Avaliação da diversidade genética e da expressão

da adesina NadA de isolados de

Neisseria meningitidis no Brasil.

Implicações na produção de vacinas contra o sorogrupo B.

Sara Ferreira Serrano

Rio de Janeiro

2012

SARA FERREIRA SERRANO

Aluna do Curso de Tecnologia em Biotecnologia

Matrícula 1011320266

Avaliação da diversidade genética e da expressão

da adesina NadA de isolados de

Neisseria meningitidis no Brasil.

Implicações na produção de vacinas contra o sorogrupo B.

Trabalho de Conclusão de Curso, TCC, apresentado

ao Curso de Graduação em Tecnologia em

Biotecnologia, da UEZO como parte dos requisitos para

a obtenção do grau de Tecnólogo em Biotecnologia,

sob a orientação do Professor Ivano de Filippis.

Rio de Janeiro

Dezembro de 2012

ii

Avaliação da diversidade genética e da expressão

da adesina NadA de isolados de

Neisseria meningitidis no Brasil.

Implicações na produção de vacinas contra o sorogrupo B.

Elaborado por Sara Ferreira Serrano

Aluna do Curso de Tecnologia em Biotecnologia

Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com

Grau________________________________________

Rio de Janeiro,____ de ____________________2012

___________________________________________

Ivano de Filippis, Doutorado

______________________________________________

Daniele Guedes, Doutorado

_______________________________________________

Maria Cristina de Assis, Doutorado

RIO DE JANEIRO, RJ- BRASIL

DEZEMBRO DE 2012

iii

Agradeço a Deus por toda força, inteligência e capacidade de aprender.

A minha Família pelo apoio, carinho, compreensão e incentivo nos momentos de

dificuldade.

Ao meu Orientador Ivano de Filippis, por ter me dado orientações, ensinado bastante, e

ajudado a desenvolver ciência.

Aos Colegas do laboratório pelo companheirismo e amizade.

Aos Professores que passaram por minha vida acadêmica fazendo toda a diferença.

iv

Dedico este Trabalho à Deus, Família, Familiares e

Amigos mais chegados que irmãos.

v

“A educação é a arma mais poderosa que você pode usar para mudar o mundo.”

Nelson Mandela

vi

Resumo

A Neisseira meningitidis (Nm) ou meningococo é uma bactéria Gram negativa responsável

pela Doença Meningocócica (DM) em crianças e adultos jovens, podendo causar surtos e

apresentando alta taxa de mortalidade. Existem 5 sorogrupos principais que causam esses

surtos A, B, C, W135 e Y. Para os sorogrupos A, C, W135 e Y existem diversos tipos de

vacinas, no entanto para o sorogrupo B ainda não foi desenvolvida uma vacina eficaz. A

busca de novos alvos vacinais para uma futura vacina contra o sorogrupo B, levou à

descrição de uma proteína presente na membrana externa do meningococo chamada NadA.

A adesina NadA se apresenta muito conservada e com capacidade de induzir a produção de

anticorpos bactericidas. Por estar presente em todos os sorogrupos, pode ser considerada

como um bom alvo para a produção de vacinas contra Nm. O objetivo desse estudo é

avaliar a diversidade genética do gene nadA e analisar a expressão da proteína NadA em

cepas de Neisseira meningitidis B e C isoladas no Brasil, fornecendo subsídios para a

produção de vacinas eficazes contra todos os sorogrupos da N. meningitidis. Nosso

resultados mostram que cepas do cc32 apresentaram o gene nadA conforme já descrito

anteriormente, no entanto detectamos o gene também em uma cepa do clone cc41 o que

nào tinha sido observado até o momento. A presença desse gene em um novo clone

hipervirulento além de ser um dado novo, tem grande importância pois aponta para uma

possível maior eficácia da nova vacina que está sendo introduzida em alguns países.

Palavras- chave:N. meningitidis, meningococo, adesina, doença, vacina

vii

Abstract

Neisseira meningitidis (Nm) is a Gram negative bacterium responsible for Meningococcal

Disease (DM) in children and young adults, and may cause outbreaks with high mortality

rates. There are five major serogroups causing outbreaks A, B, C, W135 and Y. For

serogroups A, C, W135 and Y different types of vaccines are available, however for

serogroup B an effective vaccine is still to be designed. The search for new targets for

future vaccines against serogroup B, led to the description of a protein present in the

meningococcus outer membrane called NadA. NadA is an adhesin and appears to be highly

conserved and able to elicit the production of bactericidal antibodies. Since NadA is

present in all serogroups it can be considered as a good target for the production of

vaccines against Nm. The aim of this study is to assess the genetic diversity and analyze

protein expression of NadA within serogroups B and C Neisseira meningitidis strains

isolated in Brazil, providing subsidies for the production of new effective vaccines against

all serogroups. Our results show that the nadA gene is present among strains belonging to

cc32 as previously described, but in strains of clone cc41 which has not been observed so

far. The presence of nadA a new hypervirulent clone is an important information because it

points to a possible greater efficacy of new vaccines using this protein which are going to

be introduced in some countries.

Keywords: N. meningitidis, meningococcal, adhesin, disease, vaccine

viii

Lista de Figuras

Figura 1. Número de casos de Doença meningocócica........................ 4

Figura 2. Adesina NadA......................................................................... 6

Figura 3. Eletroforese em gel de agarose............................................. 12

ix

Lista de Tabelas

Tabela 1. Características das cepas de N. meningitidis positivas para o gene

nadA......................................................................................................... 11

Listas de Siglas e Abreviaturas

CC Complexo Clonal

DM Doença Meningocócica

EXO/ SAP Exonuclease

fHbp factor H binding protein

Hib Haemophilus influenzae tipo b

NadA Neisserial adhesin A

NHBA Neisserial heparin- binding antigen

SAP Shrimp Alkaline Phosphatase

TSB Tripticase soy broth

OMV Outer membrane vesicle

x

SUMÁRIO

Página

Resumo............................................................................................... vi

Abstract................................................................................................ vii

Lista de Figuras................................................................................... viii

Lista de Tabelas.................................................................................. ix

Lista de Siglas e Abreviaturas............................................................ ix

1.Introdução........................................................................................ 1

1.1 Doença meningocócica................................................................. 1

1.2Transmissão................................................................................... 2

1.3. Sintomas....................................................................................... 2

1.4. Diagnóstico................................................................................... 2

1.5. Tratamento.................................................................................... 3

1.6.Profilaxia ....................................................................................... 3

1.7.Neisseria miningitidis..................................................................... 3

1.8.Sorogrupos...................................................................................... 4

1.9.Epidemiologia................................................................................. 4

1.10Vacinas........................................................................................... 5

1.11.Adesina NadA............................................................................... 6

2.Objetivo geral do Estudo .................................................................. 7

2.1 Justificativa..................................................................................... 7

3.Metodologia....................................................................................... 8

4.Resultados.......................................................................................... 10

xi

5.Discussão............................................................................................ 12

6.Conclusão........................................................................................... 13

7.Pespectivas......................................................................................... 13

8. Referências Bibliográficas................................................................ 14

1

Introdução:

1.1) Doença Meningocócica

A Meningite é uma doença causada por bactérias, vírus, fungos ou

parasitas. Ela tem a capacidade de ocasionar surtos e epidemias, onde crianças e

adultos jovens são a maioria das vítimas (Sacchi CT et al.,2001).

A Doença Meningocócica (DM) é causada pela bactéria Neisseria

meningitidis ou meningococo. Pode se apresentar de duas formas clínicas:

meningite e meningococcemia.

Meningite é a inflamação das meninges, membranas que protegem o

cérebro e a medula espinhal envolvendo o sistema nervoso central. As meninges

são divididas em três partes:

Pia máter: membrana altamente vascularizada que se encontra aderida ao

tecido nervoso, mas não entra em contato com as células ou fibras nervosas.

Aracnóide: membrana não vascularizada, apresenta o espaço

subaracnóide, onde está localizado o líquido do cefalorraquidiano, que protege o

sistema nervoso central contra traumatismos.

Dura máter: membrana mais externa, formada por tecido conjuntivo denso.

Entre ela e a caixa craniana existe o espaço peri-dural, onde são encontradas

estruturas como veias, tecido conjuntivo frouxo e tecido adiposo. Outro espaço

subdural é a parte da dura máter que está em contato com a aracnóide.

Meningococcemia é a infecção generalizada, também chamada de

septicemia. Ela acontece quando o microorganismo entra na corrente sanguínea

(Stephens DS, Greenwood B, Brandtzaeg P.,2007).

Os tipos de Meningites são:

Meningite Viral é a menos grave. Seus sintomas são similares aos da gripe

e resfriados.

Meningite Bacteriana é causada principalemente pela Neisseria

meningitidis (meningococo), Streptococcus pneumoniae (pneumococo) e

Haemophilus influenzae (hemófilos), mas também pode ser causada por outras

2

bactérias. A meningite causada pelos três primeiros agentes, é geralmente mais

contagiosa e mais grave (Jodar L et al.,2002).

1.2) Transmissão

O hospedeiro natural do meningococo é o ser humano, e está presente na

orofaringe de 10 a 15% da população (Comanducci et al., 2002). A transmissão

ocorre de uma pessoa para outra pela secreção respiratória (gotículas de saliva,

espirro, tosse). Depois que a bactéria é transmitida, ela fica na orofaringe do

indivíduo receptor por pouco tempo, pois logo a bactéria é destruída pela defesa

do organismo; esse seria o perfil de um portador assintomático. O portador no

entanto pode se tornar infectado quando a bactéria consegue invadir a mucosa

respiratória e alcançar a corrente sanguínea levando ao aparecimento da doença

meningocócica, isso acontece de três a cinco dias após o contágio.

1.3) Sintomas

Os sintomas mais comuns da DM são febre alta, fortes dores de cabeça,

vômitos, mal-estar, rigidez do pescoço, moleza, irritação, fraqueza, coma e

manchas vermelhas na pele (que estão associadas à quantidade de bactérias

presentes no sangue, e a gravidade da doença). O início da doença é repentino

evoluindo muito rápido, podendo levar o paciente ao óbito em 24 a 48 horas

(Stephens DS, Greenwood B, Brandtzaeg P.,2007).

1.4) Diagnóstico

O material de escolha para o diagnóstico da meningite é através da retirada

do líquido cefalorraquidiano por punção lombar, para detectar a possível presença

do patógeno (bactéria ou vírus). Quando a suspeita é de septicemia, o material de

escolha é o sangue por punção venosa (Stephens DS, Greenwood B, Brandtzaeg

P.,2007).

3

1.5) Tratamento

A terapia indicada para combater as meningites bacterianas é através de

antibióticos. Para a meningite meningocócica, os antibióticos de escolha são a

benzilpenicilina ou a ceftriaxona. Após a confirmação de um caso é recomendável

utilizar tratamento profilático com rifampicina nos contatos primários e

secundários do caso índice (Stephens DS, Greenwood B, Brandtzaeg P.,2007).

1.6) Profilaxia

Existem diferentes vacinas disponíveis contra os principais agentes das

meningites bacterianas que já fazem parte do Calendário de vacinação, como a

Meningocócica C conjugada, Hemophilus influenze tipo b (Hib) e a 10-valente

contra o pneumococo (Streptococcus pneumoniae) que devem ser administradas

às crianças nos primeiros meses de vida (Boslego et al.,1995). No entanto não há

vacina eficaz contra o meningococo do sorogrupo B (Secretaria de Vigilância em

Saúde.,2012).

1.7) Neisseria Meningitidis

É uma bactéria Gram- Negativa, pois tem parede celular mais delgada,

membrana externa, membrana plasmática, espaço periplasmático,

lipopolissacarídeos, e proteínas inseridas na membrana externa que podem ser

porinas ou outras proteínas que interagem com o sistema imune do hospedeiro.

Ao microscópio se apresenta em forma de cocos em pares (diplococos). A

bactéria é encontrada apenas em humanos e é classificada em 13 sorogrupos de

acordo com a composição química dos polissacarídeos capsulares (de

Filippis.,2009).

4

1.8) Sorogrupos

Cinco sorogrupos são responsáveis por cerca de 90% dos casos de

doença meningocócica (A, B, C, Y e W-135). O microrganismo pode ainda ser

classificado em sorotipos e subtipos, de acordo com os antígenos proteicos da

membrana externa da bactéria. Para os quatro sorogrupos existem vacinas,

menos para o sorogrupo B (Comanducci et al.,2002).

1.9) Epidemiologia

A doença meningocócica é causada pela bactéria Neisseria meningitidis.

Ela é a principal bactéria causadora de meningite.

As epidemias de meningite meningocócica podem ocorrer por vários

fatores como: aglomeração populacional, tipo de microorganismo envolvido,

localização geográfica e clima. Os casos de epidemia de meningite apresentam-

se com maior ocorrência em indivíduos adultos e adolescentes, quando há

mudança da faixa etária que normalmente acomete crianças menores de cinco

anos, mais especificamente de 0 a 12 meses de idade.

O período onde são notificados mais casos de meningite meningocócica, é

no inverno (Secretaria de Vigilância em Saúde., 2012).

Figura 1. Número de casos de DM - Guia da Vigilância Sanitária, SVS/Ministério da Saúde. (Outubro de

2012).

5

1.10) Vacinas

As primeiras vacinas contra o meningococo foram desenvolvidas por

purificação do polissacarídeo capsular. No entanto, essa estrutura apresenta

baixa imunogenicidade em recém-nascidos e não induz memória imunológica.

Nos últimos 10 anos foram desenvolvidas vacinas polisacarídeas conjugadas a

uma proteína carredora, que induz maior imunogenicidade e memória mostrando-

se extremamente eficaz em crianças, recém-nascidos e adolescentes. Essa

tecnologia foi utilizada para os sorogrupos A,C W135 e Y (Scarselli M et al.,2005).

O polisacarídeo B no entanto não pode ser usado como imunizante pois

apresenta estrutura semelhante às células nervosas humanas, não sendo

imunogênico. Isso causa grande problema no mundo, pois no Brasil a incidência

do surgimento deste sorogrupo vem aumentando. Nos Estados Unidos este

sorogrupo é responsável por aproximadamente 32% dos casos, na Europa de 45

a 80% dos casos e 50% dos casos no restante do mundo, com excessão da

África subsaariana em que o sorogrupo que prevalece é o A, responsável por

90% dos casos (Comanducci et al.,2002 ; de Filippis e Vicente.,2005 ; Bjune et

al.,1991).

Com o objetivo de se encontrar um antígeno imunogênico para proteger

contra o meningococo B, a estratégia adotada foi se desenvolver formulações

contendo proteínas conservadas da membrana externa do meningococo,

presentes em todos os sorogrupos ( Pizza et al.,2000)

Para a busca dessas proteínas, foi desenvolvida uma estratégia alternativa

chamada Reverse Vaccinology ou Vacinologia Reversa ( Rappuoli.,2001).

A Vacinologia Reversa é uma estratégia que utiliza a bioinformática para

detectar possíveis proteínas-alvo a serem utilizadas em vacinas. Algumas dessas

proteínas no entanto apresentam centenas de genótipos diferentes diminuindo

sua eficácia para o controle de surtos causados por mais de um genótipo. Com

isso foi necessário se estudar a variabilidade genética de todos os possíveis alvos

vacinais para se conseguir os mais promissores (Rappuoli.,2000).

6

1.11) Adesina NadA

É uma proteína de membrana externa, descrita pela vacinologia reversa,

que se mostrou muito conservada e capaz de induzir a produção de anticorpos

bactericidas(Granoff et al.,2001;Giuliani et al.,2005). A NadA é uma adesina

ancorada na membrana externa do meningococo com um estrutura em espiral

que se projeta para fora da célula bacteriana e interage com o sistema imune do

hospedeiro (Comanducci et al.,2004).

Está presente em todos os sorogrupos, e é candidata para produção de

vacinas contra Nm. O gene nadA que codifica a síntese da proteína NadA tem

sido pesquisado em cepas clínicas, no entanto ele não foi detectado em alguns

clones hipervirulentos (Comanducci et al.,2002).

Figura 2. Adesina NadA: Ilustração esquemática da possível topologia da NadA e estrutura

terciária. O terminal amino globular (N) e os terminais anfipáticos COOH (C) estão indicados.

As posições dos lipopolissacarídeos (LP), a estrutura em espiral e região ancorada na

membrana são mostradas.

7

2) Objetivo Geral:

Estudar a diversidade genética do gene nada, analisar a expressão da

proteína NadA em cepas de Neisseria meningitidis B isoladas no Brasil, e verificar

a ocorrência do gene nadA por PCR entre isolados de meningococos dos

sorogrupos B de pacientes apresentando doença meningocócica em diferentes

regiões geográficas do Brasil de 2005 a 2007.

2.1) Justificativa:

A Doença meningocócica é uma preocupação mundial, pois não está

restrita ao Brasil, mas ocorre em todo o mundo e apresenta grande potencial

epidêmico.Nos EUA o número de casos do sorogrupo B é de 32%, na Europa de

45 a 80% dos casos são causados pelo sorogrupo B e na África Subsariana 90%

dos casos são causados pelo sorogrupo A.

Estudos recentes mostram que desde 1977, a incidência de casos de

doença meningocócica (DM) causados pela Neisseria meningitidis sorogrupo B,

vem aumentando no Brasil até chegar a representar mais de 70% dos casos em

2005.

De 2005 a 2010 a incidência do sorogrupo C superou o B, mas desde

2011, o sorogrupo B vem apresentando novamente um ligeiro aumento de sua

incidência. É provável que o uso de vacinas conjugadas contra o sorogrupo C

esteja causando a diminuição desse sorogrupo e aumento da ocorrência de cepas

do sorogrupo B que em pouco tempo poderá voltar a ser o de maior incidência.

A DM ocorre com maiores números de casos principalemnte no inverno,

pois nesse período o aglomerado populacional em áreas fechadas é maior, sendo

este um fatores de risco para a doença. A DM acomete todas as faixas etárias,

mas apresenta maior incidência em crianças menores de cinco anos e recém-

nascidos. No entanto durante as epidemias pode ocorrer mudança nas faixas

etárias afetadas, levando ao aumento de casos entre adolescentes e adultos

jovens.

8

3) Metodologia

Obtenção dos isolados e cultivo.

As 31 cepas de Neisseria meningitidis utilizadas foram obtidas da Coleção

de Microrganismos do INCQS/FIOCRUZ onde se encontram liofilizadas em

ampolas. Os liófilos foram reidratados com caldo TSB (Trippticase soy broth) e

semeados em placa de Petri com Ágar Chocolate (base de Agar sangue com 5%

de sangue desfibrinado lisado de coelho a 70ºC). As placas foram incubadas em

atmosfera de 5% de CO2 a 37ºC por 24 horas.

Obtenção do DNA genômico

Após 24horas de incubação parte do crescimento foi utilizado para a

extração e purificação do DNA genômico utilizando o kit Blood e Tissue Kit 250

(Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. A integridade do DNA

extraído foi confirmada por eletroforese em gel de agarose a 0,7% e preservado

em microtubos de 1,5ml a -20ºC para as reações da PCR.

Amplificação do gene nadA

Foram desenhados iniciadores específicos para a amplificação por PCR do

gene nadA. Os iniciadores obtidos foram avaliados “in silico” com o programa

INSILICO (http://insilico.ehu.es/), para confirmação dos fragmentos amplificados e

determinação do tamanho das bandas a serem obtidas para cada gene.

9

Iniciadores utilizados no estudo

NADA- Forward: 5’- TGTAAAACGACGGCCAGTGGCAGAATTGACATC -

3’

NADA- Reverse: 5’- CAGGAAACAGCTATGACCCGTTGTAAGGTTGGA-

3’

Foi necessária a otimização da reação da PCR para determinação da

melhor temperatura de anelamento, para obtenção de banda única com tamanho

compatível com o obtido após amplificação “in silico”.

Condições da PCR

Temper

atura

Tempo

95°C 1’

95°C 1’

52°C 1’

72°C 1’

72°C 10’

4°C infinito

40 ciclos

10

4) Resultados

O número total de amostras analisadas foi de 31 dessas, 6 amostras

positivas para o gene nadA, representando 19,35%.

Tabela 1. Características das cepas de N. meningitidis positivas para o

gene nadA.

*P3738- controle positivo, cepa do Laboratório de Referência de

Microorganismos- FIOCRUZ.

CC- Complexo Clonal

PCR- Reação em Cadeia da Polimerase

A Figura 3, abaixo, apresenta o resultado da PCR para as amostras:

P2845, P2990, P3122 e P3738 que foi usada como controle positivo.

O peso molecular utilizado foi de 100bp DNA Ladder,Invitrogen.

Tamanho esperado para o amplicon é 1.150pb.

11

Os produtos da PCR das 6 cepas que apresentaram amplificação do

fragmento do gene nadA foram purificados utilizando kit PCR Purification da

Qiagen, seguindo o protocolo do fabricante. Porém este método, não resultou em

uma purificação eficiente, pois ainda havia restos de oligonucletídeos e

nucletídeos não incorporados. Assim, realizamos nova purificação com a enzima

SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) e Exonuclease (EXO/ SAP) seguindo o

protocolo do fabricante.

Protocolo da purificação por EXO/SAP

Concentração de reagentes

para uma reação

água para PCR (Milliq) 8,9 μL

SAP 0,5 μL

Exonuclease 0,1 μL

* DNA 8 μL

Está reação foi feita na Cabine de Segurança Biológica. Mas o DNA* foi

adicionado na bancada.

Figura 3 – Eletroforese em gel de agarose dos

produtos da PCR de nadA. 1-P2845; 2-P2990; 3-

P3122; 10- controle positivo: P3738; 11- controle

negativo.

12

A cepa de Neisseria meningitidis P2824 positiva para o gene nadA,

pertence ao complexo clonal cc41/44. Este dado é novo, pois até o momento

somente foram descritas cepas de N. meningitidis pertencentes aos complexos

clonais cc32, cc11 e cc8 contendo o gene nada.( de Filippis et al.,2012).

5) Discussão

Alguns estudos descreveram que os meningococos do sorogrupo B

isolados no Brasil no período de 1997-1998, apresentam maior prevalência de

apenas três subtipos: P1.19,15 (66%), P1.7,1 (11%) e P1.7,16 (4%). A NadA tem

se mostrado presente em 80% das cepas P1.19,15, 40% P1.7,1 e 60% P1.7,16

(Fukasawa et al., 2003). Outros estudos mostram que cepas dos complexos

clonais hipervirulentos cc32, cc11 e cc8 apresentam NadA. Estes cc estão entre

os mais prevalentes em epidemias e surtos em todo o mundo (Oster et al.,2005).

Além dessas vantagens, a NadA se apresenta muito conservada. Por essas

razões, a NadA é uma potencial candidata a ser introduzida em novas vacinas e

está sendo utilizada na vacina de 4 componentes 4CmenB (Jacobsson et al.,

2009). A vacina 4CMenB é composta pelas proteínas fHbp (factor H-binding

protein), NHBA ( Neisserial heparin- binding antigen), NadA (Neisserial adhesin

A) e uma vesícula da membrana externa (OMV - Outer membrane vesicle) obtida

de uma cepa vacinal utilizada para conter um surto na Nova Zelândia em 2000

(Su EL, Snape MD., 2011). Todas essas proteínas tem a vantagem de serem

conservadas e expostas na membrana externa da bactéria conferindo-lhe alta

imunogenicidade. Elas foram selecionadas pelo método de Vacinologia Reversa

(Rappuoli, 2000). Os componentes vacinais para que sejam eficazes devem ser

conservados e imunogênicos (de Filippis, 2009). Nosso resultados comprovaram

o que tem sido descrito, pois o gene nadA foi detectado em cepas do cc32, mas

também no cc41 no qual até agora ainda não tinha sido detectada a presença do

gene nadA. A presença desse gene em um novo clone hipervirulento além de ser

um dado novo, tem grande importância pois aponta para uma possível maior

eficácia da nova vacina que está sendo introduzida em alguns países.

13

6) Conclusão

Foi observada a presença do gene nadA em 6 cepas.

7) Perspectivas

1. Detectar o gene nadA em novas cepas pela PCR.

2. Sequenciamento dos genes nadA amplificados para availação da

diversidade genética dos mesmos e detecção de possíveis novos alelos.

3. Determinação da expressão do gene nadA para se obter a real situação

da presença da proteína NadA na superfície dos meningococos.

14

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