PAPEL DA APOPTOSE NA LEISHMANIOSE HUMANA.

INTERAÇÃO MOLECULAR COM O HIV

Dra. Maria Lourdes Farre Vallve

LIMI-CPqGM-FIOCRUZ

Fundação Oswaldo Cruz

LEISHMANIOSE

Doença infecto-parasitária causada por um protozoário da família Trypanosomatidae, gênero Leishmania

2 milhões de casos novos a cada ano - entre as seis endemias mais importantes do mundo (OMS).

Importante problema de saúde pública no Brasil e 88 outros países do mundo

Apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas e imuno-patológicas: Cura espontânea da lesão cutânea Forma cutânea localizada Forma cutâneo-mucosa Forma Visceral

características genéticas e da resposta imunológica do hospedeiro

Depende da espécie de Leishmania Xenvolvida

CO-INFECÇÃO HIV-LEISHMANIA

A co-infecção piora o estado clínico do paciente, sendo que o HIV aumenta o risco de apresentar leishmaniose e a Leishmania acelera o processo da AIDS.

Aumenta a mortalidade em comparação com os indivíduos unicamente infectados por HIV.

A co-infecção dificulta o diagnóstico sorológico.

A infecção pelo HIV está internalizando para as áreas rurais no Brasil a co-infecção afeta as áreas endêmicas de leishmaniose na Bahia?

Afeta 34 paises

3a co-infecção associada ao HIV

Principalmente associada a leishmaniose visceral

APOPTOSE: Morte celular programada

Inicia-se: Receptores de morte

Executa-se: caspases

Regula: prot. família Bcl-2

APOPTOSE E LEISHMANIOSENo modelo murino, a expressão de Fas/FasL demostrou-se crucial na resistência à infecção pela L. major (Conceição-Silva et al., 1998; Huang et al., 1998). Em humanos (pouca informação):

Leishmaniose visceral: Fas e FasL elevados no plasma e retornam a valores normais pós-cura (Eidsmo et al., 2002).

Leishmaniose cutânea: a via Fas-FasL é necessária para resolução da lesão (Sami et al., 2001).

Infecção in vitro: a L. donovani regula a apoptose do neutrófilo e macrófago para assegurar a sua sobrevida (Aga et al, 2002; Moore et al, 1994).

OBJETIVO GERALEstudar o papel da apoptose na leishmaniose humana, incluindo os casos de leishmaniose que apresentem co-

infecção com HIV.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

1. Estudar a regulação molecular da apoptose ex vivo e in vitro em células mononucleares de pacientes com leishmaniose tegumentar americana.

2. Estudar a incidência da co-infecção HIV/Leishmania e a possível alteração destas vias moleculares pela coexistência dos dois agentes infecciosos em indivíduos co-infectados.

3. Correlacionar os dados moleculares obtidos com os dados clínicos.

HIPÓTESES

A apoptose é um processo celular importante no estabelecimento e resolução da leishmaniose humana.

Nas áreas endêmicas de leishmaniose na Bahia existem casos de co-infecção HIV/Leishmania.

METODOLOGIA

Plasma PBMC

Coleta sangue

Citometria de fluxo DNA

RNA

Polimorfismo gene FAS

CBA: Caspase-3Bcl-2PARP

proteína

Sorologia: HIV Leishmania

ELISA: Fas FasL

Biopsia Paciente LTA

Dados clínicos

Banco de dados

Parafina: H/E diagnosticoIHQ

Analise Bayesiano

1a coorte

2a coorte

Plasma PBMC

Coleta sangue

Citometria de fluxo DNA

RNA

Polimorfismo gene FAS

CBA: Caspase-3Bcl-2PARP

proteína

ELISA: Fas FasL

Controle sadio

Dados clínicos

Banco de dados

1a coorte

2a coorte

Paciente leish. visceral

Plasma

Coleta sangue

DNA

ELISA: Fas FasL

RESULTADOS

1.Construção de um banco de dados e amostras de leishmaniose tegumentar americana (LTA).

181 pacientes

Dados demográficos e clínicos.

Plasma, DNA, RNA, proteína e biopsia de lesão

2. Construção de um banco de dados e DNA de leishmaniose visceral (colaboração UFMa).

1000 crianças (com manifestação clínica, DTH+ e controles sadios)

Dados demográficos e clínicos.

Plasma e DNA

CONSTRUÇÃO DE BANCOS DE DADOS E AMOSTRAS

0

25

50

75

100

Controls

LCL patients

Neutrophils Monocytes Lymphocytes

* ******

% C

D95

Análise da expressão ex-vivo do receptor Fas na superficie celular em pacientes com LTA

Aumento significante de neutrófilos, monócitos e linfócitos Fas positivos nos pacientes de LTA a respeito dos controles normais.

Correlação entre a expressão de Fas e as células mieloides somente nos controles normais (p=0.0029, r=0.83) mais não nos pacientes com LTA.

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS COM A APOPTOSE NA LTA: receptor de morte celular FAS

RELEVÂNCIA CLÍNICA ??

0

50

100

150

200

Fas"high" Fas"low"

heali

ng

tim

e (

days) **B

0 25 50 75 1000

50

100

150

200

p=0.048 r=-0.58

% CD95+ lymphocytes

hea

lin

g t

ime

(day

s)

A

Patient group

healing time≤60 days

healing time>60 days2

Fas “high” 1 5 1

Fas “low” 1 1 7

RR=6.67 (95% IC 1.03-43.19) p=0.026 (Fisher’s test)

Não observamos associação com a resposta imune humoral (anti-leishmania IgG) ou celular (DTH)

A expressão de Fas na superfície dos linfócitos correlaciona-se negativamente com o tempo de cura.

Risco relativo seis vezes maior de aumento do tempo de cura nos pacientes que expressam menos FAS.

CORRELAÇÃO EXPRESSÃO DE FAS COM DADOS CLÍNICOS

2a coorte (n=X) confirma-se os resultados da primeira coorte.

Aplicação do análise de redes bayesiana (análise de associação multifatorial - dados laboratoriais e clínicos): Expressão de Fas associa-se com o número de ciclos de tratamento requeridos.

CD95

Treatment cycles

MARCADOR DE RESPOSTA TERAPÊUTICA

Expressão de Fas na superficie dos linfocitos

Existem fatores genéticos associados??

PAPEL DO POLIMORFISMO -670 DO GENE FAS NA LTA.

** *

AA GA GG 0

1

2

3

Trea

tmen

t Sb

V * *

0

50

100

150

Healin

g t

ime (

Day)

*

Polimorfismo funcional na região promotora do gene FAS situado na seqüência de ativação por interferon-gama (GAS, STAT1 binding site).

Análise por RFLP: substituição CCAGAAACCAGGAA

RESULTADOS:

Não observamos diferenças nas freqüências dos genotipos entre os pacientes de LTA e os controles normais não contrubui com a susceptibilidade.

AA funcionalGA heterozigotosGG não funcional

Associação com a severidade o genotipo AA (funcional) esta associado com um tempo de cura menor e menor requerimento de ciclos de tratamento com antimonial pentavalente.

Análise Bayesiana confirma a associação entre o genótipo de FAS, os ciclos de tratamento e o tempo de cura

Healing time

Fas genotype

Treatment cycles

O polimorfismo –670 do gene FAS esta associado com a severidade da doença candidato a marcador farmacogenêtico para a resposta a antimoniales na LTA.

A evolução clínica da LTA é um processo multifatorial com interações complexas entre sexo, idade, fatores genéticos e resposta imune.

ANÁLISE DA REGULAÇÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS COM A APOPTOSE NA LTA: caspase-3, Bcl-2 e PARP

Extrato protéico de PBMC

(2a coorte) - Técnica CBA

Caspase-3 ativação

PARP clivagem

Bcl-2 expressão

Controles sadios

Pacientes LTA

Diminuição significativa da expressão de Bcl-2 (proteína anti-apoptotica) nos pacientes com LTA em comparação com os controles sadios.

Diminuição da ativação da caspase-3 (efetora da apoptose) nos pacientes com LTA, mas sem diferenças no clivagem de PARP (substrato da caspase-3) dúvida: marcador de apoptose ou ativação celular ???

Proximo passo: estudo da regulação destas proteínas nas populações celulares isoladas.

RESULTADOS V

Sorologia HIV pacientes área endêmica de Jiquiriçá

124 pacientes testados

2 pacientes positivos e 2 no cut off (duplicados). Para descartar falsos positivos (pois a presença de Leishmania pode interferir no teste) Detecção do RNA do vírus.

Projeto aprovado e financiado na Chamada para pesquisas clínicas e clínico-epidemiológicas em DST/HIV/Aids. Convocatória n 1/2005 – Ministério da Saúde – UNESCO

Relação Parasita-Hospedeiro na co-infecção HIV x Leishmania sp e sua

evolução para a Leishmaniose Tegumentar.

Avaliação da co-infecção HIV-Leishmania numa população de 4000 indivíduos das áreas endêmicas de Jiquiriçá (Fazenda Bom Jesus) e Jequié (Florestal) - Ba.

PERSPECTIVAS

Análise de Fas e Fas L na lesão (IHQ da biopsia)

Estudo da inicidência da co-infecção HIV/Leishmania nas áreas endêmicas de Jiquiricá e Jequié (projeto aprovado e financiado).

Estudos ex vivo e in vitro da interação HIV/Leishmania.

TRABALHOS EM ANDAMENTO

Análise dos níveis de Fas e Fas L solúveis por ELISA

Análise do polimorfismo -670 do gene Fas na coorte de leishmaniose visceral

Estudos in vitro da regulação das vias de apoptose na infecção in vitro de macrófagos humanos.

Publicacões e apresentacões a congressos

Lymphocyte Fas (CD95) expression can predict therapeutic response in human cutaneous leishmaniasis.

Lourdes Farré, Gilvanéia Silva Santos, George Soares, Jackson M Costa, Aldina Barral, Manoel Barral-Netto & Johan Van Weyenbergh Submetido no Cell Death and Differentiation.

Apresentações em congressos:

Immunogenetic and pharmacogenetic analysis of FAS (TNFRf6) -670 promoter polymorphism in cutaneous leishmaniasis. Santos, G.S. ; Farre, L ; Deforche, k. ; Soares, G ; Barral-Neto, M ; Van Weyenbergh J . XXX meting of the Brazilian Society of immunology, 2005, São Paulo.

Efeito diferencial de IFN-beta e L.amazonensis em macrófagos e células NK. Bafica AM, Farre L, Van Weyenberg J. Jornada de iniciação científica do nordeste-2004, Recife. Comunicação oral.

Efeito diferencial de IFN-beta e l. amazonensis em macrofagos e celulas NK humanas XXIII Seminário Estudantil de Pesquisa. Bafica AM, Farre L, Van Weyenberg J. UFBA, 2004,Salvador.

Fas expression in PBMC of patients with localized cutaneous leishmaniasis - correlation with clinical data. Silva G, Farre L, Soares G, Barral A, Barral-Netto M, Van Weyenbergh J. Meeting of the Brazilian Society of Immunology. 5-8 outubro 2003. Mangaratiba (RJ).

Orientações concluídas:

Estudo do polimorfismo –670 e da expressão do gene Fas na leishmaniose cutânea: possível associação com dados clínicos.

Tese de mestrado (co-orientação). Curso de Pós-graduação em Patologia UFBA-FIOCRUZ 2004 Aluna: Gilvanéia Silva Santos.

Especialização: Adriana Santos Almeida, Aline Clara da Silva.

Iniciação cientifica: Bruna

Orientações em andamento:

Doutorado: Gilvanéia Silva Santos (Co-orientação)

Mestrado: Aline Clara da Silva

EQUIPE

Adriana Santos Almeida

Gilvaneia Silva Santos

George Mariani Soares

Aline Clara da Silva

Dra. Maria Lourdes Farre Vallve

Dr. Johan Van Weyenbergh

Dr. Jackson Costa Mauricio

Dra. Aldina Barral

Dr. Manoel Barral-Netto

Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz FIOCRUZ - Bahia

COLABORADORES

Dra. Isolda Casanova

Dr. Ramon Mangues

Hospital de Sant Pau Barcelona - Espanha

Kul Deforche

Dra. Anemie Vandamme

Univestidade Católica de Lovaina – Bélgica