MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E CULTURA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

XISTO SENA PASSOS

Caracterização de fungos envolvidos em infecções

nosocomiais

ORIENTADORA: PROFª DRª MARIA DO ROSÁRIO RODRIGUES SILVA

Tese de Doutorado

GOIÂNIA – GO, 2007

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

XISTO SENA PASSOS

Caracterização de fungos envolvidos em infecções nosocomiais

ORIENTADORA: PROFª DRª MARIA DO ROSÁRIO RODRIGUES SILVA

Tese de Doutorado apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Tropical do Instituto de Patologia e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás como requisito parcial para obtenção de Grau de Doutor em Medicina Tropical. Área de concentração: Microbiologia.

GOIÂNIA – GO, 2007

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

(GPT/BC/UFG)

Passos, Xisto Sena. P289c Caracterização de fungos envolvidos em infecções nosocomiais / Xisto Sena Passos . – Goiânia, 2007. xiv,99f. : il., figs., tabs. Orientadora: Maria do Rosário Rodrigues Silva.

1 Tese ( Doutorado ) – Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Públi- ca, 2007.

2 Bibliografia: f. 61-78. Inclui lista de abreviaturas, símbolos e unidades. Anexos. 1. Candidíase 2. Candidíase – Mucosa bucal 3. Candidíase – Mucosa vaginal 4. Fungos (Candida) – Tratamento I. Silva, Maria do Rosário Rodrigues II. Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública III. Título CDU: 616.98:616.934

i

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AGRADECIMENTOS

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ppeellaass vvaalliioossaass ssuuggeessttõõeess..

ix

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES.

AIDS Acquired immunodeficiency syndrome

ATCC American type culture colletion

α Alfa

BSI Bloodstream infection

β Beta

°C Grau Celsius

CFU/ml Unidade formadora de colônia por mililitro

CIM Concentração inibitória minima

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

CVV Candidíase vulvovaginal

DNA Ácido desoxirribonucléico

HAART Highly active anti-retroviral therapy

HC Hospital das Clínicas

HIV Human immunodeficiency virus

ICU Intensive care unit

IgA Imunoglobulina A

MIC Minimal inhibitory concentration

ml Mililitro

μg Micrograma

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

PCR Polymerase Chain Reaction

pH Potencial hidrogeniônico

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms

x

SIDA Síndrome da imunodeficiência adquirida

sp. Espécie

spp. Espécies

SPSS Statistical Programmer for Social Sciences

UFG Universidade Federal de Goiás

USA United State of América

UTI Unidade de terapia intensiva

xi

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ........................................................................................ v

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES. .............................. ix

RESUMO ........................................................................................................ xiii

ABSTRACT.................................................................................................... xiv

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1

1.1 ASPECTOS GERAIS ...................................................................................... 1

1.2 MECANISMO DE PATOGENICIDADE................................................................ 2

1.2.1 Fatores relacionados ao hospedeiro ........................................................ 2

1.2.2 Fatores relacionados ao microrganismo .................................................. 3

1.3 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS .......................................................................... 7

1.3.1 Candidíase superficial .............................................................................. 7

1.3.2 Candidíase sistêmica................................................................................ 9

1.4 INFECÇÕES NOSOCOMAIS POR CANDIDA SPP. ............................................. 10

1.5 TRATAMENTO............................................................................................ 12

1.6 SUSCETIBILIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO .................................................... 15

1.6.1 Resistência aos antifúngicos .................................................................. 18

1.7 MÉTODOS MOLECULARES .......................................................................... 20

2 JUSTIFICATIVA .......................................................................................... 24

3 OBJETIVOS................................................................................................. 26

3.1 OBJETIVO GERAL..................................................................................... 26

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................................... 26

xii

4 PRODUÇÃO CIENTÍFICA ........................................................................... 27

4.1 ARTIGO 1: CANDIDA COLONIZATION IN INTENSIVE CARE UNIT PATIENST’S

URINE ............................................................................................................. 28

4.2 ARTIGO 2: SPECIES DISTRIBUTION AND ANTIFUNGAL SUSCEPTIBILITY

PATTERNS OF CANDIDA SPP. BLOODSTREAM ISOLATES FROM A BRAZILIAN

TERTIARY CARE HOSPITAL................................................................................ 33

4.3 ARTIGO 3: MOLECULAR EPIDEMIOLOGICAL ANALYSIS OF BLOODSTREAM OF

CANDIDA ALBICANS ......................................................................................... 41

4.4 ARTIGO 4: NOSOCOMIAL INVASIVE INFECTION CAUSED BY CUNNINGHAMELLA

BERTHOLLETIAE: CASE REPORT........................................................................ 55

5 CONCLUSÕES............................................................................................ 59

6 REFERÊNCIAS RELACIONADAS À INTRODUÇÃO ................................ 60

7 ANEXOS ...................................................................................................... 79

7.1 NORMAS PARA PUBLICAÇÃO NA REVISTA MEDICAL MYCOLOGY –

INSTRUCTIONS TO AUTHORS (ARTIGO 3) .......................................................... 79

7.2 PROTOCOLO DO CEPMHA/HC/UFG ....................................................... 92

7.3 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO................................... 96

xiii

RESUMO

Os pacientes da unidade de terapia intensiva apresentam um índice elevado

de infecções do trato urinário e da corrente sanguínea causadas por Candida

spp. As infecções por esse microrganismo, na maioria das vezes, estão

relacionadas à fonte endógena. Entretanto, fontes exógenas provenientes do

meio ambiente foram descritas como prováveis fontes de candidíase. Neste

trabalho, foram coletadas amostras de sangue, urina, cateter de pacientes e

da superfície da cama e mesa de Meyer da unidade de terapia intensiva de

um hospital terciário, durante o período de um ano para pesquisa e

identificação de fungos. Os potenciais fatores de risco para candidemia e

candidúria foram analisados e o teste de suscetibilidade antifúngica para os

fungos isolados da corrente sanguínea foram realizados usando-se o método

de microdiluição em caldo. A diversidade genética entre isolados de C.

albicans foi avaliada na tentativa de se verificar possíveis correlações de

padrões de DNA das cepas obtidas de amostras clínicas e do meio ambiente

da unidade de terapia intensiva. Dentre as 345 amostras de sangue, Candida

foi detectada em 33 pacientes, e em um paciente foi identicado a presença de

um fungo filamentoso, Cuninghamella bertholetiae. Candida não-albicans foi

responsável por 51,5% dos casos de candidemia. Das 153 amostras de urina

coletadas, candidúria foi verificada em 68 pacientes, sendo que Candida não-

albicans foi identificada em 31,9%. O período de internação relacionado com

candidemia e candidúria foi estatisticamente significante. Uso de antibióticos e

de cateter invasivo foram fatores predominantes nos casos de candidemia e

de candidúria. A suscetibilidade in vitro dos isolados do sangue revelou alta

sensibilidade aos antifúngicos estudados. A análise de RAPD para os 31

isolados de C. albicans do sangue, catheter, urina, superfície de cama e mesa

de Meyer confirmou que os oligonucleotídios Cnd3 e Cnd4 possuem alto valor

discriminatório. Os resultados obtidos permitiram concluir que embora

candidemia estivesse largamente associada à fontes endógenas como

candidúria, a presença de Candida nas superfícies do cateter, cama e da

mesa de Meyer foram consideradas importantes fontes exógenas.

xiv

ABSTRACT

Nosocomial bloodstream and urinary tract infections caused by Candida

spp. are common among the ICU patients. Candida nosocomial infection

has been generally related to the endogenous flora but exogenous infection

originating from the environment has occurred. In this work, we collected

samples of blood, urine, catheter of patients and the surface of bed and

Meyer table from ICU from tertiary hospital during one year period for

research and identification of fungus. It was yet verified the potential risk

factors for candidemia and candiduria and the antifungal susceptibility was

performed by broth microdilution method for Candida isolates recovered

from bloodstream. Additionally, we assessed the genetic diversity among C.

albicans isolates in an effort to establish the relationship between DNA

patterns of the strains recovered from clinical and environment samples

from the ICU. Among 345 blood samples, candidemia was recovered in 33

patients caused by different species of Candida while fungaemia by

Cunninghamella bertholetiae was identified in one patient. Candida non-

albicans was responsible by 51.5% of the cases of candidemia. Among 153

urine samples, candiduria was detected in 68 patients, from which it was

isolated 31.9% of Candida non-albicans. Candida species in the blood and

urine were statiscally associated with long term hospitalization and the most

common risk factors were the use of antibiotics and indwelling urinary

catheter. The majority of Candida isolates from blood were susceptible to

the antifungals tested. The analyses using RAPD among 31 C. albicans

isolates from blood, urine, catheter, surface of bed and Meyer table

confirmed that the Cnd3 and Cnd4 primers have high discriminatory power.

In conclusion, although candidemia was strongly associated to endogenous

sources such as candiduria, it was observed that catheter, surface of bed

and Meyer table were also considered important exogenous sources of

infection.

1 INTRODUÇÃO

1.1 Aspectos gerais

Candidíase é uma infecção normalmente secundária aguda ou crônica,

com manifestações clínicas extremamente diversificadas podendo produzir

lesões que variam de uma simples irritação no tecido cutâneo até uma

resposta granulomatosa. As lesões podem ser superficiais com localização

principalmente nas mucosas bucal e vaginal, ou sistêmica, verificando-se em

alguns casos, septicemia por Candida (Menezes et al. 2005).

As leveduras do gênero Candida incluem aproximadamente 200

espécies, dentre as quais C. albicans, C. dubliniensis, C. famata, C. glabrata,

C. guilliermondii, C. haemualaii, C. inconspicua, C. kefyr, C. krusei, C. lambica,

C. lipolytica, C. lusitaniae, C. novergensis, C. parapsilosis, C. pelliculosa, C.

rugosa, C. sake, C. spharice, C. tropicalis e C. zeylanoides estão associadas

com candidíase no homem e/ou em animais (Hajjeh et al 2004; Segal, 2004;

Almirante et al. 2005; Colombo et al. 2006). Candida albicans é a espécie

patogênica de maior prevalência na maioria das casuísticas estudadas (Richet

et al. 2002). Espécies não-albicans, entretanto têm aumentado

gradativamente, sendo que C. tropicalis, C. glabrata e C. parapsilosis são

comumente isoladas em casos de candidíase relatadas por diferentes

pesquisadores (Pfaller et al. 1999; Sota et al. 1999; Cantón et al. 2001; Galván

& Mariscal 2006).

2

O gênero Candida faz parte da microbiota da pele, das mucosas, do trato

digestivo e geniturinário humano ou de animais, encontrando-se também

saprofiticamente em plantas, objetos inanimados e no meio ambiente

havendo, portanto fatores ligados ao hospedeiro ou ao microrganismo que

influenciam na transformação dessas leveduras de saprófitas para parasitas

(Galván & Mariscal, 2006).

1.2 Mecanismo de patogenicidade

1.2.1 Fatores relacionados ao hospedeiro

A capacidade de produção de infecção por espécies de Candida depende

mais do hospedeiro do que do fungo. A candidíase pode ocorrer pelo

rompimento do equilíbrio parasita-hospedeiro, que pode ser desencadeado

pelas alterações das barreiras teciduais, da microbiota autóctone e da

resposta imune (Drago et al. 2000; Calderone & Fronzi, 2001).

Alterações na superfície da pele ou mucosas possibilitam a proliferação

ou mudança do sítio anatômico da levedura contribuindo para a instalação de

Candida no organismo do hospedeiro. Esse fator é comum em pacientes que

sofrem constantemente traumatismo devido a procedimentos invasivos, como

sondas e cateteres, e em pacientes com extensas queimaduras (Pulcini et al.

2006).

Espécies de Candida, especialmente C. albicans, consideradas como

pertencentes à microbiota autóctone humana, de orofaringe, dobras da pele,

secreções brônquicas, vagina, urina e fezes (Odds, 1988; Macphail et al.

2002) podem, em determinadas circunstâncias como uso de antibioticoterapia

3

prolongada, proliferarem desencadeando infecção. Pacientes de unidade de

terapia intensiva, que geralmente recebem altas doses de antibióticos, tornam-

se mais propensos à produção de infecção por estas leveduras (Safdar et al.

2002).

Mecanismos mediados por imunidade celular e humoral constituem uma

eficiente proteção contra infecções por fungos do gênero Candida (Richardson

& Warnock, 1994). O papel da atividade de neutrófilos contra infecções

sistêmicas pode ser evidenciado pelo aumento de infecções disseminadas em

pacientes submetidos à quimioterapia (Merz, 1990). Neutrófilos e macrófagos

participam na defesa do hospedeiro devido à sua ação microbicida

(Greenfield, 1992). Por outro lado, a importância das células T na prevenção

do desenvolvimento de candidíase mucocutânea tem sido demonstrada.

Candidíase é freqüente em crianças com problemas no timo, principal órgão

formador de linfócitos T, e em pacientes com a síndrome da imunodeficiência

humana adquirida (AIDS ou SIDA), em que se observa uma acentuada

diminuição dessas células (Merz, 1990). A imunidade humoral pode auxiliar na

defesa do hospedeiro através da formação de anticorpos, que associados ao

sistema complemento, atuam como opsonizadores para as células

fagocitárias, ou impedem a adesão do microrganismo às células do

hospedeiro (IgA secretora) (Odds, 1988; Samaranayake & MacFarlane, 1990).

1.2.2 Fatores relacionados ao microrganismo

Candida albicans e outras espécies do gênero possuem características

celulares e moleculares que possibilitam a produção de infecções. Estas

4

características estão relacionadas principalmente à adesão, ao dimorfismo

(variação de antígenos de superfície), à variabilidade fenotípica (fenômeno

switching), e à produção de toxinas e exoenzimas, como proteases e

fosfolipases produzidas pelos microrganismos (Hellstein et al. 1993; Vargas et

al. 2000; Fotedar & Al-Hedaithy, 2003).

Os mecanismos de patogenicidade das espécies de Candida variam de

acordo com o tipo de infecção. A invasão da corrente sangüínea e

crescimento nos tecidos podem requerer determinados fatores de virulência

que podem ser diferentes daqueles para causar doenças na superfície das

mucosas (De Bernardis et al. 1993; Venkatesan et al. 2005). No

estabelecimento da infecção sistêmica os patógenos oportunistas são

capazes de evadirem do sistema imune, sobreviverem e iniciarem o seu

processo de divisão, difundindo-se para os órgãos internos do hospedeiro

(Casadevall & Piorfski, 2001). O mecanismo de produção de lesões por

fungos do gênero Candida não é totalmente conhecido. Não há evidências se

a invasão da levedura está mais relacionada à falhas no sistema de defesa do

hospedeiro ou a propriedades específicas da levedura (Venkatesan et al.

2005).

A capacidade que o microrganismo tem de se aderir a superfícies das

células do hospedeiro representa o primeiro mecanismo da patogênese

(Calderone & Fronzi, 2001). As doenças infecciosas, de uma maneira geral,

são conhecidas por começar com a fixação do patógeno a um alvo particular

no hospedeiro, como ocorre com a candidíase. A parede das leveduras do

5

gênero Candida, como C. albicans, não possui apenas a propriedade de

conferir a forma estrutural à célula, mas também é o local onde se inicia a

interação entre esse fungo e o meio ambiente (Calderone & Fronzi, 2001).

Isso ocorre porque estas leveduras apresentam proteínas denominadas

adesinas que permitem a sua adesão a elementos extracelulares,

considerados receptores, como fibrinogênio, fibronectina e laminina, presentes

nos tecidos humanos (Vardar-Ünlü, 1998, Calderone & Fronzi, 2001; Yang,

2003).

Candida albicans pode se apresentar sob a forma de levedura ou

filamentosa, o que caracteriza o seu dimorfismo (Brown & Gow, 1999; Ernst,

2000). A formação de hifas é considerada importante fator de virulência não

apenas por promover a invasão da célula para o interior da mucosa, mas

também por impedir que as células de Candida sejam englobadas por

macrófagos e neutrófilos (Yang et al. 2003). A transição de leveduras para

hifas pode ser influenciada pela temperatura, pH, fontes de carbono e

substâncias químicas (Odds, 1988, Lan et al. 2002). Sua capacidade de

mudar de fase de levedura para filamentosa é importante para uma maior

interação com o hospedeiro, facilitando a adesão, e aumentando assim a sua

virulência (Cutler, 1991). As células em forma de leveduras e de hifas podem

estar presentes no hospedeiro não somente durante o processo de infecção,

mas também durante o processo de colonização do fungo (Souza et al. 1990;

Bartie et al. 2001).

6

As variações na morfologia de colônias de espécies de Candida,

descritas principalmente em C. albicans, caracterizadas como fenômeno

switching, parecem estar envolvidas no mecanismo de virulência dessas

leveduras. Nesse fenômeno, a mudança fenotípica que se expressa pela

morfologia, induz provavelmente alteração na fisiologia e na patogenicidade

do microrganismo (Lian et al. 2003, Laffey & Butler, 2005). Esse mecanismo

pode permitir que um organismo adaptado ao meio ambiente altere, através

da expressão de um gene seletivo, a resposta fúngica frente aos agentes

antifúngicos (Lachke et al. 2002; Miller et al. 2006).

A produção de proteinase e da fosfolipase tem sido relatada como sendo

um importante determinante de patogenicidade de C. albicans (Cutler, 1991;

Pincus et al. 1999, Menezes et al. 2005). As proteinases têm afinidade por

substratos tais como queratina, colágeno desnaturado, hemoglobinas, matriz

celular e albumina (Rüchel et al. 1982; McDonalds & Odds, 1983; Ghannoun &

Abu-Elteen, 1990; Culter 1991; Odds 1994, Ibrahim et al. 1995, Calderone &

Fronzi, 2001) envolvidas em vários processos bioquímicos. Esses atributos

estão associados a diversos fatores de virulência como formação de

pseudomicélio, adesão e fenômeno “switching”, tornando mais complexos os

mecanismos de patogenicidade de leveduras (Naglik et al. 2003, Naglik et al.

2004). O primeiro relato de fosfolipase em C. albicans foi publicado em 1966

(Werner, 1966). A presença de fosfolipases na superfície da levedura e na

extremidade do pseudomicélio propicia a lesão tecidual por alterar os

constituintes lipídicos da membrana celular do hospedeiro. Esta enzima tem

7

sido detectada em poucas espécies, como C. albicans e C. glabrata

(Samaranayake et al. 1984; Banno et al. 1985; Hube, 1996; Ghannoum, 1998;

Ghannoum, 2000). Williams et al. (1990) verificaram que 94% de C. albicans

isoladas da cavidade bucal de pacientes com AIDS, foram produtoras de

fosfolipase. Outras enzimas, como glucoamilase, fosfatase ácida e

metalopeptidase, provavelmente correlacionadas com virulência podem ser

encontradas em leveduras do gênero Candida (Naglik et al. 2003).

1.3 Manifestações clínicas

As infecções decorrentes da ação patogênica de fungos do gênero

Candida, denominadas candidíases, podem envolver a pele, as mucosas e

órgãos internos atingindo algumas vezes o sistema sanguíneo. De acordo

com o envolvimento do organismo no hospedeiro, a candidíase pode ser

classificada em superficial e sistêmica.

1.3.1 Candidíase superficial

A candidíase com envolvimento superficial acomete pele, unhas e

mucosas orofaríngeas e genitais (Ghannoum, 2001).

As infecções da pele se localizam principalmente em áreas intertriginosas

úmidas, como os espaços interdigitais, os sulcos submamários, axilas e

pregas suprapúbicas. As lesões se caracterizam por se apresentarem

eritematosas, úmidas, com bordos mal definidos e escamosos formados por

vesículas que se rompem precocemente. Em alguns casos, observa-se a

presença de placas secas, escamosas e pústulas (Samanarayake et al. 2002).

8

A onicomicose, definida como infecção fúngica ungueal, representa 20%

das doenças das unhas, sendo uma das mais freqüentes causas de

onicopatias em todo o mundo (Arena & Ruiz-Esmenjaud, 2004). Essa infecção

pode manifestar-se como um edema eritematoso da prega ungueal

(paroníquia), ou como uma separação da placa ungueal do seu leito

(onicólise). Esse tipo de infecção, segundo as recomendações da

nomenclatura das infecções fúngicas proposta pela "Sociedade Internacional

de Micologia Humana e Animal", quando o agente causal se trata de

leveduras do gênero Candida, deve ser denominada candidoses ungueais

(López-Jodra et al. 1999). Onicomicose por Candida spp afeta

aproximadamente 5% da população mundial, sendo altamente freqüentes na

América Latina (Arenas & Ocego 1997; Murray & Dawber, 2002) e representa

em torno de 30% de todas as infecções micóticas superficiais (Migdley et al.

1994).

A candidíase de mucosa bucal pode se apresentar sob quatro formas

clínicas. A forma eritematosa, a qual é representada por áreas avermelhadas,

localizadas principalmente no palato, língua e mucosa bucal. A

pseudomembranosa, onde se observa a formação de lesões membranosas de

cor branca à amarelada em toda a mucosa, a queilite angular que acomete as

comissuras labiais com aspectos clínicos, que variam desde os fissurais a

ulcerados e a candidíase hiperplásica que se apresenta sob a forma de placas

ou nódulos esbranquiçados, firmemente aderidos às áreas da mucosa,

podendo ocorrer na língua e ser confundida com a leucoplasia pilosa

9

(Cavassani et al. 2002). Lesões de mucosa bucal são frequentemente

relatadas em pacientes imunocomprometidos, particularmente em AIDS.

Candidíase vulvovaginal (CVV), processo inflamatório que acarreta

corrimentos, pruridos, além de incômodos como ardência e dor ao urinar

podem ser decorrentes de diversos fatores, como o abafamento da área

vaginal, higiene pessoal inadequada, mudança de pH ou até mesmo o uso de

contraceptivos (Ferrazza et al. 2005). A freqüência de CVV tem aumentado

gradativamente, evoluindo de 0,5% em 1968 para 22,5% em 1998, época em

que se tornou a causa mais comum de infecção vaginal (Adad et al. 2001).

Atualmente, CVV está entre os principais problemas ginecológicos que afetam

mulheres em idade reprodutiva, atingindo milhares de pessoas no mundo

(Costa et al. 2004). Há estimativas de que provavelmente 55,7% de todas as

mulheres terão pelo menos um episódio de vulvovaginite por Candida spp ao

longo de suas vidas (Foxman et al. 2000).

1.3.2 Candidíase sistêmica

Esse tipo de infecção ocorre quando o fungo se instala em diferentes

órgãos do hospedeiro, com localização mais freqüente nos pulmões e trato

urinário, sendo que em determinados indivíduos podem levar a candidemia

(Galván & Mariscal, 2006).

Uma das características mais importantes com relação à candidíase

sistêmica é sua associação à altas taxas de mortalidade. A taxa média de

mortalidade em pacientes com essa patologia nos Estados Unidos é de

aproximadamente 38% (Beck-Sagué & Jarvis 1993), em Israel de 21,5%

10

(Rennert et al. 2000), na Espanha oscila entre 22 e 33,3% (Sota et al. 1999;

Saballs et al. 2000), enquanto no Brasil é de aproximadamente 50% (Colombo

et al. 1999).

Em pacientes hospitalizados a combinação de vários fatores constitui

riscos para candidíase invasiva e candidemia (Cantón et al. 2001). O uso de

cateter, de antibióticos, nutrição parenteral, freqüentementes utilizados em

pacientes internados contribuem para uma maior capacidade de invasão por

leveduras do gênero Candida (Frazer et al. 1992; Franklin & Metry 1992;

Fridkin & Jarvis, 1996).

A incidência das infecções sistêmicas por Candida tem sido descrita

principalmente em indivíduos hospitalizados, particularmente em unidade de

terapia intensiva (Vincent et al. 1998), verificando-se um grande aumento nas

últimas décadas. Segundo Schwesinger et al. (2005), em um hospital terciário

alemão, de necropsias realizadas no período de 1994 – 1998, verificou-se

uma incidência de 3% de candidíases invasivas e no período compreendido

entre 1999 – 2003, a mesma passou a ser de 10%.

1.4 Infecções nosocomais por Candida spp.

Infecções invasivas são consideradas importantes causas de morbidade

e mortalidade em hospitais (Saleh & Al-Hedaithy, 2003, Boo et al. 2005). A

tecnologia disponível na área médica e laboratorial, para diagnóstico e

tratamento, além do aprimoramento das medidas de suporte de vida a

pacientes críticos, particularmente os de unidade de terapia intensiva,

possibilitaram uma maior sobrevida de portadores de doenças degenerativas

11

e neoplásicas, pós-cirúrgicos e de crianças prematuras, aumentando o risco à

aquisição de infecções (Araújo, 1998, Antunes et al. 2005). Alterações na

resposta imune do hospedeiro, rompimento de barreiras e exposição a vários

antibióticos, rendem aos pacientes de UTI altamente suscetíveis, infecções da

corrente sangüínea, do trato respiratório e urinário (Arantes et al. 2003). Um

estudo realizado por Appelgren et al. 2001, em unidades de terapia intensiva,

mostrou que 35% dos pacientes tiveram infecção nosocomial, sendo que 17%

eram infecções da corrente sanguínea.

Espécies de fungos pertencentes aos gêneros Candida e Aspergillus e a

classe dos Zygomycetos são os responsáveis pela maioria dessas infecções

(Anaisse et al. 1989; Wingard et al. 1991). É de grande interesse a elevada

freqüência de candidíase detectada nos grandes hospitais. Diversos fatores

concorrem para o aumento de infecções nosocomiais por Candida. Colombo &

Guimarães (2003) identificaram azotemia, uso de cateter venoso central, uso

de esteróides, cirurgia de grande porte, colonização por Candida spp. e

hemodiálise, como fatores de risco associados em pacientes hospitalizados.

Segundo esses autores, considerando os fatores de riscos mencionados, é

possível entender porque a maior freqüência de candidemia tem sido

documentada em indivíduos críticos admitidos em unidade de terapia

intensiva.

C. albicans é a principal espécie capaz de produzir candidemia (Colombo

& Guimarães, 2003), mas outras espécies não-albicans, como C. parapsilosis,

C. glabrata, C. krusei e C. tropicalis estão implicadas como agentes dessa

12

infecção (Colombo et al. 1999; Ellis et al. 2003; Marchetti et al. 2004, Medrano

et al. 2006). O aumento de espécies não-albicans como agentes importantes

de candidemia está ligado ao uso profilático, ou empírico, de agentes

antifúngicos, com menor suscetibilidade a esses (Rodriguez & Moreira, 1999;

Lewis & Klepser, 1999; Pfaller, 2000).

As espécies de Candida podem causar o mesmo tipo de enfermidade, no

entanto, a gravidade e as opções terapêuticas diferem entre as distintas

espécies e dentro da mesma espécie (Sandven, 2000; Cantón, 2001),

justificando o uso dos testes de suscetibilidade in vitro para uma terapia

adequada.

1.5 Tratamento

Anfotericina B é considerada o padrão ouro da terapia antifúngica. Esse

fármaco é um antibiótico macrolideo com atividade antifúngica frente a

numerosas espécies de fungos como Candida, Cryptococcus, Histoplasma

capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis e Aspergillus. É um antifúngico

altamente lipofílico, sendo administrado em associação à desoxicolato. A sua

principal limitação no emprego clínico é decorrente de seus efeitos

secundários, dos quais um dos mais graves é a nefrotoxicidade (López-

Medrado et al. 2005).

O tratamento das infecções fúngicas tem sido também realizado com

derivados azólicos, como fluconazol, itraconazol, voriconazol, ou ainda com

cancidas, como caspofungina, equinocandina e micafungina, os quais

apresentam maior facilidade na sua administração, e menores efeitos

13

colaterais do que os observados para anfotericina B (Ayeni et al. 1999;

Berrouane et al. 1999; Sheehan et al. 1999). A pouca toxicidade, fácil

administração e eficácia no tratamento têm resultado no uso abusivo de

fluconazol, o que provavelmente possibilitou o desenvolvimento da resistência

desse antifúngico em espécies de Candida (Rex et al. 1995; Rex & Pfaller

2002). As infecções invasivas por C. glabrata, principalmente em indivíduos

transplantados, têm ocorrido com altos índices de mortalidade devido ao uso

de fluconazol como profilático. Candida krusei é considerada intrinsecamente

resistente a este derivado azólico (Abi-Said et al. 1997; Bodey et al. 2002). Em

casos de candidíase que não respondem ao tratamento com fluconazol e

itraconazol, tem sido instituído o uso de voriconazol com boa eficácia (Lozano-

Chiu et al. 1999; Pfaller et al. 2002).

Voriconazol é um agente antifúngico triazólico de segunda geração, com

amplo espectro, sendo derivado sintético do fluconazol. As modificações

introduzidas na molécula de voriconazol resultaram em uma maior afinidade à

enzima 14-α-lanosterol demetilase e no aumento do espectro de ação.

Voriconazol exibe um amplo e potente espectro de ação contra os fungos: C.

albicans, Aspergillus sp, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum,

Coccidioides immitis, Scedosporium spp., Fusarium spp., Penicillium

marneffei, Trichosporon spp. e Saccharomyces cerevisae (Sabo & Abdel-

Rahmanl, 2000; Bizarro & Dinis, 2003, Gimeno & Martinez, 2007), podendo

apresentar atividade contra isolados que são resistentes ao fluconazol,

itraconazol e anfotericina B.

14

As equinocandinas, pertencente ao grupo das candinas, possuem três

agentes antifúngicos, caspofungina, micafungina e anidulafungina, sendo

fármacos que inibem a síntese da β-1,3-D glucana, componente da parede

celular de muitos fungos filamentosos e de leveduras (Bergold & Georgiadis

2004). A sua ação na parede faz com que esses agentes antifúngicos tenham

maior facilidade de ação sobre os fungos sem haver interferência no

hospedeiro e dessa forma são menos tóxicos para o paciente (Gimeno &

Martinez, 2007).

A caspofungina, licenciada para uso clínico, é um derivado semi-sintético

da pneumonocandina B, única equinocandina aprovada nos Estados Unidos,

indicada no tratamento de candidíase, onde as espécies de Candida

respondem a este antifúngico, inclusive as resistentes ao fluconazol

(Deresinski & Stevens, 2003). Resultados de estudos de caspofungina na

candidíase invasiva e na candidemia sugerem equivalente eficácia à

anfotericina B, mas com menos efeitos tóxicos (Abuhammour & Habte-Gaber,

2004).

Em um estudo realizado por Odio et al. (2004) foi avaliado o tratamento

com caspofungina em 10 recém-nascidos, com candidíase invasiva, causada

por C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. glabrata. Embora tivesse

sido registrada resistência ao fluconazol nas espécies não-albicans e em dois

casos de C. albicans, bem como resistência a anfotericina por C. glabrata, a

caspofungina mostrou-se com elevada eficácia, no tratamento da candidíase

destas crianças.

15

Embora haja boa resposta às terapias com diferentes agentes

antifúngicos no tratamento de candidíase, para pacientes de UTI há uma

enorme dificuldade na eficácia, pois além da sintomatologia das infecções

fúngicas ser totalmente inespecífica nesses pacientes dificultando o

diagnóstico, a debilidade do hospedeiro leva a uma diminuição na resposta ao

agente antifúngico (Muñoz et al. 2000). Nesses pacientes, a utilização de

antifúngicos se tem restringido àqueles com infecções fúngicas documentadas

ou com um alto risco de apresentar infecções por esses fungos (Wade, 1993;

Pizzo, 2000), para evitar o desenvolvimento de resistência aos antifúngicos.

Com a crescente incidência das infecções fúngicas sistêmicas, o

aumento do número de agentes antifúngicos além do aparecimento de

isolados resistentes, torna-se necessário à seleção adequada do antifúngico,

o que pode ser realizado através dos testes de suscetibilidade.

1.6 Suscetibilidade antifúngica in vitro

A utilização dos testes de suscetibilidade antifúngica in vitro para que seja

realizado um tratamento rápido, adequado e eficaz, tornou-se necessária

devido às constantes resistências detectadas em diferentes fungos (Colombo,

1994; Zardo & Mezzan, 2004; Yang et al. 2005; Magill et al. 2006)

Na última década, foram padronizados vários métodos para provas de

sensibilidade in vitro a antifúngicos e alguns deles são atualmente indicados

como referência, servindo para validar outras provas, incluindo àquelas

comerciais.

16

Alguns testes preconizados para detectar resistência a antifúngicos, têm

mostrado boa reprodutibilidade intra e interlaboratorial, além de correlação

com a evolução clínica dos pacientes. O National Committee for Clinical

Laboratory Standards (NCCLS), atual Clinical and Laboratory Standards

Institute (CLSI), publicou o documento M27-A2, para provas de suscetibilidade

a antifúngicos em leveduras como método de referência (NCCLS/CLSI, 2002).

Esse documento contém técnicas de macro e microdiluição em caldo para

determinar a concentração inibitória mínima (CIM). Elas foram desenvolvidas

para testes com leveduras dos gêneros Candida e Cryptococcus, frente à

anfotericina B, 5-fluorocitosina e azólicos, incluindo cetoconazol, fluconazol,

itraconazol, posaconazol, ravuconazol e voriconazol. Os possíveis fatores

como meio de cultura, pH, temperatura de incubação e leitura do teste, que

podem causar erros na determinação da CIM são padronizados neste método

(NCCLS/CLSI, 2002).

Um outro método do CLSI foi descrito no documento M44-A que

descreve uma prova sensível e prática, validada para testes de suscetibilidade

em Candida spp., utilizando discos impregnados com fluconazol ou com

voriconazol. O documento inclui critério de interpretação para os diâmetros de

halos obtidos com discos de fluconazol e valores esperados para cepas-

padrão permitindo verificar a concentração inibitória mínima (NCCLS/CLSI,

2004).

Testes de suscetibilidade in vitro aos antifúngicos são realizados por

vários sistemas comerciais, incluindo, dentre outros, ASTY (Kyokyuto Pharma-

17

Centical, Japão), ATB Fungus 2 (Api-bioMérieux, França), Candifast

(International Microbio, Itália), Etest (AB-Biodisck, Suécia), Fungitest (Bio-Rad,

Farança), Integral Systems Yeast (Liofilchen Diagnostics, Itália), Mycostandard

(Institut Pasteur, França), Mycototal (Behring Diagnostic, França) e Sensititre

®YeastOne (Trek Diagnostic System, EUA) (Arikan & Akova, 1997; Morace et

al. 2002; Bae et al. 2004; Durussel et al. 2004; Lombardi et al. 2004; Carrillo-

Muñoz et al. 2006).

Dentre os sistemas comerciais estudados, apenas alguns demonstraram

potencial suficiente para se constituir em uma alternativa para os laboratórios

assistenciais, como o Sensititre ®YeastOne e o Etest, os quais mostraram boa

reprodutibilidade e indiscutível capacidade em detectar a resistência in vitro

aos azóis, sobretudo ao fluconazol, quando comparados aos métodos de

macro e microdiluição para leveduras (Lombardi et al. 2004; Carrillo-Muñoz et

al. 2006).

Sensititre ®YeastOne é um método de microdiluição em caldo baseado

no documento M27-A2, que consiste de uma placa de microtitulação

descartável, que contém diluições seriadas desidratadas de seis agentes

antifúngicos, incluindo anfotericina B, fluconazol, itraconazol, cetoconazol,

voriconazol e 5-fluorocitosina, em cavidades individuais. As cavidades contêm

azul de Alamar como indicador colorimétrico, o qual melhora a leitura do ponto

de corte mediante mudança de cor azul para rosa. Os resultados são

expressos em CIM e estudos comparativos com os métodos NCCLS/CLSI

mostraram-se concordantes (Chaturvedi et al. 2004).

18

O Etest, método de difusão em ágar, utiliza uma tira contendo um

gradiente de concentração do agente antimicrobiano em estudo permitindo a

determinação de CIM. Este método é disponível para detectar a CIM de

anfotericina B, 5-fluorocitosina, cetoconazol, itraconazol, voriconazol,

fluconazol e caspofungina para leveduras dos gêneros Candida e

Cryptococcus e para alguns fungos filamentosos (Denning et al. 1997; Clancy

& Nguyen, 1999; Fernandes et al. 2003; Costa et al. 2004). Trabalhos

experimentais têm demonstrado concordância de Etest com os resultados

encontrados pelo NCCLS/CLSI (Hazen et al., 2003; Pfaller et al., 2003).

1.6.1 Resistência aos antifúngicos

Os derivados azólicos, como fluconazol e itraconazol, largamente

utilizados para o tratamento de candidíase, atuam inibindo a C14α–

demetilase, uma citocromo P-450 acarretando o acúmulo de esteróides

metilados e diminuição da síntese do ergosterol. Essa enzima inibe a

produção de ergosterol, que é o principal constituinte da membrana celular do

fungo, com conseqüente inibição do crescimento celular (Hitchocock et al.

1993; Vanden Bossche, 1997; Manavathu et al. 1999, Nenoff et al. 1999;

Burgess et al. 2000; Bizarro & Dinis, 2003). Alguns isolados de fungos podem

apresentar resistência aos derivados azólicos. São conhecidos três

mecanismos de resistência aos azólicos. 1- Redução do acúmulo intracelular

do fármaco resultante da utilização reduzida deste agente antifúngico ou do

aumento da efluxo do fármaco devido à ação de produtos de genes de

resistência aos antifúngicos, 2- Alteração estrutural da enzima C14α-

19

demetilase, resultando em uma diminuição na sua ligação aos azólicos, 3-

Aumento da produção de 14α-demetilase, superando o efeito inibidor dos

azólicos (Nenoff et al. 1999; Gao et al. 2003).

A resistência aos derivados azólicos pode ser influenciada pela

imunossupressão dos pacientes e uso prolongado do agente antifúngico

(Yang et al. 2003). O uso freqüente de terapia antifúngica em pacientes

imunocomprometidos, em decorrência de constantes recidivas de candidíase,

é o fator que provavelmente tenha maior influencia na ocorrência de

resistência a diferentes fármacos e selecionando espécies. Espécies de

Candida como C. glabrata e C. krusei, têm se mostrado resistentes ao

fluconazol devido ao uso prolongado desse agente antifúngico (Abbas et al.

2000; Kauffman et al. 2000; Taylor et al. 2000; Colombo et al. 2002; Trick et al.

2002). Segundo Barchiesi et al. (2002), pacientes infectados pelo HIV que

fazem uso de terapia antiretroviral altamente ativa (HAART) freqüentemente

apresentam leveduras na cavidade bucal resistentes ao fluconazol.

Há poucos relatos de resistência de espécies de Candida frente ao

voriconazol. Takakura et al. (2004) relataram que 100% dos isolados de C.

krusei e 60% de outras espécies não-albicans, com baixa suscetibilidade ao

fluconazol, foram suscetíveis ao voriconazol.

A anfotericina B pertence à ampla família dos macrolídeos poliênicos e

atua ligando-se ao ergosterol da membrana celular fúngica, alterando sua

permeabilidade o que acarreta desequilíbrio osmótico, pela perda de íons

intracelulares e conseqüentemente lise e morte das células (Vanden Bossche,

20

1997). A resistência de leveduras à anfotericina B é raramente detectada. A

resistência a anfotericina B por isolados de C. lusitaniae e C. tropicalis, assim

como de alguns fungos filamentosos como Trichosporon spp. e Fusarium spp

tem sido descrita (Vanden Bossche, 1997; Godoy et al. 2003; Antunes et al.

2005).

Diferenças na suscetibilidade, importante característica fenotípica de um

determinado patógeno aos agentes terapêuticos, pode ser detectada pela

variabilidade genética existente entre os isolados (Cirak et al. 2003; Schaller et

al. 2005).

1.7 Métodos moleculares

Várias técnicas de tipagem molecular têm sido utilizadas para

caracterização de diferentes microrganismos produtores de infecções no ser

humano (Voss et al. 1995; Lian et al. 2003). Esses procedimentos podem

responder questões relacionadas à patogênese do fungo, detecção de

microepidemias, distinção de infecção primária ou recidiva, à similaridade

entre as diferentes cepas e a tentativa de relacionar o isolado à fonte de

infecção (Merz, 1990; Voss et al. 1995; Soll, 2000; Lian et al. 2003).

A caracterização dos isolados de leveduras inclui métodos de tipagem

molecular, análise do DNA polimórfico amplificado aleatoricamente (RAPD),

métodos de fingerprinting, análise de fragmentos de DNA gerados por

enzimas de restrição (RFLPs) e hibridação por Southern blot do DNA

(Andrigheto et al. 2000; Dassanayake et al. 2000; Ergon & Gülay, 2004).

21

A cariotipagem por eletroforese de campo pulsado é considerada útil

devido ao seu alto poder discriminatório, sendo utilizada para diferenciação

intra e interespecífica de leveduras, devido a grande variedade no tamanho e

número de seus cromossomos (Dassanayake et al. 2000; Cirak et al. 2003).

Dentre as técnicas moleculares, o RAPD tem sido usado no estudo da

variabilidade entre espécies (Uijthof et al. 1994; Molnár et al. 1996). A

detecção e exploração de seqüências de polimorfismos de DNA ocorridos

naturalmente representam um dos mais significativos desenvolvimentos na

biologia molecular. O método RAPD tem sido bastante utilizado principalmente

pela vantagem de ser simples e rápido (Tavares et al. 1992).

O RAPD requer uma pequena quantidade de DNA e permite a

visualização de um grande número de marcas polimórficas. O uso de RAPD

tem-se mostrado útil nos estudos de microrganismos para o quais não se tem

muita informação genética. A técnica é baseada na amplificação de

fragmentos não específicos de DNA, em reações sucessivas de

polimerização. Como descrito por Williams et al. (1990), os oligonucleotídios

são construídos com seqüências aleatórias, ao contrário da PCR

fingerprinting, revelando polimorfismos em toda a extensão do genoma. Tais

polimorfismos são reconhecidos pela presença de um fragmento amplificado

em um dos genomas em relação à ausência desse mesmo fragmento em

outro.

O desenvolvimento da técnica de RAPD representou um marco na

caracterização molecular de diversos microrganismos, especialmente para

22

identificação de espécies microbianas, quando pequenas seqüências

genômicas são avaliadas (Ergon & Gülay, 2004; Pinto et al. 2004). A análise

de RAPD é projetada para caracterizar isolados dentro de uma mesma

espécie (Melo et al. 1998; Cirak et al. 2003) e para enfoques epidemiológicos

evidenciando uma relação entre fonte ambiental e manifestações clínicas

(Soll, 2000; Lian et al. 2003). Essa técnica, além de gastar menos tempo, é de

fácil aplicabilidade e os resultados têm demonstrado o alto poder

discriminatório e eficácia (Soll, 2000). A análise de RAPD tem também sido

usada em vários estudos em que é investigada a relação clonal entre

diferentes espécies de Candida obtidas de vários espécimes de pacientes

hospitalizados em diferentes unidades hospitalares, incluindo unidade de

terapia intensiva (Arif et al. 1996; Hedderwick et al. 2000).

A análise de RAPD foi usada por Pinto et al. (2004), para verificar a

variabilidade genômica de 37 isolados obtidos de diferentes regiões do corpo

de 11 pacientes imunocomprometidos infectados com o HIV, permitindo

verificar polimorfismo intra e inter específicos entre isolados de um mesmo

paciente e entre os isolados de diferentes pacientes.

Em experimentos utilizando diferentes materiais clínicos de um mesmo

indivíduo, usando RAPD para tipagem de C. albicans isoladas de pacientes de

UTI, Vrion & Matsiota-Bernard (2001) conseguiram estabelecer a natureza

endógena de 17 isolados desta espécie. Em isolados clínicos de C.

parapsilosis, Dassanayake et al. (2000) observaram através de RAPD

variações genéticas intra-espécies, as quais foram verificadas pelos padrões

23

diferentes de bandas. Esses experimentos demonstram a capacidade desse

método em determinar a epidemiologia de infecções por Candida.

PCR fingerprinting utiliza oligonucleotídeos que são específicos para

seqüências curtas e repetitivas hipervariáveis de leveduras, permitindo que

isolados sejam identificados com sensibilidade suficiente para detectar

diferenças inter e intra espécies (Dassanayake et al. 2000; Meyer et al. 2001).

Esse método, devido à sua eficácia, é usado com freqüência, pois permite

verificar a epidemiologia de fungos envolvidos em infecções nosocomiais

(Schönian et al. 1993; Dassanayake et al. 2000).

A técnica de RFLP é utilizada para caracterizar microrganismos pelos

padrões derivados da clivagem de seu DNA, cujos comprimentos dos

fragmentos produzidos podem diferir quando o DNA é digerido com diferentes

enzimas de restrição. Os padrões de bandas gerados podem ser usados para

diferenciar uma espécie de outra (Irobi et al. 1999; Mirhendi et al. 2005).

24

2 JUSTIFICATIVA Como exposto anteriormente, o aumento da incidência das infecções

fúngicas nosocomiais nas últimas décadas, faz com que esse tema seja

abordado por muitos pesquisadores. O registro de maior incidência dessas

infecções é observado principalmente em indivíduos imunocomprometidos,

como pacientes com AIDS, transplantados de medula óssea e órgãos sólidos,

nos submetidos à quimioterapia e naqueles que permanecem longos períodos

em hospitais essencialmente nos pacientes de UTI (Hazen 1995, Voss et al.

1995). A maior sobrevivência detectada nestes indivíduos induz a aquisição

de infecções oportunísticas como a candidíase. Em pacientes

imunocomprometidos com granulocitopenia acentuada, há um risco maior de

infecções sistêmicas por Candida, como a candidemia (Medrano et al. 2006).

A identificação da espécie de Candida, nos últimos anos, tem-se

mostrado de grande importância, pois tem sido verificada uma tendência de

mudança de etiologia da candidíase. Apesar de C. albicans ser o agente

etiológico mais comumente identificado, espécies não-albicans, têm-se

mostrado predominantes (Brilhante et al. 2005, Menezes et al. 2005). As

infecções observadas em diferentes casuísticas estudadas em pacientes de

unidade de terapia intensiva mostram as espécies de Candida não-albicans

como responsáveis por altas taxas de morbidade e mortalidade (Aquino et al.

2005).

O tratamento rápido de candidíase, provavelmente faz com que diminua

os casos de mortalidade. A eficácia do agente antifúngico pode ser detectada

através da realização prévia de testes de suscetibilidade in vitro, pois há

25

alguns microrganismos que podem ser resistentes aos diferentes antifúngicos.

O teste de suscetibilidade de diluição em caldo, preconizado pelo CLSI,

proporciona na maioria das vezes, bons resultados de leitura de end-point.

Tem sido descrito que há uma concordância in vitro e in vivo dos resultados

de suscetibilidade, principalmente quando se refere a detecção de resistência.

Há vários fatores que interferem na aquisição de candidíase nos

pacientes de UTI. Eliminar os fatores endógenos é uma tarefa difícil, mas

fatores exógenos podem perfeitamente serem contornados, o que

provavelmente evitaria vários casos de candidíase nosocomial. Sendo assim,

a verificação das características moleculares, usando testes como o RAPD,

que permite diferenciação intra-espécie torna-se de grande valia para o auxílio

de determinação dessas fontes exógenas ou endógenas, contribuindo na

prevenção de candidíase.

26

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Identificar e caracterizar leveduras do gênero Candida de fômites

(cateter, mesa de Meyer e cama) e amostras clínicas (sangue e urina) de

pacientes da unidade de terapia intensiva do Hospital das Clínicas da

Universidade Federal de Goiás.

3.2 Objetivos específicos

a. Isolar e identificar fungos presentes na corrente sangüínea e urina de

pacientes da UTI.

b. Avaliar a prevalência das espécies de Candida presentes na corrente

sangüínea e na urina e detectar os fatores de riscos para candidemia e

candidúria em pacientes da UTI.

c. Avaliar o padrão de suscetibilidade in vitro de amostras de Candida

isoladas do sangue dos pacientes frente à anfotericina B, fluconazol,

itraconazol e voriconazol.

d. Analisar os isolados de C. albicans genotipicamente, tentando

correlacionar os padrões de DNA obtidos de amostras clínicas e

ambientais da Unidade de Terapia Intensiva.

27

4 PRODUÇÃO CIENTÍFICA

a. ARTIGO 1: Candida colonization in intensive care unit patienst’s urine

b. ARTIGO 2: Species distribution and antifungal susceptibility patterns of

Candida spp. bloodstream isolates from a Brazilian tertiary care hospital

c. ARTIGO 3: Molecular epidemiological analysis of bloodstream of

Candida albicans

d. ARTIGO 4: Nosocomial invasive infection caused by Cunninghamella

bertholletiae: case report

28

4.1 ARTIGO 1: Candida colonization in intensive care unit patienst’s urine

29

30

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32

33

4.2 ARTIGO 2: Species distribution and antifungal susceptibility patterns of Candida spp. bloodstream isolates from a Brazilian tertiary care hospital.

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38

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41

4.3 ARTIGO 3: Molecular epidemiological analysis of bloodstream of Candida albicans

42

Molecular epidemiological analysis of bloodstream of Candida albicans

Xisto Sena Passos1, Werther Souza Sales2, Carolina Rodrigues Costa2, Janine de

Aquino Lemos2, Lúcia Kioko Hasimoto e Souza2, Keili Souza2, Luiz Augusto Pereira3,

Maria do Rosário Rodrigues Silva2,4

1Universidade Paulista, Goiânia, GO; Brazil; 2Instituto de Patologia e Saúde Pública

da Universidade Federal de Goiás, GO, Brazil, 3Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Goiás, 4Rua 15, no. 108 Apto. 700, Setor Oeste, Goiânia,

GO, 74.140-090, Brazil

Summary: Candidemia is generally related to the endogenous flora but exogenous

infection originating from hospital staff or from the environment has been determined

as occurring. The randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) method can reveal

strain specific variation. In this work, we used a RAPD assay to assess genetic

diversity among C. albicans isolates in an effort to find the relatedness between DNA

patterns of the strains recovered from clinical and environment samples from the ICU

from the Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás. The primers

named Cnd3 (5´-CCAGATGCAC-3`) and Cnd4 (5’-ACGGTACACT-3`) were used as

single primers in the PCR. RAPD profiles from blood and urine from the same patient

were identical in almost all samples studied, except for one patient. The bed of this

patient had the same genotype from his blood. Although most of C. albicans isolates

probably had had an endogenous origin, the finding of isolates from the patients with

same profile as the environment isolates suggest that the candidemia may be

resulted from an exogenous source.

Key words: Candida albicans, PCR, RAPD, nosocomial infection Correspondence: Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva. Rua 15, no. 108 Apto. 700, Setor Oeste. 74.140-090 Goiânia – GO, Brasil. Phone: 55 62 3209-6127; Fax: 55 62 3202-3022. E-mail: rosario@iptsp.ufg.br

43

Introduction

Candida septicemia is considered as fungal major nosocomial infection and it is

largely associated with a least a 50% mortality rate [1,2,3]. ICU patients are

particularly susceptible to systemic infection because they are seriously ill and are

subjected to a number of therapeutic and supportive interventions (central venous

catheters, mechanical ventilations and tracheostomy), which breach physiological

barriers to infection [4,5].

Although the yeast species are considered important nosocomial pathogens,

little is known of their epidemiology. Candidemia is generally related to the

endogenous flora but exogenous infection originating from hospital staff or from the

environment has been determined as occurring [5]. In cases in which an exogenous

source is involved, the sanitary measures are mandatory to prevent the cross-

transmission of C. albicans.

Molecular typing system can be employed to characterize the pathogen to the

subspecies level or still to determine whether the infections studied are due to same

strain or due to different strains [3,6,7]. The randomly amplified polymorphic DNA

(RAPD) method, that use specific short oligonucleotide primers which can be

arbitrarily primed at multiple positions of the yeast genome, can reveal strain specific

variation. This method has been used to characterize the genetic relations among

Candida species isolates [8,9].

In this work, we used a RAPD assay to assess genetic diversity among C.

albicans isolates in an effort to find the relationship between DNA patterns of the

strains recovered from clinical and environment samples from the ICU from the same

hospital over a period of one year.

44

Materials and Methods

Isolates and patients. A total of 10 C. albicans isolates recovered from blood

specimens of 10 patients of the ICU from a tertiary hospital between March 2004 and

April 2005 were included in this study. Isolates of the same species recovered from

other sources related to these patients such as urine, catheter besides isolates from

environmental sources as of surface of bed and from Meyer table collected on the

same day were also taken in this study. The sources of isolates studied are related in

table 1.

The isolates were identified by conventional sugar assimilation and

fermentation methods and the germ-tube formation and confirmed by the

commercially available API 20C identification test (API Laboratory Products Ltd.,

Grafton Way, Basingstoke, Hants, England). All isolates were maintained in sterile

water at – 20oC and the purity of cultures was ensured by regular identification using

standard techniques.

Genotypic characterization

Preparation of DNA for randomly amplified polymorphic DNA (RAPD).

Yeasts obtained from stock cultures were sub-cultured on yeast-peptone dextrose

medium (1% yeast extract peptone, 2% glucose, 1.2% agar) at 37oC for 24 to 48

hours.

Genomic DNA extraction was based on the method described by Del Poeta et

al. 1999 [10] modified by Casali et al. 2003 [11]. Briefly, a heavy inoculum of C.

albicans strains grown in YEPD agar (Yeast Extract Peptone Dextrose) were

suspended in 0.5 ml TENTS (10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA pH 8.0, 200 mM NaCl,

2% Triton, 1% SDS) containing 0.2 ml of 0.45 mm glass beads and 0.5 ml of

45

phenol:chloroform and vortexed for 2 min. After the centrifugation for 10 min at 13000

g, the aqueous phase transferred to a new tube and the same volume of 100%

ethanol was added and incubated at -20oC for 1 h for DNA precipitation. The

precipitated DNA was resuspended in 0.5 ml TE (10 mM Tris HCl pH 8, 1 mM EDTA

pH 8.0) containing 50 µg/mL RNAse A, and incubated at 37oC for 30 min. The yeast

DNA was deproteinated and extracted from the sample by adding equal volume of

phenol and chloroform. Finally, the DNA was precipitated with 70% ethanol and after

dryed, stored at-20oC in 100 μl of TE buffer until further processing for PCR.

RAPD analysis

The primers named Cnd3 (5´-CCAGATGCAC-3`) and Cnd4 (5’-ACGGTACACT-3`)

were used as single primers in the PCR. Amplifications reactions as described by

Ergon & Gülay [12], were performed in volumes of 25 μl including about 25 ng of the

DNA template; 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl, 0.2 mM each of

the dATP, dCTP, dGTP and dTTP and 2.5 U Taq DNA polymerase (Invitrogen). The

primers were used at a concentration of 30 ng. Amplification was performed in a PCR

MJ Research Thermal Cycler model PTC-100 TM programmed for denaturation at

94ºC for 3 min; 45 cycles of 1 min at 94ºC, 1 min at 36ºC and 2 min at 72ºC, and

extension at 720C for 7 min. Amplification products were separated by

electrophoresis in 1.2% agarose gel containing 1x tris-borate-EDTA (TBE) buffer,

stained with ethidium bromide at 0.5 μg/ml and visualized under UV light. All

amplifications were reapeated at least twice.

46

PCR profile analysis

The banding profiles for each isolate were compared visually. Bands were recorded

as present (1) or absent (0). Simple matching´s similarity coefficient (SM) values for

each pair wise comparison between isolates were calculated and a similarity

coefficient matrix was constructed. An SM value of 1.00 represented the same

genotype; SM values between 0.80 and 0.99 represented clonally related isolates

and SM under 0.80 represented distinct strains [12]. Clonally related isolates are

presented as of the same pattern added of ` (e.g. A’ and A’’ for Cnd3 and 1’ and 1’’

for Cnd4).

Results

A total of 31 C. albicans isolates (10 of blood, 9 of urine, 5 of catheter, 4 of Meyer

table and 3 of bed) were submitted to molecular typing using the RAPD method. Both

two primers (Cnd3 and Cnd 4) used in this study were successful in eliciting banding

profiles for each isolate. Amplification products obtained were specific to each primer

and ranged from 4 to 8 bands with fragment size from 350 bp to 2000 bp for Cnd3

and from 3 to 6 bands with fragment size from 300 bp to a 3500 bp for Cnd4. Most of

the major bands were present in all isolates studied and almost all strains had a

conserved fragment: 650 Kb for both primers (Figs 1 and 2).

Both two primers had high discriminatory power. Among 31 C. albicans

isolates, 12 patterns were detected with primer Cnd3 and 14 patterns with Cnd4

(Table 1). The similarity coefficients for Cnd3 between profiles A-L were calculated

and ranged from 28% to 85%. Some strains had closely related patterns. The isolate

7 (A’) had high similarity with the isolates 4, 5 and 6 (A), the isolate 24 (F’) with

isolates 23 and 25 (F) and the isolate 34 (B’) with the isolates 10 and 11 (B). The

47

similarity coefficients for Cnd 4 between the profiles 1-14 ranged from 16 to 80%.

Profiles 1 to 15 were clearly different from 15 previously identified.

RAPD profiles from blood and urine from the same patient were identical in

almost all sample studied, except for patient 5, where the two clinical samples were

different by using the two primers. However it was observed that the isolate from the

bed of this patient (5) had a similar genotype as the one isolated from his blood.

Another interesting fact was verified with isolates 12 (surface of Meyer table of patient

3) and 40 (bed of patient 8) of C. albicans. These isolates presented had the same

genotype when isolated from blood and urine of their patients. Additionally, it was

detected the same genotype in isolates, 19 (catheter from patient 4), 32 (bed from

patient 6) and 42 (catheter from patient 9)

Discussion

Although nosocomial candidemia constitutes a growing issue, [3] it is quite difficult to

achieve a precise understanding of its epidemiology. Colonization precedes

candidemia and it is considered to be an important risk factor in endogenous

infections [13]. Tortorano et al. 2004 [14] showed a previous colonization of the

alimentary tract by the same Candida specie causing fungaemia. Candidemia has

been relationship with previous colonization of the urinary tract [15]. Urinary tract

colonization deserves consideration, because it is a common event in hospitalized

patients affecting 6.5-20% of patients [16]. In this work, molecular typing

demonstrated that the paired isolates from blood and urine were identical for patients

with C. albicans, suggesting an endogenous origin of candidemia.

It is well known that exogenous sources of C. albicans may be involved in the

development of nosocomial candidiasis [17]. In this study, it was found that strains of

48

C. albicans isolated from the blood of patients 5 and 8 were identicals to isolated from

surface of their beds. Besides, identical strains were isolated from blood of patient 3

and surface of Meyer table (table 1). These samples from environment were collected

on the same day of blood collection of patients with candidemia. Robert et al. 1995

[18] characterized strains of C. albicans colonized on admission as identical to other

patient that was culture negative on admission and acquired the yeast after 25 days,

suggesting cross infection. The epidemiology of nosocomial C. albicans isolates

infection is complex and the mechanism by which the patients in our study acquired

their strains remains not totally clear. However the finding of three isolates from the

blood of patients with the same molecular profile as the ones isolated from the

environment isolates suggest that the candidemia may be resulted from exogenous

source.

Exogenous acquisition of candidemia is also postulated to be associated with

intravascular devices and parenteral nutrition. The candidemia related to catheter has

been suggested by some researchers [19, 20]. The isolates from catheter and blood

of patient 6 had the same genotype, suggesting that the portal of entry of C. albicans

was via the catheter.

Interestingly, molecular typing, demonstrated that isolates of catheter from

patient 4 (isolate 19), of bed from patient 6 (isolate 32) and of catheter from patient 9

(isolate 42) also had the same genotypes. These results may infere in cross infection.

It is possible that C. albicans strains recovered in catheter or surface of bed was

arised from hands of hospital coworkers.

The 12 and 14 different patterns presented by primers Cnd3 and Cnd4

respectively, confirm the discriminatory value of RAPD, which is considered quite

similar to other powerful genotyping methods [3,5]. The RAPD assay using primers

49

Cnd3 and Cnd4 can be an important tool to identify the intra-specific genetic

variability among C. albicans isolates.

In conclusion, although candidemia was strongly associated to endogenous

sources as candiduria, it was indicated that catheter, surface of bed and Meyer table

can also be considered important exogenous sources of infection.

ACKNOWLEDGMENTS

The financial help received by the first author from the Universidade Paulista – Brazil.

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52

Table 1. Candida albicans isolates recovered from 10 ICU patients with candidemia and from other clinical and environment materials relationship to these patients.

Genotype (patterns) Patients Isolation date (mo/day/yr) Isolates Sources of isolates Cnd3 Cnd4

1. 09/12/2003 4-112A3E Catheter A 1

09/26/2003 5-112C6E Blood A 1

09/19/2003 6-112B7E Urine A 1

09/23/2003 7-112C1A Meyer table A’ 2

2. 12/18/2003 10-159C6A Blood B 3

12/12/2003 11-159B7A Urine B 3

3. 12/15/2003 12-164A1A Meyer table C 4

12/15/2003 13-164A6A Blood C 4

12/15/2003 14-164A7A Urine C 4

4. 01/06/2004 15-174B1E Meyer table C 4

01/06/2004 17-174B6A Blood D 5

01/06/2004 18-174B7A Urine D 5

01/06/2004 19-174B2A Catheter E 6

5. 05/31/2004 23-231I6A Blood F 7

05/17/2004 24-231G7A Urine F’ 8

05/31/2004 25-231I2E Bed F 7

6. 04/05/2004 30-234A3E Catheter G 9

04/05/2004 31-234F6A Blood G 9

04/05/2004 32-234A2A Bed E 6

7. 08/11/2004 34-280C1E Meyer table B’ 10

08/18/2004 35-280D6A Blood H 11

08/04/2004 36-280B7E Urine H 11

8. 10/29/2004 37-315A6E Blood I 12

11/19/2004 38-315D7E Urine I 12

10/29/2004 39-315A3E Catheter J 12

10/29/2004 40-315A2E Bed I 12

9. 11/10/2004 42-320A3E Catheter E 6

11/10/2004 43-320A6E Blood K 13

11/10/2004 44-320A7A Urine K 13

10. 05/04/2005 45-365B6A Blood L 14

05/04/2005 46-365B7A Urine L 14

53

12000 5000 2000 1650 1000 850 650 500 400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 MM

Figure1. RAPD Profiles of 31 Candida albicans isolates obtained with primer Cnd3. Profile A (lines 1-3:

catheter, blood and urine related with patient 1); profile A´(line 4: table Meyer related with patient 1);

profile B (lines 5, 6: blood and urine related with patient 2); profile C (lines 7, 8, 9 and 10: table Meyer,

blood and urine related with patient 3 and table Meyer related with patient 4); profile D (lines 11, 12

blood and urine related with patient 4); profile E (lines 13 ,19, 27: catheter related with patient 4, 19

bed related with patient 6, 27 catheter related with patient 9, respectively); profile F (lines 14, 16: blood

and bed related with patient 5); profile F’ (line 15: urine related with patient 5); profile G (lines 17, 18:

catheter and blood related with patient 6); profile H (lines 21, 22: blood and urine related with patient

7); profile I (lines 23, 24, 26: blood, urine and bed related with patient 8); profile J (line 25: catheter

related with patient 8); profile K (lines 28, 29: blood and urine related with patient 9), and profile L

(lines 30, 31: blood and urine related with patient 10).

54

12000 5000 2000 1650 1000 850 650 500 400 300

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 MM

Figure 2. RAPD Profiles of 31 Candida albicans isolates obtained with primer Cnd4. Profile 1 (lines 1,

2, 3: catheter, blood and urine related with patient 1), profile 2 (line 4: Meyer table related with patient

1); profile 3 (lines 5, 6: blood and urine related with patient 2); profile 4 (lines 7, 8, 9 and 10: Meyer

table, blood and urine related with patient 3 and Meyer table related with patient 4); profile 5 (lines 11,

12: blood and urine related with patient 4), profile 6 (line 13, 19, 27: catheter related with patient 4, bed

related with patient 6; catheter related with patient 9, respectively); profile 7 (lines 14, 16: blood and

bed related with patient 5), profile 8 (line 15: urine related with patient 5); profile 9 (lines 17, 18:

catheter and blood related with patient 6); profile 10 (line 20: Meyer table related with patient 7); profile

11 (lines 21, 22: blood and urine related with patient 7); profile 12 (lines 23, 24, 25, 26 blood, urine,

catheter and bed related with patient 8); profile 13 ( lines 28, 29: blood and urine related with patient

9); and profile 14 (lines 30, 31: blood and urine related with patient 10).

55

4.4 ARTIGO 4: Nosocomial invasive infection caused by Cunninghamella bertholletiae: case report

56

57

58

59

5 CONCLUSÕES

1. Foi observada uma elevada freqüência de candidúria em pacientes da UTI

(44,4%).

2. Candidúria e candidemia podem ser adquiridas após um longo período de

internação.

3. Espécies de Candida não-albicans estavam presentes no sangue e urina

com um percentual elevado.

4. A atividade in vitro de voriconazol foi maior do que a do itraconazol,

fluconazol e anfotericina B, sugerindo que voriconazol pode ser o azólico

mais efetivo no tratamento de infecções por Candida na corrente

sangüínea.

5. O encontro de isolados resistentes a diferentes antifúngicos mostra a

importância do uso dos testes de suscetibilidade in vitro para a terapia

adequada.

6. O ensaio de RAPD usando os primers Cnd3 e Cnd4 podem ser uma

ferramenta importante para identificar a variabilidade genética intra-

específica entre isolados de C. albicans.

7. A possível fonte de transmissão ambiental de candidíase encontrada em

três casos justifica a importância de maiores cuidados na UTI para evitar a

transmissão da infecção.

8. O achado de infecção por C. bertholletiae causando fungemia em pacientes

imunocomprometidos foi muito importante, porque este microrganismo é

normalmente um contaminante. Este achado mostra que tem que se ter um

grande cuidado no isolamento de fungos não usualmente causadores de

infecção.

60

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Zardo V, Mezzan A 2004. Os antifúngicos nas infecções por Candida sp.

NewLab 63:136-146.

79

7 ANEXOS

7.1 Normas para publicação na revista Medical Mycology –

Instructions to Authors (Artigo 3)

The official publication of the International Society for Human and

Animal Mycology, Medical Mycology is an international journal which

focuses on original and innovative studies of all aspects of medical,

veterinary and environmental mycology. The topics include, but are not

limited to mycological, biochemical and molecular investigations of

etiological agents of mycoses; aspects of pathogenesis, immunology,

and epidemiology of mycotic diseases; case reports of unusual medical

or veterinary fungal infections; laboratory approaches to the identification

of fungal pathogens, antifungal therapy and prophylaxis; mode of action,

pharmacokinetics and assessments of new antifungal agents;

investigations of the mycological aspects of the indoor environment, with

a focus on human and animal health. The aim of the journal is to present

the best scientific reports from throughout the world and in so doing to

provide a comprehensive reference base for medical mycologists,

microbiologists, clinicians, and environ-mental specialists.

Further information about the Journal including links to the online

sample copy, contents pages and copyright assignment form can be

found on the Journal homepage.

80

Please note that you and your co-authors in submitting this

manuscript are confirming that all authors have (a) made a substantial

contribution to the information or material submitted for publication, (b)

read and approved the final manuscript, and (c) no direct or indirect

financial incentive associated with publishing the article. In addition, by

submitting your work, you and your co-authors are stipulating that the

manuscript is not, either in whole or in part, currently under consideration

by any other scientific journal or has been previously published in either

hard copy or electronic format.

Types of Papers

Original papers. These may be of any length, but must have; (a) a

Cover-Page listing all authors and their affiliations and contact

information for the corresponding author, (b) a separate page for a

Summary, (c) text consisting of Introduction, Materials & Methods,

Results, and Discussion, (d) References, (e) Tables with footnoted

descriptions of all abbreviations contained in the table, and (f) Figures,

with appropriate figure legends allowing a reader to understand their

content without reference to the text. Manuscripts should be in English,

double-spaced, in no less than size 12 font. Pages should be numbered

consecutively, beginning with the cover-page. References are to be

81

numbered, in brackets, e.g., [1], in order of their citation in the text and

listed in the Reference section by their appearance in the text.

Reviews. Authors must first electronically submit an outline of their

proposed article for evaluation by the Editor. The outline should be no

more than two, double-spaced pages in 12 font, in which the authors

describe the objectives and contents of the report. The outline must be

submitted to the Reviews Editor, Francoise Dromer: dromer@pasteur.fr.

Once the proposal has been evaluated, the authors will be informed of

the results of the Review Editor’s initial consideration of their proposal.

NOTE - the journal does NOT accept uncommisioned reviews for

publication.

Case Reports. Such articles must make a distinct, novel contribution to

the understanding of the etiologic agents, its clinical manifestations,

and/or its treatment. They should NOT be based merely on the first

incidence of a known cosmopolitan or widely distributed etiologic agent in

the nations of the authors’ residence. Reports of unusual etiologic agents

MUST be substantiated with a living culture deposited in an

internationally recognized professional culture collection, defined as a

collection that has full-time staff dedicated to receiving, preserving and

shipping of culture cultures. Manuscripts MUST be in English and

82

prepared as is an original article, EXCEPT that the text should consist of

an Introduction, Case Report and Discussion.

Short Communications. These manuscripts are to provide an

opportunity for the presentation of preliminary or brief observations that

do not warrant a full paper. The manuscript should be prepared as is an

original article, except they may be no more than 10 double-spaced

pages in no less than size 12 font (including cover-page, abstract, text,

references, and tables/figures).

Letters. Letters to the Editor are intended to provide an opportunity to

discuss issues related to previous published original articles, case

reports or short communications and should not be used for the

presentation of the authors’ preliminary data from their own

investigations. Letters should be no more than 2 double-spaced pages, in

no less than size 12 font, including references.

Submission of manuscripts

All submissions to this journal should be made via the Manuscript

Central site: http://mc.manuscriptcentral.com/tmmy. Users who have not

used the site before must create an account from the link on the login

page. Assistance with this and all other areas of the site are available in

83

the User Guide, which is accessed via the ‘Get Help Now’ button at the

top right of all Manuscript Central web pages.

Preparation of manuscripts

1. Manuscripts must be written in English and submitted as a Word for

Windows (PC) file.

2. Manuscripts must be prepared in 12pt font with one (1) inch

margins all around and double spaced.

3. Papers should be organized as follows: Full title and Short title;

Name(s) and affiliations of author(s); Full postal address, telephone

and fax numbers, and email address for the corresponding author;

Summary (maximum 200 words); Keywords (up to five); Introduction;

Materials and Methods; Results; Discussion (as appropriate to the

article); Acknowledgements; References; Tables; Figure captions.

4. Statistics and measurements should be given in numerals when

followed by a unit (e.g., 2 mg but two patients). SI units must be used.

5. Abbreviations should be defined when first used in the text.

References

Use the Vancouver system in preparing the references. They should

be numbered sequentially in the order in which they first appear in the

text. References should be cited in the text within brackets. e.g., [1]. In

84

preparing your reference list, please note that works with six (6) or more

authors should be cited by the names of the first three (3) authors, with

the remaining authors included by et al. Journal names must be

abbreviated without the use of periods and should be in italic font. The

journal number should be in bold font and issue numbers should not be

included. In addition, include all page numbers of the citations. The

following examples illustrate the correct style for the different types of

references:

1. Journal article

Author AB, Author CD, Author EF, et al. [if six or more] Title of paper. J

Title Abbrev 1995; 00: 000-000.

2. Book chapter

Author AB, Author CD, Author EF, et al. [if six or more] Chapter title. In:

Editor AB, Editor CD, eds. Book Title With Initial Uppercase Letters, 5th

edn. Place: Publisher, 1995: 000-000.

3. Book

Author AB, Author CD (eds). Book Title With Initial Uppercase Letters,

5th edn. Place: Publisher, 1995.

85

4. Thesis

Author AB. Paper title with lowercase initials to all words. PhD thesis,

University, 1995.

5. Conference proceedings

Author AB. Paper title. In: Editor AB, ed. Proceedings Title, place, date.

Place: publisher, 1995: 000-000 (for abstracts the abstract number

should be cited instead of the page number).

6. Personal communications, Unpublished results etc References to

personal communications, unpublished results and papers submitted for

publication (but not yet accepted) should only appear in the text, and in

the following form: [A. B. Author, unpublished results]. [C. D. Author,

personal communication].

7. Journal article on the Internet

Abood S. Quality improvement initiative in nursing homes: the ANA acts

in an advisory role. Am J Nurs [serial on the Internet]. 2002 Jun [cited

2002 Aug 12];102(6):[about3 p.]. Available from:

<http://www. nursingworld.org/AJN/2002/june/Wawatch.htm>

86

8. Monograph on the Internet

Foley KM, Gelband H, editors. Improving palliative care for cancer

[monograph on the Internet]. Washington: National Academy Press; 2001

[cited 2002 Jul 9]. Available from:

<http://www.nap.edu/books/0309074029/html>

9. Homepage/Web site

Cancer-Pain.org [homepage on the Internet].

New York: Association of Cancer Online Resources, Inc.; c2000-01

[updated 2002 May 16; cited 2002 Jul 9]. Available from:

<http://www.cancer-pain.org>

10. Part of a homepage/Web site

American Medical Association [homepage on the Internet]. Chicago: The

Association; c1995-2002 [updated 2001 Aug 23; cited 2002 Aug 12].

AMA Office of Group Practice Liaison; [about 2 screens]. Available from:

<http://www.ama-assn.org/ama/pub/category/1736. html>

11. Database on the Internet

Open database:

Who’s Certified [database on the Internet]. Evanston (IL): The American

Board of Medical Specialists. c2000-[cited 2001 Mar 8]. Available from:

<http://www.abms.org/newsearch.asp_/www.abms.org/newsearch.asp>

87

Closed database:

Jablonski S. Online Multiple Congential Anomaly/Mental Retardation

(MCA/MR) Syndromes [database on the Internet]. Bethesda (MD):

National Library of Medicine (US). c1999 [updated 2001 Nov 20; cited

2002 Aug 12]. Available from:

<http://www.nlm.nih.gov/mesh/jablonski/syndrome_title.html>

12. Part of a database on the InternetMeSH Browser [database on the

Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US); 2002-[cited

2003 Jun 10]. Meta-analysis; unique ID: D015201; [about 3 p.]. Available

from:

<http://www.nlm.nih.gov/mesh/MBrowser_/www.www.nlm.nih.gov/mesh/

MBrowser> Files updated weekly.

Tables

Tables should be numbered according to their sequence in the text;

all tables should be referred to in the text. Each table should be supplied

on a separate sheet, never within the body of the text. The table heading

should be brief and self explanatory. Column headings should be brief

and include units in parentheses where applicable. Only horizontal rules

should be used.

88

Figures

Graphics must be submitted as JPEG, GIF or BMP files. Scanned

images should be of a sufficient resolution: 300 dpi for halftones/color;

500 dpi for combination halftones; 1000–1200 dpi for line art. Illustrations

should be submitted separate from the manuscript text file, either as

individual files or together in a single file. The journal has a limited

number of free colour pages within its annual page allowance. Authors

should consult the editorial office with respect to colour reproduction at

submission stage. Authors may be required to pay to guarantee colour

reproduction. Any figure submitted as a colour original may appear in

colour within the journal’s online edition.

Nomenclature

Proposals for names of new taxa of fungi must conform with the

requirements of the current International Code of Botanical

Nomenclature, as should the scientific names used for fungi. Binomials

should appear in italic; each must be spelt out in full at first mention in

both the abstract and text (thereafter, the generic name may be

appropriately abbreviated) and whenever used in the titles of figures and

tables.

89

Animals in research

Manuscripts containing information related to the experimental use

of animals must clearly state that the studies complied with relevant

professional and institutional animal welfare policies. Specifically, that

procedures involving animals conformed to the ILAR Guide for the Care

and Use of

Laboratory Animals (1996 and later editions) of the Institute of

Laboratory Animal Research, Commission on Life Sciences, National

Research Council (http://www.nap.edu/catalog/5140.html).

Disclosures of potential conflicts of interest

Authors of research articles should disclose at the time of

submission any financial arrangement they may have with a company

whose product is pertinent to the manuscript or with a company making a

competing product. Such information will be held in confidence while the

paper is under review and will not influence the editorial decision, but if

the article is accepted for publication, a disclosure statement will appear

in the journal. The intent of this policy is not to prevent authors with these

relationships from publishing work, but rather to adopt transparency such

that readers can make objective judgements on conclusions drawn.

90

Authorship contributions

Contributions must be substantial in order to warrant authorship.

Each author should have participated sufficiently in the work to take

public responsibility for the content. All other contributors should be listed

in the acknowledgements.

Electronic proofs

When proofs are ready, corresponding authors will receive e-mail

notification with a password and Web address from which to download a

PDF. Hard copies of proofs will not be mailed. To avoid delays in

publication, corrections to proofs must be returned within 48 hours, by

electronic transmittal, fax or mail.

Offprints

Corresponding authors will receive either fifty printed offprints or a

PDF of the final version of the paper. Preferences should be stipulated

when returning proofs.

Copyright

It is a condition of publication that authors assign copyright or licence

the publication rights in their articles, including abstracts, to ISHAM. This

enables us to ensure full copyright protection and to disseminate the

91

article, and the journal, to the widest possible readership in print and

electronic formats as appropriate. Authors may, of course, use the article

elsewhere after publication without prior permission from Informa UK

Ltd., provided that acknowledgement is given to the journal as the

original source of publication, and that Informa Healthcare is notified so

that our records show that its use is properly authorised. Authors retain a

number of other rights under the Informa UK Ltd. rights policies

documents. These policies are referred to at the Copyright FAQs page.

92

7.2 Protocolo do CEPMHA/HC/UFG

93

94

95

96

7.3 Termo de consentimento livre e esclarecido

Você está sendo convidado (a) para participar, com voluntário, em uma

pesquisa intitulada “Caracterização de fungos envolvidos em infecções nosocomiais”. Após ser esclarecido (a) sobre as informações a

seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine ao final deste

documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do

pesquisador responsável. Em caso de recusa você não será penalizado (a) de

forma alguma. Se aceitar participar e decidir retirar seu consentimento, não

será prejudicado em seu tratamento. Em caso de dúvida sobre a pesquisa,

você poderá entrar em contato com o pesquisador responsável Ms. Xisto

Sena Passos nos telefones: 3255-9858 / 9972-4158.

INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA

“Caracterização de fungos envolvidos em infecções nosocomiais”.

PESQUISADORES PARTICIPANTES

Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva – Investigadora responsável

Fone: (0XX62) 3209-6127

Ms. Xisto Sena Passos – Biólogo / Pesquisador

Fones: (0XX62) 3209-6127 / 3255-9858 / 9972-4158

OBJETIVO DO ESTUDO

Será avaliado um grande grupo de pacientes, os quais se encontram

internados na UTI do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás,

durante o período de fevereiro de 2003 a dezembro de 2004.

Provavelmente você já deve ter ouvido falar em micose. Esta doença é

causada por fungos que produzem lesões na pele ou em qualquer parte do

97

organismo humano, através deste estudo o responsável pelo paciente terá

acesso aos exames laboratoriais que ajudará o médico a tratá-la.

Neste trabalho, após a devida identificação e caracterização do fungo,

será realizado um teste, chamado suscetibilidade, no qual será verificado a

sensibilidade do fungo isolado frente a três medicamentos, anfotericina B,

itraconazol e fluconazol.

Através das informações obtidas no laboratório e com ajuda do médico,

nós tentaremos controlar melhor a doença e possivelmente evitar que outros

indivíduos a adquiram.

CONDUÇÃO DO ESTUDO

O paciente será submetido inicialmente à colheita de sangue e urina, pelo

profissional responsável pela UTI, assim que for internado.

Durante a permanência do paciente na UTI serão realizadas colheitas de

sangue e urina a cada sete dias. O material coletado será levado para o

laboratório de Micologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Publica da

UFGO, onde será submetido a exame micológico.

Estes exames não serão pagos pelo paciente.

PARTICIPAÇÃO AUTORIZADA

Participar deste estudo será uma decisão autorizada pela responsável e

este poderá se recusar a participar ou desistir deste estudo a qualquer

momento, sem explicar o porquê.

98

PACIENTES PARTICIPANTES DO ESTUDO

Neste estudo serão incluídos todos os pacientes (autorizados), que

apresentarem características ou não de fungemia internados na UTI do

Hospital das Clínicas da UFGO.

RISCOS

Não há riscos para o paciente. Nenhum tipo de medicamento será

utilizado por nós.

Para colheita do material, o paciente não será maltratado. A colheita do

sangue e da urina, não implicará em mal estar para o paciente.

BENEFÍCIOS

O estudo realizado por nós possivelmente contribuirá enormemente para

a redução de infecções nos hospitais por fungos.

CONFIDENCIALIDADE

Se o responsável concordar com a participação do paciente, as

informações clínicas e laboratoriais relacionadas ao paciente serão

confidencialmente mantidas em sigilo o tempo todo, nem o nome ou mesmo

iniciais irão constar em qualquer registro nesta pesquisa. O Comitê de Ética

poderá necessitar ter acesso aos seus registros médicos para verificação dos

formulários de estudo, no entanto, sua identidade será mantida em sigilo

absoluto.

99

RESPONSÁVEL

Este estudo será conduzido por:

Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva pelo fone (0XX62) 3209-6127.

(Investigadora responsável)

Ms. Xisto Sena Passos pelo fone (0XX62) 209-6127(Biólogo / Pesquisador)