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RONALDO SCHOLZE WEBSTER
O PAPEL DO PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO
NA LESÃO DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO DO
MÚSCULO GRÁCIL DE RATOS
Tese apresentada à Universidade Federal deSão Paulo – Escola Paulista de Medicina,para a obtenção do Título de Mestre emCiências.
SÃO PAULO
2005
RONALDO SCHOLZE WEBSTER
O PAPEL DO PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO
NA LESÃO DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO DO
MÚSCULO GRÁCIL DE RATOS
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para a obtenção do Título de Mestre em Ciências.
ORIENTADORA: PROF.a DR.a EDNA FRASSON DE SOUZA MONTERO
CO-ORIENTADOR: PROF. DR. DJALMA JOSÉ FAGUNDES
SÃO PAULO
2005
Webster, Ronaldo Scholze O papel do precondicionamento isquêmico na lesão de isquemia e reperfusão do músculo grácil de ratos/ Ronaldo Scholze Webster – São Paulo, 2005. xv, 62f. Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação. The role of ischemic preconditioning at ischemia and reperfusion injury of gracilis muscle in rats. 1. Isquemia. 2. Reperfusão. 3. Pré-condicionamento isquêmico. 3. Músculos. 4. Ratos. 5. Transplante.
1. INTRODUÇÃO
O músculo grácil, com o desenvolvimento da microcirurgia vascular, tornou-se
um importante órgão a ser utilizado na área da cirurgia reparadora. As suas características
de conservação da função muscular no sítio receptor do transplante microcirúrgico fizeram
com que fosse utilizado em procedimentos corretivos com necessidade de movimentação,
tais como a correção da paralisia facial1,2.
As transferências de retalhos microcirúrgicos acarretam isquemia muscular muitas
vezes prolongada, que pode se traduzir em complicações significativas em relação à
viabilidade tecidual3. Algumas estratégias de proteção têm sido utilizadas para a
preservação do retalho, dentre as quais destaca-se o precondicionamento isquêmico (PCI).
O precondicionamento isquêmico é uma alternativa cirúrgica que consiste no
emprego de ciclos curtos de isquemia sucedidos por reperfusão, prévios a uma isquemia
sustentada4,5.
Os primeiros estudos realizados com PCI envolveram o miocárdio. Em 1984, Neely
e Grotyohann6, utilizando miocárdio de coelhos, mostraram que um período curto de
isquemia, prévio à isquemia cardíaca sustentada, produzia um efeito protetor contra a lesão
cardíaca de isquemia/reperfusão (I/R). Posteriormente, Murry et al.(1990)7, utilizando o
músculo miocárdico canino, conseguiram documentar o efeito protetor do PCI por meio de
uma série de experimentos, quando foi definitivamente difundido o termo
precondicionamento isquêmico.
A partir desses experimentos, o PCI já foi empregado em estudos relacionados a
diferentes órgãos e tecidos, inclusive no músculo esquelético8-17. Observou-se na
musculatura esquelética que, em relação ao miocárdio, eram necessários mais ciclos de
isquemia-reperfusão para atingir um limiar de proteção15.
O mecanismo de manutenção da respiração celular, a diminuição da produção de
espécies reativas e a preservação da integridade e do funcionamento das membranas
celulares, por meio de diversos mediadores, estão sendo estudados como prováveis
mecanismos de ação do PCI14-27.
2
A manutenção dos níveis de ATP e fosfato de creatina, em conjunto com a redução
da taxa de demanda energética pela célula tem-se mostrado como uma hipótese central no
mecanismo de ação do PCI no que se refere à respiração celular 5,7,15,18,28,29. Parece haver,
durante os períodos de isquemia do PCI, uma diminuição dos depósitos de glicogênio,
sendo a glicólise diminuída no período isquêmico sustentado27. Em conjunto, pelo efeito de
lavagem de catabólitos dos períodos de reperfusão do PCI, há um menor acúmulo de lactato
e íons Hidrogênio (H+), o que diminui a velocidade de progressão da acidose isquêmica7,15.
Os efeitos citados anteriormente puderam ser mimetizados com a administração de certas
substâncias tais como: a adenosina29, conhecido substrato da célula em isquemia, além de
um potente vasodilatador, e o óxido nítrico30,31, liberado na fase isquêmica, denotando a
possibilidade da participação destas substâncias no processo de PCI.
Os fenômenos citados parecem ocorrer em duas fases, uma precoce, que dura ao
redor de 3h após a isquemia sustentada, e uma tardia, a partir de 12h de isquemia32.
Identificam-se, nestas fases, efeitos do ponto de vista funcional, vascular e morfológico que
podem ser observados pela manutenção de força e contratilidade muscular, do diâmetro das
arteríolas e atenuação do fenômeno de não-reperfusão vascular 14,27,33,34,35,36,37.
Apesar de terem sido realizados estudos prévios para a avaliação do PCI em
músculos esqueléticos, o músculo grácil de ratos apenas recentemente começou a ser
avaliado quanto à sua proteção pelo PCI31-34. Zhang et al.(2004) 31 estudaram o efeito do
PCI na fase tardia de reperfusão vascular do músculo grácil de ratos demonstrando efeitos
positivos na preservação tecidual.
Uma vez que o PCI tem mostrado um efeito protetor funcional e morfológico em
diferentes tecidos e órgãos, o músculo grácil pode ter um comportamento diferente de
outros grupamentos musculares previamente analisados frente ao PCI e existe carência de
estudos quanto à fase precoce do processo de isquemia e reperfusão, foi desenvolvida
pesquisa visando elucidar as alterações celulares da fase precoce da isquemia e reperfusão
do músculo grácil de ratos submetidos ao PCI.
3
2. OBJETIVOS
Geral:
Estudar o papel do precondicionamento isquêmico na fase precoce da lesão de isquemia e
reperfusão do músculo grácil de ratos.
Específico:
Avaliar as alterações morfológicas do músculo grácil de ratos à microscopia óptica e
eletrônica de transmissão quando submetidos ao processo de isquemia e reperfusão
vascular e precondicionamento isquêmico, na fase precoce de reperfusão.
4
3. MÉTODOS
O presente trabalho recebeu aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital
São Paulo - UNIFESP-EPM sob o n º 1095/03, ratificada pelo Comitê de Ética em Pesquisa
em Seres Humanos e Animais da Universidade Luterana do Brasil-Rio Grande do Sul-
ULBRA-RS sob nº 2003-006 A.
AMOSTRA
Foram utilizados trinta Ratos Wistar, machos, com peso variando entre 250 e 350 g,
entre 3 e 4 meses de idade, criados em biotério convencional-controlado da ULBRA-RS,
mantidos em condições controladas de luz (ciclo claro das 7h às 19h), temperatura (22-
24ºC) e recebendo ração padronizada ad libitum.
Os animais foram distribuídos randomicamente em 3 grupos de acordo com o
procedimento realizado: grupo controle (G-C: n=6), grupo isquemia-reperfusão (G-I/R:
n=12) e grupo precondicionamento isquêmico (G-PCI: n=12). Os grupos I/R e PCI foram
subdivididos levando em conta o tempo de isquemia (2h e 4h), originando G-I 2h/R (n=6) ,
G-I 4h/R (n=6) , G-PCI 2h (n=6) e G-PCI 4h, conforme a Figura 1:
G-PCI-4h
(n=6)
G-PCI-2h
(n=6)
G-I 4h/R
(n=6)
G-I 2h/R
(n=6)
G-PCI (n=12)
G-I/R (n=12)
G-C (n=6)
RATOS (N=30)
Figura 1 - Esquema de distribuição dos animais conforme os grupos de experimentação.
5
PROCEDIMENTOS
Pré-operatório
Os animais foram mantidos em jejum diurno para sólidos por um período de 3
horas antes de se iniciarem os procedimentos operatórios e tiveram seu peso aferido antes
de entrarem para a sala de procedimentos, para que se efetuasse o cálculo da dose dos
fármacos utilizados como pré-anestésico e anestésico.
Procedimentos anestésicos
Os animais foram trazidos para a sala de operações em caixa de plástico própria
para transporte e submetidos à pré-anestesia em câmara saturada com éter dietílico, com a
administração subseqüente de atropina 0,044mg.Kg-1, pela via intraperitoneal (IP),
cumprindo-se um tempo de latência de 10min até o emprego dos fármacos anestésicos.
A anestesia da administrada foi a combinação entre o cloridrato de cetamina1 50mg.Kg-1 e
cloridrato de xilazina2 10mg.Kg-1 IP38,39. O plano anestésico foi avaliado por meio dos
seguintes parâmetros no trans-operatório: freqüência respiratória, freqüência cardíaca,
reflexo corneal e reflexo de pinçamento caudal. A complementação anestésica foi realizada
com metade da dose inicial de indução em um tempo médio de 1h30 após a indução
anestésica, sendo auxiliada pelos parâmetros trans-operatórios de plano anestésico.
Ato operatório
Os animais foram submetidos à epilação em torno membro posterior esquerdo no
local da articulação do quadril por tração manual de pêlos seguida pela anti-sepsia da pele
com solução de polivinilpirrolidona3 a 1%.
1 Ketalar® 2 Anasedan® 3 PVPI tópico®
6
Utilizou-se, para a realização do ato operatório, Lupa binocular4 com capacidade de
magnificação de 3,5x.
A pele, tela subcutânea e musculatura da coxa, ao redor da articulação do quadril,
foram incisados por planos, circunferencialmente, com bisturi de lâmina nº 15,
preservando-se o osso femoral e o feixe neurovascular femoral. Retirou-se o periósteo do
fêmur, abaixo da articulação do quadril, por uma extensão de 0,5cm. A hemostasia foi
realizada por compressão.
A dissecção tecidual foi realizada na proximidade do feixe neurovascular com o
auxílio de pinças e tesoura microcirúrgicas sendo então, por meio de tração delicada da
bainha do feixe, individualizados os componentes, arterial, venoso e nervoso.
O componente nervoso foi seccionado com o intuito de simular a transferência
microcirúrgica.
No G-C, foi realizada, após 30min subseqüentes ao isolamento vascular, a coleta de
fragmento do músculo grácil para análise à microscopia óptica e eletrônica de transmissão.
No G-I/R, após 30min do isolamento vascular, procedeu-se com o intervalo
isquêmico proposto conforme os subgrupos, 2h ou 4h, seguido por 1h de reperfusão
vascular.
O microclampe vascular5 utilizado na interrupção do fluxo sangüíneo possuía
pressão graduada para vasos entre 0,5 e 1,5mm de diâmetro externo.
No G-PCI, aplicaram-se 3 ciclos de 5min de isquemia, intercalados com o mesmo
período de reperfusão arterial antes do período de isquemia, 2h ou 4h, e reperfusão
sustentada por 1h (Figuras 2 e 3).
Em seguida foi coletado fragmento do músculo grácil, de dimensão aproximada de
1,5x 1,0x 0,3 cm, dividido em duas partes e acondicionado em frascos fornecidos pelo
laboratório de microscopia eletrônica da ULBRA.
Um dos frascos contendo Formalina a 10% e outro contendo Glutaraldeído a 2%,
para a fixação e posterior análise à microscopia óptica e eletrônica de transmissão,
respectivamente.
4 Heine® 5 ASSI®
7
Após a obtenção do fragmento muscular foi realizada a eutanásia do animal por
meio de injeção endovenosa de anestésico, cloridrato de cetamina 150mg.Kg-1 IV e
cloridrato de xilazina 30mg.Kg-1 IV.
a
1cm2
b
1cm2
Figura 2- Fotografia da pata posterior esquerda do animal apósepilação (a) e após o preparo operatório para o experimento (b). Aseta indica a localização do feixe neurovascular femoral.
8
MÉTODO
1mm
G
a
v
Figura 3 - Fotografia mostrando o modelo de quase-amputação da pataposterior esquerda do animal. Isolamento do feixe vascular. a: artériafemoral ocluída com dilatação vascular proximal ao clampe e ausência defluxo sangüíneo distal. Nota-se a diferença de coloração do membro emrelação ao abdome. v: veia femoral, G: músculo grácil. A seta indica aposição da vascularização do músculo grácil.
Microscopia Óptica (MO)
A análise sob Microscopia Óptica foi realizada no Instituto de Pesquisa e
Diagnóstico, da Santa Casa de Porto Alegre-RS.
Processamento: O material fixado sofreu desidratação em álcool etílico a 70%,
95%, 100%; clareamento com Xilol; impregnação com parafina fundida a 60°C; inclusão
em moldes retangulares; corte por micrótomo6 com 5µm de espessura, lâminas
descartáveis modelo 818 tamanho C e coloração pela Hematoxilina – Eosina (HE). A
análise foi realizada por meio de microscópio óptico7, com aumentos entre 100 e 1000x em
sistema de aquisição de imagens por sistema digital8 e processamento por computação em
6 Leica ultracut ®UCT RM2025 7 Olympus BX40F40 8 Samsung aerospace-ICONOS®- Imaging Systems.
9
equipamento com processador de velocidade 2.4 Gz9, com o programa de diagnóstico por
imagem10.
Foram avaliados os aspectos gerais da reação tecidual à isquemia e reperfusão
vascular, com especial atenção à estrutura fibrilar, à presença de reação inflamatória e
estase vascular, sendo semiquantificados em: 0 (ausência ou presença discreta- até 25%) , 1
(presença moderada- 26 a 50%) e 2 (intensa- acima de 50%), de acordo com a sua
ocorrência.
O padrão de menor intensidade de lesão (0) foi estabelecido nos animais menos
acometidos do G-C e o maior grau de lesão considerado (2) baseou-se nos indivíduos com
as alterações mais intensas, identificados como pertencentes ao G-I 4h/R. O nível
intermediário de acometimento (1) foi adotado quando as características lesionais situavam-
se entre as magnitudes observadas nos grupos descritos.
Obteve-se, desta forma, o percentual de animais, por subgrupo de análise, em
relação ao grau de intensidade das lesões, procurando estabelecer a influência do tempo de
isquemia na intensidade das lesões observadas.
9 Athlon® 10 SDI®- Sistema de diagnóstico por imagem, desenvolvido por Defferari Informática
Ltda.
10
Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
Fixação e Inclusão para obtenção de cortes:
O material fixado foi lavado em tampão fosfato 0,1 molar seguido pelo tetróxido de
ósmio 1% tamponado, para uma pós-fixação.
A desidratação processou-se na série: acetona ou etanol 30%, 50%, 70%, 95% e
100%. Todas as passagens com 10 minutos de duração, com exceção das duas últimas, de
20 minutos a mais.
A pré-embebição dos materiais foi feita em uma mistura de epon 812 com acetona
pura nas seguintes proporções:
a) Uma parte de epon + três partes de acetona por 2 horas;
b) Uma parte de epon + duas partes de acetona por 2 horas;
c) Uma parte de epon + uma parte de acetona por 2 horas;
d) Duas partes de epon + uma parte de acetona por 2 horas;
e) Três partes de epon + uma parte de acetona por 2 horas;
A embebição foi feita com epon 812 puro durante 24 horas. Na inclusão foram
usados moldes de silicone chatos11. A polimerização foi efetuada em estufa 60ºC constantes
por 72 horas. Os cortes semifinos foram feitos no ultramicrótomo12, sendo utilizada navalha
de diamante13, com uma espessura de 800µm e corados com solução aquosa de azul de
toluidina 1% e fucsina (AF). A análise histológica do material foi feita pela microscopia
óptica 14, com aumentos entre 100 e 1000x, para avaliação dos campos a serem utilizados
nos cortes ultrafinos.
11 Embedding molds Sigma® 12 Leica Ultracut UCT® 13 Drukker type histo® - 8mm. 14 Microscópio Carl - Zeiss - Axiolab®
11
Os cortes ultrafinos foram confeccionados com uma espessura de 100nm no mesmo
ultramicrótomo, com uma navalha de diamante15. Para o contraste dos cortes ultrafinos
utilizou-se solução aquosa de acetato de uranila 2% e após citrato de chumbo.
A análise por meio de Microscopia Eletrônica de Transmissão16 foi realizada no
Laboratório de Microscopia Eletrônica da Universidade Luterana do Brasil - ULBRA. Os
parâmetros qualitativos analisados por MET foram: a presença de glicogênio, estrutura
mitocondrial, vascularização e manutenção da arquitetura sarcomérica.
Os parâmetros quantitativos foram obtidos por programa de mensuração digital de
estruturas17. Foram medidas: distância entre as linhas Z (Z-Z), menor diâmetro
mitocondrial (M), as áreas de acúmulo de glicogênio (G), sendo registradas 15 medidas por
estrutura /animal.
15 Drukker type ultra®- 3mm. 16 Modelo EM208S® Philips. 17 Programa Carnoy®, desenvolvido pelo “Lab of Plant Systematics”, K.U. Leven, Flanders, Bélgica.
12
Análise estatística
O estudo estatístico foi feito pelo Departamento de Apoio à Pesquisa (DAP) do
Complexo Santa Casa de Porto Alegre, utilizando o programa de tratamento estatístico
computadorizado SPSS-v.8.0 desenvolvido por SPSS, Inc. Chicago, Illinois 40, versão esta,
utilizada desde a confecção do projeto piloto até a conclusão do trabalho.
Com o intuito de semiquantificação dos resultados na análise à MO quanto à
fragmentação fibrilar, presença de reação inflamatória e de estase vascular, foi aplicado o
teste do Qui-Quadrado. Levou-se em conta que a presença de até 25% de intensidade de
lesão seria considerada como Grau 0 e acima de 25% Grau 1(fusão dos graus 1 e 2 de
lesão dos subgrupos avaliados em relação ao percentual de animais acometidos pelas
diversas intensidades de lesão). Além disso, os grupos I 2h/R e I 4h/R foram agrupados e
denominados G-I/R, sendo os grupos PCI 2h e PCI 4h tratados da mesma forma, gerando
grupo G-PCI.
São apresentados, desta forma, dois tipos de tabelas e gráficos relacionados aos
achados à MO: a representação percentual de animais em cada subgrupo de estudo
acometido pelas diversas intensidades de lesão (0,1 e 2), em um primeiro momento e, a
seguir, a aplicação do teste do Qui-Quadrado, conforme os grupos de estudo I/R e PCI e
graus de lesão 0 e 1 (fusão das intensidades de lesão 1 e 2 em um só grupo para viabilizar a
semiquantificação dos dados).
A análise estatística dos aspectos estudados à MET, que dizem respeito a distância
entre as linhas Z, medida do menor eixo mitocondrial e área de acúmulo de glicogênio foi
realizada pelo teste de Mann-Whitney. O teste foi escolhido em virtude das medidas
observadas não seguirem uma distribuição normal e, de acordo com objetivo estabelecido
pelo estudo proposto, as comparações deveriam ser feitas apenas entre os grupos I/R e PCI
relacionados ao mesmo tempo de isquemia.
Fixou-se em 0,05 o nível de rejeição da hipótese de nulidade.
13
4. RESULTADOS
Verificou-se à microscopia óptica que, em relação ao grupo controle, o G-I 2h/R e
G-I 4h/R, de maneira progressiva e proporcional ao tempo de isquemia, apresentaram
fragmentação fibrilar (Grau 0 de lesão: 67% e 0%, respectivamente) (Figura 4; Tabela 1 e
Gráfico 1). Evidenciou-se o maior índice de reação inflamatória tecidual e de estase
vascular no G-I 4h/R em relação aos demais grupos (Grau 0 de lesão: 0%) (Figura 5
Tabela 2 e Gráfico 2). O precondicionamento isquêmico atenuou as alterações celulares
progressivas caracterizadas pela fragmentação fibrilar (Grau 0 de lesão: 83%) e reação
inflamatória (Grau 0 de lesão: 75%), p= 0,038 e 0,041 respectivamente, (Tabelas 1 e 2;
Gráficos 1 e 2). Não houve benefícios do PCI em relação aos achados vasculares, em
comparação aos G-I/R (Tabela 3; Gráfico 3).
Na avaliação qualitativa das estruturas celulares à MET observou-se
progressivamente, entre o G-I 2h /R e o G-I 4h /R, que houve uma perda da estrutura
sarcomérica e de definição das linhas Z, desestruturação mitocondrial com o
comprometimento da integridade das membranas, somadas à lesão endotelial (Figuras 7 e
8). Os grupos precondicionados aparentemente mostraram atenuação dos aspectos da lesão
IR, quando comparados aos grupos não-precondicionados que foram submetidos ao mesmo
período de isquemia (Figuras 7 e 8).
Quanto aos aspectos quantitativos observados à MET, a distância entre as linhas Z
permaneceu relativamente constante, apesar de apresentar diferença na análise estatística
dos grupos G-I 2h/R (2,0656± 0,3602µm) e G-PCI 4h (1,9849± 0,743µm) em relação ao
Grupo Controle (2,2372± 0,1346µm) (Tabela 4 , Gráfico 4). Houve diferença significante
na medida do menor diâmetro mitocondrial dos grupos submetidos à isquemia e reperfusão
em 2h e 4h (5900± 0,1093 e 5200± 0,1150 µm, respectivamente) e os grupos
precondicionados relacionados (4100± 0,6540µm e 3750± 0,6270µm, respectivamente)
(Tabela 5, Gráfico 5). A área de glicogênio (Figura 9) diminuiu no G-I 2h /R (0,0933 ±
0,0900µm2) em relação ao G-C (0,1341± 0,1200µm2), sendo ainda mais baixa no G-PCI 2h
(0,0733± 0,0700µm2) (Tabela 6 e Gráfico 6). A área de glicogênio muscular não foi
14
passível de ser medida nos grupos submetidos a 4h de isquemia, com e sem
precondicionamento isquêmico.
a b
c
Figura 4- Fotomicrografias mostrando a intensidade de fragmentação fibrilar à microscopia óptica.a: Grau 0 (G-C). b: Grau 1 (G-I 2h/R). c: Grau 2 (G-I 4h/R). F: Fibra muscular, V: Vacúolos. HE,aumento de 400x.
F
F
F
V
15
Tabela 1- Dados referentes à presença de fragmentação fibrilar classificada em grau 0 (ausência ou presença discreta- até 25%), grau 1 (presença moderada- 26 a 50%) e grau 2 (intensa- acima de 50%), no grupo controle (G-C), grupo isquemia /reperfusão (G- I 2h /R e G-I 4h /R) e grupo PCI (G-PCI 2h e G-PCI 4h).
GRUPOS 0 1 2
% GRAU 0 CONTROLE 6 0 0 100
I 2h /R 4 2 0 67
PCI 2h 6 0 0 100
I 4h /R 0 2 4 0
PCI 4h 4 2 0 67
Para a análise estatística os graus de lesão 1 e 2 foram somados compondo o grau 1
e os subgrupos submetidos a 2h e 4h de isquemia foram fusionados em um só grupo,
levando-se em conta o tipo intervenção realizada, resultando nos grupos I/R e PCI.
0
20
40
60
80
100
CONTROLE I /R P
% DE ANIMAIS
Gráfico 1- Distribuição do percentual de animais em função da intenconforme os grupos.Teste do Qui-Quadrado. *: p=0,048.
*
CI
GRAU 0GRAU 1
sidade da fragmentação fibrilar
16
a b
c
F
F
F
v
I
I
Figura 5- Fotomicrografias mostrando a intensidade de reação inflamatória tecidual à MicroscopiaÓptica. a: Grau 0 (G-C) ausência ou presença discreta. b: Grau 1 (G-I 2h/R) presença moderada.c: Grau 2 (G-I 4h/R) presença intensa. F: Fibra muscular, I: Infiltrado inflamatório, V: Vasculiteneutrofílica. HE, aumento de 400x.
17
Tabela 2- Dados referentes à presença de reação inflamatória tecidual classificada em grau 0 (ausência ou presença discreta- até 25%), grau 1 (presença moderada- 26 a 50%) e grau 2 (intensa- acima de 50%), no grupo controle (G-C), grupo isquemia /reperfusão (G-I 2h /R e G-I 4h /R) e grupo PCI (G-PCI 2h e G-PCI 4h). .
GRUPOS 0 1 2
% GRAU 0 CONTROLE 6 0 0 100
I 2h /R 3 1 2 50 PCI 2h 5 1 0 83 I 4h /R 0 2 4 0 PCI 4h 4 2 0 67
Para a análise estatística os graus de lesão 1 e 2 foram somados compondo o grau 1
e os subgrupos submetidos a 2h e 4h de isquemia foram fusionados em um só grupo,
levando-se em conta o tipo intervenção realizada, resultando nos grupos I/R e PCI.
0102030405060708090
100
CONTROLE I /R P
% DE ANIMAIS
Gráfico 2- Distribuição percentual dos animais em função da intenconforme os grupos. Teste de Qui-Quadrado*: p=0,041
*
CI
GRAU 0GRAU 1
sidade da reação inflamatória tecidual
18
c
b a
C
C
H I
Figura 6- Fotomicrografias mostrando a intensidade de estase vascular à Microscopiaóptica. a: Grau 0 (G-C) capilar normal, endotélio preservado. b: Grau 1 (G-I 2h/R) estasemoderada. c: Grau 2 (G-I 4h/R) estase acentuada. C: capilares, I: neutrófilos marginados,Círculo na figura c delimita capilar em detalhe. HE, aumento de 400x.
19
Tabela 3- Dados referentes à presença de estase vascular classificada em grau 0 (ausência ou presença discreta- até 25%), grau 1 (presença moderada- 26 a 50%) e grau 2 (intensa- acima de 50%), no grupo controle (G-C), grupo isquemia /reperfusão (G- I 2h /R e G-I 4h /R) e grupo PCI (G-PCI 2h e G-PCI 4h).
GRUPOS 0 1 2
% GRAU 0 CONTROLE 6 0 0 100
I 2h /R 2 2 2 33
PCI 2h 2 3 1 33
I 4h /R 1 2 3 17
PCI 4h 3 3 0 50
Para a análise estatística os graus de lesão 1 e 2 foram somados compondo o grau 1
e os subgrupos submetidos a 2h e 4h de isquemia foram fusionados em um só grupo,
levando-se em conta o tipo intervenção realizada, resultando nos grupos I/R e PCI.
0
20
40
60
80
100
CONTROLE I /R PCI
GRAU 0GRAU 1
Gráfico 3- Distribuição percentual dos animais em função da intensidade da estase vascular conforme os
grupos. Teste do Qui-Quadrado. Achado não-significante.
% DE ANIMAIS
20
3
Z-Z
Z-Z
Z-Z
Z-Z
a
b c
d
Desaparecimento das linhas Z
e
Z-Z
Z-Z
Figura 7 - Fotoultramicrografia dos subgrupos mostrando aspecto e mensuração da distância entre as
linhas Z (Z-Z). a: G-C, b: G-I 2h/R, c: G-PCI 2h, d: G-I 4h/R, e: G-PCI 4h, M: mitocôndrias intumescidas
com membranas comprometidas. Em a visibiliza-se aspecto usual da arquitetura sarcomérica. O início do
comprometimento sarcomérico com espessamento da linha Z em b e em c uma maior definição das
estruturas sarcoméricas. Em d, salienta-se a desestruturação da linha Z com desaparecimento parcial da
mesma na parte superior, enquanto em e, a sua estrutura permanece íntegra.
M
e
21
Tabela 4- Dimensões das distâncias entre as linhas Z (Z-Z),expressas em µm, observadas à
Microscopia Eletrônica de Transmissão.
ESTRUTURA GRUPO MÍNIMO MÁXIMO
CONTROLE 2,0500 2,5600
I 2h/R 1,3000 2,9700
PCI 2h 1,7800 2,7500
I 4h/R 1,6800 3,0100
Z-Z
PCI 4h 1,7600 2,2000
I 2h/R (p=0,03) e PCI 4h (p<0,05) < CONTROLE. Teste de Mann-Whitney MÍNIMO: valor mínimo observado, MÁXIMO: valor máximo observado, DP: Desvio Padrão.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Z-Z
(µm
)
CONTROLEI 2h/R PCI 2hI 4h/R PCI 4h
Gráfico 4- Média da distância entre as linhas Z (Z-Z), expressa em µm, no grupo controle (G-C), grupo isquemia/reperfusão (G-I/R) e grupo PCI (G-PCI). Os grupos I/R e PCI foram subdivididos levando em conta o tempo de isquemia (2h e 4h).
22
a
M
b c
M M
e d
Figura 8- Fotoultramicrografia do aspecto mitocondrial característico nos subgrupos. a: G-C, b: G-I2h/R, c: G-PCI 2h, d: G-I 4h/R, e: G-PCI4h. M: mitocôndria. Aumento de 8000x (Detalhe).
23
Tabela 5- Dimensões do menor diâmetro mitocondrial, expressas µm, observadas à Microscopia Eletrônica de Transmissão. ESTRUTURA GRUPO MÍNIMO MÁXIMO MÉDIA MEDIANA DP
CONTROLE 0,2200 0,4900 0,3037 0,2900 0,0569
I 2h/R 0,3800 0,9600 0,5817 0,5900 0,1093
PCI2h 0,2100 0,6000 0,4177 0,4100 0,0654
I 4h/R 0,2800 0,7700 0,5213 0,5200 0,1150
MITOCÔNDRIA
PCI 4h 0,3600 0,6300 0,4690 0,4750 0,0627
PCI 2h < I 2h/R( p< 0,05) e PCI 4h < I 4h/R (p <0,05). Teste de Mann-Whitney. MÍNIMO: valor mínimo observado, MÁXIMO: valor máximo observado, DP: Desvio Padrão.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
MIT
OC
ÔN
DR
IA (µ
m)
CONTROLEI 2h/RPCI 2hI 4h/R PCI 4h
Gráfico 5- Médias do menor diâmetro mitocondrial (MITOCÔNDRIA), expressas em µm, no grupo controle (G-C), grupo isquemia /reperfusão (G-I/R) e grupo PCI (G-PCI). Os grupos I/R e PCI foram subdivididos levando em conta o tempo de isquemia (2h e 4h).
24
Z
Z
Z
Z
Z M
M
a
b c
d e
Figura 9- Fotoultramicrografia do aspecto das áreas de mensuração de glicogênio nos subgrupos. a: G-C, b: G-I 2h/R, c: G-PCI 2h, d: G-I 4h/R, e: G-PCI4h. Z: linha Z, M: mitocôndria, Círculos: áreas demensuração. Salienta-se a ausência de areas de mensuração em c e e (G-I 4h/R e G-PCI4h). Aumentode 8000x (Detalhe).
25
Tabela 6- Dimensões das áreas de glicogênio, expressas em µm2, observadas à Microscopia Eletrônica de Transmissão.
ESTRUTURA GRUPO MÍNIMO MÁXIMO MÉDIA MEDIANA DP
CONTROLE 0,0300 0,4000 0,1341 0,1200 0,0799
I 2h/R 0,0300 0,1600 0,0933 0,0900 0,0320
GLICOGÊNIO
PCI 2h 0,0300 0,1500 0,0733 0,0700 0,0227
PCI 2h < I 2h/R < CONTROLE (p< 0,05).Teste de Mann-Whitney,
MÍNIMO: valor mínimo observado, MÁXIMO: valor máximo observado, DP: Desvio Padrão.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
GLI
COG
ÊNIO
(µm
2 )
CONTROLEI 2h/R PCI 2h
Gráfico 6- Média das áreas de acúmulo de glicogênio, expressa em µm2, no grupo controle (G-C), grupo isquemia/reperfusão (G-I/R) e grupo PCI (G-PCI). Os grupos I/R e PCI foram subdivididos levando em conta o tempo de isquemia (2h e 4h).
26
5. DISCUSSÃO
Em humanos, o músculo grácil é localizado na face interna da coxa, fazendo parte
da musculatura adutora da coxa, estendendo-se desde o púbis até a porção medial do joelho,
na parte superior da diáfise da tíbia, possuindo dimensões aproximadas de 6 x 24cm. A sua
inervação se dá pelo nervo obturador (motor) e nervo cutâneo femoral lateral (sensitivo),
sendo sua vascularização derivada dos vasos femorais superficiais e profundos41.
Estudos realizados por Mathes e Nahai (1981)42, por meio de mapeamento da
vascularização muscular, possibilitaram que o uso do músculo grácil fosse definitivamente
consagrado na cirurgia reparadora, sendo classificado como tendo uma vascularização do
tipo II, isto é, possui um pedículo vascular dominante e outros pedículos menores. O
músculo é apropriado para transferência microcirúrgica com técnica microneurovascular,
possibilitando sua utilização numa ampla gama de defeitos anatômicos com intuito
funcional, ou seja, utilizando a capacidade de contração muscular43-46. Existe porém, em
longo prazo, uma inconstância de resultados que permanece não esclarecida, sendo a
satisfação do paciente correlacionável com um bom resultado funcional47.
Geralmente é aceito um índice de sucesso em torno de 90 a 95% em transplantes
microcirúrgicos. Entretanto em torno de 4 a 26% do número geral de casos submetidos às
transferências de tecido por microcirurgia passam por revisão cirúrgica em virtude de
intercorrências vasculares que podem ser relacionadas ao fenômeno de isquemia-
reperfusão48-53. O PCI tem uma atuação muito importante na atenuação deste tipo de lesão e
tem a vantagem de poder ser utilizado no período trans-operatório, sem a necessidade de
outros tempos operatórios, nem ter os efeitos colaterais derivados do uso de fármacos
empregados com fim de aumentar a viabilidade tecidual3,54,55.
O músculo grácil já foi utilizado como objeto de estudo em vários modelos animais
de experimentação relacionados a transferências musculares56-59. Entretanto, a combinação
entre a avaliação deste músculo e o precondicionamento isquêmico apenas recentemente foi
realizada por Zhang et al.(2004)31, analisando o óxido nítrico como possível mediador do
PCI.
Sternbergh et al.(1992)60 verificaram que o tipo de fibra e a localização dos
grupamentos musculares não estão diretamente relacionados ao grau de lesão causado pelo
27
fenômeno de isquemia e reperfusão. Existe então, um interesse especial no mapeamento do
comportamento do músculo grácil frente ao precondicionamento isquêmico na lesão de
isquemia/reperfusão.
O modelo deste estudo, quanto ao isolamento do membro, já foi descrito
anteriormente na literatura61,62 e foi escolhido por produzir uma efetiva eliminação da
circulação colateral do membro posterior do rato através da secção total da pele, tela
subcutânea, musculatura e nervo femoral, somente conservando os vasos femorais.
Acrescentamos, na intenção de privar ainda mais o músculo grácil de circulação colateral, a
realização da retirada do periósteo do fêmur abaixo da articulação do quadril de maneira
circunferencial por uma extensão de 0,5 cm, preservando apenas o feixe vascular intacto. O
feixe neurovascular femoral foi dissecado e foram separados os seus componentes. O nervo
femoral foi seccionado, com o intuito de simular uma transferência microcirúrgica de
tecido, na qual inevitavelmente ocorre secção nervosa.
Vários protocolos experimentais têm analisado como devem ser aplicados os ciclos
de precondicionamento. Os regimes de PCI mais freqüentemente utilizados empregam
tempos de isquemia e reperfusão curtos e seqüenciais entre 5 min e 10 min, variando de 1 a
5 repetições de ciclo I/R prévios à isquemia sustentada63-68. Sefalian et al.(2001)69e Mattei
et al.(2000) 35 conseguiram obter resultados positivos empregando o regime de PCI de 3
ciclos alternados de I/R, por 5 min de duração. Os tempos de isquemia sustentada e
reperfusão após o PCI variam bastante, porém intervalos de 2h a 4h de isquemia, seguidas
por 1h de reperfusão são freqüentemente usados 22,69-71.
As transferências teciduais submetem o músculo à privação vascular sustentada com
subseqüente reperfusão, podendo ocorrer uma lesão significativa72. As lesões podem ser
reversíveis ou irreversíveis dependendo da duração do estímulo.
A lesão celular reversível causada pelo processo isquêmico afeta a respiração
aeróbica celular ao nível das mitocôndrias. À medida que a tensão de oxigênio dentro da
célula cai, há perda da fosforilação oxidativa e diminuição da geração de
adenosinatrifosfato (ATP). As células mudam a rota metabólica para a anaerobiose e ocorre
o estímulo das vias glicolíticas. O metabolismo anaeróbico diminui rapidamente as reservas
de glicogênio. A glicólise anaeróbica resulta no acúmulo de ácido láctico e fosfatos
28
orgânicos derivados da hidrólise de ésteres de fosfato, o que diminui o pH celular. Após
esta ocorrência existe uma ruptura estrutural do aparelho de síntese de proteínas73.
Na persistência do evento isquêmico por tempo suficientemente sustentado
sobrevém uma lesão irreversível. O processo tem representação morfológica, porém a
explicação bioquímica da transição entre a lesão reversível para morte celular ainda
continua indefinida. Existe uma associação entre a tumefação intensa das mitocôndrias,
lesão extensa das membranas plasmáticas e a tumefação dos lisossomos, com a lesão
irreversível73.
Uma vez estabelecida a lesão irreversível da célula, a morte celular manifesta-se
através da necrose ou da apoptose. A necrose é o tipo mais comum de morte celular após
estímulos exógenos, tais como a isquemia; manifesta-se por tumefação intensa ou ruptura
da célula, desnaturação e coagulação das proteínas citoplasmáticas e a degradação das
organelas celulares. Existe um componente inflamatório preponderante. A apoptose ocorre
quando a célula morre mediante ativação de um programa de remoção celular sem a
ativação de processo inflamatório. A eliminação celular é baseada no DNA e na
fragmentação celular. As células condenadas são removidas com um mínimo prejuízo ao
tecido circundante 74,75.
Os achados à microscopia óptica permitiram verificar uma proporcionalidade entre
o tempo de isquemia e a lesão tecidual. Existe importância em ressaltar os achados
inflamatórios observados no G-I 4h/R. Apesar do objetivo do estudo ser a fase precoce da
reperfusão vascular, a presença de reação inflamatória tecidual pode ser indício de uma
evolução para uma lesão irreversível do tipo necrose73.
O fato é corroborado por trabalho realizado por Kruel et al.(1981)76, que verificaram
alterações irreversíveis no músculo de cães submetidos a mais de 2h de isquemia
sustentada. Labbe et al.(1987)77 observaram 30,3% de necrose do músculo grácil de cães
submetidos à isquemia sustentada de 4h, em contraste a 2%, no grupo submetido à 2h de
isquemia.
A preservação morfológica da musculatura do G-PCI 4h, em conjunto com a
ausência de reações inflamatórias, mostrou um maior potencial de recuperação tecidual
neste grupo.
29
Identifica-se no G-I 4h/R uma tendência ao acúmulo de neutrófilos em situação
endovascular e perivascular. Os achados à microscopia eletrônica foram compatíveis com
lesões endoteliais importantes. Não foram identificadas no G-PCI 4h estas ocorrências,
sugerindo a atenuação das lesões vasculares.
Assim como constatado neste estudo, o PCI foi capaz de diminuir a adesividade e
migração de leucócitos em trabalho realizado por Akimitsu et al.(1996)36. A adesão e
migração de leucócitos estão relacionadas ao fenômeno de não-reperfusão vascular e ao
insucesso de transplantes musculares, tendo ligação com as lesões I/R16,36,37.
A distância entre as linhas Z foi medida com intuito de refletir o arranjo
sarcomérico e já foi utilizada anteriormente como parâmetro de análise, tendo mostrado
uma dimensão relativamente constante78,79.
A linha Z mostrou-se mais preservada nos grupos precondicionados, especialmente
nos submetidos a 4h de isquemia, que nos grupos não tratados, sendo uma estrutura que
permaneceu observável e passível de mensuração. Houve escalonamento progressivo das
linhas Z, proporcional ao tempo de isquemia, culminando com o seu apagamento. As
demais formações sarcoméricas que poderiam servir de parâmetro morfométrico não
puderam ser medidas em virtude da desagregação ultraestrutural ocorrida.
Os G-I 2h/R e G-PCI 4h, apesar de se mostrarem com as menores distâncias entre
as linhas Z à análise morfológica geral, assemelhavam-se muito aos grupos que
apresentavam a arquitetura muscular preservada. Sugerimos então, que a presença e a
estruturação da linha Z sejam parâmetros mais fiéis de organização sarcomérica do que a
simples medida entre elas.
Quanto a ultraestrutura mitocondrial, verificamos progressivamente os efeitos
isquêmicos deletérios causados em relação ao tempo de isquemia sustentada, sendo estes
atenuados pelo PCI.
O achado corrobora as teorias em que o PCI preserva os mecanismos de produção
de energia da célula, uma vez que, morfologicamente, foi mostrado menor intumescimento
mitocondrial com conseqüente preservação de membranas, nos grupos precondicionados80-
81.
30
Ratificando os achados anteriores, Khaliulin et al.(2004)82, demonstraram que o PCI
diminuía a oxidação das proteínas mitocondriais e melhorava a função pós-isquêmica
mitocondrial. A integridade mitocondrial é essencial para o processo de produção de
energia da célula. A matriz contém uma variedade de enzimas, incluindo, as que convertem
o piruvato e ácidos graxos em acetil-Coenzima A (acetil-CoA) e as que oxidam acetil CoA
em CO2 através do ciclo do ácido cítrico (Figura 10). O ciclo do ácido cítrico é responsável
pela oxidação de cerca de 2/3 dos compostos de carbono da maioria das células e pela
produção de elétrons de alta energia. Os elétrons são combinados com oxigênio molecular
pela cadeia respiratória através da fosforilação oxidativa, resultando na produção de ATP,
processo que se realiza ao nível da membrana interna da mitocôndria 83.
Quanto à área de glicogênio muscular, houve diminuição significativa entre o grupo
controle e o grupo I 2h/R, sendo ainda menor no grupo PCI 2h. Soma-se a este fato, a
impossibilidade de mensuração do acúmulo de glicogênio nos grupos I 4h/R e PCI 4h. O
fato mostra o consumo de glicogênio pelo músculo submetido à isquemia. Podemos
visibilizar na Figura 10, um esquema simplificado do metabolismo do glicogênio e da
glicose.
Parece que os breves períodos de isquemia do PCI aumentariam o fluxo
glicolítico24. A glicólise produzida, então, teria particular importância na manutenção da
integridade das membranas83. Fralix et al.84 confirmaram este fato através da demonstração
de que a inibição da glicólise no músculo miocárdico abolia o efeito do PCI. Somados a
estes achados, a queda da síntese e dos depósitos de glicogênio foi apontada como uma das
hipóteses de funcionamento do PCI27. Miocárdios submetidos previamente a episódios
anóxicos mostraram diminuição da produção de produtos intermediários da glicólise
(lactato), sendo nestas circunstâncias verificado um benefício funcional6,7.
Foi ainda proposta uma teoria adicional, porém em caráter especulativo, de que o
aumento do fluxo glicolítico previamente ao evento isquêmico sustentado levaria a um
acúmulo compartimentalizado de ATP que protegeria os miócitos contra a lesão I/R27.
Os resultados favoráveis obtidos vêm complementar trabalhos anteriores, como os
de Saito et al.(2003)71, que verificaram a melhoria da capacidade de oxigenação do
músculo gastrocnêmio de ratos in vivo, quando submetidos ao PCI. Temos indícios que,
31
nos grupos submetidos a 4h de isquemia, o processo de morte celular que mais
provavelmente se manifestará será o de necrose, assim como verificado em estudos de
longo prazo de acompanhamento já realizados em outros modelos experimentais76,77. Não
sabemos porém, se os grupos que sofreram isquemia de 2h, ou mesmo de 4h, entrarão em
processo de apoptose celular, o que causará um dano tecidual além do que pôde ser
detectado pela análise morfológica realizada pelo nosso estudo em fase inicial.
Visivelmente, a estrutura sarcomérica foi afetada pelo processo de isquemia e
reperfusão. O PCI , numa fase precoce, mostrou-se bastante interessante na manutenção da
estrutura sarcomérica do músculo grácil. Achados macroscópicos compatíveis com a
proteção do músculo tibial anterior de ratos submetidos ao PCI foram verificados pelo
trabalho de Saita et al.(2002)63. Na fase tardia, após 24h de reperfusão, houve proteção
contra a lesão I/R, claramente identificável pela diminuição da área de necrose muscular.
A lesão mitocondrial causada pelo processo de isquemia e reperfusão vascular foi
identificada de maneira bastante característica. O intumescimento mitocondrial e perda da
integridade de membranas também foram documentados em estudos de maior tempo de
seguimento em outros grupamentos musculares82. Os achados apresentam indícios de que
as alterações que ocorrem num período precoce possam realmente ter uma repercussão em
longo prazo, podendo talvez ser preditivas do comportamento tecidual.
Deve-se levar em conta porém, que os trabalhos relacionando o músculo grácil e
PCI ainda estão em fase inicial em ratos e existem comportamentos diferentes entre os
diversos grupamentos musculares frente ao PCI , devendo-se ter cautela na interpretação
dos resultados obtidos31.
O método de morfometria celular não foi eficiente para a mensuração do glicogênio
residual dos grupos submetidos a 4h de isquemia. A quantidade de glicogênio parece estar
relacionada à gravidade da lesão isquêmica, merecendo atenção em novos estudos. Em
conjunto, verificamos haver um aspecto polimórfico nas estruturas mitocondriais no mesmo
grupo de estudo. Podemos apenas identificar uma forma predominante de lesão, o que não
significa que a totalidade das mitocôndrias está protegida ou desestruturada, sendo estes
achados de difícil quantificação, considerando-se uma limitação da avaliação morfológica
utilizada.
32
O período inicial de reperfusão vascular mostrou ser uma área de estudo bastante
promissora. Em um aspecto mais amplo, num futuro, talvez exista a possibilidade de que a
análise precoce de um tecido possa determinar a sua viabilidade em longo prazo, podendo-
se, então, modificar uma evolução desfavorável empregando processos como o PCI.
Sugerimos que sejam conduzidas pesquisas para a avaliação do processo de
apoptose e ocorrência de necrose celular com um tempo de observação mais longo. Parece
interessante realizar, bioquimicamente, a medida da quantidade de glicogênio residual nos
grupos de estudo e correlacioná-la com a ocorrência de lesão tecidual. Estudos associando o
PCI e a produção de espécies reativas poderiam ser realizados complementarmente e teriam
aplicação na obtenção de resultados mais facilmente mensuráveis.
33
6. CONCLUSÃO
O precondicionamento isquêmico demonstrou, morfologicamente, um papel benéfico na
proteção do músculo grácil de ratos submetidos à isquemia e reperfusão vascular, na fase
precoce de reperfusão.
34
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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41
8. NORMAS ADOTADAS
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. Apresentação de originais:NB-
1139. Rio de Janeiro, 2000.
CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE- n°. 01/88: Normas de pesquisas em saúde.
Bioética 1955,3:137-54
DeCS- Descritores em Ciências da Saúde. 3.ed. São Paulo. Bireme; 1992.
FAGUNDES DJ. NORMAS PARA ELABORAÇÃO DE RELATÓRIO DE PESQUISA
[edição eletrônica-disquete]. São Paulo: UNIFESP-EPM-TOCE; 2001.
FAGUNDES DJ. NORMAS PARA CITAÇÕES E REFERÊNCIAS [edição eletrônica-
disquete]. São Paulo: UNIFESP-EPM-TOCE; 2001.
INTERNATIONAL COMMITTEE OF MEDICAL EDITORS. UNIFORM
REQUIREMENTS FOR MANUSCRIPTS SUBMITTED TO BIOMEDICAL
JOURNALS: Articles in journals Updated October 2004. Disponível em
http//www.nlm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html.
FEDERATIVE COMMITTEE ON ANATOMICAL TERMINOLOGY. Terminologia
Anatômica, [Tradução para o Português por CTA-SBA]. São Paulo, Manole, 2001,248.
INTERNATIONAL COMMITTEE ON VETERINARY ANATOMICAL
NOMENCLATURE. NOMINA ANATÔMICA VETERINÁRIA. 4a ed, ver. Zurich,1994
(together with Nomina Histológica, 2a ed. And Nomina Embriológica Veterinária)
10. ANEXO
49
ASPECTOS HISTOLÓGICOS
I
V
Figura 15- Fotomicrografia do G-I 4h/R. Reação inflamatória perivascular e perifibrilar (I) eestase vascular acentuada (V). HE, aumento de 100x.
50
E
M
Figura 16- Fotoultramicrografia do G-I 4h/R mostrando tumefação mitocondrial intensa e lesãoendotelial. M: Mitocôndrias, E:Endotélio.Aumento de 8000 x.
51
GRUPO C
F
GRUPO I 2h/R GRUPO PCI 2h
F
C
Figura 17- Fotomicrografia do músculo grácil doG-C mostrando a integridade estrutural da fibramuscular (F). Coloração pelo azul de toluidina efucsina, aumento de 400x.
F C
Figura 19- Fotomicrografia do G-PCI 2hmostrando a integridade estrutural da fibramuscular e a estase vascular, semelhante ao G-I2h/R. F: fibra muscular, C: capilares dilatados.HE, aumento de 400x.
Figura 18- Fotomicrografia do G-I 2h/Rmostrando a integridade estrutural da fibramuscular do músculo grácil e leve grau de estasevascular. F: fibra muscular, C: capilar. Coloraçãopelo azul de toluidina e fucsina, aumento de1000x.
52
GRUPO I 4h/R GRUPO PCI 4h
F F
Figura 21- Fotomicrografia do G-PCI 4hmostrando a integridade estrutural da fibramuscular (F) e capilar (C). Coloração peloazul de toluidina e fucsina, aumento de1000x.
Figura 20- Fotomicrografia do G-I 4h/Rmostrando a perda de integridade estrutural dafibra muscular (F) com vacuolização efragmentação. Coloração pelo azul de toluidinae fucsina, aumento de 400x.
53
Quadro 1- Teste do Qui-Quadrado referente à presença de fragmentação fibrilar na avaliação por MO.
Qui-Quadrado = 6.171 Graus de liberdade = 1 (p) = 0.013 Correção de Yates = 4.286 (p )= 0.0384 *
Qui-Quadrado = 6 Graus de liberdade = 1 (p) = 0.0143 Correção de Yates = 4.167 (p )= 0.0412 * Quadro 2- Teste do Qui-Quadrado referente à presença de reação inflamatória na avaliação por MO.
Qui-Quadrado = 0.75 Graus de liberdade = 1 (p) = 0.3865 Correção de Yates = 0.188 (p )= 0.665
Quadro 3- Teste do Qui-Quadrado referente à presença de estase vascular na avaliação por MO.
54
Tabela 7- Teste de Mann-Whitney. Comparação de G-C e G-I 2h/R. Processamento de dados do programa SPSS® .
ESTRUTURAS
GRUPOS MÉDIA DOS
RANKS
SOMA DOS
RANKS
GRUPO
CONTROLE
90,44 5878,50 Z-Z
I 2h/R 69,02 6211,50
GRUPO
CONTROLE
46,16 4154,50 MITOCÔNDRIA
I 2h/R 134,84 12135,50
GRUPO
CONTROLE
104,83 9435,00 GLICOGÊNIO
I 2h/R 76,17 6855,00
Quadro 4-Teste de Mann-Whitney. Comparação de G-C e G-I 2h/R. Processamento de dados do programa SPSS® .
Z-Z MITOCÔNDRIA GLICOGÊNIO
MANN-
WHITNEY
2116,500 461,500 2760,000
Z -2,934 -10,275 -3,700
p ,003 ,000 ,000
55
Tabela 8- Teste de Mann-Whitney. Comparação de G-C e G-I 4h/R. Processamento de dados do programa SPSS®. ESTRUTURAS
GRUPOS MÉDIA
DOS
RANKS
SOMA DOS
RANKS
GRUPO
CONTROLE
84,40 5486,00 Z-Z
I 4h/R 73,38 6604,00
GRUPO
CONTROLE
50,63 4556,50 MITOCÔNDRIA
I 4h/R 130,37 11733,50
GRUPO
CONTROLE
45,50 4095,00 GLICOGÊNIO
I 4h/R ,00 ,00
Quadro 5-Teste de Mann-Whitney. Comparação de G-C e G-I 4h/R.
Processamento de dados do programa SPSS®.
Z-Z MITOCÔNDRIA
MANN-
WHITNEY
2509,000 461,500
Z -1,509 -10,275
p ,131 ,000
56
Tabela 9- Teste de Mann-Whitney. Comparação de G-C e G-PCI 2h de isquemia. Processamento de dados do programa SPSS®. ESTRUTURAS
GRUPOS MÉDIA DOS
RANKS
SOMA DOS
RANKS
GRUPO
CONTROLE
105,38 6850,00 Z-Z
PCI 2h 58,22 5240,00
GRUPO
CONTROLE
54,61 4915,00 MITOCÔNDRIA
PCI 2h 126,39 11375,00
GRUPO
CONTROLE
105,40 9486,00 RETÍCULO
PCI 2h 75,60 6804,00
GRUPO
CONTROLE
114,68 10321,00 GLICOGÊNIO
PCI 2h 66,32 5969,00
Quadro 6-Teste de Mann-Whitney. Comparação de G-C e G-PCI 2h de
isquemia. Processamento de dados do programa SPSS®.
Z-Z GLICOGÊNIO MITOCÔNDRIA
MANN-
WHITNEY
3531,500 2647,000 766,500
Z -1,484 -4,045 -9,402
p ,138 ,000 ,000
57
Tabela 10- Teste de Mann-Whitney. Comparação de G-I 2h/R e G-PCI 2h de isquemia. Processamento de dados do programa SPSS®.
ESTRUTURAS
GRUPOS MÉDIA DOS
RANKS
SOMA DOS RANKS
I 2h/R 84,74 7626,50 Z-Z
PCI 2h 96,26 8663,50
I 2h/R 106,09 9548,00 GLICOGÊNIO
PCI 2h 74,91 6742,00
I 2h/R 126,98 11428,50 MITOCÔNDRIA
PCI 2h 54,02 4861,50
Quadro 7 -Teste de Mann-Whitney. Comparação de G-I 2h/R e G-PCI 2h de isquemia. Processamento de dados do programa SPSS®.
Z-Z GLICOGENIO MITOCÔNDRIA
MANN-WHITNEY
3531,500 2647,000 766,500
Z -1,484 -4,045 -9,402 p ,138 ,000 ,000
58
Tabela 11- Teste de Mann-Whitney. Comparação de G-I 4h/R e G-PCI 4h de isquemia. Processamento de dados do programa SPSS®. ESTRUTURAS
GRUPOS MÉDIA DOS
RANKS
I 4h/R 105,37 Z-Z
PCI 4h 75,63
I 4h/R 105,71 MITOCÔNDRIA
PCI 4h 75,29
Quadro 8- Teste de Mann-Whitney. Comparação de G-I 4h/R e G-PCI 4h de
isquemia. Processamento de dados do programa SPSS®.
Z-Z MITOCÔNDRIA GLICOGÊNIO
MANN-WHITNEY 1145,000 820,000 1874,000
Z -6,459 -9,252 -6,251
p ,000 ,000 ,000
59
AVALIAÇÃO DAS LESÕES DO MÚSCULO GRÁCIL ANTERIOR DE RATOS
SUBMETIDOS A PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO
FICHA DE EXPERIMENTAÇÃO
DATA:
IDENTIFICAÇÃO: ANIMAL Nº GRUPO:
PROCEDIMENTO: Epilação, abordagem cirúrgica da região inguinal à esquerda,
incisão por planos e circunferencial da pele, tecido celular subcutâneo, musculatura da
pata traseira ao nível da articulação do quadril e nervo femoral, exceto o feixe vascular
femoral, isolamento da artéria femoral profunda, clampeamento conforme o protocolo
dos grupos, coleta de material para análise.
TEMPO DE ABORDAGEM:
CICLOS DE PCI:
1-
2-
3-
INÍCIO DA ISQUEMIA SUSTENTADA:
FIM DA ISQUEMIA SUSTENTADA:
INÍCIO DA REPERFUSÃO:
FIM DA REPERFUSÃO:
COLETA DO MATERIAL:
Formalina 10%:
Glutaraldeído 2%:
60
PROTOCOLO DA ANESTESIA
IDENTIFICAÇÃO: ANIMAL Nº GRUPO:
DATA:__________________
PESO:___________________
ATROPINA:________________________________
DOSE:__________ VIA:______ HORA:____
ANESTÉSICO: CETAMINA/XILAZINA___________________
DOSE:___________________ VIA:___ HORA:
DURAÇÃO DA ANESTESIA:_________________
REFORÇO:_______
INTERCORRÊNCIAS:__________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
61
PROTOCOLO DA EUTANÁSIA
IDENTIFICAÇÃO : ANIMAL Nº GRUPO
DATA:________________
FÁRMACO PARA EUTANÁSIA:
__________________________________________________
DOSE:_______VIA:_______HORA:______
62
PROTOCOLO DE PROCEDIMENTO- LME-ULBRA
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO x MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA PESQUISADOR: RONALDO WEBSTER DATA: TIPO DE MATERIAL: MÚSCULO GRÁCIL DE RATO OBS: Material coletado e fixado com Glutaraldeído 2%, e guardado em refrigerador até a data deste protocolo. Animais: 1- Lavagem em Millonig isotônico 3x30 min 2- Pós-fixação com tetróxido de ósmio tamponado por 45 min 3- Lavagem com solução salina 0,85% 3x 30min 4- Uranila aquosa 3x30 min 5- Lavagem com solução salina 0,85% 3x 30min 6- Desidratação: 6.1: etanol 30%-10min 6.2: etanol 50%-10min 6.3: etanol 70%-10min 6.4: etanol 95%-10min 6.5: etanol 95%-20min 6.6: etanol 100%-10min 6.7: etanol 100%-20min 7- Pré- embebição: 7.1: Acetona PA 3:1 Epon 7.2: Acetona PA 2:1 Epon 7.3: Acetona PA 1:1 Epon 7.4: Acetona PA 1:2 Epon 7.5: Acetona PA 1:3 Epon 7.6: Epon puro
