes com 0, 1, 2, 3, 4, 5 e 6% de ácido sórbico, nas espessuras de 25 e 70µm,

foram intercalados em massas de pastel sem conservante. Como controle, massas adicionadas

de sorbato de potássio foram intercaladas com filmes de polietileno de baixa densidade

(PEBD). Para cada um dos 14 tratamentos, com filmes antimicrobianos, e o controle foram

montados sanduíches (filmes/massas), como apresentados na Figura 1. Esses sanduíches

foram acondicionados em sacos de PEBD e estocados sob refrigeração (8±1°C). As massas

submetidas aos referidos tratamentos foram analisadas nos tempos 0 e 40 dias de estocagem.

Figura 1 - Massa de pastel intercalada com filmes antimicrobianos.

2.4. Análises microbiológicas

As massas foram analisadas quanto à contagem de mesófilos aeróbios, psicrotróficos,

Staphylococcus spp, fungos filamentosos e leveduras, nos tempos 0 e 40 dias de estocagem.

Durante o período de estocagem, as massas foram analisadas visualmente quanto à presença

de fungos. Após os 40 dias, foram ainda efetuadas contagens de coliformes a 35°C, a 45°C e

E. coli. As análises foram realizadas conforme metodologias recomendadas pelo

Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (VANDERZANT e

SPLITTSTOESSER, 1992).

2.5. Determinação da atividade de água e do teor de umidade da massa

A atividade de água (Aa) foi determinada no aparelho Aqualab-CX2T a 25 ±2°C e o

teor de umidade (base úmida), conforme procedimento descrito na AOAC (1995).


O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado com 3

repetições, sendo os resultados submetidos a análise de variância. Quando pertinente, os dados

foram analisados por regressão com auxílio do software

Statistica 5.1.


Os resultados das análises microbiológicas, obtidos no tempo inicial para as massas

com ou sem conservante, apresentaram-se dentro dos padrões da legislação vigente (ANVISA

no 12, 2001). A contagem de microrganismos mesófilos aeróbios foi de 2,6x103 UFC.g-1 e

1,1x103 UFC.g-1 para as massas com ou sem conservante, respectivamente. Quanto aos

microrganismos psicrotróficos, Staphylococcus spp., fungos filamentosos e leveduras, as

contagens foram < 1,0x102 UFC.g-1, para ambas as massas.

Após 13 e 15 dias de estocagem, observou-se o aparecimento de fungos nas massas

intercaladas com filmes antimicrobianos com 0% de ácido sórbico (25 e 70µm) e com 1% de

ácido sórbico (25µm) (Figura 2), respectivamente, sendo então descartadas. As demais massas

mantiveram sem crescimento aparente de fungos até o final do experimento (Figura 3), sendo,

portanto, analisadas microbiologicamente, conforme resultados apresentados nas Figuras 4, 5

e 6, para mesófilos aeróbios, psicrotróficos e Staphylococcus spp., respectivamente.

Figura 2 - Massa de pastel intercalada com filme antimicrobiano (1% de ácido

sórbico - 25µm), após 13 dias de estocagem sob refrigeração 8±1°C).

Figura 3 - Massa de pastel intercalada com filme antimicrobiano(2% de ácido sórbico -

25µm), após 40 dias de estocagem sob refrigeração (8±1°C). Os dados mostraram que as massas com filmes de 70µm de espessura e concentrações

de 3, 4, 5 e 6% de ácido sórbico apresentaram, estatisticamente, crescimento microbiano

menor ou igual ao da massa controle. As massas intercaladas com filmes de 25µm, contendo

6% de ácido sórbico, apresentaram contagem de psicrotróficos aproximadamente 1 ciclo log

abaixo da determinada para a massa controle. Ao contrário, as contagens de mesófilos

aeróbios e de Staphyloccoccus spp. foram aproximadamente 1 ciclo log acima das

encontradas na massa controle.

Figura 4 - Contagem de mesófilos aeróbios nas massas de pastel após 40 dias de estocagem

sob refrigeração (8±1oC). A linha tracejada representa a contagem na massa controle.

Figura 5 - Contagem de psicrotróficos nas massas de pastel após 40 dias de estocagem sob refrigeração (8±1oC). A linha tracejada representa a contagem na

massa controle.

Figura 6 - Contagem de Staphylococcus spp. nas massas de pastel após 40 dias de estocagem sob refrigeração (8±1oC). A linha tracejada representa a contagem na massa controle.

As massas, independente do tratamento, apresentaram contagens <1,0 x 102 UFC.g-1

para fungos filamentosos e leveduras e <3,0 x 100 NMP.g-1 para coliformes a 35°C,

coliformes a 45°C e E.coli, após 40 dias de estocagem. Segundo BARBOSA-CÁNOVAS et

al. (1999), o ácido sórbico e seus sais são fundamentalmente efetivos contra fungos,

Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Vibrio parahaemolyticus, coliformes e bactérias

psicrotróficas deteriorantes, como Pseudomonas spp.

Os resultados mostraram que, após 40 dias de estocagem, a contagem de mesófilos

aeróbios nas massas intercaladas com filmes de 70µm de espessura e 3% de ácido sórbico

apresentou aumento de 0,5 ciclo log (Figura 4). Nesse mesmo período, as contagens de

psicrotróficos e Staphylococcus spp. apresentaram aumentos de 1,5 e 0,5 ciclos log,

respectivamente, em relação ao tempo inical. Contudo, esses valores foram próximos aos

encontrados para a massa controle, dentro dos padrões da legislação vigente (BRASIL, 2001).

Os resultados desse trabalho corroboram com os reportados por QUATTARA et al.

(2000a), de que o emprego de filmes antimicrobianos pode ser mais eficiente do que o uso

direto de antimicrobianos no alimento, pois o antimicrobiano migra lenta e gradualmente da

embalagem para a superfície do alimento, onde mantem-se em concentração necessária para

inibir o desenvolvimento de microrganismos. Na maioria dos alimentos frescos ou

processados, a contaminação microbiana ocorre, em maior intensidade, na superfície dos

mesmos, requerendo assim um controle efetivo do crescimento microbiano neste local

(PADGETT et al., 1998).

Os efeitos dos tratamentos, dos tempos de estocagem e da interação entre eles não

foram significativos (p=0,05) para a atividade de água e o teor de umidade das massas. Os

resultados médios de todos os tratamentos, nos tempos 0 e 40 dias de estocagem, estão

apresentados na Figura 7. Observou-se que a atividade de água foi, aproximadamente, 0,88 e

o teor de umidade 28%. Durante o período de estocagem, o filme protegeu o produto contra

perda ou ganho de umidade. A atividade de água da massa, juntamente com outros fatores,

contribui para a inibição do crescimento de microrganismos patogênicos, tais como, Bacillus

cereus, Salmonella spp. e Escherichia coli, que exigem uma Aa acima de 0,94,

aproximadamente (JAY, 1992). O pH das massas foi de 5,9, no tempo zero, com uma

variação, após 40 dias de estocagem, de 4,5 a 5,0, dependendo do teor de ácido sórbico

incorporado no filme em contato com o produto.

Médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente entre si, pelo teste F (p=0,05). Figura 7 - Atividade de água (Aa) e teor de umidade das massas de pastel, no tempo 0 e após 40 dias de estocagem sob refrigeração (8±1°C).

4. CONCLUSÕES

As massas de pastel intercaladas com filmes de 70µm, nas concentrações de 3, 4, 5 e

6% de ácido sórbico, apresentaram, estatisticamente, crescimento microbiano menor ou igual

ao da massa controle. As massas intercaladas com filmes de 25µm, contendo 6% de ácido

sórbico, apresentaram menor contagem apenas para psicrotróficos em relação à massa

controle. A atividade de água e o teor de umidade das massas, em todos os tratamentos, não

apresentaram variações durante o período de estocagem.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO 3

EFICIÊNCIA ANTIMICROBIANA E MIGRAÇÃO DO ÁCIDO SÓRBICO DO

FILME ATIVO PARA A MASSA DE PASTEL

RESUMO

Filmes ativos de 25 e 70 µm de espessura incorporados com 7 e 3 % de ácido sórbico,

respectivamente, foram intercalados em massa de pastel sem conservante e avaliados quanto à

migração do ácido sórbico e eficiência antimicrobiana nesse produto. Como controle foram

utilizadas massas contendo sorbato de potássio intercaladas com filmes de polietileno de

baixa densidade (PEBD). Os sanduíches (filmes/massas) foram acondicionados em sacos de

PEBD e estocados sob refrigeração (8±1°C). Após 40 dias de estocagem, as massas

intercaladas com filmes de 25µm/7% de ácido sórbico apresentaram redução de 2 ciclos log

na contagem de mesófilos aeróbios, porém, as contagens de psicrotróficos e Staphylococcus

spp. não apresentaram diferenças significativas (p=0,05). Nas massas intercaladas com

filmes de 70µm/3% de ácido sórbico, observaram-se reduções nas contagens de mesófilos e

psicrotróficos em 2 e 1,5 ciclos log, respectivamente. Nas massas controle as contagens de

mesófilos aeróbios, psicrotróficos e Staphylococcus spp. aumentaram em 1,5, 1 e 2 ciclos log,

respectivamente. Independente do filme, as contagens de fungos filamentosos e leveduras e de

estafilococos coagulase positiva foram < 1,0 X102 UFC.g-1 , enquanto as de coliformes a

35°C, coliformes a 45°C e E.coli foram < 3,0 x 100 NMP.g-1. Os coeficientes de difusão do

ácido sórbico nos filmes a 8±1°C, quando intercalados em massa de pastel, apresentaram

valores na ordem de 10-18m2/s. Os índices de migração do ácido sórbico nos filmes não

diferiram entre si (p = 0,05). A liberação máxima do conservante para a massa de pastel do

filme de 25µm/7% de ácido sórbico ocorreu no 20o dia de estocagem do produto, atingindo

0,07% e no filme de 70µm/3% de ácido sórbico no 9o dia de estocagem, atingindo 0,09%.

Ambos os valores encontram-se abaixo do limite máximo permitido pela legislação vigente.

1. INTRODUÇÃO

O crescimento microbiano na superfície de alimentos é uma das maiores causas de

deterioração e perdas de produtos processados e “in natura”. Agentes antimicrobianos são

adicionados diretamente nos alimentos para controlar o crescimento da microbiota presente,

prolongando, assim, a vida de prateleira dos produtos. Os alimentos também podem ser

tratados com aditivos em sua superfície, por imersão, spray ou espalhamento (CHUNG et al.,

2001). Essas técnicas de utilização de aditivos aumentam o número de etapas requeridas no

processamento.

O uso de filmes ativos contendo agentes antimicrobianos apresenta vantagens sobre os

métodos tradicionais de adição direta dos conservantes nos alimentos, visto que podem ser

liberados de maneira controlada, estando portanto em menores quantidades no alimento e

atuando, principalmente, na superfície do produto (WENG e HOTCHKISS, 1993;

APPENDINI e HOTCHKISS, 2002). Filmes antimicrobianos podem também simplificar o

processamento de alimentos por combinar embalagem e aplicação de aditivo em uma única

etapa.

A principal ação do filme ativo está baseada na liberação do antimicrobiano para a

superfície do alimento, mantendo sua concentração acima do nível crítico para controle do

crescimento de microrganismos indesejáveis no alimento (HAN, 2000; QUINTAVALLA e

VICINI, 2002), contudo, sem ultrapassar a concentração máxima permitida pelas normas

vigentes. A liberação de aditivos incorporados em diferentes polímeros vem sendo estudada

por diversos autores (REDL et al., 1996; UCHYTIL et al., 1996; HAN e FLOROS, 2000;

CHOI et al., 2001; CHUNG et al., 2001; BUONOCORE et al., 2003; CHOI et al., 2004).

Em massas alimentícias, incluindo a de pastel, a Agência Nacional de Vigilância

Sanitária regulamenta o uso do ácido sórbico e seus sais na concentração máxima de 0,1%

como ácido sórbico (BRASIL, 1999). Conservantes de ácidos fracos não têm implicações

tóxicas nas concentrações aplicadas, porém, atualmente, há uma demanda dos consumidores

no sentido de diminuir as concentrações de aditivos nos alimentos (OLIVEIRA, 2004).

O objetivo desse trabalho foi avaliar a migração de ácido sórbico incorporado em

filme antimicrobiano e seu efeito na conservação de massa de pastel sem conservante.









foram dissolvidos em solvente, já contendo ácido sórbico (3 e 7%) diluído. A mistura foi

homogeneizada, deixada em repouso por 30 minutos e espalhada em placas de vidro. As

placas foram tampadas e mantidas sob refrigeração (5 ± 1°C) por 1 hora. Posteriormente,

foram mantidas por 20 minutos à temperatura ambiente (25 ± 2°C), antes de serem

destampadas. Após completa evaporação do solvente, os filmes foram removidos das placas,

separados por folhas de papel branco (50 µm, 75 g.m-2) e estocados em temperatura ambiente

para análises posteriores.

Foram produzidos filmes contendo 7 e 3% de ácido sórbico, com espessuras médias de

25 e 70µm, respectivamente. A espessura de cada filme foi obtida pela média de medidas

tomadas em três pontos dos filmes, ao acaso, utilizando micrômetro Mitutoyo (0-25mm).

Todos os filmes foram submetidos à luz ultra-violeta (Prodicil, 110V, 254nm), por 2 minutos

em cada lado, para posterior contato com as massas de pastel.

2.2. Preparação da massa de pastel

A massa de pastel foi produzida por uma empresa local de Viçosa-MG. `A farinha de

trigo, foram misturados gordura vegetal, cloreto de sódio, glutamato monossódico e água.

Como controle foi produzida uma massa contendo 0,18 % de sorbato de potássio, conforme

utilizado pela empresa. As massas foram cortadas com 10 cm de diâmetro e conduzidas ao

Laboratório de Embalagem, sob resfriamento, em caixas de isopor, para posterior uso nos

experimentos.

2.3. Montagem do experimento

Filmes com 7 e 3% de acido sórbico, nas espessuras de 25 e 70µm, respectivamente,

foram intercalados em massas de pastel sem conservante. Como controle, massas adicionadas

de sorbato de potássio foram intercaladas com filmes de polietileno de baixa densidade

(PEBD). Para cada um dos 4 tratamentos com filmes antimicrobianos e o controle foram

montados sanduíches (filmes/massas), como apresentados na Figura 1. Esses sanduíches

foram acondicionados em sacos de PEBD e estocados sob refrigeração (8±1°C).

2.4. Análises microbiológicas

As massas foram analisadas quanto à contagem de mesófilos aeróbios, psicrotróficos,

coliformes a 35°C, coliformes a 45°C, E. coli, Staphylococcus spp., fungos filamentosos e

leveduras, conforme metodologias recomendadas pelo Compendium of Methods for the

Microbiological Examination of Foods (VANDERZANT e SPLITTSTOESSER, 1992). Essas

análises foram realizadas no tempo 0 e após 40 dias de estocagem sob refrigeração (8±1oC).

2.5. Extração e quantificação do ácido sórbico da massa

As massas foram analisadas com 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 20, 30 e 40 dias de estocagem sob

refrigeração (8±1oC). A extração do ácido sórbico da massa de pastel foi realizada de acordo

com a metodologia descrita por TFOUNI e TOLEDO (2002), com algumas modificações.

Dois gramas de amostra foram adicionados em 40 mL de etanol e após 3 horas de agitação

(agitador Fisatom, modelo 752) o volume foi completado para 100mL com água pura (18,2

ohm). Após 15 minutos de agitação, o sobrenadante foi filtrado em membrana de 0,22 µm.

Alíquotas de 20µL foram utilizadas para quantificação do ácido sórbico em

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), segundo metodologia de TFOUNI e

TOLEDO (2002). A análise foi conduzida em cromatógrafo SHIMADZU (modelo 10 AVP),

coluna Shim-pack ODS (4,6µm, 4,6 x 150 mm) e sistema de detecção UV. A fase móvel

consistiu de 81% de água, 17% de acetonitrila e 0,2% de tampão fosfato de amônio 0,005M

(pH 4,2 ajustado com ácido acético glacial), com fluxo de 1 mL.min-1, sendo a detecção

realizada em 260 nm.

Amostras de massa de pastel coletadas no comércio local também foram analisadas,

para efeito de comparação.

2.6. Experimentos de difusão

A massa fracional liberada foi determinada pela relação Mt/M∞ , sendo Mt a massa do

ácido liberada na massa de pastel em um tempo t e M∞ a massa de ácido liberada no tempo

infinito (valor de equilíbrio). Esses valores foram calculados e plotados em função do tempo.

Os coeficientes de difusão D (m2.s-1) do ácido sórbico nos diferentes filmes foram

calculados considerando o método de meia vida, dado pela seguinte equação (LIM e TUNG,

1997):

D=0,049h2/t0,5 (1)

onde h é a espessura do filme (m) e t0,5 o tempo (s) em que Mt = 0,5M∞.

A massa de ácido sórbico migrada do filme (95cm2) para a massa de pastel (Mm) e a

retida no filme (Mr) foram determinadas a partir dos valores da concentração do ácido

quantificados pela cromatografia líquida. O índice de migração (s ) do ácido sórbico foi

calculado pela equação:

s = Mm/(Mm+Mr) (2)


O experimento fo i conduzido em delineamento inteiramente casualizado com 3

repetições, sendo os resultados submetidos a análise de variância. As médias dos tratamentos

foram comparadas pelo teste F e, ou Tukey. Quando pertinente, os dados foram analisados por

regressão com auxílio do software Statistica 5.1.


Os resultados das contagens de mesófilos aeróbios, psicrotróficos e Staphylococcus

spp. estão apresentados na Figura 1. Observou-se, no tempo 0, que a contagem de mesófilos

aeróbios da massa controle foi aproximadamente 1,5 ciclo log inferior à da massa sem

conservante, indicando uma ação antimicrobiana imediata do ácido sórbico sobre esses

microrganismos. Porém, as contagens de psicrotróficos e Staphylococcus spp. não

apresentaram diferenças significativas (p=0,05) entre os tratamentos.

Aos 40 dias de estocagem, observou-se maior eficiência dos filmes ativos

antimicrobianos em relação ao método de adição direta do conservante na massa (controle),

para todos os microrganismos

As massas com filmes ativos de 25µm/7% de ácido sórbico e de 70µm/3% de ácido

sórbico apresentaram uma redução na contagem de mesófilos aeróbios de aproximadamente 2

ciclos log, enquanto que, nas massas controle, essa contagem aumentou em 1,5 ciclo log, após

40 dias de estocagem.

Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas (tratamentos dentro de cada tempo) ou minúsculas (tempos dentro de cada tratamento) não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey (p=0,05). Figura 1- Contagem de mesófilos aeróbios, psicrotróficos e Staphylococcus spp.

das massas intercaladas com filmes de PEBD (controle) e ativos (25µm/7% de ácido sórbico e 70µm/3% de ácido sórbico) no tempo 0 e após 40 dias de estocagem sob refrigeração (8±1oC).

A contagem de psicrotróficos aumentou cerca de 1 ciclo log na massa controle, após a

estocagem. Observou-se uma redução de 1,5 ciclo log na contagem desses microrganismos

nas massas intercaladas com filmes de 70µm/3% de ácido sórbico, porém, nas massas

intercaladas com filmes de 25µm/7% de ácido sórbico não houve diferença significativa

(p=0,05). Analisando a contagem de Staphylococcus spp., verificou-se que, após a estocagem,

houve aumento de 2 ciclos log na massa controle; entretanto, nas massas intercaladas com os

filmes antimicrobianos não houve diferença. GUILBERT et al. (1997) também observaram

maior atividade antimicrobiana do ácido sórbico sobre o crescimento de microrganismos,

quando incorporado em filmes à base de pectina/glúten/monoglicerídeos do que quando

adicionado diretamente no alimento. VOJDANI e TORRES (1989) reportaram que o sorbato

de potássio, quando adicionado diretamente no produto, interage com compostos presentes no

alimento, perdendo seu efeito protetor. Quando incorporado na matriz de filme à base de

metilcelulose e hidroxipropilmetilcelulose, o filme permitiu uma lenta difusão do sorbato para

a superfície do alimento, o que melhorou a proteção do mesmo. Segundo QUINTAVALLA e

VICINI (2002), pode ocorrer inibição ou redução da atividade do antimicrobiano, quando

adicionado diretamente no produto, por reação com diversas substâncias presentes no

alimento.

As contagens de estafilococos coagulase positiva, Escherichia coli e fungos

filamentosos e leveduras, após 40 dias de estocagem, permaneceram praticamente a mesma

do tempo 0, para todos os tratamentos, mostrando eficiência do ácido sórbico na inibição do

crescimento desses microrganismos (Tabela 1). Segundo BARBOSA-CÁNOVAS et al.

(1999), o ácido sórbico e seus sais são fundamentalmente efetivos contra fungos,

Staphylococcus aureus e coliformes.

Tabela 1- Análise microbiológica de massas de pastel intercaladas com filmes de PEBD (controle) e filmes ativos (25µm/7% de ácido sórbico e 70µm/3% de ácido

sórbico) no tempo 0 e com 40 dias de estocagem sob refrigeração (8±1°C).

Tempo 0 40 Dias Microrganismos

Controle 25µm/7% 70µm/3% Controle 25µm/7% 70µm/3%

Estafilococos coagulase positiva (UFC.g -

1)

< 1,0 x 102 < 1,0 x 102 < 1,0 x 102

< 1,0 x 102 < 1,0 x 102 < 1,0 x 102

Coliformes a 35°C

(NMP.g -1) 7,2 x 101 1,6 x 102 1,6 x 102

< 3,0 x 100 < 3,0 x 100

< 3,0 x 100

Coliformes a 45°C

(NMP.g -1) 9,0 x 100 3,7 x 101 3,7 x 101

< 3,0 x 100 < 3,0 x 100

< 3,0 x 100

Escherichia coli

(NMP.g -1) < 3,0 x 100 < 3,0 x 100

< 3,0 x 100

< 3,0 x 100 < 3,0 x 100

< 3,0 x 100

Fungos filamentosos e leveduras

(UFC.g -1)

< 1,0 x 102 < 1,0 x 1 02 < 1,0 x 102 3,0 x 102 7,0 x 102 6,0 x 102

A liberação do ácido sórbico dos filmes ativos com ácido sórbico para a massa de

pastel seguiu um modelo exponencial (Figura 2). Tal comportamento foi também observado

em várias pesquisas de difusão de solutos em polímeros (QUATARRA et al., 2000; CHOI et

al., 2001; CHOI et al.; 2004).

O filme ativo de 25µm/7% de ácido sórbico apresentou um comportamento mais

característico de filme ativo, com uma liberação lenta e gradual do aditivo para a massa de

pastel até atingir o equilíbrio, ou seja, o máximo de liberação, ocorreu aproximadamente, no

20o dia de estocagem do produto. Porém, o filme de 70µm/3% de ácido sórbico liberou o

conservante mais rapidamente, atingindo o máximo no 9o dia de estocagem,

aproximadamente. O consumidor, ao ingerir uma massa de pastel em contato com esses

filmes, terá consumido menor teor de conservante quanto menor for o tempo de estocagem do

produto, diferentemente da massa que tem o conservante adicionado diretamente no produto.

Figura 2 - Massa fracional de ácido sórbico liberada dos filmes ativos para a massa de pastel.

? Filme 25µm de espessura / 7% de ácido sórbico e ¦ Filme 70µm de espessura / 3% de ácido sórbico.

Os coeficientes de difusão do ácido sórbico nos filmes a 8±1°C, quando intercalados

em massa de pastel, apresentaram valores na ordem de 10-18m2.s-1, conforme mostrado na

Tabela 2. Esses valores foram aproximadamente 100 vezes menores que os registrados por

REDL et al. (1996), quando trabalharam com filmes de cera de abelha incorporados com

ácido sórbico. Vários autores, estudando a difusão em alimentos de umidade intermediária

(queijos, cremes e geléias), reportaram que o coeficiente de difusão do ácido sórbico a 25°C

alcançou valores na ordem de 10-10m2.s-1 (TORRES et al., 1985; GIANNAKOPOULOS e

GUILBERT, 1986). HAN e FLOROS (1998) estudaram a difusão de sorbato de potássio em

cubos de queijo mussarela e encontraram o valor de 6,74x10-11m2.s-1.

Observou-se que o coeficiente de difusão no filme 25µm/7% foi, aproximadamente, 10

vezes menor que no filme 70µm/3%. Provavelmente, a maior concentração do ácido na

matriz polimérica do filme de menor espessura promoveu a formação de pequenos cristais,

dificultando o processo de difusão. Contudo, o índice de migração do ácido sórbico nos

filmes não diferiu significativamente entre si (p = 0,05).

Tabela 2 - Caracterização dos filmes ativos quanto ao coeficiente de difusão do ácido sórbico (D), à massa de ácido sórbico retida no filme (Mr) e migrada para o alimento (Mm) e ao índice de migração do conservante (s). Filme

Ativo

D x 10-18

(m2.s-1)

Mr

(mg)

Mm

(mg) s

25µm/7% 9,11 a 6,69 9,53 0,59 a

70µm/3% 82,70 b 7,56 12,21 0,62 a

Nas colunas, médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente entre si, pelo teste F (p=0,05).

As massas de pastel intercaladas com filmes ativos apresentaram concentração de

ácido sórbico abaixo do limite de 0,1% permitido pela legislação vigente (BRASIL, 1999).

Após 40 dias de estocagem sob refrigeração (Tabela 3), o filme 25µm/7% de ácido sórbico

liberou menor concentração do conservante (0,07%) para a massa de pastel em relação ao

filme 70µm/3% de ácido sórbico (0,09%).

No caso das massas analisadas, disponíveis no mercado, observou-se alta variação na

concentração de ácido sórbico. As massas comerciais A e C apresentaram-se fora dos padrões

da legislação vigente. Percebeu-se também que, apesar do rótulo da massa comercial E

declarar presença de sorbato de potássio, o mesmo não foi detectado pela análise

cromatográfica. Provavelmente, outro conservante foi adicionado nessa massa, visto que sua

vida de prateleira é rotulada como 60 dias.

Tabela 3 - Concentração de ácido sórbico presente nas massas de pastel intercaladas com filme ativo e em massas de pastel comerciais, provenientes de diferentes empresas de Minas Gerais.

Produto Analisado Concentração de Ácido

Sórbico na Massa (%) Validade

Massa-25µm/7% ác.sórbico 0,07 40 dias

Massa-70µm/3% ác.sórbico 0,09 40 dias

Massa Comercial A* 0,12 40 dias

Massa Comercial B* 0,05 60 dias

Massa Comercial C* 0,20 60 dias

Massa Comercial D* 0,09 60 dias

Massa Comercial E* 0 60 dias

* Rótulo declara presença de sorbato de potássio.

Obs: concentração máxima permitida pela legislação vigente - 0,1% como ácido sórbico.

4. CONCLUSÕES

A utilização de filme antimicrobiano incorporado com ácido sórbico, apresentou-se

como uma tecnologia alternativa que garante a segurança microbiológica das massas de pastel

e evita o consumo do aditivo acima do permitido pela legislação. O prolongado período de

migração do ácido para a massa no filme de 25µm, em relação ao de 70µm, caracteriza-o

como efetivamente ativo. Além disso, com esse filme a concentração de ácido sórbico na

massa, após o período de estocagem, foi 30% menor que o permitido pela legislação,

atendendo aos anseios dos consumidores de ingerir menos conservante.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CONCLUSÃO GERAL

A maior eficiência dos filmes ativos antimicrobianos, obtida nesse trabalho, em

relação ao método de adição direta do conservante na massa, faz desses filmes uma tecnologia

alternativa que garante a segurança microbiológica das massas de pastel e evita o consumo do

aditivo acima do permitido pela legislação.

Nos estudos de difusão em sistema aquoso, o ácido sórbico teve a liberação máxima

do filme em um tempo que variou de 0,5 a 6 horas, a 25°C. Filmes com espessura de 25, 70 e

100 µm permitiram uma migração, em média, de 78, 68 e 50% do ácido incorporado para

água, respectivamente.

As massas de pastel intercaladas com filmes de 70µm, nas concentrações de 3, 4, 5 e

6% de ácido sórbico, apresentaram, estatisticamente, crescimento microbiano menor ou igual

ao da massa controle. Nas massas com filmes de 25µm contendo 6% de ácido sórbico, a

contagem de psicrotróficos foi inferior à da massa controle, porém as contagens de mesófilos

aeróbios e Staphyloccoccus spp. foram superiores em 1 ciclo log.

A atividade de água e o teor de umidade das massas não apresentaram diferenças

entre os tratamentos, ao longo do tempo de estocagem.

O prolongado período de migração do ácido para a massa no filme de 25µm, em

relação ao de 70µm, caracteriza-o como efetivamente ativo. Além disso, com esse filme a

concentração de ácido sórbico na massa, após o período de estocagem, foi 30% menor que o

permitido pela legislação, atendendo aos anseios dos consumidores de ingerir menos

conservante.

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MIRIAM FONTES ARAUJO SILVEIRA