UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica

Nanopartículas híbridas de polimetilmetacrilato (PMMA) e cloreto de

poli(dialildimetilamônio) (PDDA) - síntese, caracterização, atividade

antimicrobiana e formação de filmes

Luccas Missfeldt Sanches

Trabalho de Conclusão do Curso de Farmácia-

Bioquímica da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.

Orientador(a):

Prof.(a). Dr(a) Ana Maria Carmona Ribeiro

São Paulo

2017

SUMÁRIO

Pág.

Lista de Abreviaturas .................................................................

1

RESUMO ................................................................................ 2

1. INTRODUÇÃO…………………………………………………………………………………………………….. 3

2. OBJETIVOS…………………………………………………………………………………………………………. 4

3. MATERIAIS E MÉTODOS………………………………………………………………………………………. 5

4. RESULTADOS………………………………………………………………………………………………………. 11

5. DISCUSSÃO…………………………………………………………………………………………………………. 25

6. CONCLUSÃO………………………………………………………………………………………………………… 31

7. BIBLIOGRAFIA…………………………………………………………………………………………………….. 32

LISTA DE ABREVIATURAS

PMMA Polimetilmetacrilato

PDDA Cloreto de poli(dialildimetilamônio)

NPs Nanopartículas

Dz Diâmetro hidrodinâmico médio

P Polidispersidade

MEV Microscopia eletrônica de varredura

UFC Unidade formadora de colônia

CAQ Composto de amônio quaternário

MMA Metilmetacrilato

AIBN Azobisisobutironitrila

MBC Concentração bactericida mínima

TS Teor de sólidos

ATCC American Type Culture Collection

AMH Ágar Mueller-Hinton

DCM Diclorometano

QP Quantidade de partículas

Mw Massa molecular média ponderada

Mn Massa molecular média numérica

PDI Índice de polidispersidade

DP Grau de polimerização

RESUMO

Sanches, LS. Nanopartículas híbridas de poli(metilmetacrilato) e cloreto de

poli(dialildimetilamônio) - síntese, caracterização, atividade antimicrobiana e

formação de filmes. 2017. no. f. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-

Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo,

São Paulo, 2017.

Palavras-chave: nanopartículas, polímeros, antimicrobiano, filmes

INTRODUÇÃO: O aumento de patógenos resistentes a diversos antibióticos é uma

das três maiores ameaças à saúde pública global, segundo a Organização Mundial

de Saúde [1]. A busca por novos antimicrobianos em forma de nanopartículas (NPs)

[2] ou filmes finos [3] representa uma área de pesquisa estratégica. Recentemente

sintetizamos nanopartículas (NPs) de cloreto de poli(dialildimetilamônio) (PDDA),

um polímero antimicrobiano e poli(metilmetacrilato) (PMMA), um polímero

biocompatível [2] que poderão eventualmente ser aplicadas também em

revestimentos ou filmes antimicrobianos [3]. OBJETIVO: Caracterizar NPs de

PMMA/PDDA e seus filmes quanto a propriedades físicas e atividade

antimicrobiana. MATERIAIS E MÉTODOS: NPs foram sintetizadas por

polimerização em emulsão a partir do metacrilato de metila (MMA). O diâmetro

hidrodinâmico médio (Dz), a polidispersidade (P) e a mobilidade eletroforética das

NPs foram determinados por espalhamento dinâmico de luz. O potencial zeta foi

calculado a partir da mobilidade eletroforética pela equação de Smoluchowski.

Análise elemental, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e cromatografia por

exclusão de tamanho foram realizadas para caracterização das NPs. Os filmes

foram obtidos por revestimento rotacional ou deposição de NPs, seguidos ou não de

annealing e caracterizados por microscopia ótica, ângulo de contato e elipsometria.

A atividade microbicida ou antimicrobiana foi avaliada por plaqueamento seguido de

contagem de unidades formadoras de colônia (UFC) e por halos de inibição,

respectivamente. A atividade hemolítica foi determinada por absorbância do

sobrenadante após interação entre as NPs e as hemácias. RESULTADOS: NPs de

PMMA/PDDA carregadas positivamente, monodispersas e com alta estabilidade

coloidal mostraram alta atividade microbicida contra Escherichia coli e

Staphylococcus aureus, porém atividade menor contra Candida albicans e atividade

hemolítica superior à do PDDA livre. Os filmes obtidos a partir das NPs por

deposição ou revestimento rotacional também mostraram elevada atividade

bactericida. CONCLUSÃO: NPs de PMMA/PDDA com alta atividade microbicida são

versáteis e podem transferir essa atividade a filmes obtidos por simples deposição e

secagem. Essas características poderão resultar em diversas aplicações na área

biomédica e farmacêutica.

1. INTRODUÇÃO

Microorganismos são responsáveis por diversos problemas que afetam a

população humana, tanto por existirem diversas espécies que causam doenças,

quanto por causar a decomposição indesejada de produtos e materiais [4]. O

aumento de patógenos resistentes a diversos fármacos é uma das três maiores

ameaças à saúde pública global, segundo a Organização Mundial de Saúde, e

estima-se que infecções causadas por eles causem a morte de 23.000 pessoas

anualmente nos Estados Unidos da América, gerando um custo anual direto de US$

20 bilhões [1,5]. Na busca por antimicrobianos e novas estratégias para combater

esse quadro, o emprego de polímeros biodegradáveis é interessante, sendo

possível solucionar problemas como: instabilidade de antimicrobianos, efeitos

adversos, toxicidade e posologias com pequeno intervalo entre doses [5].

Nesse contexto, a utilização de polímeros pode ser realizada através da

obtenção de nanopartículas antimicrobianas (NPs), sendo os polímeros os

carreadores da substância ativa ou sendo eles mesmos o componente ativo [6].

Polímeros antimicrobianos biocompatíveis estão se tornando materiais de escolha

para desenvolvimento de diversas estruturas de importância biomédica contra

doenças infecciosas [7-11], sendo que duas rotas estão estabelecidas para a

produção de sistemas poliméricos com propriedades antimicrobianas: a primeira

envolve a interação física de um composto ativo em uma matriz polimérica, já a

segunda envolve a ligação covalente da substância de interesse em um carreador

polimérico [7].

Polímeros catiônicos geralmente apresentam uma alta atividade

antimicrobiana, devido a concentração de massa e carga, promovendo interações

eletrostáticas entre a estrutura catiônica e o envoltório e membrana celular dos

microorganismos, que possuem carga negativa. Essa interação causa distorções na

membrana, na parede celular ou em ambas [12].

Dentre os polímeros catiônicos antimicrobianos, há o cloreto de

poli(dialildimetilamônio) (PDDA), que possui um grupamento de amônio quaternário

em sua estrutura e apresenta uma boa atividade antimicrobiana [13-16]. Compostos

catiônicos de amônio quaternário (CAQ) são razoavelmente sustentáveis e já foram

extensamente estudados, o que incentiva seu uso [17]. Para a obtenção de NPs de

polimetilmetacrilato (PMMA) por polimerização em emulsão, há duas etapas:

nucleação e crescimento de partículas [18-21]. A polimerização ocorre nas gotículas

de monômero metilmetacrilato (MMA) dispersas em água na forma de microemulsão

[22], sendo que monômeros ligeiramente hidrofílicos como o MMA resultam em

gotículas menores, pois o MMA na interface atua como um cossurfactante para

eventuais surfactantes empregados na síntese [23]. Os radicais livres gerados pelo

iniciador podem reagir com o MMA em micelas e em gotículas de monômero e,

conforme o tamanho da cadeia dos oligorradicais aumenta, eles acabam se

difundindo para o interior das micelas ou das gotículas e, assim, dar continuidade

com o processo de polimerização [18].

Nanopartículas híbridas de PMMA e PDDA, sintetizadas por polimerização

em emulsão e na ausência de tensoativo apresentaram uma alta atividade contra

Escherichia coli e Staphylococcus aureus, reduzindo a contagem de unidades

formadoras de colônia por mililitro (UFC/ml) desses microrganismos em 8 e 7 logs,

respectivamente. No entanto, a atividade contra a levedura Candida albicans foi

consideravelmente menor, reduzindo o número de UFC/ml em 2 logs. As NPs

sintetizadas apresentaram um diâmetro hidrodinâmico médio entre 230 e 328 nm e

baixa polidispersidade (P < 0,10), indicando que as NPs obtidas apresentavam o

mesmo tamanho [2].

Antimicrobianos também são intensamente utilizados como revestimentos de

superfícies para impedir o crescimento bacteriano sobre diversos materiais,

podendo ser utilizados em embalagens de alimentos ou em materiais biomédicos,

como implantes ou próteses sintéticos. Nesse campo, polímeros antimicrobianos

associados à nanotecnologia apresentam propostas promissoras para o

desenvolvimento de tais revestimentos, além de serem compostos com uma menor

capacidade de induzir o aparecimento de bactérias resistentes, uma vez que atuam

diretamente na membrana e parede celular das bactérias [3].

O revestimento rotacional (spin coating) é uma técnica largamente utilizada

para a obtenção de filmes finos e com alta uniformidade estrutural, sendo um

método de alta reprodutibilidade e controle e sendo uma opção viável para o

revestimento de superfícies com polímeros [24]. Polímeros também podem recobrir

superfícies por processos físicos, como adsorção, ou químicos, como a formação de

ligações covalentes com a superfície do material [25].

O presente trabalho mostra a síntese, caracterização e atividade

antimicrobiana e hemolítica das nanopartículas poliméricas híbridas de PDDA e

PMMA [2] e a formação de filmes microbicidas a partir dessas NPs em diferentes

superfícies por revestimento rotacional ou simples deposição e secagem.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivos gerais

O trabalho tem por objetivos a obtenção, caracterização e determinação da

atividade antimicrobiana das nanopartículas híbridas de PDDA e PMMA e seus

filmes poliméricos depositados sobre diferentes superfícies.

2.2 Objetivos específicos

2.2.1 Nanopartículas

● Sintetizar, em emulsão, partículas de PMMA a partir de seu monômero na presença de diferentes concentrações de PDDA;

● Caracterizar as partículas quanto a carga, tamanho, polidispersidade,

massa molecular média e análise elemental das partículas (para detectar a efetiva incorporação do PDDA);

● Caracterizar o efeito da concentração de NaCl do meio sobre o tamanho das partículas por espalhamento de luz dinâmico;

● Estudar os efeitos das partículas sobre bactérias gram-positivas e gram-negativas;

● Avaliar a toxicidade contra hemácias de mamífero.

2.2.2 Filmes.

● Obter filmes por deposição e secagem de dispersões contendo NPs híbridas de PMMA e PDDA;

● Solubilizar as NPs em solventes apropriados para que filmes sejam obtidos por spin coating;

● Observar os filmes sob microscopia ótica e analisar sua superfície; ● Lavar os filmes em soluções aquosas com diferentes concentrações

salinas para avaliar o seu desprendimento ou alterações em sua superfície;

● Avaliar o extravasamento de material biocida dos filmes pelo método do halo de inibição do crescimento bacteriano;

● Avaliar, quantitativamente, o potencial biocida dos filmes, através de interações de soluções padrão bacterianas e subsequente contagem de unidades formadoras de colônia.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Síntese das dispersões

Para a síntese das dispersões de nanopartículas, foram realizadas reações

de polimerização em emulsão em banho seco a 85ºC conforme descrito em [2].

Inicialmente, manteve-se sob refluxo de N2 por 30 minutos, 100ml de soluções

aquosas contendo diferentes concentrações de PDDA (0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0

mg/ml) e 1,0 mmol/L de NaCl. A seguir, foram adicionadas duas quantidades

distintas do monômero MMA (6ml e 14ml, correspondente a 0,56 e 1,32 mol/L,

respectivamente) e 0,018 g do iniciador azobisisobutironitrila (AIBN). O refluxo de N2

foi mantido por mais 30 minutos e, em seguida, retirado, deixando-se a reação

ocorrer por mais 90 minutos. Após a síntese, o volume total obtido (cerca de 100 ml)

foi submetido à diálise exaustiva, por 48 horas em 4000 ml de água Milli-Q, com 3

trocas de água ao longo deste período. Ao todo, foram realizadas 12 sínteses,

obtendo-se 12 diferentes nanopartículas de PMMA/PDDA. As dispersões foram

nomeadas de acordo com as condições de síntese: uma letra foi dada para a

concentração de MMA (A para 0,56 mol/L e B para 1,32 mol/L) e um número para a

de PDDA (0,5 para 0,50 g/ml, 1 para 1,0g/ml e assim por diante). Dessa forma, as

suspensões passaram a ser denominadas A0,5, A1, A2, A3, A4, A5, B0,5, B1, B2,

B3, B4 e B5.

Figura 1: Estruturas químicas do PDDA, MMA e AIBN (da esquerda para a direita).

3.2 Determinação do tamanho e potencial zeta

As partículas foram caracterizadas por medidas de espalhamento de luz

dinâmico a 90° e determinação de potencial zeta por um equipamento ZetaPlus–

Zeta Potencial Analyzer (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY)

provido de um laser de 677 nm e espalhamento de luz dinâmico a 90° para

determinações de intensidade de luz espalhada, distribuições de tamanho e análise

de potencial-zeta. A polidispersidade das dispersões foi determinada por

espalhamento de luz quase-elástico seguindo técnicas matemáticas bem

estabelecidas [26]. O diâmetro hidrodinâmico médio foi obtido a partir da distribuição

log normal da curva de intensidade de luz espalhada contra o diâmetro. Potenciais

zeta foram determinados a partir da mobilidade eletroforética μ e da equação de

Smoluchowski dada por ζ = μη/ε, onde η and ε são a viscosidade e a constante

dielétrica do meio, respectivamente [26]. Para análise, as amostras foram diluídas

na proporção de 1:30 em solução de 1 mM de NaCl.

Para a análise do Dz em função da concentração de NaCl, as amostras foram

diluídas 1:30 em soluções de diferentes concentrações de NaCl, sendo elas: 1mM,

3mM, 5mM, 10mM, 50mM e 100mM. A análise no aparelho foi procedida da mesma

forma.

3.3 Cálculo da concentração de partículas

Determinou-se o teor de sólidos (TS) por gravimetria após a liofilização de

1ml de cada amostra. Com os dados obtidos, estimou-se o número de partículas por

unidade de volume. Tal cálculo foi realizado assumindo-se que cada partícula é

esférica e que ela continha predominantemente PMMA e, portanto, possui a mesma

densidade desse polímero (1,18g/ml) [27]. Assim, chega-se à seguinte equação:

𝑄𝑃 =6𝑇𝑆

𝜋𝜌𝑑3

em que QP é a quantidade de partículas por ml, TS é o teor de sólidos, ρ a

densidade do PMMA e d o diâmetro da partícula.

3.4 Análise elemental e cromatografia por exclusão de tamanho

A análise elemental foi realizada por um equipamento Perkin Elmer CHN 200

conduzido na central analítica do Instituto de Química da Universidade de São

Paulo, obtendo-se, assim, a porcentagem de carbono, hidrogênio e nitrogênio nas

amostras. Também obteve-se a massa molecular média a partir de uma

cromatografia por exclusão de tamanho. Para isso, foi utilizado um aparelho

Shimadzu HPLC/SEC class-VP.

3.5 Cálculo da concentração final de PDDA por volume de NPs ([PDDA]f)

A partir do teor de sólidos e da porcentagem de N da amostra, calculou-se a

[PDDA]f incorporada pelas NPs. Para isso, considerou-se a uma massa molar de

150.000 g/mol para o PDDA, uma vez que a embalagem do produto (Sigma-

Aldrich® - referência 409014-1L) indicava uma massa molar entre 100.000 e

200.000g/mol. Cada unidade monomérica do PDDA possui uma massa molar de

161,67 g/mol, logo, 1 mol de PDDA contém 13.003,2g de N em média. Assim, a

seguinte equação fornece o número de mols de PDDA por ml de dispersão de NPs:

[PDDA]f = (1.000TS x fN)/13.003,2

Na equação, fN corresponde a fração de nitrogênio obtida a partir da

porcentagem (fN = %N/100).

3.5 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Para a realização da microscopia eletrônica de varredura, alíquotas das

dispersões foram diluídas em água numa proporção de 1:10 e uma pequena fração

dessa diluição foi colocada sobre uma placa de silício e deixada em um dessecador

até secagem completa. Em seguida, as placas foram recobertas com ouro e as

imagens foram obtidas por um microscópio Jeol Scanning Electron Microscope

JSM-6460LV da Central Analítica do Instituto de Química da Universidade de São

Paulo.

A partir das imagens, calculou-se o diâmetro médio (D) das partículas pelo

software livre ImageJ.

3.6 Suspensão padrão de bactérias

Escherichia coli American Type Culture Collection (ATCC) 25922,

Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Candida albicans ATCC 80028 foram

reativados em placas de ágar Mueller-Hinton (AMH) (C. albicans foi cultivada em

ágar Sabouroud), as quais foram incubadas por 18-24 horas (C. albicans foi

incubada por 48h). A partir de colônias isoladas, foram preparadas suspensões de

microorganismos, padronizadas de acordo com o tubo 0,5 da escala de McFarland

(absorbância de 0,80 a 0,100 em um comprimento de onda de 625 nm), em solução

isotônica de D-glicose 0,264 mol/L.

3.7 Determinação de viabilidade celular na interação com NPs em dispersão

pelo método do plaqueamento e contagem de células viáveis.

500µL das suspensões padronizadas interagiram por 1h com 500 µL de

diferentes concentrações da dispersão de nanopartículas de PMMA/PDDA.

Após o tempo de interação, as amostras foram diluídas 10x seriadamente em

D-glicose até 100.000 vezes e 100 µL de cada amostra foi plaqueada em AMH (ágar

Sabouroud para C. albicans), incubadas a 37ºC por 24h (48h no caso de C.

albicans) e submetidas a contagem de unidades formadoras de colônias/ml

(UFC/ml) e consequente obtenção do log(UFC/ml). Ressalta-se que, para o cálculo

do log(UFC/ml), considerou-se, ao menos, 1 UFC/ml mesmo quando não haviam

unidades formadoras de colônia na placa. A determinação da concentração

bactericida mínima (MBC) foi dada pela análise do gráfico [PDDA] x log(UFC/ml) de

cada dispersão e foi definida como a primeira concentração nas curvas de

viabilidade em que foi detectado log(UFC/ml) = 0.

3.8 Determinação de hemólise em hemácias de carneiro.

Para a determinação da hemólise, 5 ml de hemácias de carneiro foram

centrifugados a 3000 RPM durante 3 minutos. Descartou-se, então, o sobrenadante

e o volume foi completado para 5 ml com solução isotônica de D-glicose 0,264

mol/L. O procedimento foi executado três vezes, sendo que, na última iteração, o

volume não foi completado com solução de D-glicose para a obtenção de uma papa

de hemácias. A partir da papa de hemácias, preparou-se uma suspensão de 1% de

hemácias em D-glicose 0,264 mol/L.

Interagiu-se, então 500μl de suspensão de NPs com 500 μl de suspensão 1%

de hemácias durante 1 hora. Em seguida, as interações foram centrifugadas a 3000

RPM por 3 minutos e a absorbância do sobrenadante a 414 nm foi medida. Os

dados obtidos foram comparados com dois controles: em um deles, substitui-se os

500μl de suspensão de NPs na interação por 500 μl de D-glicose 0,264 mol/L

(controle negativo) e, no outro, por 500 μl de Triton-X 1% em D-glicose 0,264 mol/L

(controle positivo). Considerou-se o controle negativo como 0% de hemólise e, o

positivo, como 100%.

A partir daí, a porcentagem de hemólise foi calculada da seguinte forma:

ℎ𝑒𝑚ó𝑙𝑖𝑠𝑒 =𝐴𝑝 − 𝐴𝐶−

𝐴𝐶+

em que Ap corresponde à absorbância da interação, AC+ corresponde à absorbância

do controle positivo e AC- corresponde à absorbância do controle negativo.

No experimento da hemólise em função do tempo, 5ml de suspensão de NPs

interagiram com 5ml de suspensão 1% de hemácias. A cada período de interação

(1, 2, 4, 6, 8, 10 e 24 h), 1 ml do tubo de interação era retirado, centrifugado a

3000rpm e a absorbância do sobrenadante a 414 nm era medida. Controles

positivos e negativos também foram feitos interagindo-se 5ml de suspensão 1% de

hemácias com 5 ml de Triton-X 1% (controle positivo) e 5 ml de D-glicose 0,264

mol/L.

3.9 Determinação da solubilidade em misturas de etanol e diclorometano

(DCM)

A 5 mg de NPs A5 liofilizadas, adicionou-se 500 μL de soluções de diferentes

proporções volumétricas de etanol em DCM (0, 25, 50, 75 e 100%). O resultado foi,

em seguida, vortexado até não se notar mais alterações no sistema.

3.10 Filmes por spin coating

1 ml da dispersão A5 foi liofilizado, obtendo-se em torno de 5 mg de material.

As partículas foram então diluídas em 0,5 ml de uma solução 50% (v/v) de etanol

em diclorometano, obtendo-se, assim, uma solução com 10 mg/ml de material

originado das NPs. A partir daí, 100 μL da solução foram depositados em lamínulas

de vidro ou wafers de silício, totalizando 1 mg de material a ser depositado.

Procedeu-se, então, com a rotação das lâminas a 3000 RPM por 30 s.

3.11 Filmes por deposição

20 μL de dispersão de nanopartículas A5 foram depositados em placas de

silício e secos overnight em um dessecador. Outros filmes foram obtidos a partir das

NPs A5, A4 e B5 por deposição de 200 μL (1 mg de nanopartículas) em lamínulas

de vidro (em torno de 4 cm2), 100 μL em placas de silício (aproximadamente 2 cm2)

e 50 μL em placas de poliestireno cortadas de barcos de pesagem de poliestireno (1

cm2). Ressalta-se que para atingir uma concentração de 5 mg/ml, a dispersão A4 foi

diluída na proporção 1:2 com água Milli-Q.

3.12 Annealing

Parte dos filmes obtida por deposição e spin coating foi separada para a

realização de annealing, processo em que se eleva a temperatura do sistema até

que ela ultrapasse a temperatura vítrea de um material, o que causa o relaxamento

de tensões moleculares [28]. Os filmes foram aquecidos a 120oC overnight, sendo

esta temperatura suficiente para atingir a temperatura vítrea do PMMA (105oC) [29].

3.13 Microscopia óptica

Os filmes formados em wafers de silício foram observados através de um

microscópio óptico.

3.14 Determinação do ângulo de contato

O ângulo de contato foi determinado a partir de imagens capturadas de uma

pequena gota depositada sobre os filmes.

3.15 Lavagem em diferentes concentrações salinas

Os filmes em placas de silício obtidos por deposição foram mergulhados em

soluções de diferentes concentrações salinas: 1, 10 e 100 mmol/L. A imersão da

placa foi completa em solução e, imediatamente após o total cobrimento da placa

pela solução, ela foi retirada. As amostras foram, então, analisadas por microscopia

como descrito em 3.13.

3.16 Espectrometria e determinação da espessura

A elipsometria foi realizada no ar utilizando-se um elipsômetro vertical DRE-

EL02. O ângulo de incidência foi de 70o e o laser (He-Ne) possuía um comprimento

de onda de 632,8 nm com uma área de incidência de 3 mm2. Os ângulos Ψ e Δ

foram medidos e um modelo de multicamadas foi utilizado para medição da

espessura (substrato, camada de NPs e ar). Usando-se a equação fundamental da

elipsometria indicada abaixo e cálculos iterativos da matriz de Jones, calculou-se a

espessura (d) usando-se os ângulos medidos [30].

eiΔ tanΨ = Rp/Rs = f(n,d,λ,φ)

Equação fundamental da elipsometria. Rp e Rs são os coeficientes de reflexão para as

polarizações paralelas e perpendiculares, sendo uma função do ângulo de incidência (φ),

comprimento de onda de incidência (λ), índice de refração n (sendo o índice de refração do

PMMA igual a 1,4906) e espessura (d) de cada camada do modelo.

3.17 Halo de inibição

As suspensões bacterianas padrão foram utilizadas para inocular placas de

AMH por meio de um swab e, imediatamente depois, depositou-se sobre o ágar

uma lamínula de vidro contendo os filmes obtidos por deposição ou spin coating da

dispersão A5. Os filmes foram esterilizados previamente por exposição a luz UV

durante 30 minutos. Outras placas foram inoculadas da mesma forma e, sobre o

ágar, depositaram-se lamínulas de vidro, placas de silício e placas de poliestireno

contendo os filmes descritos em 3.11. Houve esterilização prévia por UV durante 30

minutos. Para ambos os casos, incubou-se a 37oC durante 24 horas.

Os controles se deram através de lamínulas de vidro, placas de silício e

placas de poliestireno, além de lamínulas com filmes de PDDA e filmes de PMMA.

Para os filmes de PDDA, uma solução com 21,3 mg/ml foi preparada e 100 µL foram

depositados sobre a superfície da lamínula, 50 μL sobre a superfície da placa de

silício e 25 μL sobre a placa de poliestireno. O filme de PMMA foi feito a partir de

uma solução de PMMA em diclorometano em uma concentração de 3,4 mg/ml. A

partir daí, 100 µL foram depositados na lamínula e realizou-se o spin coating a 3000

RPM por 30 s.

3.18 Experimento de viabilidade celular para os filmes

60 μL de suspensão padrão bacteriana foram depositados sobre as lamínulas

de vidro contendo os filmes obtidos por deposição ou spin coating. O sistema foi

deixado para interagir durante 1 hora. Após o período de interação, as lamínulas

foram colocadas em tubos Falcon de 50 ml contendo 10 ml de solução de glicose

0,264 mol/L, os quais foram agitados vigorosamente. Em seguida, alíquotas de 100

μL foram retiradas e plaqueadas em AMH, assim como alíquotas de 100 μL de

diluições 1:10 e 1:100. As placas foram incubadas a 37oC durante 24 horas e a

contagem de UFC foi realizada, calculando-se, em seguida, UFC/mL e

log(UFC/mL). É importante ressaltar que, mesmo quando a quantidade de UFC/ml

era 0, considerou-se como 1 para que o cálculo do log fosse possível.

Controles contendo apenas lamínulas de vidro e lamínulas de vidro com

filmes de PDDA foram realizados. Para os filmes de PDDA, uma solução com 21,3

mg/ml do polímero foi preparada e 100 µL foram depositados sobre a superfície da

lamínula. A interação com a solução padrão, incubação e contagem de viáveis se

deu da mesma forma que os filmes de NPs.

4. RESULTADOS

Após o processo de síntese e diálise, obtiveram-se os potenciais zeta,

tamanhos médios e polidispersidades das amostras (Figura 2). As menores

concentrações de PDDA, independentemente da [MMA], apresentam uma elevada

polidispersidade, em função de duas populações de partícula de tamanho distinto.

Para [PDDA] ≥ 3 mg/mL, a polidispersidade indicou uma população de apenas um

Dz.

As curvas de potencial zeta (amostras com partículas apresentando Dz

superior a 1000 nm não tiveram essa propriedade aferida), polidispersidade e

tamanho em função da concentração de PDDA também foram determinadas (Figura

3).

Figura 2: Distribuições de tamanho para os particulados obtidos em diferentes

concentrações de PDDA e MMA. Dz é o diâmetro médio, p, a polidispersidade e ζ , o

potencial zeta médio.

Figura 3: Efeito da [PDDA] na síntese sobre o potencial zeta médio, Dz e P das NPs.

O teor de sólidos das amostras consideradas mais estáveis e sem nenhuma

floculação (apenas as com [PDDA] ≥ 3 mg/ml se enquadram) foi obtido e, a partir

daí, foi possível estimar a quantidade de partículas (QP) por ml (Tabela 1).

Dispersão Dz (nm) P ζ (mV) TS (mg/ml) QP/ml

A3 257 ± 2 0,06 ± 0,01 66 ± 2 5,5 ± 0,4 5,2.1011

A4 328 ± 2 0,03 ± 0,01 67 ± 1 10,1 ± 0,7 4,6.1011

A5 286 ± 2 0,02 ± 0,01 69 ± 4 4,4 ± 0,2 3,1.1011

B3 232 ± 1 0,07 ± 0,01 62 ± 2 7,3 ± 0,4 9,4.1011

B4 230 ± 1 0,04 ± 0,01 67 ± 2 5,8 ± 0,4 7,8.1011

B5 262 ± 1 0,08 ± 0,02 66 ± 2 7,2 ± 0,1 6,5.1011

Tabela 1: Dz, P, ζ , teor de sólidos e QP/ml dos particulados mais estáveis

A partir das amostras liofilizadas usadas na gravimetria, obteve-se a

porcentagem de C, N e H das NPs. Os resultados indicam que o PDDA foi

incorporado em todas as amostras analisadas, sendo que sua concentração

incorporada final ([PDDA]f) foi estimada (Tabela 2).

Dispersão %C %H %N [PDDA]f (μmol/L)

A3 53,8 ± 0,6 8,6 ± 0,1 2,4 ± 0,3 10

A4 55,4 ± 0,5 8,6 ± 0,1 1,5 ± 0,2 12

A5 51,5 ±0,0 9,0 ± 0,2 3,7 ± 0,1 12

B3 52,5 ± 0,0 8,8 ± 0,3 3,0 ± 0,3 17

B4 50,3 ± 0,0 9,2 ± 0,4 4,2 ± 0,4 19

B5 50,7 ± 0,2 9,3 ± 0,5 3,9 ± 0,3 22

Tabela 2: %C, %H e %N das NPs, além da [PDDA]f incorporada por elas

A partir da cromatografia por exclusão por tamanho, foi possível determinar a

massa molecular média ponderada (Mw) do polímero formado, além da massa

molecular média numérica (Mn) e, a partir daí, determinar o índice de

polidispersidade (PDI = Mw/Mn) e o grau de polimerização (DP), que indica o

número de resíduos de monômero por cadeia de polímero (Tabela 3).

Dispersão Mw (g/mol) PDI DP

A3 1173000 1,447 11716

A4 1065000 2,476 10650

A5 2872000 1,639 28686

B3 1514000 1,622 15122

B4 2362000 1,380 23592

B5 2056000 1,846 20535

Tabela 3: Mw, PDI, DP das partículas mais estáveis

O MEV permitiu averiguar o formato e o tamanho das nanopartículas (Figura

4). O novo tamanho calculado a partir das imagens permitiu um novo cálculo da

QP/ml, uma vez que esse dado é dependente do diâmetro das NPs (tabela 4).

Figura 4: Micrografias dos particulados de PMMA/PDDA obtidas por microscopia

eletrônica de varredura

NPs D (nm) QP/ml

A3 127 ± 12 4,33.1012

A4 112 ± 17 1,15.1013

A5 164 ± 32 1,62.1012

B3 151 ± 27 3,46.1012

B4 139 ± 22 3,47.1012

B5 143 ± 23 3,99.1012

Tabela 4: Diâmetro médio (D) das partículas calculado a partir das imagens de MEV e

QP/ml recalculada

A fim de estudar incongruências entre as medidas pelas imagens e por

espalhamento dinâmico de luz, novas medições de tamanho por espalhamento de

luz foram realizadas, variando-se a concentração de íons na solução. Dessa forma,

uma curva de Dz por [NaCl] foi construída (Figura 5) e observou-se uma queda no

Dz em função de um aumento na [PDDA].

µ

m

µ

m

µ

m

µ

m

µ

m

µ

m

Figura 5: Dz das partículas da amostra A3 em função da concentração de NaCl.

Ensaios quantitativos de determinação de atividade antimicrobiana foram

realizados com a obtenção das seguintes curvas de viabilidade celular em função da

concentração de PDDA (Figura 6, 7 e 8). A partir delas, obteve-se a MBC para as

bactérias (Tabela 5).

Figura 6: Comparação entre o efeitos das diferentes dispersões sobre E.coli. Todas as

dispersões foram comparadas com uma curva padrão em que apenas PDDA foi usado

como agente bactericida.

Figura 7: Comparação entre o efeitos das diferentes dispersões sobre S. aureus. Todas as

dispersões foram comparadas com uma curva padrão em que apenas PDDA foi usado

como agente bactericida.

Dispersão A3 A4 A5 B3 B4 B5 PDDAaq

MBC (E. coli)

(mg/ml)

0,014 0,011 0,013 0,013 0,014 0,012 0,009

MBC (S. aureus)

(mg/ml)

0,765 0,87 0,94 1,26 1,4 1,62 -

Tabela 5: MBC das NPs contra E. coli e S. aureus

Figura 8: Comparação entre o efeitos das diferentes dispersões sobre C. albicans. Todas

as dispersões foram comparadas com uma curva padrão em que apenas PDDA foi usado

como agente bactericida

A curva de hemólise causada em função da concentração de PDDA das NPs

em uma interação de 1h foi determinada e comparada com uma curva de hemólise

causada por PDDA em solução aquosa nas mesmas condições (Figura 9). Também

foi calculada a porcentagem de hemólise causada quando usou-se uma uma

concentração de PDDA igual a MBC (tabela 6).

Figura 9: Porcentagem de hemólise em função da concentração de PDDA das

nanopartículas ( ⃞ ) com interação de 1h em comparação com a porcentagem de

hemólise em função da concentração de PDDA em solução aquosa ( ⃝ ).

Dispersão A3 A4 A5 B3 B4 B5

%Hemólise

(E.coli) 2,3 2,3 2,2 1,6 1,5 0,9

%Hemólise (S.

aureus) 63 33 34 88 >75 82

Tabela 6: Porcentagem de hemólise em um período de interação de 1h utilizando-se

[PDDA] = MBC.

Para o experimento de hemólise em função do tempo, optou-se por fixar

concentrações de NPs que haviam gerado hemólise próxima a 0% no período de 1h

e uma curva da hemólise em função do tempo foi obtida (Figura 10).

Figura 10: Hemólise em função do tempo para concentrações fixas nas suspensões de

NPs comparadas com uma solução de PDDA aquoso. As concentrações usadas foram as

seguintes: A3, 0,153; A4, 0,174; A5, 0,188; B3, 0,25; B, 0,280; B5, 0,324; PDDAaq,

0,250mg/ml

Para a realização do spin coating, optou-se por avaliar se misturas de etanol

e diclorometano seriam capazes de atuar como um solvente para ambos os

polímeros (Figura 11).

Figura 11: imagens das NPs adicionadas de solventes contendo diferentes proporções de

etanol (EtOH) e DCM. O circulado em vermelho indicam material não solubilizadas.

Com as conclusões desse experimento, foram obtidos filmes através de spin

coating. Também foram feitos filmes por deposição e os resultados foram

comparados na Figura 12.

Figura 12: Imagens dos filmes obtidos por deposição (A, B), sendo A uma imagem da

borda e B uma imagem do centro ou, por spin coating (C, D).

O efeito do tipo de superfície sobre os filmes formados por deposição de

dispersões de NPs A5, A4 e B4 sobre superfícies de silício, vidro ou poliestireno foi

avaliado por fotos dos filmes após secagem submetidos ou não ao annealing

(Figura 13 e 14).

Figura 13: Filmes de PMMA e PDDA obtidos por secagem de dispersões de NPs

depositadas sobre lâminas de silício, lamínulas de vidro ou películas de poliestireno sem o

procedimento de annealing. A esquerda os filmes sobre silício, no centro os filmes sobre o

vidro e à direita, os filmes sobre o poliestireno.

Figura 14: Filmes de PMMA e PDDA obtidos por secagem de dispersões de NPs

depositadas sobre lâminas de silício, lamínulas de vidro ou películas de poliestireno após o

procedimento de annealing. A esquerda os filmes sobre silício, no centro os filmes sobre o

vidro e à direita, os filmes sobre o poliestireno.

O ângulo de contato dos filmes depositados sobre o silício também foi

avaliado resultando em ângulos baixos e indicativos de alta molhabilidade para os

filmes depositados (Figura 15).

Figura 15: Imagens de gotas de água sobre os filmes de NP A5 obtidos por deposição (A) e

por spin coating sobre lâminas de silício (B), ambos sem annealing.

Figura 16: Imagens de gotas de água sobre os filmes de NP A5, A4 e B4 obtidos por

deposição e sem annealing.

Os filmes obtidos por deposição em silício de A5 foram lavados em diferentes

concentrações salinas para se averiguar possíveis alterações na estrutura da

superfície (Figura 17). Também notou-se um descolamento dos filmes após as

lavagens.

Figura 17: Imagens dos filmes de A5 após lavagem em soluções salinas. A letra A indica

que o filme foi lavado em uma solução 1 mM de NaCl, B, 10 mM e C, 100 mM. O número 1

indica que é uma imagem da região da borda, enquanto que 2, indica uma imagem do

centro do filme.

Experimentos de elipsometria permitiram estimar a espessura dos filmes A5

obtidos por spin coating (com e sem annealing) (Tabela 7). As espessuras estiveram

em torno de 100 nm.

Amostra Δ(o) Ψ(o) Espessura (nm)

A5 (1) 29,4513 33,3640 102,5

A5 (2) 38,6184 33,4539 96,4

A5 an. (1) 17,0239 36,2736 117,7

A5 an. (2) 23,4822 35,7769 111,2

Tabela 7: Ângulos elipsométricos (Δ e Ψ) e espessuras de filmes de PMMA/PDDA para

duas amostras diferentes sem annealing (1 e 2) e duas com annealing (1 e 2). A espessura

do filme foi calculada pela equação fundamental descrita em 3.16.

Experimentos de halo de inibição permitiram estabelecer a hipótese de que

não há o extravasamento de material antimicrobiano das NPs. Inicialmente, o

experimento foi feito contra a bactéria E. coli (Figura 18) e, em seguida, contra S.

aureus (Figura 19).

Figura 18: Halos de inibição contra E. coli, sendo A proveniente dos filmes A5 por

deposição e B, por spin coating. C corresponde ao controle de PDDA e D, ao controle de

PMMA.

Figura 19: Halos de inibição contra S. aureus, sendo A proveniente dos filmes A5 por

deposição e B, por spin coating. C corresponde ao controle de PDDA e D, ao controle de

PMMA.

Observando-se os controles em que foi usada uma lamínula de vidro sem

nenhum tipo de filme, nota-se que houve crescimento de S. aureus por debaixo da

lâmina de vidro de controle. O que reforça o efeito antimicrobiano do filme (Figura

20).

Figura 20: Controle das lamínulas de vidro sem filme. A imagem A foi obtida contra E. coli,

enquanto que B, contra S. aureus, sendo C um aumento de B.

Também desejou-se avaliar possíveis efeitos da superfície em que o filme se

encontra na formação de halos de inibição (Figura 21 e Figura 22). Para todas as

superfícies avaliadas, não houve formação de halo contra E. coli ou S. aureus.

Figura 21: Halos de inibição contra E. coli de filmes de NP depositados em diferentes

superfícies. O quadrado maior transparente corresponde a superfície de vidro. A superfície

cinza/prateada corresponde ao wafer de silício e o quadrado branco corresponde ao

poliestireno.

Figura 22: Halos de inibição contra S. aureus de filmes de NP depositados em

diferentes superfícies. O quadrado maior transparente corresponde a superfície de vidro. A

superfície cinza/prateada corresponde ao wafer de silício e o quadrado branco corresponde

ao poliestireno.

Para que a real capacidade biocida dos filmes fosse avaliada, experimentos

quantitativos foram realizados utilizando-se filmes sobre as lamínulas de vidro

(obtidos apenas por deposição), tanto contra E. coli, quanto S. aureus e a elevada

atividade microbicida pode ser observada na Tabela 8.

Filme Microorganismo Log (UFC/mL)

(controle)

Log (UFC/mL) (após

interação)

A5 E. coli 7,15 0

A5 S. aureus 7,90 0

A4 E. coli 7,07 0

A4 S. aureus 8,16 0

B4 E. coli 7,07 0

B4 S. aureus 8,16 0

Tabela 8: Atividade bactericida de filmes de PMMA/PDDA obtidos por deposição de NPs.

5. DISCUSSÃO

5.1 Caracterização das NPs

O aumento de concentração de PDDA na síntese levou a uma redução de Dz e polidispersidade com um aumento concomitante do potencial zeta (Figuras 2 e 3). As nanopartículas sintetizadas com [PDDA] < 3 mg/ml tiveram valores de polidispersidade e Dz elevados. Para concentrações de polímero catiônico iguais ou superiores a 3 mg/ml, tanto tamanho quanto polidispersidade atingem valores semelhantes, indicando NPs semelhantes entre si apesar das diferentes condições

de síntese. Além disso, pela figura 2, nota-se que para [PDDA] ≥ 2mg/ml e [MMA] = 0,56M e para [PDDA] ≥ 3 mg/ml e [MMA] = 1,32M, as nanopartículas são praticamente monodispersas. É importante ressaltar que apenas para [PDDA] > 3 mg/ml foram obtidas dispersões em que não houve o acúmulo de precipitados ou floculação no fundo do recipiente de armazenamento, indicando que essa condição de síntese é fundamental para obtenção de NPs com alta estabilidade coloidal.

Quanto ao potencial zeta, foi notado um certo aumento do seu valor com o aumento da concentração de PDDA, o que era uma constatação esperada, pois, se o PDDA está realmente sendo incorporado, quanto maior sua concentração no ambiente de síntese, maior deve ser sua incorporação durante a polimerização do MMA. Além disso, notou-se que as partículas sintetizadas com 0,56M de MMA possuíam um potencial maior do que as sintetizadas com maior quantidade de PDDA, o que também está de acordo com o esperado, uma vez que há uma maior concentração relativa de PDDA/MMA.

Dessa forma, foi proposto que o PDDA atua como um estabilizante durante a síntese, talvez impedindo que as gotículas se fundam durante a polimerização. Além disso, o potencial-zeta elevado das partículas também impede que elas se aglomerem após a síntese por conta de repulsões eletrostáticas, mantendo-as como unidades individuais.

Com um aumento na concentração de PDDA, há uma redução no número de partículas por volume, a qual não está relacionada a um aumento do tamanho das partículas. É possível notar também que as dispersões obtidas com a maior concentração de MMA possuem um número maior de partículas por unidade de volume, o que era esperado.

Além disso, pode-se perceber que as dispersões preparadas com maiores concentrações de PDDA também foram as que mais incorporaram esse polímero e que as dispersões preparadas com 1,32M de MMA foram as que obtiveram uma maior incorporação final (tabela 2), o que pode ser explicado pelo fato de haver uma maior quantidade de MMA disponível no ambiente da síntese para incorporar o PDDA.

Pelas imagens de MEV (figura 4), observa-se que as NPs possuem um formato predominantemente esférico e baixa polidispersidade (todas com tamanhos semelhantes), como medido por espalhamento de luz. No entanto, a medição de tamanho apresentada pelo MEV sugere que as partículas são consideravelmente menores do que o medido pelo espalhamento de luz dinâmico, possuindo, no caso da amostra A3, 127 nm, enquanto que as medidas anteriores apontavam para um diâmetro de 257 nm (Tabela 1). Após análise da variação do Dz em função da [NaCl], observou-se que o diâmetro médio das partículas decresce com o aumento de [NaCl]. Uma possível explicação para esse fato é que a parte esférica observada no MEV é composta por PMMA, sendo que o PDDA está incrustado nessas esferas como se fossem cordas. Em baixas concentrações de íons, as cargas positivas do PDDA estão livres e repelem as cargas de outras moléculas de PDDA também presas na partícula, portanto, as molécula ficam esticadas. Isso faz com que o raio da NP seja compreendido pelo raio do core de PMMA somado ao comprimento das moléculas de PDDA. Já, com o aumento da concentração de NaCl, as cargas positivas do PDDA são, de certa forma, neutralizadas pelo íons Cl-, o que diminui as forças repulsivas entre as cadeias de PDDA, fazendo que elas deixem de assumir a forma esticada e colapsem. Nesse caso, o raio da partícula é determinado,

basicamente pelo core de PMMA, enquanto que as moléculas de PDDA pouco contribuem para essa medida. Isso pode ser melhor compreendido na seguinte figura (figura 23).

Figura 23: Representação gráfica das NPs mostrando a estrutura de core de PMMA com

shell de PDDA incrustado em sua superfície

Essa ideia fez com que os cálculos da quantidade de partículas por ml de

dispersão na tabela 1 tivessem que ser refeitos, uma vez que são dependentes do

diâmetro das NPs e, em 3.3, assumiu-se que a densidade das NPs era muito

próxima à densidade do PMMA. Utilizar uma medida de diâmetro que inclua o core

de PMMA e as moléculas de PDDA resultaria em uma medida errônea da QP/ml,

pois a densidade da partícula não seria próxima a densidade do PMMA. Assim,

percebe-se que a QP/ml (Tabela 4) é, na verdade, significativamente maior do que a

apresentado na Tabela 1.

5.2 Atividade antimicrobiana das NPs

A determinação da MBC (Tabela 5) indica que que as nanopartículas têm um

efeito muito semelhante ao PDDA livre contra E. coli, sendo discretamente menos

eficientes. Essa redução na eficiência provavelmente está relacionada à maior

superfície de contato do PDDA livre e ao fato de que o PMMA acaba por englobar

partes das moléculas de PDDA, diminuindo, assim, a carga efetiva. Além disso, para

as diferentes NPs obtidas, os efeitos bactericidas foram semelhantes, o que sugere

que as NPs atuam de forma idêntica e dependente da quantidade de PDDA

carregada por elas.

Já no ensaio contra S. aureus, as NPs se mostraram ligeiramente mais

efetivas do que o PDDA em solução e o efeito bactericida contra S. aureus ocorreu

em concentrações de PDDA bem maiores do que as necessária para se obter

mesmo efeito contra E. coli. Ainda assim, uma redução de até 7 logs também foi

obtida para a maior concentração de PDDA. Percebe-se, novamente, pela

determinação da MBC, que as condições de síntese pouco influem no efeito

bactericida (Tabela 5 e Figura 7)

O efeito contra a viabilidade celular da C. albicans se mostrou muito menor

em comparação com aquele contra a viabilidade celular de bactérias, sendo que a

redução na contagem de viáveis não passou de 3 logs (Figura 8). Além disso, os

resultados foram sempre inferiores ou muito próximos à solução de PDDA, o que

pode se dar pelas mesmas razões do ensaio contra E. coli. Uma vez que nenhum

particulado foi capaz de reduzir o log(UFC/ml) a zero, não determinou-se uma

concentração microbicida mínima contra esse microrganismo. No entanto,

comparando-se o PDDA livre às NPs, notam-se diferenças na atividade contra a

levedura, sendo que as nanopartículas aparentam ser menos efetivas. Dessa forma,

pode-se inferir que a mobilidade das moléculas de PDDA pode ter um papel

fundamental para o efeito desse composto contra essas células.

5.3 Atividade hemolítica das NPs

Os resultados da hemólise em função da [PDDA] (Figura 9) informam que,

para o período de 1h, as nanopartículas carregando uma concentração próxima a

0,1 mg/ml de PDDA podem provocar uma hemólise significativa e acima de 50%,

enquanto que o PDDA livre apresentou uma baixa porcentagem (próxima a 0%) de

hemólise para as mesmas concentrações. Verificando-se a hemólise na MBC de

ambas bactérias (Tabela 6), percebe-se que na MBC para E. coli, a porcentagem de

hemólise não ultrapassou 2,3%, independentemente da NP avaliada. Já utilizando-

se a MBC para S. aureus, a porcentagem de hemólise mínima foi de 33%,

chegando até a 88%. Isso indica que para serem efetivas contra S. aureus, as NPs

apresentariam toxicidade relevante em um organismo de mamífero, enquanto que,

para serem efetivas contra E. coli, as NPs apresentam uma baixa toxicidade contra

hemácias de mamífero. Assim, limitam-se os microorganismos em que se possa

utilizar uma possível terapia com as NPs.

A Figura 10 mostra que, usando-se o tempo como variável, as nanopartículas

provocam efeitos semelhantes de hemólise aos do PDDA aquoso. Nesse caso, as

NPs foram utilizadas em concentrações que provocaram uma hemólise próxima a

0%. Além disso, percebe-se um aumento da hemólise ao decorrer do tempo para

todas as formas avaliadas. A hemólise total após 24h não ultrapassou 12% em

nenhuma das amostras, sendo portanto baixa. Assim, apesar de o tempo influir na

hemólise, seu efeito é pequeno e menos notável do que o efeito da concentração

indicado pela Figura 9, sendo que não foram encontradas grandes diferenças entre

o PDDA livre e as NPs nessa comparação.

5.4 Obtenção e caracterização dos filmes

A determinação de um solvente que seja comum, tanto ao PDDA, quanto ao

PMMA, é uma etapa importante para que o processo do spin coating pudesse ser

realizado. A escolha do solvente não é um processo trivial, uma vez que o PDDA é

um polímero policatiônico solúvel em água [31], enquanto que o PMMA é apenas

solubilizado em solventes apolares [32]. Assim, buscou-se uma mistura que tivesse

uma polaridade adequada para ambos os polímeros utilizando-se uma mistura de

etanol e diclorometano. Os resultados apresentados pela Figura 11 mostram que

quando se usa apenas etanol ou apenas diclorometano, a solução fica turva,

indicando a não dissolução. Quando se usa 25% ou 75% de etanol em

diclorometano, ainda é possível notar algumas partículas, o que indica que a

solubilização não foi completa. Entretanto, usando-se uma mistura com proporções

volumétricas iguais dos solventes, obteve-se uma dissolução completa do

particulado. A partir de então, foi determinado que essa seria a proporção a ser

utilizada para solubilização das NPs e subsequente obtenção de filmes por spin

coating.

Os filmes obtidos por deposição não possuem grande uniformidade, o que é

percebido pela diferença de tonalidades entre diferentes regiões nas imagens

obtidas por microscopia ótica (Figura 12). Isso indica que a deposição não é

uniforme e que foram formadas regiões com um grande acúmulo de material . Além

disso, nota-se que há um grande acúmulo de material na borda, o que pode ser um

efeito da tensão superficial durante a secagem do produto. Já os filmes obtidos por

spin coating, por sua vez, são muito mais uniformes, com uma deposição de

material que aparenta ser bastante uniforme e regular. Imagens da borda não são

possíveis nesse caso, pois o filme polimérico cobriu toda a superfície da placa de

silício, diferentemente dos filmes obtidos por deposição.

Analisando-se as diferentes superfícies para deposição dos filmes (Figura

13), foi observado que as alíquotas de NPs depositadas possuem um melhor

espalhamento sobre as superfícies de vidro e sílica, quando comparadas ao

poliestireno. Isso faz com que, no caso do poliestireno, as NPs se concentrem em

uma menor área, e com maior espessura, o que pode fragilizar o filme e pode ter

sido a causa da formação de rachaduras visíveis a olho nu. Quanto à disposição do

material depositado, é possível visualizar que tanto no silício, quanto no poliestireno,

a deposição se concentrou no centro da região em que havia líquido anteriormente.

Ainda no caso do silício, é possível notar que a deposição de material cresce

gradualmente das bordas ao centro, uma vez que a dispersão de NPs havia coberto

toda a superfície do silício. Quanto ao vidro, a dispersão cobriu quase que toda a

superfície, porém a deposição aparentou ser pouco uniforme, formando regiões com

diferentes espessuras. O processo de annealing aparentou não modificar

visualmente os filmes sobre silício e vidro (Figura 14). Sobre poliestireno, o

annealing levou a um aumento das rachaduras e até ao descolamento do filme das

superfícies, efeito notado principalmente na borda do filme A4 e o filme B4 (Figura

14).

O ângulo de contato médio para os filmes A5 obtidos por deposição foi de 8o

± 1o, enquanto que, para os obtidos por spin coating, o ângulo médio foi de 14,5o ±

0,5o. Assim, nota-se que o valor obtido é muito inferior àquele de filmes de PMMA,

que é de 68o [33], indicando que a superfície do filme é pouco hidrofóbica. Esse fato

provavelmente se deve às cargas positivas presentes no PDDA, favorecendo,

assim, interações do filme com as moléculas de água e sugerindo que o PDDA está

presente na superfície do filme e não foi totalmente coberto pelo PMMA. Para o

filme obtido por deposição de A4, o valor foi de 14,8o ± 1o e para o de B4, 15,5o ±

0,5o.

As imagens indicam que as lavagens com soluções de diferentes [NaCl]

levam a um desprendimento de placas do filme (imagens A2 e B2 da Figura 17),

pois são formadas rachaduras que levam a formação e separação de placas.

Também nota-se que a borda do filme perde sua característica de circunferência

bem definida, o que deve ser um resultado da movimentação de material. Além

disso, é importante ressaltar que o aumento da concentração salina levou à

formação de estruturas com um formato ovalado e centro com pouca deposição de

material. O tamanho e o número dessas estruturas cresce com a concentração de

NaCl da lavagem. Mais estudos precisam ser realizados para entender a origem e o

processo de formação dessas estruturas, no entanto, é um ponto que pode ser

explorado com mais profundidade e pode ser uma propriedade de interesse dos

filmes. O descolamento dos filmes com o aumento da concentração salina revela a

importância da interação eletrostática entre o PDDA e a superfície de silício de

carga oposta para manutenção da aderência do filme ao substrato.

O experimento de elipsometria pode apenas ser realizado com os filmes A5

que foram obtidos por spin coating, por esses filmes terem uma superfície mais

uniforme e que permite a realização do experimento. A espessura dos filmes foi de

99,5 ± 3,1 nm para os filmes sem annealing e 114,5 ± 3,3 nm com annealing. O

annealing causou uma diminuição do ângulo Δ, mostrando que talvez a superfície

do filme seja alterada pelo aquecimento, o que muda a interação do filme com a luz

incidente.

5.5 Atividade bactericida dos filmes

Não houve a formação de halos em nenhuma condição testada, inclusive nos

controles em que foi feito um filme de PDDA e um filme de PMMA (Figura 18, 19, 21

e 22). Isso pode indicar diferentes processos: não há liberação de qualquer tipo de

material bactericida, o material bactericida que é liberado não consegue se difundir

pelo ágar ou, se há difusão, ela não é suficiente para a formação de um halo.

Apesar de os resultados não serem conclusivos por haverem diferentes hipóteses

que expliquem o resultado, eles apontam para a possibilidade de que não haja o

extravasamento de material biocida pelo filme. No entanto, para confirmar essa

possibilidade, diferentes experimentos precisam ser feitos para haver uma

caracterização efetiva do material.

Em uma análise criteriosa do experimento do halo de inibição, notou-se que

no caso do S. aureus houve crescimento bacteriano (notado pelas estrias na

imagem C da Figura 20) por debaixo do vidro sem nenhum tipo de filme usado como

um dos controles. O mesmo não ocorreu com E. coli, mesmo ambas as bactérias

sendo anaeróbicas facultativas [34, 35]. Dessa forma, há um indício de que os

diferentes filmes inibem o crescimento do S. aureus, reforçando a característica

antimicrobiana dos filmes.

A redução de logs(UFC/ml) (Tabela 8) em comparação com o controle sem

os filmes representa uma medição precisa da atividade microbicida. Dessa forma,

nota-se que os filmes conseguem reduzir a carga bacteriana de aproximadamente

107 UFC/ml até 0 UFC/mL no caso de E. coli e 108 UFC/ml até 0 UFC/ml no caso de

S. aureus. Isso indica uma redução bastante substancial na carga microbiana e

pode apontar para potencial de aplicação para os filmes híbridos de PMMA/PDDA.

Uma vez que as possíveis aplicações dos filmes são ex vivo, a questão da

toxicidade hemolítica apresentada pelas NPs torna-se menos relevante, supondo-se

que não há o extravasamento de material.

6. CONCLUSÃO

NPs híbridas catiônicas de PDDA e PMMA monodispersas podem ser obtidas

por polimerização em emulsão em uma síntese envolvendo apenas um recipiente e

na ausência de surfactantes. São formadas nanopartículas que apresentam um core

de PMMA com moléculas de PDDA incrustadas em sua superfície.

A atividade bactericida das NPs se mostrou elevada, podendo reduzir cargas

próximas a 108 UFC/ml de E. coli ou S. aureus até uma contagem de 1 UFC/ml.

Quando avaliada contra células de levedura, a atividade se mostrou menor e a

redução na contagem de unidades formadoras de colônia não foi superior a 3

logs(UFC/ml), indicando uma redução de 1000 vezes no número de UFC/ml.

Os estudo de atividade hemolítica em função da concentração indicam que a

toxicidade contra hemácias das NPs foi aumentada em relação a soluções com

PDDA livre. No entanto, quando avaliado o efeito do tempo, não foram notadas

diferenças significativas no efeito hemolítico das NPs em comparação com PDDA

livre. Na MBC contra E. coli, as NPs apresentaram uma baixa atividade hemolítica,

enquanto que na MBC contra S. aureus, a atividade foi elevada, o que sugere que

as NPs podem não ser viáveis in vivo contra este microorganismo. Por conta da

hemólise causada pelas NPs em concentrações mais elevadas, aplicações in vivo

devem ser planejadas e essa questão deve ser levada em consideração.

A formação de filmes poliméricos sobre diferentes superfícies a partir das

NPs indica uma versatilidade do material e sugere que aplicações ex vivo podem

ser viáveis. Os filmes obtidos por spin coating possuem aproximadamente 100 nm

de espessura e, independentemente do método empregado para obtenção dos

filmes, eles possuem características bastante hidrofílicas, o que provavelmente se

deve a presença de PDDA na interface do filme com o ar. Além disso, conclui-se

que filmes obtidos por deposição possuem menos uniformidade se comparados aos

filmes por spin coating.

Ainda assim, preferiu-se trabalhar com os filmes obtidos por deposição, dada a extrema facilidade de obtenção. Sobre as diferentes superfícies, houve um maior espalhamento da dispersão sobre superfícies hidrofílicas e isso levou ao recobrimento de uma maior área com uma deposição menos concentrada, o que pode auxiliar a não serem formadas rachaduras. Além disso, ao serem lavados com diferentes concentrações salinas, houve a formação de estruturas regulares e uniformes nos filmes por deposição, o que é uma propriedade que pode levar a implicações ainda não estipuladas.

Os experimentos de halo de inibição indicam que há a possibilidade de os filmes possuírem um potencial bactericida, sem o extravasamento significativo de substâncias ativas. Já os experimentos quantitativos mostram que o efeito biocida é bastante acentuado, havendo reduções de ao menos 7 logs no número de UFC/mL.

Assim, conclui-se que as NPs formadas possuem uma alta atividade biocida e que essa atividade não é perdida quando utilizadas para a formação de filmes. Isso mostra a versatilidade do material obtido, sendo que possíveis aplicações podem advir dessas características.

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25/09/2017 Luccas Missfeldt Sanches 19/09/2017 Ana Maria Carmona-Ribeiro