NANOPARTICULAS POLIMERICAS PREPARAÇÃO E

APLICAÇÃO

AULA 5 QP-434-2007

Introdução

• Liberação de fármacos a uma velocidade e/ou numa localização indicada para a necessidade do corpo ou estado da doença em um período especificado de tempo:

– Liberação temporal: controle sobre a velocidade da liberação do fármaco

– Liberação espacial: controle sobre a localização do fármaco

Liberação Controlada de Fármacos

Hamid Ghandehari in <hghandeh@rx.umaryland.edu >

IntroduçãoLiberação espacial

TUMOR

= Molécula do fármaco

LIBERAÇÃO EXCLUSIVA DO FÁRMACO A TIPOS ESPECÍFICOS DE CÉLULAS

Hamid Ghandehari in <hghandeh@rx.umaryland.edu>.

Introdução

Liberação temporal

Efeitos adversos

Níveis tóxicos

Faixa terapéutica

Concentração

Min. efetiva

Sem efeito

Convencional

Liberação ordem zero

P

L

s

m

a

l

e

v

e

l

Tempo/dosagem administrada

Sistema de Liberação Controlada • O comportamento do fármaco in vivo pode ser mudado

drasticamente ao incorpora-lo num carregador. Os veículos de

liberação de fármacos coloidais podem prover:– Liberação lenta de compostos as vezes tóxicos– Habilidade de guiar uma distribuição sistêmica– Habilidade de proteger fármacos de degradação ambiental– Habilidade de direcionar a alvos específicos diretamente em

tecidos

• Sistemas coloidais em uso são:– Nanopartículas d<1m– Microesferas d>1m– Emulsões 100nm<d<5m– Lipossomas 20nm<d<2m

Micro/nanoesferas e capsulas

NANOCAPSULAS

NANOPARTICULAS

NANOESFERASMonoliticas

ReservatorioAdapted of Lambert,G. Oligonucleotide and Nanoparticles Page,

<http://perso.clubinternet.fr/ajetudes/nano/index. html> dez/ 2003.

METODOS DE PREPARAÇÃO

• 1- Através de polimerização de monômeros• Problemas: obtidas induzindo-se a

polimerização. Difícil controle da extensão da reação-massa molar não controlada. Purificação posterior. Interação do polímero com o ativo.

• 2- Diretamente da macromolécula ou polímero pré-formado.

Polímeros biodegradaveis

Poly(3-hydroxybutyrate-co-valerate) or PHBV

O CH2 C n

O

Poli(acido glicolico) ou PGA

Poli(acido lactico) ou PLAO CH C n

OCH3

C

O

(CH2)5 OnPoli (-caprolactona)

ou PCL

BIOPOLÍMEROS TÍPICOS

Polímeros biodegradáveis e bioabsorvíveis;

Degradação depende de: MM, estrutura,

solubilidade,composição da cadeia,grau de

cristalinidade.

(PLGA)

EMULSIFICAÇÃO/EVAPORAÇÃO DE SOLVENTE

• Trata-se de um método simples, de fácil transposição de escala e cuja realização em condições assépticas garante a esterilidade final do produto.

• Em linhas gerais o polímero é dissolvido em solvente volátil em água, como CHCl3 ou CH2Cl2. Se dispersa em água por emulsificação com temnsoativo apropriado.

Algumas revisões: Couvreur et al. Eur. J. Pharm. 41, 2 (1995); Alonso. Nanoparticulate drug carrier technology. In Cohgen (Ed). Microparticuate Systems for the delivery of proteins and Vaccines. M. Dekkrt, N.Y. 2996, p. 203; Soppomath et al., J. Control. Rel. 70, 1 (2001).

MÉTODOS MAIS IMPORTANTES DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS

Maria I. Rê e M.F.A. Rodrigues-IPT-2004

1-MÉTODO DE EMULSIFICAÇÃO/EVAPORAÇÃO DE SOLVENTE

FASE AQUOSA Água destilada Tensoativo

FASE ORGÂNICA Solvente orgânico

Homogenizaçào PolímeroSonicação Agente ativo

EMULSÃO Óleo em água

Extração do solventeEvaporação do solvente

SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS

Após a formação da nanoemulsão, o solventese difunde para a fase externa (extração paraa fase aquosa) até saturação da mesma. Com aevaporação das moléculas do solvente que atingem a interfase fase aquosa-ar, reestabelece-seo gradiente de concentração, ou seja, a força motrizpara a difusão do solvente orgânico das nanogotas paraa fase aquosa. Ao ser eliminado o solvente, o polímero precipita levando a formação das nanoesferas.

Sanchez et al. Int. J. Pharm. 99, 263(1993); Zambaux et al. J. Control. Rel. 50, 31 (1998); Verrechia et al., J. Biom. Mater. Res. 27, 1019 (1993)

PREPARAÇÃO

Evaporação de solvente modificado

(nanoesferas).

SEI, 2.300 x, 20 kV, topografia

SEI, 22.000x, 20 kV, topografia

Laboratório -

Preparação: 10% (surfatante), 0,8%

(polímero), 40%etanol/acetona

2 solventes

solúveis

entre si

(um é não-

solvente

para o

polímero)

APLICAÇÃO1- Formação de nanoesferas para substâncias lipofílicas. Este método tem sido modificado para uma emulsão múltipla do tipo água/óleo/água.

2- Limitações: a) Emulsão óleo/água deve ter uma fase dispersa (óleo) bastante fina e homogênea (requer bastante tensoativo e técnicas de agitação elevada). b) Solventes orgânicos (clorados) e tensoativos usados (álcool polivinílico, p.ex.) não são compatíveis com aplicações biológicas.

3- Alternativas: Uso de tensoativos como albumina de soro humano .

4- Propriedades otimizadas: diâmetro médio e distribuição de tamanho; re-suspensão num veículo aquoso sem agregação; teor de fármaco; taxa de liberação, taxa de degradação; esterilidade; apirogenecidade; e teor desolvente residual.

5- Variáveis: Volume da fase aquosa para a fase orgânica; concentração do polímero na fase orgânica; concentração do fármaco na fase orgânica; presença de tensoativo em ambas fases (orgânica e aquosa); solubilidade do fármaco na fase aquosa (nível de saturação); método e velocidade de agitação.

-2-MÉTODO DE EMULSIFICAÇÃO

ESPONTÂNEA/DIFUSÃO DE SOLVENTE

Um solvente miscível em água (acetona, etanol ou metanol) é misturado ao solvente immiscível (CHCl3, ou CH2Cl2). A difusão espontânea do solvente miscívil no meio aquoso cria uma turbulência interfacial entre as duas fases levando a formação de partículas menores.

Faseorgânica Difusão rápida do

solvente miscível com água

Nanopartículas

Fase aquosa

Quanto maior a proporção do solvente miscívil na misturamenores as partículas formadas.

(Niwa et al. J. Pharm. Biopharm. 25, 89 91993).

3-MÉTODO DE NANOPRECIPITAÇÃO

FASE AQUOSA Água destilada Tensoativo

FASE ORGÂNICA FASE ORGÂNICASolvente orgânico Solvente orgânico Óleo Polímero Polímero Agente ativo Agente ativo

Agitação

SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS

Envolve o uso de um solvente orgânico que é completamente solúvel na fase aquosa externa consequentemente a extração e a evaporação do solventenão são nescesárias para a precipitação do polímero.

nanoesferas

nanocapsulas

p.ex. acetona

Fessi et al. Eur Pat. 0275796 B1 (1987).

1,2% PLURONIC (1)

3% (PLGA / acetona) + 4 mg de agente ativo (2)

(2) colocado em (1)

“Nanoprecipitação” – método de deslocação de

solvente

m/2m/2 n

CH2CH2OHO CHCH2O

CH3CH2CH2 HO

Metodo – Encapsulação de agente ativo

PLGA nanoesferas – Encapsulamento de violaceina

PLGA-PLURONIC-PVA system

4-MÉTODO DE SALTING-0UT

FASE ORGÂNICA Solvente orgânico Polímero Agente ativo

FASE AQUOSA (sal) Água destilada

Agitação Tensoativo (PVA)

EMULSÃOÁgua em óleo

Água destilada

SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS

Esta é baseada na formação de uma emulsão pela incorporação, sob agitação, de umasolução aquosa saturada de alcool polivinílico (PVA) em uma solução de polímero dissolvido em acetona. O PVA tem o papel de estabilizar a dispersão. Aqui a miscibilidade das duas fases é impossibilitada pela saturação da fase aquosa com PVA. A precipitação do polímeroocorre quando uma quantidade adicional de água é adicionadapermitindo então a difusãoda acetona para a fase aquosa. Este método é adequado quando ativo e polímeros são solúveis em solventespolares como acetona ou etanol.

Ibrahim et al. Int. J. Pharm. 87, 239 (1992); Allemann et al., Int. J. Pharm. 87, 247 (1992).

5-MÉTODO DE EMULSIFICAÇÃO/DIFUSÃO DE SOLVENTE

FASE AQUOSA (saturada em solvente orgânico)

Água destilada Tensoativo

FASE ORGÂNICA (saturada em água)

Agitação Solvente orgânico Polímero

Agente ativoEMULSÃOÓleo em água

Água destilada

SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS

Envolve o uso de um solvente parcialmente miscível em água, que é previamente saturado em água para garantir o equilíbrio termodinâmico inicial de ambas as fases. A precipitaçãoOcorre quando uma quantidade adicional de água é adicionado ao sistema, permitindo então a difusão do solvente para a fase aquosa.

Formada a emulsão do tipo óleo/água e o tensoativo éadsorvido na superfície das gotas da fase orgânica dispersas na fase aquosa

A adição de água ao sistema desestabiliza o estado de equilíbrioe promove a difusão do solvente na fase aquosa levando à formaçãodas nanopartículas

Leroux et al. Eur. J. Pharm.Biopharm. 41, 14 (1995).Quintanar-Guerreo et al.Pharm Res. 15, 1056 (1998).

VANTAGENS

Este método apresenta algumas vantagens sobre o método de nanoprecipitação como a possibilidade de controle do tamanho das nanopartículas. Estas apresentam tamanhos superiores àquelas preparadas por nanoprecipitação, normalmente entre 250-600 nm, dependendo de vários parâmetros como tipo e concentração do tensoativo e do polímero, tempo e velocidadede agitação.

Métodos para a preparação de nanopartículas carregadas com fármacos convencionais

--------------------------------------------------------------Método Polímero Fármaco Tamanho(nm)o/w PLA, PLA-b-PEG Lidocaine 247-817 o/w PLA-PEG-PLA Progesterone 193-335o/w PLGA Dexamethasone 109-155o/w PEO-b-PBLA Doxorubicin 37solv-disp PMLAiPr Halofantrin 150-160solv-disp PMLAnHe Halofantrin 90-190solv-disp PLGA Vancomycin 160-170solv-disp PLGA Procaine Hydr. <210solv-disp PCL, PLA, Nimodipine 81-132

PCL-co-PLA o/w PEO-b-PCL Enalapril maleate 50 o/w PLA Lidocaine 115-123b

a PBLG = poly(-benzyl L-glutamate); PBLA = poly(-benzyl L-aspartate); PMLAiPr = poly(-malic acid isopropil ester); PMLAnHe = poly(-malic acid neohexil ester). b Dimension of unloaded particles. 

PREPARAÇÃO DE MICRO E NANOPARTICULAS CARREGADAS COM FÁRMACOS PROTEÍCOS.a Método Polímero Proteina Tamanho (nm)

w/o/w PLGA L-asparaginase 196-226 w/o/w PLGA BSA sw/o/w PLGA BSA 100-200w/o/w PLGA, PLA BSA sw/o/w PLGA/PLA blend BSA sw/o/w PLGA, PCL BSA 20-1000w/o/w PLA Protein C 230-340 w/o/w PLGA FITC-BSA s

FITC-HRPw/o/w PLGA TRH 250-800 w/o/w PLGA IL-1+BSA so/w PLGA Rism. porcine so/w Biod. polym. Peptides -

PLGA BSA 300-600w/o/w PLGA rhBMP sw/o/w PEG-PLGA BSA - w/o/w PEG-co-PBT BSA s

w/o/w PLGA-b-PEO BSA s

a s = microsize; CP = coprecipitation; FITC-BSA = fluorescein isothiocyanate-labeled BSA; FITC-HRP = fluorescein isothiocyanate-labeled horseradish peroxidase; IL-1 = recombinant human interleukin-1; rhBMP = recombinant human bone morphogenetic protein-2

Exemplo de encapsulação

utilizando nanocápsulas.

PREPARAÇÃO

Sim

Precipitaçãocoágulosagregados grandesespuma

Não

Formas arredondadassuperfície lisabaixa polidispersidade

Controle das variáveis de processo

[tensoativo]

[polímero]

agitação Modo adição

solvente

temperatura

evaporação

BSA/PHB159

BSA/PHBV140

BSA/PHB540BSA/PHB273

1.- PHBV140 libera menos BSA que PHB159 (Diferencias de porosidade nas matrizes) PHBV é menos porosa que PHB.2.- Pouca diferencia entre PHB540 e o 273. (Conway et al. J. Control. Rel. 49, 1 (1997)

The effect of type of organic phase solvents on the particle size of

poly(d,l-lactide-co-glycolide) nanoparticles.

Song et al. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 276 (2006) 162–167

Nanoparticulas de PLGA foram preparadas por método de emulsificação/difusão.

Efeito de 4 solventes no tamanho da partícula: acetato de etila, carbonato de propileno, acetona e diclorometano.

Tres estabilizadores foram usados: Didodecil dimetil brometo de amonio (DMAB), poli(vinil alcool) (PVA) e Pluronic F68.

Preparação: 100 mg de PLGA foi dissolvido em 10 ml de vários solventes (EA, PC, ACE,e DCM). As fases orgânicas foram adicionadas em 20 ml de uma faseaquosa contendo o estabilizador. Após uma saturação mutua da fase orgãnicae a aquosa, a mistura foi emulsificada por 1 min com um sonicador de ponta.Para permitir a difusão do solvente orgânico na água, um volume constante de água (80 ml) foi subsequentemente adicionado a emulsão o/w sob uma agitação magnética moderada formando as nanopartículas de PLGA

Partículas pequenas foram obtidas usando solventes parcialmente solúveis em água (EA, PC), entretanto partículas grandes foram obtidas usando solvente totalmente solúveis em água (ACE) e solvente imiscíveis em água (DCM). Como as nanopartículas são formadas das gotas de emulsão após difusão do solvente orgânico, seu tamanho é dependente da estabilidade das gotas da emulsão, que colidem e coalescem ou aderem ou aglutinam entre elas. Quando o estabilizador permanece na interfase liquido–liquido durante o processo de difusão, e seu efeito protetor é adequado e logo as nanopartículas são formadas. As partículas pequenas para EA e PC foram atribuídas tanto a a proteção adequada do estabilizador contra a coalescencia e a baixa tensão interfacial entre as fases aquosa e orgânica, resultante de sua natureza de solubilidade parcial em água.

A distribuição do valor médio de tamanho da partícula forma medidas por espectroscopia de correlação de fótons (NICOMP, model 380, CA, USA). O tamanho da partícula foi expressa como diâmetro médio em volume-peso em nanômetro, e obtido de medidas de três bateladas de nanopartículas.

Quando EA, um solvente orgânico parcialmente solúvel em água foi usado, foram formadas uma pequena e discreta partículas de tamanho de 40–70 nm. Por outro lado, partículas grandes e agregados de 350–450 nm foram observados em DCM como solvente orgânico imiscível em água. Quando ACE, solvente orgânico completamente solúvel em água foi usado, partículas grandes e discretas de 250–400 nm foram obtidas. Das imagens de AFM, pode ser visto que nanopartículas abaixo de 70 nm são obtidas usando um solvente parcialmente solúvel em água (EA) que quando usou-se um solvente imiscível em água (DCM) ou um solvente completamente solúvel em água (ACE). Isto está de acordo com os resultados da distribuição de tamanho de partícula nas Figura 1.

EA DCM

ACACE

OS AUTORES EXPLICAM ISTO DA SEGUINTE MANEIRA

As partículas pequenas para EA e PC foram atribuídas tanto a proteção adequada do estabilizador contra a coalescencia e a baixa tensão interfacial entre as fases aquosa e orgânica, resultante de sua natureza de solubilidade parcial em água. Entretanto, quando DCM foi usado como solvente na fase orgânicapraticamente cada formulação resultou em agregação significativa devido a suanatureza imiscível com água e o estabilizador DMAB não foi capaz de prevenir completamente a agregação dos gotas de emulsão, levando a tamanhos de partículas grandes (390 nm). de outra maneira, como ACE é completamentemiscível com água, emulsões estáveis entre as fases orgânicas e aquosas não são formadas a pesar da presença de um estabilizador. Logo após de misturaras duas fases, PLGA imediatamente precipita como partículas sub-micron resultando em partículas de tamanho grande.

Contrariamente ao resultado de DMAB na Fig. 1, pequenos tamanhos de partículasabaixo de 70 nm não foram, obtidas por PC e EA, e não houve uma grande diferenciana distribuição do tamanho das partículas entre solvente parcialmente solúveis em água(EA e PC) ou solvente totalmente solúvel em água (ACE) e em solvente imiscível em água (MCD) em PVA ou Pluronic F68. Em particular, os tamanhos médios de partículas denanopartículas de PLGA estabilizadas com PVA mostraram valores similares na Fig. 3, independente na diferencia do solvente na fase orgânica. Também interessante paraPluronic F68 na Fig. 4 que EA mostra tamanho menor que em PC, que mostra diferenteperfil com os resultados de DMAB e PVA na Figs. 1 e 3, respectivamente. Em sistemas de estabilizante não iônicos (PVA e Pluronic F68), as partículas estão estabilizadas por impedimento estérico, mas num sistema de estabilizador iônico (DMAB), as partículas são estabilizadas por repulsão eletrostática. Os resultados acima significam que oefeito do tipo de solvente na fase orgânica para obter nanopartículas pequenas dePLGA abaixo de 70 nm chega a ser mais importante quando partículas são estabilizadas por repulsão eletrostática que impedimento estérico.

As partículas menores (50 nm) foram obtidas usando DMAB (estabilizador) e PC (solvente na fase orgânica), entretanto, as partículas maiores (461 nm) foram obtidas usando Pluronic F68 (estabilizador) e DCM (solvente na fase orgânica). Estes resultados indicam que a escolha adequada do solvente na fase orgânicae estabilizador é o fator chave na determinação do diâmetro médio das nanopartículas de PLGA.

O tamanho das partículas para PVA e Pluronic F68 diminui rapidamente com pequenas mudanças na concentração mas muito pouco para DMAB. Isto indica que com aumento da concentração do estabilizador para PVA e Pluronic F68, mais moléculas do estabilizador são adsorvidas na interfase das gotas de emulsão, permitindo um aumento na proteção contra a coalescencia e resultando em gotas menores da emulsão. Outros autores prepararam nanopartículas de poli(metilmetacrilato) (PMMA) usando PVA como estabilizante por emulsificação/difusão, e pesquisaram o efeito da concentração do PVA no tamanho das nanopartículas de PMMA. Eles observaram que a estabilidade física das nanopartículas de PMMA aumentou com aumento de concentração de PVA, levando a nanopartículas de tamanhos menores. Entretanto, para DMAB, somente uma pequena quantidade de estabilizador é adsorvida na interfase das gotas da emulsão. O excesso permanece na fase aquosa continua e não joga nenhum papel significativo na emulsificação. O tamanho médio das nanopartículas de PLGA preparadas usando DMAB como estabilizante é menor que aqueles com PVA e Pluronic F68, que está de acordo com os resultados dos outros autores.

SOLVENTE: PC

Quando EA e PC, solventes parcialmente solúveis em água, o tamanho médio diminui rapidamente quando aumenta o volume de água adicionado na faixade 20–40 ml, mas pouca mudança foi observada acima de 80 ml. Entretanto,para ACE, um solvente totalmente solúvel em água, o volume de água adicionado não joga papel importante no tamanho da partícula comparado EA e PC, e otamanho da partícula diminui moderadamente quando aumenta o volume deágua adicionado. Estes resultados significam que o volume adicionado de águaé um fator importante na determinação do tamanho da partícula de PLGA para solventes parcialmente solúveis em água como PC e EA. Também, foiobservado que o tamanho médio das partículas de PLGA preparadas usandoACE são maiores que aquelas com EA e PC, que estão de acordo com os resultados da distribuição do tamanho das partículas na Fig. 1.

CONCLUSÕES A solubilidade dos solventes na fase orgânica em água foi

um parâmetro importante afetando o tamanho médio de nanopartículas de PLGA, quando DMAB, um estabilizador iônico é usado. nanopartículas abaixo de 70 nm foram obtidas usando solventes parcialmente solúveis em água (EA e PC) que quando usados um solvente totalmente solúvel em água (ACE) ou solventes imiscíveis em água (DCM). Em particular, quando PC foi usado como solvente na fase orgânica, nanopartículas de PLGA abaixo de 50 nm foram obtidas. Entretanto, quando PVA e Pluronic F68, estabilizadores não iônicos foram usados, uma grande diferencia na distribuição do tamanho das partículas entre solvente parcialmente solúvel em água ou totalmente solúveis em água e em solvente imiscível em água não foi observado, e todas as partículas mostraram um grande diâmetro acima de 110 nm, independentemente do tipo de solventes orgânicos.

MODOS DE INTERAÇÃO DE PVA DURANTEPROCESSO DE EMULSIFICAÇÃO

Fig. 1. Diagrama ilustartivo de sistemas de longa circulação. Nanopartículas de poliestireno coberta com Poloxameros e Poloxaminas. (b)nanopartículas de Poliestireno grafted com PEO. (c) nanopartículas de copolímero de Polilactideoglicolideo com polilactideo/glicolideo-PEO, coberto (A) ou preparado de um solvente comum (B) . (d) (‘Self-forming’) Sistema de copolímero em bloco polilactideoglicolideo-PEO.Stolnik et al., Advan. Drug Deliver. Rev. 16, 195 (1995).

(enredado)

NANOPARTICULAS DE MACROMOLÉCULAS

• NANOPARTICULAS DE ALGINATO• Produzidas por extrusão de gotas de uma solução

alginato sódico numa solução de cloreto de cálcio. Os tamanhos das partículas de alginato dependem do tamanho das gotas iniciais. Num avanço adicional as partículas de alginato tem sido produzidas usando um método de gelação modificado de emulsificação/gelação interna como ilustrada na Figura

Pinto Reis et al. / Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2 (2006) 8– 21

NANOPARTICULAS DE MACROMOLÉCULAS

• NANOPARTICULAS DE QUITOSANO• Os métodos propostos para preparar nanopartículas de

quitosano estão baseadas na formação espontânea do complexo entre quitosano e polianios (tripolifostato) ou gelação de uma solução de quitosano disperso numa emulsão de óleo. Vários métodos para produzir nanopartículas de quitosano são descrito na literatura. nanopartículas de quitosano produzidos por gelação num método baseado na emulsificação está ilustrado na Figure

Pinto Reis et al. / Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2 (2006) 8– 21

NANOPARTICULAS DE MACROMOLÉCULAS

• NANOPARTICULAS DE AGAROSE• Nanopartículas de agarose foram desenvolvidas para a

administração de terapêuticos de proteínas e peptídeos.• nanopartículas de agarose foram produzidos pela

tecnologia baseada em emulsão como ilustrado na Figura

Pinto Reis et al. / Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2 (2006) 8– 21

Preparação de nanocapsulas de PCL e PCL-PEGDeterminação de encapsulaçãoCaracterização das nanocapsulasDeterminação de toxicidade aguda (LD50)Eficácia antimalariaDeterminação de parâmetros cardiovascularesEstatistica

Nota: halofantrine é um fármaco mais cardiotóxico dos usados em malaria. Induz uma prolonga intervalo de QT já que é responsável de alterar os canais de potássio produzindo uma repolarizaçãoque determina o intervalo QT

Efeito cardiotóxico

Percentage variation of QT interval (A). The values represent means±S.E.M. (standard error mean) for 30 min after IV injection of halofantrine solution (Hf. HCl), halofantrine entrapped in nanocapsules (Hf-NC) in doses of 100 mg/kg (n=6) or 150 mg/kg (n=8), unloaded NC (n=8) and DMA/PEG solution (n=8).QT= interval between the beginning of the Q wave and the end of the T wave of ECG

AGRADECIMENTOS