NOVOS MÉTODOS EMPREGADOS EM ANÁLISE MICROBIOLÓGICA

Investigar presença / ausência de micro-organismos

Quantificar os micro-organismos de interesse

Identificar diferentes espécies microbianas presentes

Analise microbiológica de alimentos:

• Métodos tradicionais ou convencionais

• Métodos rápidos ou alternativos ou novos métodos

Os Métodos Microbiológicos podem ser divididos em:

Métodos tradicionais

• Desenvolvidos há muitos anos e desde então vem sendo empregados

como métodos oficiais na maioria dos laboratórios.

• Descritos em publicações de referência, internacionalmente aceitas:

Alguns exemplos:

- Bacteriological Analytical Manual (BAM) (FDA/AOAC)

- Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (APHA)

- International Organization for Standardization (ISO)

- International Dairy Federation (IDF)

- Food and Drug Administration (FDA).

Métodos tradicionais

• São laboriosos e consomem muito tempo operacional

Dependendo do no. de análises:

- perigo de contaminação cruzada;

- muitas etapas a serem validadas;

- limitada área física e pessoal.

• A maioria dos testes são baseados na contagem de células viáveis

Injúria, alterações - processamento

Métodos tradicionais

1. ANÁLISE QUANTITATIVA -

MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS

A) Contagem de colônias de micro-

organismos em placas de petri

-Em profundidade " pour-plate"

-Na superfície do meio

Técnica de contagem por membrana filtrante

Técnica da determinação do

número mais provável (NMP)

Métodos tradicionais

2. ANÁLISE QUALITATIVA

-Técnica de presença/ausência

Problemas com os métodos tradicionais:

Sensibilidade insuficiente – capacidade de detectar o que o método propõe

Especificidade: nem sempre ocorre (podem haver falsos negativos);

Repetitividade: nem sempre se o teste for repetido por um mesmo operador inúmeras vezes se obtém o mesmo resultado;

Reprodutibilidade: capacidade de gerar resultados estatisticamente iguais (nem sempre ocorre).

Métodos rápidos ou novos métodos

Apresentam as seguintes vantagens:

Redução do tempo de análise;

Menor tempo de retenção do produto na indústria;

Diminuição de custos;

Simplificação das tarefas envolvidos na análise;

Facilidade de leitura dos resultados;

Especificidade;

Maior sensibilidade de alguns métodos quando comparados com os métodos convencionais.

Métodos rápidos ou novos métodos

Importante:

1) Ter um microbiologista treinado para interpretação;

2) Ser aprovado pelos órgãos oficiais.

Métodos rápidos ou novos métodos

3 grupos:

1) Automação laboratorial;

2) Métodos para avaliar a qualidade;

3) Métodos para avaliar inocuidade.

1) AUTOMAÇÃO LABORATORIAL

Utilizado nas etapas da analise:

a . Pesagem- Por ex, através de um

aparelho chamado DILUTER - ajustado que

ao colocar a amostra, pesa a alíquota

desejada, e já dilui acrescentando a água

necessária para a diluição!

1) AUTOMAÇÃO LABORATORIAL

b . Homogeneização- Uso do stomacher homogeneizador de pistão → não mais

os liquidificadores que “cortam” as células microbianas injuriando-as na análise!!!

c. Semeadura – Utilização de um aparelho

chamado “spiral plater” → amostra é semeada na

placa, através de uma cânula, que verte o inóculo,

e a placa fica numa superfície que gira.

2. Métodos para avaliação da qualidade

Métodos de contagem: direta e

indireta

MÉTODOS DE CONTAGEM DIRETA

Técnica de membrana filtrante: Utilizada para líquidos onde grande quantidade é necessitada para amostra: ex.: água e refrigerantes.

Aprovado pela AOAC para enumeração de bactérias totais, coliformes totais, Escherichi coli e Salmonella.

MÉTODOS DE CONTAGEM DIRETA

Técnica fluorogênica: A enzima β-glicuronidase produzida pela maioria das cepas de Escherichia coli transforma o MUG (que é adicionado ao meio de cultura) em umbeliferona (que é fluorescente quando observado sob luz ultravioleta de onda longa).

MÉTODOS DE CONTAGEM DIRETA

Sistemas prontos para uso:Placas de Petrifilm-3M, Placas de Simplate e diversos ágares adicionados de substratos cromogênicos ou fluorogênicos.

PetrifilmTM - 3M

• São filmes de papel quadriculado revestido com polietileno, recobertos de nutrientes desidratados e géis hidrossolúveis a frio com corante indicador (cloreto de trifeniltetrazolio – TTC) - exceção fungos. Cada placa tem um filme superior de polipropileno. Aprovado pela AOAC!

Petrifilme Análise de Escherichia coli

6

32

4 5

1

Petrifilme Análise de Enterobacteriaceae

Petrifilme Análise de bolores e leveduras

Petrifilme Análise de Staphylococcus aureus

Placas de Simplate - BIOCONTROL

Placas de Simplate - BIOCONTROL

Placas de Simplate - BIOCONTROL

MÉTODOS DE CONTAGEM INDIRETA

• Medição da atividade metabólica dos micro-organismos nos alimentos;

• construção de curvas-padrão: correlação entre os parâmetros medidos e o número de células viáveis;

• Princípio básico: quanto maior o número de micro-organismos presentes mais intenso é o fenômeno medido.

MÉTODOS DE CONTAGEM INDIRETA

Bioluminescência

• Emissão de luz por organismos vivos.

• Princípio: quantidade de ATP detectada a partir de células metabolicamente ativas (células microbianas; sangue, carne,...).

• ATP reage com a enzima luciferase, na presença de luciferina e íons Mg++, formando um complexo que, em contato com o oxigênio, sofre uma descarboxilação, com emissão simultânea de luz.

http://www2.uol.com.br/sciam/reportagens/o_universo_luminoso_dos_fungos_bioluminescentes.html

Bioluminescência

Mg+2

E + LH2 + ATP E - LH2 - AMP +

PP

E - LH2 - AMP + O2 oxiluciferina + CO2 + AMP +

luz

Princípio do método: emissão de bioluminiscência por ATP

A luz emitida pode ser medida em luminômetro, um fluorímetro ou em um espectrofotômetro de cintilação líquida.

Bioluminescência

Aplicação comum: Monitoramento de Higienização em plantas processadoras de alimentos.

Quanto mais sujo, + luz!

MÉTODOS DE CONTAGEM INDIRETA

Impedância/Condutância

Principio: Micro-organismos alteram a corrente elétrica de um meio de cultura devido atividades metabólicas.

Na multiplicação, moléculas grandes (proteínas, lípideos) se transformas em moléculas menores (aminoácidos, ac. graxos), que são quimicamente ativas. Resultado: acumulo destes compostos leva alterações mensuráveis na condutância e impedância elétrica do meio .

Curva-padrão: Determina micro-organismos presentes

3. Métodos para avaliar a inocuidade

BIOQUIMICOS

IMUNOLOGICOS

MOLECULARES

BIOQUIMICOS

• Baseados na avaliação da capacidade dos microrganismos de utilizarem determinados substratos ou de produzirem determinados metabólitos

• Testes normalmente executados em “kits”.

• Ex: Galerias API_ Bio-Mérieux

• BBLRapid test- Salmonella- OXOID

IMUNOLOGICOS

• Imunoenzimáticos;

• Imunocaptura;

• Imunoimobilização;

• Coaglutinação.

Grande sensibilidade e elevada especificidade.

Baseados em reações específicas entre antígenos e anticorpos.

IMUNOLOGICOS → Imunoenzimáticos

A reação é baseada na ligação do antígeno com o anticorpo específico, no qual um desses reagentes é marcado com uma enzima, normalmente cromogênica

A cor formada pode ser observada a olho nu ou em espectrofotômetro.

Tipo mais empregado: sandwich

O patógeno PROCURADO é capturado da amostra por anticorpos adsorvidos à superfície de uma matriz sólida (esferas de poliestireno, placas de microtitulação, etc)

Ex.: VIDAS (Bio Merieux- automatizado) → Salmonella, Listeria, E. coli e E. aureus Unique (Tecra) → Salmonella e Listeria

IMUNOLOGICOS → Imunocaptura

• Anticorpos ficam ligados a partículas metálicas

• Após a ligação com o antígeno, as partículas metálicas são atraídas por um imã.

• Após a retirada do imã, obtém-se um produto concentrado que pode, então, ser submetido aos testes de escolha para pesquisa do micro-organismo de interesse.

IMUNOLOGICOS → Imunoimobilização

Princípio: Bactérias móveis cultivadas em meios semi-sólidos tem sua mobilidade bloqueada pela adição de anti-corpos flagelares específicos.

Forma uma banda de precipitação visível na interface ANTI-CORPO/BACTÉRIA.

Aplicável a qualquer micro-organismo flagelado (móvel).

Ex. Teste 1-2 da Bio-Control p/ Salmonella: Duas câmaras de plástico interligadas em L . Na câmara horizontal fica o caldo de enriquecimento seletivo p/ Salmonella e na vertical o meio semi-solido onde se coloca o antisoro flagelar polivalente.

IMUNOLOGICOS → Coaglutinação

Conhecido como aglutinação de látex(passivareversa)• Uso: toxinas microbianas• Aglutinação de partículas de látexsensibilizadas com anti-corpos anti-toxinas.• Ex.: RPLA kits_ OXOID p/ pesquisa deenterotoxinas estafilocócicas.

MOLECULARES

- Segurança e rapidez nos resultados.

- Disponível para patógenos e bioindicadores

MOLECULARES

Sondas genéticas

• material genético do micro-organismo é liberado e separado em duas

fitas simples;

• adicionam-se sondas, que são fragmentos de DNA ou RNA específicos

para o patógeno alvo, marcadas com enzimas cromogênicas;

• quando há hibridização com a sonda, há desenvolvimento de cor e,

portanto, a presença do micro-organismo.

MOLECULARES

Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)

O que é PCR?

Reação em Cadeia da Polimerase

Desenvolvido em 1983 por Kary Mullis.

Prêmio Nobel em Química – 1993;

AMPLIFICAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO DE MICRORGANISMOS

• Extrair o material genético da célula (DNA ou RNA) sem danificá-lo.

Adiciona:

1. dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com três fosfato;

2. primers também chamados de oligonucleotídeos;

3. enzima DNA polimerase em solução tampão;

• Toda esta mistura é colocada no termociclador - faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).

Metodologia

MOLECULARES

Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)

PCR tradicional

- Dependente da seleção e qualidade do “primer”;

- Necessidade de otimização das reações;

- Muitas e delicadas etapas;

- Mão de obra especializada; ambiente adequado;

- Perigo de contaminação.

MOLECULARES

Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)

BAX – PCR automatizado

- “Primers” já testados e validados;

- Aprovações e validações.

FACILITA A ROTINA E DIMINUI INTERFERÊNCIAS !

MOLECULARES

Ribotipagem

Feita em um equipamento sofisticado, totalmente automatizado, no qual bactérias podem ser identificadas rapidamente (menos de 8 horas) em nível de espécie.

INDÚSTRIA ALIMENTOS NECESSITA MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS QUE SEJAM:

• Precisos

• Rápidos

• Fáceis de utilizar

• Flexíveis

• Confiáveis

• Econômicos

• Acompanhamento e

suporte técnicos

contínuos

devido à necessidade de rapidez de resultados, hoje, já são encontrados no

mercado varias técnicas que possibilitam resultados muito rápidos, essas

técnicas são conhecidas por “métodos rápidos de análise microbiológica”, os

mais usados na área da pesquisa são PCR, o ELISA, placas petrifilm e placas

simplate.

Os métodos rápidos possuem muitas vantagens, como boa exatidão, além

de minimizar os custos de uma empresa, sendo de rápida e fácil leitura, porém,

possuem algumas desvantagens, como o elevados custo de algumas técnicas e

mesmo aqueles já aprovados pela AOAC, os resultados positivos ainda não são

considerados confirmatórios.

CONSIDERÃÇÕES FINAIS

Métodos rápidos oficiais AOAC para análise microbiológica de alimentos e sistemas para monitoramento de higienização.

Métodos Simplate™ - para contagem total de bactérias em 24 horas; contagem de bolores e leveduras em 48 a 72 horas e contagem de coliformes totais e E.coli em 24 horas

VIP, 1-2 Test® e Assurance EIA - métodos imunoezimáticos AOAC OMA para análise de patógenos como Salmonella, Listeria, Campylobacter e E.coli O157:H7

GDS - Sistema de detecção genética de última geração - PCR - com aprovação AOAC para análise de patógenos com Salmonella, Listeria spp, Listeria monocytogenes, E.coli 0157:H7, Enterobacter sakazakii

Lightning MVP™ - Sistema para monitorar e avaliar a efetividade dos procedimentos de limpeza através da bioluminescência por ATP em conjunto com medidas de controle de qualidade pH, temperatura, concentração em ppm e condutividade. Possibilita a calibração de todos os parâmetros

DUVIDAS?