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Dissertação de Mestrado
O Papel dos receptores do tipo Toll
(TLRs) na infecção pelo
Schistosoma mansoni
Fernanda do Valle Durães
Dr. Sérgio Costa Oliveira
Orientador
Dra. Cristina Toscano Fonseca
Co-orientadora
Belo Horizonte
Abril, 2010
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Fernanda do Valle Durães
O Papel dos receptores do tipo Toll (TLRs) na infecção pelo Schistosoma mansoni
Dissertação apresentada ao curso de Pós–
graduação em Bioquímica e Imunologia, do
Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Minas Gerais, como requisito parcial
para a obtenção do título de mestre em
Bioquímica e Imunologia.
Área de concentração: Imunologia
Orientador:
Dr. Sérgio Costa Oliveira, Departamento de Bioquímica e Imunologia, ICB, UFMG.
Co-Orientadora:
Dra. Cristina Toscano Fonseca, Centro de Pesquisas René Rachou, Fiocruz, MG.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Instituto de Ciências Biológicas – UFMG
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
Belo Horizonte,
2010
Aos meus pais, que nunca mediram esforços
para a realização dos meus sonhos
Agradecimentos
A realização deste trabalho não teria sido possível sem a contribuição de diversas
pessoas, as quais eu gostaria de agradecer:
Ao meu orientador, Professor Sérgio Costa Oliveira, pela orientação, confiança e
pelas oportunidades cedidas em seu laboratório;
À minha orientadora, Dra. Cristina Toscano Fonseca (Kika), pela excelente
orientação, entusiasmo, disponibilidade para as constantes discussões, carinho e, sobretudo
pela paciência;
Ao Professor Marcelo Caliari, pela colaboração para a realização das análises
patológicas, pela constante disponibilidade em ajudar e solucionar dúvidas;
A todos os LIDIanos e ex-LIDIanos, pela ajuda nos experimentos e nos afazeres do
dia-a-dia, discussões, momentos de alegria e diversão;
À Nat, que sempre me ajudou desde o início deste trabalho e mais que companheira
de laboratório, grande amiga;
À Sandra, que pela eficiente administração do laboratório e disponibilidade em
ajudar, contribuiu enormemente para que esse trabalho fosse concretizado;
Aos técnicos do laboratório e do biotério: Ilma, Narciso e Peu pela ajuda;
Aos colegas do Laboratório de Esquistossomose do René Rachou, em especial a
Tati, por toda ajuda e companheirismo;
Aos colegas do laboratório de Protozooses e às técnicas de histologia;
Aos amigos do ICB, de Bases e do departamento pela amizade e constante ajuda;
Aos membros da banca, por terem aceitado o convite;
Aos professores, funcionários e técnicos do Departamento de Bioquímica e
Imunologia;
À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos para a realização deste trabalho.
À Universidade Federal de Minas Gerais, em especial ao programa de Pós-
Graduação Bioquímica e Imunologia pela oportunidade de realizar mais uma etapa na minha
vida acadêmica;
À Ju, pela amizade, força e constante presença, principalmente nos momentos mais
difíceis;
Aos meu amigos e amigas, em especial Lelê, Camilla, Flávia, Bruna e Thaís;
Aos meus pais, meu irmão e a toda minha família, que sempre me apoiaram e
acreditaram em mim;
A todos que, presentes ou não, contribuíram para a concretização de mais esta etapa
da minha vida.
Muito Obrigada!
“A vida sem ciência é uma espécie de morte”
Sócrates
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.................................................................................................. vii
LISTA DE TABELAS .................................................................................................viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...................................................................... ix
RESUMO ...................................................................................................................xiii
ABSTRACT .............................................................................................................. xiv
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 16
1.1 A ESQUISTOSSOMOSE................................................................................................ 16
1.2 O CICLO DE VIDA DO SCHISTOSOMA MANSONI ........................................................... 19
1.3 ASPECTOS FISIOPATOLÓGICOS DA ESQUISTOSSOMOSE MANSÔNICA HUMANA ............ 21
1.4 A INTERAÇÃO PARASITA-HOSPEDEIRO ........................................................................ 23
1.4.1 O tegumento do Schistosoma mansoni ......................................................... 25
1.5 A RESPOSTA IMUNE .................................................................................................... 27
1.5.1 Resposta imune inata ...................................................................................... 28
1.5.1.1 Os Receptores do Tipo Toll – TLRs ............................................................ 28
1.5.1.2 As células dendríticas (DCs) e a resposta imune ...................................... 31
1.5.1.3 O papel das células dendríticas na esquistossomose ............................... 33
1.5.1.4 Papel dos TLRs na esquistossomose ......................................................... 34
1.5.2 Resposta imune adaptativa ............................................................................. 36
1.5.2.1 Cinética das respostas Th1/Th2 na esquistossomose mansônica .......... 36
1.6 IMUNOPATOGÊNESE: O GRANULOMA ESQUISTOSSOMÓTICO ....................................... 39
1.6.1 O papel das quimiocinas no granuloma esquistossomótico ........................ 42
2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 46
3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 48
3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 49
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................................ 49
4. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 51
4.1 ANIMAIS E PARASITOS ................................................................................................ 52
4.2 INFECÇÃO ................................................................................................................... 52
4.3 OOGRAMA .................................................................................................................. 53
4.4 CONTAGEM DO NÚMERO DE OVOS NO FÍGADO ............................................................ 53
4.5 CÁLCULO DA ÁREA TOTAL E ÁREA DA ÁREA DE FIBROSE DO GRANULOMA HEPÁTICO ... 54
4.6 EXTRAÇÃO DE CITOCINAS E QUIMIOCINAS DO TECIDO ................................................. 54
4.7 CULTURA E ATIVAÇÃO DE ESPLENÓCITOS ................................................................... 55
4.8 DOSAGEM DE CITOCINAS E QUIMIOCINAS .................................................................... 55
4.9 OBTENÇÃO DE ANTÍGENOS ......................................................................................... 56
4.10 DIFERENCIAÇÃO DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS IN VITRO ............................................. 57
4.11 MATURAÇÃO DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS ................................................................. 57
4.12 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS DE SUPERFÍCIE EM CÉLULAS DENDRÍTICAS
ESTIMULADAS ................................................................................................................... 58
4.13 ANÁLISES ESTATÍSTICAS........................................................................................... 59
5. RESULTADOS ...................................................................................................... 60
5.1 RECUPERAÇÃO DE VERMES ADULTOS ........................................................................ 61
5.2 ANÁLISES HISTOPATOLÓGICAS ................................................................................... 64
5.3 ANÁLISES IMUNOLÓGICAS .......................................................................................... 66
5.4 SMTEG INDUZ A MATURAÇÃO DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS ........................................... 70
5.5 SMTEG É CAPAZ DE INDUZIR A PRODUÇÃO DE IL-12 E TNF-α .................................... 72
5.6 A MATURAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS NÃO É DEPENDENTE DA MOLÉCULA MYD88
......................................................................................................................................... 73
5.7 A PRODUÇÃO DE IL-12 E TNF- α É DEPENDENTE DE MYD88 .................................... 74
5.8 TLR4, MAS NÃO TLR2, É NECESSÁRIO PARA A PRODUÇÃO CITOCINAS PRÓ-
INFLAMATÓRIAS INDUZIDA PELO SMTEG ............................................................................ 76
6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 78
7. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 87
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 89
ANEXOS ................................................................................................................. 106
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Distribuição mundial das principais espécies causadoras da esquistossomose
Humana ................................................................................................................ 16
Figura 2: Áreas de transmissão do Schistosoma mansoni no Brasil ................................... 18
Figura 3: Ciclo de vida do Schistosoma mansoni ................................................................ 19
Figura 4: Superfície tegumentar externa do Schistosoma ................................................... 24
Figura 5: Vias de sinalização dos TLRs ............................................................................... 30
Figura 6: Principais componentes do granuloma ................................................................. 44
Figura 7: Redução da fecundidade e do número de ovos no fígado, na ausência de TLR2.63
Figura 8: Área do granuloma e área de fibrose ................................................................... 66
Figura 9: Redução na produção de quimiocinas em MyD88-/- e TLR2-/- .............................. 68
Figura 10: Redução na produção de IL-5 em MyD88-/-......................................................... 69
Figura 11: Smteg induz o aumento da expressão de CD40 e CD86 em DCs ..................... 71
Figura 12: Smteg estimula a produção de citocinas pelas DCs ......................................... 72
Figura 13: A ativação das DCs induzida pelo Smteg não é dependente de MyD88............ 74
Figura 14: MyD88 é necessário para a produção de citocinas induzida pelo Smteg ...........75
Figura 15: A produção de IL-12 e TNF-α pelas DCs estimuladas com o Smteg é dependente
de TLR4 .............................................................................................................. 77
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Recuperação de vermes adultos ........................................................ 61
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
0-3hRP Antígenos liberados pelas cercarias nas 3 primeiras horas após a transformação
g Micrograma
L Microlitro
APC Célula Apresentadora de Antígeno
ADCC Citotoxicidade celular dependente de anticorpo (do inglês: antibody-dependent cell
mediated cytotoxicity)
ANOVA Análise de variância (da expressão inglesa, analysis of variance)
BMDCs Células dendríticas derivadas da medula óssea ( do inglês: bone marrow dendritic
cells)
ºC Graus Celsius
CC Quimiocina com duas cisteínas ligadas diretamente
CCR Receptor de quimiocinas do tipo CC
CD Grupo de diferenciação (da expressão inglesa, Cluster of Diferentiation)
cDNA DNA complementar
CEBIO Centro de Bioterismo
Cy Cychrome
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DC Célula dendrítica (do inglês, Dendritic cell)
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
ELAC Earle´s salts plus lactoalbumin hydrolysate
ELISA Ensaio de imunoadsorção ligado a enzima (da expressão inglesa, Enzyme-linked
immunosorbent assay)
EPO Peroxidase eosinofílica (da expressão inglesa, Eosinophilic peroxidase)
FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
FITC Isotiocianato de fluoresceína
x
GM-CSF Fator estimulante de macrófago e granulócitos
GPI Glicofosfatidilinositol
ICAM Molécula de adesão celular 1
IFN- Interferon gama
Ig
KO
Imunoglobulina
Knockout
IL Interleucina
IRAK Cinase associada a receptor IL-1
IRF
L
Elementos reguladores de interferons
Litro
LAL
LNFPIII
Limulus amebocyte lysate
Lacto-N-Fucopentose III
LPS Lipopolissacarideo (endotoxina)
Lyso-PS Lisofosfatidil serina
MAPK Proteína Cinase Ativada por Mitógeno
MFI Intensidade média de fluorescência
MHC Complexo de Histocompatibilidade Principal
MyD88 Fator de Diferenciação Miéloide 88
MyD88-/- Deficiência do Fator de Diferenciação Miéloide 88
mL Mililitro
mm Milímetro
mM Milimolar;
ng Nanograma
NLR Receptor do tipo NOD (do ingles, Nucleotide-binding oligomerization domain
(NOD)-like receptor)
xi
OMS Organização Mundial de Saúde
PE Ficoeritrina
PAMP Padrões moleculares associados à patógenos (do inglês: Pathogen-associated
molecular patterns).
PBS Tampão Salina-fosfato (da expressão inglesa, Phosphate buffered saline)
PBMC Células mononucleares do sangue periférico (do inglês: peripheral Blood
mononuclear cells)
pg – Picograma
PRR Receptores de reconhecimento de padrões (do inglês: Patterns recognition receptor)
RANTES Proteína regulada sob ativação normalmente expressada e secretada por células
T (da expressão inglesa, Regulated on Activation Normal T cell Expressed and Secreted)
RLR Receptores do tipo RIG (do inglês, retinoic acid-inducible gene like receptors)
RNA Ácido ribonucleico
Rpm Rotações por minuto
SCID Imunodeficiência grave (do inglês, severe combined immune deficience)
SEA Antígenos do ovo de Schistosoma (do inglês: Schistosoma egg antigens)
SFB Soro fetal bovino;
SWA Antígeno solúvel do verme adulto do S. mansoni (do inglês: Soluble adult worm
antigens)
SSA Antígeno solúvel de esquistossômulo
SmTeg Tegumento do esquistossômulo de S. mansoni
TIR Região homóloga de receptores Toll/IL-1-receptor
TRAF6 Fator 6 Associado ao receptor de TNF
TRIF Adaptador indutor de interferon-β que contém o domínio TIR (do inglês, TIR-related
adaptor protein inducing interferon)
TLR Receptores do tipo Toll
TLR 2 -/- Deficiência no receptor do tipo Toll 2
xii
TLR 4 -/- Deficiência no receptor do tipo Toll 4
Th1 Células T auxiliares do tipo 1 (do inglês: T helper cells type 1)
Th2 Células T auxiliares do tipo 2 (do inglês: T helper cells type 2)
Th17 Células T auxiliares do tipo 17 (do inglês: T helper cells type 17)
TNF- Fator de necrose tumoral alfa
Treg Células T reguladoras
TGF- Fator transformador de crescimento beta (da expressão inglesa, Transforming
growth factor beta)
v/v Proporção volume/volume
w/v Proporção peso/volume
xiii
RESUMO
A esquistossomose é o resultado de uma infecção helmíntica crônica e
permanece como importante fator de morbidade em áreas endêmicas tropicais,
incluindo o Brasil. Os receptores do tipo toll (TLRs) têm um importante papel no
reconhecimento imune inato de patógenos por células dendríticas (DCs) e na
indução das respostas adaptativas subseqüentes. Embora já tenha sido
demonstrado que TLR2, TLR3 e TLR4 sejam capazes de reconhecer diferentes
componentes do Schistosoma in vitro, pouco se sabe sobre o papel desses
receptores in vivo. Para a caracterização da resposta imune inata durante a infecção
pelo Schistosoma, camundongos selvagens (C57BL/6) e deficientes em MyD88,
TLR2 e TLR4 foram infectados com 30 cercárias. Parâmetros parasitológicos como o
número de vermes e de ovos no fígado, bem como patológicos - área do granuloma
e de fibrose - e imunológicos foram avaliados. Apesar de não terem sido observadas
diferenças com relação ao número total de vermes recuperados entre os grupos, os
animais TLR2 KO apresentaram uma reduzida fecundidade, com consequente
redução do número de ovos depositados no fígado. Entretanto, as maiores
alterações foram vistas com relação à resposta imune do hospedeiro. A ausência de
MyD88 e de TLR2 resultou em granulomas menores acompanhados da menor
produção de CCL11 no tecido hepático desses animais. Além disso, a produção de
IL-5 tanto no tecido hepático quanto em esplenócitos de animais MyD88 KO quando
re-estimulados com SEA in vitro, estava diminuída, indicando uma redução na
resposta Th2. O esquistossômulo é o estágio de vida do Schistosoma mais
susceptível ao ataque pelo sistema imune do hospedeiro. Portanto, o papel da
resposta imune inata in vitro, num modelo de ativação de células dendríticas pelo
tegumento do esquistossômulo (Smteg) foi avaliado. O Smteg foi capaz de ativar as
DCs para produzir IL-12 e TNF-α e também para aumentar a expressão das
moléculas co-estimuladoras CD40 e CD86. Além disso, utilizando DCs derivadas de
camundongos deficientes em MyD88, TLR2 e TLR4 nós demonstramos que a
habilidade das DCs em produzir IL-12 e TNF-α envolve a interação entre o Smteg/
TLR4 e a via de sinalização dependente de MyD88. Em conjunto, esses resultados
indicam que o sistema imune inato participa do reconhecimento inicial de
componentes do Schistosoma tanto in vitro quanto in vivo. Esse reconhecimento
influencia as mudanças patológicas e imunológicas decorrentes da infecção.
xiv
ABSTRACT
Schistosomiais is a chronic helminthic infection and remains as an important
morbidity factor in tropical endemic areas such as Brazil. Toll-like receptors (TLRs)
play an important role in the innate recognition of pathogens by Dendritic cells (DCs)
and in the induction of immune responses. Although it is clear that TLR2, TLR3 and
TLR4 can recognize different Schistosoma components in vitro, little is known
regarding the role of these receptors in vivo. To characterize the innate immune
response during Schistosoma infection, WT (C57BL/6) and MyD88-, TLR2- and
TLR4 deficient mice were infected with 30 cercariae. Parasitological parameters,
such as the number of worms recovered and the number of eggs in the liver, as well
as pathological and immunological parameters were evaluated. Even though the
differences between WT and KO mice in terms of worm burden were not significant,
TLR2 KO mice displayed reduced fecundity, resulting is less eggs trapped in the
liver. However, major differences were seen regarding host immune responses. The
lack of MyD88 and TLR2 resulted in smaller granulomas followed by reduced
production of CCL11 in the hepatic tissue of these mice. Furthermore, cells from
infected MyD88 KO mice also produced significantly less IL-5 than their WT controls,
both in the liver tissue and in spleen cells upon restimulation with Schistosoma egg
antigen (SEA), indicating diminished Th2 response. Further, Schistosoma mansoni
larvae is the first and the most susceptible parasite life stage to interact with the host
immune system. Therefore, the role of the innate immune system was evaluated in
an in vitro model of DC activation by schistosomula tegument (Smteg). Smteg was
able to activate DCs to produce IL-12p40, TNF-α and also to up-regulate the co-
stimulatory molecules CD40 and CD86. Moreover, using DCs derived from MyD88-,
TLR2- and TLR4 deficient mice we have shown that the ability of Smteg to activate
DCs in vitro involves MyD88 signaling pathways and TLR4/Smteg interaction.
Together, these data indicate that the innate immune system is involved in the initial
recognition of Schistosoma components both in vitro and in vivo. These interactions
play an important role in dictating the outcome of pathological and immunological
changes resulting from the infection.
INTRODUÇÃO
Introdução
16
1. INTRODUÇÃO
1.1 A Esquistossomose
A esquistossomose, popularmente conhecida como "Barriga d'água",
"Xistose" ou "Bilharziose”, é uma parasitose causada por vermes platelmintos
trematódeos, pertencentes ao gênero Schistosoma. Dentre as espécies capazes de
infectar o homem, cinco apresentam maior importância médica: S. haematobium, S.
intercalatum, S. japonicum, S. mansoni e S. mekongi. Estas espécies apresentam
uma diversificada distribuição mundial (Figura 1). S. haematobium se instala no
plexo venoso perivesical, ocasionando a esquistossomose urinária. As demais
espécies se instalam no plexo venoso mesentérico do hospedeiro vertebrado
ocasionando a esquistossomose intestinal (Gryseels et al., 2006).
Figura 1: Distribuição mundial das principais espécies causadoras da
esquistossomose humana (Modificado de Gryseels et al., 2006).
Introdução
17
Apesar de acompanhar a humanidade há milhares de anos (David & Contis,
1996), a esquistossomose permanece como uma das infecções parasitárias de
maior prevalência, resultando em graves consequências econômicas e de saúde
pública. Atualmente, a esquistossomose é endêmica em 76 países tropicais e
subtropicais, localizados na África, Ásia e América Latina. Aproximadamente 779
milhões de pessoas estão sob risco de infecção e estima-se que mais de 210
milhões estejam infectadas. Destas, 50-60% (100-120 milhões) apresentam a forma
sintomática e 10% (20 milhões) apresentam a forma clínica grave (Steinmann, 2006
e OMS, 2007). A África é o continente mais afetado e estima-se que somente na
região sub-Sahariana a esquistossomose provoque cerca de 280 mil mortes por ano
(Van Der Werf et al., 2003).
No Brasil, a esquistosomose mansônica é uma doença endêmica. Estima-se
que aproximadamente 5,48% da população brasileira esteja infectada (Coura e
Amaral, 2004). A transmissão ocorre principalmente nas regiões Nordeste e Sudeste
do país, abrangendo a região limitada pelos Estados do Maranhão, Espírito Santo e
Minas Gerais. Existem também focos de transmissão isolados no Distrito Federal,
nos Estados do Pará, Piauí, Goiás, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa
Catarina e Rio Grande do Sul (Figura 2) (Coura & Amaral, 2004). A transmissão da
doença provavelmente teve início no período da escravidão com a chegada de
africanos provenientes de regiões endêmicas. Foi o médico brasileiro Manoel
Augusto Pirajá da Silva quem, em 1908, descreveu o primeiro caso de
esquistossomose mansônica no Brasil e fez uma inédita descrição do Schistosoma
mansoni, infelizmente pouco reconhecida pela literatura científica internacional
(Katz, 2008). Por ser o agente infeccioso que representa um importante problema de
saúde pública no Brasil e no estado de Minas Gerais, o Schistosoma mansoni é a
espécie em estudo nesta dissertação.
Introdução
18
Figura 2: Áreas de transmissão do Schistosoma mansoni no Brasil. Os focos de
transmissão do S. mansoni são classificados pela prevalência da doença (Modificado de
Coura & Amaral, 2004).
Introdução
19
1.2 O Ciclo de Vida do Schistosoma mansoni
O S. mansoni possui um complexo ciclo biológico, composto por uma etapa
de reprodução sexuada (vermes adultos dióicos), com produção de ovos em um
hospedeiro vertebrado, outra de reprodução assexuada (esporocistos) nos
hospedeiros intermediários e fases de vida livre (miracídios e cercárias). O ciclo de
transmissão requer três condições básicas: contato de fezes contaminadas com a
água; caramujos específicos como hospedeiros intermediários e contato humano
com a água (Silva J. R. M, Neves R. H, Gomes D. C., 2008) (Figura 3).
Figura 3: Ciclo de vida do Schistosoma mansoni. O tamanho real das diferentes fases de
vida do S. mansoni e seus hospedeiros foi alterado para melhor visualização (Modificado de
Center for Disease Control - CDC - http://www.dpd.cdc.gov).
Introdução
20
O início da infecção no hospedeiro mamífero ocorre pela penetração, através
da pele, de uma larva multicelular denominada cercária. As cercárias são liberadas
pelo molusco e penetram na pele do hospedeiro definitivo dentro de algumas horas
após sua liberação, para dar continuidade ao ciclo de vida do parasito. Em contato
com os lipídeos na superfície da pele, as cercárias são estimuladas a iniciar a
penetração. Nesta etapa, as cercárias sofrem uma série de modificações
morfológicas e bioquímicas, muitas delas envolvendo o tegumento. Essas mudanças
incluem a perda da cauda e a alteração no padrão de expressão de antígenos, até a
transformação em esquistossômulos (Abath e Werkhauser, 1996). Os
esquistossômulos migram através da pele até atingir a membrana basal, entre a
epiderme e a derme. Ao localizarem vasos sanguíneos ou linfáticos, eles
rapidamente deixam a derme e migram para os pulmões, geralmente entre 5 e 7
dias após a penetração (Knudsen et al., 2005).
Após 15 dias, os esquistossômulos iniciam uma longa jornada intravascular
para alcançar o sistema venoso porta-hepático, onde eles maturam em vermes
adultos e se acasalam. Os vermes então migram para seu sítio final da infecção,
localizado nas veias mesentéricas. Decorridas cerca de cinco semanas após a
infecção, a fêmea inicia a postura de ovos. Aproximadamente 400 ovos podem ser
produzidos por dia e cada ovo contém uma larva ciliada denominada miracídio.
Cerca de 50% dos ovos depositados atravessam a parede e chegam à luz intestinal,
onde são liberados para o meio externo, junto ao bolo fecal (Neves, 2005). Os ovos
que não são liberados permanecem presos à mucosa intestinal ou são arrastados
para outras regiões do corpo do hospedeiro (Warren et al., 1967).
O ciclo de vida se completa quando os ovos liberados nas fezes entram em
contato com água e eclodem, liberando o miracídio. O miracídio procura pelo
Introdução
21
hospedeiro intermediário, caramujos do gênero Biomphalaria, guiado por estímulos
luminosos e químicos. No Brasil, as espécies encontradas infectadas são
Biomphalaria tenagófila, B. straminea e B. glabrata, sendo esta última espécie a de
maior ocorrência (Carvalho, 1992; Paraense, 2001). Após penetrar no caramujo, o
miracídio multiplica-se assexuadamente gerando esporocistos. A partir dos
esporocistos, as cercárias se desenvolvem, são liberadas e se locomovem
ativamente na água (Neves, 2005). Um caramujo infectado por um miracídio pode
liberar milhares de cercárias a cada dia, durante meses (Gryseels, 2006).
1.3 Aspectos fisiopatológicos da esquistossomose mansônica humana
As alterações fisiológicas geradas pela infecção pelo S. mansoni acompanham
o desenvolvimento do parasita no hospedeiro. A cercária, o esquistossômulo e o
verme adulto exercem papéis diferenciados na geração da patologia. A penetração
percutânea da cercária pode produzir uma reação alérgica inflamatória denominada
dermatite cercarial, caracterizada por coceira e eritema. Assim como a cercária, o
esquistossômulo pode produzir uma reação alérgica durante a sua migração pelo
sistema hemolinfático do hospedeiro, denominada pneumonite larval e caracterizada
por tosse e febre (El-Garem, 1998). Vermes adultos quase não causam efeitos
patológicos podendo-se, porém, observar febre prolongada, sudorese, mialgia e
dores de cabeça, logo após a ovoposição (El-Garem, 1998). Já os ovos, que podem
permanecer presos nos tecidos do hospedeiro durante a migração periintestinal ou
após embolização no fígado, baço, pulmão e outros tecidos, consistem-se nos
principais agentes causadores da patologia associada à esquistossomose. Os ovos
do parasita secretam enzimas proteolíticas que provocam as típicas reações
inflamatórias eosinofílica e granunulomatosa, e são progressivamente substituídas
por depósitos fibróticos (Cheever, 2000). A fibrose dos órgãos causa a oclusão do
Introdução
22
plexo venoso, hipertensão portal, hepatomegalia, esplenomegalia e a formação de
varizes gastrointestinais (Coulson, 1997).
Indivíduos infectados com o S. mansoni podem apresentar duas condições
clínicas dicotômicas: a aguda e a crônica. A esquistossomose aguda, também
conhecida como “febre de Katayama” ou “febre do viajante”, é comum em indivíduos
expostos pela primeira vez ao parasita, tais como viajantes ou migrantes, mas é rara
em moradores de áreas endêmicas. É uma reação sistêmica de hipersensibilidade,
mediada por imuno-complexos, contra os esquistossômulos durante sua migração e
a deposição inicial dos ovos. Pode ocorrer durante um período de 14 a 84 dias após
a infecção primária. Esta manifestação clínica é caracterizada principalmente por
febre, fadiga, desordens gastrointestinais, tosse, anorexia, eosinofilia e leucocitose.
Na ausência de tratamento adequado, estes indivíduos podem evoluir para a
condição clínica crônica (Ottesen et al., 1978; Ross, 2002).
A condição clínica crônica é subdividida em três formas: intestinal,
hepatointestinal e hepatoesplênica. Pacientes crônicos intestinais podem ser
assintomáticos ou apresentar dores abdominais e repetidas diarréias
sanguinolentas. Pacientes crônicos hepatointestinais, além de apresentarem os
mesmos sintomas dos pacientes intestinais, apresentam hepatomegalia ao exame
físico. A forma crônica hepatoesplênica é a mais rara e a mais grave. Pacientes
hepatoesplênicos podem desenvolver hipertensão portal, hepatomegalia,
esplenomegalia e varizes gastroesofágicas. A gravidade dos sintomas está
relacionada tanto com a intensidade da infecção quanto com a resposta imune de
cada indivíduo (Boros, 1989). Esta heterogeneidade nas respostas também é
observada dentre as diferentes linhagens de camundongos, no modelo experimental
da doença (Stadecker et al., 2004).
Introdução
23
1.4 A Interação parasita-hospedeiro
Os vermes do gênero Schistosoma são eucariotos multicelulares complexos
que co-evoluiram com seu hospedeiro mamífero de tal forma que os vermes adultos
podem sobreviver por até 40 anos nos vasos sanguíneos de hospedeiros imuno-
competentes (Harris et al., 1984). A relação altamente adaptada entre o
Schistosoma e seu hospedeiro parece envolver a exploração de sinais imunes e
endócrinos do hospedeiro, além da captação de nutrientes, a fim de garantir o
estabelecimento, crescimento e reprodução do verme (Escobedo et al., 2005). Uma
característica importante desses vermes é a presença de mecanismos de evasão da
resposta imune inata e da resposta imune adquirida, a fim de proporcionar uma
infecção crônica (Kussel et al.,2007).
Uma estrutura que está criticamente relacionada com as complexas
interações envolvendo parasita-hospedeiro é o tegumento do Schistosoma (Hockley
e McLaren, 1973). Vários mecanismos de evasão imune estão intimamente
relacionados com o tegumento, incluindo “disfarce” molecular (aquisição de
proteínas séricas do hospedeiro na superfície do parasita), “imitação” antigênica
(produção de antígenos apropriados com epitopos similares ou idênticos aos do
hospedeiro), degradação proteolítica das proteínas de ataque do hospedeiro,
propriedades de rigidez biofísica da membrana e uma rápida renovação do
tegumento (Abath e Werkhauser, 1996; Han et al., 2009) (Figura 4). Embora muitos
desses mecanismos tenham como objetivo o escape da resposta imune do
hospedeiro, paradoxicalmente, muitos antígenos alvos da resposta imune contra o
Schistosoma estão localizados no tegumento (Smithers et al., 1989).
Introdução
24
A
B
Figura 4: A - Superfície tegumentar externa do Schistosoma. Micrografia
eletrônica de vermes adultos do S. mansoni. (A1) o tegumento é visto com uma banda
escura envolvendo um verme adulto fêmea. A barra representa 20 µm (A2) área aumentada
indicada pelo quadrado branco no painel A. A seta indica uma vesícula multilaminada se
movendo em direção ao tegumento. A barra representa 1 µm (A3) imagem aumentada da
superfície heptalaminada. A barra representa 75 nm (Van Hellemond et al., 2006). B -
Modelo hipotético do tegumento com algumas das estratégias de evasão da resposta
imune do hospedeiro (adaptado de Han et al., 2009).
A1
A2
A3
Introdução
25
1.4.1 O tegumento do Schistosoma mansoni
A cobertura externa do Schistosoma adulto é uma estrutura citológica pouco
usual denominada tegumento. O tegumento é uma camada dinâmica de interação
com o hospedeiro que está envolvido na nutrição, evasão imune e modulação,
excreção, osmorregulação, recepção sensorial e transdução de sinais (Loukas et al.,
2007).
O tegumento do S. mansoni difere morfologicamente e antigênicamente entre
os diversos estágios de vida do parasito. A cercária possui uma membrana externa
trilaminada com uma capa de material granular difuso e fibroso presente em sua
superfície. Mitocôndrias estão esparsamente distribuídas através do tegumento da
cercária (Abath e Werkhauser, 1996). Após aproximadamente três horas depois da
penetração, a membrana externa trilaminada da cercária é substituída quase
completamente por uma membrana heptalaminada. A nova membrana é formada
aproximadamente 30 minutos após a penetração a partir de vesículas
multilaminadas originadas nas células subtegumentares que se fundem com a
membrana plasmática do tegumento, liberando seu conteúdo sobre a superfície da
membrana (Abath e Werkhauser, 1996). O tegumento do esquistossômulo sofre
algumas modificações após a transformação, mas assemelha-se ao tegumento do
verme adulto.
O tegumento do Schistosoma consiste em um sincício (não possui
membranas laterais) citoplasmático (McLaren e Hockley, 1977). Este tecido está
ligado na sua superfície basal por uma membrana plasmática convencional
invaginada e possui em sua superfície apical uma aparência heptalaminada pouco
usual. Esta última estrutura foi interpretada como sendo uma membrana plasmática
normal, sobreposta por uma bicamada secretada denominada membranocálice, por
analogia com o glicocálice das células eucariotas (Wilson e Barnes, 1977) (Figura
Introdução
26
4). A matriz sincicial localizada abaixo do tegumento contém mitocôndrias, espinhos,
e uma variedade de outras inclusões citoplasmáticas. Uma lâmina basal separa o
sincício da camada muscular. Corpos celulares nucleados (cítons) estão situados
abaixo das camadas musculares, conectados ao tegumento por canais
citoplasmáticos alinhados por microtúbulos. A maquinaria de síntese protéica,
constituída por ribossomos, retículo endoplasmático e pelo aparato de golgi, está
situada nos corpos celulares. Duas formas de inclusões secretórias, corpos
discóides e vesículas multilaminadas, são produzidos nos corpos celulares e se
direcionam ao tegumento através das conexões citoplasmáticas (Wilson e Barnes,
1974) (Figura 4).
A identificação e a caracterização de proteínas associadas ao tegumento são
essenciais para o entendimento da função dessa estrutura. Proteínas com diversas
funções estão presentes na superfície do tegumento, incluindo transportadores de
açúcares e aminoácidos, enzimas e receptores (Braschi et al., 2006). Entretanto
trabalhos realizados há mais de 20 anos, bem como os atuais, têm como foco
principal a busca por moléculas que possam ser alvos da resposta imune protetora
ou relevantes para o diagnóstico (Xavier et al., 1998). Nesse contexto, já foi
demonstrado que o isolamento de membranas do tegumento de vermes adultos e
seu uso na vacinação de camundongos foram capazes de induzir proteção em
modelo murino, após exposição à cercária irradiada, demonstrando que essas
membranas contêm antígenos protetores (Smithers et al., 1989). Além disso,
anticorpos provenientes de camundongos vacinados com membranas tegumentares
dos vermes adultos reconhecem antígenos da superfície do esquistossômulo jovem,
demonstrando que existem proteínas que são conservadas entre estas duas fases
do ciclo de vida do parasita (Simpson et al., 1990). Em parasitas em cultura, essas
proteínas são liberadas de sua superfície em vesículas associadas a membranas
Introdução
27
(Simpson et al., 1984 e Pearce e Sher, 1989). Interessantemente, essas moléculas
estão ligadas à superfície do esquistossômulo via âncoras de GPI e são liberadas da
superfície do parasita por tratamento com enzimas específicas para GPI (Pearce e
Sher, 1989).
Os recentes avanços no estudo da biologia molecular do Schistosoma
permitiram uma melhor caracterização do transcriptoma, genoma e proteômica do
tegumento do S. mansoni. Dessa forma, tornou-se possível realizar um inventário
mais completo dos constituintes protéicos do tegumento e de sua superfície (Braschi
et al., 2006). Nesse aspecto, vários antígenos tegumentares já foram descritos,
incluindo a SmAQP e Sm200, além da Sm29 e da Sm-TSP2 (Faghiri e Skelly, 2009;
Braschi et al., 2006). Tanto a Sm29 quanto a Sm-TSP2 foram capazes de induzir
elevados níveis de proteção em modelo murino (Cardoso et al., 2008; Tran et al.,
2006). Assim, em conjunto, esses estudos reforçam a idéia de que o tegumento do
esquistossômulo constitui um importante alvo para a resposta imune, uma vez este
é o primeiro e mais susceptível estágio de vida do parasita a entrar em contato com
os mecanismos efetores do sistema imune do hospedeiro.
1.5 A resposta imune
A infecção pelo S. mansoni representa um complexo desafio para o sistema
imune do hospedeiro, principalmente porque o parasito apresenta diferentes
estágios evolutivos e habita distintos nichos durante seu desenvolvimento no
hospedeiro definitivo. A importância de se compreender os mecanismos envolvidos
nessa patologia está no fato de que os danos causados nos tecidos afetados são o
resultado de um processo imunopatológico iniciado pela resposta imune do próprio
hospedeiro contra antígenos do parasita. Nesse aspecto, tanto a imunidade inata
quanto a adaptativa participam na defesa do hospedeiro.
Introdução
28
1.5.1 Resposta imune inata
A imunidade inata pode ser entendida como o sistema de defesa inicial que
reconhece motivos conservados encontrados tanto em animais quanto em plantas.
As células apresentadoras de antígenos (APCs) têm um papel fundamental na
resposta imune inata, uma vez que elas são capazes de reconhecer uma ampla
variedade de estruturas características de patógenos, comumente denominados
padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs). Recentemente, foi
demonstrado que as APCs reconhecem estes PAMPs através de receptores de
reconhecimento de padrões – PRRs (do inglês, pattern recognition receptors). Várias
classes de PRRs, tais como TLRs (do inglês, toll-like receptors), RLRs (do inglês,
retinoic acid-inducible gene – RIG-I like receptor) e NLRs (do inglês, Nucleotide-
binding oligomerization domain (NOD)-like receptor) já foram identificadas (Kawai e
Akira, 2009). Esses PRRs reconhecem várias classes de patógenos em diversos
compartimentos celulares e ativam a liberação de citocinas inflamatórias e
interferons do tipo I para a defesa do hospedeiro (Medzhitov e Janeway, 2000;
Medzhitov, 2007).
1.5.1.1 Os Receptores do Tipo Toll – TLRs
Os receptores do tipo Toll (TLRs) são os exemplos mais estudados de PRRs.
Os TLRs são moléculas evolutivamente conservadas e foram identificados em
vertebrados pela sua homologia ao Toll, uma molécula que estimula a produção de
proteínas antimicrobianas em Drosophila melanogaster (Medzhitov et al., 1997). Em
mamíferos, já foram identificados até o momento 12 membros da família dos TLRs
(Beutler, 2009). Esses receptores constituem uma família de glicoproteínas integrais
de membrana do tipo I, cujo domínio extracelular N-terminal é formado por
aproximadamente 16-28 repetições ricas em leucina (LRRs). Devido à
Introdução
29
heterogeneidade de seus domínios extracelulares, uma variedade de ligantes é
reconhecida pelos TLRs, incluindo PAMPs derivados de vírus, bactérias e fungos
patogênicos e protozoários parasitas. Várias células do sistema imune, incluindo as
células dendríticas (DCs), macrófagos, neutrófilos, células endoteliais e linfócitos
expressam diferentes TLRs. Esse padrão de expressão célula-específica, porém
diferenciada, é um mecanismo que visa garantir uma resposta mais diversa aos
diferentes tipos de patógenos. A estrutura cristalizada de vários TLRs com seus
ligantes demonstrou que esses complexos formam heterodímeros tais como TLR1-
TLR2, TLR2-TLR6, TLR4-MD2 ou homodímeros, como TLR3-TLR3 (Jin e Lee,
2008a e 2008b). De acordo com o ligante e o compartimento em que são expressos,
os TLRs são divididos em categorias: lipídeos e lipopeptídeos (TLR1, TLR2, TLR4 e
TLR6 – expressos na superfície celular); ácidos nucléicos (TLR3, TLR7, TLR8 e
TLR9 – expressos em vesículas intracelulares, como o endosomo e retículo
endoplasmático – RE) e proteínas (TLR5 e TLR11 - este último somente é expresso
em camundongos – também expressos na superfície celular). O ligante para o
TLR10 ainda não foi identificado (Kumar et al., 2009).
As moléculas dos TLRs possuem um domínio citoplasmático C-terminal,
homólogo ao receptor de IL-1, conhecido como domínio TIR (Bowie e O’Neill, 2000).
Uma vez ativados, os TLRs recrutam uma das cinco proteínas adaptadoras (MyD88,
TIRAP, TRIF, TRAM e SARM) para o seu domínio TIR (O’Neill e Bowie, 2007). A
primeira molécula adaptadora descoberta e a mais estudada é o gene que codifica o
fator de diferenciação mielóide 88 (MyD88), o qual transduz sinais de todos os TLRs,
exceto TLR3, além de sinais dos receptores para IL-1 e IL-18 (Takeuchi e Akira,
2002). A associação entre um TLR e MyD88 recruta membros da família de cinases
associadas ao receptor de IL-1 (IRAK). IRAK4 e IRAK1 são sequencialmente
fosforiladas, levando a sua dissociação do complexo do receptor e a posterior
Introdução
30
associação com TRAF6. TRAF6 forma um complexo com enzimas conjugadas a
ubiquitina para ativar a cinase TAK1 que, em conseqüência ativa os fatores
nucleares de transcrição: fator nuclear (NF)-B e a proteína ativadora 1 (AP-1)
através do complexo da cinase IB (IKK) e a via da proteína cinase mitógeno-ativada
(MAP), respectivamente (Figura 5). Uma vez no núcleo, NF-B regula a produção
de mais de 150 genes de citocinas, de receptores de antígenos, de apoptose e da
defesa do hospedeiro. Porém, a produção de citocinas pro-inflamatórias e o aumento
no potencial co-estimulatório das APCs é talvez a resposta imediata do hospedeiro,
desencadeada pelos TLRs, contra aquele patógeno que forneceu o estímulo (Kawai
e Akira, 2005; kanzler et al., 2007).
Figura 5: Vias de sinalização dos TLRs (adaptado de Kumar et al., 2009).
Introdução
31
Além da via dependente de MyD88, o TLR3 e TLR4 utilizam uma outra
proteína adaptadora, TRIF (do inglês, TIR-related adaptor protein inducing
interferon). TRIF interage com a molécula adaptadora relacionada ao TRIF (TRAM)
para sinalizar via TLR4 e também pode sinalizar através do complexo de proteínas
adaptadoras MAL/MyD88 (Akira e Takeda, 2004). A via de sinalização de TLRs
MyD88-independente é capaz de induzir a fosforilação de elementos reguladores de
interferons (IRFs), como IRF-3 e IRF-7, resultando na produção de interferons do
tipo I, em particular IFN-; genes induzidos por interferon, como RANTES, IP10,
CXCL10 e genes associados à maturação das DCs (Fitzgerald et al., 2003). Outra
característica dessa via é a indução de NF-B tardiamente, em um processo
mediado pela proteína cinase RIP-1 (Meylan et al., 2004; Akira, 2006).
1.5.1.2 As células dendríticas (DCs) e a resposta imune
O estudo de modelos de interação entre parasita-hospedeiro tem fornecido
uma riqueza de informações com relação à função e a regulação da resposta da
imunidade adaptativa mediada por linfócitos T. Nesse aspecto, destaca-se o papel
das APCs na iniciação e modulação das respostas das células T aos patógenos
(Sher et al., 2003). Muitos desses trabalhos estão relacionados com as células
dendríticas (DCs), devido a sua capacidade de patrulhar os locais da entrada de
patógenos, responder a sinais microbianos e potencialmente ativar células T para
indução de respostas imunes primárias, permitindo assim o estabelecimento da
memória imunológica (Banchereau e Steinman, 1998; Banchereau et al., 2000;
Moser e Murphy, 2000). Muitas evidências sugerem que a extensão e o tipo da
resposta imune induzida por diversos estímulos dependem dos efeitos exercidos nas
DCs (Ramaswamy et al., 2000 e Angeli et al., 2001).
Introdução
32
As DCs têm origem nos precursores da medula óssea, mas as DCs
completamente diferenciadas apresentam fenótipos distintos. Os diferentes fenótipos
das DCs podem direcionar respostas imunes diversas, como imunidade ou
tolerância (Lutz e Schuler, 2002). Essas sub-populações são identificadas em
camundongos de acordo com a expressão de marcadores de superfície e pela
localização em órgãos e tecidos: DCs linfóides (CD11c+/CD8α+), mielóides
(CD11c+/CD8 α-) e plasmocitóides (CD11c+/ B220+) (Perona-Wright et al., 2006).
Duas linhagens principais, a mielóide e a plasmocitóide, são detectadas em
camundongos e humanos (Moser e Murphy, 2000). Dado a presença de múltiplos
subtipos de DCs, tem sido proposto que algumas DCs podem ser especializadas em
produzir IL-12 e direcionar respostas Th1, enquanto outras induziriam uma resposta
imune do tipo Th2. Neste modelo, tais subtipos de DC1 ou DC2 possuiriam
conjuntos variados de receptores, mutuamente exclusivos, e responderiam a grupos
distintos de patógenos (Liu, 2001). Um modelo alternativo sugere que os subgrupos
individuais de DCs não são necessariamente DC1 ou DC2 pré-existentes, e sim
respondem de uma maneira flexível a patógenos distintos e produzem citocinas
distintas de acordo com o tipo de receptor que é estimulado (Reis e Souza, 2001;
Kalinski et al., 1999 e Kapsenberg, 2003). Essa plasticidade funcional, portanto,
determinaria a resposta imune de acordo com as características do patógeno como,
por exemplo, o desenvolvimento de uma resposta Th1 contra patógenos
intracelulares.
Os progenitores das DCs na medula óssea dão origem a precursores
circulantes. Os precursores das DCs se direcionam a tecidos e órgãos não linfóides,
onde residem como células imaturas com alta capacidade fagocítica, especializadas
em capturar e processar antígenos para formar complexos MHC-peptídeos. Caso
sinais de perigo sejam encontrados pelas DCs na forma de PAMPs, um processo de
Introdução
33
clássica maturação é estimulado nas DCs. As DCs então sofrem mudanças
fenotípicas e funcionais, caracterizadas por alterações morfológicas e na motilidade,
que culminam na completa transição das dedicadas células processadoras de
antígenos (Ag) em células apresentadoras de antígenos especializadas (Matzinger,
2002). A migração das DCs em direção à zona de células T naïve do linfonodo é
acompanhada por um significante aumento e estabilização da expressão de
moléculas de superfície do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) (Cella
et al., 1997 e Pierre et al., 1997), aumento da expressão de moléculas co-
estimuladoras, tais como CD80 e CD86, molécula de adesão intracelular-1 (ICAM-1)
e CD40, além da elevada capacidade para secretar citocinas estimuladoras de
células T, como IL-12 e IL-2 (revisto por Perona-Wright et al., 2006). O resultado é
uma APC potente, equipada para interagir e ativar células T naïve (Sallusto et
al.,1995). Uma vez ativadas pelas DCs, as células T podem completar a resposta
imune interagindo com outras células, tais como células B, para a produção de
anticorpos; macrófagos, para a liberação de citocinas e produção de espécies
reativas de nitrogênio e oxigênio; e células alvos, para a lise (Banchereau e
Steinman,1998). A polarização da resposta de células T CD4+ nos fenótipos Th1 e
Th2 é influenciada por diferentes fatores imunológicos, no entanto os sinais
fornecidos pelas DCs são os principais determinantes na diferenciação destas
células efetoras (Janeway & Medzhitov, 2002).
1.5.1.3 O papel das células dendríticas na esquistossomose
A interação entre o S. mansoni e as DCs inicia-se pelo reconhecimento de
componentes específicos da mistura antigênica do parasita encontrados pelo
hospedeiro. Todos os estágios do ciclo de vida de S. mansoni produzem uma
complexa variedade de moléculas – proteínas, carboidratos, lipídeos - muitas das
Introdução
34
quais já foram extensamente caracterizadas e qualquer uma delas pode ser
considerada como candidato potencial para o reconhecimento imune inato durante a
infecção, podendo desempenhar um papel importante no condicionamento das DCs
(Perona-Wright et al., 2006). Nos estágios iniciais da infecção pelo Schistosoma a
larva na pele induz uma reação inflamatória e influxo de células, incluindo as DCs
(Hogg et al., 2003; Mountford e Trottein, 2004). Existem também evidências que
retratam a ativação e a maturação das DCs na pele, após a penetração das
cercárias, determinada pela regulação positiva da expressão de MHCII e CD86
(Riengrojpitak et al., 1998; Angeli et al., 2001; Hogg et al., 2003).
As DCs quando estimuladas com antígenos de diferentes estágios do ciclo de
vida de S. mansoni, tais como antígenos solúveis de esquistossômulos (SSA) e
antígenos solúveis de verme adulto (SWAP) não são convencionalmente ativadas
(Zaccone et al., 2003; Trottein et al., 2004). Por outro lado, BMDCs (células
dendríticas derivadas da medula óssea) quando expostas ao material liberado por
cercárias infecciosas nas três primeiras horas após a transformação (denominadas
preparação liberada entre 0-3 horas, 0-3hRP), apresentam um estado parcial restrito
de ativação, quando comparadas com as DCs estimuladas com SEA, ovos mortos
ou SSA, mencionados anteriormente. Este estado de ativação intermediário é
caracterizado pelo pequeno aumento na expressão de MHCII, CD40 e CD86 e pela
produção de IL-6 e IL-12p40 (Jenkins e Mountford, 2005).
1.5.1.4 Papel dos TLRs na esquistossomose
Muitos trabalhos têm demonstrado que as DCs podem se ligar a
componentes do Schistosoma tanto via TLRs quanto via Lecitinas do tipo C (DC-
SIGN, Langerin) (van der Kleij et al., 2002; Thomas et al., 2003; Aksoy et al., 2005 e
Meyer et al., 2005). Os antígenos solúveis do ovo (SEA), derivados do S. mansoni,
Introdução
35
são mais caracterizados produtos derivados de helmintos que contêm variados
ligantes para os TLRs e influenciam as respostas das DCs. Por exemplo, lacto-N-
fucopentose III (LNFPIII) é um açúcar que contém o glicano Lewisx, que é
encontrado no SEA, e interage com TLR4 para ativar seletivamente a sinalização via
a cinase extracelular ERK nas DCs. LNFPIII possui papel adjuvante Th2 pelo
recrutamento de macrófagos supressores e o condicionamento de DC para
promover a produção de IL-4 pelas células T CD4+ (Thomas et al., 2003). Em
adição, Lisofosfatidilserina (Lyso-PS) derivada do Schistosoma interage com TLR2
para induzir a diferenciação de células T produtoras de IL-4 e IL-10. Dependendo do
número de cadeias acil, a Lyso-PS do Schistosoma pode diferencialmente
condicionar as DCs a promover tanto a polarização de células Th2 ou
especificamente induzir células T reguladoras produtoras de IL-10 (Van der Kleij et
al., 2002). Por fim, Já foi descrito que RNA de dupla fita derivado do ovo de
Schistosoma constitui-se como ligante para TLR3 (Aksoy et al., 2005).
Embora o papel dos TLRs no reconhecimento de componentes do
Schistosoma in vitro tenha sido cada vez mais descrito, o papel desses receptores in
vivo permanece controverso. Layland e colaboradores (2005) descreveram que a
molécula MyD88 está envolvida no reconhecimento de componentes do
Schistosoma in vivo, uma vez que camundongos deficientes em MyD88 apresentam
uma redução na imunopatologia, diminuição da resposta Th1 e elevada produção de
IL-10. Em outro trabalho desse mesmo grupo, foi demonstrado que a ausência de
TLR2 resulta no agravamento da imunopatologia, que está relacionado com um
aumento na resposta Th1 e redução na Th2 (Layland et al., 2007). Entretanto,
Vanhoutte e colaboradores (2007) verificaram que a ausência de TLR2 não altera a
patologia induzida pelos ovos. Assim, o uso de vias alternativas e não naturais de
infecção bem como o de cepas e/ou de animais naturalmente resistentes poderiam
Introdução
36
explicar esses resultados conflitantes. Tais resultados não permitem obter
observações conclusivas acerca do papel dos TLRs no curso da infecção por S.
mansoni. Dessa forma, torna-se importante clarificar o papel de MyD88 e TLR2,
assim como verificar a participação in vivo de outros TLRs na patogênese,
especialmente na formação e na regulação do granuloma e na ativação das
respostas Th1 e Th2 (Pearce e MacDonald, 2002).
1.5.2 Resposta imune adaptativa
A expressão diferencial de sub-populações de linfócitos T CD4+ auxiliares na
esquistossomose tem sido reportada tanto no desenvolvimento da patologia como
na proteção contra a doença (Scott et al.,1989).
1.5.2.1 Cinética das respostas Th1/Th2 na esquistossomose mansônica
A infecção pelo Schistosoma induz diferentes respostas imune, celular e
humoral, contra os antígenos do parasita. É o balanço entre esses dois tipos de
resposta que irá determinar o resultado da doença. Essas respostas, em humanos,
estão correlacionadas com a fase (aguda X crônica) e com a forma clínica da
doença (Corrêa-Oliveira et al., 1998). Estudos imunológicos realizados em pacientes
resistentes, moradores de áreas endêmicas, apontam para um papel protetor contra
a infecção, tanto da resposta Th1 quanto Th2 (Corrêa-Oliveira et al., 2000).
Durante a fase aguda da doença, observa-se uma significativa resposta
proliferativa de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a SEA e SWAP
(Gazzinelli et al., 1987), com a detecção de níveis mensuráveis de TNF-α, IL-1 e IL-
6. A produção de citocinas reflete dessa maneira um fenótipo pró-inflamatório
dominante (Caldas et al., 2008).
Introdução
37
A exposição ao parasita, durante a fase crônica, pode resultar em diferentes
formas clínicas, que estão associadas com respostas imunes específicas. Um grupo
de indivíduos é susceptível a infecção e possui uma resposta imunológica descrita
“Th2 modificada”. Esses apresentam uma resposta Th2, com baixos níveis de
citocinas do perfil Th1 e expressão de altos níveis de IL-10, o que pode indicar uma
forte atividade de células Tregs. O perfil de anticorpos do tipo Th2 é dominado pelo
isotipo IgG4 com relativamente pouca IgE. Esses indivíduos geralmente estão
associados com a forma intestinal da doença e constituem os principais
reservatórios para futuras transmissões. No outro extremo, estão alguns indivíduos
que desenvolvem uma doença inflamatória descontrolada, associada à forma clínica
hepatoesplênica. A resposta imune inflamatória descontrolada é geralmente
caracterizada por um perfil Th1, com elevados níveis séricos de TNF-. Os níveis de
IgG4 são baixos, porém, a resposta de IgE é evidente. Um terceiro grupo de
indivíduos parece ser resistente a infecção. Nesse grupo, respostas imunes bem
balanceadas seriam caracterizadas pela presença de respostas Th1 e Th2
mensuráveis, que são controladas devido à presença de atividade de células Treg.
Isso também é refletido pelo balanço mais equilibrado na distribuição dos isotipos
IgG4 e IgE no perfil de anticorpos do tipo Th2 (Maizels e Yazdanbakhsh, 2003).
Flutuações dinâmicas no perfil de resposta imune também são observadas no
decorrer da infecção murina experimental. Neste modelo, os estágios infectivos
iniciais do Schistosoma (cercária e esquistossômulo) estimulam uma resposta de
natureza Th1, durante as primeiras 4-5 semanas de infecção. Esta resposta é
caracterizada pelo aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-1,
TNF-α, IL-6 e IFN-, e por uma limitada expressão de IL-4. Somente quando a
infecção progride e os primeiros ovos são produzidos, 5-6 semanas após a infecção,
Introdução
38
a resposta imune é gradualmente alterada para um perfil Th2 e torna-se fortemente
polarizada, oito semanas após a infecção (Pearce e MacDonald, 2002).
Concomitante ao desenvolvimento desta resposta de natureza Th2 ocorre uma
expressiva produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 e uma redução na produção de IFN-
. É neste estágio que a resposta Th2 atinge seu pico e a resposta granulomatosa
apresenta-se mais exacerbada. Há um aumento nos níveis plasmáticos de IgE e de
eosinófilos circulantes, o que resulta da produção das citocinas IL-4 e IL-5 (Pearce et
al., 1991; Grzych et al., 1991). É a expressão destas citocinas pelas células Th2 que
provoca a mudança nas células B para a produção do isotipo IgE. IL-4 e IL-5
também atuam como fatores de crescimento e sobrevivência dos eosinófilos
(Mosmann, 1992). Decorridas 12 semanas da infecção, ocorre uma redução
significativa da resposta Th2 caracterizada por uma hiporesponsividade imunológica
e um pequeno aumento na produção de IFN- (Grzych et al., 1991). É nessa fase em
que são observados os menores granulomas (Fallon, 2000). Esta resposta persiste
até o final da infecção e contribui para a sobrevivência do hospedeiro (Grzych et al.,
1991). Assim como na resposta imune humana, a IL-10 aparece como um fator
determinante da imunomodulação da resposta murina (Sadler et al., 2003). A
recente descrição de um terceiro subtipo celular, Th17, e o seu envolvimento em
uma variedade de outras doenças inflamatórias crônicas impulsionaram
investigações acerca de seu papel na esquistossomose (Steinman, 2007). As células
Th17 foram associadas com o desenvolvimento de patologia severa em
camundongos polarizados para um perfil Th1 e camundongos CBA, os quais
desenvolvem uma forte resposta inflamatória caracterizada por elevados níveis de
IFN-γ. Em seguida, foi demonstrado que a indução da patologia severa e a
expressão de IL-17 em camundongos Th1 polarizados são dependentes da
presença de IL-23, outra citocina característica do perfil Th17 (Rutizky, 2006).
Introdução
39
1.6 Imunopatogênese: o granuloma esquistossomótico
O granuloma é uma reação inflamatória crônica e focal, caracterizado pela
presença de fibras colágenas e células, incluindo macrófagos, eosinófilos e células T
CD4+, ao redor de ovos individuais. A coleção de células mononucleares é compacta
e organizada, e são as células epitelióides que definem as lesões granulomatosas
típicas (Lenzi et al., 1998).
O granuloma esquistossomótico é uma lesão dinâmica que se modifica com o
tempo. A evolução do granuloma tem sido classificada em vários estágios de
maturação, na infecção experimental e humana (Grimaud, 1986; Junqueira et al.,
1986; Li Hsu et al., 1972; Raso & Bogliolo, 1970; Lenzi et al., 1998). Na infecção
experimental murina, os granulomas podem ser classificados em cinco principais
estágios de evolução: reativo inicial, exsudativo, exsudativo-produtivo, produtivo e
involutivo. Observa-se que a intensidade da fibrose aumenta gradualmente com a
evolução do granuloma, ao passo que a celularidade total apresenta uma
intensidade progressivamente menor (Lenzi et al., 1998).
Alterações dinâmicas nas populações celulares também são observadas ao
longo da maturação do granuloma. O estágio reativo inicial é caracterizado pelo
acúmulo gradual de células mononucleares, neutrófilos e eosinófilos ao redor do ovo
recentemente depositado. Cerca de 40 dias após a infecção, surgem os primeiros
granulomas exsudativos que, além de macrófagos e eosinófilos, apresentam
fibroblastos, linfócitos, neutrófilos, células plasmáticas e mastócitos. À medida que o
granuloma amadurece no estágio exsudativo-produtivo, histiócitos e células
epitelióides começam a aparecer na periferia e gradualmente substituem a zona
leucocítica. Fibrócitos também aparecem na periferia da lesão e formam uma zona
externa ao redor dos histiócitos e das células epitelióides. Durante o estágio
Introdução
40
produtivo os ovos do Schistosoma se degeneram e se desintegram. Fibrócitos e
fibras de colágeno eventualmente se tornam mais proeminentes, e linfócitos,
histiócitos, células plasmáticas e alguns eosinófilos formam uma zona adicional na
periferia da lesão. Os fibrócitos e as fibras colágenas eventualmente se tornam a
característica principal do granuloma, ao passo que os outros tipos celulares
reduzem em número. Os granulomas no estágio involutivo são marcadamente
reduzidos no tamanho e o ovo está tipicamente desintegrado, podendo se tornar
calcificado. Após o estágio involutivo o granuloma é substituído por placas fibróticas
(Lenzi, 1998; Burke et al., 2009).
Tanto a composição quanto o tamanho do granuloma são determinados pela
atividade de linfócitos T CD4+ antígeno-específicos e o seu microambiente de
citocinas (Stadecker MJ, 1999). A interação entre APCs expressando MHC de
classe II, peptídeos antigênicos do ovo e células T CD4+ específicas resulta na
ativação das células T, expressão de moléculas de adesão, recrutamento e ativação
de outros leucócitos - notadamente eosinófilos - e na liberação de mediadores
inflamatórios, principalmente citocinas (Stadecker, 1999). O ovo e seus antígenos
são potentes indutores de citocinas do tipo Th2 e as células T CD4+ são importantes
fontes destas citocinas na resposta granulomatosa. Outros tipos celulares como, por
exemplo, os eosinófilos também têm sido caracterizados como fonte de citocinas
Th2 (Rumbley et al., 1999). Embora o granuloma seja nocivo ao hospedeiro, uma
vez que ele eventualmente danifica o fígado, está claro que a lesão induzida pelo
ovo também tem um papel protetor importante. Os antígenos secretados pelo ovo
são uma fonte contínua e potente de estímulos para a resposta imune. Se esses
antígenos não são seqüestrados ou neutralizados de forma eficiente, a resposta
inflamatória descontrolada resultante pode causar danos permanentes para os
Introdução
41
tecidos afetados. Nesse contexto, as citocinas Th2 têm um papel protetor
fundamental na patogênese da esquistossomose (Wynn et al., 2004).
O granuloma hepático forma-se inicialmente num contexto de citocinas Th1,
todavia, já nas primeiras 1-2 semanas de formação do granuloma, a resposta imune
torna-se polarizada para o perfil Th2 com a produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. A
mudança para o perfil Th2 é crucial na prevenção da morbidade da doença e
aumenta a sobrevivência do hospedeiro (Pearce et al., 2004). As citocinas Th2
estudadas isoladamente apresentam diferentes funções na patologia do granuloma
hepático. Estudos com animais deficientes para IL-4, IL-13 ou duplo-deficientes em
IL-4 e IL-13 demonstraram que IL-4 direciona o desenvolvimento da resposta
granulomatosa, ao passo que IL-13 é a citocina pró-fibrótica chave no
desenvolvimento da fibrose hepática associada à esquistossomose (Fallon, 2000). A
IL-4 é responsável pela determinação do tamanho do granuloma, indução da
proliferação de linfócitos produtores de citocinas Th2 e também é importante para a
produção de IL-5 e IL-13 por células associadas ao granuloma (Cheever, 1994;
Yamashita e Boros, 1992). Além disso, a IL-4 não é necessária para o
desenvolvimento da fibrose, porém, ela aumenta os efeitos da IL-13 na fibrogênese
(Fallon et al., 2000). A IL-4 e a IL-13 também podem contribuir para o
desenvolvimento da fibrose pela indução de macrófagos alternativamente ativados
(Wilson et al., 2007; Hesse et al., 2001). A IL-5 é necessária para o recrutamento de
eosinófilos para o granuloma (Cheever et al., 1991). Os eosinófilos são uma
importante fonte de citocinas Th2, como a IL-13, e, portanto, a IL-5 contribui
indiretamente para a polarização da resposta imune através do recrutamento dessas
células (Rumbley et al., 1999). A IL-10 tem um papel regulador chave durante a
transição da resposta Th1 para a Th2 e também na prevenção do desenvolvimento
de patologia grave, devido ao excesso das respostas Th1 ou Th2 (Wilson et al,
Introdução
42
2007). Nos estágios iniciais da formação do granuloma, a IL-10 atua na supressão
da produção de citocinas Th1, tais como INF-γ (Hesse et al, 2004). Hoffmann et al.
(2000) também demonstraram que a IL-10 é essencial para prevenir respostas Th2
excessivas em camundongos deficientes para IL-10. Em contraste, o papel das
citocinas Th1 na indução do granuloma e fibrose não é muito bem definido (Figura
6).
1.6.1 O papel das quimiocinas no granuloma esquistossomótico
As quimiocinas pertencem a uma superfamília de citocinas de baixo peso
molecular que tem como principal alvo as células derivadas da medula óssea.
Foram descritas inicialmente por sua atividade quimiotática em processos
inflamatórios, mas hoje se sabe que estas moléculas influenciam muitos outros
processos fisiológicos e patológicos como, por exemplo, controle do tráfego basal de
leucócitos, ativação e diferenciação celular, organogênese, hematopoiese,
angiogênese, rejeição de tumores, entre outros (Allen et al., 2007). As quimiocinas
geralmente se ligam a vários receptores e uma mesma célula pode apresentar mais
de um receptor, de forma que há uma sobreposição e redundância de respostas
(Allen et al., 2007). Atualmente são conhecidas aproximadamente 50 quimiocinas
que se ligam a mais de 20 receptores em humanos e camundongos.
Relativamente poucos estudos em humanos evidenciam o envolvimento das
quimiocinas na esquistossomose. Entretanto, estudos em modelos murinos
demonstram que as quimiocinas apresentam um importante papel na determinação
da intensidade e dos tipos celulares na resposta granulomatosa (Qui et al., 2001).
Em geral, estes estudos se baseiam na indução sincronizada de granulomas
pulmonares por meio da administração de ovos de S. mansoni ou micropartículas
cobertas com os antígenos do ovo.
Introdução
43
CCL2, também denominada MCP-1 (do inglês, Monocyte Chemotactic
Protein-1) interage principalmente com o receptor CCR2 e apresenta uma
importante função no direcionamento de células mononucleares, principalmente
monócitos, para os sítios de inflamação. Sua participação na reação granulomatosa
inclui o recrutamento celular e a expressão de colágeno. Camundongos deficientes
para CCR2, na fase inicial de formação do granuloma pulmonar induzido por
micropartículas cobertas com SEA, apresentam uma redução no tamanho do
granuloma devido a um menor recrutamento de fagócitos mononucleares. Uma
redução transitória na expressão gênica de procolágeno também foi observada
nestes animais (Warmington et al., 1999). CCL3 também conhecida como MIP-1
(do inglês, Macrophage Inflammatory Protein-1), interage com os receptores CCR1
e CCR5, que são expressos em vários tipos celulares como neutrófilos, monócitos,
macrófagos, linfócitos T e B e eosinófilos (Menten et al, 2002). Essa quimiocina é
importante para promover a resposta granulofibrótica, uma vez que camundongos
deficientes para CCL3, quando infectados, apresentam uma redução no tamanho
dos granulomas, na atividade da peroxidase eosinofílica (EPO) e no conteúdo de
hidroxiprolina, um indicador de fibrose, no fígado (Souza et al., 2005). Além disso,
estudos em humanos demonstraram uma associação entre níveis plasmáticos
elevados de CCL3 e um maior risco de desenvolver doença hepática grave (Souza
et al., 2005). Tais estudos sugerem que a CCL3 pode ser um fator determinante no
desenvolvimento da forma grave da esquistossomose (Falcão et al., 2002). Por
outro lado, acredita-se que CCL5 ou RANTES (do inglês, Regulated on Activation
Normal T cell Expressed and Secreted) regula negativamente o desenvolvimento do
granuloma, uma vez que camundongos deficientes nessa quimiocina apresentam
um aumento significativo na resposta granulomatosa (Chensue et al., 1999). Esses
resultados demonstram que o balanço combinado entre a produção das quimiocinas
Introdução
44
e a ativação de seus receptores é importante na determinação do curso da infecção
pelo Schistosoma em camundongos e humanos (Figura 6).
Figura 6: Principais componentes da resposta granulomatosa aos ovos do
Schistosoma no fígado do hospedeiro e o papel das principais citocinas e
quimiocinas que regulam essa resposta. Legenda: ovo, neutrófilo, eosinófilos, macrófago,
célula hepática estelada, fibroblasto, fibras de colágeno, células T CD4+/ células B,
hepatócitos (Burke et al., 2009).
JUSTIFICATIVA
Justificativa
46
2. JUSTIFICATIVA
A esquistossomose é uma doença inflamatória crônica e endêmica em 76
países tropicais e subtropicais, incluindo o Brasil (OMS, 2007). Com uma prevalência
mundial estimada em mais de 210 milhões de pessoas infectadas, essa doença
continua sendo um principal fator de morbidade em áreas endêmicas. A morbidade
da infecção pelo S. mansoni resulta da resposta imune granulomatosa aos ovos do
parasita, que ficam presos no fígado e intestino do hospedeiro, após serem liberados
por fêmeas fecundadas (Pearce e MacDonald, 2002). O grande impacto da
esquistossomose na relação saúde-doença ocorre devido ao desenvolvimento de
seqüelas não fatais, porém debilitantes, tais como fibrose hepática, obstruções
urinárias hipertensão portal e falência renal resultantes das repetidas infecções em
indivíduos de áreas endêmicas.
Uma vez que os principais danos decorrentes da doença são causados pela
resposta imune do hospedeiro, o entendimento dos mecanismos imunes
desencadeados durante a infecção pelo S. mansoni é a chave para esclarecer a
patogênese da doença e sugerir estratégias para o seu controle. Soma-se a isso o
fato de que até o momento não existem vacinas ou antígenos únicos capazes de
induzir níveis de proteção tão elevados quanto aos alcançados pelo modelo de
vacinação com a cercária irradiada (Minard et al., 1978), sugerindo que o
reconhecimento simultâneo de múltiplos componentes forneceria a chave molecular
apropriada para o completo reconhecimento imune do Schistosoma (Pearce, 2003).
Nesse contexto, tanto a imunidade inata quanto a adaptativa participam da indução
de uma resposta imune contra o parasita. Dessa forma, a caracterização do papel
dos TLRS na patogênese, especialmente na formação e na regulação do granuloma
e na ativação das respostas Th1 inicial e Th2 sucessiva, as quais direcionam
Justificativa
47
importantes mudanças patológicas no fígado e intestino, fornecerá um entendimento
mais profundo da interface dos receptores da imunidade inata e a fisiopatologia da
esquistossomose.
Ademais, os mecanismos efetores de eliminação do parasito em uma infecção
pelo S. mansoni ou no caso de imunidade protetora induzida por vacinação têm
como principal alvo os esquistossômulos. Análises recentes do proteoma e
transcriptoma, somadas com a identificação de novos candidatos vacinais presentes
na superfície do parasita, indicam que o alvo mais importante do Schistosoma é o
seu tegumento. As proteínas localizadas na interface parasita-hospedeiro são
prováveis de estarem relacionadas com os mecanismos de escape da resposta
imune do hospedeiro, bem como de outras adaptações ao parasitismo (Braschi et
al., 2006). Neste contexto, o estudo da ativação de células dendríticas pelo
tegumento do esquistossômulo de S. mansoni e do papel destas células na indução
de resposta imunológica adquirida fornecerá conhecimentos importantes para o
campo do entendimento da relação parasita-hospedeiro e para o desenvolvimento
de vacinas contra a infecção por este parasito. Ressalta-se que o esquistossômulo é
o primeiro e mais susceptível estágio a entrar em contato com os mecanismos
efetores do sistema imune do hospedeiro e o tipo de resposta imune desenvolvida
inicialmente irá determinar a sobrevivência ou persistência do verme em sua fase
adulta.
OBJETIVOS
Objetivos
49
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar o papel dos receptores do tipo Toll na infecção pelo S. mansoni e na
ativação de células dendríticas expostas ao tegumento do esquistossômulo.
3.2 - Objetivos específicos
1. Avaliar o efeito dos receptores TLR2 e TLR4 e da molécula adaptadora MyD88
na infecção pelo S. mansoni, através da determinação do número total de vermes e
do número de ovos presentes no fígado;
2. Avaliar, o efeito dos receptores TLR2 e TLR4 e da molécula adaptadora
MyD88 na patologia hepática resultante da infecção pelo S. mansoni, através da
determinação da área total e da área de fibrose do granuloma hepático, por análises
morfométricas;
3. Avaliar a produção ex vivo de TNF-, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10, JE/CCL2,
MIP-1/CCL3, RANTES/CCL5 e Eotaxina/CCL11 no tecido hepático de
camundongos C57BL/6 e deficientes em TLR2, TLR4 e MyD88, infectados com o S.
mansoni;
4. Avaliar a produção in vitro e das citocinas TNF-, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13, e IL-
10, em camundongos C57BL/6 e deficientes em TLR2, TLR4 e MyD88, infectados
com o S. mansoni em culturas de esplenócitos, em resposta ao antígeno SEA;
5. Avaliar o efeito da exposição das células dendríticas derivadas da medula
óssea ao tegumento de esquistossômulo do S. mansoni (Smteg), através da análise
da expressão da molécula de ativação MHC-II e de moléculas co-estimuladoras
(CD40 e CD86), por citometria de fluxo;
Objetivos
50
6. Determinar o nível das citocinas IL-12 e TNF-α em células dendríticas
derivadas da medula óssea ativadas pelo Smteg;
7. Avaliar o efeito dos receptores TLR2 e TLR4 e da molécula adaptadora
MyD88, na ativação de células dendríticas e na produção de citocinas por essas
células estimuladas com o Smteg;
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos
52
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Animais e Parasitos
Camundongos C57BL/6 H-2b fêmeas de 6 a 8 semanas de idade, pesando
entre 18-25g, foram adquiridos no Centro de Bioterismo (CEBIO) do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais ou do Biotério Central
do Centro de Pesquisas René Rachou (CpqRR), e mantidos durante todo o
experimento no Biotério do Laboratório de Imunologia de Doenças Infecciosas.
Camundongos nocautes para MyD88, TLR2 e TLR4 (background genético C57/BL6),
de ambos os sexos, foram gentilmente cedidos pelo Dr. Shizu Akira, e mantidos no
Biotério do Laboratório de Imunologia de Doenças Infecciosas. Os experimentos
foram realizados de acordo com os procedimentos éticos, tendo sido avaliados e
aprovados pelo CEUA – Comissão de ética de uso animal, número L0005/8, do
Centro de Pesquisas René Rachou-Fiocruz, Belo Horizonte, MG. O ciclo de vida da
cepa LE (Belo Horizonte, Brasil) do Schistosoma mansoni foi mantido pela
passagem em caramujos Biomphalaria glabrata e camundongos Swiss ou Balb/c no
Centro de Pesquisas René Rachou. As cercárias de S. mansoni, gentilmente
cedidas pelo Centro de Pesquisas René Rachou, foram obtidas pela exposição do
caramujo infectado à luz artificial, por 1h.
4.2 Infecção
Grupos contendo o mínimo de 4 camundongos (WT, MyD88-/-, TLR2-/- e
TLR4-/-) foram infectados com aproximadamente 30 cercárias da cepa LE, por via
percutânea. Cinqüenta dias após a infecção, os animais foram sacrificados e
perfundidos pela veia porta (Pellegrino e Siqueira, 1956). A carga parasitária foi
avaliada através da determinação do número de vermes recuperados e do número
de ovos/g tecido. O fígado foi dividido em três fragmentos que foram separados para
Materiais e Métodos
53
análise histopatológica, determinação do número de ovos e dosagem de citocinas e
quimiocinas. A parte distal do intestino foi retirada para realização do oograma. O
baço foi retirado para cultura de células.
4.3 Oograma
Fragmentos do íleo distal do intestino de todos os animais tiveram as fezes
retiradas. Esses fragmentos foram colocados entre lâmina de vidro e uma lamínula
de plástico. A preparação foi pressionada em uma prensa de ferro. Para a avaliação
qualitativa do oograma, as lâminas foram examinadas em um microscópio de luz a
fim de se verificar a presença e determinar os estádios de desenvolvimento dos
ovos, em cada grupo (Pellegrino e Faria, 1965).
4.4 Contagem do número de ovos no fígado
Fragmentos do fígado de cada animal foram coletados e pesados, após a
perfusão. Esses órgãos foram então digeridos por 18 horas, em KOH 10% à 4ºC e
por 30 minutos no dia seguinte, à 37ºC no banho-maria (Cheever, 1970). Os órgãos
digeridos foram lavados 4 vezes com salina 0,85%. O sedimento foi então
ressuspendido em 1mL de salina 0,85% e número de ovos foi contado com auxílio
de um microscópio de luz. Foram realizadas 3 contagens em amostras de 10
µL/cada. O número absoluto de ovos no fígado foi calculado de acordo com o peso
total do órgão e o resultado expresso como ovos/g de tecido. Para avaliar a
fecundidade, o número de ovos/g de tecido foi dividido pelo número de casais de
vermes.
Materiais e Métodos
54
4.5 Cálculo da área total e área da área de fibrose do granuloma hepático
Fragmentos do lobo maior do fígado foram coletados, fixados em formol
tamponado 10%, desidratados, diafanizados e parafinizados. Secções de 4 m de
espessura foram cortadas e coradas com Tricrômico de Gomori.
Imagens dos granulomas foram visualizadas em um microscópio óptico de luz
(Axiolab Carl Zeiss), utilizando as objetivas de 10X e de 40X, e digitalizados pela
microcâmera JVC TK-1270/RGB. A área total e área de fibrose dos granulomas
foram medidas por análises morfométricas computadorizadas, semi-automáticas,
utilizando o software KS 300, contido no analisador de imagens Kontron
Elektronick/Carl Zeiss, do laboratório de Protozooses, do departamento de Patologia
da UFMG. Para o cálculo da área total, dez granulomas por animal, apresentando
um único ovo central e no estágio exsudativo-produtivo, foram circundados com o
auxílio de um cursor. A área da região circundada foi obtida em m2. Para o cálculo
da área de fibrose, nos mesmos granulomas, os pixels das zonas de colágeno foram
selecionados, através da imagem real, com subseqüente criação de uma imagem
binária e obtenção da área selecionada em m2 (Lopes et al., 2009).
4.6 Extração de citocinas e quimiocinas do tecido
Para análise da produção de citocinas e quimiocinas no tecido hepático, 100
mg do tecido foram pesados. As amostras foram homogeneizadas em um triturador
(Tecnal) na presença de 1 mL de Solução Inibidora de Proteases (PBS, NaCl 0,4 M,
Tween-20 0,05% v/v, Albumina Sérica Bovina 0,5% w/v, Fluoreto de
fenilmetilssulfonila [Sigma] 0,1 mM, Cloreto de Benzetonio [Sigma] 0,1 M, ácido
etilenodiamino tetra-acético [EDTA] 10 mM, Aprotinina [Sigma] 20 UI/mL). Após
trituração, as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm, a 4ºC por 10 minutos. O
sobrenadante foi recuperado para dosagem de citocinas e quimiocinas.
Materiais e Métodos
55
4.7 Cultura e ativação de esplenócitos
Para a cultura de esplenócitos, os baços foram coletados em condições
estéreis e as células foram isoladas por maceração em solução salina. A suspensão
resultante foi centrifugada a 1200 rpm, a 4ºC, por 10 minutos e o sobrenadante foi
desprezado. As células foram então ressuspendidas em 1 mL de tampão ACK
(KHCO3 1% v/v, NH4Cl 8% v/v) e incubadas por 5 minutos, à temperatura ambiente,
para lise osmótica das hemácias. Solução salina em quantidade suficiente para um
volume final de 30 mL foi acrescentada às amostras, seguido de nova centrifugação,
a 1200 rpm, 4ºC, por 10 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi
desprezado e as células foram ressuspendidas em 1 mL de meio RPMI (GIBCO)
suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina 100 U/mL (GIBCO)
e estreptomicina 1 µg/mL (GIBCO). Em seguida, a concentração das células foi
determinada por meio de contagem em câmara de Neubauer.
As células foram cultivadas (1 x 106 células/poço) em microplacas de 96
poços com fundo em U (NUNC) e estimuladas com 25 µg/mL de SEA, 5µg/mL de
Concanavalina A (Sigma) ou com os seguintes agonistas dos TLRS: Pam-3Cys
(1g/mL; Invivogen, San Diego, CA), LPS de E. coli (1g/mL; Invivogen) e Zymosan
(50g/mL; Invivogen). Células não estimuladas foram usadas como controle
negativo. As células foram incubadas à 37ºC e sob atmosfera de 5% de CO2. Os
sobrenadantes foram coletados 24 e 72 horas após incubação, para a quantificação
de citocinas por ELISA.
4.8 Dosagem de citocinas e quimiocinas
Citocinas e quimiocinas foram dosadas nos sobrenadantes da cultura de
esplenócitos e nas amostras do tecido hepático por meio de ELISA sanduíche.
Foram utilizados kits Duoset ELISA (R&D systems) seguindo as recomendações do
Materiais e Métodos
56
fabricante exceto pelo tempo de bloqueio e de incubação das amostras que foram
estendidos para 6 e 16 horas, respectivamente, e foram realizados a 4ºC.
4.9 Obtenção de antígenos
Para a obtenção do tegumento do Schistosoma (Smteg), as cercárias foram
mecanicamente transformadas em esquistossômulos de acordo com a técnica
descrita por Ramalho-Pinto e colaboradores (1974). Brevemente, as cercárias foram
deixadas no gelo por 30 minutos, em tubos cônicos, para reduzir sua movimentação.
Em seguida, foram centrifugadas a 1800 g durante 3 minutos à 4º C. O pellet foi
ressuspendido em 1mL de Earle´s salts plus lactalbumin hydrolysate (ELAC) gelado,
contendo 0,5% de lactoalbumina (Sigma) suplementado com 0,17% de glicose e 1%
de penicilina/streptomicina e transferidas para um tubo cônico. As caudas foram
quebradas por agitação no vórtex na velocidade máxima, durante uma etapa de 2
minutos. Posteriormente, as caudas foram retiradas do meio através de repetidas
lavagens com ELAC. Os esquistossômulos obtidos foram então incubados por
noventa minutos, à 37º C, em ELAC e posteriormente lavados com salina fisiológica
apirogênica. Para remoção do tegumento, os esquistossômulos foram agitados no
vórtex, na velocidade 3, durante duas etapas de 8 minutos em uma solução de
CaCl2 0,3M (Bennet e Seed, 1977). O material liberdado foi centrifugado a 900g,
durante 1 minuto. O sobrenadante foi coletado, agrupado e posteriormente
centrifugado a 50.000g, durante 1 hora a 4ºC. O pellet, enriquecido em membranas,
foi submetido à diálise contra 6L de salina fisiológica 1,7%, com duas trocas.
Procedeu-se a esterilização pela exposição à radiação ultravioleta durante 1 hora.
Este material foi denominado Smteg. A ocorrência ambiental de endotoxina no
Smteg foi avaliada através do ensaio de LAL – Limulus amebocyte lysate, com
bloqueadores de β-glicanos. Este ensaio foi realizado pela companhia Profos
Materiais e Métodos
57
(Regensburg, Alemanha). A quantidade de endotoxina encontrada na amostra foi de
0,178 unidades de endotoxina/µg de proteína.
4.10 Diferenciação das células dendríticas in vitro
As células dendríticas foram diferenciadas a partir de células da medula óssea
de camundongos de quatro a doze semanas do tipo selvagem (WT) e deficientes na
expressão de MyD88, TLR2 e TLR4 com background de C57BL/6, de acordo com
Lutz e colaboradores (1999), modificado. Em resumo, as células indiferenciadas,
foram assepticamente coletadas da medula óssea do fêmur e tíbia dos
camundongos e lavadas com 20 mL de HBSS (Hank´s balanced salt solution -
GIBCO), com o auxílio de uma agulha de 26G1/2. Em seguida, um total de 1 x 107
células foram cultivadas em 7 mL de meio DMEM, suplementado com 10% de soro
fetal bovino inativado (Hyclone, Logan, UT), 100u/mL de penicilina e 100g/mL de
estreptomicina (GIBCO), por 10 dias, em placas de petri de 100 mm2, à 37ºC e 5%
de CO2, na presença de aproximadamente 20ng/mL de GM-CSF murina
recombinante. No dia 3, 7 mL de meio completo, contendo GM-CSF, foi adicionado
às placas e nos dias 6 e 8, 5 mL de meio foi removido e substituído por meio
completo novo, contendo GM-CSF.
4.11 Maturação das células dendríticas
As células dendríticas imaturas, não aderentes, foram coletadas no décimo
dia de cultura e ajustadas para 3 x 105 células por poço, em DMEM contendo 10%
de soro fetal bovino inativado (SFB), 100u/mL de penicilina, 100g/mL de
estreptomicina e 20ng/mL de GM-CSF. As células foram incubadas em placas de
cultura de 96 poços (nunc), por 24 horas, na presença de meio, 25 g/mL de Smteg,
ou dos seguintes agonistas dos TLRs: Pam-3Cys (1g/mL; Invivogen, San Diego,
Materiais e Métodos
58
CA) e LPS de E. coli (1g/mL; Invivogen) à 37º C e 5% de CO2. Como o objetivo de
controlar a contaminação por endotoxina no Smteg (0,178 unidades de
endotoxina/µg de proteína), um grupo adicional, contendo LPS de E. coli, na
concentração equivalente à detectada no Smteg, foi utilizado para estimular as DCs.
Os sobrenadantes das culturas foram coletados 24 horas após a adição dos
estímulos, para dosagem de TNF-α e IL-12p40 (R&D Systems). As células foram
coletadas em meio para análises por citometria de fluxo.
4.12 Análise da expressão de moléculas de superfície em células dendríticas
estimuladas
Para a análise da expressão de marcadores de superfície nas DCs
estimuladas, as células foram lavadas em PBS 0,15M (SIGMA) e bloqueadas com
anticorpo bloqueador de receptores FcII/III (CD16/32) (BD-Pharmigen; Fc-block
clone 2.4G2), para evitar marcações inespecíficas. Após 20 minutos de incubação a
4ºC, as células foram lavadas e marcadas com os seguintes anticorpos, anti-
camundongo: CD11c FITC (eBiosciences, clone N418), MHCII PE (BD-Pharmigen,
clone AF6-120.1) e CD40 ( BD-Pharmigen, clone 3/23) ou CD86 (BD-Pharmigen,
clone GL1) conjugados a biotina, juntamente com seus respectivos controles de
isotipo. Os anticorpos foram diluídos em solução de diluição de anticorpos (PBS
0.15M, 0,5%BSA, 2mM NaN3). Após adição dos anticorpos, a placa foi incubada no
escuro, à 4º C por 20 minutos, lavada com PBS/Azida e incubada com 20l de uma
solução de estreptoavidina (SA-PE-Cy5, BD-Pharmigen,1:200) por 20 minutos, a 4º
C, protegida da luz. Após este tempo de incubação, as células foram lavadas duas
vezes e fixadas com paraformolaldeído 2% (SIGMA). 50 mil eventos foram
adquiridos através de um citômetro de fluxo (FACS) (FACSscan – Becton &
Materiais e Métodos
59
Dickison, CA). Os resultados foram analisados no Software FlowJo (Tree Star Inc.
Ashland, EUA).
4.13 Análises estatísticas
Os dados foram analisados no programa GraphPad Prism versão 5.00. O
teste t de student foi utilizado para comparar amostras independentes, entre dois
grupos. Para comparação de amostras independentes entre mais de dois grupos foi
utilizado o teste ANOVA, com o pós-teste de Dunnet. O intervalo de confiança foi
fixado em 95% e as diferenças consideradas significativas para p<0,05. Os
resultados foram expressos como média ± desvio padrão.
RESULTADOS
Resultados
61
5. RESULTADOS
I – O PAPEL DOS TLRs DURANTE A INFECÇÃO PELO S. MANSONI
Para avaliar se os TLRs possuíam algum papel na infecção experimental pelo
S. mansoni, camundongos selvagens C57BL/6 e deficientes em MyD88, TLR2 ou
TLR4 foram infectados e as mudanças parasitológicas, patológicas e imunológicas
decorrentes da infecção foram analisadas.
5.1 Recuperação de vermes adultos
Para investigar se ocorriam diferenças com relação à carga parasitária
durante a infecção pelo Schistosoma em animais deficientes para os receptores
TLRs, os seguintes parâmetros foram avaliados: número total de vermes e número
de ovos presos no fígado dos animais. Como demonstrado na Tabela 1, não houve
diferença no número de vermes recuperados entre os animais WT e KO.
Tabela 1: Recuperação de vermes adultos
Vermes/animal C57BL/6 MyD88-/- TLR2-/- TLR4-/-
1o experimento
23±6.8 15.3±1.7 17.6±8.7 16±6.4
2o experimento
19.2±5.6 14.4±2.7 15.3±2.1 19.8±4.2
Os valores representam média ± SD do número de vermes recuperados (mínimo de 4
animais por grupo).
Resultados
62
Outro parâmetro parasitológico avaliado para determinar a carga parasitária
foi o número de ovos presos no fígado, uma vez que este é o principal sítio de
acúmulo de ovos depositados pelo Schistosoma. Para isso, o fígado de cada animal
foi coletado, pesado e digerido com KOH. O número de ovos foi contado e corrigido
para o peso do órgão. Foi observada uma redução significativa no número de ovos
depositados no fígado de animais TLR2-/- (p<0,05), quando comparados com o
controle WT. Por outro lado, não foram observadas diferenças entre os grupos WT e
MyD88-/- ou TLR4-/- (Figura 7 A).
Para avaliar se a redução no número de ovos encontrados nos tecidos dos
animais era resultado de uma redução na fecundidade da fêmea, o número de
ovos/órgão/casal de vermes foi calculado. Os resultados demonstraram que houve
uma redução na postura de ovos por fêmea no fígado, em animais TLR2-/- quando
comparados com os WT (p<0,05) (Figura 7 B). Dessa forma, pode-se concluir que o
reconhecimento de moléculas do parasita via TLR2 está relacionado com a
fecundidade da fêmea do Schistosoma, uma vez que em animais deficientes para
esse receptor há uma redução significativa no número de ovos encontrados no
fígado.
A
WT MyD88
-/-TLR2
-/-TLR4
-/-0
50
100
150
*
ovo
s/g
fíg
ad
o (
10³)
Resultados
63
B
WT MyD88
-/-TLR2
-/-TLR4
-/-0
5
10
15
20
*
ov
os
/g f
íga
do
/ca
sa
l v
erm
es
(1
0³)
Figura 7: Redução da fecundidade e do número de ovos no fígado, na ausência de
TLR2. O fígado de cada animal foi digerido com KOH e o número de ovos foi contado e
corrigido para o peso do órgão. (A) O resultado representa a média ± SD do número de
ovos. (B) média ± SD do número de ovos por grama de órgão por casal de vermes. Um
gráfico representativo de dois experimentos independentes (mínimo de 4 animais por grupo).
Diferenças estatisticamente significativas entre os grupos KO e WT estão representadas por
um * (p< 0,05).
Para avaliar se redução na fecundidade representava apenas uma pausa na
postura de ovos, foi realizado o oograma. Para isso, a parte distal do intestino
delgado foi retirada durante a perfusão para observar os estádios de
desenvolvimento dos ovos na parede do intestino, pela visualização de lâminas no
microscópio. Não foram observadas mudanças na cinética da ovoposição uma vez
que ovos de primeiro, segundo, terceiro e quarto estádios, além de ovos maduros e
mortos, foram encontrados em todos os grupos estudados (dados não mostrados).
Esses resultados indicam que não houve alteração no desenvolvimento dos ovos
nos animais KO, comparados com o WT.
Resultados
64
5.2 Análises histopatológicas
Para caracterização da resposta patológica nos animais KO a área do
granuloma e a área de fibrose foram analisadas em cortes histológicos do fígado,
corados com Tricrômico de Gomori.
Para verificar se ocorriam alterações na área do granuloma hepático, 10
granulomas/ camundongo no estágio exsudativo-produtivo, com um ovo central e
miracídio vivo, totalizando 100 granulomas por grupo, foram medidos. A Figura 8 (A)
demonstra imagens representativas dos granulomas individuais/animal. Os
granulomas hepáticos induzidos pelos ovos de S. mansoni foram menores em
animais MyD88-/- e TLR2-/- quando comparados com os granulomas desenvolvidos
nos animais WT (p<0,05) (Figura 8 B). Porém, não foram encontradas diferenças no
tamanho do granuloma entre os animais deficientes em TLR4 com relação ao WT
(Figura 8 B).
Para averiguar se a redução na área do granuloma hepático estava
correlacionada com a deposição de colágeno, a área de fibrose dos mesmos
granulomas foi avaliada por morfometria. Não foi observada nenhuma diferença
significativa entre a área de fibrose dos granulomas de camundongos WT e MyD88-/-
TLR2-/- ou TLR4-/- (figura 8 C).
Resultados
65
A
B
WT MyD88
-/-TLR2
-/-TLR4
-/-0
2000
4000
6000
8000
**
Áre
a d
o g
ran
ulo
ma/f
ígad
o (
m2)
A1 A2
1
A3
1
A4
1
Resultados
66
C
WT MyD88
-/-TLR2
-/-TLR4
-/-0
10000
20000
30000
40000
áre
a d
e f
ibro
se (
um
²)
Figura 8: Área do granuloma e área de fibrose (A) Fotomicrografias representativas
dos granulomas no estágio exsudativo-produtivo observados em animais WT (A1), MyD88-/-
(A2), TLR2-/- (A3) e TLR4-/- (A4), corados com Tricrômico de Gomori (100 X). Imagens dos
granulomas foram analisadas por morfometria, em cortes histológicos do fígado de
camundongos infectados. (B) Representa o tamanho médio de 100 granulomas por grupo.
(C) A área de fibrose foi avaliada nos mesmos granulomas em (B). Os gráficos representam
a média ± desvio padrão de dois experimentos independentes, contendo um total de 10
animais por grupo. Diferenças estatisticamente significativas entre animais WT e KO estão
denotadas por um * (p< 0,05).
5.3 Análises Imunológicas
Uma vez que a formação do granuloma está diretamente relacionada com a
resposta imunde do hospedeiro, os parâmetros imunológicos foram então avaliados.
Em primeiro lugar, os níveis de citocinas e quimiocinas foram quantificados por
dosagem ex vivo em homogenatos do tecido hepático. Correlacionando-se com a
menor área do granuloma em animais MyD88-/-, foi encontrada uma redução na
produção das quimiocinas CCL5 e CCL11 (Figura 9 A e B). Também foi vista uma
redução na produção de CCL11 nos animais TLR2-/-. Entretanto, não foram
Resultados
67
observadas diferenças significativas com relação à produção de CCL2 e CCL3 entre
esses grupos e nem entre animais WT e TLR4-/- (Figura 9 C e D).
WT MyD88-/-
TLR2-/-
TLR4-/-
0
1000
2000
3000
**
A
CC
L5 (
pg
/mL
)
WT MyD88-/-
TLR2-/-
TLR4-/-
0
500
1000
1500
2000
2500
** **
B
CC
L11 (
pg
/mL
)
WT MyD88-/- TLR2-/- TLR4-/-0
100
200
300
400
500
C
CC
L3 (
pg
/mL
)
WT MyD88-/-
TLR2-/-
TLR4-/-
0
200
400
600
800
D
CC
L2
(pg
/mL
)
Figura 9: Redução na produção de quimiocinas em MyD88-/- e TLR2-/-. Amostras
individuais do fígado de animais WT e KO foram pesadas e homogeneizadas. Os níveis de
CCL5 (A), CCL11 (B), CCL3 (C) e CCL2 (D) foram quantificados por ELISA. Um gráfico
representativo da média ± desvio padrão de dois experimentos independentes, contendo o
mínimo de 4 animais por grupo. Diferenças estatisticamente significativas entre animais WT
e KO estão denotadas por um * (p< 0,05).
Resultados
68
Com relação à produção de citocinas no tecido hepático, houve uma redução
significativa na produção de IL-5 somente em células de animais MyD88-/- (p<0,05)
(Figura 10 A). Porém, não foram observadas diferenças significativas com relação à
produção de IL-4, IL-13, IL-10 ou IFN-γ entre os animais WT e KO (dados não
mostrados).
Por fim, o padrão da resposta imunológica sistêmica foi avaliado em animais
WT ou KO, 50 dias após a infecção. Para isso, o baço dos animais foi removido no
dia da perfusão e a produção de citocinas foi analisada em resposta a SEA em
cultura de esplenócitos, por 24 ou 72h. Conforme demonstrado na Figura 10, houve
uma redução significativa na produção de IL-5 em células de animais MyD88-/-
quando comparados com os animais WT (p<0,05). Porém, não foram observadas
diferenças significativas com relação à produção dessa citocina entre os animais WT
e TLR2-/- ou TLR4-/- (Figura 10 B). Além disso, não foi observada nenhuma diferença
estatisticamente significativa na produção de IL-13, IL-4, IFN-γ ou TNF-α entre os
animais WT e KO (dados não mostrados).
Resultados
69
A
WT MyD88
-/-TLR2
-/-TLR4
-/-0
20
40
60
80
100
*IL
-5
(pg
/mL
)
B
SEA
0
500
1000
1500
WT
MyD88-/-
TLR2-/-
TLR4-/-
#
IL-5
(p
g/m
L)
Figura 10: Redução na produção de IL-5 em MyD88-/-. A produção de IL-5 foi quantificada
por ELISA em amostras do fígado de animais WT e KO, ex vivo (A) e in vitro, em cultura de
esplenócitos de animais WT e KO infectados, re-estimulados com SEA, após 72h (B). A
linha tracejada representa os níveis detectados nas células não estimuladas. Um gráfico
representativo da média ± desvio padrão de dois experimentos independentes, contendo 5
animais por grupo. Diferenças estatisticamente significativas entre animais WT e KO estão
denotadas por um * (p< 0,05).
*
Resultados
70
II – O PAPEL DOS RECEPTORES TLRs NA ATIVAÇÃO DE DCs EXPOSTAS AO
SMTEG
Diante dos resultados obtidos relativos à participação de MyD88 na infecção
pelo Schistosoma, partimos para avaliar o papel dessa via de sinalização, bem como
dos TLRs em um modelo de ativação de céluas dendríticas in vitro, tendo como alvo
o tegumento do esquistossômulo.
5.4 Smteg induz a maturação das células dendríticas
A fim de determinar se o tegumento do esquistossômulo possuía
propriedades de estimular o sistema imune inato, o Smteg foi avaliado pela sua
capacidade de induzir o aumento da expressão de moléculas co-estimuladoras e
produção de citocinas pró-inflamatórias em DCs. Para isso, células derivadas da
medula óssea foram diferenciadas em DCs e cultivadas na presença de meio
sozinho ou expostas ao Smteg ou LPS de E.coli, por 24 horas. As DCs foram
analisadas por citometria de fluxo e selecionadas de acordo com a expressão de
CD11c e MHCIIhigh. A capacidade de aumentar a expressão de CD40 e CD86 foi
analisada dentro dessa população.
As análises por citometria de fluxo (FACS) indicaram que tanto as DCs
estimuladas com Smteg, quanto com LPS, foram capazes de aumentar
significativamente a expressão de CD40 e de CD86 (p<0,05), quando comparadas
com as DCs não estimuladas (Figura 11). Esses resultados demonstram que tanto o
Smteg quanto o LPS foram capazes de induzir a maturação das BMDCs.
Resultados
71
Medium SmTeg LPS0
50
100
150
**
B
MF
I C
D40
Medium SmTeg LPS0
50
100
150
**
MF
I C
D86
Figura 11: Smteg induz o aumento da expressão de CD40 e CD86 em DCs. Células
dendríticas imaturas (dia 10 de diferenciação) foram estimuladas com meio, LPS de E. coli
(1µg/mL) ou Smteg (25 µg/mL), por 24h. A expressão das moléculas de superfície CD40 e
CD86 foi avaliada por citometria de fluxo. (A) Histogramas vazios representam a
fluorescência detectada nas DCs marcadas e não estimuladas; histogramas cheios
representam a fluorescência detectada nas DCs marcadas e estimuladas com Smteg ou
LPS. Um histograma representativo de 12. Os números indicam os valores referentes à
intensidade média de fluorescência (MFI). (B) os gráficos representam os valores de MFI de
CD40 ou CD86 detectados nas células não estimuladas (barras brancas) e estimuladas com
Smteg (barras cinzas) ou LPS (barras pretas). Os dados representam a média ± SD de três
experimentos independentes, com 4 animais cada. Diferenças estatisticamente significativas
em relação ao controle não estimulado estão denotadas por um * (p< 0,05).
A
Resultados
72
5.5 Smteg é capaz de induzir a produção de IL-12 e TNF-α
Em seguida, foi verificada a capacidade das DCs estimuladas com o Smteg
em produzir citocinas. Para isso, os sobrenadantes das culturas de BMDCs foram
coletados 24h após o estímulo com Smteg ou LPS. O Smteg foi capaz de induzir a
produção de níveis significativos das citocinas pró-inflamatórias IL-12p40 (p <0,05) e
TNF-α (p<0,001) pelas DCs estimuladas, em níveis similares aos detectados pela
clássica ativação com o LPS (Figura 12 A e B).
Análises para a quantificação de endotoxina contaminante presente no
Smteg, utilizando o método de detecção LAL, revelaram que a preparação continha
baixos níveis de contaminação por endotoxina. A adição de LPS sozinho, na
quantidade equivalente a encontrada no Smteg, às DCs, não foi capaz de induzir a
ativação e nem a produção de citocinas nas DCs, in vitro. Dessa maneira, pode-se
concluir que o Smteg e não a contaminação com o LPS foi capaz de induzir a
produção de IL-12 e TNF-α.
medium Smteg LPS0
10000
20000
30000
40000
*
*
A
IL
-12p
40 (
pg
/mL
)
medium Smteg LPS0
1000
2000
3000
*
*
B
T
NF
-
(p
g/m
L)
Figura 12: O Smteg estimula a produção de citocinas pelas DCs. Os níveis de (A) IL-
12p40 e (B) TNF-α foram quantificados nos sobrenadantes das culturas, por ELISA, após
24h de estimulação. O Smteg induziu tanto a produção de IL-12 (p<0,05) quanto de TNF-α
(p<0,001). Dados representativos da média ± SD de três experimentos independentes, com
4 animais cada. Diferenças estatisticamente significativas entre células estimuladas células
não estimuladas estão denotadas por um * (p< 0,05).
Resultados
73
5.6 A Maturação de células dendríticas não é dependente da molécula MyD88
Como o tegumento do esquistossômulo foi capaz de induzir a maturação e a
produção de citocinas inflamatórias pelas células dendríticas, a próxima questão foi
determinar se essa ativação era dependente da via de sinalização dos TLRs. Como
MyD88 é uma molécula adaptadora chave na sinalização dos TLRs (Kaisho e Akira,
2001), e também é importante para a indução de imunidade celular, verificamos seu
papel na ativação das DCs induzida pelo Smteg. Para isso, BMDCs provenientes de
camundongos selvagens e MyD88-/- foram estimuladas com Smteg e o estado de
maturação foi avaliado pela expressão de CD40 e CD86.
Como esperado, a indução da expressão de moléculas co-estimulatórias pelo
LPS ocorre por uma via de transdução de sinal independente de MyD88 (Kaisho et
al., 2001). Da mesma forma, a ativação das DCs induzida pelo Smteg também não
foi dependente de MyD88, uma vez que DCs de camundongos MyD88-/- foram
capazes de aumentar a expressão de CD40 e CD86 em resposta ao Smteg (Figura
13 A e B).
A
Resultados
74
medium Smteg LPS 0
50
100
150C57BL/6
MyD88-/-
* **
*
BM
FI
CD
40
medium Smteg LPS 0
50
100
150 C57BL/6
MyD88-/-
***
*
MF
I C
D86
Figura 13: A ativação das DCs induzida pelo Smteg não é dependente de MyD88.
Células dendríticas imaturas (dia 10 de diferenciação) de camundongos WT ou MyD88−/−
foram estimuladas com meio, LPS E. coli (1µg/mL) ou Smteg (25 µg/mL), por 24h. A
expressão das moléculas de superfície CD40 e CD86 foi avaliada por citometria de fluxo. (A)
Histogramas vazios representam a fluorescência detectada nas DCs marcadas e não
estimuladas; histogramas cheios representam a fluorescência detectada nas DCs marcadas
e estimuladas com Smteg ou LPS. Um histograma representativo de 12. Os números
indicam os valores referentes à intensidade média de fluorescência (MFI). (B) os gráficos
representam os valores de MFI de CD40 ou CD86 detectados nas células de camundongos
WT (barras brancas) ou MyD88−/−(barras pretas) não estimuladas e estimuladas com Smteg
ou LPS. Os dados representam a média ± SD de três experimentos independentes.
Diferenças estatisticamente significativas entre células estimuladas com Smteg ou LPS e
células não estimuladas estão denotadas por um * (p< 0,05).
5.7 A produção de IL-12 e TNF-α é dependente de MyD88
Em seguida, verificamos se o perfil da produção de citocinas por células
dendríticas derivadas de camundongos MyD88-/- estimuladas com o tegumento do
esquistossômulo era dependente da molécula adaptadora MyD88. Como esperado,
a produção de IL-12p40 e TNF- (p<0,05) foi significativamente reduzida em DCs de
camundongos MyD88-/- estimuladas com LPS. Da mesma forma, DCs de
camundongos MyD88-/- estimuladas com Smteg tiveram uma redução significativa
Resultados
75
na produção de IL-12 e TNF- (p<0,05). Esses resultados indicam que a via de
sinalização dos TLRs está envolvida na produção de citocinas pró-inflamatórias
pelas DCs, induzida pelo Smteg (Figura 14 A e B).
medium Smteg LPS
0
20000
40000
60000C57BL/6
MyD88-/-
# #
*
*
AIL
-12p
40 (
pg
/mL
)
medium Smteg LPS 0
1000
2000
3000 C57BL/6
MyD88-/-
#
#
*
*
B
T
NF
-
(p
g/m
L)
Figura 14: MyD88 é necessário para a produção de citocinas induzida pelo Smteg . Os
níveis de (A) IL-12p40 e (B) TNF-α foram dosados por ELISA nos sobrenadantes das
culturas, após 24h de estimulação. Dados representativos da média ± SD de três
experimentos independentes, com 4 animais cada. Diferenças estatisticamente significativas
entre células estimuladas com Smteg ou LPS e células não estimuladas estão denotadas
por um *, e entre WT e MyD88-/-, por um # (p< 0,05).
Resultados
76
5.8 TLR4, mas não TLR2, é necessário para a produção citocinas pró-
inflamatórias induzida pelo Smteg
Estudos recentes sugerem que TLR2 e TLR4 estão envolvidos no
reconhecimento de diversos antígenos de helmintos por DCs e macrófagos (van der
Kleij et al., 2002; Thomas et al., 2003; Aksoy et al., 2005; Jenkins et al., 2005;
Goodridge et al., 2005). Deste modo, uma vez que a via de sinalização dependente
de MyD88 está envolvida na produção de citocinas pró-inflamatórias pelas DCs
induzida pelo Smteg , decidimos verificar qual TLR participava desse processo.
Assim, DCs imaturas provenientes de camundongos selvagens e deficientes em
TLR2 e TLR4 foram estimuladas, por 24 horas, com Smteg ou com os agonistas dos
TLRs: Pam-3Cys e LPS de E. coli e a produção de citocinas pelas DCs estimuladas
foi então avaliada. Os níveis de IL-12 e TNF-α não foram alterados em células de
camundongos TLR2-/- (Figura 11 A e B). Porém, DCs provenientes de camundongos
TLR4-/- produziram quantidades significativamente menores de IL-12 (Figura 15 A) e
TNF-α (Figura 15 B) do que as células de camundongos selvagens (p<0,05). Esses
dados indicam que o TLR4 é necessário para a produção de citocinas pró-
inflamatórias induzida pelo Smteg.
Resultados
77
medium Smteg LPS PAM3Cys0
10000
20000
30000
40000
50000 C57BL/6
TLR2-/-
TLR4-/-
## #
*
*
** * *
A I
L-1
2p
40 (
pg
/mL
)
medium Smteg LPS PAM3Cys0
1000
2000
3000
4000 C57BL/6
TLR2-/-
TLR4-/-
# # ##
*
**
**
*
B
TN
F-
(p
g/m
L)
Figura 15: A produção de IL-12 e TNF-α pelas DCs estimuladas com o Smteg é
dependente de TLR4. BMDCs imaturas, provenientes de camundongos C57BL/6, TLR2-/- e
TLR4-/- foram estimuladas in vitro com Smteg (25µg/mL) ou com os devidos agonistas de
TLRs: Pam-3Cys (1µg/mL) e LPS (1µg/mL). Os níveis de (A) IL-12p40 e (B) TNF-α foram
dosados por ELISA nos sobrenadantes das culturas, após 24h de estimulação. Dados
representativos da média ± SD de dois experimentos independentes. Diferenças
estatisticamente significativas entre células estimuladas com Smteg ou LPS e células não
estimuladas estão denotadas por um *, e entre WT e animais KO por um # (p< 0,05).
DISCUSSÃO
Discussão
79
6. DISCUSSÃO
A infecção pelo Schistosoma representa um complexo desafio para o sistema
imune do hospedeiro. A indução de uma resposta imune contra o parasita envolve
tanto a imunidade inata quanto a adaptativa. As células apresentadoras de
antígenos, tais como as células dendríticas, reconhecem os componentes do
Schistosoma via seus receptores da imunidade inata e são então capazes de
fornecer os sinais apropriados para a ativação das células T. Embora o Schistosoma
tenha desenvolvido habilidosos mecanismos de escape do sistema imune do
hospedeiro, os TLRs são capazes de reconhecer componentes do parasita
(Venugopal et al., 2009). Porém, a participação desse reconhecimento durante o
curso da infecção in vivo não está claramente definido.
Esse estudo in vivo demonstrou que a ausência de MyD88, TLR2 ou TLR4
não influenciaram a capacidade de sobrevivência do parasita no hospedeiro, uma
vez que não houveram diferenças significativas no número de vermes recuperados
entre os grupos (Tabela 1). A relação entre o Schistosoma e seu hospedeiro envolve
interações complexas e multifatoriais. O parasita, altamente adaptado a viver por
longos períodos em íntimo contato com seu hospedeiro, precisa de fatores e sinais
dele para se desenvolver e ao mesmo tempo interfere com a resposta imune do
hospedeiro. De fato, análises genômicas funcionais recentes indicam que os vermes
codificam um painel de receptores, similares aos dos mamíferos, para os hormônios
esteróides e da tireóide, assim como para fatores de crescimento e citocinas (Mann
et al., 2008; Han et al., 2009). Isso implica que o Schistosoma poderia aceitar sinais
hormonais e de citocinas do hospedeiro para proliferação celular, desenvolvimento,
cópula e reprodução, além de responder aos hormônios endógenos endócrinos do
próprio parasita (de Mendonça et al., 2000). Um exemplo disso está no fato de que o
Discussão
80
Schistosoma depende do sistema imune do hospedeiro para se desenvolver e
produzir ovos, uma vez que em animais depletados de linfócitos T CD4+ os vermes
possuem o desenvolvimento atenuado, acompanhado por uma redução dramática
no acúmulo de ovos no fígado. Essa redução é atribuída tanto à diminuição na
produção de ovos quanto ao atraso na ovoposição (Davies et al., 2001). Em adição,
infecções realizadas em camundongos que possuem defeitos induzidos no sistema
imune bem como em camundongos NUDE e SCID (do inglês, severe combined
immune deficience), portadores de imunodeficiência grave, demonstraram que a
produção e a excreção de ovos estão reduzidas nesses animais (Amiri et al., 1992;
Harrison e Doenhoff, 1983). Posteriormente foi demonstrado que a eliminação dos
ovos está relacionadas com a presença de IgE, TNF-α, IL-7 (Amiri et al., 1992 e
Amiri et al., 1994). Nesse aspecto, é interessante notar que neste trabalho, a
ausência de TLR2 interferiu com a fecundidade do Schistosoma, uma vez que em
animais deficientes nesse receptor houve uma redução na postura de ovos pela
fêmea, com uma significativa redução no acúmulo desses ovos no fígado (Figura 7).
Esses resultados estão de acordo com os dados publicados por Layland et al (2007)
que sugerem que a elevada produção de IFN-γ, resultando numa resposta Th1
dominante, estaria relacionada com a redução no número de ovos. Porém, não
observamos diferenças com relação à produção de IFN-γ entre os grupos, indicando
que talvez a participação de outros mediadores e/ou tipos celulares poderia estar
envolvida.
Os ovos do Schistosoma, que não são excretados, podem ficar presos nos
tecidos, notoriamente no fígado, constituindo-se nos principais responsáveis pela
patologia da esquistossomose devido à formação dos granulomas. Nesse contexto,
nós demonstramos nesse trabalho que através de MyD88 e TLR2 o sistema imune
inato influenciou importantes mudanças patológicas e imunológicas decorrentes da
Discussão
81
infecção. Essa conclusão é baseada nos granulomas menores e na reduzida
produção das quimiocinas CCL5 e CCL11, e de IL-5, tanto in vitro quanto ex vivo,
em animais MyD88-/- (Figuras 8-10). Em adição, a ausência de TLR2 teve efeitos
similares na imunopatologia induzida pelo ovo do Schistosoma, uma vez que os
granulomas desenvolvidos nesses animais foram menores (Figura 8), porém sem
alteração na área de fibrose. Tanto a composição quanto o tamanho do granuloma
são inevitavelmente dependentes da função das células T CD4+, que por sua vez
depende intimamente do estado de ativação e dos sinais estimulatórios fornecidos
pelas APCs com as quais eles interagem (Stadecker, 1999; Hesse et al., 2001).
Essa interação resulta na ativação de células Th, na expressão de moléculas de
adesão e no recrutamento e ativação de leucócitos adicionais, notavelmente os
eosinófilos. Ocorre também a liberação de vários mediadores inflamatórios, dentre
os quais as citocinas e quimiocinas são uma parte fundamental (Stadecker, 1999).
Assim, a redução na produção das quimiocinas CCL5 e CCL11 observada nos
animais MyD88-/- e TLR2-/- poderia estar relacionada com um menor recrutamento
celular, notadamente de eosinófilos, e, portanto, poderia explicar o tamanho reduzido
dos granulomas encontrados nesses animais (Figuras 8 e 9).
A eosinofilia é uma característica proeminte da resposta celular contra o
Schistosoma e os linfócitos T CD4+ produtores de IL-5 desempenham um papel
fundamental na resposta contra os ovos do parasita (Scott et al., 1989). De acordo
com essa idéia, camundongos deficientes para IL-5 e/ou CCL11/eotaxina têm a
eosinifilia tecidual praticamente abolida, associada a uma reduzida produção da
citocina pró-fibrótica IL-13, por células CD4+ Th2 (Rothenberg e Hogan, 2006).
Nesse aspecto, é interessante notar que na ausência de MyD88 as células desses
animais responderam in vitro e ex vivo com menor produção de IL-5, indicando uma
redução na resposta Th2 (Figura 10). Esses resultados estão de acordo com a idéia
Discussão
82
de que a polarização da resposta para o tipo Th2 no modelo murino induz o
desenvolvimento de granulomas grandes e ricos em eosinófilos (Hoffmann et al.,
2000).
Assim, diante desses resultados poderíamos sugerir que na ausência de
MyD88 a resposta dos linfócitos Th2 estaria defeituosa, devido a menor produção de
IL-5 e CCL11, resultando no menor recrutamento e ativação dos eosinófilos para o
granuloma. Contudo, apesar do bloqueio da IL-5 por tratamento com anticorpos
resultar em uma significativa redução nos níveis de eosinófilos no granuloma, seu
efeito é apenas minoritário no tamanho total das lesões (Scott et al., 1989; Sher et
al., 1990). Dessa forma, a participação de outros fatores na regulação do granuloma
e da inflamação, incluíndo as células Treg ou Th17 não deve ser descartada. Um
mecanismo aparente utilizado pelas células Th17 para causar patologia é atraves do
recrutamento de granulócitos, que, no caso do granuloma esquistossomótico, inclui
os eosinófilos (Rutitzky e Stadecker, 2006). Além disso, dados recentes demonstram
que em animais deficientes em IL-23, uma citocina importante para diferenciação do
subtipo Th17, a resposta celular inflamatória, bem como o tamanho dos granulomas,
estão bastante reduzidas, implicando um papel importante desse subtipo celular no
controle da patologia da doença (Rutitzky et al., 2008). A presença e função de
células Treg ou Th17 estão atualmente sendo investigados.
Após a investigação in vivo do papel dos TLRs no desenvolvimento da
infecção pelo Schistosoma, partimos para avaliar o papel desses receptores in vitro,
num modelo de ativação de DCs. Já está claramente estabelecido que alguns
patógenos e seus produtos, incluindo LPS e CpG, são capazes de ativar DCs
resultando em um fenótipo definido capaz de direcionar respostas Th1 polarizadas
(de Jong et al., 2002; Sher et al., 2003). Entretanto, está cada vez mais claro que
produtos não convencionais de patógenos podem ativar as DCs de uma forma
Discussão
83
diferencial e resultar em fenótipos de maturação alternativos (Perona-wright et al.,
2006). Nesse contexto, dados emergentes têm demonstrado que componentes
derivados de helmintos, incluindo moléculas do Schistosoma, podem interagir com
APCs via PRRs, especialmente TLRs e Lecitinas do tipo C (Thomas et al., 2003;
Jenkins et al., 2005; van Leimpt et al., 2007). Através do reconhecimento via TLRs,
as DCs são capazes de responder a organismos estranhos através de uma série de
eventos que ligam a imunidade inata à adaptativa (Reis e Sousa, 2004). Devido ao
papel central das DCs na interface parasita-hospedeiro, e no fato de que o
esquistossômulo é o estágio de vida do parasita mais susceptível ao ataque pelo
sistema imune do hospedeiro, nós avaliamos a capacidade do tegumento do
esquistossômulo do S. mansoni em induzir a maturação das DCs. Neste trabalho
nós demonstramos que o Smteg é reconhecido pelas DCs e induz o aumento da
expressão das moléculas co-estimulatórias CD40 e CD86 (Figura 11) e a produção
de IL-12 e TNF-α in vitro (Figura 12). Dessa forma, esses resultados demonstram a
capacidade do Smteg em induzir a ativação das DCs.
Durante a infecção pelo S.mansoni, os eventos iniciais que ocorrem na pele
após a exposição às cercárias são vitais para guiar a forma e a magnitude da
resposta imune adquirida subseqüente e a conseqüente indução de proteção e/ou
patologia. Seguido da infecção, os esquistossômulos interagem intimamente com as
APCs na pele do hospedeiro, especialmente as DCs (Riengrojpitak et al., 1998). No
modelo de vacinação com a cercária irradiada (RA) os altos níveis de resistência
imunológica contra a infecção estão associados ao influxo de uma grande
quantidade de APCs na pele do hospedeiro aliada à produção de citocinas pró-
inflamatórias tais como IL-12, TNF-α, IL-1 e IL-6 (Hewitson et al., 2005; Hogg et al.,
2003b). No modelo murino, esse padrão de resposta imune está relacionado à
proteção, uma vez que a administração de IL-12 recombinante aumenta a imunidade
Discussão
84
protetora induzida pela larva atenuada e também por outros antígenos do S.
mansoni (Anderson et al., 1998; Mountford et al., 1996; Fonseca et al., 2004). Além
disso, camundongos IL-12p40-/- vacinados possuem reduzidos níveis de proteção
contra a infecção pelo S. mansoni e que podem ser restabelecidos pela
administração intradérmica de IL-12 recombinante (Anderson et al., 1998). Ainda, em
humanos, a ativação predominante de células Th1 por antígenos do
esquistossômulo estão relacionados a proteção naturalmente adquirida em
indivíduos naturalmente resistentes a infecção (Correa-Oliveira et al., 2000). Uma
vez que as DCs expostas ao Smteg são capazes de aumentar a expressão de
moléculas co-estimulatórias e produzir tanto IL-12 quanto TNF-α, é provável que
essas células direcionem respostas do tipo Th1 contra os antígenos do tegumento
do esquistossômulo.
A capacidade do Smteg em induzir a produção de IL-12 e TNF-α pelas DCs
pode ser devido à presença de uma grande variedade de antígenos no tegumento
do esquistossômulo. De fato, as secreções produzidas pela larva do Schistosoma
também induzem a produção de IL-12 e TNF-α tanto por DCs quanto macrófagos
(Jenkings et al., 2005 e Jenkings e Mountford, 2005). Está claro agora que esses
antígenos invocam respostas celulares através da interação com lecitinas e PRRs
(Van Die et al., 2003; van den Berg et al., 2004; Thomas et al., 2003). Assim, o
Smteg, uma estrutura derivada de patógeno que hipoteticamente contém PAMPs
pode perfeitamente interagir com um ou mais TLRs. A observação de que DCs
derivadas de camundongos MyD88-/- e estimuladas pelo Smteg não foram capazes
de produzir IL-12 ou TNF-α indica que a via de sinalização estimulada pelo Smteg
ocorre através do recrutamento da molécula adaptadora MyD88 (Figura 14),
sugerindo que os TLRs participam do reconhecimento do Smteg pelas DCs. Com o
objetivo de investigar essa hipótese, nós avaliamos o papel de TLR2 e TLR4 na
Discussão
85
ativação das DCs mediada pelo Smteg. Nós observamos então que o TLR2 não foi
necessário para a produção das citocinas pro-inflamatórias pelas DCs induzida pelo
Smteg. Por outro lado, nós demonstramos que a produção de IL-12 e TNF-α
induzida pelo Smteg é dependente de TLR4, uma vez o que o nível dessas citocinas
foi drasticamente reduzido nos animais TLR4 KO (Figura 15).
Até o momento, ainda não está claro quais os componentes do tegumento
constituem-se nos ligantes do TLR4. Entretanto, Lacto-N-fucopentose III (LNFPIII),
um glicano presente no ovo do Schistosoma que contém o motivo Lewisx e que
também pode ser encontrado no tegumento do Schistosoma, foi demonstrado
recentemente em ser um ligante para TLR4 que direciona a maturação de DCs do
tipo 2 (Thomas et al., 2003). Além do Smteg, produtos secretados pelo
esquistossômulo podem induzir a produção de IL-12 por macrófagos por uma via
dependente de MyD88 e TLR4 (Jenkings e Mountford, 2005). É possível que dentre
esses componentes secretados pelo esquistossômulo estejam alguns componentes
do Smteg, uma vez que estudos proteômicos recentes revelaram a composição das
secreções da cercária e dentre muitas enzimas e proteínas secretadas estão alguns
antígenos ligados ao tegumento (Knudsen et al., 2005). Também é interessante
notar que os ligantes do TLR4 presentes no Smteg não devem estar presentes no
estágio de ovo, já que foi demonstrado que o ovo vivo não é capaz de ativar as DCs
via TLR4 (Aksoy et al., 2005). Esses resultados contrastantes apenas reforçam a
idéia de que cada estágio de vida do parasita no hospedeiro vertebrado contém
diferentes PAMPs capazes de ativar diferentes tipos de respostas imunes que
favorecem tanto a sobrevivência do parasita quanto do próprio hospedeiro.
Em resumo, a dependência de MyD88 e a dependência parcial de TLR4 para
a produção de IL-12 induzida pelo Smteg sugerem que podem existir ligantes no
Discussão
86
Smteg, independentes de TLR4, que sinalizam através de outros TLRs, exceto TLR2
e TLR9. Alguns candidatos possíveis incluem o TLR6 ou ainda um receptor não
identificado. Não podemos também excluir a participação de outros tipos de
receptores além dos TLRs, uma vez que já foi sugerido que as lecitinas do tipo C,
como por exemplo, a Dectina-1 e DC-SIGN têm um efeito somatório com os TLRs
para favorecer a produção de citocinas tais como IL-12 e TNF-α (Slack et al., 2007).
CONCLUSÃO
Conclusão
88
7. CONCLUSÃO
Esse estudo demonstrou que o sistema imune inato participa do
reconhecimento de componentes do Schistosoma, tanto in vitro quanto in vivo e que
esse reconhecimento é importante para o curso da infecção. A formação do
granuloma e o recrutamento celular foram influenciados pela molécula adaptadora
MyD88 e pelo receptor TLR2, que contribuem em parte para a orientação da
resposta imune durante a infecção. Ademais, nossas observações também ajudam
no entendimento das interações entre o Schistosoma e a larva infectante. Nós
demonstramos nesse trabalho que a maturação das DCs in vitro pode ser induzida
pelo tegumento do esquistossômulo. Em adição, o Smteg estimula a produção de IL-
12 e TNF-α por DCs por uma via dependente de TLR4 e da sinalização através da
molécula MyD88.
Os conhecimentos gerados nesse estudo servirão como base para o
direcionamento de novas pesquisas acerca do papel da imunidade inata na patologia
da esquistossomose. A futura caracterização das moléculas presentes no tegumento
do esquistossômulo favorecerá a identificação de novos componentes adjuvantes e
candidatos vacinais contra a esquistossomose, além de auxiliar na determinação do
seu papel na ativação do sistema imune.
REFERÊNCIAS
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