NOVOS DESAFIOS DA PESQUISA EM NUTRIÇÃO E PRODUÇÃO ANIMAL

Edição 2010

Pirassununga – SP2010

NOVOS DESAFIOS DA PESQUISA EM NUTRIÇÃO E PRODUÇÃO ANIMAL

Edição 2010

OrganizadoresProf. Dr. Marcos Veiga dos SantosProf. Dr. Ricardo de AlbuquerqueProf. Dr. Francisco Palma Rennó

Prof. Dr. Luis Felipe Prada e Silva

Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Produção Animal

ISBN: 978-85-60014-09-5

Edição 2010

Os organizadores autorizam a reprodução total ou parcial deste trabalho, para qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

O conteúdo e revisão ortográfica são de inteira responsabilidade de seus autores.

Edição Editora 5DRua Visconde do Rio Branco, 670 Pirassununga - SP - CEP: 13630-115Tel.: 19 3562-1514Email: contato@5d.ppg.brwww.5d.ppg.br

CapaAlexandre RaisAlexandre de Oliveira Yamamoto

Editoração EletrônicaAlexandre RaisAlexandre de Oliveira YamamotoPaula Bertanha Izepom

Novos desafios da pesquisa em nutrição e produção animal / organizado por Marcos Veiga dos Santos ... [et al.]. – Pirassununga, SP: Editora 5D; Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Produção Animal, 2010. 260 p.

1. Nutrição animal. 2. Produção animal. I. Albuquerque, Ricardo de. II. Rennó, Francisco Palma. III. Silva, Luis Felipe Prada e.

SUMÁRIO

APRESENTAÇÃO

CAPÍTULO I 009Antibióticos, probióticos, prebióticos e simbióticos como aditivos zootécnicos para frangos de corte

CAPÍTULO II 028Imunização passiva como potencial ferramenta para manipulação da fermentação ruminal e seus efeitos em bovinos de corte e leite

CAPÍTULO III 051Avaliação do potencial antimicrobiano e de cicatrização do muco de escargot achatina SP

CAPÍTULO IV 069Fingerprinting por espectrometria de massas para identificação de agentes causadores da mastite bovina

CAPÍTULO V 088Biologia molecular no melhoramento do valor nutritivo de forragens tropicais

CAPÍTULO VI 105Leveduras na alimentação de monogástricos

CAPÍTULO VII 123Fontes de gordura na alimentação de vacas leiteiras: Fluxo intestinal de ácidos graxos e manipulação do perfil de ácidos graxos do leite

CAPÍTULO VIII 147Uso de enzimas exógenas na alimentação de frangos de corte

CAPÍTULO IX 165Modelagem matemática para o planejamento, otimização e avaliação da produção agropecuária

CAPÍTULO IX 192Efeito da interação nutrição e reprodução em reprodutores suínos

CAPÍTULO X 207Pesquisas com uso da soja como fonte de lipídeo na alimentação de ruminantes

CAPÍTULO XI 225Dieta completa extrusada na alimentação de equinos

CAPÍTULO XII 243Fisiologia do ciclo estral, sincronização do estro e ovulação em fêmeas bovinas

TEXTO APRESENTAÇÃO

FALTA O PROF. MARCOS ENVIAR

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CAPÍTULO I

ANTIBIÓTICOS, PROBIÓTICOS, PREBIÓTICOS E SIMBIÓTICOS COMO ADITIVOS ZOOTÉCNICOS

PARA FRANGOS DE CORTE

Cássia Yumi Yonemura, Francine Andrea de Russo, João Guilherme Ferreira, Maria Fernanda de Castro Burbarelli, Maria

Tereza Antunes, Márcio José da Rocha Luppi, Nayara Tavares Ferreira, Patricia Maria Meneghetti Pulici, Pedro de Assumpção Pimenta Ribeiro,

Ricardo de Albuquerque

1. INTRODUÇÃO Na primeira metade do século passado a indústria animal, em especial aquela da área avícola, desenvolveu-se de forma efetiva, melhorando os resultados zootécnicos e disponibilizando a cada ano uma maior quantidade e diversificação de alimentos. Este fato refletiu e vem refletindo, em nosso país, na forma de produtos avícolas de menor custo e, conseqüentemente, em uma maior oportunidade de consumo dos mesmos por parte dos cidadãos; tem possibilitado, também, os excelentes resultados da balança comercial brasileira, decorrência direta do aumento de exportação de produtos cárneos e, de modo muito particular, da carne de frango. Os progressos advindos de diversas áreas do conhecimento foram fundamentais para o progresso da avicultura nacional. De fato, a relevância dos conhecimentos angariados na área de sanidade animal, e o emprego de técnicas de melhoramento genético vem possibilitando, indiscutivelmente, ganhos efetivos de desempenho zootécnico. Foi assim que - através de cruzamentos e de seleção – escolheu-se da população de aves os indivíduos mais qualificados e que, a cada geração, foram transferindo suas qualificações genéticas, o que permitiu a obtenção de plantéis com excelentes habilidades de produção. Este procedimento técnico exigiu dos responsáveis pelos elos da cadeia produtiva aviária, um acompanhamento dos animais por um período superior a 50 anos. Neste mesmo período, a evolução do conhecimento das necessidades nutricionais das aves, bem como daqueles ligado às relações indivíduo – indivíduo e às necessidades ambientais, permitiu uma melhora substancial dos procedimentos de manejo em avicultura. Em seu conjunto, estas competências têm colaborado de maneira decisiva para o aumento da eficiência zootécnica das criações, de forma tal que se atingissem hoje, os indicadores técnicos de excelência que pontuam o agronegócio brasileiro. Assim, em um cenário em que os custos da ração atingem patamares cada vez mais elevados em função, por exemplo, dos aumentos de preço

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da soja e do milho, o rendimento adicional carreado pelo uso de aditivos antimicrobianos não pode ser desprezado. Por outro lado, o fato de vivermos em um país tropical e de empregarmos um tipo de manejo que permite o aparecimento e a propagação de infecções clínicas ou sub-clínicas em nossos plantéis praticamente condiciona o uso de medicação preventiva. Neste contexto, e ainda que aparentemente de forma paradoxal, trabalhos recentes têm mostrado que o banimento pela Suécia e pela Dinamarca do uso de antimicrobianos como aditivos em avicultura está ocasionando um aumento do consumo dos mesmos nestes países, agora na forma de medicação terapêutica destinada ao tratamento de processos infecciosos instalados principalmente no trato gastrintestinal das aves. O presente trabalho abordará a questão do uso dos antimicrobianos e de alguns produtos alternativos (probióticos, prebióticos e simbióticos) como aditivos zootécnicos em avicultura.

2. HISTÓRICO DA UTILIZAÇÃO DE PROMOTORES DO CRESCIMENTO PARA FRANGOS DE CORTE Verificou-se, durante a Segunda Guerra Mundial, que concentrados protéicos animais eram superiores aos vegetais no sentido de manter o crescimento de aves. Naquela ocasião, denominou-se de “fator protéico animal” ao componente da ração animal responsável por este aumento de eficiência. Pouco mais tarde, identificou-se a vitamina B12 - presente nos tecidos hepáticos utilizados para a produção de concentrados protéicos animais - como sendo o fator responsável pelo aumento de crescimento das aves. Mostrou-se que a adição de vitamina B12 cristalina à ração “compensava” as deficiências de concentrados protéicos vegetais na manutenção do crescimento dos animais. Nesta ocasião, constatou-se serem os caldos de cultivos de Streptomyces griseus e Streptomyces aureofaciens ricos em vitamina B12. Encontrou-se, assim, uma importante fonte comercial para a obtenção dessa vitamina: os resíduos cristalizados dos caldos de cultura utilizados para a produção de estreptomicina e clortetraciclina. Estes resíduos foram, então, testados experimentalmente como fonte alternativa de vitamina B12 em aves. Surpreendentemente, o ganho de peso dos animais assim tratados foi sistematicamente maior que aquele esperado em decorrência apenas do uso da vitamina B12. Esta constatação permitiu que Stokstad e Jukes relatassem em 1950 e, por vez primeira, que a adição de estreptomicina e clortetraciclina, na presença de quantidades suficientes de vitaminas e de sais minerais (incluindo-se aqui a vitamina B12) era capaz de estimular o crescimento de aves. Este resultado inicial foi confirmado posteriormente por diversos autores e estendido para outros antimicrobianos.

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3. MECANISMOS DE AÇÃO DOS ADITIVOS ANTIMICROBIANOS Os prováveis mecanismos de ação dos aditivos antimicrobianos têm sido revisados por diversos autores; mesmo assim, os fatores responsáveis pela promoção de crescimento das aves não estão, ainda, totalmente esclarecidos. Neste sentido, Thonke & Elwinger, analisaram o fato de serem os aditivos antimicrobianos absorvidos ou não pelo trato gastrintestinal das aves, uma vez que constataram ser alguns destes medicamentos absorvidos após uso oral, enquanto que outros eram pouco ou nada absorvidos. A divisão que fizeram dos antimicrobianos em sistêmicos e não sistêmicos, entretanto, revelou-se pouco útil para a compreensão do mecanismo de ação destes aditivos, visto que o fato de serem ou não absorvidos nada tinha a ver com a eficácia dos mesmos como aditivos. Lembra-se, a esse respeito, no entanto, que a absorção de um antimicrobiano é fundamental para seu uso como medicação preventiva ou curativa de processos infecciosos sistêmicos. Outros trabalhos, realizados em seqüência mostraram que a melhora no desempenho das aves é obtida principalmente por modificações que ocorrem nas bactérias que compõem a flora intestinal das aves. Neste sentido, é de amplo conhecimento que a ação ideal de um aditivo ocorre sem que haja destruição total da flora bacteriana normal do trato intestinal das aves; de fato, uma destruição como esta reduziria a barreira bacteriana protetora natural do trato intestinal, fato que levaria à multiplicação de cepas patogênicas e ao aparecimento de infecções graves e amplas, caracterizadas por diarréia de sérias conseqüências para os animais. No entanto, há consenso entre os autores que o entendimento do mecanismo de ação dos aditivos antimicrobianos está, ao menos em parte, relacionado com o comportamento ecológico das numerosas e variadas cepas bacterianas que habitam o trato intestinal das aves. Neste sentido, mostrou-se que os aditivos antimicrobianos produzem, ainda, uma diversidade de respostas no organismo das aves, o que nos leva a concluir que o mecanismo de ação dos mesmos não seja único, mas múltiplo e complexo. Rosen, em 1995, analisando os efeitos de aditivos antimicrobianos em aves, propôs uma divisão dos mesmos em: microbiológicos, morfo-fisiológicos, nutricionais e metabólicos. Há que salientar, no entanto, que a classificação proposta por Rosen não é estática, mas dinâmica, tendo importância muito mais didática que científica. De fato, as ações produzidas pelos aditivos ocorrem em uma seqüência tipo “dominó” sendo muito difícil, às vezes, dizer qual delas ocorreu em primeiro lugar. Neste sentido, é até provável que todas elas ocorram simultaneamente. O uso de aditivos antimicrobianos tem permitido a manutenção de uma flora microbiana desejável; estes aditivos deprimem o crescimento de cepas de microrganismos considerados indesejáveis, proporcionando um meio favorável para a proliferação daquelas ditas desejáveis.

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Neste sentido, a compreensão dos eventos microbiológicos induzidos pelos aditivos antimicrobianos requer uma análise preliminar da microflora intestinal das aves. Sabe-se ser esta microflora composta principalmente por lactobacilos, estreptococos e estafilococos (microorganismos aeróbios e GRAM + ); no ceco e no colon predominam cepas de Eubacterium sp e de Clostridium sp (Gram +) bem como de Fusobacterium spp e bacterioides (Gram -), além de outros microorganismos anaeróbicos. A atividade bioquímica das bactérias intestinais produz um leque amplo de substâncias, muitas das quais são altamente tóxicas para o organismo do hospedeiro, o que requer uma constante desintoxicação. A neutralização adequada dessas substancias tóxicas requer um constante gasto de energia procedente da dieta cotidiana. Assim, se a atividade das bactérias intestinais pode ser modificada, tal que não produzam substâncias tóxicas, então existirá energia disponível para uma melhora do desempenho. Este fato seria observado de forma constante, e eqüivaleria a um incremento na eficiência da utilização do alimento. Tem sido demonstrado que algumas bactérias patogênicas presentes no trato intestinal de aves produzem uma redução significativa do rendimento do plantel. Assim, por exemplo, mostrou-se que aves criadas em ambientes livres de germes apresentavam um rendimento melhor de carcaça que aquelas que viviam em criadouros convencionais. Especificamente, observou-se que frangos criados em ambientes livres de germes cresciam mais depressa e de forma mais eficiente que aqueles criados em condições convencionais; mostrou-se, também, que os animais criados livres de germes não respondiam à ação dos aditivos antimicrobianos (WALTON, 1990). Por outro lado, frangos criados em condições convencionais apresentavam um rendimento quase tão bom quanto aquele de frangos livres de germes quando recebiam os aditivos antimicrobianos junto com a alimentação. Em outro experimento, mostrou-se que a inoculação de Enterococcus faecalis em aves livres de germes diminuiu significativamente o crescimento dos animais, prejudicando a conversão alimentar; neste sentido, a inclusão de um aditivo antimicrobiano na dieta foi capaz de restaurar o crescimento e os índices de conversão alimentar.

4. EFEITOS BIOLÓGICOS DE ADITIVOS ANTIMICROBIANOSUSADOS EM AVICULTURA O uso de aditivos antimicrobianos vem sendo feito no Brasil há mais de 50 anos. Durante este período, tem sido possível avaliar a relevância deste tipo de tratamento para a avicultura nacional. Nos sistemas de criação usados em nosso país, convivem juntas e em um mesmo espaço restrito, muitas aves de mesma linhagem, mesma idade, mesmas condições nutricionais e de higiene, alimentando-se da mesma ração, bebendo da mesma água e respirando o mesmo ar. Nestas condições o uso de aditivos, além de

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provocar melhora na conversão alimentar e, consequentemente no ganho de peso dos animais (pelos mecanismos acima especificados) evita o risco de aparecimento e de disseminação de processos infecciosos no plantel. Neste sentido, o aparecimento de um único animal doente no plantel traria graves conseqüências para o produtor seja do ponto de vista de manejo, de sanidade e de mortalidade, como também daquele ligado à rentabilidade do agronegócio e, mais importante, à qualidade dos alimentos produzidos. O Quadro 1 sumariza os resultados de 1546 experimentos conduzidos com aditivos antimicrobianos no período de 1950 a 2000. Em todos eles observou-se melhora dos índices zootécnicos, avaliados através do crescimento e do peso das aves, da eficiência alimentar e do custo de produção por quilo de frango produzido. Estes resultados foram obtidos de forma constante, por diferentes autores, em diferentes países, usando diferentes agentes antimicrobianos. Todavia, vale ressaltar que segundo alguns autores, estes dados não espelham de forma correta o real impacto dos aditivos usados em condições de campo; de fato, como já comentado acima, acredita-se que estes agentes tenham maior eficácia em condições de campo que naquelas ditas “laboratoriais” e em que foram realizados grande número dos experimentos analisados.

Quadro 1 - Desempenho de frangos de corte tratados ou não com aditivos antimicrobianos. (modificado de BUTOLO, 2002)

(1) HAYS & MUIR (1979) – aditivos (microingredientes de alimentação) utilizados: tetraciclinas, penicilina, bacitracina de zinco, virginiamicina, flavomicina, nitrovin, olaquindox e lincomicina.(2) BUTOLO (2001) – levantamento efetuado em trabalhos de pesquisa (USA/EU/Brasil) – aditivos (microingredientes de alimentação) – pró-nutrientes.

ROSEN fez em 1995, uma revisão ainda mais ampla do uso de aditivos antimicrobianos, tendo sumariado os resultados de 12.153 experimentos em que estes produtos foram utilizados em avicultura; verificou em 72% deles, respostas positivas no desempenho dos animais. Mais uma vez, questões de manejo, qualidade das rações utilizadas e sanidade do plantel foram apontadas como responsáveis pela ausência de efeitos e pelos resultados negativos do trabalho.

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A utilização de aditivos antimicrobianos em poedeiras comerciais foi abordada por MILTENBURG (1999); este autor justificou a utilização destes produtos em função das condições desfavoráveis de instalação, manejo, clima, sanidade e outras situações envolvidas com a recria de frangas, isto é, que dificultavam o alcance do peso ideal recomendado para postura nesta linhagem. Obteve, na fase de postura, resultados bastante significativos em vários aspectos ligados à produtividade. Segundo este autor, o uso de aditivos antimicrobianos acarretou melhoras sensíveis, conforme se depreende da leitura do Quadro 2.

Quadro 2 - Efeitos de aditivos antimicrobianos em parâmetros de desempenho avaliados em poedeiras.

1 Segundo MILTENBURG (1999)

Neste sentido, a análise dos resultados advindos do banimento de alguns aditivos antimicrobianos efetuado por alguns países da União Européia, traz informações relevantes sobre o uso destes produtos. De fato, após essa proibição e decorridos alguns anos da mesma, foram observados: 6% de piora na Conversão Alimentar (em função de um maior consumo de ração), 5% de redução no ganho de peso, 4% de aumento no uso de medicamentos veterinários destinados a uma terapêutica curativa, 12% de redução na margem bruta de lucro entre os melhores criadores e 30% de redução entre aqueles de pior desempenho e 1,6% de aumento na mortalidade total dos animais. Mais recentemente, dados levantados em 7 países da Comunidade Européia revelaram o impacto econômico representado pela proibição do uso de antimicrobianos como promotores de crescimento; a perda ocorrida foi estimada como sendo da ordem de US$ 2,124 bilhões de dólares assim distribuídos (em bilhões de dólares): carne bovina (US$ 0,637), carne de vitela US$ 0,178), carne suína US$ 1,103), carne de frango (US$ 0,176) e ovos (US$

0,030). Os autores do trabalho relataram que 42% deste custo foi absorvido pelos consumidores e os outros 58% pelos produtores.

5. ALTERNATIVAS AO USO DE ANTIMICROBIANOS5.1- PROBIÓTICO O termo probiótico deriva do grego e significa “pró-vida”, sendo o antônimo de antibiótico que significa “contra-vida” (COPPOLA; TURNES, 2004). Os primeiros relatos do consumo de microrganismos, influênciando na saúde, foram realizados por Metchnikoff em 1907 ao observar e descrever que camponeses da Bulgária, que consumiam leite fermentados (um exemplo de probiótico) com Lactobacillus acidophilus, apresentavam maior longevidade. Essa longevidade foi atribuída à baixíssima incidência de câncer no cólon e a proteção contra infecções gastrintestinais relacionadas ao consumo de grandes quantidades de leite fermentado por bactérias produtoras de ácido láctico (SILVA, 2000; ALBUQUERQUE, 2005; MACARI; FURLAN, 2005). Entretanto, o termo probiótico foi usado pela primeira vez por Lilly e Stillwell (1965) ao verificarem a ação de microrganismos como promotores de crescimento. Posteriormente, Parker (1974) definiu probióticos como microrganismos ou substâncias que contribuem para o balanço da microbiota intestinal. O conceito moderno de probiótico foi definido por Fuller (1989) como sendo “um suplemento alimentar constituído de microrganismos vivos capazes de beneficiar o hospedeiro através do equilíbrio da microbiota intestinal”. Mais tarde, o mesmo autor considerou que, para serem considerados como probióticos, “os microrganismos deveriam ser produzidos em larga escala, permanecendo estáveis e viáveis em condições de estocagem, serem capazes de sobreviver no ecossistema intestinal e possibilitar ao organismo os benefícios de sua presença”. Nas condições atuais de produção em escala industrial de aves de corte, o manejo exclui o contato do pinto com a galinha, impedindo a inoculação, com microrganismos benéficos através do contado direto com a mãe. Ao serem alojadas em aviários, as aves estão sujeitas as morbidades do meio ambiente no qual existem os diferentes microrganismos, desde aqueles desejáveis e benéficos (flora normal) até aqueles indesejáveis e por vezes patógenos, como é o caso de bactérias dos gêneros Clostridium, Salmonella, Escherichia coli, entre outros (DAY, 1992; MENTEN; PEDROSO, 2005). Assim o equilíbrio entre a flora intestinal e o hospedeiro pode ser desafiado pelo potencial invasivo dos microrganismos que vivem em meio ambiente comum aos aviários e instalações avícolas (FLEMMING, 2005). Entretanto, em equilíbrio, o trato intestinal consegue de forma mais eficiente absorver

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nutrientes e impedir a fixação e multiplicação de agentes patogênicos na mucosa intestinal (FERNANDES et al., 2000), prevenindo desta forma as instalações de doenças entéricas e consequentemente melhorando a produtividade, diminuindo a mortalidade e a contaminação dos produtos de origem animal (EDENS, 2003; PATTERSON; BURKHOLDER, 2003). Portanto, para uma boa eficiência, os probióticos devem ser utilizados já nos primeiros dias de vida (LORENÇON, 2007), para que possam modular beneficamente a microbiota intestinal, através dos seus mecanismos de ações benéficas ao hospedeiro como a competição por sítios de ligação (aderência a sítios de ligações no epitélio intestinal) e nutrientes (competição ocorre entre as bactérias por seus nutrientes específicos), produção de substâncias antibacterianas (produção de compostos como bacteriocinas), supressão da produção de amônia (reduzindo a produção intestinal por amônia), neutralização de enterotoxinas e assim favorecer melhores índices zooeconômicos, maior produtividade, aumento no ganho de peso, melhor conversão alimentar, e o estímulo do sistema imune, antes desse ser contaminado por alguns patógenos (FULLER, 1989; JIN et al., 1997; ANDREATTI FILHO; SAMPAIO, 2000; SILVA, 2000a; ANDREATTI FILHO; SILVA, 2005). Segundo Andreatti Filho e Silva (2005), a administração dos probióticos logo na chegada das aves ao aviário ou mesmo, ainda, no incubatório, é a mais indicada diante da possibilidade cada vez mais freqüente da contaminação precoce por Salmonella spp. O modo de administração dos probióticos pode ser o mais variado possível (adicionado na ração, em água de bebida, pulverização sobre as aves, inoculação em ovos embrionados, através da cama usada em cápsulas gelatinosas e via intra-esofagiana), e determina uma melhor ou pior capacidade de colonização intestinal pelas bactérias presentes no produto utilizado (SILVA, 2000; ANDREATTI FILHO; SIVA, 2005). As principais cepas bacterianas utilizadas no preparo de probióticos incluem: Lactobacillus spp, Bifidobacterium sp, Enterococcus faecium e Bacillus spp (SIMON et al., 2001; FERREIRA et al., 2002). Contudo, ainda não é conhecida à composição microbiana ideal de um produto probiótico, mas a eficácia do mesmo é estritamente dependente da quantidade e das características das cepas bacterianas utilizadas na elaboração do aditivo alimentar. Muitas vezes estes aditivos não produzem bons resultados, pois não utilizam microrganismos que atendam os requisitos para atuar como probiótico, como, por exemplo, sobreviver às condições adversas do trato gastrintestinal (ação da bile e dos sucos gástricos, pancreáticos e entéricos); não ser tóxico e ou patogênico; ter capacidades antagonistas às bactérias intestinais indesejáveis; ser altamente viável e estável durante a estocagem, além de, comprovadamente, benéfico ao hospedeiro (JIN et al., 1997; TOURNUT, 1998).

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Assim, Santos e Turnes (2005), em revisão bibliográfica, concluíram que os probióticos, além de mudarem a estrutura da microflora bacteriana do trato gastrintestinal das aves, podem prevenir infecções e melhorar a qualidade da carcaça, mantendo os mesmos índices de produtividade alcançados com a utilização de antimicrobianos, reduzindo a mortalidade, as condenações de carcaças, melhorando a conversão alimentar e o ganho de peso.

5.2- PREBIÓTICO Os estudos sobre os prebióticos são antigos, na década de 50, a descoberta de que o leite humano possui compostos que atuam como inibidores de adesão de bactérias patogênicas na superfície epitelial e potencializam o crescimento das populações de bifidobactérias e lactobacilos, aliviando os sintomas de encefalopatia hepática em bebês (WALKER; DUFFY, 1998; NICOLI; VIEIRA, 2000) incentivou outras explorações sobre o efeito do consumo de compostos não digestíveis na microbiota intestinal (KULLEN et al., 1998; SHEEHY; MORRISSEY, 1998; STRICKLING et al., 2000). Em 1995, Gibson e Roberfroid definiram prebióticos como sendo ingredientes alimentares que são digeridos na porção proximal do trato gastrintestinal de monogástricos e que proporcionam efeito benéfico no hospedeiro por estimular seletivamente o crescimento e/ou metabolismo de um limitado grupo de bactérias no cólon. Outro aspecto importante é que para ser considerado um prebiótico, o ingrediente não poder ser hidrolisado ou absorvido no intestino anterior (intestino delgado), seja um substrato seletivo para um determinado grupo de bactérias benéficas, seja capaz de alterar a microbiota intestinal de forma favorável ao hospedeiro e possa induzir efeitos benéficos sistêmicos ou na luz intestinal (ANDREATTI FILHO; SILVA, 2005). Portanto, carboidratos não digeríveis como oligossacarídeos, alguns peptídeos não digeríveis, lipídeos, fibras e álcoois de açúcares podem ser considerados como prebióticos. Os oligossacarídeos são carboidratos constituídos de cadeias curtas de polissacarídeos, compostos de três a dez açúcares simples ligados entre si (SILVA, 2000a; ANDREATI FILHO; SILVA, 2005; JUNQUEIRA; DUARTE, 2005). Assim, as substâncias que têm sido mais estudadas como prebióticos são os oligossacarídeos, principalmente os frutoligossacarídeos (FOS), glucoligossacarídeos (GOS) e os mananoligossacarídeos (MOS). FOS são polímeros ricos em frutose, podendo ser naturais, derivados de plantas (inulina) como chicória, alcachofra, dália, alho e cereais ou sintéticos, resultantes da polimerização da frutose (GIBSON; ROBERFROID, 1995; IJI; TIVEY, 1998). GOS e MOS são obtidos a partir da parede celular de leveduras e contém glucose e manose, respectivamente, como os dois principais açúcares em proporções semelhantes e N-acetilglucosamina. O MOS, adicionado às dietas animais consiste de fragmentos de parede

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celular de Saccharomyces cerevisae com uma estrutura complexa de manose fosforilada, glucose e proteína (SPRING, 2000). Segundo este autor, a parede celular é separada do conteúdo intracelular, e o líquido contendo MOS é evaporado a baixa temperatura (spray dry) para evitar a destruição da parte funcional da molécula de MOS. Alguns autores relatam que, os prebióticos são capazes de estimular o desenvolvimento de bactérias benéficas como Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp, Eubacterium spp, pois estas bactérias podem utilizar certos açúcares complexos como nutrientes (FERNANDEZ; HILTON; GILS, 2000; FERNANDEZ; MALAGUIDO; SILVA, 2003; SILVA; NÖRNBERG, 2003; FLEMMING, 2005). Sendo essas bactérias benéficas conhecidas pela capacidade de produzirem ácidos graxos de cadeia curta (acético, propiônico e butírico) e lactato, o aumento no desenvolvimento dessas bactérias, causaria uma maior produção desses ácidos e o aumento da presença destes nos cecos, consequentemente ocorreria à diminuição do pH do trato gastrintestinal, o que provocaria uma inibição no desenvolvimento de bactérias patogênicas (sensíveis a ambientes ácidos) (RADECKI; YOKAYAMA, 1991; MATHEW et al., 1993; CORNELI, 2004; ANDREATTI FILHO; SILVA, 2005) e uma favorável alteração na microbiota intestinal, com melhoras nas condições luminais e nas características anatômicas do trato gastrintestinal (SILVA; NÖRNBERG, 2003). Mas, segundo Nunes (2008) a ação dos prebióticos não se limita ao estímulo do desenvolvimento de bactérias benéficas, mas também ao exercerem efeitos diretos sobre a colonização do trato gastrintestinal por bactérias patogênicas. Para que as bactérias consigam colonizar o trato gastrintestinal e criar uma condição patológica, é necessário a aderência à superfície epitelial. Essa adesão ocorre através de fímbrias (moléculas de açúcares ramificadas (polissacarídeos) que se estendem da parede externa das bactérias) ou lectinas (glicoproteínas) que reconhecem especificamente açúcares presentes na superfície dos enterócitos do hospedeiro. Portanto, caso estas estruturas bacterianas se liguem a açúcares ou oligossacarídeos dietéticos, e não à mucosa intestinal, os patógenos passarão com a digesta sendo eliminados do trato intestinal (MATHEW et al., 1993; DAWSON; PIRVULESCU, 1999; COLLET, 2000), e com isso, teremos a mucosa intestinal inteiramente apta às funções de secreção, digestão e absorção de nutrientes. Em 1994 Mewmann, relata que os mananoligossacarídeos atuariam nessa etapa de colonização, pois algumas bactérias patogênicas que apresentam a fimbria tipo 1 (especifica para MOS), se ligariam aos mananoligossacarídeos e não aos sítios de ligação dos enterócitos e assim seriam eliminados. Há relatos que os mananoligossacarídeos (MOS) também exercem efeitos indiretos sobre as populações bacterianas e colonização intestinal

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por bactérias patogênicas. Por exemplo, a adição de MOS na dieta de perus, promoveria alterações na multiplicação de organismos anaeróbicos que poderiam inibir de forma competitiva o crescimento e a atividade de clostrídios (DAWSON; PIRVULESCU, 1999). Assim, Silva e Nörnberg (2003), concluíram que os prebióticos são compostos biologicamente seguros à saúde humana e animal, contudo, as respostas biológicas na nutrição animal nem sempre são evidenciadas, o que pode estar relacionado com a composição química dos demais ingredientes, com a dosagem adicionada, com a adaptação e a seletividade da microbiota ao prebiótico ou ao nível de estresse do animal.

5.3- SIMBIÓTICO A combinação de prebiótico e probiótico é denominada simbiótico e constitui um novo conceito na utilização de aditivos em dietas de aves. Esta associação é uma alternativa interessante no sentido de melhorar a sanidade do intestino delgado e cecos dos frangos de corte, através dos mecanismos fisiológicos e microbiológicos. A ação simbiótica estabiliza o meio intestinal e aumenta o número de bactérias benéficas produtoras de acido láctico, favorecendo a situação de eubiose (FULLER, 1989; FURLAN et al., 2004). A microbiota é favorecida pela ação dos prebióticos que têm a capacidade de se ligarem às fimbrias de bactérias patogênicas, conduzindo-as junto ao bolo fecal, estimulando o crescimento e acelerando o metabolismo de um limitado número de microrganismos não patogênicos. A essa ação soma-se a dos probióticos, facilitando a nutrição de células (enterócitos) que recobrem o trato digestório e proporcionando equilíbrio e saúde intestinal as aves (GIBSON; ROBERFROID, 1995). Assim, Schwarz (2002), conclui que é perfeitamente possível substituir os antibióticos por probióticos, prebióticos e simbióticos, sem perdas no desempenho de aves.

6. MODULAÇÃO BENÉFICA DA MICROBIOTA INTESTINAL COMO MECANISMO DE AÇÃO Sabe-se que o equilíbrio da microbiota intestinal reflete diretamente na integridade do estado de saúde do hospedeiro. Assim, qualquer desequilíbrio como o resultante do estresse de qualquer natureza ou do uso de antimicrobianos poderá favorecer a instalação e multiplicação de microrganismos patogênicos (SILVA, 2000). Embora ainda não exista uma classificação objetiva das bactérias da microbiota das aves em benéficas ou prejudiciais, em humanos alguns organismos componentes da microbiota intestinal são classificados como estritamente benéficos para o hospedeiro (GIBSON; ROBERFROID, 1995).

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É o caso de Lactobacillus e Bifidobacterium, cujas características benéficas estendem-se desde a inibição do crescimento de bactérias prejudiciais, auxílio na digestão e/ou absorção de nutrientes, síntese de vitaminas, até o estímulo da imunidade (MENTEN e LODDI, 2003). Os probióticos modulam beneficamente a microbiota intestinal através da competição por sítios de ligação e nutrientes, produção de substâncias antibacterianas, supressão da produção de amônia, neutralização de enterotoxinas e são capazes até mesmo de atuar sobre o metabolismo nutricional das aves (FULLER, 1989; JIN, 1997; ROLFE, 2000). Vanbelle (1990) relata que a propriedade de competir pelos sítios epiteliais de adesão depende do número de bactérias viáveis que atingem o local a ser colonizado e do tipo de receptor específico para a bactéria. As bactérias intestinais, benéficas ou patogênicas, nutrem-se de ingredientes que não foram total ou parcialmente degradados pelas aves. Portanto, a competição por nutrientes não ocorre entre a ave e as bactérias, mas sim entre estas últimas. A escassez de nutrientes na luz intestinal que possam ser metabolizados por patógenos é certamente fator limitante para a manutenção dos mesmos neste local (SILVA, 2000). As bactérias probióticas produzem ácidos graxos de cadeia curta (acético, butírico e propiônico) e lactato. O aumento da produção destes ácidos no trato gastrointestinal promove a queda do pH local, resultando na inibição do desenvolvimento de bactérias nocivas como E. coli, Clostridium sp e salmonelas, que são sensíveis a ambientes ácidos (MATHEW et al., 1993). Outras substâncias antimicrobianas produzidas pelas bactérias probióticas incluem: bacteriocinas, nisina, acidofilina, lactalina, peróxido de hidrogênio e toxinas letais para certos patógenos (VANBELLE, 1990; JIN et al., 1997). Tal como os antibióticos, há relatos de que probióticos reduziriam a produção intestinal de amônia, que pode ser tóxica para as células epiteliais (MENTEN, 2003). Segundo Stewart e Chesson (1993), probióticos contendo Bifidobacterium previnem a formação de aminas tóxicas pelas bactérias intestinais. Jin et al. (1997) citou estudos em que os probióticos reduziriam a concentração de amônia nas excretas de frangos de corte. E, fez referência a uma possível neutralização de enterotoxinas produzidas por patógenos através da ação de substâncias produzidas por microrganismos probióticos. A literatura também ressalta ação da microbiota benéfica sobre o metabolismo nutricional das aves, aumentando a digestão e absorção de nutrientes. Nutrientes sobre os quais as enzimas naturais das aves não atuam serviriam de substrato para os probióticos. E, as substâncias resultantes deste

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processo poderiam ser absorvidas ou secundariamente metabolizadas pelas aves (SILVA, 2000).Jin et al. (1997) descreve a secreção de enzimas como amilase, lípase e protease por organismos probióticos. Ainda, os ácidos graxos voláteis de cadeia curta produzidos no intestino podem ser usados como fonte de energia para as células epiteliais (LEEDLE, 2000). Da mesma forma que os probióticos, uma das propostas para o mecanismo de ação dos prebióticos é a modulação benéfica da microbiota intestinal (MENTEN e LODDI, 2003). Fernandez, Hilton e Gils (2002) relatam que é grande o interesse nas propriedades específicas e seletivas de determinados carboidratos insolúveis e seus efeitos sobre a microbiota intestinal de humanos, aves e outros animais. Entre estes carboidratos destacam-se os oligossacarideos à base de frutose, manose e galactose . Os mananoligossacarídeos exercem efeitos indiretos sobre as populações bacterianas e colonização intestinal por patógenos. Alguns trabalhos demonstraram que este aditivo promove alterações na multiplicação de organismos anaeróbicos benéficos que podem inibir de forma competitiva o crescimento e a atividade de clostrídios (DAWSON; PIRVULESCU, 1999). Os prebióticos são capazes de estimular o desenvolvimento de bactérias benéficas como Bifidobacterium spp , Lactobacillus spp, Eubacterium spp (FERNANDEZ, HILTON E GILS , 2002; FERNANDES; MALAGUIDO; SILVA, 2003). Contudo, a ação dos prebióticos não se limita ao estímulo do desenvolvimento de organismos anaeróbicos benéficos. Sabe-se que os prebióticos também exercem efeitos diretos sobre a colonização do trato gastrointestinal por bactérias patogênicas. Para que as bactérias consigam colonizar o trato intestinal e criar uma condição patológica, é necessária a aderência à superfície epitelial. Esta adesão pode ocorrer através de fímbrias ou lectinas (glicoproteínas) que reconhecem especificamente açúcares presentes na superfície dos enterócitos do hospedeiro. Portanto, caso estas estruturas bacterianas se liguem a açúcares ou oligossacarídeos dietéticos, e não à mucosa intestinal, os patógenos passarão com a digesta sendo eliminados do trato intestinal (COLLETT, 2000; CLOSE, 2001). Alguns autores relatam que os oligossacarídeos prebióticos (principalmente a D-manose) atuariam exatamente nesta etapa de colonização, ao competir com os carboidratos da superfície dos enterócitos pelas fímbrias bacterianas (SPRING, 2000; SILVA, 2000).

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Flemming et al. (2004) relata que mananoligossacarídeos podem ser usados como substrato pelas bactérias benéficas. Atuando sobre certas substâncias parcialmente ou não digeridas pelas enzimas das aves, como os oligossacarídeos, bactérias benéficas produziriam ácidos orgânicos (ANDREATTI FILHO; SILVA, ?). A literatura aponta outros estudos fazendo uso de FOS e MOS na ração em que não foram encontradas diferenças significativas quanto ao total de bactérias benéficas em relação aos tratamentos controle e com adição de prebiótico. Sugere-se que esta variação esteja relacionada às diferenças nas composições das populações microbianas nas diferentes espécies animais, bem como às diferenças de estrutura química e propriedades físico-químicas dos compostos utilizados como prebióticos (SUNVOLD et al., 1995).

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS Produtores, nutricionistas e geneticistas estão agudamente conscientes dos desafios a serem enfrentados na indústria da produção animal e freqüentemente a resposta ao desafio pode ser convertida em uma oportunidade. Em um mercado altamente competitivo estes são os primeiros a responder com sucesso adquirindo uma vantagem com o crescimento nas vendas através do sucesso do marketing, criando potencial para ser o melhor preparado para enfrentar os desafios. Até recentemente o objetivo de formular dietas com baixos custos foi realizado com ótimos ganho de peso vivo e eficiente conversão alimentar em base de nutrientes mínimos e a menor custo. Enquanto que, investigações e pesquisas têm demonstrado que certos ingredientes ou aditivos alimentares têm valor, particularmente em termos de promover a saúde e merecem seu uso em maiores quantidades que seriam especificadas nas formulações de dieta de menor custo ou para estimar requerimentos mínimos. Aditivos alimentares que aumentem o crescimento e a produção de ovos têm sido propostos ao longo de muitos anos. Somente aqueles que têm dados de testes resultantes de estudos cuidadosos em laboratórios de pesquisas e que tem provado por si mesmo, serem seguros e efetivos no campo, têm sido preconizados para o uso na indústria avícola. A utilização destes produtos deve ser realizada com muito cuidado, a despeito das perspectivas promissoras relativas às vantagens econômicas e nutricionais.

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CAPÍTULO II

IMUNIZAÇÃO PASSIVA COMO POTENCIAL FERRAMENTA PARA MANIPULAÇÃO DA FERMENTAÇÃO RUMINAL E SEUS EFEITOS

EM BOVINOS DE CORTE E LEITE

Carolina Tobias Marino¹, Walter Guimarães Otero¹, João Paulo Sigolo Teixeira Bastos², Danilo Domingues Millen³, Rodrigo Dias Lauritano Pacheco², Fernanda Altieri Ferreira¹, Mário de Beni Arrigoni², Paulo

Henrique Mazza Rodrigues¹

¹Departamento de Nutrição e Produção Animal, FMVZ-USP, Pirassununga-SP, Brasil.²Departamento de Melhoramento e Nutrição Animal, FMVZ-UNESP, Botucatu-SP, Brasil. ³Faculdade de Zootecnia, UNESP, Dracena-SP, Brasil.

RESUMO Nas últimas décadas tem sido notável o desenvolvimento mundial na produção de carne e leite bovina. Na área de manejo nutricional, a utilização de ionóforos tem sido imprescindível para otimizar a eficiência das dietas utilizadas e prevenir os distúrbios metabólicos que podem ser provocados pelo aumento da proporção de alimentos prontamente fermentescíveis presentes na dieta. Porém, a busca do mercado consumidor por produtos de origem animal oriundos de criações que utilizam a menor quantidade de substâncias sintéticas quanto possível, abre espaço para a pesquisa de novos aditivos alimentares. Neste contexto, surge a possibilidade da utilização do conceito de imunização passiva para manipulação da fermentação ruminal através de anticorpos policlonais produzidos contra bactérias ruminais específicas. Assim, esta revisão bibliográfica tem como objetivo apresentar os resultados com a utilização dos anticorpos policlonais no comportamento ingestivo, desempenho de bovinos de corte e na manipulação da fermentação ruminal.

Palavras chave: acidose, fermentação ruminal, imunização passiva, ruminante

INTRODUÇÃO Nas últimas décadas vem sendo notável o crescimento da produção brasileira de carne bovina, em termos quantitativos como qualitativos. Dentro deste contexto, a indústria vem identificando constante melhora na qualidade dos animais e, conseqüentemente, no produto final produzido. Este avanço deve-se ao esforço conjunto de todos os setores da cadeia produtora, no intuito

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de desenvolver e implementar tecnologias que aumentem a eficiência de produção, desde a fazenda até a mesa do consumidor. Na área de manejo nutricional, a utilização de ionóforos como aditivos alimentares para bovinos se tornou imprescindível na manipulação da fermentação ruminal, aumentando a eficiência no aproveitamento das dietas empregadas. Nestes confinamentos, é observado um aumento na utilização de dietas com alta proporção de carboidratos prontamente fermentescíveis, com intuito de obter maior ganho de peso diário. Com isso, há diminuição dos dias necessários para a terminação dos animais. Neste caso, a inclusão de ionóforos garante a saúde animal por controlar microorganismos relacionados com quadros de acidose. Porém, há questões sanitárias e de segurança alimentar relacionadas ao seu uso que vem sendo discutidas mundialmente há alguns anos. O Brasil, como importante produtor e exportador de alimentos de origem animal, deve estar atento à nova realidade do mercado mundial. A Comunidade Européia, através do Regulamento (EC) N° 1831/2003 (EUROPA, 2003), determinou a proibição da utilização de antibióticos e coccidiostáticos como aditivos alimentares para bovinos. Alguns princípios farmacêuticos já não se encontram em comercialização; outros, porém, estão sendo retirados de forma gradual. Apesar de não haver comprovação científica, esta medida foi adotada como prevenção à possível relação entre o aumento da incidência de microorganismos resistentes aos antibióticos, observado na medicina humana, e o uso destas substâncias nas rações animais. Além disso, há solicitação crescente do mercado consumidor por alimentos de origem vegetal e animal saudáveis e naturais, que provêem de criações conduzidas com a menor utilização de substâncias sintéticas, quanto possível. Desta forma, surge a oportunidade de pesquisa e desenvolvimento de novos aditivos que desempenhem funções semelhantes aos antibióticos e ionóforos e que sejam seguros à saúde humana (Newbold, 2007). O objetivo desta revisão bibliográfica é apresentar os resultados com a utilização de um novo aditivo alimentar, o preparado de anticorpos policlonais, sobre a manipulação da fermentação ruminal, sobre a microbiota ruminal, a digestão ruminal e total, além de respostas de desempenho em gado leiteiro e de corte.

CARACTERIZAÇÃO DO PROCESSO DE FERMENTAÇÃO RUMINAL O processo digestivo das espécies ruminantes compreende uma das relações simbióticas entre seres vivos mais bem sucedidas na natureza. O principal órgão digestório dos ruminantes, o rúmen, é considerado uma câmara de fermentação que apresenta condições ambientais adequadas, tais como temperatura entre 38-41°C, pH entre 5,5-7,2, umidade entre 85-90%,

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osmolaridade entre 260-340 mOsm e ambiente anaeróbio. Além disso, há presença constante de substratos para fermentação oriundos da alimentação, um padrão de motilidade ruminal que permite a mistura do conteúdo e remoção periódica dos subprodutos de fermentação não utilizados pela microbiota através de absorção pelo epitélio ruminal (Carvalho et al., 2003). Estes, por sua vez, degradam e fermentam os alimentos ingeridos pelo hospedeiro, obtendo, como produtos, nutrientes necessários para sua sobrevivência e ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) que não são utilizados pelos microorganismos, mas sim pelos ruminantes, como fonte de energia para os diversos processos metabólicos. O objetivo do ruminante é manter as condições ruminais descritas acima para assegurar que o metabolismo dos microorganismos mantenha-se ativo para fermentar os nutrientes da dieta. A não manutenção destas condições poderá acarretar distúrbios metabólicos, como acidose ruminal. O principal diferencial entre ruminantes e outras espécies de mamíferos é que, através da relação simbiótica com os microorganismos, é possível o aproveitamento dos nutrientes contidos nos carboidratos estruturais e nos compostos nitrogenados não-protéicos. Isto se deve à presença de enzimas no metabolismo dos microorganismos que permitem degradar estes compostos (Valadares Filho & Pina, 2006). No final do século XVIII, Tappeiner (1884) (citado por Bergman, 1990) demonstrou que os microrgasnimos presentes no rúmen fermentavam celulose e como produtos obtinham ácidos graxos de cadeia curta, metano e dióxido de carbono. Desde esta época, a comunidade científica busca entender os processos metabólicos que ocorrem neste órgão e suas interações, bem como desenvolver estratégias de manipulação da fermentação ruminal com intuito de melhorar a eficiência energética destas reações. Esta energia disponível pode ser utilizada para incremento dos fins produtivos do animal, como ganho de peso ou produção leiteira.

ETIOPATOGENIA DA ACIDOSE RUMINAL O rúmen possui um ecossistema basicamente anaeróbio que converte substratos fermentescíveis da dieta ingerida em ácidos orgânicos, que posteriormente são removidos através de absorção. Portanto, se a produção desses ácidos for estável, sua absorção também o será e, conseqüentemente, haverá manutenção do pH em níveis aceitáveis para a microbiota (5,8–6,5). Os fatores que influenciam na flutuação do pH são a quantidade de carboidratos rapidamente fermentescíveis que o animal ingere, a capacidade animal de produção de tampão (presentes na saliva) e a taxa de utilização e absorção dos ácidos produzidos. Quando algum destes fatores é alterado, ocorrerá acúmulo dos ácidos no rúmen, levando a queda do pH (abaixo de 5,5), estimulando

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assim bactérias produtoras de lactato e inibindo as bactérias fermentadoras deste mesmo ácido (Nagaraja & Titgemeyer, 2007). Owens et al. (1998) descreveram alguns itens que ilustram bem as origens da acidose, como: 1) concentração de amido e sua conversão à glicose: a apresentação do amido na dieta e sua quantidade nesta influi na velocidade de sua fermentação, já o açúcar livre no rúmen pode aumentar a osmolaridade do conteúdo ruminal, aumentando assim o acúmulo de AGCCs no rúmen e inibindo sua absorção; 2) fornecimento de amido e açúcar: a quantidade de carboidrato altamente fermentescível na dieta influi diretamente no surgimento da acidose; 3) produção de AGCC e produção e utilização lactato: a disponibilidade de substrato pode alterar o balanço entre bactérias produtoras e as utilizadoras de lactato, sendo as últimas sensíveis à quedas pronunciadas de pH; 4) depressão do pH ruminal: o pH ruminal é mantido por elementos ácidos, básicos e tamponantes, um desbalanceamento destes leva a flutuação do pH ruminal; 5) osmolaridade ruminal: AGCC, lactato, minerais e glicose são solutos presentes no conteúdo ruminal e, com excesso de um destes, a osmolaridade se eleva, gerando um aumento da passagem de água para dentro do rúmen que inibe a absorção dos ácidos. Os sintomas clínicos da maior disponibilidade de carboidratos altamente fermentescíveis variam de acordo com o tipo e quantidade destes carboidratos consumidos, assim como a cascata de efeitos relacionados à acidose. A fermentação destes carboidratos leva à produção de ácidos fora do limite fisiologicamente suportável e o pH é reduzido. O limiar do pH não está somente relacionado com a taxa de crescimento microbiano e mudanças em suas populações, mas também com o estado metabólico sistêmico do animal e sua habilidade de catabolizar ou excretar certos metabólitos (Nocek, 1997). O bicarbonato é um dos tamponantes responsáveis pela manutenção do pH no rúmen. Metade deste bicarbonato chega ao rúmen, via saliva, durante o processo de mastigação e ruminação. A outra metade chega via corrente sanguínea, através de trocas por ácidos graxos ionizados, durante o processo de absorção destes. Na acidose ruminal, há comprometimento do fornecimento deste tamponante via saliva e o animal deve manter o pH ruminal neutro com o bicarbonato provindo da corrente sanguínea. Porém, se o ruminante não conseguir manter a homeostase corporal, ocorrerá acidose metabólica (Owens et al., 1998). Huber (1976), em revisão sobre acidose em gado confinado, afirmou que a ingesta ruminal se torna hipertônica pela alta presença de ácido lático, que durante todo o processo acidótico eleva sua concentração molar de 0,08 para 89,2 mM, elevando, assim, a osmolaridade ruminal de 255 para 401 mM, causando perda de água do plasma para o rúmen, o que leva à desidratação do animal. Nocek (1997) descreveu que alterações na osmolaridade

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sanguínea podem levar à laminite. Durante a acidose ruminal, a presença de alta concentração de lactato no rúmen leva a lesões no epitélio ruminal que possibilitam a instalação de agentes bacterianos, como Fusobacterium necrophorum e Actinomyces pyogenes, que, além de colonizarem e lesionarem o epitélio deste órgão, o que resulta em redução da superfície de absorção deste, também podem chegar ao fígado, levando ao surgimento de abscessos hepáticos (Nagaraja & Chengappa, 1998). A acidose pode ser classificada em clínica e a subaguda. Na acidose clínica, bovinos que consumiram grandes quantidades de carboidratos não fibrosos, como grãos, apresentam maiores produções de ácidos graxos de cadeia curta (Galyean & Rivera, 2003). A concentração de ácido lático ruminal também é abruptamente aumentada com o aumento da produção de ácidos graxos de cadeia curta, resultando em drástica redução do pH ruminal. Concentrações de ácido lático no rúmen maiores que 40 mM (ambas as formas isômeras D e L) são consideradas reflexos de acidose clínica (Owens et al., 1998). O pH ruminal menor que 5,2 é considerado a barreira para acidose clínica (Owens et al., 1998; Galyean & Rivera, 2003). Ainda, pode ocorrer a acidose ruminal subaguda, definida por Krause & Oetzel (2006) como um período de depressão moderada do pH ruminal (5,5-5,0), que pode estar associada à laminite ou outro problema de saúde, levando à queda da produção. Goad et al. (1998) utilizaram animais adaptados à dieta à base de forragens para induzir acidose subaguda mudando subitamente para dieta exclusiva em grãos. Estes autores observaram diminuição de pH (5,0-5,5), concentração normal de ácido lático (5 mM), além de mudanças normais na população bacteriana relacionadas a animais em adaptação à dietas com maior proporção de carboidratos prontamente fermentescíveis, como maior presença de bactérias amilolíticas, aumento da população de Lactobacillus spp e presença de bactérias utilizadoras de lactato. Porém, o que chamou a atenção foi a diminuição da população total de protozoários ciliados após 48 horas de desafio, o que, segundo os autores, pode ser um bom indicador de um potencial ambiente acidótico dentro do rúmen.

MÉTODOS DE CONTROLE DA ACIDOSE O balanço entre a produção fermentativa dos ácidos e sua remoção ou neutralização está diretamente ligada a um ótimo ambiente ruminal. Pode-se dizer que a prevenção da acidose está relacionada com dois princípios: o primeiro seria proporcionar uma adaptação correta da mucosa e microbiota ruminal para absorção e metabolização dos altos níveis de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e a segunda estaria relacionada com métodos de manutenção do pH ruminal quando o animal tem acesso a dietas com altos níveis de energia. Desta forma, procura-se atuar na prevenção das desordens da

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fermentação, principalmente no manejo dos animais e da alimentação destes, ou na regulação dos processos fermentativos, com regulação do conteúdo de fibra ou com uso de aditivos na dieta (Kleen et al., 2003).

IMUNIZAÇÃO COMO POTENCIAL ADITIVO ALIMENTAR Alguns autores (Hardy, 2002; Berghman & Waghela, 2004) tem citado a utilização do conceito de imunidade como potencial ferramenta na manipulação da fermentação ruminal. Lee et al. (2002) testaram in vitro anticorpos contra Salmonella enteritidis e Salmonella thyphimurium e observaram inibição de crescimento dos microrganismos em meio líquido e também a existência de uma reação cruzada entre os anticorpos das duas espécies testadas. Em análise microscópica, foi demonstrado que a IgY específica para Salmonella se liga ao antígeno expressado na superfície da bactéria, levando à alterações estruturais que diminuem o crescimento destas. Shu et al. (1999) observaram que a imunização de novilhos contra bactérias produtoras de ácido lático, o Streptococcus bovis e o Lactobacillus, foi eficaz em manter o consumo alimentar, diminuir a concentração ruminal de lactato e a contagem de S. bovis e Lactobacillus após desafio, com dieta composta por 90% de concentrado. Gill et al. (2000) observaram resultados semelhantes quando ovinos alimentados à base de forragem foram imunizados contra Streptococcus bovis Sb-5. Os animais foram desafiados com a introdução súbita de alta proporção de grãos na dieta. Os ovinos vacinados mantiveram o consumo alimentar e o pH ruminal, bem como tiveram menores concentrações ruminais de lactato e menores escores de diarréia severa quando comparados aos animais controle. Ainda, Shu et al. (2000) observaram que ovinos imunizados contra S. bovis mantiveram o consumo alimentar e o pH ruminal, com menores escores de diarréia severa, quando comparados aos animais controle (não-vacinados). Em relação à imunização passiva, Sherman et al. (1983) observaram que a administração oral de anticorpos monoclonais de origem aviária contra o antígeno K99 da bactéria enterotoxinogênica Escherichia coli foi eficaz em atenuar a severidade da enfermidade e o grau de desidratação dos animais acometidos por quadros de diarréia, reduzindo a taxa de mortalidade. Resultados semelhantes foram encontrados por Yokoyama et al. (1992), onde a imunização passiva em leitões neonatos contra a bactéria enterotoxigênica Escherichia coli foi alcançada com a administração oral de anticorpos de origem aviária fornecidos logo após a exposição induzida aos antígenos. Em bezerros neonatos, Ikemori et al. (1992) observaram que a administração de anticorpos monoclonais de origem aviária contra a bactéria enterotoxigênica Escherichia coli foi capaz de proteger os animais contra o principal sintoma da infecção por este agente, a diarréia severa e conseqüente morte. Já no grupo

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controle, a taxa de mortalidade foi 100%. Ikemori et al. (1997) avaliaram a eficácia da imunização passiva contra coronavírus bovino, utilizando gema de ovo ou colostro em pó preparados a partir de galinhas ou vacas vacinadas com o vírus inativado de coronavírus bovino. Os bezerros foram desafiados 24 a 36 h após o nascimento com uma cepa virulenta do vírus. A administração da gema de ovo ou colostro em pó por via oral foi iniciada 6 h após o desafio e estendeu-se por mais 7 dias. Os animais do grupo controle apresentaram diarréia severa e todos morreram 6 dias após a infecção. Já nos tratamentos com gema de ovo de título de 1:2560 e colostro de título de 1:10240, todos os animais sobreviveram e ganharam peso. O pó de gema de ovo foi mais eficaz que o colostro, pois foi necessária menor concentração de título de anticorpo para promover a proteção contra os antígenos. Estes trabalhos de pesquisa mostram que o princípio da imunização tem potencial para originar novos aditivos alimentares. Dentro deste princípio, foram desenvolvidos os preparados de anticorpos policlonais (PAPs), específicos para as bactérias alvo presentes no ambiente ruminal e que podem ser adicionados à dieta animal.

PREPARADO DE ANTICORPOS POLICLONAIS Segundo Hau & Coenraad (2005), os princípios da resposta imune específica ao antígeno são: ativação das células B, responsáveis pela produção de anticorpos; ativação das células T, responsáveis pela resposta citotóxica ao antígeno; ativação das células Th (T helper), responsáveis pela estimulação das células B e T. A manutenção da resposta antígeno-anticorpo é realizada através de comunicação intercelular, pelo contato célula-célula (mediado pelas citosinas). Para a produção de anticorpos policlonais, galinhas são imunizadas via intramuscular contra antígenos inativados. Para cada antígeno, há um calendário de reforços. O sistema imune da ave reage, produzindo anticorpos específicos (IgY) para cada antígeno. Quando o ovo ainda está no ovário, a galinha transfere suas imunoglobulinas séricas Y para a gema do ovo. À medida que o ovo passa pelo oviduto, os anticorpos IgM e IgA são adicionados à albumina (Schade et al., 2001). Assim, as imunoglobulinas podem ser extraídas da gema do ovo por diversas técnicas, sendo que uma das mais utilizadas envolve a precipitação protéica com sulfato de amônia. Este método de produção de anticorpos foi avaliado pelo Centro Europeu de Validação de Métodos Alternativos (Schade et al., 1996), órgão que promove a aceitação científica e regulamenta métodos laboratoriais alternativos, com fins de reduzir ou substituir a utilização de animais de laboratório. O uso desta técnica foi incentivado, pois reduz a necessidade de

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animais de laboratório, já que uma galinha produz em média 5 - 7 ovos por semana. Além disso, causa menor estresse aos animais por não haver sangria após a imunização. As imunoglobulinas Y, produzidas de ovos de galinhas, possuem características fundamentais para atuação no ambiente ruminal, como resistência a pH até 4,5, temperatura de 120°C, à proteólise e, mesmo após sua quebra, não perdem o sítio de ligação (Alfredo diConstanzo, comunicação pessoal). Acredita-se que esta resistência à proteólise esteja relacionada à presença de ligações dissulfeto na composição das imunoglobulinas, mais difíceis de serem rompidas pelas enzimas proteolíticas (Santos, 2006).

RESPOSTAS à UTILIZAÇÃO DOS ANTICORPOS POLICLONAISEFEITOS SOBRE OS MICRORGANISMOS RUMINAIS Cada preparado de anticorpos policlonais foi desenvolvido para agir contra microrganismos ruminais específicos. DiLorenzo et al. (2006 e 2008) observaram que a adição de preparados de anticorpos policlonais (PAP) contra Streptococcus bovis (PAP-Sb) ou Fusobacterium necrophorum (PAP-Fn) foi eficaz na redução das concentrações ruminais das bactérias alvo. Ainda, a concentração de F. necrophorum não foi alterada pelo uso de PAP-Sb e a concentração de S. bovis não se alterou pela utilização de PAP-Fn, demonstrando a alta especificidade dos PAPs. Já Blanch et al. (2009) não observaram diferenças entre o grupo tratado com PAP-Sb e o grupo controle avaliado pela técnica de PCR em tempo real. Numericamente, a concentração de DNA da bactéria produtora de lactato (S. bovis) foi mais elevada no grupo controle em relação ao PAP-Sb (91,6 ± 54 e 49,5 ± 11 ng/mL no fluido ruminal, respectivamente), mas estas diferenças não foram significativas devido à grande variação de animal para animal. Em trabalho de pesquisa desenvolvido no Departamento de Nutrição e Produção Animal, FMVZ/USP com animais tratados com dois diferentes modificadores ruminais (monensina e PAP contra Streptococccus bovis, Fusobacterium necrophorum e cepas de bactérias proteolíticas) e 3 fontes energéticas distintas, Otero (2008) descreveu que não foi possível atribuir um padrão na estrutura de amplificação das comunidades Bacteria ou Archaea do conteúdo ruminal avaliado pela técnica da eletroforese em gel com gradiente de desnaturação (DGGE). O mesmo foi relatado por Blanch et al. (2009). Em relação aos protozoários, Otero (2008) relatou que o PAP contra Streptococccus bovis, Fusobacterium necrophorum e cepas de bactérias proteolíticas aumentou em 93,65% a contagem relativa de Isotricha em relação ao grupo controle, às 4 horas após a alimentação, independentemente das dietas utilizadas. Em outras palavras, quando da contagem de protozoários do gênero Isotricha, o efeito de modificador não dependeu do tipo de fonte

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energética adotada, sendo possível o estudo apenas do efeito principal de tipo de modificador ruminal utilizado (ausência ou monensina ou PAP), conforme foi apresentado na Figura 1.

Figura 1. Contagem relativa de protozoários do gênero Isotricha (x 103/mL) obtida com os tratamentos compostos por diferentes modificadores ruminais. Letras diferentes acima das barras indicam diferença estatística, quando cada momento de coleta foi estudado.

O efeito do PAP no aumento de Isotricha pode demonstrar a ação deste produto na diminuição do número de bactérias responsáveis pela acidificação do ambiente, uma vez que baixo pH foi comumente associado à defaunação ruminal (Vance et al., 1972; Lyle et al., 1981). Assim, pode ser que a utilização de PAP em dietas de alto teor de concentrado possa ser associada à proliferação de bactérias, uma fonte de substrato para protozoários, tornando possível a sobrevivência destes últimos no ambiente ruminal. Em contrapartida, Blanch et al. (2009) não observaram diferença na contagem de protozoários entre o grupo tratado com PAP-Sb e o grupo controle. O mesmo foi observado por Bastos (2009) que testou diferentes dosagens de um preparado de anticorpos policlonais contra Streptococccus bovis, Fusobacterium necrophorum e cepas de bactérias proteolíticas. A diversidade microbiana ruminal é determinada pelas características do rúmen (temperatura, pressão osmótica e pH), tipo de nutriente disponível, além de interações, como predação, mutualismo e antibiose, que ocorrem entre os microrganismos ruminais. O impacto da retirada de uma ou mais espécies bacterianas do ambiente ruminal não é bem conhecida (Arcuri et al., 2006). As bactérias ruminais produzem produtos em culturas puras que não são observadas em culturas mistas, porque a relação sintrófica entre as espécies envolve uma dependência de metabolismo e alimentação cruzada (Van Soest, 1994).

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A bactéria Streptococcus bovis, uma das principais bactérias-alvo do preparado de anticorpos policlonais, é classificada como fermentadora de carboidratos não-estruturais, principalmente amido e açúcares. São anaeróbias facultativas de curto tempo de geração (máximo 24 min). É uma bactéria oportunista que apenas se torna uma espécie dominante se grandes quantidades de carboidratos solúveis são adicionados à dieta (Russell, 2002). É possível pressupor que, se esta bactéria é retirada do ambiente ruminal, seu nicho será ocupado por espécies que disputem os mesmos substratos para fermentação, como Bacteroides ruminicola, Selenomonas ruminantum ou, ainda, protozoários. Porém, os metabólitos produzidos podem ser diferentes, o que pode acarretar novas alterações no ambiente ruminal.

EFEITOS SOBRE A FERMENTAÇÃO RUMINAL Os resultados de pH ruminal com a utilização dos preparados de anticorpos policlonais são variados. Em diversas condições experimentais, o pH ruminal não foi influenciado pela sua utilização (Dahlen et al., 2003; DiLorenzo et al., 2008; Blanch et al. 2009). Bastos (2009) em outro trabalho desenvolvido no Departamento de Nutrição e Produção Animal da FMVZ/USP observou que diferentes doses (0; 1,5; 3,0 e 4,5 g/anim/dia) de um PAP contra S. bovis, F. necrophorum e várias cepas de bactérias proteolíticas não alteraram o pH ruminal de vacas fistuladas alimentadas com dietas de alto concentrado. Já em um experimento com vacas leiteiras, o preparado de anticorpos policlonais foi efetivo em manter o pH ruminal em animais em início de lactação, quando comparado ao grupo controle (DiLorenzo et al., 2007). Marino (2008), ao trabalhar com vacas canuladas no rúmen em outro experimento realizado no Departamento de Nutrição e Produção Animal (FMVZ/USP) e alimentadas com dietas com alta proporção de concentrado, sendo estas compostas por três fontes energéticas (milho seco moído, silagem de grão úmido de milho e polpa cítrica), observou que o PAP contra S. bovis, F. necrophorum e várias cepas de bactérias proteolíticas (Clostridium stricklandi, Clostridium aminophilum e Peptostreptococcus anaerobius) foi tão eficaz quanto a monensina em manter o pH ruminal às 4 h após a alimentação. Ainda, o efeito dos modificadores foi aditivo à inclusão da polpa cítrica nas dietas em elevar o pH ruminal (Figura 2). Nela, observa-se que o pH ruminal dos animais suplementados com milho seco sofre um aumento de 0,21 unidades de pH (3,8%) com a utilização da monensina (5,79), em relação ao grupo controle (5,58). Quando avalia-se os grupos de animais tratados sem aditivos, observa-se que a adição da polpa cítrica (5,89) acarreta aumento de 0,31 unidades de pH (5,6%), quando comparado ao grupo suplementado com milho seco (5,58). Quando se compara o grupo suplementado com polpa cítrica e monensina (6,27) com o grupo milho seco sem monensina (5,58), observa-se que a diferença entre

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esses dois grupos é igual à 0,69 unidades de pH. Esta diferença é compatível com os aumentos isolados de pH causados pela polpa cítrica e pela monensina (0,31 + 0,21 = 0,52). O mesmo raciocínio é válido para o PAP, indicando que os modificadores PAP e MON apresentaram efeito aditivo à inclusão da polpa cítrica em elevar o pH ruminal. Entretanto, a inclusão do PAP não alterou, ao longo do dia, o tempo em que o pH ruminal permaneceu abaixo de 6,0.

Figura 2. Efeito de fonte energética (MS = milho grão seco, SGUM = silagem de grão úmido de milho, PC = polpa cítrica) ou aditivo alimentar [CON = controle, MON = monensina, PAP = anticorpos policlonais] no pH ruminal 4 h após a alimentação de vacas Holstein.

A concentração total de ácidos graxos de cadeia curta, bem como a proporção molar do ácido acético, propiônico e butírico, não foi alterada com a inclusão dos PAPs nas dietas (Dahlen et al., 2003; DiLorenzo et al., 2008; Marino, 2008; Bastos, 2009; Blanch et al., 2009). Provavelmente, a retirada de algumas espécies bacterianas do ambiente ruminal não é suficiente para alterar a proporção dos ácidos graxos de cadeia curta. O mesmo foi observado para a concentração de ácido lático. Nos experimentos citados, as concentrações de ácido lático observadas foram baixas ou não detectadas. Provavelmente, isto está relacionado com as variações diárias de pH ruminal observadas (5,70-6,27). Somente quando o pH ruminal diminui abaixo de 5,5, as bactérias que utilizam lactato são inibidas e este ácido começa a se acumular (Nagaraja & Titgemeyer, 2007). Apesar de alguns anticorpos policlonais agirem contra bactérias proteolíticas, a concentração ruminal de nitrogênio amoniacal não foi alterada com sua utilização (Dahlen et al., 2003; DiLorenzo et al., 2008; Marino, 2008; Bastos, 2009; Blanch et al., 2009).

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Em outro projeto de pesquisa conduzido no Departamento de Nutrição e Produção Animal – FMVZ/USP (Pacheco, comunicação pessoal), visou-se avaliar o preparado de anticorpos policlonais contra as bactérias ruminais precursoras de distúrbios nutricionais (Streptococccus bovis, Lactobacillus ssp. e Fusobacterium necrophorum), como aditivo alimentar preventivo à acidose em bovinos. Nove vacas canuladas no rúmen com 677±98 kg de peso vivo médio foram agrupadas em baias individuais através de delineamento em blocos casualizados com dois períodos de 20 dias. Separaram-se os animais em três tratamentos: controle (CTL), preparado de anticorpos policlonais (PAP) e monensina sódica (MON). Nos primeiros cinco dias de cada período, os animais receberam apenas cana-de-açúcar e úreia como alimento, em seguida, foi fornecida a dieta desafio com aproximadamente 74% de concentrado, com o intuito de causar acidose ruminal. Não foi observado efeito de tratamento (P>0.05) para a ingestão de matéria seca. Os animais tratados com monensina apresentaram pH mais elevado (P<0.0001) que os demais tratamentos (MON = 6.06 vs. PAP = 5.89 e CTL = 5.91). O nível de lactato ruminal permaneceu baixo (0.23 mM), mesmo após o desafio (Tabela 1). A concentração de N-amoniacal do CTL foi menor (P=0.0039), comparado à MON e PAP (11.20 vs. 14.74 e 13.64 mg/dL, respectivamente). Os tratamentos não influenciaram a proporção molar de acetato (P=0.3288). Entretanto, houve interação dia x tratamento (P=0.0079) para a proporção molar de propionato, na qual a MON aumentou a proporção deste ácido nos quatros dias subseqüentes ao desafio (Figura 3). Da mesma forma, a MON reduziu (P = 0.0007) a relação acetato:propionato nos três dias seguintes ao desafio (Figura 4). Ambos os tratamentos foram eficazes em diminuir (P = 0.0001) a proporção molar de butirato (18.43 vs. 15.42 e 16.35 mol/100 mol; para CTL, MON e PAP, respectivamente). A acidose gerada não foi lática e, assim, talvez não tenham sido atingidas as condições para o PAP agir sobre as bactérias produtoras de lactato. Em contrapartida, a MON foi eficaz em controlar o pH e melhorar a fermentação ruminal de animais em condições de acidose subaguda.

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Tabela 1. Valores de pH ruminal, dias em que os animais apresentaram acidose (DEA), concentração de lactato, ácidos graxos de cadeia curta totais (AGCCt) e nitrogênio amoniacal (N-NH3) de bovinos induzidos à acidose ruminal recebendo PAP ou MON.

1 Média dos tratamentos; 2 EPM = erro padrão da média; 3 DEA = contabiliza-se os dias a partir do desafio com a dieta de alto concentrado cujo pH mensurado na terceira hora pós-prandial foi < 5,66; 4 AGCCt = ácidos graxos de cadeia curta totais.

Figura 3. Proporção molar de propionato em bovinos induzidos à acidose ruminal. A seta em negrito representa a mudança da dieta de 100% forragem para a de 74% concentrado, juntamente com o fornecimento dos aditivos alimentares.

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Figura 4. Relação Acetato:propionato em bovinos induzidos à acidose ruminal. A seta em negrito representa a mudança da dieta de 100% forragem para a de 74% concentrado, juntamente com o fornecimento dos aditivos alimentares.

EFEITOS SOBRE A DIGESTÃO Otero (2008) estudou os efeitos da administração de dois modificadores de fermentação ruminal, PAP ou monensina, em três tipos de dietas, segundo o principal ingrediente energético das mesmas: milho seco moído, silagem de grão úmido ou polpa cítrica. Ao avaliar a degradabilidade potencial (Dp) da FDN da cana-de açúcar, houve interação entre os fatores modificador e tipo de dieta (P=0,0174), sendo possível a comparação entre aditivos somente dentro de cada dieta estudada. Desta forma, em dietas com silagem de milho úmido, a Dp da FDN da cana-de açúcar foi três vezes maior para vacas que receberam PAP do que vacas do tratamento monensina. Este resultado é muito interessante, pois o modificador de fermentação ruminal mais utilizado atualmente, a monensina, pode estar associado à queda na degradabilidade da FDN de alimentos fibrosos (Newbold et al., 1990; Katsuki et al., 2006; Rodrigues et al., 2007). Sendo assim, o PAP poderia ser alternativa interessante à monensina, principalmente em dietas contendo silagem de grão úmido, como demonstrado por Otero (2008). Em contrapartida, em dietas com milho seco ou polpa cítrica, a Dp da FDN da cana se mostrou muito semelhante entre PAP e monensina, não havendo significativas alterações desta variável nestas dietas (Figura 5).

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Figura 5. Efeito de modificadores ruminais PAP ou monensina sobrea a degradabilidade potencial da cana-de-açúcar, em diferentes dietas. Os animais controle não receberam nenhum aditivo alimentar.

Apesar de o PAP ser produzido para agir contra bactérias proteolíticas, Otero (2008) não observou nenhum efeito deste produto sobre a degradabilidade in situ da proteína bruta do farelo de soja, a fonte protéica utilizada neste estudo. Em relação às fontes energéticas, o efeito do PAP foi limitado. O grupo tratado com PAP apresentou diminuição da fração solúvel “a” do amido do milho seco moído de 45,26% e 45,37% em relação ao grupo controle e monensina, respectivamente. Não foram observados efeitos do PAP em nenhum parâmetro de degradabilidade in situ do amido do grão úmido de milho ou da pectina da polpa cítrica (Otero, 2008). Marino (2008) observou diminuição da digestibilidade da FDN, FDA e amido, além do NDT com a utilização do PAP. Não há outros relatos na literatura a respeito dos efeitos da administração de anticorpos policlonais na digestibilidade in vivo. Uma hipótese para a diminuição na digestibilidade das frações fibrosas da dieta com a utilização do PAP seria sua atuação contra as bactérias proteolíticas. Sabe-se que as bactérias celulolíticas necessitam de amônia para degradar a fibra e uma interferência na disponibilidade de nitrogênio amoniacal, poderia estar relacionada com a diminuição da digestibilidade destas frações. Di Lorenzo et al. (2006) observaram que houve diminuição na contagem de S. bovis e F. necrophorum com a utilização do PAP específico para estas bactérias. Porém, no estudo de Marino (2008) não foram realizados ensaios para a contagem dos microrganismos específicos aos quais este produto foi direcionado.

EFEITOS EM GADO DE CORTE Espera-se que animais em engorda tenham melhor desempenho se não forem acometidos por acidose subaguda que provoca flutuações no consumo, diminuindo o ganho de peso e aumentando os dias necessários para

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o abate. Acredita-se que o controle do Streptococcus bovis, bactéria produtora de ácido lático, pode contribuir para manter um ambiente ruminal mais estável, contribuindo assim para o desempenho animal. Dahlen et al. (2004) observaram que novilhos que receberam um PAP contra Streptococcus bovis (PAP-Sb) ou Fusobacterium necrophorum (PAP-Fn) tiveram maiores pesos finais ao abate quando comparados ao grupo controle. Os animais alimentados com a dieta PAP-Sb obtiveram melhor eficiência alimentar do que os alimentados com as dietas controle ou PAP-Sb + PAP-Fn. As carcaças dos novilhos com a dieta PAP-Sb foram mais pesadas, com maior camada de gordura subcutânea e melhores classificações ao abate, quando comparadas às carcaças dos animais recebendo as dietas com ambos PAPs (Sb e Fn) ou controle. Millen et al. (2007) relataram que animais suplementados com anticorpos apresentaram menor incidência de rumenites quando comparado aos animais suplementados com monensina, sem diferença significativa com respeito ao desempenho em confinamento. O incremento na saúde das papilas ruminais permite maior absorção de ácidos graxos voláteis, promovendo, assim, a saúde e o desempenho do animal com menores riscos de ocorrência de quadros de acidose e abscessos hepáticos. A severidade dos abscessos hepáticos foi diminuída com a utilização de um PAP contra F. necrophorum, bactéria envolvida com o desenvolvimento destes abscessos (DiLorenzo et al., 2008). Sarti et al. (2009) observaram que a inclusão do PAP contras as bactérias S. bovis, F. necrophorum, Lactobacillus spp., E. coli e endotoxinas na dieta não melhorou a superfície de absorção da parede ruminal; no entanto, a suplementação com monensina sódica mostrou ser efetiva em aumentar a superfície de absorção por cm2 de parede do rúmen quando foram comparados aos animais que não receberam monesina (24,92 vs. 19,45 cm2). A maior superfície de absorção do epitélio ruminal pode indicar maior absorção de ácidos graxos de cadeia curta e ainda menor extensão de lesões (rumenites). DiLorenzo et al. (2008) observaram que um PAP contra S. bovis (PAP-Sb) foi efetivo em elevar a eficiência alimentar. Porém, no grupo alimentado com um PAP contra F. necrophorum (PAP-Fn), houve diminuição no rendimento de carcaça. As prováveis razões para estas observações são desconhecidas. Pacheco et al. (2008) e Millen et al. (2009) observaram que a utilização do preparado de anticorpos policlonais não afetou as características de carcaça e qualidade de carne, com exceção de diminuição do rendimento de carcaça no estudo de Pacheco et al. (2008), demonstrando que não há possíveis perdas na qualidade da carne. O pesquisador atribuiu essa diferença aos procedimentos normais sofridos pela carcaça na linha de abate, uma vez que não houve diferença estatística em nenhuma das outras variáveis estudadas. Da mesma forma, de acordo com Fossa et al. (2008), bovinos jovens com diferentes graus

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de sangue Zebu alimentados com PAP (contra as bactérias ruminais S. bovis, F. necrophorum, E. coli e várias cepas de bactérias proteolíticas) ou monensina sódica apresentaram algumas similaridades no perfil de ácidos graxos da gordura subcutânea do músculo Longissimus. Foram observados resultados similares para os ácidos mirístico (C14:0), esteárico (C18:0), oléico (C18:1), linoléico (C18:2) e linolênico (C18:3). No entanto, para os ácidos palmítico (C16:0) e margárico (C17:0), foram encontradas maiores concentrações dos mesmos na gordura subcutânea de animais suplementados com monensina. Millen et al. (2007), ao testarem um PAP contra as bactérias ruminais S. bovis, F. necrophorum, E. coli e várias cepas de bactérias proteolíticas sobre o desempenho de bovinos jovens com diferentes graus de sangue Zebu, relataram que animais suplementados com PAP apresentaram ganho de peso diário (1,35 vs. 1,31 kg), ingestão de matéria seca em quilos (8,37 vs. 8,14 kg) e eficiência alimentar (0,159 vs. 0,160) similares aos de animais suplementados com monensina sódica. Já em porcentagem do peso vivo, animais suplementados com anticorpos policlonais aviários consumiram mais que aqueles suplementados com monensina sódica (2,20 vs. 2,14%). Os dados de Millen et al. (2009), em estudo similar, concordam com o experimento anterior, onde nenhuma diferença em ganho de peso diário e conversão alimentar foi detectada, com maiores ingestões de matéria seca para bovinos que receberam PAP comparados àqueles que foram suplementados com monensina sódica. O aumento da ingestão de matéria seca devido ao uso de PAP na alimentação de bovinos alimentados com dietas de alta energia tem sido relatado por diversos autores (Shu et al., 1999; Gill et al, 2000; Shu et al., 2000). Barducci et al. (2009) estudaram a inclusão ou não de monensina sódica ou PAP contras as bactérias S. bovis, F. Necrophorum, Lactobacillus spp., E. coli e endotoxinas em dietas com altos teores de concentrado para bovinos jovens Brangus em confinamento. Os animais suplementados com monensina apresentaram melhor eficiência alimentar (0,180 vs. 0,173 kg/kg), maiores ganho de peso diário (1,68 vs. 1,57 kg) e peso de carcaça quente (248,46 vs. 240,20 kg) que aqueles que não receberam monensina. Por outro lado, a adição de PAP na dieta não melhorou o desempenho dos bovinos confinados e nem afetou negativamente a ingestão de matéria seca (9,16 vs. 9,08 kg) ou o rendimento de carcaça (52,38 vs. 52,12 kg).

ANTICORPOS POLICLONAIS X COMPORTAMENTO INGESTIVO Mariani (2009) reportou que animais suplementados com monensina apresentaram maior número de refeições/dia e menor tempo de alimentação/refeição que animais recebendo PAP (contra as bactérias ruminais S. bovis, F. necrophorum, E. coli e várias cepas de bactérias proteolíticas), indicando

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que como a ingestão de matéria seca por refeição foi numericamente menor, animais suplementados com monensina foram mais vezes ao cocho, aumentando, com isso, a taxa de passagem da digesta do rúmen para o omaso e, consequentemente, aumentando o tempo de ruminação desses animais, o qual foi observado apenas no período de terminação. O menor tempo de alimentação por refeição e o maior número de refeições por dia em bovinos recebendo monensina devem estar ligados à reduzida variação na ingestão de matéria seca. Burrin et al. (1988) e Stock et al. (1995) reportaram reduzida variação na ingestão de matéria seca quando monensina foi fornecida a bovinos confinados. No entanto, no mesmo estudo de Mariani et al. (2009) não foram encontradas diferenças para eficiências de alimentação e ruminação da matéria seca e do FDN quando animais que receberam PAP foram comparados àqueles suplementados com monensina sódica.

EFEITOS EM GADO LEITEIRO Limitadas são as informações dos efeitos do PAP sobre o desempenho produtivo ou composição do leite em vacas leiteiras. Quando vacas leiteiras foram alimentadas com PAP contra bactérias proteolíticas ruminais Clostridium stricklandi, Clostridium aminophilum e Peptostreptococcus anaerobius, a produção leiteira dos animais em início (<140 dias) ou estágio avançado (>140 dias) de lactação não foi afetada pela utilização dos anticorpos. Ainda, a concentração de gordura e proteína no leite, bem como a contagem de células somáticas ou a quantidade de uréia no leite, não foram alteradas pela utilização deste aditivo. Já a concentração de sólidos no leite foi reduzida (Dahlen et al., 2003).

CONCLUSÕES Os resultados acima citados demonstram o potencial dos anticorpos policlonais no controle de populações bacterianas ruminais. Ainda, sua metodologia de produção é conceituada e aprovada pela menor necessidade de animais de laboratório e exposição dos mesmos a condições de estresse. O uso da imunização passiva oral é uma tecnologia que surge como alternativa eficaz para a produção de novos aditivos alimentares. Neste contexto, novos estudos são necessários acerca deste potencial aditivo alimentar, no intuito de melhor compreender seus efeitos na manipulação da fermentação ruminal e, desta forma, inferir as condições de uso mais adequadas dentro da produção de ruminantes.

AGRADECIMENTOS Os autores agradecem aos funcionários do Departamento de Nutrição e Produção Animal da FMVZ/USP, Gilmar Botteon pelo cuidado e carinho com

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os animais e discentes, aos técnicos do laboratório de Bromatologia, Ari Luiz de Castro, Everson J. Lázaro, Gilson L.A. de Godoy, Isabel G. Ramos e Simi L. D. Aflalo, pela paciência, disponibilidade para ensinar e participar de todas as etapas das análises laboratoriais e a Alessandra de Cassia Terassi da Silva e José Francisco Malachias Ferreira por toda assistência com o desenvolvimento do projeto. Agradecem também ao Departamento de Nutrição e Melhoramento Animal da FMVZ/UNESP (Botucatu), representado por seus docentes, alunos e funcionários, pelo apoio na execução da parte do projeto que coube a Pirassununga. Esses experimentos são produtos da frutífera parceria entre a UNESP e a USP. Agradecem ainda à Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão de auxílio financeiro ao projeto e bolsas de treinamento técnico, mestrado, doutorado, pós-doutorado e produtividade pesquisa a todos os envolvidos.

COMUNICAÇÃO PESSOAL Dr. Alfredo DiCostanzo - Departamento de Ciência Animal, Universidade de Minnesota, St. Paul, E.U.A, 550108. E-mail: dicos001@umn.edu Rodrigo Dias Lauritano Pacheco – Departamento de Melhoramento e Nutrição Animal, FMVZ/UNESP, Botucatu, Brasil. E-mail: pachecozoo@yahoo.com.br

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CAPÍTULO III

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO E DE CICATRIZAÇÃO DO MUCO DE ESCARGOT ACHATINA SP

MARTINS, M.F.; PIERUZZI, P.A.P.; PAIM, E.F.

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, Departamento de Nutrição e Produção Animal -VNP

RESUMO Os caracóis terrestres pertencem à família Achatinidae (África) e Helicidae (Europa). A espécie mais conhecida é o Achatina fulica (Gigante africano), sendo a mais recomendada para as regiões tropicais e subtropicais devido a sua capacidade de adaptação a estes climas. O muco de caracóis terrestres Achatina sp tem sido pesquisado devido a sua atividade cicatrizante, antimicrobiana, antitumoral e cosmética. Em busca de produtos de origem animal de importância terapêutica, a exemplo de venenos dos aracnídeos, própolis e mel das abelhas e, com a experiência acumulada ao longo desses anos sobre as propriedades farmacológicas do muco do escargot Achatina sp, muitas questões estão sendo revisadas e indagações suscitadas com o propósito de suas aplicações terapêuticas e cosméticas utilizadas desde os primórdios da humanidade.

1. INTRODUÇÃO As investigações científicas relacionadas ao muco de escargots Achatina sp envolvem diferentes parâmetros alicerçados no conhecimento científico ou popular, passando pelo misticismo de algumas seitas como o candomblé, na qual o escargot Achatina monocromatico ou escargot africano branco é considerado uma iguaria importante para os orixás se purificarem (Santos, comunicação pessoal, 2000). O muco de escargots Achatina sp é armazenado em estruturas secretoras internas revestidas por células epiteliais e são distinguidas em constitutivas, pré formadas e armazenadoras ou induzidas, reação a trauma. Essas estruturas são encontradas no pé do animal, órgão muscular, totalmente revestido por glândulas e que corresponde à porção comestível do escargot (Sírio, 2005). O prazer e o desafio de estudar detalhadamente esse intrigante molusco permite determinar de modo racional, desde a forma de extração do muco ao seu estudo biológico, genético, bioquímico, histológico e citotóxico em diferentes

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espécies animais, do camundongo hairless do biotério ao estábulo na mastite bovina encontrando nesse muco, uma importante contribuição para o reparo tecidual e capacidade antimicrobiana. Estas características promovem efeitos terapêuticos em diferentes espécies com perspectivas de aplicação na espécie humana, o que já ocorre com um xarope da medicina popular denominado Helicidine®, produzido nas bouticas francesas (Figura 1) assim como na área cosmética. Desse modo, podemos destacar a distribuição do muco na Europa, Chile e EUA.

Figura 1. Xarope francês a base de muco de escargots Helix pomatia.

2. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OS MOLUSCOS ACHATINA SP Os moluscos são animais invertebrados que constituem um filo distinto e particular destituído de semelhança ou afinidade filogenética com qualquer outro grupo vivente. O filo Mollusca possui uma abundância de espécies, cerca de 100.000 espécies vivas, constituindo o segundo maior filo animal. Sucesso este atribuível à extrema plasticidade e adaptabilidade do plano básico corporal. Os moluscos podem ser encontrados no mar, na água doce e na terra e, devido a sua imunidade natural, formadas pela barreira de proteção anatômica e química que previnem danos aos tecidos básicos, perda de fluido corporal e infecções por microrganismos patógenos e parasitas, obtiveram grande sucesso adaptativo e reprodutivo. A principal barreira física é a concha e o muco que envolve todo o corpo do animal (Lorenzi et al., 2008). O gênero Achatina fulica no Brasil está entre as 100 espécies invasoras do mundo, pois foi introduzido em diversos países, apresentando grande sucesso de adaptação e dispersão (Alowe et al., 2004).

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Sua introdução no Brasil deu-se a partir do ano de 1988, quando produtores brasileiros importaram-no como possível alternativa barata para o escargot do gênero Helix (Martins, 2000). A disseminação desse molusco, que é conhecido como escargot gigante africano, estendeu-se por todo o território brasileiro atacando diferentes culturas agrícolas, porém não causou nenhum tipo de óbito ou doenças (Instituto Horus de Desenvolvimento e Conservação Ambiental, 2005). O gênero Achatina pertence à família Achatinidae, são animais lentos e intimamente associados ao substrato, mas apesar desta condição, apresentam uma notável capacidade de irradiação adaptativa que reflete no tipo de concha, nos tipos de alimentação e na especialização de diversos micro habitats e nichos (Barnes et al., 1995). A pele representa a interface entre o meio externo e o meio interno dos animais e em muitos moluscos a epiderme está envolvida na troca respiratória, no fluxo de água e, provavelmente, na regulação iônica. É bastante inervada e contém um número de órgãos sensitivos de grande importância para o seu contato com o meio externo. Muitos moluscos também secretam uma variedade de substâncias derivadas de ácidos de ésteres aromáticos que podem atuar como protetores (Simkiss & Wilbur, 1977). O corpo dos caracóis Achatina sp é revestido por uma rica secreção mucoglicoprotéica que apresenta funções já identificadas como facilitador de seus movimentos e prevenção de desidratação (Mitra et al., 1988). Iguchi (1982) descreveu o muco como um fluido viscoelástico resultante da mistura da secreção de várias glândulas e apresenta como funções: veículo de transporte de partículas da superfície ciliada, secreção de produtos, transferência de água e eletrólitos através da epiderme, auxílio na locomoção, sendo que a principal função da secreção glicoprotéica envolve a proteção do corpo do animal contra a desidratação. De acordo com o autor, esses invertebrados possuem fatores de defesa que impedem a entrada de materiais estranhos, para tal, os moluscos apresentam fatores antimicrobianos que exibem atividades contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. De acordo com Fuchino et al., (1992) os fatores de defesa dos moluscos são principalmente as reações de defesa celular e humoral, sendo que, na primeira envolvem fagocitose e, na segunda, englobam: lisozimas, lecitinas, fatores antibacterianos ou antivirais e opsonização. Em observação a atividade bactericida da glicoproteína, achacin, presente no muco do caracol da espécie Achatina fulica (Figura 2), assim como na membrana citoplasmática e nas células da parede da bactéria Gram negativa Escherichia coli, observou-se por microscopia imunoeletrônica que não houve qualquer atividade bacteriostática apenas nos estágios de crescimento da bactéria.

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Figura 2. Caracol terrestre Achatina fulica. Segundo Ehara et al., (2002) a achacin está intimamente ligada à fase de crescimento da bactéria, ou seja, uma função importante na fase dependente de crescimento bacteriano e também pode atuar como uma defesa molecular contra invasão bacteriana. Os componentes humorais da imunidade dos moluscos são formados por atividades lisoenzimática, lecitinas e o sistema feniloxidase, sendo que o mecanismo de defesa interno dos moluscos envolve reações celulares, tais como: fagocitose, formação de nódulos, encapsulação, atrofia, necrose e liquefação do tecido (Glinski & Jarosz, 1997). Os caracóis terrestres Achatina fulica possuem uma proteína glicosaminoglicana presente em seu corpo, chamada Acharan sulfato, que representa cerca de 3 a 5% do peso seco dos tecidos deste animal e constitui quase inteiramente o muco produzido por esses animais (Jeong et al., 2001). Estes moluscos possuem hábitos generalistas, alta resistência aos rigores ambientais, aliado ao alto potencial reprodutivo, favorecendo a disseminação da espécie a partir dos locais de introdução. É um molusco pseudohermafrodita, pode produzir cerca de 350 ovos por postura, indicando a necessidade de compreender o impacto causado pela introdução dessa espécie exótica nas populações de vários estados brasileiros (Barbosa & Salgado, 2001). Baseado nesse fato, o enfoque etnoecológico associado às práticas educativas, como o projeto “Dr. Escargot”, apoiado pela FAPESP (Martins, 2000), levou a uma diversidade cultural e de respeito a todas as formas de vida para dentro das escolas de Pirassununga, aprofundando a compreensão desse molusco exótico e as relações desse animal com o ser humano.

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O impacto causado na natureza pelo homem ao introduzir um animal diferente de nossa forma aliado as pesquisas envolvendo seu muco e a zooterapia propriamente dita proporcionou interagir crianças com ou sem necessidades especiais, nas escolas gerando aprendizado e motivação (Martins, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004).

3. BIOFÁRMACOS Os biofármacos são definidos como todo o medicamento manufaturado obtido exclusivamente de princípios ativos de animais ou vegetais, com a finalidade de interagir com meios biológicos a fim de auxiliar no diagnóstico, reduzir ou prevenir manifestações patológicas promovendo benefícios para os animais ou seres humanos. São também caracterizados pelo conhecimento da eficácia dos riscos advindos do seu uso assim como a reprodutibilidade e constância de sua qualidade e o produto final acabado, embalado e rotulado (ANVISA, 2010). Nos últimos anos a gama de biofármacos disponíveis para seu emprego terapêutico ou cosmético tem aumentado progressivamente. Os componentes dos produtos de origem animal, marinha ou vegetal têm sido elucidados, principalmente, no que diz respeito as suas proteínas com uma ampla gama de estruturas e pesos moleculares (Barbosa & Salgado, 2001) sendo disponibilizados para o mercado. Em nosso laboratório do Departamento de Nutrição e Produção Animal da FMVZ – USP, Campus de Pirassununga, associados também aos grupos de pesquisa do laboratório de Morfologia e Anatomia das Faculdades de Odontologia e Farmácia da USP de Ribeirão Preto, atualmente investiga-se o muco de escargots Achatina sp quanto as suas propriedades cicatrizantes e antimicrobianas. Desse modo, resultados obtidos em estudos prévios como “Avaliação fenotípica e histológica de feridas cirúrgicas de coelhos tratados com secreção mucoglicoprotéica de escargots Achatina fulica”, abrem perspectivas para a utilização terapêutica e cosmética do muco de escargots Achatina sp não só para animais mas também para os seres humanos.

4. ATIVIDADE COSMÉTICA E HIDRATANTE DE ESCARGOTS ACHATINA SP O uso medicinal do muco de escargots Achatina sp e sua utilização com essa finalidade é reportada desde o tempo clássico de povos gregos e romanos, com aplicação nas feridas dos cavalos em combate e sua carne consumida pelos guerreiros (Lobão, 2001). No Brasil, sua exploração foi iniciada nos anos 90, essencialmente para a produção de carne. Durante o ano 2000, Martins e colaboradores iniciaram estudos com o muco de escargots analisando conjuntamente pesquisas sobre

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sua atividade cicatrizante e antimicrobiana. Nessas análises, verificou-se o efeito do uso profilático do muco na desinfecção de tetos de vacas leiteiras (Yokoya, 2010), no pré e pós dipping, com redução significativa na microbiana do teto e discreta atividade antimicrobiana sobre Staphylococcus aureus, Streptococcus sp e Micrococcus sp da mastite bovina, quando comparado com outros princípios desinfetantes comumente utilizados, como o iodo. Neste trabalho, observou-se que os tetos submetidos à solução de dipping de muco apresentaram hidratação cutânea, ao contrário dos tetos tratados com iodo que apresentaram ressecamento. Atualmente, encontramos produtos disponíveis para venda à base do muco de escargots, os mesmos são utilizados em humanos com finalidades cosméticas (Figura 3) e/ou dermatológicas, prometendo alto potencial de hidratação cutânea, pelo fato do muco ser rico em alantoína, substância com propriedades umectantes e emolientes, que protegem a função de barreira da pele.

Figura 3. Creme hidratante e regenerador a base de muco de escargots.

A busca constante da manutenção de uma aparência jovem e saudável tem favorecido cada vez mais o crescimento da indústria cosmética, despertando o interesse pelo muco dos escargots Achatina sp, que pode vir a ser uma inovação tecnológica, envolvendo equipes multidisciplinares de universidades, centros de pesquisas e produtores destes moluscos para a retirada e comercialização do muco, porém existe uma carência de estudos visando a obtenção de um produto estável, seguro e eficaz, considerando que na literatura ainda há poucos estudos que comprovem a eficácia dessa substância. Faz-se necessário estudos de estabilidade, pH, aparência, odor e consistência que serão de grande importância para que sejam mantidas as características iniciais exigidas para uma formulação ser considerada de

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qualidade, eficaz e estável. Segundo Pires de Campos et al., (2003) estudos de estabilidade fornecem informações sobre a estabilidade física da formulação, ou seja, verificam se há reações de oxidação e hidrólise, para que este produto possa ser registrado na Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Assim, para a avaliação do muco, dentre as metodologias disponíveis atualmente, estão os ensaios biológicos em animais do biotério ao estábulo (pré-clínicos), para que futuramente possamos aplicá-lo em humanos (clínicos). O muco de escargots por apresentar esse efeito cicatrizante e regenerador da matriz celular, possivelmente deve estimular a síntese de colágeno e fibronectina, aumentando o espessamento da pele e consequentemente sua firmeza. Em nossos estudos nos tetos das vacas, tal efeito pode ser verificado, porém com a necessidade de novas pesquisas para confirmação da hipótese levantada. Nesse sentido, os estudos propostos são de fundamental importância, pois permitirão maior conhecimento desse produto, com potencial desenvolvimento do mesmo para aplicação terapêutica no controle e tratamento da mastite bovina, ou na cosmetologia para o lançamento desse biofármaco. 5. IMPORTâNCIA DO MUCO DE ESCARGOTS NA CICATRIZAÇÃO Segundo Gillitzer & Goebeler, 2007, a cicatrização é um processo interativo que envolve mediadores solúveis, componentes da matriz extracelular e células como queratinócitos, fibroblastos, células endoteliais, nervosos e ainda, infiltrados de diferentes subtipos de leucócitos que participam diferentemente na classificação de cada uma das três fases da cicatrização: inflamatória, proliferativa e remodelação. A cicatrização da pele inicia-se imediatamente após uma injúria e consiste em 3 fases gerais: inflamatória, que consiste em agregar e recrutar células inflamatórias; proliferativa, que envolve migração e proliferação de queratinócitos, fibroblastos, células endoteliais e formação do tecido de granulação; e remodelação, com migração de células inflamatórias, inicialmente, neutrófilos no local da lesão, sendo estes a primeira linha de defesa que realiza limpeza de partículas e bactérias. Os neutrófilos são o primeiro sinal para ativação dos fibroblastos e queratinócitos. Os macrófagos são responsáveis por debridamento através de fagocitose de microrganismos mediadores dos fatores de crescimento, como por exemplo, o fator básico de crescimento de fibroblasto (Yukami et al., 2007). Segundo Wilgus (2008) a neovascularização é um processo importante para a cicatrização devido ao suplemento de oxigênio e nutrientes para o crescimento das células mediadoras de reparo. A angiogênese é um processo de crescimento de novas células sanguíneas, é o elemento chave da fase proliferativa da cicatrização.

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No trabalho realizado por Silva (2009) foi avaliada a dinâmica da cicatrização de feridas provocadas cirurgicamente em camundongos mediante diferentes concentrações do muco e também com a adição de própolis à ração dos moluscos com a finalidade de implementar a cicatrização, pelo muco de escargots Achatina sp. Os resultados indicaram que o uso do muco na promoção da cicatrização das feridas acelerou a formação de tecido de granulação, como também aumentou a diferenciação celular em miofibroblastos com neovascularização. O decréscimo do tamanho da ferida (Quadro 1) e a cicatrização podem ser observados a partir de 3 a 5 dias despertando o interesse de seu estudo não só para os animais, mas também para o ser humano.

Quadro 1. Diâmetro da lesão, em milímetros (mm), nos diferentes grupos experimentais ao 5° dia de tratamento. Peso dos camundongos em gramas (g), no dia da cirurgia (dia 0), ao segundo dia do tratamento (dia 2) e ao quinto dia de tratamento (dia 5).

A perspectiva de utilização do muco de escargots Achatina sp no tratamento de feridas é promissora, uma vez que as bases desenvolvidas sob nossa orientação (Sírio, 2005; Lorenzi, 2008; Silva, 2009; Yokoya, 2010) têm mostrado que o muco de escargots tem capacidade de acelerar o processo de cicatrização, com reepitelização mais rápida impedindo complicações posteriores, como subsequente infecções, o que vem de encontro as pesquisas de Iguchi (1982) que descreveram o princípio antimicrobiano do mesmo. Em modelo de feridas excisionais em camundongos hairless, tratados com muco de escargots Achatina sp, por três e cinco dias subsequentes a excisão, não só reduziu o tempo de cicatrização como também, o muco foi mais eficiente em promover a reepitelização das feridas quando comparados ao controle com uso de soro fisiológico (Martins et al., 2003; Sírio, 2005; Silva,

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2009) pelos achados histológicos. O muco tem acelerado a formação de tecido de granulação através de mecanismos diretos, parece ser indutor da diferenciação em miofibroblastos e, indiretos, através de efeitos parácrinos, com a produção de alguns fatores de crescimento (Silva, 2009). Nossos trabalhos realizados até o momento, fazendo uso do muco de escargots Achatina sp na cicatrização de feridas provocadas, tem destacado um possível potencial parácrino do mesmo e necessita de mais repetições para demonstrar se o seu efeito pode promover a transdiferenciação celular capaz de promover a cicatrização cutânea .

6. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DAS LESÕES Análises histológicas foram realizadas através da observação de lâminas contendo tecidos corados por hematoxilina e eosina no período que compreende o terceiro e o quinto dia após o procedimento da injúria experimental em ratos hairless tratados com o muco de escargots (Silva, 2009). Cortes histológicos referentes ao processo de cicatrização dos animais nesse período encontram-se evidenciados na figura abaixo (Figuras 4, 5 e 6).

Figura 4. Fotomicrografia da borda da lesão do grupo tratado com muco + própolis. A coloração específica revela feixes de fibras colágenas (seta grossa) bem constituídos entre as fibrilas colágenas delgadas (seta). Coloração de Picro-sírius, aumento de 40X.

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Figura 5. Fotomicrografia da borda da lesão do grupo tratado com muco puro. A coloração específica revela na porção profunda feixes de fibras colágenas com indícios de agrupamento (seta grossa) e na porção superficial as fibrilas colágenas delgadas (seta). Coloração de Picro-sírius, aumento de 40X.

Figura 6. Fotomicrografia do grupo controle com soro fisiológico. A coloração específica revela fibrilas colágenas delgadas (seta) e escassos feixes de fibras colágenas (seta grossa). Coloração de Picro-sírius, aumento de 40X.

Em estudos realizados por Martins et al., (2003) e Sírio (2005) a pontuação atribuída a partir dos achados histológicos observados nos grupos tratados com o muco de escargots e também associado a plantas com princípios cicatrizantes bem elucidados, como é o caso do confrei e da própolis, evidenciam um maior número de vasos sanguíneos nas regiões dessas feridas pertencentes ao grupo tratado e que o confrei e a própolis acrescido à ração dos escargots promoverá um menor processo inflamatório nas lesões provocadas quando comparadas ao controle (Quadro 2).

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Quadro 2. Avaliação histopatológica dos animais submetidos a injúria cirúrgica no quinto dia de tratamento com o muco de escargots Achatina sp (MARTINS et al., 2003; SÍRIO, 2005).

A partir das análises histológicas das regiões tratadas com o muco de escargots podemos inferir que houve o surgimento do tecido de granulação. O tecido de granulação é o primeiro tecido a ser formado em regiões do epitélio lesado, apesar de ser um tecido desorganizado no qual ainda não há evidências de estruturas fundamentais da pele, é um tecido extremamente importante, principalmente por ser vascularizado. Além disso, estão presentes no tecido de granulação células imunologicamente competentes (Witte & Barbul, 1997). Investigando-se o conteúdo de neutrófilos na região da lesão no terceiro e quinto dia de tratamento com o muco de escargots Achatina sp, observamos que nesse período o número desse tipo celular na região da injúria não apresentou relevância significativa entre os tratamentos devido a grande

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variação individual entre os animais de um mesmo grupo (Martins et al., 2003). Sabe-se que neutrófilos são células de imunidade inata que apresentam grande importância na erradicação de microrganismos, porém o pico de atividade desse tipo celular ocorre em períodos muito iniciais. Este tipo celular poderia estar relacionado a uma diminuição do conteúdo microbiológico das lesões, o que poderia reforçar a capacidade antimicrobiana do muco de escargots, porém não podemos fazer essa correlação do aumento ou diminuição da infecção nos ensaios de cicatrização, pois não foram observadas diferenças entre a colonização microbiológica dos animais ensaiados (Martins et al., 2003). As análises histológicas do período não demonstram grandes diferenças entre os achados histopatológicos de animais tratados com muco + confrei, muco + própolis e muco puro, sendo que foi observado tecido de granulação, presença de vasos sanguíneos, em todos os grupos tratados. Dessa forma, a utilização do muco de escargots, seja na sua forma pura ou acrescida de plantas com princípio cicatrizante definido, foi efetiva quando comparada ao controle, promovendo a aceleração do processo cicatricial (Sírio, 2005). Outra propriedade a ser investigada no muco refere-se à possível propriedade imunorreguladora in vitro, no qual possivelmente esse muco estimula a função imunológica de várias populações celulares do sistema imune, tais como células T e expressão de alguns marcadores de superfície celular CD45, CD34, CD19 entre outros acelerando processo de cicatrização, impedindo complicações posteriores como subsequentes infecções pela sua capacidade antimicrobiana, hipóteses a serem confirmadas em nossas pesquisas. Os mecanismos envolvidos nesse processo ainda não foram elucidados durante a nossa pesquisa, consequentemente em um segundo momento serão estudados esses mecanismos, inclusive em colaboração com a Faculdade de Farmácia da USP de Ribeirão Preto, evidenciando que maiores investigações mostram-se necessárias a fim de confirmar nossas hipóteses de que o muco de escargots tem potencial angiogênico e regenerativo promovendo uma maior rapidez na cicatrização. O efeito da atividade citotóxica exercida pelo muco dos escargots Achatina sp foi estudado por Silva (2009) com a finalidade de verificar se o mesmo danificava ou matava as células ou até mesmo se perturbava os mecanismos fundamentais da proliferação celular, o que não ocorreu nos testes realizados. Na prática, o efeito citotóxico é utilizado para indicar os fármacos que inibem a divisão celular e são potencialmente úteis no tratamento do câncer, o que vem de encontro às pesquisas realizadas por Ghosh (2002).

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7. ATIVIDADE ANTITUMORAL DO MUCO DE ESCARGOTS ACHATINA SP De acordo com os estudos Ghosh et al., (2002) a angiogênese, crescimento de novos vasos sanguíneos a partir de uma vascularização pré-existente, é esperado para ser um alvo promissor para o tratamento de várias doenças, incluindo inflamação crônica, como a artrite reumatóide, aterosclerose, retinopatia diabética, psoríase e inflamação crônica das vias aéreas, além de sólido crescimento tumoral. No câncer, este processo contribui para o crescimento progressivo de metástases de tumores sólidos. A Angiogênese tumoral é regulada pela produção de estimuladores angiogênicos incluindo membros do fator de crescimento fibroblástico (FGF) e famílias do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Os medicamentos que interferem com a angiogênese, por travar a ação das proteínas angiogênicas, poderia reduzir o tamanho dos tumores e mantê-los em um estado dormente, assim como os inibidores angiogênicos tais como angiostatina e endostatina que podem modular esse processo, tanto no sítio primário quanto nos sítios de metástases (Ghosh, 2002). O potencial uso destes e de outros inibidores da angiogênese naturais e sintéticas está atualmente a ser estudado intensamente por muitos laboratórios (Lee et al., 2003). A angiogênese, em um estado inflamatório crônico, facilita a migração de células inflamatórias para o sítio inflamatório e fornece nutriente e oxigênio para o tecido de granulação. De fato, a indução e manutenção dessas doenças são largamente dependentes da angiogênese e no tratamento destas doenças existe a necessidades do desenvolvimento de novos agentes terapêuticos devido a atual falta de agentes terapêuticos satisfatórios (Dam et al., 2004). Os glicosaminoglicanos são um dos membros da sua família linear aniônico polissacáridos que são tipicamente proteoglicanos, isolados como uma proteína ligada ao núcleo. As funções biológicas dos proteoglicanos, incluindo a regulação do crescimento celular e são expressos pela interação das cadeias de glicosaminoglicanos, com proteínas proteoglicanas como fatores de crescimento e seus receptores. O acharan sulfato é um glicosaminoglicano que foi isolado e purificado a partir do caramujo gigante africano Achatina fulica (Kim et al., 2007). O acharan sulfato é constituído principalmente por repetição de um dissacarídeo cuja estrutura α-DN-acetylglucosaminyl (1 → 4) 2-sulfoiduronic ácido (Figura 7). O acharan sulfato é armazenado no interior do grânulo corpo do caramujo e é secretado para a superfície exterior mediante estimulação (Kim et al., 2007).

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Figura 7. Estrutura do acharan sulfato (n=240).

A média de peso molecular de acharan sulfato é conhecido como 114 kilodaltons baseados em gel de filtração cromatografia. O acharan sulfato tem uma vasta gama de atividades biológicas incluindo a atividade antitumoral, que foi relatado anteriormente por inibir o crescimento de tumores. A atividade antitumoral de acharan sulfato pode estar relacionada com a inibição da angiogênese porque este composto inibe o fator de crescimento fibroblástico básico e a angiogênese vascular fator de crescimento endotelial (VEGF)-induzido vascular tubo formação in vivo (Ghosh et al., 2002; Lee et al., 2003; Kim, 2007). Acredita-se também que a atividade antitumoral do acharan sulfato também pode ser devido à ativação de mecanismos de defesa do hospedeiro que aumentar a atividade fagocítica in vivo (Kim et al., 2007). No estudo de Lee et al., (2003) foram realizados experimentos para avaliar a atividade antiangiogênica do acharan sulfato. Demonstrou-se que o mesmo inibiu a formação de novos vasos sanguíneos, in vivo de matrigel e na membrana teste chorioallantoica. Além disso, observou-se uma substancial atividade antitumoral contra o sarcoma 180-induzido em tumores primários e do pulmão. Sendo assim, acreditamos que o acharan sulfato pode agir como um inibidor da angiogênese e como um agente antitumoral. Mais estudos são necessários para elucidar estes mecanismos, atentando para mais uma possível utilização do muco de escargots Achatina sp, reafirmando suas possibilidades de ser utilizado como um emergente biofármaco.

8. UTILIZAÇÃO DO MUCO DE ESCARGOTS ACHATINA SP NOS PROCESSOS DE MASTITE BOVINA A bovinocultura leiteira é um campo emergente de pesquisa com o muco de escargots Achatina sp, sua utilização nos processos de mastites bovinas abrem perspectivas terapêuticas para seu emprego nesta área. Trabalhos como a dissertação de mestrado de Eugênio Yokoya, financiado pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo –

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FAPESP e finalizado em maio de 2010, intitulado: “Controle de Infecções intramamárias no Gado Leiteiro Usando as Propriedades Antibacterianas e Cicatrizantes do Muco de Escargots Achatina sp no Pré e Pós Dipping”, demonstra que no estado de São Paulo, cuja produção leiteira gira em torno de 28.000 litros/mês/ propriedade, tem- se uma perda de aproximadamente 4.800 litros/mês/ propriedade, em função da mastite bovina. Com a utilização do muco de escargots como agente desinfetante, o mesmo mostrou ser tão eficiente quanto o iodo, no controle desta afecção no pré e pós dipping (Figura 8), com a vantagem de que o muco dos escargots Achatina sp, interfere no processo de regeneração epitelial hidratando a pele dos tetos das vacas evitando a presença de fissuras que representam porta de entrada a infecções.

Figura 8. Aplicação do muco de escargots Achatina sp como antisséptico no pré e pós dipping de vacas leiteiras.

O muco destes moluscos apresenta uma glicoproteína antibacteriana, achacin, e de acordo com Fuchino et al., (1992) a ação dessa glicoproteína assemelha-se aquela de antimicrobianos pertencentes ao grupo dos beta-lactâmicos que inibem a síntese de peptideoglicanos na superfície celular, assim como ocorre na utilização das penicilinas.Apesar das propriedades que vem sendo atribuídas ao muco de escargots como cicatrizante, antimicrobiana, antitumoral e também como cosmético, ainda existem poucos relatos na literatura envolvendo estudos que comprovam os reais benefícios destes em animais ou humanos.

9. CONSIDERAÇÕES FINAIS Apesar dos modestos resultados encontrados em nosso laboratório, acreditamos na utilização do muco de escargots tanto para os animais, pois

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os nossos testes pré clínicos realizados até o momento apontam direções importantes e possível emprego em humanos (testes clínicos). Essa é uma linha de pesquisa que abraçamos e que hoje compartilhamos com parceiros nas faculdades de Odontologia e Farmácia da USP de Ribeirão Preto que possibilita a abertura para estudos de alunos de iniciação científica, mestrado, doutorado e pós doutorado. Somos imensamente gratos à FAPESP e aos seus auditores que ao apontar indagações suscitam ao nosso grupo à busca por respostas e caminho no avanço de pesquisas que começaram no biotério e que atualmente caminham para o estábulo, com uma nova mestranda que se propõe a estudar o efeito antimicrobiano desse muco nos processos de mastite bovina, o que sem dúvida poderá contribuir para com a produção leiteira que hoje tem na mastite um grande desafio quanto a sua profilaxia e tratamento.

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CAPÍTULO IV

FINGERPRINTING POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES CAUSADORES DA MASTITE

BOVINA

Juliana Regina Barreiro¹, Daniele Cristine Beuron¹, Julianne de Rezende Naves¹, Juliano Leonel Gonçalves¹, Cristina Simões Cortinhas¹, Elmeson

Ferreira de Jesus¹,Christina Ramires Ferreira², Marcos Veiga dos Santos¹

¹Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – VNP/USP – A. Duque de Caxias Norte, 225, 13635-900 – Pirassununga, SP, mveiga@usp.br.²Laboratório ThoMSon de Espectrometria de Massas, Instituto de Química, Universidade de Campinas - UNICAMP Campinas, 13083-970, São Paulo,

RESUMO A mastite é uma das principais doenças de vacas leiteiras em todo o mundo. O diagnóstico de rotina pode ser feito por meio de cultura microbiológica, cujo procedimento é demorado. A espectrometria de massas, utilizando matriz assistida por dessorção e ionização por tempo-de-vôo (MALDI-TOF MS) vem sendo usada para identificar e caracterizar microrganismos de forma rápida, utilizando protocolo de extração de amostra de fácil execução. Esta técnica permite a identificação de bactérias com alta confiabilidade e velocidade a partir de extrato bruto bacteriano ou bactérias lisadas. Com o uso de MALDI-TOF MS, 33 isolados bacterianos do leite obtidos de diferentes vacas leiteiras foram analisadas e os resultados foram comparados com aqueles obtidos pelo método microbiológico.A metodologia de MALDI-TOF MS apresentou confiabilidade para a identificação bacteriana de bactérias isoladas em 24 h de cultivo em casos de mastite subclínica, possibilitando emprego imediato de medidas de controle da mastite e controle da qualidade do leite na indústria de laticínios.

INTRODUÇÃO A mastite (do grego mastos) bovina é uma doença de grande importância econômica. A maioria das mastites não apresenta sinais físicos de processo inflamatório agudo, sendo crônicas ou incipientes, no entanto, causam elevados prejuízos econômicos e servem de fonte de infecção. A resposta inflamatória ocorre em resposta à invasão bacteriana, fúngica, ou infecções por algas da glândula mamária (Radostits et al., 2002).

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O leite é uma mistura complexa, nutritiva e estável de gordura, proteínas e outros componentes, os quais se encontram suspensos ou solubilizados em água (Gianola et al., 2004). Segundo Dingwell et al., (2004), a qualidade do leite está diretamente relacionada à diversos fatores, como saúde, alimentação e manejo dos animais, com a qualidade da mão-de-obra, manejo adequado dos equipamentos e utensílios utilizados durante a ordenha e transporte até a indústria. Todos esses fatores influenciam a composição e as características sensoriais, certificando ou não a qualidade do produto. O diagnóstico da mastite clínica pode ser feito por meio da sintomatologia, como inflamação do úbere, secreção láctea com grumos, sangue, pus, entre outras alterações visuais. Entretanto, para diagnosticar a mastite subclínica é necessária a utilização de exames complementares baseados no conteúdo celular ou alterações da composição do leite. Além disso, existe a necessidade da cultura microbiológica e isolamento dos agentes etiológicos envolvidos, visando o uso de métodos de tratamento e estratégias de controle e profilaxia adequados (Dias, 2007). Segundo Radostits et al., (2002), o diagnóstico clínico de mastite é simples, visto que qualquer vaca com úbere inflamado, difuso ou focalmente, ou dolorido em um ou mais quartos, mas secretando leite com sangue, pus, grumos apresenta mastite. Entretanto, mastites subclínicas crônicas, que podem reduzir a capacidade funcional da glândula mamária, causando prejuízos econômicos, não são diagnosticadas pelos métodos rotineiros de exame clínico: inspeção do animal, leite e palpação. A técnica de espectrometria de massas com fonte de ionização do tipo dessorção e ionização por matriz assistida à laser – MALDI (do inglês matrix assisted laser desorption/ionization) tem sido utilizada de modo crescente em microbiologia clínica humana para a identificação de microrganismos devido à sua capacidade de analisar moléculas de massas elevadas, misturas complexas de biomoléculas, e ainda por apresentar alta sensibilidade mesmo em reduzida quantidade de amostra (Siuzdak, 2006). Essa técnica possui um tipo de ionização branda, que permite a dessorção de peptídeos e proteínas a partir de cultivos bacterianos ou extratos bacterianos (Ruelle et al., 2004). Os íons são separados e detectados de acordo com a massa molecular e número de cargas. Cada pico de massa corresponde a um fragmento molecular desprendido da superfície celular durante a dessorção à laser (Holland et al., 2006; Siuzdak, 2006). A técnica de MALDI-MS possui alta sensibilidade a mudanças mínimas de composição química; de forma que a reprodutibilidade de espectros é um fator crítico na comparação de espectros bacterianos (Zhang et al., 2004). Com a utilização desse método, pode-se identificar bactérias pela comparação do espectro de massas (obtido em poucos segundos), com espectros referência

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de cepas por meio de análise estatística multivariada. Desta forma, tem-se um diagnóstico para o patógeno da mastite com mais rapidez do que os métodos convencionais.

MASTITE: CONCEITOS, MÉTODOS DIAGNÓSTICOS E PRINCIPAIS AGENTES Mais de 80 diferentes espécies de microrganismos foram identificadas como agentes causadores de mastite bovina, sendo que as espécies mais frequentemente isoladas são Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium sp, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis e Escherichia coli (Holtenius, 2004). Santos et al., (2004) relatou que a colonização da glândula mamária bovina por bactérias patogênicas resulta em eventos que conduzem a alterações na composição do leite, seguida pelo aumento marcante no número de células somáticas. Santos & Fonseca (2007) afirmam que a mastite inicia-se quando os microrganismos invadem a glândula mamária atravessando o canal do teto e multiplicam-se no interior dos tecidos. A invasão microbiana pode ocorrer por diversas formas, como a colonização da pele e do canal do teto entre as ordenhas, flutuações de vácuo durante a ordenha que introduzem os microrganismos para dentro do teto e introdução de cânulas contaminadas no momento do tratamento intramamário. Após a invasão, ocorre intensa migração de leucócitos do sangue para o leite, com o objetivo de eliminar o agente patogênico, além de alterações da permeabilidade vascular e outros sinais de inflamação. Os autores também citam quatro fatores principais que envolvem a ocorrência da mastite, como a resistência da vaca, o agente patogênico, o ambiente e o estágio de lactação. Um programa de controle da mastite tem como objetivos eliminar infecções existentes, monitorar a saúde da glândula mamária e minimizar a incidência de novas infecções (Dohoo & Leslie, 1991; Santos & Fonseca, 2007). Detectar a infecção intramamária é de grande importância para manter o padrão de qualidade do leite e a saúde do rebanho. Os principais métodos de diagnóstico da mastite são: condutividade elétrica (EC), contagem de células somáticas (CCS), Califórnia Mastitis Test (CMT), teste da caneca, Wisconsin Mastitis Test (WMT) e cultura microbiológica (Santos & Fonseca, 2007; Kamphuis et al., 2008). Medidas de controle da mastite incluem o uso do pré-dipping e pós-dipping (imersão dos tetos em solução desinfetante), terapia de vaca seca com antibiótico de longa duração, segregação e descarte de animais com mastite crônica e controle ambiental. O pós-dipping previne novas infecções intramamárias causadas por patógenos contagiosos, já a terapia de vaca seca visa eliminação de casos de mastite subclínica e prevenção de novos casos

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durante o período seco. Medidas como a redução da exposição do animal ao agente, o aumento da resistência da vaca (por meio da dieta, vacinação e prevenção ao estresse) diminuem a incidência de mastite causada por patógenos ambientais (Sargeant et al., 2001). A mastite pode resultar na substituição de células epiteliais secretoras por tecido conjuntivo, ocasionando queda na produção de leite. Durante a infecção ocorre migração de células somáticas para o interior dos alvéolos, sendo que durante este processo pode ocorrer destruição de células epiteliais (Sommerhauser et al., 2003). O aumento da CCS é dos principais métodos de diagnóstico indireto da mastite subclínica, já que é um bom indicador da probabilidade de ocorrência de uma infecção intramamária. Quanto maior a CCS maior é a probabilidade de que a vaca esteja infectada. O leite de um quarto não infectado apresenta CCS < 100.000 cel/ml, enquanto a CCS de um quarto infectado é geralmente > 200.000 cel/ml, indicando a ocorrência de mastite subclínica ou que o quarto está se recuperando da infecção. O CMT é um dos testes mais conhecidos e práticos para o diagnóstico da mastite subclínica. Seu princípio baseia-se na estimativa da contagem de células somáticas no leite. O resultado do teste é avaliado em função do grau de gelatinização ou viscosidade da mistura de partes iguais de leite e reagente, sendo o teste realizado em bandeja apropriada e ao pé da vaca. Os resultados são expressos em cinco escores: negativo, traços, um, dois e três cruzes, os quais apresentam boa correlação com a CCS (Esslemont & Kossaibati, 2002; Santos & Fonseca, 2007). Segundo Berglund et al., (2007) a infecção intramamária é a principal causa do aumento da CCS. Prestes et al., (2002) mencionaram que microrganismos contagiosos (Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp. coagulase negativa, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae e Corynebacterium bovis) levam ao aumento da CCS, por outro lado, os microrganismos ambientais (Escherichia coli, Klebsiella sp., Enterobacter sp., Streptococcus uberis e Pseudomonas aeruginosa) podem ou não alterar os valores da CCS devido às diferenças das respostas imunológicas e do agente etiológico evolvido na infecção intramamária. A cultura bacteriológica do leite é considerado um teste qualitativo e para que um resultado seja positivo é preciso o isolamento de pelo menos um microrganismo viável, no entanto, qualquer contaminação externa pode gerar resultado falso-positivo ou erros na preparação das amostras e dos meios de cultura podem gerar resultados falso-negativos. Por ser considerado um teste caro e demorado como exame de rotina na fazenda; outros testes de diagnóstico da mastite devem ser empregados (Urech et al., 1999). O diagnóstico microbiológico e a identificação dos agentes infecciosos de amostras do leite de tanque é um método auxiliar no monitoramento das

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mastites contagiosas, entretanto, apresenta algumas limitações como o tempo necessário para o diagnóstico, a identificação dos agentes e os procedimentos de conservação e transporte das amostras. O diagnóstico molecular, baseado na técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR), possibilita a identificação do agente sem a necessidade do mesmo estar viável na amostra (Santos, 2006). A infecção por S. aureus apresenta geralmente caráter subclínico e resposta imune branda, condição que contribui para sua habilidade de estabelecer infecções intramamárias crônicas (Bannerman et al., 2004). Além disso, o S. aureus possui grande capacidade de invasão, instalando-se em partes profundas da glândula mamária. A taxa de cura desse tipo de infecção durante a lactação tende a ser bastante reduzida. Tratamentos de maior duração foram associados a maiores chances de cura, porém é necessário avaliar o custo-benefício de tal tratamento. Visando maximizar a cura o tratamento durante a lactação deve ser realizado em animais jovens com infecção recente tendo apenas um quarto do úbere comprometido (Hensen et al., 2000). Os Staphylococcus coagulase negativa vivem na pele do teto e podem infectar a glândula mamária. As infecções causadas por este patógeno resultam em elevação moderada da CCS. Casos clínicos são comumente observados (Costa et al., 1995) e tanto a taxa de cura espontânea quanto a resposta ao tratamento antibiótico ocorrem frequentemente. Vacas adultas e novilhas apresentam alta prevalência de mastite causada por esse tipo de agente após o parto, com rápido declínio dos casos após a segunda semana de lactação (Santos & Fonseca, 2007). A principal fonte de eliminação dos Streptococcus agalactiae e Staphylococcus aureus, dentro do rebanho, é a própria glândula mamária infectada. Porém, os microrganismos ambientais, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae e coliformes; quando isolados de amostras de leite, do tanque especialmente, podem ser oriundos de outras fontes externas e não específicas do leite (Brito et al., 1998). A infecção por S. agalactiae frequentemente se apresenta na forma subclínica com acentuado aumento da contagem de células somáticas. Entretanto, a infecção causada por essa bactéria apresenta boa resposta ao tratamento antibiótico intramamário durante a lactação. Vacas infectadas por S. agalactiae apresentaram maior taxa de cura durante a lactação, quando comparadas com outros tipos de patógeno (Wilson et al., 1999). Vacas com mastite por esse patógeno tornam-se reservatórios da bactéria no rebanho e a ordenha é considerada o momento de maior transmissão da bactéria. Essa espécie bacteriana reside somente no úbere de vacas infectadas e elimina elevado número de bactérias no leite, podendo influenciar a contagem bacteriana total (CBT) do leite do tanque. Devido ao limitado habitat do S. agalactiae e a maior taxa de cura seguida de tratamento, algumas fazendas

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optam por erradicar o patógeno do rebanho. O programa de controle de S. agalactiae é baseado em cultura microbiológica e tratamento antibiótico de todos os quartos do úbere infectados pelo patógeno. Vacas não responsivas a segunda fase de tratamento devem ser separadas do rebanho ou descartadas (Santos & Fonseca, 2007). Infecções causadas por Streptococcus ambientais têm natureza variada devido a distintas características de dois constituintes desse grupo, S. uberis e S. dysgalactiae. Diferentes linhagens de S. uberis apresentam não somente padrão epidemiológico ambiental como também padrão contagioso. O S. dysgalactiae também mostra padrões alternados e o aumento de sua prevalência nos rebanhos leva à necessidade de mais trabalhos sobre essa espécie bacteriana (Santos & Fonseca, 2007). Na rotina de isolamento microbiológico, os Enterococcus spp. são muitas vezes classificados como parte do grupo dos Streptococcus ambientais (ou não agalactiae). As bactérias do gênero Enterococcus spp. são mais resistentes aos antimicrobianos e sobrevivem em ambientes pouco favoráveis, o que pode afetar a prevalência e a taxa de cura dos estreptococos (Santos et al., 2007). Casos de mastite causada por bactérias Gram negativas envolvem principalmente Escherichia coli e Klebsiella spp. Os casos clínicos desse grupo de bactérias, em geral, apresentam-se de forma aguda. A destruição da bactéria pelo sistema imune causa a exposição de fatores estimulantes da inflamação que desencadeiam os típicos sinais clínicos da infecção (Bannerman et al., 2004). A quantidade de estímulo ao sistema imune determina a severidade da infecção, e em cerca de 40% dos casos severos o animal pode apresentar bacteremia (Wenz et al., 2001). Outra bactéria causadora da mastite frequentemente isolado de casos clínicos é Corynebacterium sp. (Costa et al., 1995). O canal do teto parece ser um dos principais locais de ocorrência desse agente, ainda que a infecção possa se localizar na cisterna da glândula. Com relação à patogenicidade, o Corynebacterium spp. é considerado um patógeno de significância limitada, apresentando-se na forma decasos subclínicos e leves, mas é altamente contagioso, fato que aumenta sua frequência de isolamento nas mastites. O Arcanobacterium pyogenes é conhecido por causar mastites severas com extensa destruição do tecido mamário. Esse microrganismo é encontrado nas membranas mucosas dos animais, mas age como patógeno oportunista causando infecções piogênicas. Nas mastites, o Arcanobacterium pyogenes apresenta baixa resposta ao tratamento de antibióticos (Santos & Fonseca, 2007).

ESPECTROMETRIA DE MASSAS A espectrometria de massas (MS) é uma técnica analítica que permite a

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identificação da composição química de um determinado composto isolado, ou de diferentes compostos em misturas complexas, por meio da determinação de suas massas moleculares na forma iônica, (ou seja, com carga elétrica líquida, positiva ou negativa), baseada na sua movimentação através de um campo elétrico ou magnético. Esta movimentação é determinada pela razão entre a massa de um determinado composto (analito) e sua carga líquida, designada por m/z (mass-to-charge ratio). Assim, conhecendo o valor de m/z de uma molécula é possível inferir sobre a composição química elementar, e com isso determinar sua estrutura. A espectrometria de massas pode ser utilizada em análises quantitativas, mas é em análises qualitativas que ela tem se destacado, como na identificação de compostos em misturas e, principalmente, na caracterização estrutural de compostos desconhecidos, que pode ser alcançado através da formação de íons-molécula e de seus respectivos íons-fragmentos (Souza, 2008). Devido a sua elevada sensibilidade, exatidão e resolução proporcionadas por essa técnica na identificação das massas das proteínas, ela pode ser considerada a principal ferramenta analítica no campo da proteômica. Métodos tradicionais exigem grande número de amostras biológicas e diversas etapas de purificação de proteínas são exigidas para sua análise. O uso da MS proporcionou o desenvolvimento de métodos rápidos e eficientes de separação (Fernandez-Lima et al., 2005). Um espectrômetro de massas é composto por três módulos principais: fonte de íons, analisadores de massas e os detectores (Figura 1). Fontes de íons é parte do espectrômetro responsável pelo processo de ionização das moléculas, ou seja, transformação de moléculas neutras em íons; os analisadores de massas são parte do espectrômetro responsável pela separação dos íons de acordo com seu m/z, realizado através de aplicações de campos elétricos e magnéticos; e os detectores representando a parte final de um espectrômetro de massas, responsável pela detecção e amplificação dos íons.

Figura 1: Representação esquemática de um espectrômetro de massas.

A ionização é o processo físico/químico de conversão de um átomo ou molécula em um íon, adicionando ou removendo partículas carregadas, como elétrons ou outros íons. Este processo funciona de maneira diferente dependendo se um íon positivo ou negativo está sendo produzido. Um íon de carga positiva é produzido quando um elétron ligado a um átomo (ou

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molécula) absorve energia suficiente para escapar da barreira elétrica que o limitava, desfazendo assim o vínculo com o núcleo, sendo expelido para fora da eletrosfera. A quantidade de energia necessária é chamada de potencial de ionização. Um íon negativamente carregado é produzido quando um elétron livre choca com um átomo e é então capturado, ficando no interior da barreira do potencial elétrico. Em alguns casos, um próton pode ser adicionado ou subtraído da molécula, rendendo os íons [M+H]+ ou [M-H]-, respectivamente. Em outros casos, os íons são formados através da interação com adutores, como metais alcalinos (por exemplo, Li+, Na+, K+), formando íons positivos, ou então com anions como Cl-, rendendo íons com cargas negativas (Dass, 2007; Hoffmann & Stroobant, 2007). Tendo em vista que os processos de ionização são fundamentais para a espectrometria de massas, diversas fontes de ionização foram desenvolvidas ao longo da sua história, como Ionização Eletrônica (EI), Ionização Química (CI), Ionização por Bombardeamento Rápido de Átomos (FAB), Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz (MALDI), Ionização por Spray de Elétrons (ESI), Ionização Química a Pressão Atmosférica (APCI), Ionização por Dessorção de Spray de Elétrons (DESI), entre outras técnicas de ionização. Segundo Watson & Sparkman (2007) a fonte de ionização é a parte do espectrômetro de massas que produz os íons a partir dos analitos, e realiza sua transferência para a fase gasosa (nos casos onde a ionização não precisa ocorrer direto em amostra voláteis). Estes íons são então levados para dentro do espectrômetro, sob um ambiente de vácuo, e então conduzidos até o detector. A base da espectrometria de massas é a separação destes íons por suas diferenças de m/z. Para atender esta necessidade, foram desenvolvidas diferentes formas para controlar a trajetória desses íons através do espectrômetro, as quais são realizadas por campos elétricos e magnéticos, chamados de analisadores de massas (na realidade são analisadores de íons, ou m/z), e são quase tão diversificados quanto às fontes de íons. Sendo os mais conhecidos os analisadores Quadrupolares (Q – Quadrupole), Armadinha de Íons (IT – Íon Trap, ou QIT – Quadrupole Íon Trap), Tempo-de-Vôo (TOF – Time-of-Flight), Analizadores com Transformada de Fourier (FT – Fourier Transform), Analisadores de Mobilidade de Íons (IM – Íon Mobility), etc. Os detectores compreendem a porção final dos espectrômetros de massas, sua função é detectar os íons que chegam até eles e amplificar o sinal. Os detectores funcionam pela conversão dos feixes de íons em sinais elétricos, que podem ser armazenados e traduzidos em imagens, entre eles se destacam os detectores Faraday crup, Multiplicadores de Elétrons (EM – Electron Multiplier), Multiplicadores de Fótons, entre outros (Watson & Sparkman, 2007). A técnica de MS com fonte de ionização do tipo MALDI tem sido

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amplamente utilizada para a caracterização de microrganismos devido à sua capacidade de analisar moléculas de massas elevadas, misturas complexas de biomoléculas, e ainda por apresentar alta sensibilidade mesmo em reduzida quantidade de amostra (Siuzdak, 2006). Essa técnica possui um tipo de ionização branda, que permite a dessorção de peptídeos e proteínas a partir de cultivos bacterianos ou extratos bacterianos (Ruelle et al., 2004). Os íons são separados e detectados de acordo com sua massa molecular e número de cargas. Cada pico de massa corresponde a um fragmento molecular desprendido da superfície celular durante a dessorção à laser (Holland et al., 2006; Siuzdak, 2006). Utilizando esse método, pode-se identificar bactérias por meio da comparação do espectro de massas (obtido em poucos segundos) com espectros referência de cepas por meio de análise estatística multivariada.Na ionização por MALDI, a amostra deve ser misturada a uma matriz específica que auxiliará na sua ionização. A amostra é misturada a uma determinada matriz que quando seca, cristaliza-se juntamente com o analito. A transferência de energia por MALDI ocorre por meio da irradiação pulsada de laser, a matriz energizada converte a energia do laser em energia para a excitação do analito, promovendo sua ionização (Figura 2). Esta forma de transferência de energia é eficiente na obtenção de moléculas intactas, já que elas não sofrem incidência direta da excessiva energia do laser, o que poderia causar sua decomposição. Este processo ocorre em uma câmara sob vácuo e os íons então formados na fase gasosa são acelerados por campos eletrostáticos em direção ao analisador (Ardrey, 2003; Hoffmann & Stroobant, 2007; Dass, 2007). Existe uma grande variedade de matrizes que podem ser utilizadas em MALDI, constituídas principalmente de compostos aromáticos. As fontes de laser também podem variar, no entanto a mais comum é a de N2, com comprimento de onda de 337 nm. Os íons formados apresentam-se de modo geral protonados monocarregados em modo positivo, desprotonados em negativo. Contudo, é comum de serem formados íons com duas ou mais cargas, ou com adutores como Na+ ou K+ (Hoffmann & Stroobant, 2007; Dass, 2007).

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Figura 2 – Ionização por fonte de MALDI.Fonte: Adaptado de http://www.chm.bris.ac.uk/ms/images/maldi-mechanism.gif

Analisadores de tempo-de-vôo são baseados no princípio de que os íons com a mesma carga têm energias cinéticas iguais, e velocidade inversamente proporcional à raiz quadrada da sua massa. Então se dois íons com mesma carga, mas com massas diferentes, são acelerados através de um campo elétrico com potencial constante, suas velocidades serão dependentes de suas massas, e eles atingirão o detector com “tempos de vôo” diferentes. Assim, o íon de menor valor de m/z (menor massa neste caso) atingirá o detector primeiro, enquanto que o de maior massa levará mais tempo para chegar ao detector (Hoffmann & Stroobant, 2007; Dass, 2007). O potencial de aplicação da MS para estudos biológicos tem sido bastante estendido devido aos avanços observados nos últimos anos em aplicações nas áreas de genômica, transcriptoma, metabolômica, proteômica, lipidoma e outras plataformas “omics”, e ao desenvolvimento extraordinário dos equipamentos (Hoffmann et al., 2007; Feng et al., 2008). A MS é atualmente a técnica de escolha para identificação de proteínas e para o estudo de modificações protéicas pós-traducionais em diferentes condições fisiológicas. Além disso, a MS vem sendo utilizada no monitoramento e caracterização de diversos processos industriais como, por exemplo, em processos fermentativos (Royce, 1993) e até mesmo na análise de microorganismos intactos (Claydon et al., 1996; Fenselau & Demirev, 2001). A discriminação e caracterização de micobactérias foi relatada por MALDI-TOF MS (Hettick et al., 2006). A técnica foi usada também para

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quimiotaxonomia bacteriana (Claydon et al., 1996; Smole et al., 2002; Ruelle et al., 2004). A espectrometria de massas também é utilizada na determinação de razões isotópicas. Por exemplo, a análise de uma amostra de NaCl. Em solução os íons Na+ e Cl- estarão dissociados, e quando analisados em modo de detecção de íons positivos, será obtido apenas um íon de m/z 23 referente ao Na+. Entretanto, quando analisamos esta mesma solução em modo de detecção de íons negativos veremos o aparecimento de dois íons, um de m/z 35 sendo este o íon base (aquele aparece representando 100%) e outro de m/z 37, que deverá representar cerca de 1/3 do íon base. Estes resultados devem-se à relação isotópica apresentada pelos íons analisados (Souza, 2008).

ESPECTROMETRIA DE MASSAS APLICADA à MICROBIOLOGIA Métodos tradicionais microbiológicos com base na morfologia e as características bioquímicas são demorados, propenso a erros e laboriosos. Portanto, é necessário o desenvolvimento de novos métodos rápidos e eficazes para identificação das espécies bacterianas. A espectrometria de massa é uma poderosa ferramenta de rotina em estudos biológicos e apresenta-se como alternativa aos métodos tradicionais, em especial para identificação bacteriana e de diferenciação. Ilina et al., (2009) utilizaram a espectrometria de massas para identificação de espécies de Neisseria, confirmando a utilizada da técnica. Vários métodos manuais e automatizados baseados nas características fenotípicas têm sido desenvolvidos para a identificação de estafilococos. No entanto, estes sistemas têm suas limitações, principalmente em razão de diferenças fenotípicas entre estirpes da mesma espécie. Ao longo dos últimos 10 anos, muitos métodos genotípicos com base na análise de determinados alvos de DNA foram concebidos para a identificação em nível de espécie mais comum de Staphylococcus Coagulase Negativa em isolados. Dubois et al., (2010) utilizaram a matriz assistida por dessorção e ionização por tempo de vôo (MALDI-TOF MS), usando “impressões digitais”, para a identificação de 152 cepas de Staphylococcus de origem clínica e ambiental, também avaliaram a capacidade do sistema Biotyper MALDI (Bruker Daltonique, Wissembourg, França), concluindo que este método é uma excelente alternativa aos métodos tradicionais e pode ser utilizado para a análise das relações clonais e/ou taxonômica. Carbonelle et al., (2007) descreveram a aplicação do MALDI-TOF-MS para a identificação de Staphylococcus coagulase-negativa que acometem humanos. Vinte e três cepas de referência de espécies clinicamente relevantes ou subespécie foram selecionadas, para cada cepa de referência, o perfil de MALDI-TOF-MS foi analisado e comparado com o perfil de 196 cepas testadas. Em todos os casos o conjunto de picos de referência pertencentes

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amesma espécie que o da estirpe testada, demonstrando assim que os 23 conjuntos de picos selecionados podem ser utilizados como um banco de dados para a identificação rápida de espécies de Stafphylococcus coagulase-negativo. Resultados semelhantes foram obtidos por meio de quatro diferentes condições de crescimento. Nove cepas de bactérias anaeróbias foram caracterizadas por MALDI-TOF e aplicou-se o método para identificação com sucesso dessas bactérias em amostra de 75 pacientes que apresentaram infecção periodontal. Os autores sugeriram que a técnica de MALDI-TOF MS possa se tornar um método útil para a identificação de bactérias anaeróbicas, especialmente aquelas que não podem ser prontamente identificadas por análise bioquímica. Essa técnica pode se tornar um sistema atrativo até mesmo para a identificação de rotina de amostras clínicas (Stingu et al., 2008). Strephtococcus viridans (VS) são responsáveis por várias doenças sistêmicas, como endocardite, abscessos e septicemia. Porém, a identificação das espécies pelos métodos convencionais, parece ser mais difícil do que identificação de espécies de outros grupos de bactérias. Friedrichs et al., (2007) avaliou o uso de MALDI-TOF para a rápida identificação de 10 espécies diferentes de VS. Um total de 99 isolados clínicos, 10 cepas de referência e 20 estirpes foram analisados. Para avaliar a espectrometria de massa todas as cepas foram identificadas em paralelo por métodos fenotípicos e genotípicos. A comparação dos resultados de identificação das espécies obtidas pelas análises MALDI-TOF MS com os sistemas de identificação fenotípica/genotípica mostrou 100% de consistência em nível de espécie. Ilina et al., (2010) usaram a técnica de MALDI-TOF MS para identificação de bactérias Helicobacter pylori, sendo 17 espécies clínicas e 2 laboratoriais. Apesar da heterogeneidade protéica evidente de H. Pylori, espectros de massas coletadas sob várias formas de cultivos foram altamente reprodutíveis. Além disso, todas as amostras clínicas foram identificado como espécie H. pylori por meio de análise comparativa. Teramoto et al., (2007) através da espectrometria de massas utilizando o MALDI obtiveram resultados conviáveis na identificação da Pseudomonas putida, afirmando que a classificação pelo método proposto foi semelhante aos resultados do seqüênciamento de DNA . Barreiro et al., (2010) utilizaram o método de MALDI-TOF – MS para identificar 33 bactérias isoladas de amostras de leite de diferentes fazendas leiteiras, as quais foram previamente identificadas pelo protocolo de exame microbiológico de rotina (Figura 3) como Staphylococcus aureus (n = 13), Streptococcus agalactiae (n = 10) e Staphylococcus coagulase negativo (n = 10). Para todas as amostras de Streptococcus agalactiae, resultados similares foram observados para a identificação microbiológica e MALDI-TOF MS. Em

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relação ao Staphylococcus aureus, de 13 isolados, 11 apresentaram resultados de mesma identificação (Tabela 1). A partir destes dados, é possível afirmar que MALDI-TOF MS (com base em perfis de proteínas conservadas) (Figura 4), é capaz de identificação de distintas espécies dentro do mesmo gênero bacteriano. O banco de dados Biotyper MALDI (Bruker Daltonik, Alemanha) contém uma coleção ou seqüência de estirpes bacterianas, e tem sido otimizado para uma melhor identificação (Lartigue et al., 2009). Um isolado de Staphylococcus aureus foi identificado por MALDI-TOF como Staphylocccus haemolyticus, este resultado foi confirmado pelo seqüenciamento de 16S rRNA. A informação obtida por MALDI-TOF MS foi de que a cultura mista de bactérias pode ser identificada, MALDI-TOF indicaram uma impressão digital com íons indicativo de uma cultura mista (Barreiro et al., 2010).

Figura 3: Esquema identificação microbiológica e MALDI-TOF MS.

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Tabela 1: Cepas bacterianas isoladas de diferentes amostras de leite de vacas com mastite sub-clínica identificada por exame microbiológico padrão e por ‘fingerprint’ MALDI-TOF MS.

Fonte: Barreiro et al., (2010).

Figura 4: Identificação de microrganismos através da dessorção/ionização por matriz assistida a laser por tempo de vôo em espectrometria de massas de três isolados (MALDI- TOF MS). Nota-se as características dos perfis da proteína obtidos por Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus haemolyticus.Fonte: Barreiro et al., (2010).

Staphylococcus coagulase negativa são representados por um grande número de espécies de bactérias, que normalmente são agentes causadores de mastite. Rotineiramente, as espécies não são determinadas pelo exame microbiológico, mas essa identificação mais detalhada é facilmente possível por MALDI-TOF MS (Figura 5) (Barreiro et al., 2010). A presença de S. aureus no grupo Staphylococcus coagulase negativo não era esperado. Em estudos de caracterização molecular (PCR por espaçador intergênico tRNA), de 26

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S. chromogens (a Staphylococcus coagulase negativo) isoladas de mastite subclínica de 44 isolados de rebanhos leiteiros na Bélgica, identificou-se uma estirpe de S. aureus, que não mostrou nenhuma reação de coagulase positiva e pode ser detectada somente por meio da caracterização molecular (Catry, 2003).

Figura 5: MALDI-TOF MS espectros de S.coagulase negativos isolados (de acordo com a Tabela 1). MALDI-TOF MS permite a identificação das espécies de isolados de S. coagulase negativo. Fonte: Barreiro et al., (2010).

CONSIDERAÇÕES FINAIS O uso de MALDI-TOF MS possibilita detecção rápida de microrganismos causadores de mastite e, portanto, pode auxiliar na escolha de medidas de controle e tratamento mais adequado para a mastite subclínica e clínica. Na indústria de laticínios, MALDI-TOF MS também pode fornecer uma identificação mais rápida, mais barata e confiável de microrganismos presentes no leite para um controle de qualidade microbiológico mais abrangente.

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CAPÍTULO V

BIOLOGIA MOLECULAR NO MELHORAMENTO DO VALOR NUTRITIVO DE FORRAGENS TROPICAIS

Luis Felipe Prada e Silva, Daniela Maria Gerônimo e Lígia Garcia Mesquita.

Departamento de Nutrição e Produção Animal. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Universidade de São Paulo. Av.

Duque de Caxias Norte,225. CEP 13635-900. Pirassununga-SP.Brasil.lfpsilva@usp.br

INTRODUÇÃO O Brasil apresenta grande heterogeneidade de sistemas de produção de bovinos à pasto, com maior ou menor aplicação de tecnologia, o que dificulta a identificação de objetivos claros em programas de melhoramento de plantas forrageiras. Apesar desta heterogeneidade, a produção de bovinos vem apresentando melhora nos índices produtivos, o que, combinado com a pressão nacional e internacional para que os biomas Amazônia e Cerrado sejam preservados, indica que o mercado buscará cultivares de plantas forrageiras que aumentem a produtividade por área em sistemas mais intensivos de produção. O principal limitante da maior lotação animal em áreas de pastagem é a estacionalidade da produção do pasto, sendo este um importante objetivo de programas de melhoramento (Valle et al., 2009). No entanto, apesar da expressão de alguns genes já ter sido relacionada com a resistência a seca e salinidade (Kim et al., 2010), será preciso ainda um grande avanço no conhecimento para que a transgenia consiga contribuir de maneira significativa para aliviar o problema de baixa produção de pastagens na época da seca. Outro importante limitante da produção animal em pastagens é a baixa qualidade nutricional, ou ainda mais precisamente, a rápida queda da qualidade nutricional com a maturidade. A parede celular (fibra) corresponde de 50 a 80% da matéria seca (MS) de forragens, e representa a maior fonte de energia para ruminantes. O sistema digestivo dos ruminantes e populações microbianas associadas são adaptados para obter nutrientes e energia da parede celular de forragens; mas, infelizmente menos de 50% desta fração é digerida e utilizada pelo animal (Buxton & Redfearn, 1997). Sendo assim, a qualidade da fibra é o fator mais limitante à produção de ruminantes em regiões tropicais (Wattiaux et al., 1991). As forrageiras tropicais possuem elevada produção de massa em condições de alta temperatura, devido ao processo fotossintético do tipo C4 (Long, 1999). Essa adaptação anatômica às altas temperaturas garante às

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forrageiras tropicais maior eficiência do uso da água e do nitrogênio, maior tolerância à seca, maiores taxas de fotossíntese e, consequentemente, maior velocidade de crescimento do que forrageiras temperadas de ciclo fotossintético C3 (Wedin, 2004). As mesmas diferenças anatômicas que garantem maior produção de massa às forrageiras tropicais, também afetam a qualidade nutricional. Em comparação com forrageiras temperadas e leguminosas, as gramíneas de ciclo C4 possuem taxa de degradação e fermentação ruminal relativamente lenta (Van Soest, 1994). Forrageiras tropicais possuem proporcionalmente mais tecidos com degradação lenta, como xilema, epiderme e células da bainha vascular, e menos tecidos com degradação rápida, como mesófilo e floema (Akin & Burdick, 1975). Ainda, devido à concentração da enzima Rubisco nas células da bainha vascular, bem como devido à maior eficiência do aparato fotossintético, as folhas de gramíneas C4 possuem menor concentração de proteína do que folhas de gramíneas C3 (Mullahey et al., 1992). Os resultados com manejo de forrageiras tropicais em sistemas de pastejo intensivo indicam que após 95% de interceptação luminosa, ou seja, quando a planta atinge seu índice de área foliar crítico, o processo de elongação e maturação do colmo se acelera tremendamente, tanto em espécies mais decumbentes (Brachiaria brizantha) quanto em espécies de crescimento mais cespitoso (Panicum maximum) (Da Silva & Nascimento Jr., 2007).Portanto, o declínio da qualidade nutricional das plantas forrageiras tropicais de ciclo C4 é um dos maiores limitantes ao desempenho animal nos trópicos, e deve ser foco dos programas de melhoramento genético, bem como de programas visando o desenvolvimento de plantas transgênicas com melhor qualidade nutricional. O processo de lignificação da parede celular de plantas influencia não somente a indústria pecuária, mas também é um componente indesejável na indústria de papel (Baucher et al., 2003), e para a produção de álcool celulósico a partir do bagaço da cana-de-açúcar ou outras biomassas (Chen & Dixon, 2007) O melhoramento genético é um dos meios mais efetivos para o aumento da produtividade e qualidade de plantas forrageiras. NO entanto, plantas forrageiras apresentam enorme variabilidade no número de cromossomos, comportamento reprodutivo, incompatibilidade sexual e modo de polinização, o que representa tanto desafios como oportunidades para o desenvolvimento de melhores cultivares. Considerando a complexidade genética e as dificuldades encontradas pelo melhoramento convencional, a transgenia oferece várias alternativas e estratégias efetivas para o melhoramento de cultivares (Spangenberg et al., 1998). Esta revisão irá focar no uso da transgenia como ferramenta para acelerar o melhoramento de plantas forrageiras tropicais, visando principalmente o desenvolvimento de ecótipos com maior valor

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nutritivo, sem prejudicar a resistência à insetos herbívoros. Por que utilizar biologia molecular no melhoramento de plantas forrageiras? Avanços recentes em conhecimentos e técnicas de genética molecular modificaram radicalmente a percepção científica sobre a maneira e o grau no qual as plantas podem ser geneticamente modificadas para aumentar seu valor nutritivo. Enquanto os métodos tradicionais de avaliação laboratorial e seleção recorrente são severamente limitados por tempo e mão-de-obra, métodos moleculares aparentemente são limitados apenas pela imaginação humana (Casler, 2009). Existem numerosas revisões sobre mecanismos de alteração na estrutura e composição da parede celular, especialmente após a recente explosão de interesse da comunidade científica mundial sobre a produção de álcool celulósico a partir de biomassa (Bouton, 2007; Sticklen, 2008; Li et al., 2008; Hisano et al., 2009). Ressalta-se que o desenvolvimento de plantas forrageiras para a produção de bioenergia está alicerçado no conhecimento desenvolvido ao longo das últimas décadas por cientistas interessados em aumentar o valor nutritivo de forragens em sistemas de produção de ruminantes (Jacob et al., 2009). Enquanto biólogos moleculares estão avançando rapidamente o conhecimento sobre a estrutura da parede celular e sua relação com degradabilidade, poucos programas estão em parceria com programas de melhoramento genético de forrageiras. O potencial de efeitos prejudiciais da modificação da parede celular sobre o fenótipo da planta, como redução da produção, decréscimo na resistência à insetos, e menor tolerância ao estresse, evidencia a necessidade de colaboração com programas de melhoramento orientados para o uso no campo dos cultivares. Avaliações de plantas transgênicas em estufas ou câmaras de crescimento são insuficientes para prever o fenótipo de plantas em condições de campo (Baucher et al., 1999). Modificações genéticas são particularmente úteis para elucidar o papel de enzimas em vias metabólicas de interesse, e para a modificação de parâmetros para os quais não há variação genética conhecida, ou que tenha sido constatado de difícil modificação por seleção e cruzamento. O número de genes candidatos disponíveis para melhoristas de forragens de clima temperado têm aumentado rapidamente com o advento de programas de descoberta de genes em larga escala, como os baseados em etiquetas de sequências expressas de espécies relevantes, como azevém perene e trevo branco (Sawbridge et al. 2003a, 2003b), ou do seqüenciamento completo de genomas de espécies modelo como Medicago truncatula (Kulikova et al. 2004), Lotus japonicus L. (Stougaard, 2001), e arroz (Goff et al., 2002; Yu et al., 2002). A atual limitação da adoção de tecnologias genéticas em programas de melhoramento destas

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forrageiras de clima temperado não é, portanto, a identificação dos genes, mas sim a anotação funcional destes genes e a prova de fenótipo (proof of phenotype) em espécies alvo (Smith et al., 2007). Os recursos genéticos em forrageiras tropicais são muito incipientes, e avanços significativos dependem ainda do seqüenciamento em larga escala do transcriptoma, ou do genoma. Como comparação, existem 21.780 EST`s de azevém perene (Lolium perenne L.) depositadas no GeneBank, e somente 13 EST`s de Brachiaria brizantha e 4 de B. decumbens (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/ - consultado em 12/10/2010). Sequências parciais de genes da via da lignificação das espécies de forrageiras tropicais P. maximum, B. brizantha e C. dactylon foram recentemente depositadas no GeneBank (Acessos EU741931.1, EU741932.1, EU741933.1, EU741934.1, EU741935.1, HM007818.1, HM007816.1, HM007815.1, HM007814.1, HM007824.1, HM007823.1, HM007822.1, HM007821.1, HM007819.1). A comparação destas sequências com outras gramíneas de avançado conhecimento genômico (milho e arroz) demonstrou alta similaridade entre as espécies, com média de similaridade de 94% com milho e 87% com arroz (Lazarini et al, 2007; Gerônimo et al., 2010). Estes altos índices de similaridade sugerem que os recursos genéticos já desenvolvidos para milho e arroz, como base de dados de genes, microarranjos de DNA, marcadores moleculares e oligonucleotídeos iniciadores, podem ser úteis no estudo de plantas forrageiras tropicais. TÉCNICAS DE TRANSGENIA Os métodos de transformação de plantas podem ser divididos em diretos, o qual utiliza processos físicos ou químicos que causam modificações nas paredes e membranas celulares para que o DNA exógeno possa ser introduzido (eletroporação com protoplastos, transformação por etilenoglicol, aceleração de partículas, microinjeção) e indireto, o qual se utiliza do vetor Agrobacterium tumefaciens (Santarém, 2000). A eletroporação de protoplastos é um método utilizado para introduzir macromoléculas em células vegetais. Protoplastos são células vegetais desprovidas de paredes celulares e são submetidas à eletroporação, que consiste na aplicação de pulsos curtos de corrente contínua e alta voltagem, induzindo a formação de poros reversíveis nas membranas celulares para a entrada do DNA exógeno (Monquero, 2005). Esta técnica tem a vantagem de não necessitar de vetor biológico e não haver barreira física para a introdução do DNA, além de ser uma técnica simples, rápida, e que não utiliza agentes tóxicos às células, e é indicada para monocotiledôneas. Embora os pulsos elétricos possam ter efeitos deletérios para os protoplastos e na regeneração das plantas (Santarém, 2000). A desvantagem desta técnica é que o polietilenoglicol (PEG) pode danificar

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as células, reduzindo sua capacidade de regeneração (Newell, 2000), portanto é necessário um sistema eficiente de regeneração a partir de protoplasto, atualmente restrito a poucas espécies (Santarém, 2000). O método de aceleração de partículas, também conhecido como biobalística ou bombardeamento, pode ser definido como a introdução de moléculas de DNA em células vegetais intactas com a utilização de microprojéteis de alta velocidade (Sartoretto, 2008). Esse método consiste em atravessar a parede celular e membrana plasmática carreando o DNA para livre penetração deste na célula (Sartoretto, 2008). O bombardeamento é feito com um equipamento (também chamado de canhão) que acelera microprojéteis (partículas) cobertas com sequências de DNA (Monquero, 2005). Microprojéteis de ouro ou de tungstênio penetram a parede e membrana celular de maneira não letal, alojando-se aleatoriamente nas organelas e o DNA é dissociado dos microprojéteis pela ação de líquido celular e integrado ao genoma do organismo que o recebeu (Monquero, 2005). A biobalística pode ser utilizada em qualquer tipo de tecido vegetal, porém requer equipamento apropriado de alto custo e pode inserir um grande número de cópias do gene de interesse na célula, provocando problemas de inserção e regulação do mesmo (Handel, 1997). Este método de transformação tem sido o mais utilizado em gramíneas, e tem sido otimizado para B. brizantha (Silveira et al., 2003). A primeira transformação de Brachiaria foi feita em Brachiaria ruziziensis utilizando biobalística (Lenis-Manzano, 1998). A transferência de DNA por meio da Agrobacterium tumefaciens é o método mais usado na obtenção de plantas transgênicas de dicotiledôneas, mas não em monocotiledôneas, pela dificuldade de identificar estirpes da bactéria que infectem estas plantas (Handel, 1997). A. tumefaciens é o agente causal da galha da coroa, doença caracterizada pelo crescimento de tumores na junção caule e raiz, e esses tumores ocorrem por esta bactéria possuir um plasmídeo (DNA extracromossomal) chamado de plasmídeo Ti (indutor de tumor) que possui a habilidade de transferir uma parte de seu DNA (DNA transferido; T-DNA) para a célula vegetal a ser infectada (Monquero, 2005). O T-DNA contém genes envolvidos na produção de reguladores de crescimento vegetais e opinas, que são aminoácidos modificados que servirão como alimento para o patógeno. Portanto, em condições naturais, quando o T-DNA é transferido para a célula vegetal, essa produzirá opinas para o patógeno e levarão a célula vegetal a se multiplicar, formando tumores ou calos (Gander, 1997). Utilizando-se enzimas de restrição, é possível realizar o desarmamento do plasmídeo retirando-se os genes responsáveis pela formação de tumores e prepara-se o vetor contendo, entre as extremidades da região T, os genes de interesse (Sartoretto, 2008). Assim, quando Agrobacterium contendo um

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plasmídeo Ti manipulado infecta uma célula vegetal, ele transferirá o gene de interesse para dentro da célula transformada (Gander, 1997). Apesar da otimização de técnicas de transformação, os sítios de DNA exógeno e número de cópias integradas ao genoma da planta são ainda imprevisíveis, levando a variação na expressão do transgene. Fatores epigenéticos também podem influenciar o nível de expressão, podendo haver a inativação por inibição da transcrição ou acúmulo de RNA mensageiro (Santarém, 2000). O domínio das técnicas de regeneração é condição indispensável para o desenvolvimento da biotecnologia de transgenia na agricultura e esta etapa ainda representa o maior gargalo, já que cada espécie de planta tem diferentes exigências nutricionais, hormonais e ambientais para a regeneração (Gander, 1997). Após algum tempo de desenvolvimento, as plantas são transferidas para vasos e se desenvolvem em casa de vegetação com condições controladas para obtenção de sementes. Inicia-se a fase de teste de campo com o intuito de verificar o comportamento destas plantas em condições normais de cultivo, sua eficiência agronômica e sua capacidade de transferir o gene para outras plantas da mesma espécie (Monquero, 2005). Diferentes cepas de Agrobacterium spp. foram testadas para transformação de Brachiaria, com resultados negativos para formação de tumores ou raízes (Cabral et al., 2005). Apesar de Agrobacterium normalmente não infestar plantas monocotiledôneas, como cereais e gramíneas perenes, demonstrou-se que algumas cepas são capazes de transformar arroz, milho, cevada, trigo, sorgo e Panicum virgatum (Sticklen, 2008). Considerando-se as vantagens da transformação mediada por Agrobacterium (menor número de cópias, menor rearranjo do transgene), este é o método de escolha para transformação de plantas (Hisano et al., 2009).

DIGESTIBILIDADE DA FIBRA A lignificação de tecidos limita a quantidade de energia digestível disponível aos ruminantes, resultando em utilização incompleta da celulose e hemicelulose pelos animais (Casler et al., 2002; Fukushima & Hatfield, 2004). Ligninas são heteropolímeros fenólicos complexos associados com os componentes polissacarídicos da parede de células específicas. Além do conteúdo de lignina, a composição da lignina é um fator importante que influencia a digestibilidade de forragens (Campbell & Sederoff, 1996). A lignina em gramíneas é composta por unidades guaiacílicas (G) derivadas do álcool coniferílico, unidades siringílicas (S) derivadas do álcool sinapílico, e unidades p-hidroxifenílicas (H) derivadas do álcool p-coumarílico. Uma das maneiras mais diretas de se alterar o conteúdo e composição da lignina na parede celular é utilizar técnicas de transgenia para modificar a

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expressão das enzimas responsáveis pela sua biossíntese. Presumivelmente, todas as enzimas da via de lignificação são conhecidas (Hisano et al., 2009): fenilalanina amônia-liase (PAL), cinamato 4-hidroxilase (C4H), 4-coumarato CoA ligase (4CL), hidroxicinamoil CoA transferase (HCT), coumarato 3-hidroxilase (C3H), cafeoil-CoA 3-O-metiltransferase (CCoAOMT), cinamoil-CoA redutase (CCR), cinamil álcool desidrogenase (CAD), ferulato 5-hidroxilase (F5H), e ácido caféico O-metiltransferase (COMT). Vários estudos demonstram que a redução da expressão de PAL, HCT, C3H, CCoAOMT, CCR e CAD afetam a composição monomérica e o conteúdo de lignina (Tabela 1). A redução da expressão de enzimas da biossíntese da lignina foi inicialmente realizada utilizando oligonucleotídeos antisensos, entretanto, o uso de tecnologia de RNA de interferência (RNAi) também tem sido utilizada para este propósito (Sticklen, 2008)

Tabela 1. Engenharia genética de genes da biossíntese de lignina e seus efeitos na lignina e digestibilidade da forragem.

Apreende-se pelos resultados mostrados na Tabela 1 que a redução na expressão de diversos genes da biossíntese de lignina, como o C3H em alfafa, resulta em mudança dramática na quantidade e composição de lignina, produzindo um material mais digestível. Uma preocupação quando da redução do teor de lignina é reduzir concomitantemente a aptidão da forrageira ao ambiente, reduzindo a produção total de massa, tolerância à seca ou a pragas, como a cigarrinha das pastagens. A seleção recorrente de forragens perenes para maior digestibilidade in vitro da matéria seca (DIVMS), e consequentemente com menor teor de lignina, pode, teoricamente, levar a menor sobrevivência das plantas em condições de campo. Casler et al. (2002) indicam possível relação negativa entre aumento da digestibilidade, devido a seleção recorrente, e sobrevivência

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de Dactylis glomerata L. O mesmo foi observado em seleção recorrente de Panicum virgatum L, com menor produção de massa e sobrevivência da linhagem com alta DIVMS (Casler et al., 2002). Ressalta-se que a mortalidade ocorre durante o inverso rigoroso do hemisfério norte, porém evidencia a potencial queda da aptidão de plantas devido à redução dos teores de lignina. Em contrapartida, a seleção recorrente de Bromus inermis Leyss para maior DIVMS, não alterou a aptidão agrícola desta espécie (Casler et al., 2002). Da mesma forma, Chen et al. (2003) reduziu o teor de lignina com a supressão da expressão de CAD por transgenia em festuca (Festuca arundinacea Schreb) e não observou diferenças entre as plantas transgênicas e normais quanto à produção, maturidade, altura, acamamento ou resistência à insetos. Para minimizar possíveis efeitos indesejáveis da transgenia, torna-se necessária a adoção de uma visão da biologia de sistemas sobre a biossíntese de lignina, de modo a tornar mais precisos os alvos de modificação gênica. Como toda via metabólica, não são todas as enzimas que são alteradas de forma a controlar o fluxo de lignificação nas plantas. A determinação dos pontos de controle é importante para melhor caracterização dos alvos de transgenia. Neste sentido, em um estudo recente com 11 cultivares de P. maximum, Stabile (2009) estudou a expressão de 6 genes da via da lignificação (PAL, C3H, C4H, CAD, CCR e COMT) e identificou a expressão dos genes COMT e C4H como os únicos correlacionados com a queda da digestibilidade da parede celular do colmo que ocorre com o avanço da maturidade, posicionando os mesmos como fortes candidatos para estudos de engenharia genética que reduzam a expressão destes genes visando a obtenção de cultivares de P. maximum com maior digestibilidade da fibra do colmo e com queda mais lenta da digestibilidade com o avanço da maturidade (Figura 1). O conteúdo de lignina não precisa ser reduzido para que haja aumento na digestibilidade; modificações de sua composição podem aumentar significativamente a digestibilidade da parede celular. Redução da expressão de CAD em dicotiledôneas não ocasionou nenhuma redução no teor de lignina ou no crescimento das plantas, porém aumentou a digestibilidade (Baucher et al., 1999; Halpin, 2004). Ainda, a maior expressão de F5H em Populus tremuloides promove mudança para lignina-S aumentando a digestibilidade da parede celular (Huntley et al., 2003). Ainda, a produção de mutantes de milho e sorgo com menor ligação cruzada da celulose com lignina, mediada por ferulatos, se mostrou efetiva no aumento da digestibilidade da parede celular de tecidos maduros (Jung & Phillips, 2010).

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Figura 1. Dados reportados como médias de quadrados mínimos ± EPM. (A) Alterações na abundância de RNAm de ácido caféico O-metiltransferase (COMT) no colmo de genótipos de P. maximum separados em dois grupos com queda rápida ou lenta da digestibilidade da FDN com o avanço da maturidade. Tecidos foram obtidos com 30, 60 e 90 dias após nivelamento. Dados foram analisados pelo método de 2–ΔΔCt considerando-se 30 d como ponto de referência da expressão. (B) Alterações na abundância de RNAm de cinamato 4-hidroxilase (C4H) no colmo de genótipos de P. maximum separados em dois grupos com queda rápida ou lenta da digestibilidade da FDN com o avanço da maturidade. Diferenças significativas (P< 0,05) entre dias dentro do tratamento LENTA são representadas dor letras maiúsculas diferentes, e diferenças significativas (P<0,05) entre dias dentro do tratamento RÁPIDA são representadas por letras minúsculas diferentes. Fonte: Modificado de Stabile (2009).

Outra possibilidade interessante, mas não surpreendente, para modulação da via de biossíntese da lignina, é através dos fatores de transcrição (FTs). Vários FTs estão vindo à tona como reguladores da biossíntese de lignina em Arabidopsis, milho e árvores (Patzlaff et al. 2003a; Goicoechea et al. 2005; Zhong et al. 2006; Zhong & Ye 2007; Zhong et al. 2008). FTs da família NAC parecem ser específicos para certos tipos de células, que ativam a cascata de resposta de outros TFS, MYB e KNAT, que por sua vez, ativam genes para síntese de celulose e hemicelulose (Kubo et al. 2005; Mitsuda et al.

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2007; Zhong et al. 2008). Os TFs MYB e LIM também foram propostos como especificamente envolvidos com a síntese de lignina (Kawaoka et al. 2000; Patzlaff et al. 2003a,b; Karpinska et al. 2004; Goicoechea et al. 2005; Yang et al. 2007). Mais estudos devem identificar FTs regulando tanto a síntese de lignina quanto de celulose. Tais conhecimentos são importantes para manipular TFs específicos que controlam a lignificação em tecidos alvos, reduzindo a possibilidade de efeitos colaterais indesejáveis da transformação, como menor resistência à cigarrinha-das-pastagens, doenças foliares, ou menor produção de massa. Identificação de genes homólogos: Diversas cópias dos genes da lignificação são encontradas no genoma de plantas, levando a existência de isoformas que podem ser expressas diferencialmente pelos tecidos em diferentes momentos do desenvolvimento das plantas. Isto abre a possibilidade da identificação de genes homólogos que estejam controlando a síntese de lignina em situações específicas, como lignificação do colmo com o avanço da maturidade ou lignificação de folhas como mecanismo de resposta a insetos ou patógenos. Em fumo (Nicotiana tabacum), diferentes isoformas de COMT foram identificados, sendo a isoforma COMT1 associada com síntese de lignina, e a isoforma COMT2 com mecanismos de defesa da planta (Collendavelloo et al., 1981). Normalmente, PAL é codificado por uma família multigênica pequena que leva a existência de múltiplos isoformas de PAL (Bolwell et al., 1985). Em Arabidopsis, quatro isoformas de PAL foram caracterizadas (Cochrane et al., 2004). C4H é outra enzima chave da via de fenilpropanóides, sintetizando inúmeros metabólitos secundários que participam do desenvolvimento e adaptação. Duas isoformas de C4H foram clonadas em Brassica napus (Chen et al., 2007). Recentemente, homólogos de três genes chaves da síntese de lignina foram isolados e caracterizados em azevém perene: CAD (Lynch et al., 2002), 4CL (Heath et al., 1998) e CCR (McInnes et al., 2002), supostamente com diferentes funções na planta. Em P. virgatum, quatro cDNAs similares a CCR foram caracterizados, com dois deles codificando enzimas com atividade de CCR (PvCCR1 e PvCCR2 – Escamilla-Treviño et al., 2010). Os resultados destes estudos sugerem que homólogos específicos destes genes possuem atuações distintas, como por exemplo, o homólogo PvCCR1 seria a enzima envolvida com a lignificação, e portanto gene candidato para transgenia de P. virgatum visando maior digestibilidade, enquanto PvCCR2 aparentemente está envolvido com a defesa da planta. Estes resultados evidenciam a importância do desenvolvimento de conhecimento fundamental e compreensivo da expressão destas enzimas do

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ponto de vista da biologia de sistemas, para solucionar como diversas vias metabólicas podem ser reguladas independentemente, porém agir de forma sinergística (Dauwe et al., 2007). O uso de construções contendo promotores específicos e não constitutivos, também pode auxiliar na redução de efeitos colaterais indesejáveis do silenciamento de genes. A maioria das estratégias utilizadas para modificar lignina utilizou promotores constitutivos (expressos abundantemente em todos os tecidos). No entanto, o uso de promotores específicos, como celulose sintase de paredes secundárias, ou promotores de fatores de transcrição, pode ser empregado de maneira a silenciar os genes desejados somente nos tecidos em lignificação (Persson et al., 2007).

CONCLUSÕES É grande o potencial de ganhos efetivos com o uso da transgenia, e esta técnica vem sendo aplicada com sucesso em programas de melhoramento de forrageiras de clima temperado, bem como para o desenvolvimento de biomassa para bioenergia em gramíneas como milho, cana-de-açúcar e P. virgatum. Para que o melhoramento genético de forrageiras tropicais possa avançar no ritmo necessário para atender às demandas do mercado, é necessário investimentos consideráveis que incorporem de maneira efetiva a biotecnologia em programas de melhoramento, sendo que grandes benefícios imediatos viriam de esforços de seqüenciamento em massa do transcriptoma de espécies de interesse. Ferramentas de biologia molecular e transgenia poderiam rapidamente contribuir para a melhoria da qualidade nutricional de forrageiras tropicais, através da identificação de QTL`s (locos de caracteres quantitativos) e polimorfismos associados com qualidade nutricional, caracterização da expressão específica de genes homólogos, e modulação da expressão de genes específicos de modo a aumentar a digestibilidade da parede celular.

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CAPÍTULO VI

LEVEDURAS NA ALIMENTAÇÃO DE MONOGÁSTRICOS

Lara Santa Cruz Valadares¹, Luis Carlos Garibaldi Simon Barbosa¹, Bárbara Volpi de Freitas¹, Teresa Cristina de Freitas¹, Cristiane Soares da Silva Araújo¹, Ricardo de Albuquerque¹, Lúcio Francelino Araújo¹,²

¹Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP²Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP

RESUMO Nós últimos anos, a utilização de leveduras na alimentação animal tem se tornado cada vez mais frequente. Em animais monogástricos, um das principais funções exercidas pelas leveduras é a promoção da saúde intestinal o que resulta, consequentemente, em melhor desempenho dos animais. Vários trabalhos foram conduzidos com o objetivo de avaliar o efeito de diferentes fontes de levedura na alimentação de suínos e aves, cujos resultados são descritos nas tabelas apresentadas nesta revisão.

INTRODUÇÃO No campo da produção animal, o progresso da indústria avícola e suinícola tem sido de relevada significância. Entre os vários fatores que contribuem para esta finalidade, a nutrição tem desempenhado papel essencial, com intensa busca de melhora no aproveitamento dos nutrientes da dieta. Segundo a previsão do USDA, a produção mundial de grãos e oleaginosas em 2009 deve ser de aproximadamente dois bilhões e 621 milhões de toneladas, sendo 4,3% maior que em 2008. De acordo com o Sindirações (2005), 79% da produção nacional de milho e 41% da oferta de farelo de soja são consumidos na alimentação animal. Apesar da constante busca por alimentos alternativos, as rações de aves ainda são formuladas basicamente com o milho e farelo de soja. Com a proibição do uso de antibioticos promotores de crescimento na alimentacao animal a partir de janeiro de 2006, pela União Européia, e devido a problemas relacionados com a BSE e as dioxinas, surgiram novas oportunidades para o uso de substâncias naturais que podem ser empregadas na produção animal. Neste contexto, a levedura desempenha importante papel devido a suas qualidades nutricionais e farmacodinâmicas. Leveduras são microorganismos unicelulares, que se reproduzem assexuadamente por brotamento e se desenvolvem na fermentação alcoólica (Yara, 2006). Apresentam membrana

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celular bem definida, pouco espessa em células jovens e rígidas em células adultas. Possuem constituição variável, com predominância de hidratos de carbono e menor quantidade de proteínas e graxas. Internamente delimitando o citoplasma, existe a membrana citoplasmática, mais evidente em células adultas. O núcleo pequeno (0,5-0,15 µm) esférico é bem definido e de localização variável. As leveduras são as mais antigas fontes de proteínas unicelulares. Na alimentação animal, as leveduras, principalmente Saccharomyces cerevisiae tem sido usado por décadas através do uso de subprodutos da indústria de fermentação. Desde o final dos anos 70, com a criação do Programa Nacional do Álcool (Proálcool) houve um estimulo ao desenvolvimento da produção de álcool em larga escala, e consequentemente o beneficiamento do creme de leveduras, como um de seus principais subprodutos. Após este período vários trabalhos foram publicados avaliando a levedura na alimentação animal como uma fonte protéica (Tabela 1), substituindo o farelo de soja nas dietas, quando havia uma viabilidade econômica. Contudo, nos últimos anos, novas pesquisas tem demonstrado a viabilidade do uso da levedura na dieta dos animais através das diferentes funções desenvolvidas no organismo.

Tabela 1. Utilização da levedura na dieta de aves e suínos.

As leveduras possuem em sua composição uma fração de carboidratos (20% a 40%), que na grande maioria fazem parte da parede celular, que é composta principalmente por glucanas e mananas (MOS), as quais parecem ter impacto no sistema imunológico e habilidade em prevenir a colonização de bactérias patogênicas no trato gastrointestinal. O sistema imunológico é dividido em imunidade celular e imunidade humoral. É importante que os dois sistemas funcionem de forma apropriada para proteger o organismo contra a ação de agentes patogênicos. A ativação de linfócitos é acompanhada pelo aumento da síntese de ácidos nucléicos. Os nucleotídeos e seus metabólitos são componentes essenciais em diversos

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processos metabólicos. A síntese de purinas e pirimidinas ocorre por ″via de novo″ a partir de moléculas como CO2 (custo extremamente elevado), amônia e ribose (pirimidinas) ou glicina, aspartato, e formil e grupos amina (purinas). Embora os trifosfatos de nucleotídeo possam ser formados diretamente por ″via de novo″, eles podem ser sintetizados por via de salvamento, a partir da degradação dos próprios nucleotídeos já presentes no organismo. Alternativamente, a via de salvamento pode ocorrer a partir de nucleotídeos presentes na própria dieta. Este é o processo de menor custo metabólico ao organismo.

FLORA DO TRATO GASTROINTESTINAL DAS AVES A célula de levedura de parede celular do Saccharomyces cerevisae possui a particularidade de impedir cepas patogênicas de bactérias de se estabelecerem no intestino. A superfície das leveduras contém moléculas de carboidratos complexos, mananoligossacarídeos (MOS), que interferem na habilidade das bactérias de se aderirem à parede intestinal, e por um processo de exclusão competitiva, impedem que as mesmas se instalem no trato intestinal. Smith e Sanz (1991), utilizando leveduras verificaram a inexistência de diferença relativa ao peso dos ovos e conversão alimentar, ao utilizarem farinha de vísceras de frangos, farinha de carne e levedura na ração de matrizes. A microbiota do trato gastrintestinal das aves apresenta uma população heterogênea e complexa, bastante dinâmica, constituída por inúmeras espécies bacterianas, sofrendo a ação de uma série de fatores. A colonização intestinal já após a eclosão e alojamento das aves, tende a persistir ao longo do ciclo de vida da ave, passando a compor a microbiota normal. A formação da flora microbiana ocorre nos primeiros dias de vida; a partir dos quatro dias de idade verifica-se um aumento significativo no número de bactérias, com tendência à estabilidade a partir da segunda semana de vida. A ocorrência de desafios maiores em situações de morbidade ambiental pode tornar a flora instável até a quinta semana de vida das aves (Canalli et al., 1996; Maiorka, 2001). Estima-se que há entre 109 até 1014/g bactérias no intestino dos animais; portanto as bactérias do trato gastrintestinal têm uma grande influência no metabolismo, na fisiologia e na nutrição do hospedeiro (Fuller, 1989). Aproximadamente 90% da flora intestinal é composta por bactérias anaeróbias facultativas produtoras de ácido lático (Bacillus, Bifidobacterium, Lactobacillus) e bactérias anaeróbias estritas (Bacterioides, Fusobacterium, Eubacterium). Os 10% restantes consistem de Escherichia coli, Proteus, Clostridium, Staphylococcus, Blastomyces, Pseudomonas e outras. Qualquer mudança nesta proporção determina baixo desempenho e enterites nos animais (Savage, 1977).

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No aparelho digestivo das aves em situações normais predominam no inglúvio os Lactobacillus que produzem pH levemente ácido; no pró ventrículo e moela o pH é extremamente ácido, praticamente inviabilizando a presença de microorganismos; no intestino ocorrem bactérias Gram positivas como Lactobacillus sp., Estreptococcus faecalis e Estreptococcus faecium e nos cecos predominam os microorganismos do gênero Clostridium e Gram negativos que fermentam a fibra da dieta (Garlich, 1999). A dominância e persistência da flora desejável, pode ser efetivada quando os microorganismos fixam-se no epitélio intestinal, multiplicando-se mais rapidamente do que a sua eliminação pelo peristaltismo intestinal, como é o caso dos Lactobacillus e Enterococcus; ou encontram-se livres na luz intestinal por incapacidade de se ligarem ao epitélio intestinal, que por sua vez agregaram-se a outras bactérias que já estão aderidas à mucosa entérica (Silva, 2000). A flora eutrófica inibe o crescimento de bactérias indesejáveis, estimula a produção de ácidos graxos voláteis principalmente o ácido lático, produzido em grandes quantidades por lactobactérias como o Lactobacillus acidophillus e Lactobacillus latis. Esses ácidos orgânicos determinam a diminuição do pH com a inibição de bactérias patogênicas e estímulo à proliferação de enterócitos, favorecendo a manutenção da integridade da parede celular e viabilizando a total capacidade de absorção intestinal das aves. Valores de 5% a 10% das necessidades energéticas podem sofrer a influência da ação dos microorganismos, principalmente na formação de ácidos graxos voláteis de rápida absorção e utilizados como energia. A microbiota eutrófica tem a capacidade de produzir esses ácidos a partir da fibra da dieta no intestino grosso, fato este que associado à manutenção da integridade da mucosa intestinal, proporciona uma economia na energia da dieta (Fernandez & Crespo, 2003). A flora indesejável é representada por Escherichia coli, Clostridium, Staphylococcus, Blastomyces, Pseudomonas e Salmonellas. O desequilíbrio da microbiota intestinal com alteração na população de microorganismos é chamada de disbiose e ocorre em condições diversas como jejum alimentar ou hídrico prolongado, estresse e infeções virais, provocando desequilíbrio da flora com proliferação de microorganismos indesejáveis. Em situações de disbiose, a população microbiana indesejável atua no trato gastrintestinal diminuindo a absorção de nutrientes, aumentando a espessura da mucosa e a velocidade de passagem do digesta. Há nesse caso interferência das necessidades nutricionais do hospedeiro com aumento da velocidade de renovação dos enterócitos e diminuição da altura dos vilos e aumentando a profundidade das criptas da mucosa intestinal, reduzindo a absorção dos alimentos, competindo com o hospedeiro por nutrientes presentes na luz intestinal e resultantes do processo

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digestivo como hexoses, aminoácidos, ácidos graxos, vitaminas e outros. Este desequilíbrio produz aminas biogênicas (cadaverina, histamina, putrescina), amônia e gases, que são altamente prejudiciais à integridade da mucosa e à saúde intestinal (Miles, 1993; Garlich, 1999).

INTEGRIDADE DO TRATO INTESTINAL Os principais mecanismos de defesa contra as infecções causadas por microorganismos enteropatogênicos são a mucosa intestinal intacta, formando uma verdadeira barreira; o sistema imunológico eficiente e população probiótica aderida ao epitélio intestinal evitando a sua colonização por patógenos. Um dos mecanismos mais comuns de danos ao trato digestivo por microorganismos é aquele onde ocorre uma interação específica ou fixação entre as bactérias e as células epiteliais da parede intestinal. Esse mecanismo é característico das bactérias Gram negativas (Salmonellas, por exemplo), que possuem em sua superfície estruturas conhecidas como fímbrias. Essas estruturas servem como suporte para a ligação entre as lectinas, presentes em sua superfície e o receptor no epitélio. As lectinas são proteínas que têm a capacidade de reconhecer resíduos de açúcares que formam as glicoproteínas (Edens, 2003). A habilidade de muitos microorganismos aderirem ao epitélio intestinal é essencial para a sua permanência e desenvolvimento. Desta maneira eles evitam serem removidos com os movimentos peristálticos. Um método para prevenir a colonização do intestino por patógenos é saturar os sítios receptores do epitélio, ação que a maioria dos probióticos executa. Diferentes bactérias têm diferentes mecanismos de adesão; os lactobacilos, por exemplo, têm a sua adesão controlada pelo glicocálix e proteínas da parede celular da bactéria (Wadstron et al., 1987). Os microorganismos capazes de se multiplicarem e se adaptarem rapidamente ao meio intestinal da maioria dos animais e com capacidade de impedir mecanismos de fixação de bactérias indesejáveis no trato gastrintestinal são denominados probióticos (Day, 1992).

NUCLEOTÍDEOS Existem diversas fontes de nucleotídeos, entre elas a levedura. O extrato de levedura é rico em nucleotídeos, inositol (importante promotor de crescimento), glutamato (estimulante de palatabilidade), proteínas, vitaminas e minerais. Produtos a base de nucleotídeos tem sido utilizados com sucesso em dietas de suínos (Maribo, 2003) e de peixes (Burrells et al., 2001). Nucleotídeos são compostos por uma base nitrogenada, um monossacarídeo pentose e um, dois ou três grupos fosfatos. As bases nitrogenadas (Figura 1) pertencem a duas famílias de compostos: as purinas [adenina (A) e guanina (G)] e as pirimidinas [citosina (C), timina (T) e uracila

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(U)]. Na realidade, a adição de um açúcar pentose a uma base produz um nucleosídeo (Figura 2). Os ribonucleosídeos de A, G, C, T e U são denominados adenosina, guanosina, citidina, timidina e uridina, respectivamente. Se o açúcar é uma ribose, um ribonucleosídeo é produzido. Por outro lado, se o açúcar é uma desoxirribose, um desoxirribonucleosídeo é produzido. Os nucleotídeos (Figura 3) são ésteres mono, di ou trifosfato dos nucleosídeos. O grupo fosfato é unido por uma ligação éster ao 5’-OH da pentose. Este composto é denominado nucleosídeo 5’-fosfato ou 5’-nucleotídeo. O tipo de pentose é denotado pelo prefixo nos nomes “5’-ribonucleotídeo” e “5’-desoxirribonucleotídeo”.

Figura 1 – Fórmula estrutural das bases nitrogenadas

Figura 2 – Fórmula estrutural dos nucleosídeos

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Figura 3 - Fórmula estrutural dos nucleotídeos

Os nucleotídeos e seus metabólitos são extremamente importantes em diversos processos metabólicos, sendo que a síntese de purinas e pirimidinas tem um custo energético muito elevado (via de novo), e ocorre a partir de moléculas como o CO2, amônia e ribose, para as pirimidinas, ou glicina, aspartato, formil e grupos amina, para as purinas. (Rutz et al, 2006). Entretanto, o organismo pode reaproveitar os trifosfatos de nucleotídeo, por via de salvamento, através da degradação dos nucleotídeos já presentes no organismo, ou ainda, a partir dos nucleotídeos presentes na dieta, diminuindo assim o custo metabólico para a formação de tais compostos (Rutz et al., 2006). Ainda, de acordo com o mesmo autor, a exigência de suplementação de nucleotídeos na dieta pode variar de acordo com as condições de crescimento dos animais, recuperação de lesões e infecções sistêmicas, e se o fígado encontra-se comprometido. Faz-se necessário frisar ainda, que alguns tecidos como, por exemplo, a mucosa intestinal, a medula óssea, e as células hematopoiéticas e cerebrais, apresentam capacidade limitada de síntese de novo de nucleotídeos, dependendo basicamente da via de salvamento (Yamamoto et al., 1997). Deve-se salientar ainda, a importância destas moléculas no sistema imune das aves. É sabido que o processo de ativação de linfócitos é acompanhado pelo aumento da síntese de ácidos nucléicos, sendo que esta ativação pode ocorrer pela maximização da via de salvamento, e minimização da via de novo. Adicionalmente, em estudo realizado por Rudolph et al. (1994), foi possível observar que o fornecimento de uma dieta sem nucleotídeos é capaz de causar uma imunossupressão. Atualmente observa-se que a suplementação de nucleotídeos na dieta dos animais pode proporcionar efeitos benéficos sobre o sistema imune, crescimento e desenvolvimento do intestino delgado, metabolismo de lipídios e funções hepáticas. O termo “semi”, ou condicionalmente essencial, tem sido usado para os nucleotídeos na nutrição humana, tanto é que já existem produtos

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com nucleotídeos para neonatos e tratamentos de doenças imunossupressoras como a AIDS. Estes nutrientes podem se tornar essenciais quando a síntese endógena é insuficiente para atender às funções normais, embora a sua ausência na dieta não leve a sintomas clássicos de deficiência clínica. Condições em que podem tornar-se essenciais incluem certos estados de doença, períodos de consumo limitado de nutrientes ou crescimento rápido e a presença de fatores regulatórios ou de desenvolvimento que interferem com na capacidade de síntese endógena. Sob estas condições, o consumo de nucleotídeos pode poupar o organismo dos custos da síntese “de novo” e da via de salvação e, consequentemente otimizar as funções dos tecidos e/ou órgãos. O desenvolvimento do sistema imunológico da ave é iniciado durante o período embrionário e continua na primeira semana após a eclosão. Durante esta semana, ocorre um rápido aumento na população de leucócitos, através dos órgãos linfóides, e este aumento irá mediar a imunidade celular. Durante este período, tanto o excesso como a deficiência de nutrientes pode ser prejudicial ao desenvolvimento do sistema imune das aves. De uma maneira geral, a deficiência crônica de micronutrientes pode ser mais prejudicial do que a deficiência de energia e proteína. O saco vitelínico é importante para a mantença e o crescimento das aves no período pós-eclosão, além de ser importante para a proteção imunológica dos pintos. O saco vitelino atua na transferência de imunidade passiva. As imunoglobulinas (IgA e IgG) presentes no albúmen e gema são transferidas para o pinto recém nascido protegendo este contra o ataque microbiano do meio. Assim, o sistema imune das aves encontra-se parcialmente desenvolvido no momento da eclosão. Na primeira semana de vida, há um rápido aumento da população de leucócitos, assim como há um crescimento acelerado dos órgãos. A migração de linfócitos para o timo ocorre a partir do sexto dia de incubação. No caso da bursa, esta migração ocorre entre o 10° e o 15° dia. O efeito da retirada do timo e da bursa sobre o desenvolvimento da resposta imune é um indicativo do estado sanitário da ave. A retirada do timo não produz efeitos sobre a resposta mediada por células, indicando um alto grau de desenvolvimento do timo durante a incubação. No caso de retirada da bursa, ocorre uma redução da resposta humoral, principalmente nas regiões de diferenciação e desenvolvimento de anticorpos. Os órgãos imunológicos secundários (baço, gânglios cecais, glândula de Harder, tecido linfóide presente no intestino e sistema respiratório) encontram-se incompletos no momento da eclosão. Paralelamente ao desenvolvimento da ave, ocorre também o desenvolvimento do tecido linfóide associado ao intestino, o qual irá se desenvolver de forma mais aguda quanto mais cedo as aves forem alimentadas (Friedman et al., 2003). O desenvolvimento do sistema imune parece ser dependente da alimentação inicial fornecida às aves. Dibner et al. (1998)

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propuseram três mecanismos para elucidar o efeito da nutrição sobre o sistema imunológico do recém-nascido. O primeiro considera o fornecimento de ração imediatamente após a eclosão fornecendo substrato limitante. O segundo considera que a alimentação afeta os níveis endógenos de hormônios e de outros imunomoduladores, enquanto o terceiro afirma que a presença de antígenos no sistema gastrointestinal pode ser necessária por promover à diferenciação total de células do sistema imune, particularmente dos linfócitos B. A diferenciação completa dessas células é crítica para o desenvolvimento eventual de estruturas imunológicas secundárias, tais como centros germinativos e gânglios cecais, juntamente com a capacidade de responder à vacinação com o desenvolvimento do sistema de memória. O sistema imunológico é dividido em imunidade celular e imunidade humoral. É importante que os dois sistemas funcionem de forma apropriada para proteger o organismo contra a ação de agentes patogênicos. A ativação de linfócitos é acompanhada pelo aumento da síntese de ácidos nucléicos. Os nucleotídeos e seus metabólitos são componentes essenciais em diversos processos metabólicos. A síntese de purinas e pirimidinas ocorre por via de novo (custo extremamente elevado) a partir de moléculas como CO2, amônia e ribose (pirimidinas) ou glicina, aspartato, e formil e grupos amina (purinas). Embora os trifosfatos de nucleotídeo possam ser formados diretamente por via de novo, eles podem ser sintetizados por via de salvamento, a partir da degradação dos próprios nucleotídeos já presentes no organismo. Alternativamente, a via de salvamento pode ocorrer a partir de nucleotídeos presentes na própria dieta. Este é o processo de menor custo metabólico ao organismo. O processo de ativação de linfócitos ocorre de tal forma que a síntese de novo é minimizada e a de salvamento é maximizada, indicando um processo de economia pelo organismo. Diversos estudos já demonstraram que o fornecimento de uma dieta sem nucleotídeos durante períodos prolongados resulta em imunossupressão (Rudolph et al.,1994). Tendo em vista a síntese de novo de nucleotídeos, principalmente no fígado, os animais aparentemente não necessitariam da suplementação de nucleotídeos na dieta. Entretanto, a exigência de nucleotídeos exógenos pode variar consideravelmente, podendo aumentar em certas condições como crescimento rápido dos tecidos, recuperação de lesões e infecções sistêmicas. Além disso, a exigência de nucleotídeos aumenta quando, por alguma razão, o fígado encontra-se comprometido. Em um estudo com ratos alimentados com uma dieta deficiente em nucleotídeos, foi observada uma redução significativa nos níveis de proteína e RNA no intestino (Leleiko et al., 1987). Grimble & Westwood (2000) observaram que a perda de ribossomos do músculo esquelético após um processo inflamatório reduz a exigência de

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novo e aumenta a de salvamento durante a recuperação, visando manter taxas adequadas de síntese de RNA. Já a síntese de RNAr ocorre a uma taxa de 15% ao dia. É provável que o aumento na exigência de nucleotídeos seja satisfeita pela via de salvamento, onde participam os nucleotídeos da dieta. Quanto ao fígado, a síntese de RNAr ocorre a uma taxa de 12-25% ao dia, sendo baixa em comparação à quantidade de proteína sintetizada no fígado. O fígado é bem adaptado à rápida indução do suprimento de nucleotídeos para a síntese de RNA e DNA, no entanto é altamente dependente da síntese de pirimidinas via salvamento. Para o intestino, a síntese de RNAr nas criptas do jejuno depende da obtenção de pirimidina obtida por via de salvamento. Por outro lado, a incorporação de pirimidinas sintetizada pela via de novo para formar o RNAr é baixa, porém contribuiu muito para a síntese de RNAm. A ocorrência de uma inflamação no intestino aumenta a síntese de RNAr e, consequentemente, a exigência de pirimidinas e purinas via salvamento. Com base nas considerações acima, pode-se afirmar que embora durante muito tempo os nucleotídeos e os nucleosídeos não tenham sido considerados nutrientes dieteticamente essenciais, isto pode não ser verdadeiro. Partiu-se sempre do principio de que os animais poderiam sintetizar as quantidades adequadas destes compostos necessários para o crescimento e desenvolvimento normal dos animais. Entretanto, como já citado anteriormente alguns tecidos como a mucosa intestinal, a medula óssea, e as células hematopoiéticas e cerebrais apresentam capacidade limitada de síntese de novo de nucleotídeos, dependendo fundamentalmente da via de salvamento (Yamamoto et al.,1997). Outro importante fator a ser considerado é que as empresas que comercializam as leveduras têm trabalhado no sentido de oferecer ao mercado produtos com uma ótima qualidade nutricional. Desta forma, vale ressaltar que a utilização dos alimentos e de seus subprodutos na alimentação dos animais se baseia principalmente, no conhecimento obtido pela análise proximal, dos valores de digestibilidade e de disponibilidade dos nutrientes e de seu desempenho (Ferreira et al., 1997). Atualmente, milhões de toneladas de subprodutos animais e vegetais são produzidos pelas indústrias e se esse material não for utilizado reciclado em rações animais, passam a ser considerados resíduos industriais, causando perda econômica para os setores de processamento (Vieites, 2000).

UTILIZAÇÃO DAS LEVEDURAS NAS DIETAS Do ponto de vista ambiental, a necessidade de maximizar a utilização do nitrogênio da dieta com o objetivo de diminuir a contaminação ambiental, tem desafiado os nutricionistas a desenvolverem novas técnicas visando uma melhor utilização dos nutrientes. Na literatura, os valores relativos à

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composição química de levedura, indicam grande variabilidade no conteúdo protéico e de aminoácidos. Para uma maior precisão na formulação das dietas com o objetivo de melhorar o desempenho animal, é importante observar suas exigências nutricionais com base em seu conteúdo digestível (Lemme et al., 2004). A maioria dos dados publicados sobre digestibilidade de aminoácidos em alimentos para as aves, é baseada na digestibilidade das excretas. Por outro lado, os valores de digestibilidade são melhor caracterizados pela quantidade absorvida até o final do íleo, uma vez que os aminoácidos não absorvidos nesta parte do intestino delgado, são degradados por microorganismos a diferentes taxas no intestino grosso. Araujo et al., (2009) avaliaram a digestibilidade de aminóacidos da levedura inativada e hidrolisada e observaram melhor valor de digestibilidade para a levedura hidrolisada (Tabela 2).

Tabela 2. Digestibilidade dos aminoácidos das diferentes leveduras.

Araujo et al., 2009

Barbalho et al. (2009) avaliou o desempenho de frangos de corte alimentados com dietas contendo levedura hidrolisada e plasma sanguíneo no periodo de 1 a 21 dias e não observou diferenças no desempenho das aves ao final do período experimental. Em outro trabalho, avaliando o efeito de diferentes niveis de inclusão (0%, 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8% e 1.0%) de levedura hidrolisada, no período de 1 a 14 dias, sobre o desempenho de frangos de corte Barbalho (2009) observou melhor ganho de peso com a inclusao de 1% de levedura na dieta dos animais aos 14 dias. Após este período os animais receberam a mesma dieta, sem a inclusão de levedura, até os 42 dias quando observou-se os mesmos resultados encontrados no período inicial (Tabela 3). Andrade (2009) avaliou o uso de levedura hidrolisada sobre a performance e a morofometria dos orgãos de leitões aos 34 dias. A autora não observou efeito sobre morfometria dos órgãos digestórios mas o peso do baço foi maior para leitões recebendo a dieta contento levedura hidrolisada.

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Tabela 3. Efeito dos diferentes níveis de inclusão da levedura hidrolisada na dieta de frangos de corte no período de 1 a 14 dias sobre o desempenho aos 42 dias.

Barbalho, 2009

Tabela 4. Pesos relativos dos órgãos digestórios e não digestórios (baço), do comprimento do intestino delgado (comp. ID), comprimento relativo (CR) e da relação peso:comprimento do intestino delgado, em função dos tratamentos.

Andrade (2009)

Nas Tabelas 5 e 6 são apresentados os dados de desempenho e rendimento de carcaçaalimentadas com diferentes fontes e níveis de levedura na dieta de frangos de corte. Não foram encontradas diferenças significativas para as características de desempenho no período de 1 a 14 dias . Entretanto, quando realizado o contraste entre os tratamentos pode-se perceber que as aves recebendo a levedura inativada e a levedura autolizada apresentaram ganho de peso 3% e 7% acima do tratamento controle (p<0,05). Além disso, no período total do experimento, 1 a 42 dias, o fornecimento de 0,6% de levedura autolisada na dieta resultou em maior ganho de peso corporal (p<0,05). Não houve, porém, efeitos sobre o consumo

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de ração e conversão alimentar dos animais. Da mesma forma, as características de carcaça como rendimento de carcaça, peito e pernas também não foram afetadas pelos diferentes tratamentos experimentais. Através da análise de regressão, pela derivação da equação GP = 2,744 + 0,3788X, determinou-se que o melhor nível de inclusão da levedura autolisada foi de 0,59 %. No período total de criação não ocorreu diferenças entre o tratamento controle e as aves recebendo a levedura inativada. As diferenças de resultados entre as leveduras avaliadas pode ser decorrente do tipo de processamento pelo qual as mesmas são submetidas resultando em maior disponibilidade de nutrientes e melhor aproveitamento pela ave.

Tabela 5. Desempenho de frangos de corte alimentados com diferentes tipos e níveis de levedura.

Valadares et al., 2010a

Tabela 6. Rendimento de carcaça de frangos de corte alimentados com diferentes tipos e níveis de levedura.

Valadares et al., 2010a

Em outro trabalho, Valadares et al. (2010b) avaliaram programas alimentares para frangos de corte utilizando diferentes fontes de levedura na dieta. Pode-se observar na Tabela 7, no período de 1 a 14 dias, que o consumo de ração não foi alterado em função dos diversos tratamentos estudados

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(p>0,05). Entretanto, o fornecimento da dieta contendo levedura hidrolisada apresentou melhor ganho de peso e conversão alimentar, quando comparados aos demais tratamentos, sendo o ganho de peso, em média, 5,7% maior que o tratamento utilizando antibiótico promotor de crescimento (p<0,05). Observa-se também que as aves alimentadas com a dieta sem a suplementação de antibióticos apresentaram menor ganho de peso e pior conversão alimentar (p<0,05). Embora as aves alimentadas com a dieta contendo levedura autolisada tenham apresentado o mesmo desempenho que as aves alimentadas com a dieta controle positivo, com a suplementação de antibióticos, a sua utilização demonstra a possibilidade de substituição dos promotores de crescimento sem o comprometimento no desempenho dos animais. No período total de criação, 1 a 42 dias (Tabela 8), o programa representado pelo fornecimento de levedura autolisada durante toda a fase de criação apresentou maior consumo de ração e pior conversão alimentar quando comparado aos demais tratamentos (p<0,05). Observa-se também que o fornecimento da levedura hidrolisada até os 14 dias e da levedura autolisada até o período de abate apresentou melhor resultado de desempenho para os animais (p<0,05). As características de carcaça não foram afetadas pelos tratamentos estudados, de acordo com os resultados descritos na Tabela 9 (p>0,05).

Tabela 7. Desempenho de frangos de corte alimentados com diferentes programas nutricionais no período de 1 a 14 dias.

Valadares et al., 2010b

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Tabela 8. Desempenho de frangos de corte alimentados com diferentes programas nutricionais no período de 1 a 42 dias.

Valadares et al., 2010b

Tabela 10. Características de carcaça de frangos de corte alimentados com diferentes programas de alimentação.

Valadares et al., 2010b

CONCLUSÕES Os trabalhos realizados com a utilizacão de leveduras na dieta dos animais demonstram seus efeitos positivos sofre diferentes parâmetros de produtividade. Devido a tendência mundial de diminuição ou até mesmo de substituição total do uso de antibióticos na alimentação animal, as leveduras desempenham um papel cada vez mais importante na produção animal como um aditivo promotor de crescimento. Contudo, é necessário a realizaçao de novos trabalhos comparando os efeitos das leveduras inativadas e hidrolisadas elucidando os seus efeitos na alimentação animal.

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CAPÍTULO VII

FONTES DE GORDURA NA ALIMENTAÇÃO DE VACAS LEITEIRAS:

Fluxo intestinal de ácidos graxos e manipulação do perfil de ácidos graxos do leite

Francisco Palma Rennó, Beatriz Conte Venturelli, José Esler de Freitas Júnior, Jefferson Rodrigues Gandra, Rafael Villela Barletta, Flávio

Garcia Vilela, Anaí Bacci Naves, Lenita Camargo Verdurico

Departamento de Nutrição e Produção Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo

RESUMO Objetivou-se nesta revisão de literatura discutir como as diferentes fontes de gordura influenciam o fluxo intestinal de ácidos graxos e afetam o perfil de ácidos graxos do leite em vacas leiteiras. A grande variação entre a gordura da dieta e a gordura secretada ou depositada em ruminantes está nas mudanças ocorridas no perfil dos ácidos graxos durante o processo de digestão. Os estudos conduzidos nas últimas décadas têm buscado entender de forma concreta como ocorre o metabolismo digestivo de vacas leiteiras suplementadas com fontes de gordura. Entretanto, diante das descobertas de intermediários do processo de biohidrogenação aliada a dinâmica ruminal, em diferentes sistemas de produção, os resultados observados na literatura sobre fluxo e alterações no perfil de ácidos do leite são inconsistentes. É possível afirmar que pouco se sabe sobre o efeito da inclusão de sementes de oleaginosas, como o grão de soja em altos níveis da dieta de vacas leiteiras, e seus efeitos sobre o processo de fluxo intestinal e alteração da composição do perfil de ácidos graxos do leite. Contudo, a grande diversidade de métodos de coleta e técnicas para avaliar o fluxo intestinal tem desviado o objetivo final em busca dos efeitos das fontes de gordura. Portanto, novos estudos são necessários que permitam a avaliação da utilização de fontes de gordura em animais de alta produção e que permitam a recomendação de níveis e fontes adequadas de ácidos graxos em diferentes fases de produção e com diferentes objetivos nutricionais.

Palavras chave: fluxo intestinal, ácidos graxos, vacas leiteiras

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INTRODUÇÃO A utilização de diferentes fontes de gordura suplementar nas rações de vacas leiteiras tem sido prática comum na alimentação, principalmente por permitir melhoria do status energético desses animais. Entretanto, quando se avalia a suplementação de rações para ruminantes com fontes de gordura, todos os processos fisiológicos devem ser levados em consideração, pois o metabolismo ruminal, a absorção intestinal, o transporte e o metabolismo sistêmico, a secreção e a deposição de gordura no organismo são aspectos diretamente ligados ao metabolismo de lipídios e podem influenciar as respostas fisiológicas de animais recebendo gordura nas rações (Christensen et al.,1994). A suplementação de gordura tem algumas vantagens, dentre as quais podemos citar: a disponibilidade comercial de fontes de boa qualidade, aumento da eficiência do uso de energia com um menor consumo de matéria seca, aumento da eficiência do uso de energia em decorrência de menor incremento calórico, aumento parcial da eficiência da produção de leite pela incorporação direta da gordura da dieta na gordura do leite, substituição de carboidratos rapidamente fermentáveis visando à otimização de consumo de forragem e fermentação ruminal (participação de nutrientes para a secreção do leite), aumento da flexibilidade para o preparo da ração, utilizados para modificação da composição da gordura do leite ou de tecidos para aceitação pelo consumidor e aumento da absorção de nutrientes solúveis (NRC, 2001; Palmquist & Mattos, 2006). Os lipídeos em dietas de ruminantes estão presentes principalmente na forma esterificada, como mono e digalactoglicerídeos em forragens e como triglicerídeos em alimentos concentrados. Diferentes fontes de gordura têm sido utilizadas nas rações de vacas leiteiras, sendo que cada uma delas possuem características específicas que conferem diferentes efeitos sobre a fermentação ruminal, digestibilidade de nutrientes, consumo de matéria seca, e produção e composição do leite. Os produtos a base de soja possuem grande percentual de ácidos graxos insaturados, principalmente o óleo de soja, em média, com 75% de insaturação. Óleos vegetais nas rações de ruminantes apresentam efeitos desejáveis, como inibição da produção de metano, redução da concentração de N-NH3 ruminal, aumento na eficiência da síntese microbiana e aumento de acido linoléico conjugado (CLA) (Palmiquist & Mattos, 2006). Por outro lado, a utilização de óleos vegetais, mais especificamente para vacas leiteiras, pode causar efeitos indesejáveis, como a redução na digestibilidade da matéria seca, redução na relação acetato:propionato e conseqüente diminuição da gordura do leite (Vargas et al., 2002). O grão de soja integral é outra fonte utilizada para vacas leiteiras.

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Entre as características nutritivas, destaca-se a alta quantidade de proteína degradável no rúmen (PDR), que pode ser convertida em proteína não degradada no rúmen (PNDR) por meio de tratamento térmico, e ao seu alto teor de energia devido ao elevado teor de extrato etéreo. De acordo com o NRC (2001) e Valadares Filho et al. (2006), a soja crua possui cerca de 19,20 % de extrato etéreo e 39,20 % de proteína bruta na matéria seca. Segundo Bateman & Clark (2000), a utilização do grão de soja nas rações de vacas leiteiras pode proporcionar aumentos na produção de leite maiores do que quando se utiliza quantidades semelhantes de farelo de soja na ração. O grão de soja integral (GSI) ainda destaca-se pela sua disponibilidade regional, pelo elevado teor de ácidos graxos insaturados e pela grande aceitação pelos animais (Palmquist, 1991; Rabello et al., 1996; Palmquist & Mattos, 2006). Existem no mercado diversos tipos de suplementos comerciais contendo lipídios inertes no rúmen. O mais comum deles são os sais de cálcio de ácidos graxos, obtido a partir de ácidos graxos de cadeia longa. Esses ácidos graxos reagem com os sais de cálcio, unidos na forma de um sal do tipo R-COO-Ca, popularmente conhecido como sabão de cálcio. Considerando que ocorram possíveis efeitos deletérios da suplementação de algumas fontes de gordura insaturadas sobre a fermentação ruminal, esses produtos comerciais teriam como principal vantagem fornecer ácidos graxos essenciais que iriam passar direto para o abomaso sem que ocorresse liberação de ácidos graxos no rúmen, e conseqüentemente, intensa biohidrogenação ruminal, não afetando diretamente a população microbiana. Independentemente da fonte de gordura fornecida, o que ocorre no rúmen dos animais são processos da quebra e saturação denominados, respectivamente, de lipólise e biohidrogenação dos ácidos graxos pela microbiota ruminal. A lipólise corresponde ao início do processo de metabolismo dos lipídeos no rúmen, sendo imprescindível para que ocorra a biohidrogenação (Harfoot & Hazlewood, 1988). Segundo Church (1993) nem todas as bactérias possuem atividade lipolítica, o mesmo acontecendo com os protozoários do rúmen. O processo de biohidrogenação pode ser considerado um mecanismo de autodefesa dos microrganismos ruminais, que convertem ácidos graxos insaturados em ácidos saturados, que são conseqüentemente menos tóxicos a população microbiana ruminal. Os ácidos graxos reagem com íons de cálcio insolúveis que, portanto, se tornam atóxicos em nível de rúmen (Palmquist & Mattos, 2006). Embora a biohidrogenação possa ser alta, acima de 90%, a intensidade a qual esse processo é realizado depende das características das fontes de gordura, tempo de retenção da fonte de gordura no rúmen e características da população microbiana (Allen, 2000). Os fatores importantes na digestão e absorção de lipídeos no intestino

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delgado (duodeno e abomaso) de ruminantes são: a natureza e conformação dos ácidos graxos e o pH mais alto do intestino. Os ácidos graxos do conteúdo intestinal são mais saturados e não esterificados (70 a 80%) (Scott & Lough, 1971; Harrison & Leat, 1972). Em ruminantes, os ácidos graxos de cadeia curta (C2 a C6) são absorvidos pelo rúmen e em menor medida pelo abomaso. Maior parte do acetado e especialmente o butirato são convertidos em corpos cetônicos (acetotacetato e β-hidroxibutirato) durante a absorção. Os ácidos graxos de cadeia média são absorvidos no intestino delgado e secretado como ácidos graxos não-esterificados (AGNE) na veia porta (Andrews & Lewis, 1970). Os ácidos graxos de cadeia longa são absorvidos pelas células epiteliais do intestino delgado e são esterificados (Arienti ETA al., 1974). Esse triglicerídeo incorporado por um quilomicron e uma lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) e transportado pela via porta para os tecidos periféricos. O fluxo intestinal tem grande importância para a distribuição dos ácidos graxos pelos tecidos e a chegada a glândula mamária de vacas leiteiras que tem seu perfil alterado. Um dos componentes do leite que sofre alteração com a utilização de lipídeos na dieta é a gordura do leite, que é composta primeiramente por aproximadamente 98% por triglicerídeos. E sua diferença com os monogástricos é que apresentam uma alta quantidade de ácidos graxos de cadeia curta. A gordura do leite contém 17 ou mais tipos de ácidos graxos, variando quanto ao número de carbonos na cadeia de 4 a 20. Os ácidos graxos com cadeias de 18 a 20 carbonos passam do sangue para a glândula mamária e têm origem na dieta ou na síntese de ácidos graxos feita pelo tecido adiposo do bovino e representam cerca de 55% dos ácidos graxos presentes no leite. Cerca de 50% dos ácidos graxos com 16 carbonos (palmítico) também tem origem na dieta e no tecido adiposo, enquanto a outra metade é sintetizada pela própria glândula mamária, principalmente a partir de acetato resultante da fermentação ruminal. Cadeias de carbono variando de 4 a 14 átomos são sintetizadas na glândula mamária. Os ácidos graxos do leite podem não sofrer alterações pela dieta do ruminantes devido as duas formas de obtenção da gordura: síntese de novo que ocorre na glândula mamária e por absorção do lipídeo sanguíneo. O objetivo desse trabalho é discutir como as diferentes fontes de gordura influenciam o fluxo intestinal de ácidos graxos e afetam o perfil de ácidos graxos do leite em vacas leiteiras.

LIPÓLISE E BIOHIDROGENAÇÃO De acordo com Jenkins & Jenny (1992) e Jenkins (1993), o processo de digestão de lipídeos em ruminantes pode ser resumido por duas principais etapas, sendo: lipólise e biohidrogenação de ácidos graxos insaturados. A cinética ruminal do processo de digestão de lipídeos, resumida nestes dois

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processos, tem sido objeto de estudo por vários anos (Butler, 1952; Hawke & Silcock 1969). Além disso, o processo de biohidrogenação reduz o fluxo intestinal de ácidos graxos poliinsaturados para duodeno e contribui para o acúmulo de isômeros do CLA, cis e trans, em produtos derivados de ruminantes. Atualmente o processo de biohidrogenação tem sido estudado in vitro, in situ e in vivo na tentativa de conhecer, de forma mais precisa, esse processo, assim como os modelos para sua estimativa (Bauman et al., 2008; Chilliard et al., 2007; Jenkins & Brigdes, 2007). Havertine & Allen (2006) avaliaram a utilização de ácidos graxos saturados, insaturados e uma mistura das duas fontes (50%/50%) em vacas leiteiras fistuladas no rúmen e abomaso no inicio de lactação. Estes autores observaram alterações no fluxo de ácidos graxos para o duodeno devido ao processo de biohidrogenação e redução da digestibilidade destes na dieta, sendo estes efeitos vinculados ao tipo de ácido graxo predominante na dieta. Lundy et al. (2004) avaliaram o efeito da suplementação com óleo de soja, sais de cálcio de ácidos graxos insaturados (óleo de soja), e a mistura de ambos em 2,75 % na matéria seca total das rações, e avaliaram a biohidrogenação ruminal em quatro vacas Holandesas canuladas no rúmen no terço médio de lactação. Estes autores verificaram que a biohidrogenação variou de 90 a 92% e não houve diferença entre as rações experimentais, concluindo que a biohidrogenação diminuiu significativamente com a mistura de óleo de soja e sais de cálcio de ácidos graxos. De forma semelhante, Loor et al. (2004) avaliaram a adição de óleo vegetal em dietas com baixa e alta proporção volumoso:concentrado sobre o processo de biohidrogenação em quatro vacas Holandesas multíparas canuladas no rúmen no início de lactação. Os autores concluíram que as rações com baixo volumoso podem favorecer as condições para reduzir a biohidrogenação de ácidos graxos e aumentar o fluxo duodenal de trans-18:1 para o intestino delgado. Enjalbert et al. (2004) avaliaram o processo de extrusão da semente de canola sobre o tempo e a taxa de biohidrogenação ruminal in vitro e in situ de ácidos graxos insaturados e observaram alteração no perfil de ácidos graxos antes e depois do tratamento. Beam et al. (2000) avaliaram, em cinco experimentos, os fatores que afetam as taxas de lipólise e a biohidrogenação de fontes de gordura no conteúdo ruminal, os quais podem explicar a variabilidade no fluxo duodenal de ácidos graxos insaturados registrados na literatura em função do tipo e nível de suplemento incluído nas rações. De acordo com estes autores, a variação no fluxo duodenal de ácidos graxos depende de sua concentração na dieta. No entanto, o processo de lipólise pode variar consideravelmente com a fonte e o nível de lipídios adicionado na dieta. O processo de lipólise consiste na quebra das ligações éster encontradas nos lipídios dos alimentos da dieta seguida pela biohidrogenação

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de ácidos graxos insaturados, a qual reduz o número de duplas ligações de ácidos graxos insaturados (AGI) advindos das fontes de gordura (Jenkins, 1993; Bauman & Lock, 2006). A hidrólise é predominantemente realizada pelas bactérias ruminais, sendo geralmente alta (>85%) e podendo ser influenciada por alguns fatores, como o nível de gordura na ração, pH ruminal e a utilização de ionóforos, que podem inibir a atividade e crescimento de bactérias (Doreau & Chilliard, 1997; Harfoot & Hazlewood, 1988). A extensão da lipólise é dependente também da natureza do lipídeo da dieta, sendo que óleos de plantas, assim como óleo de linhaça, são quase que completamente hidrolisados (em torno de 90%) enquanto que óleos de origem animal, como exemplo o óleo de peixe, tendem a ser menos hidrolisados (em torno de 50%) (Church, 1993). A grande variação entre a gordura da dieta e a gordura secretada ou depositada em ruminantes está nas mudanças ocorridas no perfil dos ácidos graxos durante o processo de digestão (Byers & Schelling, 1993). Partes dessas mudanças ocorrem no processo de biohidrogenação ruminal, que consiste na adição de íons de hidrogênio nos ácidos graxos com duplas ligações, transformando ácidos graxos insaturados em AG saturados. O passo inicial para a biohidrogenação é uma reação de isomerização que converte a dupla ligação cis-12 no ácido graxo insaturado para o seu isômero trans-11 (Figura 1). As bactérias responsáveis pela biohidrogenação podem ser divididas em dois grupos. O primeiro grupo é responsável pela biohidrogenação do ácido linoléico (C18:2) e ácido linolênico (C18:3) a ácido transvacênico (trans-11 C18:1), com pequenas quantidades de outros isômeros. Este grupo parece ser incapaz de biohidrogenar AG C18:1 a ácido esteárico (C18:0). As bactérias do segundo grupo, ao contrário das bactérias do primeiro, são capazes de biohidrogenar uma grande extensão de cis e trans C18:1 a C18:0 (Demeyer & Doreau, 1999). A isomerase não é funcional a menos que o ácido graxo esteja na forma livre, o que ocorre no caso de ácidos graxos poliinsaturados, assim como C18:2. A manutenção de baixos valores de pH no rúmen através da utilização de dietas com alto concentrado, pode se constituir em uma estratégia para a proteção de fontes suplementares de lipídeos insaturados (óleos) contra a biohidrogenação, possibilitando que mais ácidos graxos insaturados cheguem ao intestino, onde poderão então ser absorvidos e incorporados à gordura do leite (Van Nevel & Demeyer, 1996b).

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Figura 1. Biohidrogenação ruminal. Adaptado de Chilliard et al. (2007).

Embora o processo possa ser eficiente (90%), o grau de hidrogenação é dependente das características químicas das fontes de gordura utilizadas, do tempo de retenção no rúmen, e das características da população microbiana presente no rúmen-retículo (RR) (Bickerstaffev & Warner, 1968). A biohidrogenação aumenta com o grau de insaturação de ácidos graxos (AG), e pode ser reduzida pelo grau de insaturação das rações (Wu, 1991). Além disso, a extensão pela qual este processo ocorre depende também da freqüência de alimentação (NRC, 2001). De acordo com NRC (2001) a estimativa de hidrogenação de AGPI varia de 60 a 90%, enquanto que a biohidrogenação de suplementos que contém AGPI pode ser de 30 a 40% se os ácidos graxos são fornecidos como sais de cálcio de ácidos graxos. No entanto, a maior parte dos estudos in vivo com bovinos se referem a utilização de animais em crescimento ou vacas secas, canuladas no rúmen ou então no rúmen e abomaso, nas estimativas do percentual de biohidrogenação ruminal e fluxo intestinal de ácidos graxos. Assim, em diversos momentos os dados obtidos não necessariamente são fidedignos para vacas em lactação, que apresentam alta taxa de passagem de digesta no rúmen-retículo, além de características dietéticas distintas na alimentação destes animais quando comparados com animais que não estão em produção. A utilização de AG inertes, como na forma de sais de cálcio, é também uma prática que pode ser empregada para evitar ou reduzir as modificações na composição dos AG resultantes do metabolismo ruminal (Chouinard et al., 2001). Porém, apenas em situações de alto pH ruminal não ocorre a dissociação dos sais de cálcio de AG insaturados e estes são então parcialmente protegidos da biohidrogenação pela ausência de um grupo carboxila livre. Portanto, para se obter uma maior eficiência de proteção dos sais de cálcio de AG insaturados é necessário manter um pH relativamente alto

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através da utilização de agentes alcalinizantes ou substâncias tamponantes, aumento da freqüência da alimentação ou fornecimento dos sais de cálcio após a alimentação (Van Nevel & Demeyer, 1996b). O grau de saturação se apresenta como uma das principais características inerentes ao tipo de gordura suplementada que pode interferir diretamente no metabolismo ruminal podendo afetar o aproveitamento de nutrientes. Os produtos a base de soja possuem grande percentual de ácidos graxos insaturados, principalmente o óleo de soja, em média, com 75% de insaturação. Óleos vegetais nas rações de ruminantes apresentam efeitos desejáveis, como inibição da produção de metano, redução da concentração de N-NH3 ruminal, aumento na eficiência da síntese microbiana e aumento de acido linoléico conjugado (CLA) (Palmquist & Mattos, 2006). Explorar o processo de biohidrogenação pela característica especifica de ácidos graxos poliinsaturados como óleos na tentativa de aumentar a concentração de ácidos graxos como o cis-9 trans-11 CLA no leite tem sido objeto de estudo nos últimos anos. Isso pode ser justificado pelo aumento do processo de biohidrogenação quando grandes quantidades de ácidos graxos poliinsaturados são fornecidas nas rações (Zheng et al., 2005). Entre as vantagens de uso do grão de soja integral como fonte de gordura pode ser citada a lenta liberação de lipídios no rúmen, não superando a capacidade de hidrogenação dos microrganismos ruminais, impedindo possível perda de digestibilidade de fibra pelo efeito negativo que gorduras insaturadas prontamente disponíveis no rúmen podem causar nas bactérias fibrolíticas (Coppock & Wilks, 1991; Palmquist, 1991). Isso ocorre em sementes de oleaginosas porque a maioria dos lipídios encontra-se no germe e, portanto, há necessidade da degradação da parede celular para que a hidrolise se inicie. Apesar da reconhecida capacidade de sementes de oleaginosas em fornecerem AGPI para absorção no intestino delgado, faltam estudos caracterizando a utilização destas fontes de gordura associadas a animais em lactação. Além disso, sementes de oleaginosas como o grão de soja e caroço de algodão ainda não foram avaliados adequadamente em relação ao potencial em fornecer AGPI para absorção intestinal e, desta formas, atuarem não somente como fonte de energia, ma também como nutracêutico na nutrição de vacas leiteiras.

FLUXO INTESTINAL DE ÁCIDOS GRAXOS Os ácidos graxos presentes nas forragens, cereais e fontes oleaginosas são na sua maioria ácidos graxos poliinsaturados C18 (18:2n-6 e 18:3n-3), alguns óleos vegetais são ricos em ácidos graxos monosaturados (C9-C18:1) e produtos de origem marinha (óleo de peixe, algas, etc) são ricos em ácidos graxos de cadeia longa [C20:5n-3 (EPA) e 22:6n-3 (DHA)]. Esses alimentos

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são metabolizados no rúmen que resulta na produção não somente de C18:0, mas isômeros de ácidos graxos poli e monosaturados que vão para o intestino. A maioria dos ácidos graxos que chegam ao duodeno são não esterificados. Eles são absorvidos no intestino e no enterócito sofrem ação da ∆-9 desaturase (Bickerstaffe et al., 1972), mas de uma maneira limitada. Esses ácidos são esterificados nos enterócitos e exportados para o organismos na forma de quilomicrons e lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL). Ao comparar a proporção dos ácidos graxos essenciais e não-essenciais do sangue com o duodeno ocorre uma diferença, a concentração de C18:2n-6 e C18:3n-3 é mais alta no plasma (Glasser et al., 2007). As características dos ácidos graxos são compostas de C18:0 e C9-C18,1 (Enjalbert et al, 1998; Kitessa et al., 2001) semelhante ao encontrado no duodeno e estes que vão para a glândula mamária ser utilizados na síntese de gordura do leite, já os fosfolipídios e o colesterol (não necessariamente serão utilizados pela glândula mamária (58)) são ricos em C18:2n-6 e C18:3n-3, que difere do encontrado no duodeno. Kalscheur et al., (1997a) avaliando o efeito de fontes de gordura no fluxo de trans-C18:1 para o duodeno, observaram que houve uma incompleta biohidrogenação, representada pelo aumento do fluxo de trans-C18:1 para o duodeno, em vacas alimentadas com dietas suplementadas com óleo de girassol com alto conteúdo de ácido oléico e linoléico. No entanto, apesar do aumento de trans-C18:1 ser maior no leite de vacas com reduzido teor de gordura, o autor acredita não haver uma associação constante entre a quantidade total de trans-C18:1 no leite e uma diminuição no teor de gordura do leite. Loor et al., (2004) avaliou o efeito de dietas de alto concentrado com e sem óleo de linhaça em vacas em lactação sobre o fluxo intestinal de isômeros cis e trans de C18:1 e C18:2. O autor observou uma redução no fluxo de ácidos graxos de cadeia média (C14, C15 e C16) nos animais que receberam uma dieta de alto concentrado e atribuiu tal resultado a baixa produção de acetato, isobutirato e isovalerato. Dessa forma pode concluir que houve menor síntese desses ácidos graxos no rúmen, confirmando que a suplementação com ácidos graxos insaturados o que leva a uma redução dos ácidos que irão para o duodeno. Em dietas de alto concentrado (80c:20v) ocorre um importante efeito sobre a biohidrogenação ruminal devido as alterações na população microbiana do rúmen. A população de bactérias celulolíticas é reduzida quando comparada a população de bactérias as amilolíticas (Latham et al., 1972). Com a diminuição da biohidrogenação, ocorre aumento nos níveis de ácido linoléico e assim aumenta a chance de isomeração desse ácido para a forma trans 10, cis12-18:2. Esse efeito pode ser visto pelo aumento desse isômero no leite de vacas que receberam dietas com altas quantidades de concentrado (Piperova et al., 2002). No estudo de Loor et al. (2004), não foi observado esse aumento

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que pode ser devido a rápida hidrogenação desse isômero para o trans 10-18:1 que teve um grande aumento no duodeno. Loor et al. (2004) confirmaram os estudos feitos in vitro relacionados a produção dos isômeros de C18:2 encontrados no duodeno. O primeiro AG a ser hidrogenado é o C18:3n-3, tem também o C18:2n-6 resultado da isomeração. Os autores observaram também uma redução desses dois isômeros quando o óleo de linhaça foi adicionada na dieta, isso se deve pelo aumento de intermediários ruminais formados (trans9, cis12-18:2; cis9, trans13-18:2; trans9, trans12-18:2 e trans11, cis15-18:2). Glasser et al., (2008) em meta-análise sobre o fluxo duodenal de ácidos graxos C18 e C4 ao C16, concluíram que os óleos vegetais tem alta correlação no aumento de isômeros C18 no duodeno pela biohidrogenação ruminal. Os autores concluíram que existe uma relação positiva para a quantidade de isômeros C18 no duodeno com o C18 do leite. O C18 do leite tem um equilíbrio na proporção com os AG <C16 e tem um limite por mais que o fluxo duodenal seja muito intenso, isso não acarretará um grande aumento no C18 do leite. Jenkins & Bridges (2007) elaboraram revisão de literatura de 25 artigos com animais canulados, sendo bovinos de corte e vacas leiteiras, sobre suplementação de diferentes fontes de gordura e produção de ácidos graxos (Tabela 1). Os autores concluíram que fontes de gordura desprotegidas têm uma perda de ácidos graxos insaturados no rúmen de 86% de ácido linolênico e oléico e 82% de ácido linoléico. Para os animais que receberam dietas sem adição de gordura, o fluxo intestinal normal foi de 45, 38 e 5g/dia para os ácidos oléico, linoléico e linolênico, respectivamente (Tabela 2). O aumento do fluxo intestinal dos ácidos graxos insaturados pode ser necessário para atender a demanda dos tecidos por ácidos graxos essenciais ou alterar a composição do perfil de ácidos graxos do leite. Esse aumento é obtido pela suplementação de fontes de ácidos graxos insaturados e a cada fonte tem uma concentração de inclusão para aumentar a mesma quantidade do ácido graxo que passa para o intestino, por exemplo, para cada 100g de ácido linoléico vindos da dieta de gorduras não protegidas tem um aumento do fluxo intestinal de 18g de ácido linoléico, usando óleo de soja como fonte de gordura insaturada é necessário 200g na dieta para ter esse mesmo aumento, por isso altos níveis de fontes de gordura não protegidas podem ter efeito benéfico ou negativo no consumo de matéria seca, fermentação e digestão ruminal e produção de leite. Os autores concluíram também que dietas a base de grãos integrais ou processados e sais de cálcio de ácidos graxos são fontes de gordura protegidas, o que diminuiria a perda no rúmen pela biohidrogenação. As fontes de ácidos graxos comerciais têm uma perda no rúmen maior que os encontrados nos grãos mostrando que existe uma barreira natural da biohidrogenação ruminal

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em sementes oleoginosas.

Tabela 1. Referências e fontes de gordura para fluxo duodenal de 25 estudos com gado de corte e vacas de leite (n=93).

Fonte: Jenkins & Bridges (2007).1 Valor total da concentração de ácidos graxos por g/kg de matéria seca.2 AMD, amida de óleo de soja; AVF, gordura animal-vegetal; CaP, sais de cálcio de ácidos graxos de palma; CaR, sais de cálcio de ácidos graxos de colza; CaS, sais de cálcio de ácidos graxos de óleo de soja; CRSB, grão de soja triturada e tostada; FTWS, girassol tratada com formaldeído, GCS, algodão; GRSB, grão de soja tostado; HLSO, óleo de girassol com alto linoleico, HOSO, óleo de girassol de alto oléico; PHT, talão parcialmente hidrogenizado; PHV, óleo vegetal parcialmente hidrogenizado; SFA, ácidos graxos saturados; T, talão; WCS, casca de algodão; WRSB, casca de soja tostado; WSB, casca de soja; YG, gordura amarela.

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Tabela 2. Efeito das fontes de gordura no consumo diário, fluxo duodenal diário e perda ruminal no total de ácidos graxos insaturados descritos na Tabela 1.

Fonte: Jenkins & Bridges (2007).abc Médias, na linha, seguidas de letras iguais não diferem no teste de Tukey (P<0,05).1 Erro padrão da média.2 Aparente perda ruminal de ácidos graxos espresso em procentagem do consumo de ácidos graxos

SÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS DO LEITE A gordura presente no leite esta na forma de triglicerídeos (98%), que são compostos formados por três moléculas de ácidos graxos unidas na glândula mamária a uma molécula de glicerol. A síntese de triglicerídeos da gordura do leite ocorre nas células epiteliais mamárias. Os precursores usados para a síntese da gordura do leite são glicose, acetato, β-hidroxibutirato e triglicerídeos. Os ácidos graxos de 18 átomos de carbono e alguns de 16 átomos de carbonos da gordura do leite, provem em quase sua totalidade dos triglicerídeos dos quilomicrons e das lipoproteínas de baixa densidade do sangue. Os triglicerídeos nas VLDL são hidrolisados nos capilares mamários pela enzima lipoproteína lípase (LPL). A LPL pode hidrolisar um, dois ou três dos ácidos graxos da cadeia do glicerol, resultando em ácidos graxos livres mais diacilglicerídios, monoacilglicerídios ou glicerol respectivamente. Os ácidos graxos livres, diacilglicerídios, monoacilglicerídios e glicerol podem ser captados pelas células mamárias epiteliais e serem reutilizados para a síntese de triglicerídeos dentro das células (Fonseca, 1993). Estima-se que 25% dos ácidos graxos do leite da vaca são provenientes dos ácidos graxos da dieta. A glândula mamária de ruminantes sintetiza quantidades muito pequenas de ácidos graxos a partir de glicose, pois apresenta

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atividade baixa da enzima citrato liase. O Acetil-CoA utilizado pela glândula mamária dos ruminantes para a síntese de gordura se forma fundamentalmente a partir do acetato, no citoplasma. Estima-se que 30% dos carbonos da gordura do leite sejam provenientes do acetato (Fonseca, 1993). A síntese de pequenas e médias cadeias de ácidos graxos (com menos de 16 carbonos) ocorre na glândula mamária pela síntese de novo (síntese de novas moléculas de ácidos graxos de precursores absorvidos do sangue). A síntese de novo de ácidos graxos ocorre no citoplasma das células mamárias epiteliais. A síntese de novo requer de duas fontes: cadeias carbônicas curtas (acetil- CoA) e equivalentes redutores. A origem destes varia entre as espécies, nos ruminantes, as fontes de carbonos usadas são acetato (mais importante) e β-hidroxibutirato. Os equivalentes redutores necessários para a síntese de ácidos graxos provem do NADPH (Figura 2).

Figura 2 – Metabolismo de gordura do leite

PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS DO LEITE O perfil de ácidos graxos no leite, pode ser alterado por modificações no padrão de fermentação ruminal, espécies de bactérias ruminais (Kalscheur et al., 1997a) e suplementação de CLA e trans-11 C18:1 na dieta (Chouinard et al., 1999; Romero et al., 2000). Os ácidos graxos de cadeia curta e média (C4 ao C14) constituem aproximadamente 20% da quantidade geral de ácidos graxos do leite e são sintetizados pela própria glândula mamária, enquanto que os outros 80% são representados pelos ácidos graxos de cadeia longa C16 e C18 principalmente os ácidos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oléico (C18:1) com as porcentagens 28,2, 13,3 e 29,8 respectivamente (Tabela 2).

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Tabela 3. Denominação dos principais ácidos graxos, efeitos no colesterol sanguíneo e porcentagem de gordura no leite.

Fonte: Adaptado de Lincheer e Vergroesen, 1994; 1Minessota-South Dakota Dairy Foods Research Center; 2Waghor e Baldwing, 1984.

A utilização de suplementação lipídica com altos níveis de ácidos graxos poliinsaturados mostrou-se bastante eficaz no aumento da concentração de CLA e outros ácidos graxos insaturados na gordura do leite. As fontes vegetais como óleo de soja e óleo de linhaça, ricas em C18:2 e C18:3, são particularmente efetivas (Chouinard et al., 2001). O fornecimento de fontes de gordura com alta proporção de ácido linoléico pode efetivamente aumentar a concentração de produção de trans-C18:1 e cis-9, trans-11 C18:2 no leite (Abuchazaleh et al., 2003). Piperova et al. (2000) analisando o CLA da gordura do leite de animais recebendo uma dieta com adição de óleo de soja, encontraram uma redução na concentração de cis-9, trans-11 C18:2 e um aumento nos isômeros trans-10, cis-12 C18:2 e trans-7, cis-9 C18:2. O isômero trans-10, cis-12 C18:2 é provavelmente produzido no rúmen pela ação de uma isomerase específica e então hidrogenado a trans-10 C18:1. O uso de óleos nas rações de vacas leiteiras tem potenciais efeitos sobre o metabolismo ruminal (Bauman & Griinari, 1999). Porém, é preciso considerar que alterações no padrão de fermentação ruminal com a inclusão de fontes de gordura altamente insaturadas pode promover além de reduções no consumo de matéria seca, diminuição na digestibilidade da fibra (NRC, 2001),

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embora sejam aumentados os teores dos isômeros de CLA na gordura do leite visando produtos mais desejáveis ao consumidor. De acordo com Griinari et al. (2000) e Corl et al. (2001), apesar do CLA ser um intermediário da biohidrogenação ruminal do ácido linoléico, a maior fonte desse AG é a síntese endógena, o que envolve a ação da enzima ∆-9 desaturase sobre o trans-11 C18:1, outro intermediário da biohidrogenação ruminal. Isto é comprovado quando se verifica aumento na concentração de CLA na gordura do leite de vacas mantidas em pastagens ou suplementadas com óleo de peixe, fontes reconhecidamente pobres em ácido linoléico. Segundo Freitas Júnior et al., (2010), ao avaliar a concentração de vacênico (C18:1 trans-11) no contraste de rações óleo de soja e sais de cálcio esta última apresentou maior concentração deste ácido graxo indicando que ocorreu de certa forma maior biohidrogenação para a ração contendo essa fonte de gordura. Teoricamente aumentos na proporção de ácidos graxos insaturados nas rações, promoveria redução na proporção de ácidos graxos insaturados/saturados C18, mas também promoveria aumentos na concentração de trans-C18:1 como resultados de biohidrogenção. Essa relação ocorreu neste estudo (Tabela 4) através da utilização de óleo de soja. Entretanto de todas as rações experimentais a ração contendo sais de cálcio de ácidos graxos apresentou maior concentração de trans-C18:1 podendo se concluir dessa forma, que houve biohidrogenação deste suplemento e que a determinação deste ácido graxo foi essencial para este estudo de ácidos graxos do leite de vacas suplementadas com fontes de gordura. De forma geral, como conseqüência a grande mudança no perfil de ácidos graxos para as rações avaliadas foi à redução na secreção de ácidos graxos contendo menos que 16 carbonos (<16 C). Conseqüentemente, a composição da gordura do leite foi alterada promovendo aumento correspondente na porcentagem da maioria dos ácidos graxos (>16 C). Esses resultados foram também foram observados em outros estudos (Chouinard et al., 1999a,b; Baumgard et al., 2000, 2001; Peterson et al., 2002; Loor & Herbein, 2003; Mackle et al., 2003).

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Tabela 4. Perfil de ácidos graxos da gordura do leite (g/100g de AG) obtidos para as rações experimentais

Fonte: Freitas Júnior et al. (2010).1controle; 2oleo de soja; grão de soja; 4sais de cálcio de ácidos graxos (Megalac-E®). C1= controle versos fontes de gordura (óleo de soja, grão de soja e sais de cálcio de ácidos graxos);C2= grão de soja versos sais de cálcio e óleo de soja;C3= óleo de soja versos sais de cálcio.

Barletta (2010) avaliou dietas para vacas leiteiras utilizando níveis crescentes de grão de soja cru e integral, e verificou que apesar da adição do grão de soja resultar em maior teor de extrato etéreo nas dietas, não houveram alterações significativas no perfil de ácidos graxos do leite (Tabela 5). Quando se avalia a concentração dos isômeros C18:1 trans-11, C18:2 cis 9, trans 11 e C18:2 trans 10, cis 12 verifica-se concentrações semelhantes entre as dietas experimentais. Estes resultados demonstram que não houve aumento da extensão de biohidrogenação de ácidos graxos com a inclusão de grão de soja cru e integral nas dietas, nem mesmo quando o teor de extrato etéreo das rações foi aumentado. De forma semelhante, esses resultados também foram relatados por Jenkins & Bridges (2007) em um estudo analisando 25 referências com diferentes fontes de gordura.

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Tabela 5. Médias, erro padrão da média (EPM), para o perfil de ácidos graxos (g/100g de AG) de acordo com as rações experimentais

Fonte: Barletta (2010).1 Controle (C), (8%), inclusão de 8% de grão de soja cru inteiro na dieta total, (16%), inclusão de 16% de grão de soja cru inteiro na dieta total, (24%), inclusão de 24% de grão de soja cru inteiro na dieta total.2 Probabilidades de resposta linear (L), ou quadrática (Q). Médias seguidas de letras diferentes nas linhas se diferenciam em 5% no teste de TUKEY ajustado pelo PROC MIXED.

Por outro lado, Naves (2010) avaliou diferentes formas de processamento de grão de soja cru, sendo fornecido integral ou moído em duas peneiras, de 2 e 4 mm. Os resultados obtidos demonstraram que a concentração dos isômeros C18:1 trans-11 e C18:2 trans 10, cis 12 variaram entre as dietas experimentais, notadamente nas dietas com grão de soja moído, em ambas as peneiras. Estes resultados demonstraram que houve aumento da extensão de biohidrogenação de ácidos graxos com a inclusão de grão de soja cru e moído nas dietas, diferentemente do que ocorre com o grão de soja servido integral. Provavelmente este efeito ocorreu devido a moagem do grão de soja, que perdeu sua proteção natural e assim sofreu maiores efeitos da biohidrogenação

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ruminal, aumentando a quantidade de determinados ácidos graxos no intestino delgado, para absorção, e na gordura do leite (Tabela 6).

Tabela 6. Perfil de ácidos graxos de acordo com as rações experimentais

Fonte: Naves (2010). 1 Controle; 2 Grão de soja integral, 20% MS; 3 Grão de soja moído em peneira de 2 mm, 20% MS; 4 Grão de soja moído em peneira de 4 mm, 20% MS. 5 C1 = controle vs com grão de soja (GI+G2+G4); C2 = grão integral vs grão de soja moído (G2+G4); C3 = grão de soja moído em peneira de 2 mm vs grão de soja moído em peneira de 4 mm.

CONSIDERAÇÕES FINAIS Baseado no explanado, é possível afirmar que pouco se sabe sobre o efeito da inclusão de sementes de oleaginosas, como o grão de soja em altos níveis da dieta de vacas leiteiras, e seus efeitos sobre o processo de fluxo intestinal e alteração da composição do perfil de ácidos graxos do leite. Contudo, a grande diversidade de métodos de coleta e técnicas para avaliar o fluxo intestinal tem desviado o objetivo final em busca dos efeitos das fontes de gordura. Portanto, novos estudos são necessários que permitam a avaliação da utilização de fontes de gordura em animais de alta produção e que permitam

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a recomendação de níveis e fontes adequadas de ácidos graxos em diferentes fases de produção e com diferentes objetivos nutricionais.

AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Sr. Antônio Carlos Bueno da Silva, funcionário responsável pelo Laboratório de Pesquisa em Bovinos de Leite do Departamento de Nutrição e Produção Animal da FMVZ-USP, pelo imprescindível auxílio na realização dos projetos de pesquisa. Agradecem também a FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo auxílio ao desenvolvimento dos projetos de pesquisa.

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CAPÍTULO VIII

USO DE ENZIMAS EXÓGENAS NA ALIMENTAÇÃO DE FRANGOS DE CORTE

Teresa Cristina de Freitas¹, Lara Santa Cruz Valadares¹, Luis Carlos Garibaldi Simon Barbosa¹, Bárbara Volpi de Freitas¹, Ricardo de

Albuquerque¹, Lúcio Francelino Araújo¹, ², Cristiane Soares da Silva Araújo¹,

¹Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP²Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP

RESUMO Um dos grandes objetivos na produção de aves atualmente, é a busca por redução dos custos de produção sem afetar o desempenho dos animais. Os principais ingredientes utilizados na alimentação, como o milho e o farelo de soja, além de ingredientes alternativos apresentam fatores antinutricionais que, se não forem considerados, podem comprometer o desempenho dos animais. Por estes motivos, tem-se buscado alternativas para maximizar o potencial genético dos animais com o uso de aditivos nutricionais. As enzimas exógenas apresentam como benefícios a manutenção da qualidade dos alimentos, a melhora na digestibilidade dos nutrientes, a redução da umidade das excretas e a eliminação em parte ou total dos fatores antinutricionais dos alimentos utilizados na alimentação de aves. Sendo assim, esta revisão teve como objetivo elaborar este documento com base nos avanços e demais utilizações das enzimas exógenas na alimentação de aves.

INTRODUÇÃO A produção e consumo de carne de frango têm apresentado um forte crescimento nas últimas décadas. De acordo o MAPA (Ministério da Agricultura e do Abastecimento) e o ABEF (Associação Brasileira de Exportadores de Frango), a produção passou de 2,0 milhões de toneladas em 1989 para 9,3 milhões de toneladas em 2006, o que corresponde a um acréscimo de 465% em 17 anos, ou seja, um crescimento de aproximadamente 27,5% ao ano. É conhecido que a nutrição animal é responsável por cerca de 70 a 80% do custo de produção em monogástricos (aves, suínos e coelhos). Diante disso, muitos estudos têm sido realizados com o intuito de maximizar a produção animal. De acordo com Cousins (1999), a formulação de ração moderna é voltada principalmente para fornecer alimento com uma densidade

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de nutrientes adequada para alcançar alto desempenho animal e ao mesmo tempo obter custos mínimos de produção. A alimentação de aves consiste de dois ou três ingredientes os quais compõe mais de 75% da ração completa Cousins (1999). As principais fontes de energia e proteína utilizadas são o milho e o farelo de soja respectivamente. De acordo com Torres et al. (2003), esses ingredientes, em razão do consumo elevado, tornam as aves competidoras com o homem. Segundo Rodrigues et. al. (2003) 65% da produção nacional de milho e 40% da oferta de farelo de soja são consumidos na alimentação animal. Neste sentido, os nutricionistas se esforçam na busca de alternativas que possibilitem a formulação de rações mais eficientes e econômicas, uma vez que a alimentação representa a maior parte do custo de produção de aves comerciais. É duvidoso, entretanto, que os maiores avanços na nutrição possam ocorrer com o descobrimento de novos nutrientes ou mediante o ajuste dos requerimentos nutricionais. Pelo contrário, o melhoramento na eficiência da utilização de matérias-primas e o uso de uma ampla variedade de ingredientes, atualmente considerados de qualidade inferior, possivelmente produzirão os maiores avanços na alimentação animal. Segundo Cousins (1999), os fatores antinutricionais, normalmente encontrado nos alimentos, não são tóxicos para os animais, mas a sua presença pode comprometer o desempenho produtivo, além de produzir alterações hormonais ou lesões esporádicas em certos órgãos. Neste contexto fica evidente a necessidade de otimizar a nutrição e alimentação animal. Uma possibilidade para o aumento da eficácia da produção é o uso de enzimas alimentares, que segundo Buttolo (2002) apud Barbosa et al. (2008) são micro ingredientes da alimentação classificados como pró-nutrientes. Sendo assim, a utilização de enzimas exógenas é um método promissor para alcançar as metas impostas pelo setor produtivo no que se refere à alimentação animal e que tem recebido grande atenção nos últimos anos.

PRINCÍPIOS DO USO DE ENZIMAS As enzimas são substâncias orgânicas produzidas pelas células, capazes de catalisar reações químicas, podendo sintetizar ou degradar substratos químicos e transformar um composto orgânico em outro. Ainda de acordo com Fischer et. al, (2002) e Torres et. al, (2003) as enzimas são proteínas globulares que atuam como catalisadores biológicos, aumentando a velocidade das reações no organismo, sem seres, elas próprias, alteradas neste processo. No trato digestivo dos animais elas facilitam a digestão de proteínas, carboidratos e lipídios. A maioria das enzimas digestivas são substratos-dependentes, ou seja, a secreção enzimática é ativada pela presença do substrato em que ela será responsável pela digestão, como a protease que age sobre proteína, a amilase sobre o amido e a xilanase sobre o xilano (Costa

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et al., 2004). Segundo Zanella (2008), tanto as enzimas endógenas, quanto as exógenas são proteínas catalisadoras e apresentam as mesmas características estruturais e modo de ação, requerendo assim, condições idênticas para o meio em que se encontram. De acordo com Buhler et al. (1998.) citado por Fischer et al, (2002) somente atuam em condições específicas de temperatura, umidade e pH. As aves não sintetizam certas enzimas endógenas para a digestão de vários componentes encontrados em alimentos de origem vegetal. As sementes oleaginosas, como a soja, a canola, e os grãos dos cereais com seus respectivos subprodutos, como por exemplo, o trigo, a cevada, o centeio, o triticale, o arroz, apresentam em sua composição bromatológica constituintes que as aves não digerem ou a sua digestão é incompleta, como os polissacarídeos não amiláceos (Tabela 1). Em outros animais como nos ruminantes, estes polissacarídeos são degradados pela fermentação microbiana no rúmen. A fermentação dos polissacarídeos nos monogástricos está limitada ao intestino grosso e representa um volume desprezível.

Tabela 1. Composição de diferentes alimentos em polissacarídeos não amiláceos (% da matéria seca).

Adaptado de CLASSEN, 1996.

A utilização de enzimas como aditivos representou um marco na alimentação animal e o potencial de seu uso tem sido reconhecido há muitos anos. Durante os últimos anos da década de 50, os investigadores da Universidade do Estado de Washington demostraram que quando uma fonte de uma enzima foi suplementada aumentou o valor alimentício das dietas de frangos de corte baseadas em cevada (Fry et al., 1958; Berg, 1959; Willingham et al.,1959). A resposta benéfica foi no começo erroneamente atribuída a capacidade amilolítica da fonte enzimática, mais tarde foi demonstrado que a atividade da ß glucanase, uma enzima contaminante, foi a resposta primária (Rickes et al., 1962 citado por Classen, 1993). Nas décadas seguintes, a investigação sobre o uso de enzimas microbianas foi esporádica, mas se conseguiu importantes avanços no entendimento dos mecanismos de ação das

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enzimas e seus usos potenciais. As enzimas somente passaram a ser utilizadas amplamente na alimentação animal. Elas são administradas com o alimento e catalisam, no trato gastrointestinal, as reações químicas que conduzem a degradação de nutrientes contidos no alimento. As enzimas usadas como aditivo alimentar são produzidas pela fermentação de microorganismos como fungos e bactérias, sobre um substrato selecionado. Elas possuem características próprias tais como atividade específica, afinidade pelo substrato, sensibilidade ao pH e temperatura. Uma ampla gama de microorganismos são capazes de produzir enzimas que podem ser usadas com êxito pela indústria de alimentos. No entanto, a seleção das enzimas de um organismo específico pode não ser crucial para o êxito de seu uso. Baseados na legislação de alimentos em vários países, alguns microorganismos já são considerados seguros como ingredientes alimentícios e, no entanto, são usados facilmente como fontes enzimáticas. Sem dúvida nenhuma o futuro mostrará um universo mais amplo de organismos a serem usados rotineiramente na produção de enzimas. As fontes enzimáticas devem ser selecionadas com base na atividade enzimática sobre o substrato de interesse e as condições da reação. Como muitos substratos são complexos, as enzimas alimentícias usualmente são mesclas que contém as atividades de importância primária e outras que são secundárias e que não têm sido caracterizadas completamente. Geralmente as misturas de enzimas produzem efeitos mais desejáveis que as fontes purificadas com uma atividade enzimática específica. Dentre as enzimas utilizadas na alimentação de aves destacam-se as xilanases, as ß glucanases, as fitases e as pectinases utilizadas respectivamente com sucesso em rações contendo centeio, cevada, aveia, e soja. As principais enzimas usadas em rações de frangos de corte e seu modo de ação estão apresentadas na Tabela 2. As enzimas comerciais são produzidas através da recombinação do DNA e mutações de fungos, bactérias e leveduras. De acordo com Zanella, (2001), existem três tipos de enzimas comercializadas: enzimas para alimentos com baixa viscosidade (milho, sorgo e soja); enzimas para alimentos de alta viscosidade (trigo, centeio, cevada, aveia, triticale e farelo de arroz) e enzimas capazes de degradar o ácido fítico dos grãos vegetais. De acordo com Barbosa et. al. (2008) e Pereira (2008) a suplementação enzimática pode ser feita de duas maneiras. Uma aplicação mais simples e prática, conhecida por “over the top” (por cima), consiste em suplementar as enzimas com uma formulação padrão, sem alterar os níveis nutricionais. A segunda alternativa seria alterar a formulação da ração reduzindo os nutrientes e adicionando enzimas exógenas para restaurar o valor nutricional da dieta-padrão visando o mesmo desempenho de uma dieta com os níveis nutricionais

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recomendados.

Tabela 2. Enzimas usadas em rações de frango e seu modo de ação.

Cleophas et al., 1995.

Segundo Fischer et. al. (2002), as enzimas geralmente são utilizadas na alimentação animal com dois objetivos bem definidos: complementar as enzimas que são produzidas pelo próprio animal em quantidades insuficientes (amilases e proteases), principalmente em animais jovens que não possuem a sistema enzimático totalmente maduro ou fornecer aos animais enzimas que eles não conseguem sintetizar e que são capazes de degradar substratos específicos (celulases). De acordo com Torres et. al. (2003), as enzimas digestivas exógenas atuam basicamente de duas maneiras: rompendo paredes celulares e degradando nutrientes. Além disso, segundo Cousins (1999), as enzimas ajudam a reduzir o impacto da produção avícola na poluição ambiental. A suplementação com enzimas melhoram a eficiência de produção das aves, pois aumentam a digestão de produtos de baixa qualidade e reduzem a perda de nutrientes nas fezes e de acordo com Zanella et. al. (1999) causa uma redução na síntese de enzimas endógenas, e em conseqüência, o organismo tem mais aminoácidos disponíveis para a síntese de proteína. Desta maneira é possível reduzir os níveis nutricionais da dieta com possíveis vantagens econômicas. Torres et al. (2003b). Em geral, a adição de enzimas exógenas, pode realizar a quebra das paredes celulares, reduzir a viscosidade da dieta, degradar proteínas e os fatores antinutricionais, aumentar a digestibilidade total da ração, potencializar a ação das enzimas endógenas e diminuir a poluição ambiental causada principalmente pelo fósforo e nitrogênio excretados nas fezes, proporcionando desta maneira um melhor aproveitamento dos nutrientes pelos animais. Campestrini et al. ( 2005).

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MODOS DE AÇÃO DAS ENZIMAS EXÓGENAS As enzimas nos alimentos para animais podem derivar-se de fontes microbianas, vegetais e animais. Mas, a maioria deriva-se da fermentação de bactérias e fungos, sendo a última a fonte de muitos suplementos comerciais (Chesson, 1987 citado por Classen, 1993). As enzimas microbianas desempenham um papel importante na reciclagem do material orgânico na natureza. Portanto, não é surpreendente que os microorganismos produzam atividades enzimáticas capazes de hidrolisar uma ampla variedade de compostos, incluindo aqueles que têm importância em nutrição animal. O uso de enzimas no alimento pode categorizar-se amplamente em quatro áreas que não são mutuamente exclusivas (Classen, 1996). Estas áreas são: a) remoção dos fatores antinutricionais; b) aumento da digestibilidade dos nutrientes existentes; c) aumento da digestibilidade de polissacarídeos não amiláceos;

A) REMOÇÃO DOS FATORES ANTINUTRICIONAIS Os fatores antinutricionais são componentes comuns das matérias primas alimentícias, entre eles podemos citar os fitatos, tanino, lecitina, inibidor da tripsina e vicina. Eles são predominantemente polissacarídeos não amiláceos (PNA’s) da parede celular e não podem ser metabolizados pelas enzimas endógenas das aves (Gitzelmann & Auricchio,1965, citados por Korin et al., 1991). Os animais monogástricos não possuem capacidade endógena de digerir as fibras. A utilização de enzimas exógenas se torna importante, pois estas hidrolisam os polissacarídeos não amiláceos que poderão ser utilizados pelos animais, aumentando a utilização de energia e reduzindo o impacto negativo destes resíduos sobre a viscosidade da digesta. Segundo Araújo et al. (2008) os PNA’s são os principais substratos para fermentação bacteriana, particularmente no intestino grosso de animais monogástricos e também possuem características benéficas, por interagirem com a mucosa e a microflora, tendo um importante papel no controle da “saúde intestinal”. Os PNA’s presentes na dieta causam uma inibição geral da absorção dos macronutrientes e provavelmente dos micronutrientes (Annison, 1993). A presença de alguns fatores antinutricionais nos cereais fazem com que, ao serem ingeridos, tornem-se solúveis no trato digestivo produzindo uma maior viscosidade da digesta. Este incremento na viscosidade é um fator que influencia o valor nutritivo dos cereais (Brenes, 1992). Outros fatores antinutricionais inibem diretamente as enzimas resultando em uma menor digestibilidade dos alimentos. Isto pode eventualmente causar doenças. Alguns destes efeitos negativos podem ser eliminados pelo

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uso de enzimas como suplemento alimentar e/ou incorporando-as nas rações durante o processamento. A identificação e caracterização do substrato está bem entendida para os grãos de cevada. Os efeitos antinutricionais da alimentação com cevada, estão associados com os componentes da parede celular do grão (Tabela 3).

Tabela 3. Composição típica do material da parede celular do trigo, milho e cevada.

Partridge & Wyatt, 1995.

As paredes celulares são complexas, compostas primariamente de carboidratos com menores quantidades de proteína e ácidos fenólicos. A fração carboidratada consiste de: microfibrilas de celulose que são insolúveis e nutricionalmente inertes e, uma fração principal que consiste primariamente de ß glucano e arabinoxilana. Como os monogástricos não são capazes de hidrolizar estes carboidratos, então impedem o acesso destas enzimas endógenas aos nutrientes contidos nas células dos grãos. O mais importante, no entanto, são as frações de ß glucano e arabinoxilana que se tornam solúveis depois da digestão, causando um aumento dramático na viscosidade da digesta, má absorção dos nutrientes, crescimento microbiano no intestino delgado e baixa produtividade animal. Como um exemplo, os componentes da parede celular do grão de cevada (ß glucanos e arabinoxilanas) causam um efeito antinutricional nas aves. Frações solubilizadas da parede celular reduzem a retenção dos nutrientes e causam baixos rendimentos dos nutrientes e camas molhadas. A atividade enzimática especificamente selecionada para hidrolizar a fração causante do problema se adiciona na dieta para melhorar o valor nutricional do grão. Também se tem documentado um uso similar de enzimas para outros cereais incluindo aveia, trigo, triticale e centeio. Apesar da aplicação comercial das enzimas para eliminar os fatores antinutricionais mencionados, o potencial de eliminação destes fatores pelas enzimas apenas se inicia (Classen, 1993) A alimentação de grãos de centeio causa efeitos que são similares, porém maiores que os observados com a alimentação de cevada. No centeio, o efeito negativo se atribui as arabinoxilanases localizadas em frações de alto peso molecular das paredes celulares do grão que se liberam durante sua

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passagem através do trato digestivo (Classen, 1993). Para os cereais, o peso molecular, a solubilidade e a estrutura química dos constituintes da parede celular, podem ter um efeito importante no que diz respeito aos fatores antinutricionais. Na cevada, os efeitos genéticos e ambientais sobre o valor nutricional e mais especificamente a natureza dos componentes da parede celular, estão bem estabelecidos e reconhece sua variabilidade no grau de resposta frente ao uso de enzimas alimentícias (Campbell et al., 1989). Além do efeito sobre a qualidade nutricional, as enzimas alimentícias também reduzem a variabilidade das matérias primas, permitindo a formulação de rações mais precisas e com uma margem de segurança maior (Classen et al., 1996). A idade do animal também pode influenciar no ambiente digestivo. Administrando cevada ou grãos que produzem efeitos similares, causam um maior efeito em aves jovens (Salih et al., 1991). Os oligossacarídeos, celulose, hemicelulose, arabinose e xilanas presentes no farelo de arroz e a rafinose, estaquiose e sacarose encontrados na soja, são exemplos claros que as aves produzem enzimas endógenas para a sua digestão. É possível que o oligossacarídeo rafinose, encontrado na soja, seja a causa do menor tempo de trânsito do bolo alimentar, contribuindo assim, para reduzir a digestão da fibra bruta, resultando no menor valor da energia metabolizável do farelo de soja, (Mc Ginnis, 1983, citado por Coon et al., 1990). O terno polissacarídeo não amiláceo é usado frequentemente para se referir às fibras (Nuvital, 2000). Os PNA’s são encontrados principalmente como componentes estruturais das paredes dos cereais. Estes são importantes para a integridade estrutural da planta e suas as ligações com outros componentes provavelmente determinam a atividade nutricional e digestibilidade do alimento. De acordo com Pereira (2008), os PNA’s são polissacarídeos de elevado peso molecular, composto por pentoses (arobinose e xilose), hexoses (glicose, galactose e manose), 6-desoxihenoses (ramnose e fucose) e ácidos úricos (ácido glicorônico e ácido galacturônico. Segundo Rodrigues et al. (2003), o farelo de soja apresenta em sua composição constituintes não-digeridos pelas aves, ou com digestão incompleta, os quais são denominados (PNA’s). Segundo Cantor (1995) apud por Rodrigues et al. (2003) o farelo de soja apresenta 20% de PNA’s, com digestibilidade praticamente nula. Além disso, os inibidores de proteases e as lectinas são os fatores antinutricionais da soja e do farelo mais comumente destacados na literatura. Segundo Jorge Neto (1992), os inibidores de proteases são compostos protéicos que se complexam com a tripsina e quimotripsina prejudicando todo o processo de digestão de proteínas já desdobradas pela pepsina. As lectinas são glicoproteínas que possuem capacidade de se

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aglutinarem com os eritrócitos e na sua presença, as células do epitélio intestinal, tendem a se unir prejudicando a absorção dos nutrientes. De acordo com Cantor (1995), o conteúdo e digestibilidade dos PNA’s, respectivamente, do farelo de soja são de 20 e 0%; farelo de arroz 25 e 30%; trigo 10 e 12%; e da cevada 15 e 14%, quando avaliados com pintos jovens. Segundo Cousins (1999), os PNA’s são capazes de se ligarem a grande quantidade de água e com isso aumentar a viscosidade do fluido. A viscosidade depende do tamanho destes polissacarídeos não amiláceos, da forma, da presença ou não de carga e da sua concentração. O aumento na viscosidade pode causar problemas no intestino delgado devido ao fato dos nutrientes tornarem menos disponíveis para a digestão, resultando em uma depleção da digestão de gorduras, proteínas e carboidratos. As características estruturais dos PNA’s não são uniformes porque o nível, o tipo e a sua composição difere grandemente entre as sementes vegetais, mesmo dentro de uma mesma espécie. Embora o conhecimento dos monossacarídeos que compõem os PNA’s seja útil, ele é falho para definir a natureza dos polissacarídeos e suas características importantes (Tabela 4). A composição dos polissacarídeos afeta as suas propriedades e também o requerimento de enzimas para hidrolisá-los (Classen, 1996). De acordo com Trugo et al. (1995) apud Zanella (1999), as fibras dietéticas dos grãos de leguminosas podem incluir alfa galactosídeos, amido resistente, polifenóis e proteínas ligadas à parede celular. O farelo de soja apresenta alta quantidade de alfa galactosídeos (rafinose e estaquiose) e galactamananos (PNAs) que são eliminados em seu processo prejudicando o aproveitamento desse alimento pelos não ruminantes. Tabela 4. Características importantes dos polissacarídeos não amiláceos.

Classen, 1996.

A estrutura da parede celular de alimentos protéicos de origem vegetal, diferem dos cereais quanto a sua composição, já que contém quantidades elevadas de substâncias pécticas e alfa galactosídios (Brenes, 1992). O desenvolvimento de enzimas específicas com atividade α galactosidase, adicionadas as dietas avícolas, podem contribuir para aumentar o valor

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energético da sementes das leguminosas. A energia metabolizável do alimento é influenciada negativamente pelos níveis de PNA’s nos cereais. Assim, cereais que apresentam uma maior quantidade de PNA’s possuem uma quantidade de energia metabolizável inferior (cevada), quando comparado com aqueles que possuem menor quantidade destes polissacarídeos (sorgo) (Cleophas et al., 1995). Dentre os cereais, o trigo, o centeio e o triticale possuem grande quantidade de arabinoxilanas solúveis em água exibindo efeito antinutricional. Já no sorgo e milho elas são em sua maioria insolúveis em água, não conferindo assim atividade antinutricional. A cevada e a aveia possui grande quantidade de ß glucano. Em grãos de leguminosas, como a soja e feijão, são encontrados altos níveis de pectina. As pectinas exibem propriedades antinutricionais quando fornecidas para a alimentação de aves.

B) AUMENTO DA DIGESTIBILIDADE DOS NUTRIENTES EXISTENTES O fato dos animais não reterem todos os nutrientes consumidos nas matérias primas é uma consequência da disponibilidade do ingrediente alimentício e da capacidade do trato digestivo do animal. A má absorção das matérias primas é a princípio o resultado da falta de enzimas endógenas para extrair os nutrientes dos complexos dentro do ingrediente alimentício. Como as espécies monogástricas não têm o complemento enzimático para digerir muitas frações de PNA’s, estes materiais podem impedir o acesso das enzimas endógenas a nutrientes valiosos para a alimentação. Um exemplo disso é o uso das fitases são usadas para melhorar a disponibilidade do fósforo. Nas rações para as aves, o fósforo é um dos ingredientes mais caros. Alguns grãos vegetais como a soja, contêm quantidades significantes de fósforo, porém está unido a fitatos (indisponível para as aves). Estudos efetuados com frangos de corte de 0 a 24 dias de idade (Tabela 5) mostram que na medida em que se aumenta a suplementação da enzima fitase na ração, há uma maior disponibilidade de fósforo, aumentando o ganho de peso, melhorando a conversão alimentar e diminuindo o fósforo nas fezes (Avicultura Professional, 1991), o que diminui o impacto ambiental causado pelos dejetos dos animais. Além disso, a qualidade nutricional do milho não é constante. De acordo com Leeson et al. (1993), citado por Rodrigues et al. (2003) existem variações no conteúdo energético de uma partida de milho para outra. Segundo FISCHER et al. (2002), a variabilidade na qualidade do milho deve-se a fatores genéticos e ambientais, aos quais se somam as alterações causadas pelos processos de secagem e armazenagem. O milho contém em média 87,1% de matéria seca, 8,26% de proteína

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bruta, 3,61% de extrato etéreo, 3.925Kcal/Kg de energia e bruta e 1,73% de fibra bruta. De acordo com Rostagno et al. (2005), apresenta aproximadamente 9% de PNA’s sendo 4,9% destes representados pelos xilanos. De acordo com Pereira (2008), a digestibilidade dos nutrientes do milho, principalmente do polissacarídeo amido, é relativamente alta, podendo os teores de fibra, proteína e gordura influenciar o aproveitamento da energia do amido pelas aves. Tabela 5. Efeito da suplementação de fitase para frangos de corte1.

Avicultura Professional, 1991.

A utilização dos preparados enzimáticos tem concentrado na melhoria do valor nutritivo dos cereais. A participação dos cereais nas rações para aves é alta, atuando, como fornecedores de energia e de proteína (Brenes,1992).

C) AUMENTO DA DIGESTIBILIDADE DOS POLISSACARÍDEOS NÃO AMILÁCEOS

A capacidade das espécies monogástricas para degradar os PNA’s é variável, dependendo da natureza da fração e do tempo de exposição da digesta às enzimas digestivas e à microflora intestinal. Em geral, pode-se dizer que os monogástricos não têm a capacidade endógena para hidrolisar estes materiais. No entanto as enzimas exógenas têm a capacidade de hidrolisar os PNA’s que podem ser potencialmente utilizados pelo animal. A hidrólise completa dos PNA’s em componentes monossacarídeos pode resultar em sua absorção e utilização. O benefício exato para o animal está determinado pela natureza do monossacarídeo (Salih et al. 1991, Schutte et al., 1992). Os principais monossacarídeos encontrados em PNA’s de origem vegetal, como a xilose e arabinosa, são pouco absorvidos e causam um efeito negativo quando estão presentes em grandes quantidades. No entanto, estão bem documentados os exemplos do aumento na digestibilidade destes mediante o uso de enzimas que degradam a fibra (Slominski et al., 1992, citado por Classen, 1993). Os cereais têm um alto conteúdo de arabinoxilanos e ß glucanos

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ligados (Tabela 3). Estes são de importância nutricional significativa porque constituem a parede celular do endosperma do cereal e em solução no intestino dos animais tendem a criar condições de viscosidade (podem formar gel). Tanto a quantidade destas fibras, como o comprimento de suas cadeias são importantes para a sua propriedade de aumentar a viscosidade do conteúdo intestinal. A adição de preparados enzimáticos contendo xilanases e ß glucanases ativas, tem um importante impacto sobre a viscosidade da digesta no intestino da ave, resultando em uma melhora na utilização dos nutrientes e consequentemente no desempenho das aves. A natureza precisa desta relação é importante porque permite prever uma possível resposta da adição de enzima em várias circunstâncias (Partridge & Wyatt, 1995).

USO DA ENZIMA NA ALIMENTAÇÃO ANIMAL Trabalhos recentes têm demonstrado respostas positivas em relação à digestibilidade e ao desempenho de aves alimentadas com ração a base de milho e farelo de soja, quando estas foram suplementadas com enzimas. Gracia et. al. (2003), realizaram um estudo com dietas a base de milho e farelo de soja acrescida com α-amilse e observaram que a suplementação melhorou em 9,4% o ganho de peso e 4,2% a conversão alimentar, concluindo que a suplementação enzimática foi eficiente. Yu & Chung (2004) apud Pereira (2008), verificaram que a adição de complexo enzimático composto por amilase, xilase e beta-glucanase em rações com redução de 3% de energia metabolizável, para frangos de corte, resultou em desempenho semelhante ao obtido com a dieta controle. Torres et. al. (2003), ao verificarem o efeito de um complexo multienzimático que possui atividades de amilase, protease e xilanase, adicionado a dietas à base de milho e soja, sobre o desempenho de frangos de corte, concluíram que a adição de enzimas exógenas melhorou o desempenho das aves pela influência exercida no aumento do ganho de peso, no índice europeu de eficiência produtiva e melhorou na conversão alimentar. Garcia et. al. (2000), em estudos com o objetivo de avaliar o efeito da suplementação enzimática em rações a base de milho e soja sobre o desempenho de frangos de corte concluíram que a adição de complexo multienzimático em rações com farelo de soja e soja integral extrusada para frangos de corte (1-42 dias) foi efetiva na melhoria da utilização de energia metabolizável, proteína e aminoácidos (Met,Met+Cis e Lis) em 9; 7; e 5%, respectivamente. Segundo Pereira (2008) apud Choct et. al. (1997), o aumento de PNAs solúveis aumentou a viscosidade da digesta e reduziu a energia metabolizável (EM) da dieta, resultando em queda de ganho de peso e pior conversão alimentar. A suplementação enzimática reverteu os efeitos adversos,

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aumentando a EM e melhorando o desempenho dos animais. Os autores concluíram que, na presença de grandes quantidades de PNAs na ração, há um aumento da fermentação no intestino delgado das aves, prejudicando o desempenho e o bem-estar destes animais. Por outro lado Fischer et. al. (2002) estudando o efeito da inclusão de um composto multienzimático à base de proteases, amilases e celulases, na dieta de frangas de corte, da linhagem comercial Ross em rações à base de milho e farelo de soja, não encontraram ganhos no desempenho de frangos de corte. De acordo com Wyatt & Bedford (1998), citado por Rodrigues et. al. (2003), o uso de enzimas que sejam capazes de neutralizar os fatores antinutricionais da soja, degradando os inibidores de tripsina, lectinas, PNA’s, auxiliando na digestão do amido, bem como reduzindo a variabilidade em dietas à base de milho, pode resultar em melhor qualidade nutricional da dieta e desempenho animal mais uniforme. Freitas et al. (2010) avaliaram o fornecimento de um complexo enzimático na alimentação de frangos de corte, machos e fêmeas, no período de 1 a 42 dias. As aves receberam uma dieta padrão (controle positivo) e uma dieta com redução nos níveis de energia, proteína e aminoácidos, com e sem a adição de enzimas. No período de 1 a 21 dias (Tabela 6), os frangos de corte machos alimentados com as dietas com a suplementação do complexo enzimático e com os níveis convencionais apresentaram maior peso médio e ganho de peso (P<0,05). No entanto, o consumo não foi afetado significativamente e a conversão alimentar foi pior para fêmeas alimentadas com dietas formuladas com níveis reduzidos (P<0,05). Dentro de cada sexo, na realização de contraste, a redução da dieta com a suplementação de Rovabio Max resultou, para frangos de corte fêmeas (Tabela 7), estatisticamente em mesmo peso médio, ganho de peso e conversão alimentar que o fornecimento da dieta com nível convencional (P<0,05), não ocorrendo alterações no consumo. Entretanto, para frangos de corte machos (Tabela 8) a suplementação de Rovabio Max resultou em melhor peso médio e ganho de peso quando comparado aos demais tratamentos, não ocorrendo diferenças para consumo e conversão alimentar (P>0,05). No período total de criação (1 a 42 dias) pode-se observar (Tabela 9) que os frangos de corte machos alimentados com uma dieta reduzida em nutrientes e com a suplementação de Rovabio Max apresentaram os melhores índices de desempenho representados pelo seu peso médio e ganho de peso total (P<0,05). Em análise de contraste (Tabela 10) as aves fêmeas apresentaram o mesmo perfil demonstrando no período de 1 a 21 dias, sendo que as aves alimentadas com a redução dos níveis nutricionais apresentaram pior

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desempenho (P<0,05). Com relação ao machos (Tabela 11), embora a suplementação de Rovabio Max não tenha promovido diferenças em relação ao tratamento convencional para consumo de ração e conversão alimentar, as aves pertencentes a este grupo apresentaram peso ao abate e ganho de peso aproximadamente 4,5% e 5,9% superior aos tratamentos convencional e com redução dos níveis sem a suplementação de Rovabio Max, respectivamente (P<0,05). Não foram observados efeitos para as características de carcaça (Tabela 12) quando avaliados o rendimento de carcaça, peito e pernas (P>0,05). Entretanto, em análise de contraste (Tabela 13), a suplementação de Rovabio Max resultou em maior rendimento de carcaça quando comparado aos demais tratamentos (P<0,05). O mesmo efeito não foi observado para as demais características de carcaça e para as aves fêmeas. Tabela 6. Avaliação do uso de Rovabio Max na dieta de frangos de corte no período de 1 a 21 dias

F – Fêmeas; M – Machos; 1- Níveis reduzidos sem Rovabio; 2 – Níveis reduzidos com Rovabio; 3 – Níveis normais sem Rovabio

Tabela 7. Avaliação do uso de Rovabio Max na dieta de frangos de corte fêmeas no período de 1 a 21 dias.

F - Fêmeas; 1- Níveis reduzidos sem Rovabio; 2 – Níveis reduzidos com Rovabio; 3 – Níveis normais sem Rovabio

Tabela 8. Avaliação do uso de Rovabio Max na dieta de frangos de corte machos no período de 1 a 21 dias.

M – Machos; 1- Níveis reduzidos sem Rovabio; 2 – Níveis reduzidos com Rovabio; 3 – Níveis normais sem Rovabio

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Tabela 9. Avaliação do uso de Rovabio Max na dieta de frangos de corte no período de 1 a 42 dias.

F – Fêmeas; M – Machos; 1- Níveis reduzidos sem Rovabio; 2 – Níveis reduzidos com Rovabio; 3 – Níveis normais sem Rovabio

Tabela 10. Avaliação do uso de Rovabio Max na dieta de frangos de corte fêmeas no período de 1 a 42 dias.

F – Fêmeas; 1- Níveis reduzidos sem Rovabio; 2 – Níveis reduzidos com Rovabio; 3 – Níveis normais sem Rovabio

Tabela 11. Avaliação do uso de Rovabio Max na dieta de frangos de corte machos no período de 1 a 42 dias.

M – Machos; 1- Níveis reduzidos sem Rovabio; 2 – Níveis reduzidos com Rovabio; 3 – Níveis normais sem Rovabio

Tabela 12. Avaliação do uso de Rovabio Max na dieta de frangos de corte machos no período de 1 a 42 dias.

F – Fêmeas; M – Machos; 1- Níveis reduzidos sem Rovabio; 2 – Níveis reduzidos com Rovabio; 3 – Níveis normais sem Rovabio

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Tabela 13. Avaliação do uso de Rovabio Max na dieta de frangos de corte machos no período de 1 a 21 dias.

M – Machos; 1- Níveis reduzidos sem Rovabio; 2 – Níveis reduzidos com Rovabio; 3 – Níveis normais sem Rovabio

CONCLUSÃO Levando-se em conta que nos últimos anos a produção e o consumo da carne de frango e as exportações aumentaram muito, se comparado a outros produtos, e que para manter ou melhorar esta competitividade vários estudos foram e têm sido realizados a fim de se promover uma maior eficiência produtiva destes animais. As enzimas entram neste contexto, uma vez que, reduzem os efeitos dos fatores antinutricionais presentes em quase todos os alimentos, melhorando o desempenho das aves e com isso aumentando a rentabilidade, além de ajudarem a reduzir o impacto da produção avícola no meio ambiente. Desta maneira, torna-se evidente que a utilização de enzimas exógenas para a produção de frangos de corte implica em melhoria dos índices econômicos de produção.

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CAPÍTULO IX

MODELAGEM MATEMÁTICA PARA O PLANEJAMENTO, OTIMIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO AGROPECUÁRIA

Augusto Hauber Gameiro¹ José Vicente Caixeta Filho²

Carina Simionato de Barros²

¹Professor Doutor, Departamento de Nutrição e Produção Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Campus Pirassununga. E-mail: gameiro@usp.br. ²Professor Titular, Departamento de Economia, Administração e Sociologia, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Campus Piracicaba. E-mail: jvcaixet@esalq.usp.br. ³Médica Veterinária, Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Produção Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Campus Pirassununga. E-mail: carinaveter@gmail.com.

RESUMO O objetivo deste capítulo é analisar o surgimento e os avanços da modelagem matemática, com destaque para a área do conhecimento denominada de “Pesquisa Operacional”, aplicada ao planejamento e avaliação da produção agropecuária. É apresentado um modelo matemático multiobjetivo para otimização e avaliação de uma propriedade rural caracterizada pela integração entre lavoura (culturas vegetais) e pecuária (culturas animais). Procurou-se ressaltar que o aumento da complexidade envolvida nos sistemas produtivos, em função da necessidade de se considerar aspectos sociais e ambientais, além dos técnicos, implicará esforços para o desenvolvimento de novos métodos e ferramentas auxiliares no processo de tomada de decisão quanto às três questões centrais dos sistemas sociais: o que produzir, como produzir e para quem produzir. Como resultado, tem-se que o modelo pode ser utilizado como ferramenta para simular os impactos na realocação dos recursos diante de mudanças nas prioridades (pesos) atribuídas a cada um dos três grupos de variáveis consideradas: econômicas, ambientais e sociais. Todavia, para a elaboração do modelo é necessário que se tenha disponível um detalhamento bastante minucioso dos dados, o que implicará tanto esforços gerenciais de campo, quando da pesquisa científica.

1. INTRODUÇÃO Fazer uso racional dos recursos disponíveis é um desafio que se confunde com a própria história da humanidade. Independentemente da

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localização geográfica das civilizações e da sua época, eleger o que será produzido, como será produzido e de que forma a produção será consumida configuram-se como as três questões centrais das sociedades, sejam elas tradicionais ou ditas modernas. O desafio, portanto, é historicamente, o mesmo. Todavia, quando se pensa em uso racional abre-se espaço para diversas reflexões. A evolução dos seres humanos e a sua capacidade de interferir no meio em que vivem alteram as relações homem-homem e homem-natureza, modificando a racionalidade das mesmas. Se a simples coleta de frutos e sementes, assim como a caça, eram métodos racionais de subsistência há milhares de anos, não o são hoje para a maioria das civilizações. Explorar a natureza de forma a satisfazer as necessidades humanas atuais sem comprometer sua capacidade futura de ser igualmente explorada, começa a se configurar como a racionalidade que, possivelmente, deverá direcionar os processos de transformação dos recursos. Especificamente considerando o meio rural, definir os cultivos e/ou as criações que, conjuntamente ou não, permitem o maior retorno do empreendimento com uma interferência negativa que seja mínima ou, pelo menos, suportável sobre o meio, destaca-se como estratégia iminente de grande parte das civilizações contemporâneas. Importante ressaltar que a consideração conjunta desses cultivos implica maior necessidade do conhecimento: i) de suas características biológicas intrínsecas (botânicas e zoológicas); ii) do solo, que é base de sustentação; iii) do clima, pela sua interferência direta sobre os cultivos; iv) das tecnologias disponíveis para o manejo (mecânica, química, genética etc.); v) dos mercados de produtos finais e insumos (disponibilidades, preços, sazonalidades etc.); e vi) das relações sociais pertinentes (relações de poder, direito de propriedade, absorção de mão de obra, qualidade de vida no trabalho, políticas regulatórias etc.). Fica evidente, por conseguinte, que há uma complexidade significativa envolvida na configuração desses sistemas produtivos. Há muitos fatores relacionados, com inúmeras relações de causa e efeito envolvidas. Planejar a produção agropecuária, tendo como foco a propriedade como um todo (uma determinada área territorial) e sua inserção social, visando o uso mais racional possível (otimização) dos seus recursos, vem sendo tema de pesquisa científica nas últimas quatro décadas, especialmente no campo das ciências exatas (engenharias, com o conhecimento de modelagem matemática) e agrárias (com o conhecimento das culturas agrícolas e pecuárias). Mais recentemente, outras áreas do conhecimento, em especial aquelas relacionadas às ciências biológicas e ambientais (como a ecologia, por exemplo) e as humanas (economia, administração e sociologia), também passaram a se

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dedicar mais diretamente ao problema do planejamento e da otimização da produção agropecuária. O objetivo deste capítulo é apresentar uma revisão de literatura destacando o surgimento e os avanços da modelagem matemática, com destaque para a área do conhecimento denominada de “Pesquisa Operacional”, aplicada ao planejamento e avaliação da produção agropecuária. Procurar-se-á destacar os avanços no sentido de se incluir, em tais modelos, aspectos ambientais e sociais. É apresentado um modelo matemático multiobjetivo para otimização e avaliação de uma propriedade rural caracterizada pela integração entre lavoura (culturas vegetais) e pecuária (culturas animais).

2. A DISPONIBILIDADE DOS RECURSOS, OS SISTEMAS INTEGRADOS E A OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO AGROPECUÁRIA O desenvolvimento de modelos de otimização de sistemas de produção agropecuários vem despertando a curiosidade dos cientistas desde meados do século XX, quando a complexidade das relações técnicas de produção aumentou significativamente com o advento e utilização de insumos e tecnologias responsáveis pelo incremento da produtividade de cultivos vegetais e animais. Eleger as culturas mais adequadas, suas respectivas áreas cultivadas, o padrão tecnológico, o número e as categorias de animais, diante de recursos escassos (terra, equipamentos, mão de obra, insumos etc.) caracteriza-se como o problema central desses modelos. Mais recentemente, como mencionado na introdução, adiciona-se ao contexto a preocupação com o ecossistema, ou seja, a interferência do sistema sobre o ambiente à sua volta, especialmente no que se refere: i) à conservação de recursos naturais (maciços vegetais, mananciais hídricos etc.); ii) ao uso intensivo de recursos não-renováveis (especialmente os derivados de petróleo); e iii) à geração de resíduos (excrementos animais, agroquímicos, gases do efeito estufa etc.). Além da dimensão técnica-econômica e ambiental, algumas sociedades passaram a se preocupar com a influência dos sistemas agropecuários na matriz de relações sociais, por perceberem a relevância que o meio rural apresenta na manutenção cultural, da história e na geração de renda e ocupação das pessoas. Tais preocupações são perceptíveis com mais nitidez na União Européia, que apresenta certa tradição na formulação de políticas agrícolas que visavam, originalmente, a segurança alimentar. No entanto, atualmente, ganham dimensões maiores exatamente por contemplarem o serviço ambiental e social que o meio rural pode proporcionar à sociedade como um todo. O uso de recursos não-renováveis na agricultura foi recentemente discutido por Lana (2009). O autor apresenta alguns exemplos de possibilidade

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iminente de exaustão de alguns recursos. As reservas de fosfato no mundo, que podem ser exploradas a baixo custo, são suficientes para 40 a 100 anos e as reservas mundiais de potássio são suficientes para 50 a 200 anos. Para os micronutrientes a situação é ainda mais delicada: as reservas de cobre e zinco são suficientes para 60 anos, de manganês para 35 anos e de selênio para 55 anos. Além da escassez dos recursos naturais, Lana (2009) alertou para a questão da contaminação do ambiente pelo uso de insumos na agropecuária. Para o pesquisador, o uso excessivo de fertilizantes pode contribuir para a contaminação do solo e dos cursos d’água com nitrato, acidificação do solo e emissões de dióxido de carbono, óxido nitroso (N2O) e amônia para a atmosfera. A poluição com nitrato tem sido uma atual preocupação na Europa e América do Norte. A fertilização com fósforo e nitrogênio causa decréscimo na oxigenação da água pelo excessivo aumento na população de algas tóxicas nos oceanos (Lana, 2009). No que se refere à emissão de gases, Lana (2009) afirma que aproximadamente 70% de todas as emissões antropogênicas de N2O são atribuídas à agricultura. Há uma correlação direta entre emissão de N2O e aplicação de fertilizantes. O N2O retém 13 vezes mais calor que o metano e 270 vezes mais que o CO2 (Lana, 2009). Estudos no sentido de se estimar a emissão de gases pelos animais também vêm sendo desenvolvidos. Um exemplo é a pesquisa recente de Burgos et al. (2010), que procuraram avaliar a emissão de amônia por vacas leiteiras. Além de despertar para a seriedade da questão ambiental, o principal aspecto trabalhado por Lana (2009) refere-se ao fato que as necessidades nutricionais dos sistemas de recomendação consideram um determinado nível de produção, e a consequente exigência nutricional para atingi-la, sem, na maioria das situações, considerarem-se os aspectos econômicos da relação custo-benefício dos diferentes nutrientes e dos ganhos de produção auferidos. Um aspecto chave quando se considera a necessidade de otimização de sistemas de produção agropecuária é a integração entre os cultivos vegetais e os animais, conhecida genericamente por “integração lavoura-pecuária” (ILP). Duas referências recentes sobre o assunto no país são Balbinot Junior et al. (2009) e Macedo (2009). Para Balbinot Junior et al. (2009), a ILP pressupõe o uso contínuo das áreas agrícolas e a melhoria e manutenção da qualidade do solo ao longo do tempo. Segundo esses autores, a ILP “pode ser definida como um sistema de produção que alterna, na mesma área, o cultivo de pastagens anuais ou perenes, destinadas à produção animal, e culturas destinadas à produção vegetal, sobretudo grãos” (p.1926). Para os estados do Sul do Brasil, aqueles autores afirmam que os sistemas de ILP acontecem sob três estratégias básicas:

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i) pastagens anuais de inverno e culturas para produção vegetal no verão; ii) pastagens anuais de verão e culturas para produção vegetal no inverno; e iii) pastagens perenes por alguns anos, intercalando um ou mais anos com culturas anuais. Balbinot Junior et al. (2009), afirmam que os sistemas de ILP podem propiciar vantagens biológicas e econômicas em relação aos sistemas não-integrados. As vantagens biológicas, segundo os autores seriam: i) aumento na velocidade de ciclagem de nutrientes: os animais representam agentes aceleradores da ciclagem de nutrientes, principalmente pela aceleração na mineralização dos nutrientes contidos na massa vegetal. Segundo Russelle (1997), os animais devolvem ao solo, via fezes e urina, cerca de 70% a 95% dos nutrientes que ingerem; e ii) Melhoria da qualidade do solo: os sistemas de ILP podem aumentar as concentrações de carbono orgânico no solo ao longo do tempo, devido ao crescimento contínuo de plantas na área, seja pastagens ou culturas para exploração vegetal, rotação de culturas, incremento da massa produzida por tempo em decorrência do pastejo e maior ciclagem de nutrientes. Já em relação às vantagens econômicas sugeridas por Balbinot Junior et al. (2009), tem-se: i) Diversificação de renda: resultante da produção vegetal e animal na mesma área; ii) Redução de riscos de insucesso econômico: também pela diversificação de atividades econômicas; e iii) Aumento da renda por área: devido ao aumento da produtividade por área e à redução dos custos de produção devido às vantagens biológicas. Já para Macedo (2009), dois aspectos chamam a atenção quando se analisa sustentabilidade dos sistemas agropecuários: o uso do solo com preparo excessivo e monocultivos, e a degradação das pastagens. Segundo o autor, o monocultivo e práticas culturais inadequadas na agricultura, como o preparo tradicional do solo, têm causado queda na produtividade, degradação do solo e dos recursos naturais. Sistemas contínuos de monocultivos, por sua vez, aumentam a ocorrência de pragas e doenças, tais como o percevejo castanho da soja, o cancro da haste, o nematóide das galhas, e o nematóide do cisto com inúmeros prejuízos à sojicultura, e mais recentemente a ferrugem da soja. Completa Macedo (2009) que, na ILP, a introdução de lavouras não é eventual mas parte constante de um sistema de produção de grãos e de produção animal que interagem e se completam em aspectos do manejo, da fertilidade, da física e da biologia do solo, aumentando a renda dos produtores e trazendo progresso social ao campo. Para o autor, mais recentemente tem crescido a ILP como alternativa muito eficiente, porém mais complexa, de manutenção da produtividade e de recuperação/renovação indireta de pastagem. As vantagens da ILP também foram discutidas por Macedo (2009). Para o autor, do ponto de vista das propriedades físicas e químicas do solo, há uma melhoria na fertilidade, pela ciclagem dos nutrientes e eficiência no uso

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de fertilizantes, em função das diferentes necessidades das culturas em rotação. As alterações nas propriedades físicas têm sido o aumento da estabilidade dos agregados, a diminuição da densidade aparente, a compactação e o aumento da taxa de infiltração de água. Outra vantagem citada por Macedo (2009) refere-se à possibilidade de redução de pragas, doenças e plantas invasoras. De forma geral, o autor sugere como principal hipótese favorável à ILP o efeito positivo das lavouras em elevar a fertilidade, amortizando os custos pela venda dos grãos, subprodutos e a melhoria das propriedades físicas pela ação das raízes das forrageiras, que melhorariam a estrutura, elevariam os estoques de carbono, e a capacidade de infiltração e retenção de água no solo. Completa ainda que, com a melhoria dessas qualidades haveria, também, um incremento na densidade e na riqueza da fauna do solo e outros atributos microbiológicos. Outros autores discutem amplamente as vantagens da integração entre lavoura e pecuária. São eles: Fontaneli et al. (2000), Ambrosi et al. (2001), Costa & Macedo (2001), Cobucci et al. (2007), Muniz (2007), Martha Jr. et al. (2008). A adoção da ILP, portanto, implica lidar com a complexidade dos sistemas produtivos, em especial pela inter-relação entre solo, planta, animal, homem e ambiente. Nesse sentido, os modelos matemáticos podem ser úteis na tentativa de se representar, de forma mais sucinta e objetiva, as principais relações de causa e efeito dos sistemas produtivos e, com isso, gerar um nível menor de incerteza nas tomadas de decisão dos agentes envolvidos (Gameiro, 2009). Especificamente em relação ao uso dos modelos de tomada de decisão por parte dos agricultores e pecuaristas, Rennó (2005) abordou suas principais vantagens e refere-se a tais modelos como “sistemas de suporte à decisão” (SSD). Para o autor, referenciando-se em Newman et al. (1999), a utilização de SSD na produção animal permite aos produtores obterem vantagens como: 1) integrar as informações pertinentes aos seus sistemas de produção numa forma mais utilizável; 2) melhorar as técnicas de manejo utilizadas e, desta forma, implementar e aperfeiçoar a tomada de decisão; 3) aumentar a capacidade de analisar o custo/benefício e o risco das modificações introduzidas nos sistemas de produção e; 4) permitir que sejam realizadas comparações efetivas de custos de produção sob várias alternativas de produção. Ainda para Rennó (2005) a técnica de análise de sistemas de produção através da simulação, aplicada no contexto da produção pecuária, permite perceber como o sistema reagirá diante de mudanças genéticas, de manejo ou ambientais, assim como testar novas hipóteses. A contribuição dos modelos de simulação computacionais à análise de sistemas pecuários, já existentes ou projetados, tem se tornado mais importante devido ao avanço das

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técnicas computacionais e à necessidade de maior integração dos resultados experimentais das diversas disciplinas. Do ponto de vista de definição e avaliação de políticas públicas com uso de modelos matemáticos, os trabalhos mais recentes que consideram sua adoção têm sido desenvolvidos na Europa, em especial na Universidade de Wageningen, na Holanda. O artigo de Janssen & Ittersum (2007) apresenta uma ampla revisão sobre os modelos denominados “bioeconômicos” aplicados na agropecuária. Esses são modelos que procuram considerar os aspectos econômicos, sociais e ambientais, tanto em nível local (em termos de gleba de terra), quanto em nível macro (nacional, continental, mundial). Tais esforços vêm sendo conduzidos, em grande parte, no contexto de um amplo projeto denominado System for Environmental and Agricultural Modelling (SEAMLESS). Trata-se de um projeto da União Européia, composto por 29 instituições de pesquisa, com especialistas nas áreas de agricultura, ecologia, economia, gestão de fazendas, tecnologia da informação, análise institucional, pesquisa participativa, sociologia, análise de sistemas e simulação, e engenharia de sistemas (SEAMLESS, 2010). Nesse sentido, vale o registro de uma das principais áreas de conhecimento relacionadas à modelagem matemática com vistas à otimização: a Pesquisa Operacional. A Sociedade Brasileira de Pesquisa Operacional (SOBRAPO) a define como:

“[...] uma ciência aplicada voltada para a resolução de problemas reais. Tendo como foco a tomada de decisões, aplica conceitos e métodos de várias áreas científicas na concepção, planejamento ou operação de sistemas. A Pesquisa Operacional é usada para avaliar linhas de ação alternativas e encontrar as soluções que melhor servem aos objetivos dos indivíduos ou organizações. Através de desenvolvimentos de base quantitativa, a Pesquisa Operacional visa também introduzir elementos de objetividade e racionalidade nos processos de tomada de decisão, sem descuidar, no entanto, dos elementos subjetivos e de enquadramento organizacional que caracterizam os problemas” (SOBRAPO, 2010).

As aplicações de modelagem visando à otimização da produção agropecuária começaram a surgir com mais evidência na década de 70. Alguns trabalhos referenciais internacionalmente são: Beneke & Winterboer (1973), Casey (1977), Balm (1980), Sargent (1980), Butterworth (1985) e Zuo et al. (1991). Azevedo Filho & Neves (1988) apresentaram uma revisão de literatura sobre o uso da Pesquisa Operacional na agricultura brasileira. Para os autores, a utilidade de Pesquisa Operacional na agricultura decorre de

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sua natureza multidisciplinar que envolve métodos e técnicas quantitativas que visam determinar decisões ótimas sob vários aspectos, assim como estabelecer padrões e critérios para alocação de recursos. Os autores ressaltam que a Pesquisa Operacional envolve, basicamente, a aplicação de métodos científicos e matemáticos para a solução de sistemas complexos. Reforçam que não é apenas um ramo da matemática aplicada, mas o inter-relacionamento dos conhecimentos de diversas disciplinas. Segundo os autores, o interesse pela Pesquisa Operacional no Brasil surgiu em 1955, com o Professor Rui A. S. Leme, da Faculdade de Economia da Universidade de São Paulo, que promoveu um seminário para discussão de aplicações da Programação Linear4

a problemas de Economia. Especificamente com aplicação na agricultura, Azevedo Filho & Neves (1988) mencionam que foi o próprio Professor Leme que, em 1960, desenvolveu um trabalho de formulação de rações a custo mínimo para duas empresas do setor na época. Azevedo Filho & Neves (1988) afirmam que a Pesquisa Operacional, e em especial a Programação Linear – uma de suas principais técnicas –, pode ser aplicada à solução de diversos problemas na agricultura, tais como: otimização de rações e dietas, planejamento de fazendas e empresas agroindustriais, otimização de transporte e localização espacial, análise e planejamento de experimentos, planejamento regional, inter-regional e política agrícolas, e planejamento florestal. Em relação à aplicação em planejamento de fazendas e empresas agroindustriais, os autores identificam 81 trabalhos elaborados por autores brasileiros, sendo cinco na década de 1960, 47 trabalhos na década de 1970 e 29 na década de 1980. Azevedo Filho & Neves (1982) utilizaram um modelo de Programação Linear para definir a melhor estratégia entre diferentes sistemas de confinamento de bovinos de corte no estado de São Paulo e possibilidades de aplicação do capital em outras alternativas de mercado. O estudo foi motivado pela percepção – já no início da década de 80 – de que áreas com culturas de exportação e energéticas, no estado, estavam tornando praticamente inviável a pecuária extensiva. O modelo de Azevedo Filho & Neves (1982) considerou quatro níveis de ganho de peso e, para cada nível de ganho de peso, existia uma exigência nutricional que deveria ser atendida por uma combinação de alimentos que otimizasse o modelo. As exigências nutricionais 4A “Programação Linear” é uma das principais técnicas da Pesquisa Operacional. É amplamente utilizada devido à relativa simplicidade de modelagem matemática a ser solucionada, à disponibilidade de diversos algoritmos no mercado e à possibilidade de encontrar solução ótima e única (quando existente) para sistemas complexos. O modelo matemático a ser resolvido por técnicas de Programação Linear é normalmente composto, como sugere o nome, por equações e/ou inequações lineares. Há uma função objetivo linear que deve ser otimizada (maximizada ou minimizada), respeitando um conjunto de equações e/ou inequações também lineares denominadas restrições.

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consideradas foram: proteína bruta, proteína digestível, energia metabolizável, cálcio, fósforo, vitamina A entre outras. Quanto à época de compra e venda dos animais, foram considerados três períodos para cada uma. Interessante ressaltar que os autores consideraram o custo de oportunidade do capital e também a receita adicional advinda da comercialização do esterco dos animais confinados. Na década de 1990, Toniello & Caixeta Filho (1992) desenvolveram um modelo de Programação Linear para o planejamento de uma propriedade agrícola na região Centro-Oeste do Brasil. Os autores consideraram como culturas candidatas, a soja, o algodão, o milho, a avicultura de corte e a pecuária de corte. A partir dos custos de produção por hectare, das receitas esperadas e do limite de crédito rural disponível para cada cultura foram calculadas as áreas ótimas para cada atividade. Caixeta Filho (1993) dedicou-se à modelagem para otimização e planejamento da colheita de laranjas para fins industriais. Dossa (1994) desenvolveu um modelo de Programação Linear para servir como ferramenta auxiliar no planejamento de uma propriedade rural produtora de leite, grãos de inverno e verão no Paraná. O que motivou o autor a desenvolver o trabalho foi a constatação de que os produtores precisavam melhorar sua eficiência técnico-econômica na gestão das propriedades rurais do Estado. Araújo & Caixeta Filho (1998) estimaram uma fronteira de eficiência econômica utilizando Programação Linear e incluindo o risco, em 33 empresas agrícolas na região Sul do estado de Santa Catarina. No final da década de 1990, Caixeta Filho et al. (2002) desenvolveram um modelo de otimização para o planejamento da produção de lírios. Este trabalho, antes de ser publicado, recebeu no ano de 2001 o “Franz Edelman Award - Honorable Mention”, do Insitute for Operations Research and the Management Sciences (INFORMS), principal entidade norte-americana promotora da Pesquisa Operacional. A experiência na aplicação da Pesquisa Operacional pela ESALQ/USP permitiu o lançamento, no ano de 2001, do livro “Pesquisa Operacional: Técnicas de Otimização Aplicadas a Sistemas Agroindustriais” (Caixeta Filho, 2001), que atualmente é um dos principais livros-texto para estudo e ensino desta ciência quando aplicada à produção agropecuária e agroindustrial. Mais recentemente, Biagio et al. (2007) desenvolveram um modelo matemático para o planejamento da produção de grãos em uma propriedade rural no estado de Minas Gerais. O trabalho, além dos atributos técnicos e econômicos, preocupou-se em incluir variáveis financeiras visando auxiliar na tomada de decisão de como o agricultor deveria obter recursos para financiamento da produção, diante de linhas alternativas de crédito rural. Milan (2008) propôs um modelo de Programação Linear multiobjetivo para o planejamento da produção - especialmente o sequenciamento de colheita -, de

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cafés finos em uma fazenda localizada no estado de São Paulo. A aplicação de técnicas de otimização, em especial a Programação Linear, tem sido particularmente mais recorrente para o planejamento e corte de áreas de produção florestal. São exemplos de referências nesse sentido: Garcia (1990), Bueno et al. (1993), Fidelis & Reis (2001), Ohman & Lamas (2003), Ducheyne et al. (2004) e Kangas & Kangas (2005). Apesar de diversos trabalhos de otimização aplicados à agropecuária mencionarem ou reconhecerem o caráter multidisciplinar dessas técnicas, a grande parte considera apenas variáveis e restrições de ordem técnica e econômica, sendo raros os que incluem variáveis ambientais e, ainda mais escassos aqueles que incluem variáveis sociais. Quingzhen et al. (1991) descreveram a aplicação de um modelo de programação linear em um projeto de desenvolvimento de planejamento da produção agropecuária na China. O modelo visava o aumento da renda líquida sem gerar efeitos adversos sobre o meio ambiente. Annetts & Audley (2002) propuseram um modelo de otimização multiobjetivo para o planejamento da produção agropecuária considerando tanto aspectos econômicos (maximização do lucro), quanto ambientais. Trata-se de uma referência bastante interessante para a inspiração de modelos com múltiplos objetivos por meio da Programação Linear. Em relação à questão ambiental, um tema de grande relevância refere-se à rotação de culturas, pois essa prática apresenta uma série de benefícios em termos biológicos e agronômicos. Dogliotti (2003) tem sido uma importante referência para trabalhos de planejamento da produção considerando esquemas ótimos de rotação de culturas. Detlefsen & Jensen (2006) desenvolveram um modelo de otimização cujo principal objetivo era definir a melhor sequência de culturas vegetais em uma mesma área agrícola. No Brasil, a tese de Santos (2009) abordou a programação de rotação de culturas, focando na produção de base sustentável de hortaliças. Segundo a autora, a produção de hortaliças é particularmente complexa por envolver um grande número de culturas com limitações específicas no que se refere a aspectos técnicos, como época de plantio e colheita; e a aspectos ecológicos, como adubação verde, pousio, dentre outros. Aplicações de modelagem matemática especificamente na área da Zootecnia também vêm sendo desenvolvidas mais recentemente. Karmakar et al. (2007) elaboraram uma completa revisão de literatura sobre as ferramentas disponíveis para a tomada de decisão integrada quanto ao uso/destino de dejetos animais. O trabalho de Silva Neto & Retzlaff (2004) é um dos poucos encontrados na literatura brasileira específica de Zootecnia nos últimos anos. Os autores desenvolveram modelagem de otimização sob condição de incerteza

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para a avaliação econômica de sistemas de integração lavoura-pecuária de leite. A experiência de Silva Neto culminou com o lançamento recente do livro “Modelagem e planejamento de sistemas de produção agropecuária” (Silva Neto & Oliveira, 2009), que certamente também passará a compor a biblioteca dos estudiosos de Pesquisa Operacional aplicada à produção.

3. PROPOSIÇÃO DE UM MODELO MATEMÁTICO MULTIOBJETIVO DE PLANEJAMENTO E OTIMIZAÇÃO DE UMA PROPRIEDADE RURAL O modelo para planejamento e otimização de propriedade rural caracterizada pela integração entre lavoura e pecuária a ser apresentado nesta seção pode ser classificado como “multiobjetivo”. O que caracteriza um modelo de Programação Linear como “multiobjetivo” – tal como sugere o nome – é o fato de sua função objetivo ser composta por mais de um conjunto de atributos a serem otimizados.Tradicionalmente, a função objetivo é composta por um único atributo, como o lucro, por exemplo, a ser maximizado. Contudo, diante da necessidade iminente de se contemplar, nos estudos de planejamento agropecuário, também variáveis ambientais e sociais, é necessário que se trabalhe com uma função multiobjetivo, como será descrito na sequência. Será apresentada a estrutura matemática básica de um modelo dessa natureza, com o intuito de se discutir: i) a importância de tal ferramenta; ii) a necessidade de se dispor de dados relevantes para o seu processamento; iii) sua potencialidade em termos de respostas e análises que podem ser obtidas e desenvolvidas, respectivamente; e iv) suas principais limitações.

3.1. Função multiobjetivo:

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As expressões (2), (3) e (4) representam, respectivamente, os objetivos relacionados à maximização do lucro, à minimização do impacto ambiental e à maximização da inserção social.

3.2. Variáveis endógenas: 3.2.1. Quantidade das culturas

Xi,t representa a quantidade (em hectares, se forem culturas vegetais e em cabeças se forem criações animais) da cultura i no período t.

3.2.2. Quantidades movimentadas

representa a quantidade (em unidade de peso) movimentada de material fertilizante f da cultura animal (iA) para a cultura vegetal (iV) no período t.

representa a quantidade (em unidade de peso) movimentada de nutriente n da cultura vegetal (iV) para a cultura animal (iA) no período t.

3.3. Restrições econômicas 3.3.1. Lucro econômico (LE): representado pela receita (R) diminuída pelos custos variáveis (CV) e fixos (CF) de produção, pelos custos logísticos de suprimento de insumos (CS) e de distribuição de produtos (CD).

Desmembrando-se a equação (5) tem-se que:

3.3.2. Receita (R): preço do produto, multiplicado pela sua produtividade e pela quantidade (área para vegetais e cabeças para animais):

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onde: precoprodi,t = preço do produto i (R$/t para produtos vegetais ou R$/UA5 para produtos animais), no período t; produtividadei,t = produtividade da cultura i no período t (t/hectare ou UA/cabeça); e Xi,t = quantidade da cultura i no período t (hectares para vegetais e cabeças para animais).

3.3.3. Custo Variável (CV): somatória dos custos variáveis de produção multiplicados pela quantidade:

onde: custovi,m= custos variáveis (fertilizantes, defensivos, sementes, inseminação, combustível, medicamentos, rações, suplementos etc.), em R$/hectare ou R$/animal. Mais especificamente para culturas vegetais:

Para culturas animais:

Em (8) e (9), tem-se os seguintes custos variáveis: 3.3.3.1. Sementes custosemi,t = custo com semente na cultura i no período t (R$/hectare):

psemi,t representa o preço unitário da semente i no período t (R$/kg) e qsemi,t a quantidade da semente i a ser utilizada em t (kg/hectare).

Consequentemente, a quantidade total utilizada da semente i em t será:

5Para simplificar a representação do modelo, será utilizada a sigla “UA” para representar “unidade animal”, podendo esta dizer respeito ao número de cabeças, à quantidade de litros de leite, número de ovos, quilogramas de peso vivo etc., dependendo da situação. Quando for considerado necessário, esta equivalência será devidamente detalhada.

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3.3.3.2. Fertilizantes custoferi,t: custo com todos os fertilizantes f na cultura i no período t (R$/hectare):

pferi,t representa o preço unitário do fertilizante f a ser aplicado na cultura i no período t (R$/kg) e qferi,t a quantidade do fertilizante f a ser utilizada em t (kg/hectare). Assim, tem-se que:

TROCAS DE FERTILIZANTES As culturas animais são potenciais ofertantes de fertilizantes para as culturas vegetais (potenciais demandantes). Essa troca implica custos logísticos de movimentação dos resíduos animais (esterco, basicamente). Considera-se, portanto, outro conjunto de variáveis endógenas ( ), representadas pelas quantidades movimentadas de cada cultura animal (iA) para cada cultura vegetal (iV), tal como já apresentado anteriormente. A quantidade do fertilizante f ofertado pela cultura animal iA no período t deve totalizar as quantidades movimentadas para as potenciais culturas vegetais iV , que representam os destinos demandantes. Portanto, para todo fertilizante f, toda iA em todo t, tem-se que:

Além dessa oferta das culturas animais, deve-se considerar a possibilidade de aquisição dos fertilizantes no mercado:

onde Qferiv,f,t é a quantidade do fertilizante f adquirido no mercado no período

t, que deve totalizar a soma dos fluxos logísticos desse fertilizante com destino às culturas vegetais iV no período t. A demanda por fertilizante pelas d i f e r e n t e s culturas vegetais iV também deve ser considerada visando o equilíbrio, tal que:

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3.3.3.3. Defensivos custodefi,t: custo com defensivo na cultura i no período t (R$/hectare):

pdefd,t representa o preço unitário do defensivo d a ser aplicado na cultura i no período t (R$/kg ou R$/l) e qdefi,f,t a quantidade do fertilizante f a ser utilizada em t (kg/hectare ou l/hectare). Consequentemente, a quantidade total utilizada de defensivos na cultura i em t será:

3.3.3.4. Combustível custocomi,t= custo com combustível na cultura i no período t (R$/hectare);

sendo pcomi,t o preço unitário do combustível no período t (R$/l) e qcomi,t

a quantidade de combustível a ser utilizada na cultura i em t (kg/hectare). Consequentemente, a quantidade total utilizada de combustível em t será:

3.3.3.5. Serviços custoseri,t= custo com serviços na cultura i no período t (R$/hectare);

sendo pinsi,t o preço unitário do serviço no período t (R$/hora) e qseri,t a quantidade de horas a serem utilizadas na cultura i em t (hora/hectare). Consequentemente, a quantidade total utilizada de serviços em t será:

3.3.3.6. Inseminação custoinsi,t= custo com inseminação para a pecuária i no período t (R$/animal);

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sendo pinsi,t o preço unitário da inseminação no período t (R$/dose) e qinsi,t a quantidade de doses a serem utilizadas na cultura i em t (dose/animal). Consequentemente, a quantidade total utilizada de inseminação em t será:

3.3.3.7. Nutrição animal custonuti,t= custo com nutrição para a pecuária i no período t (R$/animal);

sendo pingg,t o preço unitário do ingrediente g (farelo de soja, pelet de polpa cítrica, caroço de algodão etc.) a ser fornecido à pecuária i no período t (R$/kg) e qingi,g,t a quantidade do ingrediente g a ser utilizada em t (kg/animal).

Portanto:

TROCAS DE NUTRIENTES As culturas vegetais são potenciais ofertantes de nutrientes para as culturas animais (potenciais demandantes). Essa troca implica custos logísticos de movimentação dos nutrientes. Considera-se, portanto, outro conjunto de variáveis endógenas ( ), representadas pelas quantidades movimentadas de cada cultura vegetal (iV) para cada cultura animal (iA), tal como já apresentado anteriormente. A quantidade do nutriente n ofertado pela cultura vegetal iV no período t deve totalizar as quantidades movimentadas para as potenciais culturas animais iA que representam os destinos demandantes. Portanto, para todo nutriente n, toda iV em todo t, tem-se que:

Além dessa oferta das culturas vegetais, deve-se considerar a possibilidade de aquisição dos nutrientes no mercado, ou seja:

onde QnutiM

,iA

,n,t é a quantidade do nutriente n adquirido no mercado no período t, que deve totalizar a soma dos fluxos logísticos desse nutriente a partir da

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fonte de suprimento do mercado iM com destino às culturas animais iA no período t. Os nutrientes n (proteínas, carboidratos, lipídeos e sais minerais) estão contidos em ingredientes g (farelo de soja, pellet de polpa cítrica, grão de milho etc.), de modo que se deve considerar a sua relação:

A quantidade no nutriente n, a partir do mercado iM a ser fornecida à pecuária iA será a soma das quantidades dos diferentes ingredientes g multiplicadas pelas concentrações c do nutriente nos respectivos ingredientes. A demanda por nutriente pelas diferentes culturas animais Dnuti

A,n,t

também deve ser considerada visando o equilíbrio, tal que:

A dinâmica das relações de troca entre culturas vegetais e animais, para fertilizantes e nutrientes, pode ser representada pela Figura 1.

Figura 1. Dinâmica de trocas de fertilizantes e nutrientes entre culturas animais e vegetais.

Uma determinada cultura animal iA pode fornecer a quantidade de material fertilizante (basicamente representado pelos dejetos

orgânicos) para a cultura vegetal (iV). Caso alguma quantidade desse material

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não venha a ser aproveitada pelas culturas vegetais, é caracterizado como resíduo RSi

A, sendo disposto, de alguma forma, no ambiente. Além do material fertilizante ofertado pelas culturas animais, pode ser necessária a obtenção de certa quantidade do fertilizante no mercado (compra). Este fluxo é representado pela variável Zi

M,iV. De forma análoga, as culturas vegetais (iV) podem fornecer

os nutrientes para as culturas animais YiV,i

A, via a produção e o fornecimento de grãos, forragens, silagens e resíduos vegetais. Quando não suficiente, a propriedade terá de adquirir tais nutrientes no mercado: Yi

M,iV .

3.3.3.8. Medicamentos customedi,t: custo com medicamentos para a pecuária i no período t (R$/animal);

sendo pmedm,t o preço unitário do medicamento m a ser fornecido à pecuária i no período t (R$/dose) e qmedi,t a quantidade do ingrediente g a ser utilizada em t (dose/animal). Consequentemente, a quantidade total utilizada de medicamentos na cultura i em t será:

3.3.4. Custo de Suprimento (CS): custo de suprimento de todos os insumos utilizados em todas as culturas i e períodos t considerados:

de tal forma que:

Essas expressões calculam o custo de suprimento da cultura i no

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período t, sendo função do custo unitário de transporte (ct_i,t) e da quantidade a ser suprida de cada insumo (Q_i,t).

3.3.5. Custo de Distribuição (CD): custo de distribuição de produtos.

3.3.6. Custo Fixo (CF): custo fixo da propriedade.

3.4. Restrições ambientais 3.4.1. Impacto ambiental (IA): representado pelos gases de efeitos estufa emitidos (GE) descontados os gases de efeito estufa sequestrados pela cultura (GS), adicionando os resíduos animais gerados não-aproveitados (RG) e os resíduos químicos disponibilizados no ambiente (RQ)6 .

Desmembrando-se a equação (43), tem-se que: 3.4.2. Gases de efeito estufa emitidos (GE): emissão estimada de gases por cultura multiplicada pela quantidade (área para vegetais e cabeças para animais):

A emissão dos gases ocorre naturalmente pela cultura e pela combustão do combustível utilizado em suas operações mecânicas:

3.4.3. Gases de efeito estufa sequestrados (GS): volume de gases sequestrados por cultura, multiplicado pela quantidade (área para vegetais e cabeças para animais):

6A definição de uma unidade comum para esses parâmetros, em princípio, seria necessária, sendo esse um desafio para futuras pesquisas nas respectivas áreas.

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O sequestro dos gases ocorre naturalmente pela cultura:

3.4.4. Resíduos gerados (RG): volume de resíduos de origem animal gerado por cultura (não aproveitado sequencialmente por alguma cultura vegetal), multiplicado pela quantidade (cabeças):

3.4.5. Resíduos químicos (RQ): volume de resíduos químicos (defensivos agrícolas) aplicados por cultura, multiplicado pela área da cultura:

3.5. Restrições sociais 3.5.1. Inserção social (IS): representado pela soma da mão de obra da família envolvida nas atividades (MF), da mão de obra permanente contratada (MC), da mão de obra terceirizada (MT) e do número de dependentes diretos dessa mão de obra (DM).

Desmembrando-se a equação (50), tem-se que: 3.5.2. Mão de obra familiar (MF): número de horas de trabalho de pessoas da família do proprietário que atuam na atividade:

O número de empregos gerados é assim calculado:

3.5.3. Mão de obra contratada (MC): número de horas de trabalho de pessoas contratadas que atuam na atividade:

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O cálculo do número de empregos gerados dá-se da mesma forma que no item anterior. 3.5.4. Mão de obra terceirizada (MT): número de horas de trabalhos pessoas terceirizadas que atuam na atividade:

O cálculo do número de empregos gerados dá-se da mesma forma que no item anterior. 3.5.5. Dependentes da mão de obra (DM): número de pessoas que dependem diretamente da mão de obra familiar, contratada ou terceirizada que atuam na fazenda.

3.6. Restrições técnicas7

3.6.1. Restrições de disponibilidade de terra

Limitam a disponibilidade de terra para as diferentes culturas alternativas em determinado período t, sendo Xi

v a área das culturas vegetais, li

A a lotação (cabeças de animais por hectare) e XiA a quantidade de animais.

3.6.2. Restrições de disponibilidade de máquinas e implementos Limitam a disponibilidade de máquinas e equipamentos na propriedade. Tais restrições podem implicar a necessidade de contratação de serviços terceirizados de mecanização.

3.6.3. Restrições de disponibilidade de mão de obra Limitam a disponibilidade de mão de obra própria e contratada para as diferentes culturas alternativas em determinada estação de determinado ano. Tais restrições podem implicar a necessidade de contratação de mão de obra terceirizada em determinadas estações.

3.6.4. Restrições de disponibilidade de crédito Limitam a disponibilidade de recursos próprios disponíveis, indicando a necessidade de se alavancar financeiramente no mercado.

7A título de ilustração, apenas a restrição de disponibilidade de terra será apresentada algebricamente.

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3.6.5. Restrições nutricionais Limitam a disponibilidade de nutrientes por meio das culturas cultivadas, indicando a eventual necessidade de aquisição de nutrientes no mercado, sejam eles volumosos ou concentrados. Os nutrientes serão desagregados nas suas principais frações (proteínas, carboidratos, lipídeos, sais minerais). Também são consideradas restrições para o atendimento das exigências nutricionais das espécies e categorias animais criadas na propriedade.

3.6.6. Restrições de fertilidade do solo Limitam a disponibilidade de nutrientes no solo, indicando a necessidade de adubação. As criações animais podem fornecer nutrientes a serem aplicados ao solo. Os nutrientes serão desagregados nas suas principais frações (nitrogênio, fósforo, potássio etc.).

3.7. Obtenção dos dados e processamento do modelo Uma vez definida a estrutura matemática, é necessário o levantamento de todos os parâmetros envolvidos nas equações e inequações formuladas. Tais informações podem vir tanto de observação a campo e no mercado, quanto de experimentos científicos. Por meio de software8 específico, o modelo pode ser então processado.

Seus resultados indicarão o planejamento da propriedade, ou seja, as áreas, o número de animais (por espécie/categoria), em cada período (que pode ser um mês, semestre, safra etc.) que resultarão na maximização de MOBJ (a função multiobjetivo), ponderada para os três atributos considerados: econômicos, ambientais e sociais, respeitando-se todas as restrições previamente definidas.

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS Este capítulo procurou apresentar o estado da arte da modelagem matemática aplicada ao planejamento da produção agropecuária. Procurou-se destacar que o aumento da complexidade envolvida nos sistemas produtivos – em função de uma “nova” racionalidade do homem – implicará a necessidade de desenvolvimento de novos métodos e ferramentas auxiliares no processo de tomada de decisão quanto às três questões centrais dos sistemas sociais: o que produzir, como produzir e para quem produzir.

8O algoritmo conhecido como “Simplex” é o mais tradicionalmente utilizado para a solução de problemas de Programação Linear. Diversos software disponíveis no mercado possuem solver que normalmente incorpora tal algoritmo, possibilitando assim a obtenção da solução para o modelo.

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Apresentou-se um modelo matemático teórico que pode ser aplicado no planejamento visando a otimização de uma propriedade rural, especialmente caracterizada pela integração entre lavoura e pecuária. O modelo apresentado suscita algumas considerações que são listadas a seguir e que procuram resumir a potencialidade e os desafios de tais ferramentas. O modelo apresenta uma solução que contempla, conjunta e concomitantemente, uma série de fatores (parâmetros e variáveis) que se relacionam entre si das mais diversas formas. Esta é uma característica intrínseca aos modelos de programação linear que se configura como uma das suas principais vantagens: levar em consideração um grande número de informações e apontar a melhor solução dentre as inúmeras possíveis, algo que a mente humana, por mais privilegiada que seja, não consegue fazer ante à complexidade dos sistemas. O modelo pode ser utilizado como ferramenta para simular os impactos na realocação dos recursos diante de mudanças nas prioridades (pesos) atribuídas a cada um dos três grupos de variáveis consideradas: econômicas, ambientais e sociais. Em outras palavras, como mudaria o planejamento das culturas na propriedade se fosse aumentado o peso atribuído às variáveis ambientais? O que aconteceria se, ao invés de se preocupar mais com o retorno econômico (lucro), houvesse a preocupação de que a propriedade fosse capaz de absorver mais mão de obra? São apenas alguns exemplos para reflexão. O modelo pode ser útil para avaliar o impacto de alterações em parâmetros econômicos, agronômicos e zootécnicos. Consequentemente, ele pode ser útil para avaliar impacto de pesquisas científicas que propõem mudanças tecnológicas que alteram tais parâmetros. Como alteraria o retorno da propriedade se aumentasse a produtividade de leite por vacas (litros/vaca/dia), devido a um melhoramento genético? Qual seria o retorno se fosse produzida uma silagem com maior percentagem de energia líquida? Qual o retorno se houvesse um aumento significativo no preço do litro do diesel? O que aconteceria se, eventualmente, fosse cobrada uma taxa sobre cada tonelada de CO2 equivalente emitido pelos animais? E assim sucessivamente. Para a elaboração do modelo, como pode ser claramente observado, é necessário que se tenha disponível um detalhamento bastante minucioso dos dados de todas as culturas. Isso exigirá, no campo, um controle rigoroso dos coeficientes técnicos e do uso dos fatores de produção (horas-máquina, litro de defensivos, produtividade por animal etc.). Na pesquisa científica, provavelmente também surgirão desafios: quantos kg de CO2 equivalente emite um animal sob determinadas condições? Quanto de cada um dos principais nutrientes uma determinada cultura em determinadas condições extrai do solo, quanto ela devolve a ele? Etc.

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Visto haver a necessidade de certo conhecimento matemático de modelagem, para se processar e fazer uso do modelo no campo é necessário treinamento e reciclagem periódicos por parte dos usuários, como engenheiros agrônomos, técnicos agrícolas, médicos veterinários, zootécnicas, administradores, entre outros.

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CAPÍTULO X

EFEITO DA INTERAÇÃO NUTRIÇÃO E REPRODUÇÃO EM REPRODUTORES SUÍNOS

Aníbal de Sant’Anna Moretti1, Simone Maria Massami Kitamura Martins1, Esther Ramalho Afonso1, Larissa José Parazzi1, Octávio

Henrique Orlovsky Eckhardt 1, Tácia Antunes Del Santo1

1Laboratório de Pesquisa em Suínos, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo1Mestrando, Depto. de Nutrição e Produção Animal; 2Doutoranda, Depto. de Reprodução Animal FMVZ – USP 3Prof. Dr. Depto. de Nutrição e Produção Animal – FMVZ – USP

1.INTRODUÇÃO A suinocultura diante do atual avanço no conhecimento técnico e científico principalmente nas áreas do melhoramento genético, vive momentos de mudanças na biologia do animal, as quais tem requerido novas adaptações nos vários segmentos da produção, visando atender a progressiva melhora na produtividade e qualidade do produto final. Com o desenvolvimento dos programas de seleção genética e hibridação, pesquisadores se vêem diante da necessidade em avaliar as novas linhagens, quanto ao desempenho reprodutivo de fêmeas, bem como, quanto a definição de estratégias que possam adequar o potencial o potencial genético conquistado com a precocidade de crescimento dos animais. Diante dessa perspectiva, atenção deve ser dada às fêmeas primíparas, pois, deve ser considerada a conciliação da continuidade do seu crescimento desde a puberdade seguindo-se com o período pós púbere, a posterior manutenção da primeira gestação, o adequado aporte de nutrientes aos embriões e fetos, a galactogênese, mamogênese e ainda o posterior retorno a atividade estral pós-desmame ( Whittemore,1996; Verstegen et al.,1998;). A utilização de um manejo nutricional inadequado em uma fase do ciclo reprodutivo pode influenciar vários aspectos da biologia reprodutiva, tendo como reflexo o possível prolongamento do intervalo desmame estro fértil, a diminuição da taxa de ovulação e redução da sobrevivência embrionária (Foxcroft, 1997; Sincclair et al.,2001). Nesta interação, nutrição e reprodução, estão relacionadas diversas substâncias, dentre as quais, nutrientes, hormônios e neuropeptídeos, os quais atuam em mecanismos fisiológicos variados, agindo em diferentes pontos do eixo hipotálamo- hipófise-ovário-útero (Prunier e Quesnel, 2000).

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Busca-se, na verdade, o entendimento necessário para proporcionar às fêmeas suínas um desempenho reprodutivo que, em um seqüencial de acréscimos de parto a parto, mantenha um estado metabólico ideal e característico para a faixa etária e fase de produção específica. Nesta linha de investigação, destaca-se a importância de averiguações que elucidem os fatores nutricionais que contribuam com a ocorrência de perdas na eficiência reprodutiva em fêmeas suínas levando a redução do número de leitões na segunda leitegada , conhecida com Síndrome do Segundo Parto. Esta síndrome pode ser resultante de um desenvolvimento folicular limitado e de um recuperação incompleta de eixos endócrinos ligados à reprodução, fruto de um catabolismo acentuado na primeira lactação, a um nível tal que desencadeie o processo, aliado invariavelmente a alteração do estado metabólico da matriz com reflexos na eficiência reprodutiva futura. Dada a multifatoriedade do processo alia-se nas hipóteses os efeitos da dieta na gestação, cujos reflexos estariam associados a uma menor taxa de ovulação e menor sobrevivência embrionária, das primíparas ( Kemp e Soede, 2004), as quais apresentariam maior predisposição à perda de peso durante a lactação, devido a menor capacidade de ingestão de ração( Whittemore, 1996;Guedes e Nogueira,2001; Thaker e Bilkei, 2005; Schenkel,et al.,2010). Isto justificaria o fato de fêmeas que pariram um maior número de leitões de leitões no primeiro parto, estariam sujeitas a maiores perdas na lactação, sendo assim propensas à apresentação da Síndrome do Segundo Parto (Schenkel et al., 2005). Tais estudos devem avaliar as correlações entre sua manifestação e o estado metabólico das fêmeas.

2. PRODUTIVIDADE DA FÊMEA SUÍNA A busca pela maior produtividade nos sistemas de produção de suínos tem levado ao interesse sobre a longevidade das fêmeas. A produtividade de plantéis suínos é aferida através do número de leitões desmamados/porca/ano, que por sua vez é fortemente influenciado por inúmeros fatores, como: número de dias não-produtivos, duração de aleitamento, número de natimortos por leitegada, mortalidade pré-desmame e, logicamente, tamanho da leitegada (Clark et al., 1986; XUE et al., 1997a; Lucia Junior etal., 1999, 2000). Segundo Clark e Leman (1987) e Clark, Leman e Morris (1988) o tamanho da leitegada, por sua vez, é diretamente ligado à ordem de parto, idade e época do ano a primeira concepção, manejo reprodutivo, linhagem da fêmea e duração da lactação. O tamanho da leitegada aumenta com o maior número de partos, atingindo o pico de leitões nascidos vivos no 4º parto e o máximo de total de leitões nascidos no 5º ou 6º partos (Kyriazakis, 1999). Na avaliação de um rebanho de 5500 matrizes localizado no centro oeste brasileiro, Schenkel et al. (2005), verificaram diminuição da segunda

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leitegada em 55% das fêmeas. Os mesmos autores em 2010 avaliando em 1220 fêmeas a problemática de um rebanho que mostrava falhas reprodutivas associadas a mesma síndrome, averiguando o efeito da reserva corporal ao desmame e sua mobilização durante a lactação sobre o tamanho da leitegada no segundo parto, mostraram que não apenas a minimização da perda de peso durante a lactação, mas a obtenção de uma adequada reserva corporal no parto e desmame seriam essenciais na problemática. Furtado et al. (2005) observaram que 60,5% das fêmeas de um sistema de produção em Santa Catarina, Brasil, apresentaram redução de pelo menos um (1) leitão na segunda leitegada. Os autores observaram que o peso, idade e espessura de toucinho no momento da primeira cobertura não afetaram o desempenho das fêmeas no tocante à redução da segunda leitegada. Em contrapartida, Eissen et al. (2003) demonstraram que a redução da perda de peso corporal durante a primeira lactação favorece o tamanho da segunda leitegada. Apesar da ocorrência variável da redução da segunda leitegada. De acordo com Vargas et al. (2006), esta redução na segunda leitegada, pode ser resultante de um desenvolvimento folicular limitado e de uma recuperação incompleta de eixos endócrinos ligados à reprodução, relacionados ao estado metabólico durante a lactação. Esta afirmação retoma o ponto investigatório no qual haveriam no caso para retratar estado metabólico determinadas mensurações diretas e indiretas para caracterizar com precisão as causas reais das alterações levando no final a queda na segunda leitegada. Os estudos desenvolvidos por Shenkel et. al 2010, em uma rebanho que apresentava a causa, comentam sobre as perdas de massa muscular e de gordura no período catabólico, afirmando que houve o dobro da perda em lipídeos comparado com gordura, corroborando ainda com outros estudos de que há um valor no percentual de perda de peso e consequentemente de proteína no qual não ocorre a queda do tamanho da leitegada, acima deste, o problema começa a aparecer, havendo a relação com o estado metabólico.. . Eckhardt (2009) estudou a influência da estratégia nutricional no terço final da gestação, em vinte e três marrãs que receberam no terço final da gestação dois tratamentos, Pré-lactação (P) com o fornecimento de 2,9kg de ração de Pré-Lactação (3.200 kcal EM/kg, 17% PB) até o momento do parto, e Gestação (G) fornecimento de 2,5 kg de ração de Gestação padrão. Assim, procurou-se obter um diferencial de 25% no fornecimento de energia metabolizável com o oferecimento aos 75 dias de gestação. Ao início do estudo os animais apresentaram médias em peso de 183,79 vs 186,36kg, para P e G, respectivamente e espessura de toucinho ET de 12,40 vs 12,12mm, para P e G, respectivamente, (Tabela 1). No pré-parto, os animais do tratamento P revelaram numericamente peso médio maior (229,08 vs 220,09kg) (p=0,086), assim como, em menor grau, a ET, valores de ET(p=0,106). O ganho de peso

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diário no terço final da gestação apresentou significância (p<0, 001), com diferencial positivo de 0,315 kg/dia para o tratamento P.

Tabela 1 – Médias e desvios padrão de características de desempenho de fêmeas alimentadas com ração de Gestação (G) ou Pré-Lactação (P) a partir dos 75 dias de gestação.

Resultados semelhantes foram relatados por Weldon et al. (1994), considerando que a quantidade de ração ingerida pela fêmea a partir dos 60 dias de gestação, possui uma relação negativa com a ingestão de alimento durante a fase de lactação, acarretando maiores perdas de peso neste período. Esta redução é mais evidente em fêmeas com maiores reservas de lipídeos (Verstegen et al., 1998), possivelmente devido à modulação de diversos fatores endócrinos de regulação como, por exemplo, concentrações de insulina e leptina (Eissen et al., 2000). Os estudos de Weldon et al.,1994 citam ainda que a superalimentação durante a gestação está associada com uma redução no consumo voluntário na fase de lactação, aumentando a perda de peso no período (Dourmad, 1991) e prejudicando o retorno a atividade estral cíclica da fêmea no pós-desmame. Eckhardt (2009) verificou menor número de nascidos totais quando as fêmeas foram alimentadas com ração gestação comparado com as fêmeas que receberam ração pré-lactação (12,64 vs 13,75 , respectivamente), apesar da não significância(p=0,346); (Tabela 2). Este diferencial de mais de 1 leitão quando foi analisado o número de nascidos vivos, relacionou-se com o maior número de natimortos (0,91 vs 0,18; p=0,042) no tratamento pré-lactação, e maior número de mumificados (1,09 vs 0,33; p=0,099) no tratamento gestação. Assim, as taxas de perdas foram similares, sendo de 10,07% e 9,09% para ambos os tratamentos, respectivamente. O peso dos leitões ao nascimento não foi influenciado pelos tratamentos (p=0, 947). Esta resposta encontra semelhança quando da comparação entre alimentação ad libitum ou não durante o terço final da gestação (Weldon et al., 1994) ou quando se suplementa energia e/ou proteína a partir dos 42 dias (Sinclair et al., 2001). Existem no entanto, estudos que reafirmam a influência do consumo nesta fase sobre o peso ao nascimento dos leitões (Coffey et al.,1994).Esta seria uma outra linha

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investigatória interessante pois nesse segmento estariam associados ao estado metabólico além da capacidade uterina da fêmea, a influência da ingestão no desenvolvimento fetal, que nessa fase final de gestação apresenta um aumento expressivo.

Tabela 2 – Médias e desvios padrão do tamanho da leitegada de fêmeas alimentadas com ração de Gestação (G) ou Pré-Lactação (P), e peso médio ao nascimento dos leitões.

Envolvendo ainda a produtividade de fêmeas suínas, deve ser considerado o intervalo desmame estro (IDE), o qual é influenciado por diversos fatores, incluindo: raça, manejo nutricional, ordem de parto, peso na ocasião do parto, duração da lactação, número de leitões desmamados, perda de peso durante a lactação, alojamento e interação social (Fahmy et al., 1979; King e Willians, 1984; MULLAN; Willians, 1989; Vesseur, 1997). Usualmente, primíparas possuem maior IDE comparado com porcas de ordem de parto maior, pois estas últimas normalizam seu padrão hormonal mais rapidamente, permitindo assim um IDE mais curto, e, conseqüentemente, um estro mais longo (Fahmy et al., 1979). A redução no consumo de ração na lactação influencia negativamente o estado metabólico e endócrino das fêmeas, com impactos sobre a fertilidade, principalmente no tocante ao IDE (Thaker e Bilkei, 2005). DOURMAD et al., 1994, em sua revisão, comentam que tal mecanismo compensatório apresenta certas limitações, já que a ingestão de menos de 5970 kcal EM / dia durante a gestação já foi associada a IDE prolongado e redução na longevidade dos animais. Essas avaliações interativas, com a vida útil, acabam por englobar períodos longos de vida da fêmea havendo a necessidade de averiguar fases distintas da vida que se complementa para estabelecer-se condição corporal e estados metabólicos específicos que contribuem notodo com a produtividade média de cada matriz. Segundo Dourmad, 1991, o manejo nutricional das primíparas na gestação e lactação não pode ser baseado em resultados imediatos mas deve ser considerado também os efeitos a médio e longo prazo no desempenho da vida útil. Desse modo, tomemos com exemplo que o consumo inadequado de nutrientes influencia o estado metabólico do animal em uma fase anterior ao desenvolvimento final de folículos pré-ovulatórios,

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que caracteriza um processo determinante para a fertilidade subseqüente (Poleze et al., 2006). Esta redução tanto na qualidade quanto na quantidade de folículos e, conseqüentemente, de oócitos devido ao balanço energético negativo pode contribuir para a redução da produtividade (Thaker e Bilkei, 2005), representado por algum indicador ou indicadores em conjunto que se mostram fora da faixa normal de aceitação, nível de interferência.Maior IDE influencia os subseqüentes desempenhos reprodutivos (Vesseur et al., 1997; Tantasuparuk et al., 2000) podendo ser utilizados como indicadores da fertilidade nos ciclos reprodutivos seguintes e vida útil reprodutiva da fêmea no plantel.

3. ESTADO METABÓLICO E PRODUTIVIDADE A relação entre estado metabólico e produtividade, a qual engloba a interação entre nutrição e reprodução dentro de cada uma das diversas fases do ciclo produtivo, vem trazer subsídios essenciais para as interpretações multifatoriais através da análise de uma série de metabólitos e hormônios que vem sendo pesquisados e citados como mediadores desta inter-relação, incluindo glicose, ácidos graxos não esterificados, aminoácidos específicos, insulina, Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) e hormônios tireoidianos (Guedes e Nogueira, 2001). Fêmeas freqüentemente se encontram em estado catabólico, principalmente durante a fase de lactação, já que as altas demandas de nutrientes para a produção de leite aliado ao consumo inadequado resultam na mobilização de reservas corporais (Kim e Easter, 2001). Esta mobilização permite que a lactação ocorra independente de possíveis limitações na ingestão de nutrientes (Clowes et al., 2003), podendo, porém, causar prejuízo principalmente na atividade reprodutiva subseqüente. A presença de grandes estoques de nutrientes quando da entrada na fase de lactação pode compensar o déficit nutricional, especialmente de proteína, minimizando o impacto sobre a galactogênese e o desempenho reprodutivo subseqüente (Van Den Brand et al., 2001; Mejia-Guadarrama, 2002). De acordo com Xue et al. (1997b), fêmeas com maior peso ao parto e, conseqüentemente, menor ingestão de energia na lactação, apresentaram menor liberação de LH tanto pré quanto pós-desmame, além de, quando submetidas a teste de tolerância de glicose, possuir menores níveis de insulina, indicando uma participação deste hormônio na interação nutrição reprodução. A variação no consumo de alimento na gestação e lactação pode ser investigada através de avaliações de parâmetros bioquímicos sanguíneos, que podem indicar a condição do estado metabólico nas fêmeas, assim evitando e/ou prevenindo a Síndrome do Segundo Parto. Eckhardt (2009), avaliou a evolução de alguns parâmetros em marrãs num período de 75 a 102 dias de

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gestação seguindo-se, logo após o parto e durante a fase de lactação (7, 14 e 21 dias). A análise constou das frações de colesterol HDL, LDL, VLDL, colesterol total, triglicérides (TGL) e ácidos graxos não-esterificados (AGNE) em diferentes dietas, gestação (G) e pré-lactação (P) esta com níveis de energia mais elevados. Os resultados revelaram diferenças significativas entre os tratamentos relacionados com a variável tempo, e efeito de interação para tempo e HDL na gestação e lactação e de tempo e AGNE na gestação (tabela 3). A significância observada foi com as frações do colesterol, HDL, LDL, AGNE e colesterol total e ainda maior valor numérico no TGL.Verificou-se portanto que as fêmeas alimentados com a dieta P apresentaram maiores níveis de colesterol total e frações de colesterol, HDL e LDL, no período de gestação, justamente por estes animais terem consumido mais alto nível de energia.. Os níveis de triglicerídeos na fase de gestação apresentaram padrão similar em ambos os grupos, com uma vantagem numérica para o tratamento P, evidenciando o maior consumo de energia deste tratamento. Hultén et al. (2002) também observaram que independente do nível de catabolismo apresentado pelas fêmeas, avaliado através das concentrações plasmáticas de AGNE, as concentrações de triglicerídeos permaneceram similares ao longo da gestação. No momento do parto, devido ao jejum imposto, notou-se uma redução drástica na concentração de triglicerídeos séricos. Pelo fato do triglicerídeos séricos exercerem papel crucial na produção de leite, os níveis de triglicerídeos aumentaram no pós-parto como resposta ao maior consumo, porém permaneceram em níveis inferiores aos registrados ao longo da gestação. O tratamento P apresentou uma redução de triglicerídeos séricos na primeira semana de lactação, evidenciando que, apesar de apresentar consumo similar ao grupo G, a utilização destes compostos como substrato para a produção de leite foi mais intensa. Ao mesmo tempo, devido ao maior peso apresentado pelos animais na primeira semana pós-parto, as suas exigências energéticas de mantença seriam maiores e, com a restrição alimentar realizada no início da lactação, levaram a maior perda de peso observada (p=0,038), com maior utilização de triglicerídeos e AGNE como fonte de energia por parte dos tecidos. Hultén et al. (2002), trabalhando com fêmeas de diferentes taxas de catabolismo na fase de lactação, também encontraram um cenário em que animais com maior peso ao parto perderam mais peso na lactação, apresentando maiores níveis de AGNE no sangue, apesar de apresentar mesmo consumo de ração. Para os autores, animais em estado catabólico mais intenso utilizam reservas corporais como principal fonte de nutrientes para a produção de leite, enquanto animais em menor catabolismo seriam mais eficientes na utilização dos nutrientes ingeridos como substrato para a glândula mamária. Segundo discutido por Knipping et al. (1987) e Allan et al. (2001), na

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espécie suína, existem evidências de que a maior parte dos ésteres de colesterol encontrados nas LDL são provenientes da síntese de novo de colesterol aos invés de serem oriundas apenas do catabolismo de VLDL, como no humanos. Este certo grau de independência entre cLDL e cVLDL poderia explicar o porque da diferença na evolução entre estes dois parâmetro, especialmente na fase de gestação. Durante esta fase, o tratamento P apresentou níveis mais expressivos de cLDL, denotando uma maior disponibilidade de colesterol para as células. Esta maior disponibilidade está ligada a maior concentração de substratos para a síntese de colesterol, devido ao maior consumo de ração imposto no terço final de gestação. A redução gradual com o desenrolar da gestação pode estar ligada a maior incorporação das partículas de LDL pelas células do organismo, para, por exemplo, a síntese de progesterona e estradiol, o qual aumenta no terço final da gestação até o momento do parto (ROBERTSON; KING, 1974). O colesterol total foi significativamente maior para o tratamento P no pré-parto, resultante do maior consumo de substrato energético pelos animais deste grupo. . Já na lactação, o aumento de todas as frações colaborou com o incremento gradual observado nos níveis de colesterol total. Na dependência da dieta empregada no terço final de gestação, fêmeas suínas podem apresentar catabolismo já nesta fase, por esta representar o período de maior crescimento dos fetos (EINARSSON; ROJKITTIKHUN, 1993). Os níveis de ácidos graxos não esterificados (AGNE) foram muito similares na fase de gestação, com elevação apenas no momento do parto, a qual foi responsável pela diferença estatística entre os tratamentos no pré-parto. Para o tratamento G, os níveis de AGNE mantiveram-se estáveis até a semana -1. Já para o tratamento P, neste mesmo período, a concentração sérica de AGNE apresentou uma gradual redução, indicando que o incremento energético nesta fase da gestação pode reduzir a mobilização de reservas lipídicas para suprir a maior exigência inerente aos processos fisiológicos que se desenrolam. Hultén et al.2 (1993 apud EINARSSON; ROJKITTIKHUN, 1993, p.233) trabalharam com fêmeas em lactação subdivididas de acordo com sua espessura de toucinho nove dias antes do parto. Em ambos os grupos, durante o final da gestação os níveis de AGNE encontravam-se baixos, enquanto o de triglicerídeos apresentavam altas concentrações, denotando um estado de anabolismo (EINARSSON; ROJKITTIKHUN, 1993). Assim, ao analisarmos os dados obtidos, percebemos que, embora não foi possível observar diferenças estatísticas entre os tratamentos, os animais alimentados com ração de pré-lactação apresentaram na fase de gestação níveis numericamente maiores de triglicerídeos e concentrações baixas de AGNE. Isto denota um estado de anabolismo mais intenso, confirmado pelo ganho de peso e aumento de espessura de toucinho nesta fase.

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As altas concentrações de AGNE no momento da parição, principalmente para o tratamento P, são similares aos obtidos por Oliviero et al. (2009). Os autores comentam que nesta fase o processo de parto torna-se prioridade, reduzindo assim uma possível atividade digestiva, elevando as reservas corporais ao status de principal fonte de energia, justamente em um momento de alta demanda pela mesma, aumenta a mobilização tecidual.. As concentrações de AGNE foram significativamente maiores para o tratamento P no momento do parto, evidenciando uma maior mobilização de estoques energéticos durante este evento, sugerindo uma maior intensidade da resposta a estímulos lipolíticos destes animais com maior peso vivo e espessura de toucinho. Ao longo da lactação a avaliação deste mesmo parâmetro sanguíneo apresentou valores que foram numericamente maiores para o tratamento P, sendo estatisticamente significativos nas semanas 2 e 3 desta fase, mostrando que a maior mobilização de reservas perdurou ao longo da lactação.. Weldon et al. (1994) relataram maiores níveis plasmáticos de AGNE e menor consumo durante a lactação em fêmeas alimentadas a vontade durante a gestação, indicando maior mobilização de reservas de gordura destes animais. Além disto, Quesnel et al. (2009) demonstraram aumento progressivo de AGNE com o evoluir da lactação. No presente estudo, um aumento discreto foi observado entre as concentrações pré e pós-parto, porém nenhum efeito do manejo nutricional na fase de gestação foi observado sobre o consumo na lactação. Tabela 3- Parâmetro sangüíneo durante a gestação e parto (Ges) e lactação(Lact)

1mg/dl; 2mmol/l; *p<0,05; Interação Tratamento x Tempo

A evolução do colesterol VLDL apresentou comportamento semelhante ao triglicérides, apenas por terem participado no transporte destes a partir do fígado. Grundy and Denke (1990), em sua revisão, relacionam a alimentação e o aumento dos níveis de cVLDL produzida e secretada pelo fígado. Isto é devido ao aumento do influxo de substrato energético para o

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organismo e maior disponibilidade de ácidos graxos livres, quando em jejum. Na primeira semana de lactacao, o grupo P aumentou o uso de nutrientes para a produção de leite e manutenção do organismo. No mesmo período, os animais do tratamento G tinham níveis mais elevados de VLDL, o que sugere aumento da produção utilizacao dos triglicerideos do fígado, a partir do excedente de energia do substrato. Estes triglicerídeos são então estocados nos adipócitos, contribuindo para o ganho de peso, o que ocorreu no grupo G na primeira semana de lactação. Os parâmetros sangüíneos refletiram em um maior consumo de energia durante a gestação para o tratamento P, e apesar deste tratamento perder mais peso durante a lactação, este fato não afetou o estado metabólico das fêmeas (Eckhardt,2009), caracterizadopela não diferença verificada no intervalo desmame estro. A insulina é um hormônio produzido pelo pâncreas endócrino, que estimula a entrada e utilização de glicose e lipídeos nos tecidos, promove a lipogênese e glicogênese e inibe a lipólise (Wade e Schneider, 1992). Diversas regiões do Sistema Nervoso Central possuem receptores de insulina (Schwartz et al., 1992), inclusive estruturas relacionadas ao controle da secreção de GnRH (Monget e Martin, 1997), sugerindo que seja um mediador metabólico da secreção de GnRH que medeia os efeitos da nutrição sobre os níveis de gonadotrofinas (Miller et al., 1995). Quesnel e Prunier (1998), avaliando a administração de insulina no período de lactação de fêmeas subalimentadas, não observaram melhoras quanto à duração do IDE e taxa de ovulação. O IGF-I é um peptídeo produzido no fígado e, em menor escala nos ovários (Adashi, 1998). Nesta mesma revisão, resumiu-se a ação do IGF-I como sendo de um amplificador da atuação das gonadotrofinas, além de promover a síntese de estrógenos e inibina e estimular a mitose das células da granulosa. Segundo Spicer e Echternkamp (1995) há uma correlação positiva entre diâmetro folicular e as concentrações de IGF-I no fluído folicular, porém ainda é necessário esclarecer se esta relação é devido à estimulação mitótica do IGF-I. Segundo Van Den Brand et al. (2001), há uma interação entre peso vivo no momento do parto, perda de peso durante a lactação e concentrações plasmáticas de IGF-I. Com maior peso no momento do parto, diminui-se o efeito das perdas de peso sobre o IGF-I, ressaltando a importância do manejo alimentar durante a fase de gestação. Em termos gerais, a insulina e o IGF-I afetam positivamente os ovários, estimulando a proliferação das células da granulosa e produção de progesterona, incrementando a esteroidogênese pelas células luteínicas (Spicer e Echternkamp, 1995). Alterações na maturação folicular são associadas com diferenças na habilidade destas estruturas fornecerem o ambiente necessário para o desenvolvimento do oócito, que por sua vez influencia a sobrevivência

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embrionária (Foxcroft, 1997). Zak et al. (1997b) mostraram que fêmeas em estado catabólico durante a lactação apresentam desenvolvimento folicular limitado, com folículos menores e com menor concentração folicular de estradiol, resultando em piores resultados na maturação de oócitos in vitro. Evidências como estas, de que o estado metabólico afeta o desenvolvimento folicular e, conseqüentemente, a qualidade dos oócitos, podem sugerir o mecanismo pelo qual a nutrição interfere na evolução dos conceptos (Foxcroft, 1997; Zak et al., 1997b). As exigências de energia de fêmeas suínas gestantes e lactantes são de difícil determinação, decorrente das diferentes interações e conseqüências que um ciclo reprodutivo exerce sobre o ciclo seguinte (Coffey et al., 1994). Neste cenário, a energia ingerida durante a gestação afeta o consumo voluntário de energia durante a lactação, que por sua vez influencia a exigência de energia necessária para o melhor desempenho no subseqüente IDE e gestação (Dourmad, 1991). Uma estratégia amplamente utilizada para se incrementar a ingestão de energia é a adição de gordura à dieta, através da inclusão de óleos, principalmente o de soja. Van Den Brand e Kemp (2005), em sua revisão, criticam esta estratégia com base em três fatores: a gordura adicional fornecida seria diretamente disponibilizada para a produção de leite, anulando o incremento de ingestão energética, dietas ricas em gorduras aumentam níveis plasmáticos de AGNE, β-hidroxibutirato e uréia, os quais poderiam ter efeito negativo sobre a reprodução, e, por fim, tais dietas reduziriam a liberação de insulina e IGF-I os quais, direta e indiretamente, afetariam níveis de hormônios reprodutivos e o desenvolvimento embrionário.

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS O estudo que representou uma linha de pesquisa com fêmeas primíparas desenvolvido no Laboratório de Pesquisa em Suínos (LPS-FMVZ USP) no qual investigou-se a alguns aspectos da Síndrome do Segundo Parto com o objetivo de associar estado metabólico das fêmeas, desempenho e parâmetros reprodutivos, foi o primeiro a ser experenciado. Na sequência desta linha de estudo multidisciplinar a averiguação das dietas sobre o catabolismo da lactação e a relação com os níveis de metabólitos e hormônios podem em muito contribuir para o esclarecimento das verdadeiras necessidades dessas fêmeas, nesse primeiro ciclo visando garantir respostas que podem oferecer subsídios que garantam as explicações essenciais para a vida útil reprodutiva esperada dentro do potencial genético disponível no mercado. Assim, associando os primeiros resultados obtidos pode-se inferir que, mesmo num catabolismo mais acentuado nas fêmeas que tiveram uma dieta mais energética no terço final da gestação, ração de pré- lactação, comparativamente ao grupo controle

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com ração de gestação, de nível energético menor, não houve influência no intervalo desmame estro, e também na duração do estro. Houve resposta significativa, na averiguação dos embriões com 5 dias, no pós desmame da primeira leitegada, quanto ao número de estruturas fecundadas encontrada em maior número no grupo que recebeu ração de pré lactação, o que veio sugerir neste grupo um estado metabólico tal que influenciou positivamente na sobrevivência embrionária dada também as significâncias observadas nos níveis de colesterol principalmente a fração LDL. As perspectivas futuras nesta linha de estudo, estão voltadas para averiguações quanto ao oferecimento de proteína ideal para as primíparas no período de gestação tendo como base os níveis de lisina e tendo como princípio a associação: estado metabólico, perda de massa muscular no primeiro catabolismo e medidas de averiguação de parâmetros sanguíneos,homônios e metabólitos.A interação entre nutrição e reprodução que envolve a Síndrome do Segundo parto, precisa de maiores averiguações para solucionar o problema, pois, apesar dos conhecimentos sobre o assunto as perda na suinocultura ainda são grandes. A dieta da marrã durante a gestação e lactação é crucial para se obter um bom desempenho no parto subseqüente.

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CAPÍTULO XI

PESQUISAS COM USO DA SOJA COMO FONTE DE LIPÍDEO NA ALIMENTAÇÃO DE RUMINANTES

PEREIRA, A.S.C1.; CÔNSOLO, N.R.B1.; LOPES, M.R.F1.; VIDAL, M.P1.; RENNÓ, F.P1.

1Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. 1- INTRODUÇÃO A bovinocultura de corte é uma atividade extremamente importante para o Brasil, visto que o país detém o maior rebanho comercial do mundo, superior a 200 milhões de cabeças (SOUZA, 2007). Outra atividade pecuária que tem recebido destaque atualmente é a ovinocultura de corte, apresentando-se como uma das opções no agronegócio brasileiro, pois o Brasil além de possuir grande lacuna a ser preenchida no consumo interno de carne ovina, apresenta atributos necessários para ser também um grande exportador (ALMEIDA JÚNIOR et al., 2004). O rebanho nacional de ovinos é de aproximadamente 17,5 milhões de cabeças (Santos et al., 2008), representando 1,4% do efetivo mundial, e concentra-se nas regiões Sul (30%) e Nordeste (58%). A produção de carne é uma atividade alternativa capaz de aumentar a renda nos negócios, não só de ovinocultores, mas de toda a atividade rural. E apesar de a população brasileira não ter o hábito de consumir carne ovina, observa-se aumento da procura nos últimos anos. O confinamento na pecuária de corte é uma das técnicas mais utilizadas na cadeia de produção da carne bovina e ovina, onde a alimentação de ruminantes representa até 75% dos custos de produção no confinamento. Portanto, é fundamental o uso de ingredientes de alta qualidade na dieta, que forneça nutrientes necessários para um ganho de peso elevado com baixos custos; e animais de boa qualidade, com características desejáveis de carcaça e da carne, (SAMPAIO et al., 2002). Atualmente, em muitos países a qualidade da carne é um fator importante para se determinar o preço de uma carcaça. Pesquisas realizadas nos Estados Unidos e em grande parte da Europa verificaram que os consumidores estão dispostos a pagar mais pelo produto carne, de acordo com suas características sensoriais e organolépticas (NEVES et al., 2000). Assim, a qualidade da carne é comumente avaliada a partir de características como cor, maciez, quantidade e distribuição da gordura, sabor e suculência. No entanto, cada vez mais frequentemente, outros aspectos têm sido considerados

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relevantes na avaliação da qualidade da carne. Estes aspectos podem incluir o tipo de dieta fornecida aos animais, uma vez que esta influencia fortemente na composição da carne, possibilitando o consumo de produtos de origem animal mais saudáveis ao ser humano. Ruminantes convencionalmente são alimentados com dietas que apresentam quantidades limitadas de gordura (HESS et al., 2008). Assim, respostas em animais mantidos de acordo com as práticas normais de produção poderiam ser diretamente atribuídas ao uso de lipídeos nas dietas. Neste contexto, ingredientes como a soja se destacam na alimentação animal como uma das leguminosas mais ricas, quando avaliadas as suas características nutricionais, podendo ser fornecida na forma de grãos, farelo de soja, rolão, silagem, massa verde e, ainda, como feno obtido do corte nas fases de desenvolvimento vegetativo, floração ou frutificação (GRIS, 2008). A produção mundial de soja na safra 2005/2006 foi estimada em 218 milhões de toneladas. (AGRIANUAL, 2007). Atualmente, o Brasil é o segundo produtor mundial de soja, com 68,5 milhões de toneladas produzidas na safra 2009/2010, perfazendo aproximadamente 23 milhões de hectares cultivados (AGRIANUAL, 2009). Além disso, a área de maior produção da soja está concentrada próxima aos grandes confinamentos brasileiros, o que possibilita ajuste do custo desse grão para a utilização na nutrição de bovinos de corte confinados. A forma de utilização mais comum da soja na alimentação animal, e particularmente, em bovinos de corte, é o farelo, abastecendo o rebanho mundial, respondendo aproximadamente por três quartos da alimentação animal com alto teor de proteína. (PORCILE et al., 2000). Porém, alguns autores verificaram que características de desempenho de animais alimentados com soja grão e farelo de soja são muito próximas ou semelhantes (PELEGRINI et al., 2000; PAULINO et al., 2002). A soja grão é uma excelente fonte de proteína, e devido ao seu alto teor de lipídeos, consiste também em uma ótima fonte de energia. Dentre as sementes de oleaginosas, o grão de soja é o mais empregado nos países desenvolvidos, com o objetivo de suprir lipídeos em rações de vacas de alta produção (RUEGSEGGER e SCHULTZ, 1985). Segundo NRC (1985), grãos de soja (GS) contêm cerca de 90% de nutrientes digestíveis totais (NDT), valor superior ao encontrado nos grãos de milho. Possuem composição média de 19% de gordura e 39% de proteína bruta (STERN; ILLG, 1991) e apresentam 10% mais energia líquida, por quilo, de matéria seca, que a soja na forma de farelo (NRC, 1988). Segundo SILVA et al. (2002) o grão integral contém em média 38% de proteína bruta, 17,7% de óleo e energia digestível equivalente a 3962 kcal/kg de MS, sendo que o farelo de soja contém 45% de proteína bruta, aproximadamente 1,4% de óleo e 3448

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kcal/kg de MS de energia digestível. Estas características nutricionais permitem que a soja seja empregada para reduzir os custos com a alimentação, uma vez que o grão integral pode ser processado na propriedade a preço inferior ao do farelo de soja. Portanto, neste panorama, a soja, nos dias de hoje, torna-se um dos principais produtos inseridos na cadeia alimentar de ruminantes e monogástricos. A soja atualmente também vem sendo amplamente utilizada como fonte de ácidos graxos polinsaturados, com resultados muito satisfatórios, aumentando a concentração de ácidos graxos polinsaturados em diversos alimentos, tais como, leite e carne (RAMASWAMY et al., 2001). Sabe-se que ácidos graxos de cadeia longa, particularmente de ácidos graxos polinsaturados possuem atividade anticarcinogênica, antiteratogênica, além de reduzirem doenças cardiovasculares (BAUBLITS et al., 2007). Estudos conduzidos por MADRON et al. (2002) relataram que a gordura da carne de novilhos terminados com dietas contendo soja integral apresentou elevados teores de ácido linoléico conjugado (CLA), potente anticarcinogênico natural e agente repartidor de nutrientes, capaz de alterar a deposição de gordura e músculo. Entre as opções de alimentação com dietas ricas em lipídeos, o grão de soja destaca-se pela sua disponibilidade regional, pelo elevado teor de ácidos graxos insaturados e pela grande aceitação dos animais (RABELLO et al., 1996). A biohidrogenação é o mecanismo utilizado pelos microrganismos ruminais para reduzir o efeito deletério que ácidos graxos insaturados têm na degradação ruminal, sobretudo da fibra dietética (HARFOOT e HAZLEWOOD, 1988; JENKINS, 1993). A biohidrogenação dos ácidos graxos insaturados ocorre inicialmente com uma reação de isomerização, onde a dupla ligação cis-12 é convertida ao isômero trans-11. É necessária a presença de um grupamento carboxílico livre para a ação da enzima isomerase, tornando imprescindível a lipólise de triglicerídeo (HARFOOT e HAZLEWOOD, 1988). Quando as características ruminais são favoráveis, o ácido graxo após a isomerização sofre ação de uma enzima redutase e então é hidrogenado a ácido graxo saturado. Quando se tem ácido graxo com mais de uma insaturação, há isomerização da ligação trans-11 e a outra ligação sofre ação da redutase microbiana, resultando na transformação em ácido graxo saturado (JENKINS, 1993). Porém, quando a biohidrogenação não é completa, há maior quantidade de ácidos graxos insaturados, sobretudo CLA no duodeno, onde será digerido, absorvido e incorporado ao tecido animal (PARIZA et al., 2001 e LORENZEN et al., 2007). Assim, óleos vegetais, em geral, não são amplamente utilizados como suplementos de dietas, devido à elevada quantidade de ácidos graxos polinsaturados, que pode ser tóxica às bactérias ruminais. Desta forma, uma

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alternativa consiste no fornecimento de lipídeos protegidos ou em grãos e sementes processadas com alto teor de gordura, que permite que o óleo se torne gradualmente disponível no rúmen, sem efeitos adversos para o crescimento microbiano (GRIINARI & BAUMAN et al., 2001, citados por MADRON et al., 2002), tornando-se uma tentativa de reduzir a biohidrogenação completa. Em estudos realizados por COPPOCK e WILKS (1991), concluiu-se que o fornecimento de lipídeos provenientes de sementes oleaginosas compreende uma liberação lenta da gordura durante o decorrer de todo o dia, devido à regurgitação e remastigação das sementes. Esse fato permitiria ação dos microrganismos ruminais em hidrogenar as ligações duplas dos ácidos graxos insaturados, impedindo o efeito inibidor da gordura sobre a digestibilidade da fibra. Outra opção no fornecimento de uma alimentação rica em lipídeo proveniente da soja é a utilização da casca do grão de soja (CGS) que é obtida no processamento da extração do óleo do grão desta oleaginosa. A cada tonelada de soja processada, cerca de 2% é transformada no resíduo de casca de soja (ZAMBOM et al., 2001). A CGS trata-se de um resíduo de alto valor nutricional, possuindo em sua composição 91% de matéria seca, 2,89 Mcal EM/ kg de MS (bovinos), 12,20% de proteína bruta, 66,30% de fibra em detergente neutro, 2,99% de lignina, 2,10% de extrato etéreo e 80,0% de nutrientes digestíveis totais (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1996). Apesar de apresentar altos teores de FDN, estes são de alta digestibilidade, podendo chegar a 90% (QUICKE et al., 1959). Devido ao padrão de fermentação ruminal, a CGS pode ser classificada como fibra rapidamente fermentável, podendo ser utilizada tanto como fonte de energia, quanto para manter ideal o teor de fibra da dieta, sem diminuir a concentração do acetato ruminal e da gordura do leite. Como fonte de fibra de rações altamente energéticas, ela não deve exceder 28% da MS da dieta, já que níveis mais altos podem diminuir a digestibilidade da ração (SARWAR et al., 1991), provavelmente devido a um aumento da taxa de passagem (NAKAMURA et al., 1989). A CGS pode substituir concentrados ricos em amido (ANDERSON et al., 1988), mantendo a qualidade da dieta. A substituição do milho pela CGS em até 28% da MS da dieta melhora a digestibilidade da fibra, enquanto que a ingestão e a digestibilidade da MS e a produção de leite permanecem semelhantes às obtidas com dietas tradicionais, segundo NAKAMURA et al. (1989). Entretanto, o grão de soja in natura e alguns de seus co-produtos possuem fatores antinutricionais que interferem no aproveitamento das proteínas pelos animais, como inibidores de tripsina, hemaglutininas (lecitinas), ácido fítico, enzimas lipase e lipoxidase, estrógenos, fatores flatulentos e alergênicos

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(glicininas e conglicininas), usualmente inativados por aquecimento dos grãos (BUTOLO, 2002). COPPOCK e WILKS (1991) afirmaram que a digestibilidade dos lipídeos de sementes oleaginosas não promove efeito negativo na ingestão, provavelmente em razão da lenta liberação dos lipídeos dos grãos, não superando, dessa forma, a capacidade de hidrogenação dos microrganismos ruminais. Tais afirmações podem ser evidenciadas por FERNANDES (1987), que estudou o efeito da utilização da soja grão, crua e moída em dietas de vacas leiteiras de alta produção. Foram avaliados três níveis de inclusão da soja grão crua na dieta dos animais, 20% e 40% de inclusão no concentrado e concluiu-se que é possível a inclusão de até 40% na dieta, sem qualquer efeito negativo no consumo.

1.1 USO DA SOJA PARA BOVINOS DE CORTE Na definição de um plano de alimentação para bovinos de corte, é importante considerar além dos volumosos, os concentrados. Portanto, a soja é considerada uma das sementes oleaginosas mais ricas e disponíveis no mundo, podendo ser usada na alimentação de ruminantes na forma original (crua) ou devidamente processada, podendo aumentar assim seu valor biológico, tornando-se de fácil digestão e com elevados teores de aminoácidos essenciais (GOMES, 2000). A utilização de grão de soja cru ou não processado na alimentação de ruminantes não é recente. Por apresentar composição de aproximadamente 39,3% de proteína bruta, 19,2% de extrato etéreo e 95% de NDT, o grão de soja tem sido utilizado na alimentação de ruminantes com o propósito de atuar como fonte de proteína, especialmente pela alta concentração e adequado valor biológico deste nutriente, e por também apresentar fibra de alta digestibilidade e com efetividade mediana quando comparado com forragens, mas superior a de outros alimentos concentrados (NRC, 2001; VALADARES FILHO et al., 2006). Também, pelo elevado teor de extrato etéreo, pode ser considerado como fonte de gordura, rico em ácidos graxos insaturados, para ruminantes. A utilização de fontes de gordura na dieta de bovinos de corte apresenta várias vantagens, como o aumento na densidade energética e a diminuição no incremento calórico. Entretanto, mudanças no consumo de matéria seca e digestibilidade da fibra são indicativas de que a fermentação ruminal foi alterada com o fornecimento de fontes de gordura nas rações, o que do ponto de vista de produção, é indesejável. Outro ponto importante na inclusão de lipídeos na dieta de bovinos seria o fornecimento de ácidos graxos específicos para determinados processos metabólicos, como a reprodução e a composição de gordura da carcaça. A alteração da composição da gordura das carcaças, visando um perfil de ácidos graxos mais favorável à saúde humana,

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certamente é um grande diferencial para agregar valor ao produto cárneo. O grão de soja apresenta grande quantidade de óleo e, portanto, alta densidade energética. Além disso, evidencia uma boa atividade da fibra, estimulando os processos de ruminação, com a lenta liberação de lipídeos no rúmen, não superando assim a capacidade de hidrogenação dos microrganismos ruminais, impedindo possível perda da digestibilidade de fibra pelo efeito negativo que gorduras insaturadas prontamente disponíveis no rúmen podem causar às bactérias fibrolíticas. Isso ocorre em semente de oleaginosas, porque a maioria dos lipídeos encontra-se no germe ou presos à matriz protéica e, portanto, há necessidade de degradação da parede celular para que a hidrólise se inicie (COPPOCK; WILKS, 1991; PALMQUIST, 1991). Em experimento com a utilização da soja crua e tostada, FERREIRA et al. (1983), utilizaram 100 novilhos, com idade entre 20 e 38 meses, peso médio de 359 kg. Os animais foram distribuídos em cinco lotes segundo o critério de peso, idade e raça ou “grau de sangue” e avaliados durante 84 dias. As dietas utilizadas foram: 0% (A); 5% (B); 10% (C); 20% (D) de soja crua e 20% (E) de soja tostada na dieta total e como volumosos foram utilizados o feno de Capim-Jaraguá e feno de soja perene. Os ingredientes do concentrado foram milho, soja crua, soja tostada e minerais. A dieta total foi constituída de volumoso:concentrado na proporção de 50:50 na matéria seca. Os ganhos médios diários por novilho foram de 1,11; 1,14; 1,19; 1,21 e 1,33 kg para as dietas A, B, C, D e E, respectivamente. Com intuito de comparar os efeitos de duas fontes protéicas (farelo de soja vs grão de soja), PELEGRINI et al. (2000) trabalharam com 20 novilhos inteiros cruzados, com média de peso inicial de 160 kg e idade média de 7 meses. Os animais foram alimentados: T1 – silagem de sorgo mais concentrado (farelo de soja + milho + mistura mineral), e T2 – silagem de sorgo mais concentrado (soja grão + milho + mistura mineral). O grão de soja foi utilizado in natura e triturado no momento do preparo da ração. De acordo com os resultados observados pelos autores, (Tabela 1), os animais que consumiram as dietas contendo farelo de soja tiveram um maior consumo médio diário (P<0,05), e por conseqüência, maior ganho médio diário (P<0,05). No entanto, não foi observada diferença para o peso final e ganho total, referentes às dietas com grão de soja. Por outro lado, a conversão alimentar foi maior as dietas contendo grão de soja, em relação ao farelo (P>0,05).

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Tabela 1 - Peso inicial e final, ganho de peso médio diário e total, consumo médio diário de matéria seca (kg/animal/dia), kg por 100 kg de peso vivo (kg/100kgPV/dia), gramas por unidade de tamanho metabólico (g/UTM/dia) e conversão alimentar, de acordo com as dietas

PVI = peso vivo inicial; PVF = peso vivo final; GMD= ganho médio diário; GT= ganho total; CMD= consumo médio diário; CA= conversão alimentar. *(P<0,05); **(P>0,05). Adaptado de Pelegrini et al. (2000).

Posteriormente, JORDAN et al. (2006), avaliaram os efeitos da inclusão de soja grão, ou o óleo de soja na dieta de bovinos, com a utilização de 36 animais confinados com inclusão de 6% da matéria seca (MS), na forma de soja grão ou óleo de soja refinado. O consumo de MS variou entre as dietas, sendo 7,46; 6,11 e 7,03 kg de MS/dia para os tratamentos controle, grão de soja e óleo de soja, respectivamente. No entanto, apesar das diferenças observadas para o consumo total de MS, não foram verificadas diferenças no desempenho dos animais, embora as dietas com adição de óleo de soja apresentaram maiores valores, provavelmente devido a maior ingestão de matéria seca (Tabela 2). Em relação às características de carcaça, JORDAN et al. (2006) relataram aumento nas quantidades de gordura renal e pélvica para as dietas contendo óleo de soja, em relação às demais (Tabela 2). Vale ressaltar que não foi retirado o depósito de gordura renal e pélvica das carcaças no momento do abate, talvez por isso, não tenham sido observadas diferenças no rendimento de carcaça.

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Tabela 2 - Efeitos da inclusão de soja grão ou óleo de soja sobre o desempenho animal e características de carcaça

a,b Valores dentro da mesma linha sem sobrescrito comum são diferentes (P < 0.05).*escore segundo o sistema de classificação europeu.Fonte: Adaptado de Jordan et al. (2006).

FELTON e KERLEY (2004) realizaram dois experimentos e testaram os níveis crescentes de inclusão de grão de soja na alimentação de bovinos de corte. No primeiro estudo, foram utilizados animais cruzados com peso médio de 441 kg e no segundo animais da raça angus de peso médio 413 kg. As dietas em ambos experimentos foram: 0, 8%, 16% e 24% de inclusão de grão de soja na matéria seca da dieta, diferindo apenas na porcentagem de volumoso oferecido, 8 e 15% de silagem de milho, no experimento 1 e 2 respectivamente. Quanto a ingestão de matéria seca, referente ao estudo 1, houve decréscimo linear (P < 0,05), com a inclusão do grão de soja, fato não observado no estudo 2. Em ambos não houve efeito da inclusão do grão na eficiência alimentar dos animais. Os autores explicam a queda de consumo dos bovinos, devido à alta quantidade de ácidos graxos polinsaturados (PUFA) presente no grão, aumentando na dieta a proporção do mesmo. Isso pode resultar em uma depreciação do consumo de matéria seca, reduzindo o desempenho animal. Estes resultados também foram comprovados por ENGLE et al. (2000). Em contra partida, no estudo 2, FELTON e KERLEY (2004) não observaram efeito na IMS. Já em relação ao GMD e peso final nenhum efeito foi observado em ambos experimentos (Tabelas 3 e 4). Quanto às características de carcaça, não houve efeito da inclusão de grão de soja no peso de carcaça quente e área de olho de lombo (AOL), corroborando com resultados previamente encontrados por demais autores (RUMSEY et al., 1999; ENGLE et al., 2000). Em adição, não foi observada

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diferença na marmorização, espessura de gordura subcutânea da carne, em ambos experimentos (Tabelas 3 e 4). Diferentemente, BRANDT e ANDERSON (1990) e EWEEDAH et al. (1997) encontraram diferenças para estas características, com a inclusão de soja grão e óleo de soja na dieta de bovinos confinados.

Tabela 3 - Efeitos dos níveis de inclusão do grão de soja na dieta de bovinos de corte sobre o desempenho e características de carcaça no experimento 1

T0= tratamento controle; T8= 8% de grão de soja na MS da dieta; T16% de grão de soja na MS da dieta; T24= 24% de grão de soja na MS da dieta;GMD= ganho médio diário; IMS=ingestão de matéria seca; CA= conversão; PCQ= Peso de carcaça quente; EGS=Espessura de gordura subcutânea; AOL= Área de olho de lombo.Adaptado de Felton e Kerley (2004).

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Tabela 4 - Efeitos dos níveis de inclusão do grão de soja na dieta de bovinos de corte sobre o desempenho e características de carcaça no experimento 2

T0= tratamento controle; T8= 8% de grão de soja na MS da dieta; T16% de grão de soja na MS da dieta; T24= 24% de grão de soja na MS da dieta;GMD= ganho médio diário; IMS=ingestão de matéria seca; CA= conversão; PCQ= Peso de carcaça quente; EGS=Espessura de gordura subcutânea; AOL= Área de olho de lombo.Adaptado de Felton e Kerley (2004).

1.2 - USO DA SOJA PARA OVINOS E CAPRINOS Segundo RIBEIRO et al. (2005), na produção de carne ovina, o cordeiro é potencialmente a categoria de melhores características da carcaça e, conseqüentemente, de maior aceitabilidade pelo consumidor. Normalmente, o cordeiro apresenta maior eficiência de ganho e qualidade de carcaça, principalmente nos primeiros seis meses de vida, sendo que estas características podem ser otimizadas pelo uso de sistemas adequados de terminação. A terminação de cordeiros em confinamento apresenta uma série de benefícios, como menor mortalidade dos animais devido a menor incidência de verminoses e maior controle nutricional o que proporciona abate precoce e carcaças com alta qualidade, o que reflete em melhor preço pago pelo mercado consumidor e retorno mais rápido do capital investido pelo produtor (URANO, 2006). Além de encurtar o ciclo de produção e colocar no mercado carcaças de animais mais precoces e carne ovina de qualidade (RODRIGUES et al., 2008). Segundo URANO (2009), o melhor conhecimento da utilização do grão de soja na alimentação animal pode viabilizar sua utilização em rações para animais de produção. As sementes oleaginosas (grão de soja, caroço de algodão) são utilizadas como fonte de lipídeos, que além de fornecerem energia, apresentam também elevados teores de proteína bruta.

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Na maioria dos experimentos envolvendo suplementação lipídica para ruminantes são utilizados bovinos como modelo animal, tornando escassas as informações dos efeitos dos lipídeos sobre as características de fermentação ruminal em caprinos (TEH et al., 1994; LANA et al., 2005; SILVA et al., 2007). URANO et al. (2006) estudaram a inclusão de diferentes níveis de grão de soja (0, 7, 14 e 21%) na matéria seca, na dieta de ovinos confinados e concluíram que a conversão alimentar, o rendimento de cortes e as características da carcaça não foram alterados pela inclusão de grãos de soja na ração para cordeiros em crescimento, embora o consumo diário de matéria seca e o ganho de peso vivo tenham sido afetados negativamente. O consumo médio diário de matéria seca (CMS) foi de 1,0 kg por dia, e diminuiu linearmente com o aumento do teor de GS na ração (Tabela 5). Resultados semelhantes foram observados em cordeiros alimentados com teores crescentes (0, 2,5 e 5%) de gordura protegida (HADDAD & YOUNIS, 2004).

Tabela 5 – Desempenho dos cordeiros no período experimental

(1)CMS: consumo de matéria seca; CEE: consumo de extrato etéreo; CPB: consumo de proteína bruta; PV: peso vivo; GPV: ganho de peso vivo; CA: conversão alimentar. (2)GS0: controle; GS7: 7% de grãos de soja, GS14: 14% de grãos de soja, GS21: 21% de grãos de soja na MS da ração. (3)Erro-padrão da média. (4)Efeito linear. (5)Efeito quadrático. nsNão-significativo. *Significativo a 5% de probabilidade. Adaptado de Urano et al. (2006).

A redução no consumo de matéria seca de acordo com o aumento da inclusão de sementes oleaginosas na ração total também foi relatada por SILVA et al. (2007), trabalhando com caprinos. Isto poderia ocorrer, de acordo com os autores, em função de um feedback quimiostático, no qual o consumo de matéria seca é ajustado para manter constante o consumo de energia, uma vez que há aumento da densidade calórica proporcionado pelo elevado teor de lipídeos da ração.

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Por outro lado, o efeito potencialmente negativo da ingestão de gordura na digestibilidade dos nutrientes depende de vários outros fatores, tais como: forma de fornecimento, tipo de processamento da fonte, quantidade ingerida e grau de instauração, uma vez que os ácidos graxos polinsaturados ocasionam menos prejuízos que os monoinsaturados, e estes últimos, mais que os saturados. A diminuição no consumo de proteína relaciona-se ao consumo de matéria seca (kg por dia) que também apresentou redução linear de acordo com o aumento do teor de grão de soja na ração (SILVA et al., 2007). O mesmo efeito foi observado por outros autores, que avaliaram teores crescentes de gordura protegida na ração de cordeiros e observaram diminuição do consumo de proteína bruta decorrente da diminuição no consumo de matéria seca (kg por dia). Além disso, de acordo com os autores, as quantidades de extrato etéreo (EE) no rúmen foram diferenciadas, com valores de 75,9; 29,8; 50,8 e 58,6% em relação ao consumido para as dietas controle, OS, SC e GS, respectivamente, reforçando a necessidade de se determinarem as taxas de passagem de líquidos quando da adição de lipídeos às dietas, para que o desaparecimento ruminal possa ser corretamente mensurado (Figura 1).

Figura 1 – Quantidades de EE (g/d) ingeridas, presentes no rúmen e no omaso e excretadas por cabras submetidas a diferentes formas de suplementação lipídica na dieta.Adaptado de Silva et al. (2007).

Os autores concluíram que um maior tempo de retenção de partículas sólidas foi obtido com o uso de grão de soja como suplemento. As dietas

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não influenciaram o pH, a síntese e a eficiência de proteína microbiana, mas reduziram a concentração de amônia no rúmen e a suplementação com lipídeos no nível de 4,5% pode ser utilizada de modo eficiente em dietas para caprinos. Em estudo realizado com ovinos, JENKINS e THIES (1997), constataram que os animais alimentados com dietas ricas em ácidos graxos insaturados, apresentaram redução do consumo de matéria seca (CMS), como conseqüência da maior concentração plasmática de acido linoléico. Provavelmente a queda linear no CMS que ocorreu com a suplementação de fontes lipídicas ocorreu em virtude do controle quimiotáctico, (ANDRADE et al., 2001), no qual o CMS tenha sido ajustado pelos próprios animais para manter constante o consumo de energia, uma vez que houve um aumento na densidade calórica proporcionado pelo elevado teor de gordura na ração. Posteriormente, Mendes et al. (2007) avaliaram o desempenho e os parâmetros de carcaça de cordeiros confinados alimentados com grão de soja moído (9,2% da matéria seca da ração) em substituição ao farelo de soja e observaram redução do consumo de matéria seca e melhora na conversão alimentar. Segundo os autores, a inclusão do grão de soja elevou o teor energético da ração, o que pode ter contribuído para a redução no consumo e manutenção do ganho de peso dos animais, devido à melhor utilização da ração consumida. Como não foi observada variação no ganho médio de peso, os animais que receberam o grão de soja apresentaram melhor conversão alimentar em relação às dietas contendo apenas farelo de soja. A espécie ovina apresenta rendimentos de carcaça que variam de 40 a 50%, levando-se em consideração a conformação da carcaça, que envolve o desenvolvimento e perfil das massas musculares e a quantidade e distribuição da gordura de cobertura (SILVA SOBRINHO, 2001). URANO et al. (2006) verificaram rendimentos de carcaça quente (RCQ) e fria (RCF) de 48,9% e 47,7%, respectivamente, em cordeiros confinados com níveis crescentes de grão de soja, porém sem diferença entre as dietas para RCQ, RCF e quebra por resfriamento (QR) (Tabela 6). A área de olho de lombo observada foi satisfatória, embora a espessura de gordura tenha se apresentado baixa, pois, segundo SILVA SOBRINHO (2001), a espessura de gordura média varia de 2 a 5 mm. Ainda, de acordo com URANO et al. (2006), a espessura de gordura pode estar relacionada à idade reduzida dos cordeiros abatidos, os quais apresentaram média de 150 dias de idade. Animais jovens tendem a depositar e apresentar menor teor de gordura na carcaça. A gordura proveniente da ração tende a promover a sua deposição na carcaça do animal, mas apresenta grande variação, uma vez que esta deposição pode ser influenciada pela fonte de gordura, consumo, estado fisiológico e categoria animal. Vários pesquisadores que avaliaram teores e fontes de lipídeos também não verificaram alterações nas características da carcaça.

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Tabela 6 – Parâmetros de carcaça e rendimento de cortes dos cordeiros confinados

(1)PVA: peso vivo de abate; RCQ: rendimento de carcaça quente; RCF: rendimento de carcaça fria; QR: quebra por resfriamento; AOL: área de olho de lombo; EG: espessura de gordura. (2)GS0: controle; GS7: 7% de grãos de soja; GS14: 14% de grãos de soja; GS21: 21% de grãos de soja na MS da ração; não houve efeito significativo dos tratamentos. (3)Erro-padrão da média. Adaptado de Urano et al. (2006).

2- CONSIDERAÇÕES FINAIS A soja é considerada uma das sementes oleaginosas mais ricas em proteína e energia disponíveis, podendo ser utilizada na alimentação de ruminantes. O emprego deste ingrediente pode se tornar economicamente viável aos criadores, sobretudo quando são adotados sistemas de confinamento. É possível que o grão de soja seja utilizado não somente como fonte de proteína em rações para ruminantes, substituindo o farelo de soja, mas também como substituto parcial do fubá de milho, possibilitando dessa forma, baratear o custo das rações. O grão de soja tem sido utilizado na alimentação de ruminantes com o propósito de ser fonte de proteína, especialmente pela alta concentração e adequado valor biológico deste nutriente. A suplementação de lipídeos para ruminantes pode ser uma estratégia eficaz para aumentar a densidade energética da dieta animal e pode ser explorada como potencial nutracêutico. Ainda são escassos os estudos que avaliam o uso deste ingrediente (grão ou óleo) em rações de ruminantes, com o objetivo de analisar o consumo de matéria seca, as características de desempenho e qualidade de carne dos animais. Portanto, faz-se necessário analisar os efeitos da inclusão do grão de soja em dietas para ruminantes, visando também um produto cárneo de melhor qualidade sensorial e lipídica. Vale ressaltar que níveis ótimos de gordura na dieta dependem de metas estabelecidas dependendo do sistema e objetivos de produção.

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3 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASAGRIANUAL: Anuário da agricultura brasileira. São Paulo: FNP Consultoria e Comércio, 2007. p. 462-485.

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CAPÍTULO XII

DIETA COMPLETA EXTRUSADA NA ALIMENTAÇÃO DE EQUINOS

Alexandre Augusto de Oliveira Gobesso1, Mariano Etchichury1, Iaçanã Valente Ferreira Gonzaga1

1Departamento de Nutrição e Produção Animal FMVZ-USP

RESUMO Os equinos são herbívoros por natureza, e precisam consumir fibras vegetais para manter a homeostase do seu sistema digestivo. As forragens cobrem as necessidades nutricionais de manutenção, mais são insuficientes para sustentar cavalos de esporte, trabalho ou de produção altamente exigente. Os grãos de cereais são incorporados na nutrição eqüina para prover energia adicional concentrada, constituindo uma prática alimentar não isenta de riscos, tais como cólica e laminite. Recentes avanços no processamento industrial dos alimentos têm feito grande contribuição para atenuar estes riscos, facilitando a digestão dos grãos e tornando os alimentos mais seguros. A necessidade de fornecer aos cavalos fibra vegetal e concentrados, na forma de grãos de cereais ou misturas balanceadas, faz necessário manejar, no mínimo, duas frações, volumoso e concentrado, o que incide no transporte, armazenamento, distribuição e manejo. O conceito de dieta única completa para equinos não é novo, porém o seu desenvolvimento encontrou limitantes na falta de conhecimentos da fisiologia digestiva dos equinos e na tecnologia de produção de alimentos, postergando assim a sua presença no mercado. Novos avanços na tecnologia de produção e no conhecimento da nutrição eqüina permitem conceber novas formas de apresentação dos alimentos, que considerem não somente os aspectos nutricionais senão também de transporte, armazenamento e manejo, com vantagens significativas. A dieta completa extrusada é um novo conceito que reúne num único produto todos os nutrientes exigidos para as diferentes categorias nutricionais, permitindo o aproveitamento dos mais diversos ingredientes disponíveis no mercado, seguro em termos alimentares, viável economicamente e com potencial de mercado expressivo.

INTRODUÇÃO A espécie equina é herbívora por natureza. Milhares de anos de evolução modelaram o aparelho digestivo dos cavalos para o aproveitamento de alimentos vegetais fibrosos, dos quais são capazes de extrair todos os nutrientes necessários para a perpetuação da espécie. A domesticação trouxe

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como conseqüência um gasto de energia adicional, em virtude do trabalho exigido pelo homem, e com isto importantes mudanças na alimentação. Para suprir esta energia adicional, foram incorporados às dietas eqüinas grãos de cereais, tais como aveia, cevada, centeio milho e sorgo. Com estes ajustes nutricionais, somados à seleção e manejo, foram criadas ao longo da história praticamente todas as raças conhecidas atualmente, cada uma com a sua aptidão especifica. Surgiram desta maneira, animais maiores e mais vigorosos, restando daquelas raças primitivas somente alguns pequenos grupos. A fisiologia digestiva dos equinos requer, para apropriado funcionamento, a ingestão de fibra alimentar, para manter a tonicidade muscular dos intestinos e também como estimulo à motilidade. Desta maneira, as forragens tornam-se um elemento imprescindível, e os concentrados energéticos na forma de grãos, um complemento que permite o seu uso no trabalho ou esporte. Por este motivo, devem ser fornecidos aos cavalos de esporte ou trabalho alimentos volumosos, como capim ou feno, e alimentos concentrados, como grãos e rações balanceadas. Nos últimos anos, a nutrição dos equinos tem experimentado grandes avanços, acompanhando as exigências cada vez maiores da área dos esportes eqüestres. Estes avanços se traduzem principalmente num maior conhecimento da fisiologia digestiva, e na incorporação de diversos ingredientes à alimentação, que segundo a quantidade, qualidade e tipo de processamento permitem melhorar expressivamente o rendimento esportivo dos cavalos. Um interesse crescente no estudo de dietas únicas completas para equinos tem surgido tanto no ambiente acadêmico como no setor esportivo, principalmente para cavalos confinados em criatórios de manejo intensivo ou estabulados em centros urbanos. Uma dieta com estas características permitiria agilizar o arraçoamento destes animais, fornecendo somente um ingrediente por refeição, barateando o manejo e a mão de obra, custos com frete e armazenamento, sem sacrificar a qualidade nutricional nem induzir transtornos digestivos.

ASPECTOS DA FISIOLOGIA DIGESTIVA DOS EQUINOS A adaptação evolutiva dos equinos ao consumo de materiais fibrosos se traduz numa serie de características anatômicas, á começar pelo robusto aparato bucal, dotado de fortes mandíbulas e grandes peças molares, que permitem moer e triturar alimentos grosseiros, diminuindo o seu tamanho para favorecer a ação dos sucos digestivos. O intestino pode ser dividido funcionalmente em duas partes bem definidas, o intestino delgado, onde a digestão é principalmente enzimática, e pelo intestino grosso e ceco, onde os alimentos são submetidos à fermentação bacteriana. No intestino delgado, as enzimas sintetizadas pelas células do pâncreas, epitélio intestinal, assim

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como os ácidos biliares secretados pelo fígado, catabolizam as longas cadeias protéicas, carboidratos solúveis e gorduras, transformando-as em pequenas moléculas para serem absorvidas. Neste segmento digestivo são absorvidos os carboidratos solúveis, as proteínas, as gorduras, vitaminas e minerais. (Hintz, 1979; Wolter, 1981; Frape, 1992; Kohnke, 1992). O intestino grosso e o ceco funcionam como câmaras de fermentação, todos aqueles nutrientes que não foram absorvidos no intestino delgado serão degradados por bactérias e outros microorganismos através da fermentação. Neste segmento são degradados principalmente os carboidratos que compõem a parede celular dos vegetais, como celulose, hemicelulose e pectinas. As enzimas responsáveis pela digestão destes nutrientes são sintetizadas por microorganismos, que produzem como resultado ácidos graxos voláteis. Em cavalos mantidos em regime de pastejo, ou consumindo só forragem, esta é a principal fonte de energia. A fração energética dos alimentos concentrados é composta por amido, que pode ser catabolizado e absorvido no intestino delgado, resultando num aporte energético muito maior quando comparado à parede celular, por unidade de peso. O tempo de permanência dos alimentos no estômago varia de 2 a 3 horas, com um tempo mínimo de retenção de 20 minutos Essa velocidade de trânsito, associada ao pH estomacal baixo, restringe a ação da ação microbiana na fermentação de açúcares e amido. O grau de digestão protéica no estômago é pequeno, e depende do ácido clorídrico e da pepsina (Frape, 1992; Konhke, 1992; Lewis, 2000). O conteúdo intestinal flui pelo intestino delgado a uma velocidade de 30 cm por minuto, demorando em média oito horas para percorrê-lo, dependendo da quantidade de fibra ingerida. Baixos fluxos são esperados com aumento da proporção de concentrado na ração e maiores fluxos com aumento de fibra alimentar (Wolter, 1981).

DIGESTÃO DO AMIDO O amido, também denominado carboidrato não estrutural ou de reserva, é a forma como as plantas armazenam a energia contida nas moléculas de glicose nos grãos de cereais. Amplamente usado na nutrição de equinos, é a forma de energia concentrada que mais estudos têm gerado na área, e existe atualmente grande quantidade de informação disponível. A digestão do amido nos cavalos apresenta características próprias da espécie, e depende das propriedades dos grânulos de amido, do tipo de processamento, das estruturas nutricionais associadas (paredes celulares), da velocidade de trânsito no intestino delgado e da disponibilidade e concentração de enzimas intestinais (Cuddeford, 2001). Os grânulos de amido contidos nos grãos têm propriedades físico-

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químicas específicas para cada espécie vegetal. Independentemente da espécie vegetal, o amido dos diferentes grãos apresenta altos coeficientes de digestibilidade aparente (97-98%), que resulta da diferença entre amido consumido e o excretado nas fezes (Meyer et al., 1993). Esta metodologia de análise, de grande valia na avaliação de outras frações nutricionais, não reflete de maneira fiel a dinâmica da digestão e absorção do amido ao longo do trato gastrintestinal. Isto é devido a que todo o amido que não é digerido e absorvido no intestino delgado ingressa no intestino grosso, e é degradado pela microflora pela via fermentativa. A fermentação do amido no intestino grosso não resulta na produção de ácidos graxos de cadeia curta, que podem gerar glicose no fígado, senão em ácido láctico, que não é absorvido e se acumula no lúmen intestinal, reduzindo o pH, provocando assim a morte da flora intestinal e alterando a barreira mucosa. Uma alteração intensa da homeostase ceco-cólica neste sentido é causa freqüente de cólicas e laminite (Mair et al., 2002). Diversos esforços foram feitos nos últimos anos por pesquisadores para entender a dinâmica da digestão do amido nos equinos, e como melhorá-la. Dentre os avanços obtidos, a fistulação íleo-cecal permitiu diferenciar claramente os dois principais segmentos digestivos envolvidos, e determinar a digestibilidade de cada tipo de amido no intestino delgado. Com esta metodologia foi possível estabelecer que o grão de aveia, em virtude dos seus pequenos grânulos de amido, apresenta a maior digestibilidade pré-cecal entre todos os grãos de cereais (85-87%), o que o torna o grão mais utilizado na alimentação de equinos, e os grãos de cevada e milho os menores coeficientes de digestibilidade, por conterem grânulos compactos e cristalinos, difíceis de serem catalizados pela amilase pancreática e intestinal (Cuddeford, 2001, Vervuet, et al., 2003). A velocidade do transito intestinal afeta significativamente a digestão do amido, com o qual mantém uma relação diretamente proporcional. Vários fatores podem alterar a velocidade do transito intestinal, inclusive a quantidade de amido fornecido na dieta. Estudos feitos por diversos autores permitiram estabelecer quantidades máximas de amido dietético, estipuladas entre 3,5 – 4 g por kg de peso corpporal (Potter et al., 1992; Kienzle, 1994). Estas quantidades devem ser interpretadas como orientativas, uma vez que o seu grau de segurança alimentar, entendida como a capacidade de evitar transtornos clínicos, varia de um tipo de grão para outro, do tipo de processamento, da velocidade do consumo da ração e de outros fatores. Por tanto, dietas contendo quantidades de 2 g kg/peso vivo (PV) de amido podem desencadear transtornos digestivos, dependendo dos fatores mencionados. Existem fatores individuais que podem interferir na digestão do amido, relacionados principalmente com a síntese enzimática que cada cavalo é capaz de desenvolver. Isto foi demonstrado em trabalho feito com adição

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de amilase na dieta por Meyer et al. (1993), no qual foi possível observar aumento na digestibilidade do grão de milho moído de 47,3 para 57,5%.

PROCESSAMENTO DOS ALIMENTOS E COMPORTAMENTO ALIMENTAR O processamento dos alimentos tem grande influencia na digestibilidade e no comportamento alimentar. Em condições de manejo extensivo, os cavalos dedicam grande parte do dia, entre 14 e 18 horas, ao pastejo. Existem várias espécies de forragens que são bem aceitas e podem prover nutrientes em concentrações adequadas para atender as exigências nutricionais de cavalos em manutenção, porém, para animais que se encontrem em outras categorias por exemplo, éguas em lactação, potros e cavalos de desempenho, o pasto deve ser completado com energia e outros nutrientes (NRC,2007). A utilização de feno para alimentação de equinos, apesar de não se dispor de uma estatística oficial a respeito de sua quantidade total e valor, caracteriza-se, de forma bastante evidente, como um mercado igualmente significativo e promissor. Considera-se como feno, todo alimento volumoso obtido pela desidratação parcial de uma planta forrageira, que pode ser gramínea ou leguminosa. Entre as gramíneas, destacam-se as do gênero Cynodon, e praticamente todas as suas variedades são adequadas para o processo de fenação. Entre as leguminosas, o feno de alfafa possui a maior quantidade de proteína. O preço do feno apresenta grande variação estacional, atraindo produtores nos períodos de alta. Quando os preços baixam, ocorre redução do seu número. A sazonalidade nos preços está associada às variações climáticas, mais especificamente, à precipitação pluviométrica (Barros et al., 2006). O custo do frete limita a área de atuação dos produtores de feno, já que a quilometragem do frete gira em torno do preço do litro de óleo diesel. Desta forma, os produtores de feno possuem área de atuação limitada pelo custo do frete. Distâncias superiores a 200 km, em geral, inviabilizam economicamente o transporte. Assim, as empresas produtoras de feno atuam localmente e, em alguns casos, regionalmente, mas nunca nacionalmente (Barros et al., 2006). Fenos de gramíneas ou de leguminosas constituem a principal fonte de fibra na formulação de rações destinadas aos equinos. Os fenos de leguminosas, normalmente, possuem valores nutricionais mais elevados comparativamente aos de gramíneas, por outro lado, estes são produzidos mais facilmente e apresentam custos menores, porém com qualidades nutricionais inferiores (Lewis, 2000). Os equinos gastam menos tempo para ingerir uma refeição composta por feno na forma de cubos ou pellets do que em ramas. Essa rápida ingestão

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é contraproducente em cavalos confinados ou com baixa disposição de fibra. A necessidade instintiva de mastigar leva àqueles animais que não dispõem de forragem a desenvolver vícios ou estereótipos como mastigar a madeira das portas da cocheira, coprofagia, aerofagia, ingestão de pelos, ou outros. Num estudo, a mastigação de cama composta por palha ou maravalha, aumentou quando foi oferecido forragem na forma de pellet ou cubo, como fonte exclusiva de volumoso (Hintz,1975). A dureza do pelete ou cubo também pode influenciar a ocorrência de mastigação de cama, à medida que a dureza do pelete diminui, a incidência aumenta (Lewis, 2000). Do mesmo modo, outros efeitos decorrentes do aumento abrupto ou consumo de quantidades inadequadas de carboidratos solúveis, pode criar um ciclo de alimentação / jejum no qual são geradas, grandes flutuações hormonais e de outros substratos metabólicos importantes para o crescimento e formações ósseas (Kronfeld, 1996). O efeito do processamento dos grãos de cereais foi comunicado em vários estudos, despertando o interesse de pesquisadores e produtores de rações principalmente no que se refere ao amido. Um interesse especial no grão de milho se justifica pela sua grande disponibilidade no mercado, e por sua concentração de amido por unidade de peso, quando comparado com outros grãos de cereais (Gobesso et al., 2008). Os processamentos de grãos podem ser divididos em frios ou quentes. Os processamentos frios consistem na moagem em diferentes granulometrias por moinhos de martelo ou de roda, e podem ser aplicados à determinados tipos de grãos, como o milho. No caso da aveia, a moagem resulta num material pastoso, difícil de manipular, motivo pelo qual este processo não é utilizado. Os métodos que usam calor são mais utilizados na indústria moderna, principalmente a laminação a quente e a extrusão. A laminação consiste em esmagar o grão de milho entre dois rolos metálicos rotatórios, aquecidos com vapor de água, que gelatiniza parcialmente o amido, e produz um floco cozido parcialmente. A extrusão consiste em submeter determinado alimento a ação física do extrusor, aparelho composto por um forte parafuso central coberto por uma camisa metálica, que ao girar empurra e espreme os alimentos contra a camisa, misturando homogeneamente todas as partículas e elevando a temperatura da massa a 140°C. Como resultado deste processo o amido gelatiniza, modificando a sua estrutura molecular por ruptura das ligações químicas que unem as moléculas de glicose, e que não podem ser catalisadas pela amilase intestinal, facilitando a absorção de glicose neste segmento e favorecendo o balanço energético (Julliand et al, 2006, Hartlova et al, 2010). Estudos comparativos de diferentes processamentos foram desenvolvidos em equinos por Gobesso et al. (2008). Utilizando grãos de milho e sorgo triturados e extrusados em quantidades de 4 g kg/PV,

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estes autores observaram maior digestibilidade do amido e maior resposta glicêmica naquelas dietas contendo grãos extrusados comparados com os grãos triturados. No mesmo sentido, estudo feito por Vervuet et al. (2007) comparando dietas formuladas com cevada in natura, moída, micronizada e extrusada comprovaram maior digestibilidade do amido e maior resposta glicêmica nas dietas contendo cevada extrusada. Por outro lado, Vervuet et al. (2003) compararam a digestibilidade e resposta glicêmica dos grãos de aveia in natura, micronizada e extrusada, e concluíram que o processamento da aveia não apresenta diferença na leitura dos parâmetros mencionados. Isto indica que o efeito do processamento na digestibilidade e na resposta glicêmica será mais evidente em aqueles grãos que contém amido cristalino e resistente, como o milho, o sorgo e a cevada, quando comparado com amidos de fácil digestão, como a aveia.

CONSUMO DE ÁGUA Os padrões de ingestão são modificados pela fonte e disponibilidade de água, além da idade do animal. Para animais adultos, estabulados, é normal ocorrerem de 2–8 episódios de ingestaão por dia, que duram em média de 10–60 segundos (McDonnell et al., 1999). Também de acordo com os estudos de Sufit et al (1985); McDonell et al (1999) e Nyman & Dahlborn (2001), observou-se que os animais costumam beber maior quantidade de água durante as refeições. Em experimentos anteriores verificou-se que em 75 a 89 % dos episódios observados em pôneis alimentados ad libitum e em cavalos alimentados quatro vezes por dia, a ingestão de água foi peri-prandial, ou seja, dentro de 2 horas pós-ingestão (Sufit et al., 1985; Nyman & Dahlborn, 2001). Em um estudo feito por Pagan & Harris (1999), a ingestão de água foi significantemente alterada quando adicionado feno à dieta concentrada, tanto ao mesmo tempo, como 2 horas antes ou 4 horas depois. No entanto, o pico de ingestão ocorreu em 2 horas no período peri-prandial da alimentação com o feno. Por outro lado, o comportamento e padrões de ingestão de água não diferiram em equinos da raça Standardbred quando foram oferecidas dietas contendo quantidades similares de aveia e feno por 2 ou 6 vezes ao dia. A ingestão hídrica diária não foi afetada pela freqüência alimentar, mas a quantidade consumida em cada período das refeições não foi uniforme ao longo do dia (Jansson & Dahlborn, 1999).

RESPOSTA GLICÊMICA Define-se resposta glicêmica como a capacidade de certo alimento de gerar uma determinada glicemia ou quantidade de glicose no sangue. Os mecanismos glicoregulatórios nos cavalos não têm sofrido avaliações criteriosas, apesar de serem importantes para compreensão do padrão

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plasmático da glicose, não somente nos casos de doenças, como também em conseqüência da influência de exercícios, medicações e nutrição. Para ilustrar, a concentração de glicose plasmática é menor em pôneis alimentados com dietas contendo grãos, quando comparada com a de pôneis que comem feno, mas aumenta, e se equivale, quando estes animais recebem infusão intravenosa de glicose (Garcia & Beech, 1986). A glicose é a maior fonte de energia para os cavalos, e a glicólise é a reação enzimática mais eficiente para a produção de ATP nas células (Arai et al., 1994). É absorvida no intestino delgado, e em condições naturais sua disponibilidade é proporcional à digestão dos polissacarídeos e oligossacarídeos da dieta. Por tanto, uma absorção normal depende de uma mucosa intestinal íntegra e funcional (Hintz et al., 1971a). A glicemia depende do equilíbrio entre a absorção da glicose alimentar, sua síntese e liberação pelo fígado e sua utilização pelos tecidos (Argenzio & Hintz, 1972; Ford & Evans, 1982). Esta dinâmica é regulada pela insulina, hormônio produzido pelas células pancreáticas ß e principalmente encontrado no tecido muscular. Em adição à insulina, outros hormônios regulatórios estão envolvidos na homeostase da glicose como o glucagon, glicocorticóides, catecolaminas e hormônios de crescimento (Lacerda Neto et al., 1998). Dietas ricas em grãos tendem a ter maior digestibilidade de carboidratos no intestino delgado e maior absorção de glicose, enquanto uma dieta exclusiva de forragens estimula maior conversão de carboidratos para ácidos graxos voláteis por bactérias no ceco e cólon. Entretanto, a glicose plasmática não é influenciada pela variação da relação concentrado/volumoso na dieta, sugerindo que diferenças nas propriedades glicêmicas da dieta podem ser compensadas por ação hormonal (Hintz, 1971b). Nos cavalos, a glicogênese é a principal fonte de glicose utilizada pelos tecidos, que aumenta durante o jejum, minimizando os efeitos da redução da absorção intestinal de glicose. Desta forma é possível especular que nos animais alimentados exclusivamente com gramíneas, a glicemia é mantida somente pela glicose endógena associada a baixos níveis de secreção de insulina. Por outro lado, quando os animais recebem uma estimulação aguda com glicose, a secreção de insulina é menos intensa que em animais adaptados à alimentação com concentrados (Ford & Evans, 1982). A concentração de glicose plasmática nos equinos é mediada por mecanismos diferentes dos que atuam em ruminantes, e a resposta da insulina à glicose em pôneis se assemelha a descrita em humanos (Argenzio & Hintz, 1972). A concentração plasmática de glicose após a ingestão de alimento pode ser influenciada pelo tamanho da partícula, tipo de processamento, composição em proteína, gordura e fibra do alimento, estrutura bioquímica e processo de absorção do carboidrato, conteúdo e intervalo de tempo da refeição anterior (Guezennec, 1995). A moagem dos grãos pode melhorar a digestibilidade do

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amido no intestino delgado; porém, alimentos peletizados podem produzir um significativo aumento na glicose e insulina plasmáticas, quando comparada com a de alimentos menos processados (Potter et al., 1992). Para completar a avaliação do índice glicêmico de um alimento, a concentração plasmática de insulina pode ser um bom indicativo da presença de glicose na corrente sanguínea. Uma rápida resposta secretora de insulina pelo pâncreas pode estar associada com a ingestão de grandes quantidades de energia e proteína (Glade et al., 1984; Rankin, 1997). Nos cavalos, o controle da glicose e insulina, pode ser prejudicado em vários estágios de vida ou em condições como crescimento, exercício, obesidade, gestação, disfunção da pituitária, laminite e idade (Ralston, 2002). É importante observar, segundo Madigan & Evans (1973), que a observação das trocas plasmáticas de insulina, são associadas à secreção e não à remoção. Desde que a insulina é secretada no sistema porta, e uma porção significante é removida pelo fígado, e estas perdas irreversíveis no plasma podem não fornecer informações sobre os níveis de secreção pancreática. Do mesmo modo, Giraudet et al. (1994) comunicaram que o aumento inicial nos níveis plasmáticos de insulina, após a alimentação, é decorrente da secreção de insulina armazenada nas células pancreáticas beta, comprovado em dosagens dos níveis de insulina plasmática realizadas 5 minutos após a aplicação de glicose por via endovenosa, tempo insuficiente para síntese de insulina.

DIETA COMPLETA úNICA Entende-se como dieta completa única aquela que se destina a ser oferecida como refeição completa para o equino sem nenhum grão, suplemento, pasto ou feno adicional (Lewis, 2000). Em termos de produção, uma das vantagens de se oferecer um alimento semelhante, é que todos os suplementos vitamínicos, minerais e protéicos permanecem amalgamados na mistura, impedindo a sua separação durante a mastigação e evitando a seleção, já que os equinos são sabidamente muito seletivos. Também pode ser bastante benéfico para cavalos de manutenção difícil, especialmente aqueles com dificuldades mastigatórias ou dentes deteriorados (equinos idosos), podendo assim diminuir a incidência de cólicas e laminite nestes animais que não mastigam adequadamente o alimento, particularmente as forragens. Para a produção industrial de um alimento completo, moem-se uma mistura de grãos e forragens in natura ou como feno, em quantidades calculadas pelo balanceamento dos nutrientes. Esta mistura pode ser submetida a diversos processos industriais, como peletização ou extrusão, usando geralmente um ligante, que resulta num material cuja forma final depende dos moldes utilizados. Ott et al. (1999) demonstraram que alimentos extrusados são mais bem aceitos pelos cavalos, mais prontamente digeríveis, além de serem consumidos em menos tempo do

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que alimentos peletizados. O conceito de dietas completas para equinos não é novo, e já cientistas russos compreenderam a sua importância na década de 30 (Sorokin, 1936). Os alemães usaram este conceito também durante a segunda guerra mundial para alimentar os cavalos do exercito de uma maneira prática, que permitisse aproveitar diversas fontes de nutrientes e transformá-las num único material, fácil de armazenar, distribuir e fornecer, sem perder a qualidade nutricional (Earle, 1950). Em 1991, foi solicitada e concedida nos EEUU uma patente de Dieta Completa Extrusada Limitante (Alley & Scott, 1991), formulada com feno de alfafa, grãos e diversos subprodutos da agroindústria, destinada a animais em manutenção. Basicamente, estes materiais foram balanceados, moídos, misturados e extrusados, resultando em partículas com tamanho de 2-3 polegadas. O diferencial deste produto é a sua baixa densidade energética, com baixo conteúdo de amido, que permite disponibilizar alimentos ad libitum para os cavalos, com baixo risco de complicações clínicas. Isto é possível devido às características anatômo-fisiológicas desta espécie, que tem um estomago proporcionalmente pequeno, quando comparado ao total do trato digestivo. A ingestão de alimentos volumosos estimula a distensão das paredes do estomago, induzindo uma sensação de saciedade que limita o consumo. Alimentos ricos em energia concentrada, principalmente na forma de amido, devem ter o consumo controlado, uma vez que a saciedade por expansão do estomago obrigaria a uma ingestão exagerada de energia, aumentando o risco de complicações de ordem clínico. Assim, utilizando fórmulas de baixo conteúdo energético, os alimentos podem ser fornecidos sem restrições, uma vez que o próprio animal é capaz de regular o consumo, com todas as vantagens de manejo que isto significa. Devido a estas características, este produto foi desenhado para atender cavalos em manutenção e de lazer, sendo de pouca valia para cavalos de esporte. Estudos recentes com dietas completas para equinos foram realizados por Weyemberg et al. (2007), para comparar os efeitos da freqüência de arraçoamento na digestibilidade e na resposta glicêmica. Esses cavalos foram tratados com dieta consistente em feno de alfafa picado a 10 cm, grãos de cereais moídos e premix vitamínico mineral, fornecido em mistura como único alimento, e não apresentaram diferenças na digestibilidade, indicando que o fornecimento conjunto de volumoso e concentrado não induz modificações neste sentido.

DIETA COMPLETA EXTRUSADA A partir da compreensão do enorme potencial deste tipo de alimento, foram realizados testes com equinos no Departamento de Nutrição e Produção Animal FMVZ-USP, conjugando critérios de nutrição consolidados com os

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últimos avanços em tecnologia de produção industrial, para avaliar o seu impacto na digestibilidade e resposta glicêmica, e contribuir com o subsidio cientifico à disseminação do uso da Dieta Completa Extrusada (DCE). A DCE foi comparada com a dieta tradicional composta por fração volumosa e fração concentrado, e, fornecidas em cochos separados. Na composição de ambas dietas foram usados os mesmos ingredientes, a base de grãos de milho moído, farelo de soja, premix vitamínico mineral feno de Tifton 85. A DCE foi elaborada com molde especifico, para resultar em partículas longas, de 0,6 x 10 cm, de maneira de conservar as fibras vegetais longas (Figura 1).

Figura 1.- Dieta completa extrusada, contendo fibras vegetais longas e concentrado balanceado. A comparação entre dietas foi realizada com níveis de inclusão. Os grupos controle foram alimentados com dietas tradicionais, a base de feno e concentrado separados, e os grupos teste receberam 33, 66 e 100% de substituição da dieta tradicional por DCE.

COMPORTAMENTO ALIMENTAR DCE Foi possível observar uma diferença no tempo de consumo entre tratamentos, inversamente proporcional ao nível de inclusão (p<0,05). Os animais alimentados com 100% de DCE demoraram entre 45 a 90 minutos para a ingestão de toda a refeição, havendo dois episódios isolados de um animal que demorou mais de 2 horas. Frape et al. (1995) concluíram que um cavalo com peso médio de 500 kg, demora 40 minutos para a ingestão de 1 kg de feno, enquanto que para a ingestão da mesma quantidade de feno, processado e peletizado, o tempo despendido é de aproximadamente de 8 – 10 minutos. A pesar do processamento da DCE ter efeito no tempo de consumo, este não foi muito diferente do tempo de consumo de dieta tradicional comunicada em trabalhos anteriores. Isto foi atribuído pelos autores à forma física do produto, que com medidas superiores aos peletes convencionais (0,5 x 3-4 cm), permite

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a inclusão de fibras vegetais longas, o que aumenta o tempo de mastigação. Um consumo maior de água foi observado nos cavalos que receberam 100% de DCE. Nos tratamentos restantes, o consumo de água foi episódico e circadiano, condizente com resultados comunicados em estudos anteriores. Os padrões de ingestão de água são modificados pela fonte e disponibilidade da mesma, além da idade do animal. Para animais adultos, estabulados, é normal ocorrerem de 2 – 8 episódios por dia, que duram em média de 10 – 60 segundos. (McDonnell et al., 1999). Os cavalos costumam aumentar o consumo de água durante as refeições, fato que também foi observado nestes testes. Em experimentos anteriores verificou-se que em 75 a 89 % dos episódios observados em pôneis alimentados ad libitum e em cavalos alimentados 4 vezes por dia, a ingestão de água foi periprandial, ou seja, menor que 2 horas após a refeição (Nyman & Dahlborn, 2001). Pagan & Harris (1999) comunicaram que a ingestão de água foi significantemente alterada quando adicionado feno à dieta concentrada, tanto ao mesmo tempo, como 2 horas antes ou 4 horas depois. No entanto, o pico de ingestão ocorreu em 2 horas no período periprandial da alimentação com o feno. Por outro lado, o comportamento e padrões de ingestão de água não diferiram em equinos da raça Standardbred quando foram oferecidas dietas contendo quantidades similares de aveia e feno por 2 ou 6 vezes ao dia. A ingestão hídrica diária não foi afetada pela freqüência alimentar, mas a quantidade consumida em cada período das refeições não foi uniforme ao longo do dia (Jansson & Dahlborn, 1999).

DIGESTIBILIDADE DCE Como hipotetizado, não foi possível observar diferenças entre tratamentos na digestibilidade da matéria seca (MS), matéria orgânica, (MO), proteína bruta (PB), extrato etéreo (EE), matéria mineral (MM), fibra em detergente ácido (FDA), fibra em detergente neutro (FDN) e amido. Os resultados da digestibilidade do amido foram desestimados, devido à metodologia de coleta total de fezes utilizada, com a qual os resultados são sempre elevados, ao ponto de não ser possível observar diferenças.

RESPOSTA GLICÊMICA A resposta glicêmica apresentou diferenças entre tratamentos nestes testes, e foi usada para estimar a digestibilidade do amido indiretamente. Uma resposta glicêmica maior se correlaciona fortemente com a digestibilidade do amido. Sendo no caso a fonte de amido a mesma, a diferença foi atribuída ao tratamento, uma vez que a extrusão é capaz de transformar e gelatinizar o amido, aumentando assim a sua digestibilidade. A concentração plasmática normal de glicose, em jejum, foi estipulada em 81-100 mg/dL por Meyer et al., (1995), valores que coincidem com os observados neste estudo. Respostas glicêmicas

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em equinos alimentados com rações contendo grãos foram estudadas por Stull & Rodiek, 1988, que comunicaram aumentos de 81-90 mg/dL para 109,8–135 mg/dL duas horas após a alimentação. Por outro lado, dietas ricas em forragens apresentam respostas glicêmicas inferiores. Entretanto, dietas compostas por forragem e concentrado ou dietas completas peletizadas também demonstram aumento significativo na concentração de glicose sanguínea. A área abaixo da curva (AAC) de glicose, segundo Vervuert et al. (2004), é uma forma eficiente de se avaliar a quantidade total de glicose absorvida durante determinado período. Os resultados da AAC dos testes realizados pelos autores estão expostos na Figura 2. Os dados obtidos coincidem com os achados em outros estudos. Observa-se que os tratamentos com 33, 66 e 100 de DCE apresentaram o pico de glicose aos 90 minutos após a alimentação, concordando com Stull & Rodiek (1988), os quais, fornecendo dietas ricas em amido, observaram o pico de glicose dentro de duas horas após a alimentação. No tratamento 100 % de DCE é possível observar uma maior AAC, porem, sem picos abruptos de glicose, resultados que discordam daqueles comunicados por Robinson (1992), quem afirmou que vários tipos de dietas alteram significativamente a altura da curva glicêmica, mas não a forma.

Figura 2.- Área Abaixo da Curva das glicemias dos quatro tratamentos, com cinco repetições por tratamento.

ANÁLISE DE VIABILIDADE ECONÔMICA DA DCE Para avaliar a viabilidade econômica e mercadológica da DCE foi desenvolvido estudo específico no Laboratório de Análises Econômicas do Departamento de Nutrição e Produção Animal da FMVZ/USP, durante o

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segundo semestre de 2008, por meio de levantamento detalhado e elaboração de custos em planilhas eletrônicas da produção agrícola do feno, do beneficiamento industrial, do transporte e da comercialização da DCE para a espécie eqüina. No referente aos custos agrícolas, levou-se em conta a qualidade e o tipo de solo, a operação agrícola de preparo de solo, os tratos fitossanitários, o uso de defensivos e adubos (tanto adubação de cobertura, quanto adubação de plantio) e os equipamentos de lavoura necessários para a produção do feno. A tecnologia de produção do feno foi levantada mediante contato com empresas especializadas na sua produção, localizadas no Estado de São Paulo. Para levantar os custos do beneficiamento do produto, levaram-se em consideração os equipamentos industriais, os ingredientes necessários, os custos de energia elétrica da região, de mão-de-obra, assim como o custo de ensacamento e embalagem. Para os custos de transporte, levou-se em conta um raio de distribuição de 300 km. A metodologia de contabilidade de custos, tanto agrícolas quanto industriais, seguiu o modelo proposto por Martins (1990). Todos os preços de insumos e serviços foram levantados junto ao mercado por meio de ligações telefônicas ou visitas aos estabelecimentos. Foram pesquisadas as regulamentações envolvidas na produção e comercialização do produto. A regulamentação relacionada à produção de ração e alimentos para animais foi obtida na base de dados do Diário Oficial da União. A incidência dos diversos impostos (federais, estaduais e municipais), suas respectivas alíquotas e formas de cobrança foram fornecidas por meio da assessoria de um escritório contábil especializado (Senso, 2008, comunicação pessoal). Par o estudo de marketing, foram levantados os principais canais de comercialização (locais, público, formas de transporte, pagamentos, etc.) potenciais para escoamento do produto, bem como os preços que eventualmente poderiam ser praticados a partir do conhecimento dos custos e da comparação com produtos correlatos disponíveis no mercado (concentrado comum e feno comum). As dez planilhas que sustentaram este estudo levaram em conta os seguintes parâmetros econômicos: imobilizado (imóveis, equipamentos, veículos), pessoal (operacional e administrativo), insumos (agrícolas e industriais), despesas (operacionais e administrativas), planejamento da produção (volume, preço etc.), equivalência nutricional (dieta completa), tributação (municipal, estadual e federal), transporte (até mercado consumidor), Demonstrativo de Resultado do Exercício (mensal), Fluxo de Caixa (anual, para 30 anos). Foram elaborados três cenários baseados em preços diferenciados de venda do DCE ao consumidor final. Em termos de volume de venda, considerou-se um mercado cativo referente o consumo de 1.125 animais/ano que consumiriam exclusivamente a DCE. Considerou-se, ainda, a distribuição

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comercial da DCE por um representante que receberia uma margem bruta de 25%. No cenário 1, o preço de venda da DCE ao criador (R$ 0,82/kg) seria o mesmo equivalente à soma dos custos dos ingredientes se esses fossem adquiridos separadamente. Neste cenário, portanto, não seria cobrada a “conveniência” por se dispor de um produto único, com as vantagens operacionais já abordadas. No cenário 2, seria cobrado um adicional de 10% sobre o custo que os criadores teriam para adquirir os ingredientes separadamente. Este valor a mais poderia ser conquistado desde que os criadores valorizassem a praticidade da DCE. No cenário 3, a praticidade seria ainda mais valorizada e os criadores estariam dispostos a gastar 20% a mais do que gastariam com a aquisição dos ingredientes separadamente. Levando-se em conta as condições consideradas nesse estudo, pôde-se concluir que a produção da DCE para equinos é economicamente viável desde que tenha um mercado consumidor em escala adequada para garantir o consumo da produção.

CONCLUSÕES Com os conhecimentos sobre fisiologia digestiva, nutrição de equinos, e tecnologia de produção de alimentos disponíveis atualmente, é possível formular e fabricar uma ampla gama de alimentos para atender as mais diversas necessidades, não somente nutricionais, senão de manejo, armazenamento, de mão de obra e transporte. Nesse contexto, a Dieta Completa Extrusada apresenta-se como uma ferramenta nutricional promissora, de grande versatilidade e plasticidade, que permite combinar os mais diversos ingredientes num produto final único, fácil de manipular, armazenar e transportar, sem perder a qualidade nutricional, e economicamente viável. Estudos futuros deveram indicar com maior acurácia o verdadeiro potencial deste tipo de alimento, e contribuir de maneira significativa ao enriquecimento do universo nutricional da espécie eqüina.

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CAPÍTULO XIII

FISIOLOGIA DO CICLO ESTRAL, SINCRONIZAÇÃO DO ESTRO E OVULAÇÃO EM FÊMEAS BOVINAS

Marcos Vinicius Biehl1, Delci de Deus Nepomuceno2, Filipe Marinho da Rocha3, Alexandre Vaz Pires4

1 Aluno de Doutorado do Programa de Pós Graduação em Nutrição e Produção Animal – FMVZ/USP2Aluno de Doutorado do Programa de Pós Graduação em Ciência Animal e Pastagens – ESALQ/USP3Aluno de Mestrado do Programa de Pós Graduação em Nutrição e Produção Animal – FMVZ/USP4Professor Associado do Departamento de Zootecnia – ESALQ/USP

INTRODUÇÃO Determinados fatores da cadeia produtiva na pecuária de corte nacional ainda impedem o seu desenvolvimento, entre eles podemos citar o elevado intervalo entre partos, pouco uso da inseminação artificial (IA), conseqüentemente, demorada evolução genética e é claro um grande prejuízo na qualidade do produto original que é a carne. A previsão é que o rebanho bovino nacional, que atualmente possui cerca de 202,2 milhões de cabeças (IBGE, 2009) apresente crescimento constante nos próximos anos. Murta et al. (2001), cita que a inseminação artificial em gado de corte no Brasil representa pouco menos de 5% do rebanho efetivo. Porém atualmente revisando os dados estatísticos do rebanho bovino brasileiro (ANUALPEC, 2010), juntamente com a quantidade de sêmen vendida no ano de 2009 (ASBIA, 2009), podemos concluir que houve um aumento substancial do número de animais inseminados, que está em torno de 10% do rebanho nacional. Este forte crescimento está associado diretamente à utilização da Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF), que definitivamente começou a ser usada em grande escala pelos produtores brasileiros. Os problemas rotineiramente encontrados em programas de IA são: as características fisiológicas de fêmeas bovinas zebuínas, pouca qualificação da mão de obra, rebanhos muito numerosos e grandes extensões das propriedades, estes são os fatores que diminuem a detecção de cio e a taxa de serviço na IA. Portanto, tendo em vista aumentar a exploração da IA, obtendo então os benefícios desta tecnologia, espera-se que a sincronização do ciclo estral e IATF torne-se uma ferramenta apropriada para a solução de alguns dos fatores

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acima citados. Nesse sentido busca-se através da melhora no aspecto nutricional, uma adequada utilização de substâncias farmacológicas em protocolos reprodutivos, os quais proporcionem uma correta sincronia dos estros, boas taxas de fertilidade, racionalização da mão de obra empregada, dentro de um manejo coerente e obviamente com melhor retorno financeiro. O controle farmacológico do ciclo estral e da ovulação de vacas de corte depende primeiramente do entendimento do comportamento fisiológico reprodutivo da vaca, o qual este ligado diretamente com seu estado nutricional e condição (parida ou solteira). Neste mesmo sentido as interações e funções de hormônios aplicados para este fim, requerem compreensão e análise do seu funcionamento fisiológico.

REGULAÇÃO DAS ONDAS DE CRESCIMENTO FOLICULAR O período que compreende dois estros consecutivos, envolvendo crescimento dos folículos ovarianos é denominado como um ciclo estral que tem duração entre 18 à 24 dias, com um intervalo médio de 21 dias. O crescimento dos folículos ovarianos em bovinos ocorre em um padrão denominado ondas de crescimento folicular (Ginther et al., 1989; Adams et al.,1992; Bo et al., 1994), onde em um ciclo estral há normalmente a emergência de duas ou três ondas de crescimento folicular (Binelli, 2000) (Figura 01). Durante o ciclo estral uma onda de folículos emerge entre os dias 1 e 3 após o estro. São geralmente, em torno de 10 à 50 folículos neste grupo com o tamanho de 2 à 3 mm cada. Nos dias subseqüentes, parte desses folículos crescem para 4 à 6 mm, sendo que 2 à 5 folículos maiores do grupo continuarão a crescer enquanto que os outros regridem. Neste grupo de folículos pelo menos um continua a crescer e torna-se dominante (Bo et al., 1994), este momento é denominado divergência, após isso essa onda na maioria das vezes inicia sua atresia.

Figura 01 – Padrão de desenvolvimento folicular em duas e três ondas de crescimento. Adaptado de Adams et. al., 2008.

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Durante a primeira onda de crescimento folicular a divergência ocorre entre os dias 2 e 4 da fase de crescimento (Ginther et al., 1996). O desenvolvimento do folículo dominante é dividido em 3 fases: fase de crescimento, estática e de regressão. Na primeira onda de desenvolvimento folicular a fase de crescimento vai desde a emergência até em torno do oitavo dia após o estro, a fase estática ocorre entre o oitavo e décimo dia e a fase de regressão ocorre após o décimo dia, para fêmeas que apresentam duas ondas de crescimento folicular, sendo que na existência de três ondas de crescimento têm-se do sexto ao sétimo dia para estática e sétimo a oitavo para regressão (Silcox et al.,1993). Em torno do oitavo dia do ciclo estral (ou sexto, pela variação do número de ondas) ocorre emergência da segunda onda de crescimento folicular e o processo se reinicia. O folículo dominante dessa segunda onda de crescimento folicular regride (se houver três ondas) ou se torna folículo ovulatório se ocorrer apenas duas ondas (Bo et al. 1995). O desenvolvimento do ciclo estral e conseqüente crescimento folicular são regulados por mecanismos endócrinos e neuroendócrinos principalmente os hormônios hipotalâmicos, as gonadotrofinas e os esteróides secretados pelos ovários. A regulação de secreção destes hormônios durante o ciclo estral requer um delicado balanceamento entre complexas interações hormonais, podendo ser denominados de mecanismos de “Feedback”. O folículo dominante que escapa da atresia secreta quantidades crescentes de E2 (estradiol), este induz mudanças de comportamento que estão associadas ao estro e induz o pico de LH (hormônio luteinizante). O folículo ovulado sofre mudanças estruturais e funcionais e dá origem a uma estrutura denominada corpo lúteo (CL) (Binelli, 2000), esta estrutura é responsável pela secreção de progesterona (P4), hormônio essencial para ciclicidade normal da vaca (Bo et al., 2000). Durante a fase de secreção de P4 ocorrem aumentos periódicos de secreção do hormônio FSH (hormônio folículo estimulante), o qual estimula a emergência das ondas foliculares. Neste, raciocínio vacas com 2 ondas de crescimento folicular tem dois aumentos de FSH e vacas com três ondas tem três aumentos (Bo et al., 2000). Em torno do quarto dia após a ovulação, quando o folículo dominante tem aproximadamente 10 mm de diâmetro, ocorre a transição da dependência de FSH para LH (divergência), sendo este estágio o ponto crítico para continuar o crescimento do folículo dominante (Ginther et al., 1996). Nas observações de Jolly et al.(1994) o LH estimulou o AMPc (AMP cíclico) em células da granulosa somente em folículos com mais de 9 mm de diâmetro, provando então que folículos com mais de 9 mm de diâmetro adquirem receptores para LH e portanto capacidade ovulatória. Durante a fase lútea (período de formação e atividade do corpo lúteo) do ciclo estral e em vacas gestantes, a progesterona secretada pelo corpo lúteo

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produz “feedback” negativo na liberação do LH, e por esta razão não ocorre ovulação (Fortune, 1994). Se ocorrer uma baixa pulsatilidade de LH após a divergência dos folículos, surge um “turnover” de folículos e subseqüente aumento do numero de ondas de crescimento folicular por ciclo estral (Murphy et al. 1991). Portanto o que determina se irão ocorrer duas ou três ondas de crescimento folicular parece ser a taxa de crescimento, que pode ser dependente do padrão de secreção do LH e ainda a duração da fase lútea no ciclo estral normal. Se a regressão do corpo lúteo ocorrer enquanto o folículo dominante da segunda onda for funcional (fase de crescimento ou estática), ele será ovulatório (ciclo estral com duas ondas), porém, se o folículo já iniciar a fase de regressão no momento da luteólise, haverá o crescimento de outro folículo dominante da terceira onda de crescimento folicular (Kastelic et al., 1990). No trabalho de Figueiredo et al., (1997), a dinâmica folicular para vacas e novilhas cruzadas Nelore (Bos taurus indicus) foram caracterizadas pela presença de duas ou três ondas de crescimento folicular. Tal padrão de crescimento folicular é igual a padrões reportados para fêmeas cruzadas européias (Bos taurus taurus) (Figueiredo et al, 1997) as quais apresentaram também duas ou três ondas de crescimento folicular predominantemente. Entretanto, uma ou quatro ondas de crescimento folicular foram raramente observadas. Neste mesmo trabalho os animais que foram acompanhados por dois ciclos seguidos, apresentaram o mesmo padrão de crescimento folicular, no entanto, um terço apresentou variação no número de ondas de crescimento folicular de um ciclo para o outro. Novilhas Brahman (Bos taurus indicus) apresentaram de uma ou até quatro ondas de crescimento folicular, porém a predominância é de três ondas foliculares (Rhodes et al., 1995).

Tabela 01 – Principais diferenças na fisiologia de fêmeas Bos indicus e Bos taurus.

1Intervalo do início do estro até a ovulação; 2por onda de crescimento folicular; 3 após a ovulação; *Folículo dominante;

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Bastos et al. (2010), trabalharam com o desenvolvimento folicular de vacas Nelore (Bos taurus indicus) e vacas Holandesas (Bos taurus taurus) mantidas sobre a mesma condição de ambiente e alimentação, e observaram que 80 % das vacas Nelore e 60 % das vacas Holandês apresentaram três ondas de crescimento folicular durante o ciclo estral, sendo que todas as demais apresentaram duas ondas. O comprimento médio do ciclo estral foi similar entre Nelore e Holandês (23 dias; variando de 21 a 26). Também foram encontradas diferenças quanto ao número de folículos antrais à emergência da onda, o número de folículos de 2 a 5 mm presentes nos ovários foi de 42,7±5,9 para Nelore (variando de 25 a 100) e 19,7±3,2 para Holandês (variando de 5 a 40). Além disso, esta diferença no número de folículos entre as raças persistiu durante todo o ciclo estral.

ANESTRO PÓS-PARTO O anestro pós-parto é o período de transição, durante o qual a funcionalidade do eixo hipotalâmico-hipofisário-ovariano-uterino se recupera da prenhez anterior. As primeiras três semanas após o parto são necessárias para a involução uterina e reposição dos estoques hipofisários do hormônio luteinizante (LH) e início do desenvolvimento folicular (YAVAS & WALTON, 2000). A duração do anestro pós-parto é influenciada principalmente por fatores como: balanço energético, presença do bezerro e número de partos. Influem também a raça, presença de touro, gemelaridade, distocia e retenção de placenta (YAVAS & WALTON, 2000). A maioria dos casos de um anestro pós-parto prolongado está associado ao manejo nutricional inadequado das vacas, entretanto, tem sido observado que, mesmo em matrizes com condição corporal e nutrição adequadas, um percentual elevado de animais demora mais que 70 dias para retornar ao ciclo estral após o parto. Esse atraso é mais evidente em animais zebuínos e mestiços de zebuínos, sendo o efeito inibitório da presença do bezerro sobre a pulsatilidade de LH a provável principal causa. Uma matriz que demora mais que 70 dias para retornar à atividade cíclica ovariana, dificilmente, produzirá um bezerro por ano, pois para isso deveria conceber até aproximadamente o 75º dia pós-parto. Wiltbank et al, (2002) basearam-se no estudo de Cortez e Oliveira (1999), para especular que fêmeas zebuínas apresentavam deficiência de FSH no pós-parto, pois verificaram que os folículos destas fêmeas não alcançavam diâmetros superiores a 6 mm. Contudo estudos recentes sobre dinâmica folicular em Bos indicus, (Gimenes et al., 2005b; Castilho et al., 2006) constaram que o folículo nestes animais atige a dominância em torno de 6 mm de diâmetro, bem inferior aos animais Bos taurus (8,5 mm). Portanto,

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podemos concluir que as condições anovolutórias frequentemente encontradas em zebuínos no pós parto não está associada a deficiência do FSH, e sim como citado anteriormente ao anestro pós parto destas fêmeas, ocorre devido o comprometimeto na liberação de LH, pois os folículos não atingem diâmetros superiores a 6 mm. A fisiologia da condição anovulatória que ocorre em novilhas na fase pré-púbere, em animais com carência nutricional e em vacas no período pós-parto é muito semelhante. Nestes casos, o crescimento folicular ultrapassa a fase de divergência e atinge a dominância; no entanto, não ocorre ovulação, pois há perda da dominância, atresia do folículo dominante (FD) e emergência de nova onda de crescimento folicular (STAGG et al., 1995). A intensidade do balanço energético negativo em bovinos leiteiros (BUTLER, 2000) e de corte e/ou a amamentação em bovinos de corte provocam efeito inibitório do estradiol na secreção do hormônio liberador das gonadotrofinas (GnRH) pelo hipotálamo durante o anestro pós-parto. Isto acarreta redução dos pulsos de liberação do hormônio luteinizante (LH) e falha no crescimento folicular final. A menor freqüência de pulsos de LH impede a ocorrência do pico pré-ovulatório de estradiol e GnRH e LH, e conseqüentemente a ovulação (YAVAS et al., 2000). Em experimentos desenvolvidos com vacas da raça Nelore (Bos taurus indicus) secas e paridas por Biehl e Pires, 2009 (dados não publicados), foram observadas taxas de ciclicidade de 90 % para vacas secas e 27 % para as vacas lactantes (60 dias pós-parto), evidenciando assim o efeito negativo da amamentação ao retorno da ciclicidade após o parto.

O USO DE PROGESTÁGENOS E ESTRÓGENOS PARA SINCRONIZAÇÃO DO ESTRO Nos anos 50, diversos progestágenos ativos por via oral foram sintetizados, mas somente na década de 60 é que estes esteróides começaram a ser empregados na sincronização do estro de bovinos. Tratamentos com progestágenos por períodos prolongados sincronizam o estro com precisão, porém as inseminações artificiais após o estro sincronizado resultaram em baixa taxa de prenhez (Barros et al., 2000). O progestágeno é utilizado para inibir o desenvolvimento de um corpo lúteo (CL) em fêmeas que ovularam recentemente (próximo a data de colocação do implante) ou inibir a ovulação se a fêmea estiver no final do ciclo estral (Odde, 1990). Porém, dispositivos de progestágenos implantados, na ausência de CL na fêmea provocam a formação de um folículo dominante (FD) persistente que quando ovula produz um ovócito de baixa qualidade (Smith & Stevenson, 1995). Isto se deve à alteração do padrão secretório de LH (alta freqüência e baixa amplitude) (Rajamanhenderan & Taylor, 1991), característico

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de fase folicular, e não um padrão de alta amplitude e baixa freqüência, característico do diestro provocando então uma manutenção prolongada do folículo dominante, interrompendo o padrão usual do crescimento folicular em ondas. Este padrão secretório desencadeia o mecanismo de maturação nuclear, porém, insuficiente para promover a ovulação, no entanto, esta se torna presente quando é interrompida a administração do progestágeno (Madureira, 2000). A capacidade do estradiol de induzir o turnover da onda folicular depende de concentrações elevadas de progesterona na circulação. Isso foi claramente demonstrado em vacas que receberam uma injeção de 1 mg de BE no dia 13 do ciclo estral e nenhum outro tratamento, ou uma dose luteolítica de PGF2α às 0, 24 ou 48 horas depois da injeção de BE (BURKE et al., 1997). O turnover da onda folicular, sinalizado pelo número de animais que apresentaram 3 ondas de desenvolvimento folicular, foi induzido em todos os animais que não receberam PGF2α e em todas as vacas (com exceção de uma) que receberam PGF2α 48 horas depois do BE. Por outro lado, as vacas injetadas às 0 ou 24 horas depois do BE manifestaram ciclos estrais de duas, três e quatro ondas de desenvolvimento folicular e certa prevalência de desenvolvimento de folículos císticos que não conseguiram ovular. Este estudo indicou que as concentrações de progesterona circulante precisam manter-se elevadas por pelo menos 48 horas depois do tratamento com estradiol para que ocorra a indução do turnover da onda folicular, aumentando a possibilidade de ocorrência de luteólise espontânea, quando os tratamentos de sincronização de progesterona/estradiol forem iniciados. (DAY et al., 2010) Caccia & Bo (1998) investigaram a utilização de estrógenos junto aos programas que usam progestágenos e verificou-se que a administração de estradiol induzia a atresia do folículo dominante daquele momento, proporcionando então o crescimento de uma nova onda folicular. Sá Filho et al.(2010) avaliaram o efeito da administração de 2 mg de Benzoato de Estradiol (BE), na inserção do implante contendo progestágeno e duas diferentes doses de Valerato de Estradiol (VE) para sincronização da emergência de uma nova onda em vacas e novilhas Bos indicus, no estudo foi observada uma interação entre categoria animal e o estradiol utilizado. Sendo que o BE promoveu um efeito semelhante nas categorias animais, na indução da emergência de uma nova onda de crescimento folicular. São vários os produtos utilizados encontrados comercialmente: acetato de melengestrol (MGA) administrado oralmente, CIDR®, PRIMER®, PRID®, Sincrogest® entre outros dispositivos intravaginais de P4, e ainda o Crestar® e o Sincro-Mate-B® que são dispositivos subcutâneos de Norgestomet (análogo de P4).

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SINCRONIZAÇÃO DA OVULAÇÃO A sincronização da ovulação é uma ferramenta importante quando o objetivo é trabalhar com IA em tempo fixo, pois torna mais preciso o momento e o mecanismo da ovulação nos animais tratados, ou seja, pela aplicação de hormônios os quais possam promover um mecanismo de “feedback” positivo para LH no momento final do crescimento folicular. Os medicamentos utilizados para a indução da ovulação possuem ação por retroalimentação positiva na liberação pulsátil de LH (estrógenos e LH), ou agem diretamente nos receptores de LH no folículo (eCG e LH), o intervalo entre a administração e a ocorrência das ovulações é específico e de acordo com o fármacos utilizados. Wiltbank e Haughian (2003), observaram que no caso do GnRH, o intervalo entre a administração e a ovulação varia de 26 a 30 horas. Este intervalo é encurtado quando se administra eCG ou LH, variando de 24 a 26 horas. Já quando é realizada a administração de BE a ovulação é induzida em torno de 45 horas após a aplicação, sendo que o intervalo entre a aplicação e o pico de LH ocorre 22 horas, após a administração de BE (MAIO et al. 2006) O Cipionato de Estradiol (CE), quando administrado no momento da retirada do implante de Progesterona, induz o pico de LH entre 45 e 49 horas (SALES et al. 2008), sendo que a ovulação ocorre em torno de 68 horas após o tratamento (SALES et al. 2007). Com essas afirmações podemos concluir que ovulação ocorre em momentos semelhantes quando aplicamos CE na retirada do dispositivo de Progesterona e ou BE 24 horas após a retirada do mesmo. Os sistemas syncro-mate B®, Crestar®, CIDR® e PRID® oferecem alta porcentagem de animais em estro, num período bastante curto, o que possibilita a realização de IA em tempo fixo geralmente entre 48 e 60 horas após a retirada dos implantes ou dispositivos intravaginais. Se isto ocorre, é porque o “status” folicular, no final do tratamento é bastante homogêneo entre os animais o que possibilitaria a sincronização da ovulação mediante a aplicação de drogas que desencadeiem o pico pré-ovulatório de LH (Madureira, 2000). Os estrógenos, como os andrógenos são carreados por proteínas na circulação. De todos os esteróides, os estrógenos apresentam a maior variação de funções fisiológicas. O estrógeno age sobre o SNC para induzir o comportamento do estro na fêmea, porém pequenas quantidades de progestágenos com estrógenos são necessárias em ovelhas e vacas para indução do estro sendo o estradiol o estrógeno biologicamente ativo produzido pelo ovário (Kaltenbach & Dunn,1988). O estrógeno pode agir como um agente sincronizador da ovulação, induzindo um pico de LH através de “feedback” positivo ao GnRH e conseqüentemente liberação de LH, que foi estudo de Mcmillan & Burke (1996) e Madureira et al., (1997), onde foi observado também que com 0,75

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mg ou com 1,0 mg de benzoato de estradiol 24 h após a remoção do implante do progestágeno é eficaz para o pico de LH pré ovulatório, constatado também por Barbuio et al., (1999). O uso de estradiol após um curto período de exposição a progestágenos é aplicado em vacas leiteiras em anestro a fim de incrementar a indução, detecção e precisão do estro (Day et al., 2000), mostrando também que o desenvolvimento folicular após uma injeção de BE 48h após a remoção do implante resultou em um estro sincronizado em 98% das vacas tratadas, e uma taxa de concepção 70% pela primeira IA após a detecção do cio. O mesmo procedimento foi realizado por Biehl e Pires (2009) (dados não publicados), onde as fêmeas zebuínas receberam 1 mg de BE após 48 horas da retirada do dispositivo de progesterona, tiveram estro sincronizado de 92 %, porém a taxa de concepção não ultrapassou 35 % na primeira IA após a detecção do estro. O GnRH provoca a liberação de LH pela hipófise anterior que atua diretamente no folículo dominante causando ovulação (Pursley et al., 1995); Seguin et al.,(1976), testaram 5 doses de GnRH (25, 50, 100, 150, 250µg) em vacas leiteiras com cisto folicular e observaram que a concentração de LH aumentava de forma proporcional a dose administrada. A administração de GnRH ou estradiol pode induzir um pico de LH, mas a ovulação seguida da formação de um corpo lúteo com vida normal pode não ocorrer a menos que este pico de LH tenha sido precedido por uma fase lútea normal ou por algum tratamento com progestágeno durante um período mínimo de 7 dias. Efeitos na sincronização da ovulação foram relatados por Vasconcelos et al., (1994), com a aplicação de GnRH 30 horas após a retirada do implante do Syncro-Mate B e posteriormente a IA era feita 24 horas após a aplicação do mesmo GnRH. A extensão do anestro pós-parto em vacas Brahman amamentando como citado por Henao et al., (2000), pode ser explicada pela baixa secreção de LH, ou seja, nestes animais ha uma redução na freqüência dos pulsos de secreção de LH evitando a maturação e ovulação do folículo dominante. Resultados semelhantes também foram encontrados por Ruiz-Cortés et al. (1999); isso mostra uma vantagem em se usar hormônios para tornar mais preciso o pico de LH, e conseqüentemente uma melhor sincronia da ovulação, onde fêmeas Bos taurus indicus apresentam uma maior sensibilidade a gonadotrofinas exógenas (Cavalieri et al., 1997). É possível, portanto, não só sincronizar o estro, mas também a ovulação pelo uso de GnRH, benzoato de estradiol, ou eCG e realizar a IA em tempo fixo (Madureira, 2000). Quando o “feedback” negativo da progesterona é removido seja espontaneamente ou pela indução da luteólise, aumenta a secreção pulsátil

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de LH e a esteroidogenese pelo folículo. As vacas com um proestro longo tiveram um aumento precoce de estradiol (logo após a administração de PGF), e uma concentração maior de estradiol no momento da aplicação do GnRH, quando comparado com as vacas que tiveram um proestro curto, embora o diâmetro do folículo ovulatório não diferiu entre os tratamentos (BRIDGES et al., 2004). Neste mesmo estudo, as vacas com mais do que 10 pg/ml de estradiol circulante no momento da aplicação do GnRH tiveram uma maior taxa de concepção do que as com menos de 10 pg/ml de estradiol. Resultados semelhantes foram encontrados por (Perry et al., 2003). Para aumentar a produção de estradiol pelo folículo ovulatório, a regressão induzida do CL logo após a emergência da onda folicular pode ser mais benéfica do que os típicos programas de sincronização. Os dados de Valdez et al., (2005) suportam esta afirmação indicando que no dia 4 após a emergência, os folículos dominantes aumentam o estradiol intrafolicular e a capacidade enzimática para produzir estradiol quando comparado aos folículos dominantes mais velhos (dia 6 a 8). Conseqüentemente, removendo o “feedback” negativo do folículo dominante mais cedo na onda folicular, pode resultar no aumento da secreção de estradiol pelos folículos menores mas esteroidogenicamente mais ativos. Garantir uma adequada concentração pré-ovulatória de estradiol, pode ser tão critico quanto diminuir a secreção pré-ovulatória do estradiol pelo folículo ovulatório para induzir a ovulação, que pode alterar a morfologia do endométrio uterino e reduzir a habilidade do útero para secretar ‘histotroph”, e mudar a resposta de outros sinais endócrinos. Adicionalmente, o estradiol pré-ovulatório serve para estabelecer receptores para progesterona no útero, o qual é a chave para os processos fisiológicos para permitir uma apropriado secreção pelas glândulas endometriais para garantir a sobrevivência do embrião em resposta ao aumento da concentração de progesterona luteal. Quando a progesterona diminui no início da fase de crescimento do folículo ovulatório, ocorre rápido aumento na secreção de LH pulsátil e aumenta a probabilidade de concepção devido ao aumento da estimulação da esteroidogênese ou outras ações sobre o folículo pré-ovulatório e/ou útero. Existem outras evidências para suportar a teoria de que a regressão precoce do CL irá aumentar a fertilidade. Tem-se demonstrado que no dia 8, o programa Benzoato de estradiol + CIDR utilizado em vacas de corte após o parto, mais a aplicação de prostaglandina no 4º dia do CIDR aumenta a fertilidade de receptoras utilizadas em programas de transferência de embriões, quando comparado com vacas que recebem prostaglandina no dia 8 (MORENO et al., 2002). O princípio deste estudo foi que a luteólise precoce pode criar um baixo teor de progesterona (a única progestrona presente é a do CIDR), assim como um alto teor de LH e com isso aumentar o desenvolvimento

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folicular. Da mesma maneira, Tribulo et al., (2002) tratou vacas de corte com 400 UI de eCG no 5º dia de um programa de 8 dias CIDR + Benzoato de estradiol, para aumentar exogenamente a estimulação gonadotrófica do folículo ovulatório. A taxa de prenhez destas vacas quando usadas receptoras em programas de transferência de embriões foi aumentada em relação as vacas que não receberam eCG. A aplicação de eCG na remoção do CIDR também tem mostrado melhora na taxa de prenhez assim como aumento na secreção de progesterona pelo CL desenvolvido (Baruselli et al., 2004). Estes resultados evidenciam que o aumento da gonadotrofina suporta o folículo ovulatório para aumentar a fertilidade. A preocupação e o desafio em reduzir o intervalo do GnRH a aplicação de prostaglandina em qualquer protocolo de sincronização de cio é o impacto destas mudanças sobre a habilidade da prostaglandina em induzir luteólise do CL acessório formado em resposta ao GnRH. Tem-se observado que o CL desenvolvido (dia 1-5) é resistente a aplicação de prostaglandina para induzir a luteólise (Tanabe and Hann, 1984; Watts and Fuquay, 1985). Recentes pesquisas desenvolvidas na Ohio State University tem demonstrado que o CL acessório é resistente a aplicação de prostaglandina para induzir a luteólise no dia 4 após a aplicação de GnRH (Sandeen, 2003). Duas injeções de prostaglandina dadas 12 horas de intervalo têm mostrado ser efetivas em induzir a regressão do CL com 4 dias de idade (Macmillan et al., 1996). Este resultado tem sido confirmado por pesquisadores da Ohio State University quando a prostaglandina é aplicada com um CL do dia 5 do ciclo estral em intervalos de 2 à 12 horas.

INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO (IATF) Por muitos anos vem se discutindo e estudando a melhor maneira de se empregar a IA em grandes rebanhos de corte, porém com o advento da IATF a utilização desta biotecnologia vem se difundido. O sucesso da IA convencional com a detecção visual do estro, depende de vários fatores como: conhecer realmente os sinais do animal em cio, tempo gasto para a observação, horário da IA e especialização e dedicação da mão de obra destinada ao serviço. O tempo gasto para a observação do estro pode ser citado como um fator de extrema importância, portando pode-se concluir que quanto mais vezes e por mais tempo se observar estro maior seria a taxa de detecção de estro. Porém, maior seria a ocupação da mão de obra dispensada por um longo período. Em fêmeas zebuínas, a curta duração do estro (cerca de 10 horas) associada a alta incidência de cios noturnos (30 a 50%) dificultam a detecção do cio e prejudicam a implantação a implantação de programas convencionais de IA (Barros et al., 2000).

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Nos últimos tempos com o avanço tecnológico da pecuária tem se empregado a utilização da IATF. O processo se resume em determinar o dia que um lote de vacas serão inseminadas. Com este avanço se reduz a estação de monta em um menor número de dias, não se perde com a falha na detecção de cio, pois não há, e parte do trabalho é reduzido à alguns dias, diminuindo também o número de touros utilizados na estação de monta. Atualmente estão sendo encontrados bons resultados quanto a taxa de concepção dos protocolos de sincronização da ovulação associados com a IATF. Sá filho et al., (2009), realizando uma análise retrospectiva de dados oriundos de propriedades comerciais do Brasil, que utilizavam a sincronização do estro com a associação do BE e da progesterona, descreveu que a taxa de prenhez média foi de 49,6% (31.786/64.033 vacas). Sendo que este resultado foi influenciado basicamente por quatro variáveis: fazenda (26-28%), categoria animal (novilhas 39,6%; vacas primíparas 45,2%; vacas multíparas 51,8%), touro (7,2-77,3%) e escore de condição corporal (43-52,7%). O emprego da IA é a base para a aplicação de um correto melhoramento genético da propriedade, pois aumentarão a eficiência reprodutiva, melhores índices zootécnicos, uma vez dominados, resultarão no auxilio à maior difusão do uso IA e melhor resultado econômico.

CONSIDERAÇÕES FINAIS Na última década diversos pesquisadores se dedicaram a estudar o comportamento do desenvolvimento folicular, bem como particularidades inerentes as diferentes raças. Com esses estudos foram desenvolvidos procedimentos para administração dos hormônios com o intuito de sincronizar as ondas de crescimento folicular e posteriormente a ovulação. Atualmente estudos estão sendo realizados com o intuito de reduzir a quantidade de dias em que a fêmea fica exposta ao dispositivo de progesterona, reutilização de dispositivos, quantificar a dose inicial de estradiol para acelerar o inicio de uma nova onda, reduzir manejos para sincronização, entre outros. Ou seja pequenos ajustes que podem reduzir o custo do protocolo, bem como aumentar os índices já existentes. Trabalhos para a aplicação da IATF podem ser desenvolvidos, com utilização de produtos comerciais já existentes e novos produtos. Porém, ainda existem dúvidas sobre qual metodologia ou controle hormonal seria mais adequado para cada subespécie, categoria e escore de condição corporal. Pesquisas as quais possam contribuir para se aumentar e aperfeiçoar a técnica continuam em andamento, possibilitando então uma ampla e segura utilização desta tecnologia.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASADAMS, G.P.; JAISWAL, R.; SINGH, J.; MALHI, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. v.69, 72-80, 2008.

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