UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA

CAMPUS DE ARAÇATUBA

EFEITOS DA SOMATOTROPINA RECOMBINANTE BOVINA NA TAXA DE CONCEPÇÃO, COMPOSIÇÃO

CELULAR DO CORPO LÚTEO E MORFOMETRIA DAS GLÂNDULAS ENDOMETRIAIS EM VACAS DE CORTE

Natália Paulozzi Costa

Zootecnista

ARAÇATUBA - SP 2014

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA

CAMPUS DE ARAÇATUBA

EFEITOS DA SOMATOTROPINA RECOMBINANTE BOVINA NA TAXA DE CONCEPÇÃO, COMPOSIÇÃO

CELULAR DO CORPO LÚTEO E MORFOMETRIA DAS GLÂNDULAS ENDOMETRIAIS EM VACAS DE CORTE

Natália Paulozzi Costa

Orientadora: Profa. Dra. Flávia Lombardi Lopes

Coorientadora: Profa. Dra. Claudia Maria Bertan Membrive

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária – UNESP, Campus de Araçatuba, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal (Medicina Veterinária Preventiva e Produção Animal).

ARAÇATUBA - SP

2014

Catalogação na Publicação(CIP) Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação – FMVA/UNESP

Costa,Natália Paulozzi Costa C837e Efeitos da somatotropina recombinante bovina na taxa de

concepção, composição celular do corpo lúteo e morfometria das

glândulas endometriais em vaca de corte / Natália Paulozzi Costa. --

Araçatuba: [s.n], 2014.

85 f. il.; + CD-ROM

Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária, 2014.

Orientadora: Profa. Dra. Flávia Lombardi Costa Coorientadora: Profa. Dra. Cláudia Maria Bertan Membrive

1. Hormônio do crescimento. 2. Desenvolvimento embrionário. 3. Inseminação artificial. 4. BovinosI. T.

CDD 636.6089

Efeitos da somatotropina recombinante bovina na taxa de concepção, composição celular do corpo lúteo e morfometria das

glândulas endometriais em vacas de corte.

DADOS CURRICULARES DA AUTORA

NATÁLIA PAULOZZI COSTA – Nascida em 23 de junho de 1987, na cidade

de Araçatuba/SP. Em 2005, ingressou no curso de Graduação em Zootecnia

pela Universidade Estadual de Maringá − UEM, na cidade de Maringá/PR,

concluído em dezembro de 2009. Em fevereiro de 2012, iniciou o curso de

Mestrado em Ciência Animal na Faculdade de Medicina Veterinária, UNESP,

Campus de Araçatuba/SP, na área de Medicina Veterinária Preventiva e

Produção Animal, sob a orientação da Profa. Dra. Flávia Lombardi Lopes e

Coorientação da Profa. Dra. Claudia Maria Bertan Membrive. Foi bolsista de

Mestrado da CAPES, no período de agosto de 2011 a julho de 2012.

“A vontade de Deus nunca irá levá-lo aonde a graça de Deus

não possa protegê-lo.”

Chico Xavier

Dedico este trabalho

Aos meus pais, Maristela Paulozzi e Paulo César Costa,que me apoiaram a

cada nova etapa.

Aos meus irmãos Renan e Nicholas.

Ao Guilherme Beraldi, por toda paciência e ajuda.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por iluminar meu caminho em sua imensa bondade.

À minha família, por sempre me apoiar e incentivar em tudo, minha eterna gratidão.

À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Faculdade

de Medicina Veterinária da UNESP, Campus de Araçatuba/SP, em especial a Profa.

Dra. Adj. Juliana Regina Peiró, pela oportunidade concedida.

À Universidade Estadual Paulista – UNESP “Júlio de Mesquita Filho”,

Faculdade de Medicina Veterinária, Campus de Araçatuba/SP, por disponibilizar a

estrutura física do Campus de Araçatuba para realização de parte dos estudos.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

concessão da bolsa de mestrado.

À Profa. Dra. Flávia Lombardi Lopes, pela cordial disponibilidade como

orientadora.

À Profa. Dra. Adj. Claudia Maria Bertan Membrive, pela coorientação e por todos

os conhecimentos passados, indispensáveis para o desenvolvimento do projeto e

crescimento profissional, além da confiança e apoio demonstrados.

Ao Prof. Dr. Adj. Mario Binelli, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

da Universidade de São Paulo, Campus de Pirassununga/SP, pela valiosa contribuição

científica e por ter disponibilizado a estrutura do Laboratório de Fisiologia e

Endocrinologia Molecular (LFEM) para a realização das análises da composição

celular do corpo lúteo e morfometria das glândulas endometriais.

Ao Dr. Manoel Francisco de Sá Filho, Pós-Doutorando da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, Campus de Pirassununga/SP,

pela valiosa contribuição na execução das análises estatísticas.

Ao Dr. Milton Maturana Filho, Pós-Doutorando da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, Campus de Pirassununga/SP,

pela valiosa contribuição na execução das análises estatísticas.

Ao Prof. Dr. Ricardo de Francisco Strefezzi, da Faculdade Zootecnia e Engenharia

de Alimentos da USP, Campus de Pirassununga/SP, por disponibilizar sua estrutura

laboratorial para o preparo das lâminas histológicas.

À Profa. Dra. Caliê Castilho, da Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE,

pelas valiosas considerações realizadas durante o exame geral de qualificação.

Ao Prof. Dr. Ricardo da Fonseca, da UNESP de Dracena/SP, pelas valiosas

sugestões realizadas durante o exame geral de qualificação.

À Profa. Dra. Ângela Maria Gonella Diazza, Doutoranda da Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, Campus de

Pirassununga/SP, pela experiente contribuição na avaliação das células luteais e

morfometria das glândulas endometriais.

À médica veterinária, Rita Cristina Rossetti, por ter disponibilizado parte dos seus

dados para a presente dissertação.

Ao médico veterinário, Renato Girotto, da Empresa RG Genética, localizada em

Água Boa – MT, pelo imprescindível preparo dos animais e realização dos protocolos

de sincronização dos estros no Experimento 1.

Ao médico veterinário, Guilherme Agostinho Domingues, da Empresa Fazzembryo,

localizada em Araçatuba - SP, pelo imprescindível preparo dos animais e realização

dos protocolos de sincronização dos estros no Experimento 3.

Ao zootecnista, Robson Nunes Dinardi, pelo auxílio na aplicação dos tratamentos

realizados durante o Experimento 1.

Aos proprietários da Fazenda Santo Antônio, localizada em Araguaiana/MT, pela

disponibilidade de parte dos animais utilizados neste estudo.

Aos proprietários da Fazenda Jacareúna, localizada no município de São Félix do

Araguaia/MT e da Fazenda Guanabara localizada no município de Andradina/SP,

pela concessão de parte dos animais utilizados neste estudo.

Aos proprietários da Fazenda São José, localizada no município de Birigui/SP, pela

concessão dos animais utilizados no Experimento 3.

Aos funcionários e equipe de apoio de todas as fazendas acima mencionadas, pelo

acolhimento e auxílio nos procedimentos realizados.

À Coordenação Executiva da UNESP do Campus de Dracena/SP, em especial ao

Prof. Dr. Paulo Alexandre Monteiro de Figueiredo e Prof. Dr. Fábio Ermínio

Mingatto, por disponibilizar a estrutura física do Campus de Dracena para realização

de parte dos estudos.

À Doutoranda Saara Carolina Scolari, da Faculdade de Medicina Veterinária e

Zootecnia da Universidade de São Paulo, Campus de Pirassununga/SP, pela valiosa

contribuição no corte histológico do endométrio e corpo lúteo.

À aluna de Graduação em Medicina Veterinária da Faculdade de Zootecnia e

Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo, Bárbara Piffero Mello, pela

grande e gentil contribuição na análise morfométrica do endométrio e na contagem das

células luteais realizadas no experimento 3.

À Doutoranda do Programa de Ciência Animal, da UNESP de Araçatuba/SP,

Mariângela Bueno Cordeiro, pela valiosa contribuição na coleta do sistema

reprodutivo e processamento das amostras durante o experimento 3.

Às alunas de graduação em Zootecnia da UNESP de Dracena, Leriana Garcia Reis

e Viviane do Nascimento Santana de Almeida, pela ajuda na coleta do sistema

reprodutivo e processamento das amostras durante o experimento 3.

Ao Mestrando do Programa de Ciência Animal, da UNESP de Araçatuba/SP,

David Giraldo pela valiosa contribuição na localização dos animais utilizados no

experimento 3.

A todos os técnicos de laboratório da UNESP, Campus de Dracena/SP, pelo auxílio

concedido, em especial ao Marcelo José Martini Bartholomei, pela ajuda na coleta dos

materiais biológicos realizada no experimento 3.

Ao frigorífico Brasfrigo, sediado na cidade de Birigui/SP, por realizar o abate dos

animais utilizados no experimento 3.

À MSD Saúde Animal, em especial ao veterinário João Paulo Barbuio, pelo auxílio

financeiro formalizado pela doação de todos os fármacos utilizados neste estudo.

À amiga Juraci Carreon Beraldi, pela grande contribuição na correção deste

trabalho.

E, por fim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização dos

meus estudos, muito obrigada.

SUMÁRIO

Página

I INTRODUÇÃO............................................................................ 25

II REVISÃO DE LITERATURA...................................................... 28

2.1 Limitações da eficiência reprodutiva em rebanhos bovinos de corte....................................................................................... 28

2.2 Mortalidade embrionária precoce......................................... 29

2.3 Mecanismo de ação do hormônio de crescimento............... 32

2.4 Efeitos da somatotropina recombinante bovina na performance reprodutiva de fêmeas bovinas.............................. 37

III OBJETIVOS................................................................................ 40

IV HIPÓTESE.................................................................................. 41

V MATERIAL E MÉTODOS........................................................... 41

5.1 EXPERIMENTO 1................................................................. 41

5.1.1 Local do Experimento............................................. 41

5.1.2 Animais.................................................................... 41

5.1.3 Sincronização das ovulações.................................. 42

5.1.4 Procedimentos de IATF........................................... 43

5.1.5 Tratamento com bST............................................... 43

5.1.6 Diagnóstico de Gestação........................................ 43

5.1.7 Análise Estatística................................................... 43

5.2 EXPERIMENTO 2................................................................. 44

5.2.1 Local do Experimento............................................. 44

5.2.2 Animais.................................................................... 44

5.2.3 Sincronização das ovulações.................................. 44

5.2.4 Procedimentos de IATF........................................... 45

5.2.5 Tratamento com bST............................................... 46

5.2.6 Diagnóstico de Gestação........................................ 46

5.2.7 Análise Estatística................................................... 46

5.3 EXPERIMENTO 3................................................................. 46

5.3.1 Local do experimento.............................................. 46

5.3.2 Animais.................................................................... 47

5.3.3. Sincronização das ovulações................................. 47

5.3.4 Tratamento com bST............................................... 48

5.3.5 Coleta do Corpo Lúteo............................................ 48

5.3.6 Preparo Histológico do Corpo Lúteo....................... 49

5.3.7 Avaliação das células luteais esteroidogênicas...... 49

5.3.8 Análise estatística para avaliação do corpo lúteo... 49

5.3.9 Coleta do tecido Endometrial.................................. 50

5.3.10 Preparo histológico do tecido uterino.................... 50

5.3.11 Análise morfométrica das glândulas endometriais 51

5.3.12 Análise estatística da morfometria das glândulas endometriais.................................................................... 52

VI RESULTADOS.......................................................................... 52

6.1 EXPERIMENTO 1................................................................. 52

6.2 EXPERIMENTO 2................................................................. 53

6.3 EXPERIMENTO 3................................................................. 54

VII DISCUSSÃO.............................................................................. 62

7.1 EXPERIMENTO 1................................................................. 62

7.2 EXPERIMENTO 2................................................................. 64

7.3 EXPERIMENTO 3................................................................. 65

VIII CONCLUSÃO........................................................................... 67

REFERÊNCIAS............................................................................... 68

LISTA DE ABREVIATURAS

µg = Micrograma

µm = Micrômetro

µm2 = Micrômetro ao quadrado

AGL = Ácidos graxos livres

ASBIA = Associação Brasileira de Inseminação Artificial

BE = Benzoato de estradiol

BEN = Balanço energético negativo

bST = Somatotropina recombinante bovina

ºC = Graus Celsius

CLG = Células luteais grandes

CLP = Células luteais pequenas

COX-2 = Cicloxigenase 2

D = Dia

DNA = Ácido desoxirribonucleico

E2 = Estradiol

ECC = Escore de condição corporal

eCG = Gonadotrofina coriônica equine

ECL = Eletroquimioluminescente

G = Grama

GH = Hormônio do crescimento

GHBP = Proteína ligadora do hormônio do crescimento

GHR = Receptor do hormônio do crescimento

GHRH = Hormônio liberador do hormônio do crescimento

GIRH = Hormônio inibidor do hormônio do crescimento

GTP = Guanosina trifosfato

H2O = Água

HE = Hematoxilina – Eosina

IA = Inseminação artificial

IATF = Inseminação artificial em tempo fixo

IEP = Intervalo entre partos

IFN-τ = Interferon-tau

IGF I = Fator de crescimento semelhante a insulina tipo I

IGF II = Fator de crescimento semelhante a insulina tipo II

IGFBP = Proteína ligadora do fator de crescimento semelhante a insulina

IGFBP2 = Proteína ligadora do fator de crescimento semelhante a insulina tipo 2

IGFBP3 = Proteína ligadora do fator de crescimento semelhante a insulina tipo 3

IGFs = Fatores de crescimento semelhantes a insulina

IGP = Índice geral de preços

IM = Intramuscular

JAK2 = Janus quinase 2

kDa = Quilodaltons

Kg = Kilograma

LH = Hormônio Luteinizante

Mg = Miligrama

mHZ = Mega-hertz

Ml = Mililitro

Mm = Milímetro

NaH2PO4 = Fosfato monossódico

NEFA = Acidos graxos não esterificados

OT = Ocitocina

P4 = Progesterona

PAF = Paraformaldeído

PBS = Tampão fosfato-salino

PGF2 = Prostaglandina F2

PKC = Proteína quinase-C

PLA2 = Fosfolipase A2

PLC = Fosfolipase C

RNAm = RNA mensageiro

SBTE = Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões

SC = Subcutânea

TETF = Transferência de embriões em tempo fixo

UI = Unidades Internacionais

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1 - Representação esquemática do delineamento referente

ao Experimento 1: colocação do dispositivo intravaginal

contendo 1g P4 associado a 2mg de benzoato de

estradiol via IM (D-10); retirada do dispositivo intravaginal

associado a administração de 0,530mg de D-cloprostenol

e 300UI de eCG ambos via IM (D-2); administração de

1mg de benzoato de estradiol via IM (D-1); IATF (D0) 30

horas após a aplicação da última injeção; aplicação no

D0 de 5ml de solução salina via SC (Grupo Controle; n =

194), 250mg bST via SC (Grupo bST 250; n=197) ou

500mg bST via SC (Grupo bST 500; n=196) e

diagnóstico de gestação por ultrassonografia 30 dias

após IATF (D30) em vacas de corte.................................. 42

Figura 2 - Representação esquemática do delineamento referente

ao Experimento 2: colocação do dispositivo intravaginal

contendo 1g P4 associado a 2mg de benzoato de

estradiol via IM (D-10); retirada do dispositivo intravaginal

associado a administração de 112,5g de D-cloprostenol

e 300UI de eCG ambos via IM (D-2); administração de

1mg de benzoato de estradiol via IM (D-1); IATF (D0) 30

horas após a aplicação da última injeção; aplicação no

D7 de 5ml de solução salina via SC (Grupo Controle; n =

124) ou 500mg bST via SC (Grupo bST 500; n=119) e

diagnóstico de gestação por ultrassonografia 30 dias

após IATF (D30) em vacas de corte.................................. 45

Figura 3 - Representação esquemática do delineamento referente

ao Experimento 3: colocação do dispositivo intravaginal

contendo 1g P4 associado a 2mg de benzoato de

estradiol via IM (D-10); retirada do dispositivo intravaginal

associado a administração de 0,530mg de D-cloprostenol

e 300UI de eCG ambos via IM (D-2); administração de

1mg de benzoato de estradiol via IM (D-1); Dia esperado

para o estro (D0); aplicação no D0 de 5ml de solução

salina via SC (Grupo Controle; n = 9) ou 500mg bST via

SC (Grupo bST 500; n=11) e abate dos animais com

coleta de útero e corpo lúteo (D15) em vacas de corte......

48

Figura 4 - Efeito do tratamento na taxa de concepção 30 dias após

a IATF (D30), em vacas Nelore pluríparas submetidas à

IATF, tratadas com 5ml de solução salina (Grupo

Controle; n= 194) ou bST (Boostin) na dose de 250mg

(Grupo bST 250; n=197) ou 500mg (Grupo bST 500;

n=196), via subcutânea (SC), p>0,05................................ 53

Figura 5 - Efeito do tratamento na taxa de concepção 30 dias após

a IATF (D30), em vacas Nelore pluríparas submetidas à

IATF, tratadas com 5ml de solução salina (Grupo

Controle; n= 124) ou 500mg de bST (Grupo bST 500;

n=119), via subcutânea (SC), p>0,05................................ 54

Figura 6 - Imagem das células luteais esteroidogênicas em

aumento de 40X: células luteais grandes (CLP; diâmetro

< 20 μm); células luteais pequenas (CLP; diâmetro > 20

μm), no D15 (D0 = dia esperado para o estro) de novilhas

Nelore tratadas com 5ml de solução salina via SC (Grupo

Controle; n = 9) ................................................................. 56

Figura 7 - Imagem das células luteais esteroidogênicas em

aumento de 40X: células luteais grandes (CLP; diâmetro

< 20 μm); células luteais pequenas (CLP; diâmetro > 20

μm), no D15 (D0 = dia esperado para o estro) de novilhas

Nelore tratadas com 500 mg de bST via SC (Grupo bST

500; n = 11)........................................................................

57

Figura 8 - Imagem das glândulas endometriais superficiais em

aumento de 20X, no D15 (D0 = dia esperado para o

estro) de novilhas Nelore tratadas com 500mg de bST

via SC (Grupo bST 500; n = 11) ou com 5ml de solução

salina SC (Grupo Controle; n=9), respectivamente........... 60

Figura 9 - Imagem das glândulas endometriais profundas em

aumento de 20X, no D15 (D0 = dia esperado para o

estro) de novilhas Nelore tratadas com 500mg de bST

via SC (Grupo bST 500; n = 11) ou com 5ml de solução

salina SC (Grupo Controle; n=9), respectivamente........... 61

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1 - Média e erro padrão do peso dos ovários, diâmetro do

ovário esquerdo, diâmetro do ovário direito, diâmetro do

corpo lúteo, peso do corpo lúteo, porcentagem de CLG

e porcentagem de CLP no D15, em novilhas Nelore

tratadas com 5ml de solução salina via SC (n=9) ou

com 500mg de bST (n=11) no D0 (D0=dia esperado

para o estro)..................................................................... 55

Tabela 2 - Avaliação do peso médio dos ovários, diâmetro do

ovário esquerdo, diâmetro do ovário direito, diâmetro do

corpo lúteo, peso do corpo lúteo, porcentagem de CLG

e porcentagem de CLP no D15, em novilhas Nelore

tratadas com 5ml de solução salina via SC (n=9) ou

com 500mg de bST (n=11) no D0 (D0=dia esperado

para o estro)..................................................................... 59

EFEITOS DA SOMATOTROPINA RECOMBINANTE BOVINA NA TAXA DE

CONCEPÇÃO, COMPOSIÇÃO CELULAR DO CORPO LÚTEO E

MORFOMETRIA DAS GLÂNDULAS ENDOMETRIAIS EM VACAS DE CORTE

RESUMO – Fêmeas bovinas leiteiras tratadas com somatotropina

recombinante bovina (bST) apresentam maior taxa de concepção. Verificou-se

que componentes maternais e embrionários são positivamente afetados pela

bST favorecendo a concepção. Entretanto, poucas investigações foram

realizadas em fêmeas de corte. Hipotetizou-se que vacas de corte tratadas com

bST, no dia da inseminação artificial em tempo fixo (IATF) ou sete dias após a

IATF, apresentam maiores taxas de concepção e que a morfometria das

glândulas endometriais e a proporção de células esteroidogênicas luteais são

alteradas por tal tratamento. No presente estudo objetivou-se avaliar o efeito da

aplicação de bST, na dose de 250 ou 500mg, no dia da IATF, na taxa de

concepção aos 30 dias de gestação (Experimento 1); verificar os efeitos da

aplicação de 500mg de bST, sete dias após a IATF, na taxa de concepção aos

30 dias de gestação (Experimento 2) e averiguar os efeitos da bST na

proporção de células esteroidogênicas luteais e na morfometria das glândulas

endometriais (Experimento 3). No Experimento 1, vacas Nelore (n=587)

receberam um dispositivo intravaginal contendo progesterona (1g; DIB®)

associado a uma injeção intramuscular (IM) de benzoato de estradiol (2mg;

Gonadiol®). Os dispositivos foram removidos oito dias após, quando as vacas

foram tratadas com D-cloprostenol (0,530µg; Ciosin®) e gonadotrofina

coriônica equina (300UI; Novormon®) e 24 horas após receberam benzoato de

estradiol (1mg; Gonadiol®), via IM. Após 30 horas da última injeção (D0) as

fêmeas foram submetidas à IATF e receberam 5ml de solução salina (Grupo

Controle; n= 194) ou bST (Boostin) na dose de 250mg (Grupo bST 250;

n=197) ou 500mg (Grupo bST 500; n=196), via subcutânea (SC). O diagnóstico

de gestação foi realizado 30 dias após a IATF por ultrassonografia. No

Experimento 2, vacas Nelore (n=243) receberam protocolo idêntico ao

Experimento1 e foram submetidas à IATF no D0. No D7 receberam 5ml de

solução salina (Grupo Controle; n= 124) ou bST (Boostin) na dose de 500mg

(Grupo bST 500; n=119), via SC. O diagnóstico de gestação foi realizado 30

dias após a IATF por ultrassonografia. No Experimento 3, vacas Nelore (n=20)

receberam protocolo idêntico ao Experimento 1 e foram tratadas, 48 horas

após a remoção do dispositivo intravaginal, com 5ml de solução salina (Grupo

Controle; n=9) ou bST (Boostin) na dose de 500mg (Grupo bST 500; n=11),

via subcutânea (SC). As fêmeas foram abatidas 15 dias após a aplicação de

bST. O corpo lúteo foi removido e avaliado quanto ao diâmetro, peso,

porcentagem de células luteais grandes (CLG) e pequenas (CLP) em relação a

porcentagem total de células esteroidogênicas. O tecido uterino foi removido,

do terço médio do corno uterino ipsolateral ao corpo lúteo, lâminas histológicas

foram preparadas e o tecido uterino corado com hematoxilina e eosina, sendo o

tecido endometrial avaliado quanto ao número, perímetro e área total das

glândulas endometriais superficiais e/ou profundas. Os dados foram analisados

por análise de variância. As médias foram analisadas pelo Proc Glimmix do

SAS. No Experimento 1, não houve efeito de tratamento (p>0,05) nas taxas de

concepção que foram de 59,27%, 58,37% e 65,82% para o Grupo Controle,

bST 250 e bST 500, respectivamente. No Experimento 2, as taxas de

concepção não diferiram (p>0,05) entre os tratamentos e foram de 57,30% e

60,50% para o Grupo Controle e bST 500, respectivamente. No Experimento 3,

verificou- se que a aplicação de bST não promoveu alterações na composição

celular do corpo lúteo e na morfometria das glândulas endometriais. Conclui-se

que vacas tratadas com bST, no dia da IATF ou sete dias após a IATF, não

apresentam maiores taxas de concepção e que a morfometria das glândulas

endometriais e a proporção de células esteroidogênicas luteais não são

alteradas por tal tratamento.

Palavras-chave: Hormônio do crescimento, Desenvolvimento embrionário,

Inseminação artificial, Bovinos.

EFFECTS OF RECOMBINANT BOVINE SOMATOTROPIN ON CONCEPTION

RATE, CELL COMPOSITION OF CORPUS LUTEUM AND ENDOMETRIAL

GLANDS MORPHOMETRY IN BEEF COWS

SUMMARY – Dairy cows treated with recombinant bovine somatotropin (bST)

have higher conception rate. It was found that maternal and embryonic

components are positively affected by the design favoring bST. However, few

investigations have been done on beef cows. It was hypothesized that beef

cows treated with bST, the day timed AI (TAI) or seven days after TAI, have

higher conception rates and the morphology of the endometrial glands and the

proportion of steroidogenic luteal cells are altered by such treatment. The

present study aimed to evaluate the effect of bST at a dose of 250 or 500mg,

the day of TAI, the conception rate at 30 days of gestation (Experiment 1); verify

the effects of application of 500mg of bST, seven days after TAI, the conception

rate at 30 days of gestation (Experiment 2) and investigate the effects of bST in

the proportion of steroidogenic luteal cells and morphometry of the endometrial

glands (Experiment 3). In Experiment 1, Nelore cows (n=587) received an

intravaginal device containing progesterone (1g; DIB®) associated with an

intramuscular (IM) injection of estradiol benzoate (2mg; Gonadiol®). The

devices were removed after eight days, when cows were treated with D-

cloprostenol (0.530 mg; Ciosin®) and equine chorionic gonadotropin (300UI;

Novormon®) and after 24 hours received estradiol benzoate (1 mg; Gonadiol®),

via IM. After 30 hours of the last injection (D0) females were inseminated and

received 5ml of saline (Control Group; n=194) or somatotropin (Boostin®) at a

dose of 250mg (Group bST 250; n=197) or 500mg (Group bST 500; n=196),

subcutaneously (SC). Pregnancy diagnosis was performed 30 days after TAI by

ultrasonography. In Experiment 2, Nelore cows (n=243) received the

Experimento1 similar protocol and were inseminated on D0. In D7 received 5ml

of saline (Control Group; n=124) or somatotropin (Boostin®) at a dose of 500mg

(Group bST 500; n =119) subcutaneously. Pregnancy diagnosis was performed

30 days after TAI by ultrasonography. In Experiment 3, Nelore cows (n=20)

were identical to Experiment 1 protocol and were treated 48 hours after removal

of the intravaginal device with 5ml of saline (Control Group; n=9) or

somatotropin (Boostin®) 500mg dose (Group 500 bST; n = 11), subcutaneously

(SC). The heifers were slaughtered 15 days after application of bST. The

corpus luteum was removed and evaluated for size, weight, percentage of large

luteal cells (LLC) and small (SLC) in relation the total percentage of

steroidogenic cells. The uterine tissue was removed from the middle third of the

uterus ipasolateral the corpus luteum, histological slides were prepared and

stained uterine tissue with hematoxylin and eosin, and endometrial tissue were

evaluated on the number, perimeter and area of surface endometrial glands and

/ or deep. Data were analyzed by analysis of variance. The means were

analyzed by SAS Proc GLIMMIX. In Experiment 1, there was no effect of

treatment (p> 0.05) in conception rates which were 59.27%, 58.37% and

65.82% for the control, 250 and 500 bST groups, respectively. In Experiment 2,

the conception rates did not differ (p> 0.05) between treatments and were

57.30% and 60.50% for the control and bST Group 500, respectively. In

Experiment 3, it was found that the application of bST did not change the

cellular composition of the corpus luteum and the morphometry of the

endometrial glands. It was concluded that cows treated with bST, the day of TAI

or seven days after TAI, didn’t have higher rates of conception and the

morphometry of the endometrial glands and the proportion of steroidogenic

luteal cells were not affected by such treatment.

Keywords: Growth hormone, Embryonic development, Artificial insemination,

Cattle.

25

I INTRODUÇÃO

A demanda mundial por alimentos cresce rapidamente, de forma

proporcional ao aumento da população. Em 2014, o Brasil ocupa a posição de

maior exportador de carne bovina e tem recebido grande atenção mundial

devido ao modelo de criação extensiva e potencial de incremento na produção.

O rebanho bovino brasileiro é constituído por 198.655.689 animais, sendo 79%

destes destinados à produção de carne. Estima-se que a produção nacional de

carne bovina seja de 8.520.651 toneladas, proveniente do abate de 43.269.775

cabeças, sendo 1.940.000 toneladas do produto destinadas às exportações, o

que representa 22,76% da produção anual (ANUALPEC, 2014).

Atualmente o Brasil apresenta uma taxa de desfrute (número de animais

abatidos, dividido pelo número total de animais x 100) de 20% e abate de

carcaças com um peso médio de 15 arrobas (ANUALPEC, 2014). Em

comparação, os norte-americanos desfrutam de 35% do seu rebanho e abatem

carcaças pesando 24 arrobas (ANUALPEC, 2014). Embora detentor do maior

rebanho bovino comercial do mundo, o Brasil apresenta uma eficiência na

produção pecuária aquém da necessária, caracterizada inclusive pela baixa

eficiência reprodutiva nas operações de cria.

Mantendo-se baixa a eficiência reprodutiva, a única maneira de se

aumentar o volume de carne produzido é aumentando a área destinada à

exploração pecuária. Contudo, tal prática torna-se indesejável pelas óbvias

implicações ambientais negativas. Assim, evidencia-se a importância de se

aumentar a eficiência reprodutiva das explorações pecuárias com o objetivo de

incrementar a produção de carne, sem necessariamente aumentar o número

de matrizes. Para tanto, torna-se imprescindível aumentar a taxa de prenhez

(número de bezerros nascidos, dividido pelo número de fêmeas em reprodução

x 100) e concepção (número de bezerros nascidos dividido pelo número de

fêmeas inseminadas x 100). Entretanto, para que a bovinocultura brasileira

atinja maiores índices de produtividade, além da eficiência reprodutiva, o

melhoramento genético necessita ser priorizado (BARUSELLI et al., 2006).

26

Tais requisitos tem alavancado o emprego da inseminação artificial (IA).

Para otimizar seu emprego foram desenvolvidos protocolos hormonais que

permitem a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) em 100% das fêmeas

tratadas em um momento predeterminado, procedimento que exclui a

necessidade da detecção de estros. Além disso, a IATF possibilita a indução da

ciclicidade de fêmeas em anestro no período pós-parto (DAY, 2005; PURSLEY

et al., 1995; VASCONCELOS et al., 1994). No Brasil, segundo estimativas da

Associação Brasileira de Inseminação Artificial (ASBIA), estima-se que 27,19%

das fêmeas bovinas tenham sido inseminadas em 2012, destas 32,96% fêmeas

de corte e 19,21% fêmeas de leite, sendo aproximadamente 50% do total de

inseminações realizadas por IATF (ASBIA, 2012). Apesar dos bons resultados

obtidos com o emprego da IATF, as taxas de prenhez à primeira inseminação

dificilmente são maiores que 60% em vacas de corte e 30% em vacas leiteiras

de alta produção, indicando que uma proporção expressiva de fêmeas

inseminadas não se torna prenhes. A taxa média de concepção em rebanhos

de corte comerciais no Brasil com o emprego da IATF é de 49,1% (BARUSELLI

et al., 2008; SÁ FILHO et al., 2009).

Considerando a importância do incremento genético aliado ao aumento

da eficiência reprodutiva, o Brasil também se tornou líder mundial no emprego

da técnica de transferência de embriões em tempo fixo (TETF). A TETF, aliada

à produção de embriões in vitro, constituem biotécnicas poderosas na

disseminação de produtos nascidos oriundos de animais geneticamente

superiores. Entretanto, as taxas de concepção no emprego da TETF

dificilmente superam 50%. Segundo a Sociedade Brasileira de Tecnologia de

Embriões (SBTE), o Brasil é líder mundial na produção in vitro de embriões

bovinos, sendo responsável por 70% do total de embriões gerados no mundo

através desta biotecnologia (FAEMG, 2013).

Para se atingir uma boa produtividade, a eficiência reprodutiva das

fêmeas deve ser melhorada. Em fêmeas bovinas de corte os principais

desafios biológicos para o estabelecimento da prenhez ocorrem no período

27

especialmente crítico, compreendido entre os dias 15 e 19 após a fecundação

(BINELLI et al., 2001).

Em fêmeas bovinas, durante o período crítico, o concepto (embrião e

membranas associadas) deve produzir competentemente moléculas que

interagem com o endométrio inibindo a síntese de prostaglandina F2 (PGF2)

e consequentemente a luteólise. Contudo, a simples existência do concepto no

útero não assegura o bloqueio efetivo da luteólise. A supressão da síntese de

PGF2 endometrial pelo concepto torna-se necessária para o estabelecimento

da prenhez (BINELLI et al., 1999). Imediatamente após a ovulação, se inicia o

desenvolvimento do corpo lúteo, uma estrutura glandular transitória, com

capacidade de sintetizar vários hormônios, sendo que o principal é a

progesterona (P4), fundamental para preparar adequadamente o meio uterino

para o desenvolvimento do concepto. Para a determinação de uma prenhez,

deve ocorrer o reconhecimento fisiológico da presença do concepto. A luteólise

é promovida na ausência da fertilização ou quando o concepto é incapaz de

promover competentemente tal reconhecimento.

Diante deste contexto, estratégias farmacológicas podem ser

empregadas com a finalidade de reduzir a mortalidade embrionária entre os

dias 15 e 19 da gestação. Tais estratégias objetivam minimizar a capacidade

de síntese de PGF2 no endométrio materno e/ou maximizar o estímulo anti-

luteolítico induzido pelo concepto. Nesse contexto, a administração de

somatotropina recombinante bovina (bST) constitui uma estratégia que objetiva

maximizar o estímulo anti-luteolítico induzido pelo concepto, favorecendo o

reconhecimento materno-fetal. Verificou-se que o uso da bST aumenta a

expressão de RNAm nas células endometriais para proteínas que constituem o

histotrófo e favorece maior crescimento do concepto durante o estágio de pré e

peri-implantação. Vários estudos foram realizados para avaliar os efeitos da

bST na performance reprodutiva de vacas leiteiras em lactação e em doadoras

e receptoras de embriões. Entretanto, em fêmeas bovinas de corte, o estudo

dos efeitos da bST na reprodução são escassos e a determinação da dose com

melhor custo/benefício ainda não foi suficientemente estabelecida.

28

II REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Limitações da eficiência reprodutiva em rebanhos bovinos de corte

Na criação de bovinos a produtividade está diretamente relacionada à

eficiência reprodutiva das fêmeas, que devem apresentar um intervalo entre

partos (IEP) de 12 meses, gerando a produção de 1 bezerro/matriz/ano. Em

2013, o rebanho nacional era composto por 78.595.090 matrizes, destas

63.817.516 eram vacas e 14.777.574 novilhas com mais de 24 meses. Em

2014, estima-se uma produção nacional de 55.274.645 bezerros (ANUALPEC,

2014). Quando se estabelece uma relação entre o número de matrizes em

idade reprodutiva e o número de bezerros nascidos no ano subsequente,

estima-se uma produção nacional média de 0,70 bezerro/matriz/ano e um IEP

de 17 meses. Nos últimos sete anos, houve uma grande agregação ao valor do

bezerro ao desmame, onde o Índice Geral de Preços (IGP) passou de 60 por

bezerro em 2006 para 183,0 IGP/bezerro em 2013 (ANUALPEC, 2014).

Conclui-se que a baixa eficiência reprodutiva nas operações de cria,

caracterizada pela baixa eficiência na produção de bezerros nascidos, reduz a

lucratividade e a competitividade do setor pecuário.

Segundo a Associação Brasileira de Criadores de Zebu (ABCZ), para

obter uma eficiência reprodutiva de 100% a matriz deve ter o primeiro parto aos

36 meses e o IEP de 12 meses. Em rebanhos bovinos, a mortalidade

embrionária é uma das maiores causas de falhas reprodutivas, conforme

revisado por Santos et al. (2004) e Sartori (2004). Nos primeiros sete dias pós-

inseminação tal mortalidade foi associada a falhas de fertilização, defeitos

genéticos e anormalidades no desenvolvimento embrionário até o estágio de

blastocisto. Neste período, a mortalidade normalmente é inferior a 10%, mas

em vacas de leite sob estresse calórico pode ultrapassar 40% (SARTORI,

2004; SARTORI et al., 2002). Em fêmeas bovinas os principais desafios

biológicos para o estabelecimento da prenhez ocorrem no período

especialmente compreendido entre os dias 15 e 19 após a fecundação, esse

29

designado de “período crítico” (BINELLI et al., 2001). Neste período específico

foram reportadas perdas embrionárias de 20 a 40% em fêmeas zebuínas,

grande parte atribuídas à incapacidade do concepto em promover o

reconhecimento materno fetal e, desta forma, determinando a mortalidade

embrionária precoce (MACHADO et al., 2009).

2.2 Mortalidade embrionária precoce

O ciclo estral de fêmeas bovinas é mediado por um conjunto de

mecanismos neuroendócrinos. A ocorrência da luteólise, entre os dias 15 e 19

do ciclo estral, determina o fim da fase progestacional, o desenvolvimento de

um folículo pré-ovulatório e o estro. Em fêmeas bovinas um “período crítico” é

determinado quando o estado fisiológico reprodutivo da fêmea deve ser

definido para a manutenção do corpo lúteo e da prenhez ou para o

desencadeamento da luteólise e do estro. A luteólise é desencadeada pela

ocorrência de 5 a 8 pulsos de PGF2, ocorridos durante 2 ou 3 dias,

compreendidos entre o 15º e 19o dias do ciclo. Na presença do concepto, o

reconhecimento materno-fetal deve ser estabelecido de forma competente para

evitar a liberação dos pulsos de PGF2 (BINELLI et al., 2001). Segundo Godkin

et al. (2008), durante este período, na ocorrência de uma prenhez, o concepto

(embrião e membranas associadas) deve tornar-se capaz de enviar sinais anti-

luteolíticos apropriados ao endométrio e este responder a tais sinais, inibindo a

síntese de PGF2 endometrial. Frequentemente, tal evento fisiológico não é

bem sucedido, resultando na ocorrência da luteólise, na mortalidade

embrionária e em perdas representativas na pecuária.

A mortalidade embrionária associada à falha na manutenção do corpo

lúteo aumenta os intervalos entre partos (HANK, 1979). Falhas de fertilização

até o 8° dia pós-inseminação são responsáveis por 10% dos casos de fracasso

reprodutivo, enquanto as mortes embrionárias entre os dias 8 e 16 pós-

inseminação contribuem com mais de 30% dos referidos casos (DISKIN;

30

SREENAN, 1980). Isso justifica relatos de taxas de nascimento após única

inseminação de 50 a 55% para novilhas (ROCHE et al., 1977; SREENAN;

MULVEHILL, 1975), de 52% a 57% para vacas selecionadas para a produção

leiteira (MAWHINNEY; ROCHE, 1978) e de 53% para vacas especializadas na

produção de carne (ROCHE et al., 1977).

Em fêmeas bovinas, é de amplo conhecimento que a PGF2 é o

principal agente luteolítico e tem como função promover a luteólise

(CARAMBULA et al., 2002; MEIDAN et al., 1999). Sabe-se ainda que a

estimulação da síntese de PGF2 envolve fatores endócrinos como o estradiol

(E2), a ocitocina (OT), a progesterona (P4) e o hormônio luteinizante (LH). O

papel do E2 neste contexto foi pouco estudado. Contudo, sabe-se que durante

o período crítico a supressão do E2, por meio da irradiação ou cauterização de

folículos retarda a luteólise (HUGHES et al., 1987). Além disso, vacas prenhes

apresentam diminuição do E2 circulante (PRITCHARD et al., 1994),

provavelmente em função de uma redução no desenvolvimento folicular e na

produção de E2 pelo folículo (THATCHER et al., 1991). Em contrapartida, a

administração de E2 em vacas cíclicas estimula a luteólise e promove o estro

(THATCHER et al., 1986) e quando aplicado em vacas no 18° dia da prenhez

estimula apenas de maneira modesta a produção de PGF2 (THATCHER et

al., 1991). Sugere-se que, possivelmente, a presença do embrião atenua os

efeitos do E2.

A síntese de PGF2 no endométrio de fêmeas bovinas resulta de uma

complexa cascata de eventos intracelulares que ocorrem de maneira altamente

coordenada. Tais eventos envolvem a ativação sequencial de várias proteínas

como a proteína acopladora da guanosina trifosfato (GTP), a fosfolipase C

(PLC), a proteína quinase-C (PKC), a fosfolipase A2 (PLA2) e a ciclooxigenase

2 (COX-2).

Concentrações circulantes de P4 parecem estar correlacionadas

positivamente com o reconhecimento da prenhez em bovinos. Verificou-se

maior concentração de P4 no leite de vacas inseminadas e prenhes do que em

vacas inseminadas e não prenhes (BULLMAN; LAMMING, 1978; LAMMING et

31

al., 1989; MANN et al., 1999). Sugere-se que a alta concentração de P4 durante

o período crítico é importante para a manutenção da prenhez.

O principal regulador deste reconhecimento é o interferon-tau (IFN-τ),

secretado no lúmen uterino pelo concepto (BINELLI et al., 1999). Um possível

mecanismo, por meio do qual a P4 estimula a manutenção da prenhez, seria

pela estimulação da secreção IFN-τ. Reportou-se que o aumento na

concentração de P4, durante a fase luteal e o período crítico, estimula o

reconhecimento da prenhez. Durante o período critico, o concepto apresenta

um rápido aumento de tamanho. Thatcher e Hansen (1992) demonstraram que

no décimo sétimo dia os conceptos variavam o tamanho de 15-250 milimetros

(mm). Observou-se que a luteólise pode ocorrer mesmo na presença do

concepto, quando o mesmo não apresenta tamanho suficiente para produzir

IFN-τ em quantidade suficiente para promover, de forma bem sucedida, o

reconhecimento materno-fetal. A produção de IFN-τ foi positivamente

correlacionada ao tamanho do embrião e concepto (MANN; LAMMING, 2001).

Em fêmeas bovinas, durante tal período crítico, o concepto (embrião e

membranas associadas) deve produzir competentemente moléculas que

interagem com o endométrio inibindo a síntese de PGF2. Especificamente,

esse reconhecimento requer que moléculas produzidas pelo concepto

interajam com o endométrio para alterar a sua “pré-programação”, bloqueando

assim a secreção de PGF2 e impedindo a luteólise (BINELLI et al., 1999).

Neste contexto, as funções do concepto e do endométrio podem ser

melhoradas, para aumentar as possibilidades de êxito no reconhecimento

materno-fetal, reduzindo a mortalidade embrionária precoce ocorrida durante o

período critico.

O hormônio de crescimento (GH) e os componentes da família dos

fatores de crescimento semelhante à insulina (IGFs) podem estimular o

desenvolvimento do concepto e desempenhar um papel importante no

crescimento do mesmo e no processo de reconhecimento materno da prenhez

(LUCY et al., 1995).

32

2.3 Mecanismo de ação do hormônio de crescimento

A secreção hipofisária de GH está sob o controle de dois neuropeptídios

do hipotálamo, o hormônio liberador de GH (GHRH) e o hormônio inibidor do

GH (GIRH) reconhecido posteriormente como sendo a dopamina (TUGGLE;

TRENKLE, 1996). Um mecanismo de feedback negativo ajuda a manter em

equilíbrio da concentração de GH no organismo, logo, elevada taxa de GH na

circulação promove redução dos estímulos à adenohipófise e/ou reduz a

interação do mesmo com seus receptores teciduais, minimizando seus efeitos

(BACHA, 2013).

Após a liberação de GH pela glândula hipófise, o mesmo se conjuga a

proteína ligadora de GH (GHBP), identificada no soro de várias espécies

(BAUMANN, 1994), que liga-se ao domínio extracelular do receptor hepático de

GH (GHR). Demonstrou-se que a GHBP aumenta os efeitos do GH como

promotor de crescimento in vivo, provavelmente através do aumento da meia-

vida na circulação. Posteriormente, o GH é ligado a um receptor na membrana

das células-alvo. Tais receptores são altamente expressos no fígado, mas

também são encontradas em outros tecidos (SORENSEN et al., 1992). Membro

da superfamília de receptores de citocinas, GHR é capaz de se associar e

ativar a Janus quinase 2 (JAK2) que, por sua vez, ativa uma série de vias

intracelulares (WOJCIK; POSTEL-VINAY, 1995).

Os mecanismos de ação do GH podem ser divididos em diretos e

indiretos. O primeiro seria mediado pela cascata de sinalização intracelular

gerada pela ligação do GH ao seu receptor na membrana plasmática. O

segundo mecanismo seria intermediado pela regulação da síntese dos IGFs,

sintetizados principalmente no fígado (BACHA, 2013). Os efeitos biológicos do

GH são, em grande parte, mediados pela produção do fator de crescimento

semelhante à insulina tipo I (IGF I) no fígado e em tecidos periféricos

(BOGUSZEWSKI, 2001). Parte dos efeitos do GH também é mediado pelo fator

de crescimento semelhantes à insulina tipo II (IGF II), liberado em resposta ao

GH nos tecidos alvos. Além da síntese hepática, a produção local de IGF I e

33

IGF II tem também sido demonstrada em diversos outros tecidos e órgãos

(RENAVILLE et al., 2002).

O GH é um hormônio polipeptídeo, com peso molecular de 22

quilodaltons (kDa) constituído por 191 aminoácidos (CASAGRANDE;

CZEPIELEWSKI, 2007). O IGF-I é constituído por 70 aminoácidos e IGF-II por

67 aminoácidos, ambos polipeptídeos de cadeia simples com

aproximadamente 7,5 kDa. O IGF-I e IGF-II apresentam homologia em 70%

dos aminoácidos de suas cadeias, e uma homologia de 50% com a pró-

insulina. A sequência de IGF-I é altamente conservada entre espécies,

enquanto a de IGF-II difere entre as espécies (JONES; CLEMMONS, 1995).

As moléculas de IGF-I e IGF-II interagem com dois tipos de receptores,

tipo I e II, que diferem na sua sequência de aminoácidos, estrutura secundária

e especificidade de ligação-ligante (RAJARAM et al., 1997). O receptor tipo I

tem uma estrutura heterotetramérica homóloga à do receptor de insulina e

apresenta elevada afinidade para o IGF-I. O receptor de tipo II é idêntico ao

receptor da nanose 6-fosfato cátion-independente, com uma afinidade muito

fraca para o IGF-I e nenhuma afinidade para a insulina.

Os IGFs estão presentes em todos os fluidos biológicos, estando 95 a

99% ligados a uma família de seis proteínas estruturais ligadoras de fatores de

crescimento semelhantes à insulina (IGFBPs) (RAJARAM et al., 1997). Em

adultos, a maior parte das proteínas de ligação das IGFs está presente em um

complexo de 150 kDa que contém a IGFBP-3 (45-50 kDa) e uma proteína

adicional de 85 kDa conhecida como subunidade ácido-lábil. As IGFBPs

diferem nas funções e afinidade para o IGF-I e IGF-II. Além de servir como

proteínas transportadoras, há uma crescente evidência de que as IGFBPs

agem como potencializadoras ou moduladoras de várias atividades fisiológicas

complexas das IGFs.

Tratamentos com GH exógeno em vacas leiteiras em lactação,

independentemente da fase de lactação e modo de administração, aumentam

consideravelmente as concentrações de GH plasmático em até cinco vezes.

Utilizando-se de um sistema de detecção eletroquímioluminescente (ECL) e

34

anticorpos monoclonais, verificou-se que as concentrações de GH no leite

foram significativamente mais elevadas (P <0,05) em animais tratados quando

comparados ao grupo controle (BERTOZZI et al., 2001).

Os efeitos fisiológicos e metabólicos do GH em animais de produção

foram bastante documentados (CHILLIARD et al., 2001; LOUVEAU;

BONNEAU, 2001). A eficiência alimentar pode ser melhorada com a

administração de GH (CHILLIARD et al., 2001). O GH leva a um aumento da

lipólise, aumento da síntese de proteínas agregado a diminuição da

degradação de proteínas, bem como, promove um incremento de proteína no

organismo, fundamental para o crescimento (RENAVILLE et al., 2002).

O GH tem ação antagonista direta aos efeitos provocados pela insulina

sendo hiperglicemiante, diminuindo a utilização e oxidação de glicose pelos

tecidos (AIRES, 1991; GHANAAT; TAYEK, 2005), favorecendo a utilização de

ácidos graxos no tecido adiposo e na musculatura esquelética e cardíaca e

produção de glicose pelo fígado (GANONG, 1991; GHANAAT; TAYEK, 2005;

PELL, 1990). O GH é caracterizado como um hormônio “diabetogênico”, pois

aumenta a concentração de glicose circulante e estimula a liberação de mais

insulina para manter a glicemia adequada (CRUZAT et al., 2008; PELL,1990).

Os IGFs apresentam ações semelhantes à insulina em alguns tecidos,

importante atividade insulínica, aumentando a oxidação da glicose em

adipócitos (AIRES, 1991). Nesta situação a insulina é liberada, pois as células

ficam saturadas de glicogênio e o excesso de glicose no sangue estimula a

secreção de insulina, e a hiperglicemia pode ser desenvolvida devido a um

excesso de tamponamento pelo IGFBP-1 nos IGFs livres (ROTUNNO; ZAIA,

2001). Tanto a insulina quanto o IGF-I parecem concorrer para manter normais

os valores de glicose no sangue. O IGF-I auxilia na homeostase da glicose

favorecendo seu transporte para dentro das células, durante o jejum e na

ausência de insulina (NYOMBA et al., 1997). A ação hipoglicemiante da

insulina pode ser impedida pela ação do GH, resultando num quadro de

resistência à insulina com menor captação da glicose pelas células musculares

e adiposas e estimulação da gliconeogênese hepática (BERNE; LEVY, 1990;

35

ROTUNNO; ZAIA, 2001). A ação diabetogênica do GH é apontada como uma

das maiores limitações ao uso crônico de altas doses de GH, pois pode

provocar hiperglicemia, fator de risco para diversas complicações

cardiovasculares (ADAMS, 2000; BORST, 2004).

O GH também é considerado um hormônio “anabólico”, pois promove

um balanço proteico positivo (FRYBURG et al., 1991), aumento na quantidade

de massa muscular (MACHIDA; BOOTH, 2004) e liberação de IGF-1 (ADAMS,

2000), o qual está envolvido na estimulação do processo hipertrófico muscular

(CHEN et al., 2005; MACHIDA; BOOTH, 2004). Os efeitos do GH no

metabolismo proteico dependem da interação entre o GH, as IGFs e os

substratos, em especial, as proteínas (CRUZAT et al., 2008; RENNIE, 2003),

aumentando transporte e a concentração no interior da célula da maioria dos

aminoácidos. O GH estimula a síntese proteica celular, pois aumenta a

transcrição de RNA que, consequentemente, eleva a síntese, por meio dos

ribossomos, de novas proteínas na célula (GUYTON; HALL, 2006; MEDEIROS;

SOUSA, 2008). O GH também desfavorece o catabolismo proteico e de

aminoácidos (GUYTON; HALL, 2006; MEDEIROS; SOUSA, 2008.) diminuindo

o seu uso como fonte de energia. Também está bem estabelecido que o GH

exógeno aumente a massa muscular e diminui o conteúdo lipídico da carcaça

(CHILLIARD et al., 2001; LOUVEAU; BONNEAU, 2001). Estas mudanças

envolvem pelo menos um aumento na síntese de proteínas em animais

alimentados com um nível adequado de proteínas. Assim, o tratamento com

GH cria um estado de balanço positivo de nitrogênio, aumentando a retenção

de nitrogênio e diminuindo o catabolismo proteico. Além disso, proteínas

musculares podem ser mobilizadas, mas de forma limitada, porque a

administração de GH diminui oxidação de aminoácidos e a excreção de

nitrogênio urinário, o que explica o aumento em deposição de proteína em

animais em crescimento (CHILLIARD et al., 2001).

Nos tecidos, o GH aumenta a conversão de ácidos graxos em acetil-

CoA, sendo este utilizado para a produção de energia e, assim, favorecendo a

utilização da gordura para a produção de energia (BERNE; LEVY, 1990). O GH

36

mobiliza grandes quantidades de AGL, do tecido adiposo, para suprir a maior

parte das necessidades energéticas das células (GUYTON, 1982; ROTUNNO;

ZAIA, 2001). O tratamento com GH estimula a lipólise, elevando as

concentrações circulantes de ácidos graxos livres (AGL), aumentando a

capacidade do organismo de responder a estímulos lipolíticos e reduzindo a

oxidação de glicose no tecido adiposo em suínos, ovinos e bovinos (BREIER,

1999; CHILLIARD et al., 2001; LOUVEAU; BONNEAU, 2001). A redução da

deposição de lipídios resulta da diminuição na taxa de lipogênese in vivo

(DUNSHEA et al., 1992) e in vitro (LOUVEAU; BONNEAU, 2001; WANG et al.,

1999) e de um decréscimo na expressão de RNAm e atividades de várias

enzimas lipogênicas (LOUVEAU; BONNEAU, 2001; WANG et al., 1999). Além

disso, administração de GH em bovinos e suínos diminui bruscamente a

quantidade de RNAm da lipoproteína lipase e estearoil-CoA desnaturase no

tecido adiposo (BESWICK; KENNELY, 2000; WANG et al., 1999).

Nas vacas em lactação, a administração de GH é caracterizada por um

aumento no teor de ácidos graxos não esterificados (NEFA) na circulação,

resultante da lipomobilização. A administração de GH também eleva as

concentrações de insulina e glicose no plasma (CHILLIARD et al., 2001;

LOUVEAU; BONNEAU, 2001).

A administração de GH aumentou as concentrações de IGF-I no plasma

em quase quatro vezes 48 horas pós-injeção, atingiu seu pico máximo 10 dias

após a aplicação, permanecendo elevada até o 14o dia pós-aplicação quando

comparada às vacas tratadas com placebo (BERTOZZI et al., 2001). Como

observado em cordeiros, o tratamento crônico com GH leva a um aumento

dose-dependente no número de GHR com alta afinidade hepática e a

autorregulação do GHR. A estimulação do GH em mecanismos pós-receptores

pode levar a um aumento da síntese do IGF-I e um aumento nas

concentrações plasmáticas (BREIER et al., 1994; SÉVE et al., 1993). Este

aumento de IGF-I no soro é acompanhada por um aumento de

aproximadamente 140% na abundância de RNAm de IGF-I no fígado

(VANDERKOOI et al., 1995). A regulação da síntese de IGF-I, em grande

37

parte, é devido ao nível de abundância de RNAm (SÉVE et al., 1993),

evidenciando que o aumento da síntese de IGF-I no fígado é, em grande parte,

responsável pelo aumento na concentração de IGF-I no soro de animais

tratados com GH.

No entanto, em vacas leiteiras, a resposta de IGF-I circulante às injeções

de GH é maior no fim da lactação ou após a secagem do que no início da

lactação, quando as vacas têm um grande balanço energético negativo

(CHILLIARD et al., 2001).

Utilizando-se da técnica de Western Blotting, observou-se que os

tratamentos com GH aumentam a quantidade de IGFBP-3 no soro em

aproximadamente 60% e diminuem a quantidade de IGFBP-2 em 25%

(BERTOZZI et al., 2001). Estes resultados permitem sugerir que a relação

calculada de IGFBP-3/IGFBP-2 é drasticamente alterada pelo tratamento com

GH, e amplifica diferenças significativas entre os animais tratados e não

tratados (BERTOZZI et al., 2001).

2.4 Efeitos da somatotropina recombinante bovina na performance reprodutiva

de fêmeas bovinas

A bST já vem sendo utilizada no Brasil há mais de 30 anos, desde o

início da década de 80. A partir de 1982, usando a tecnologia de recombinação

de DNA, a bST passou a ser produzida em escala comercial possibilitando seu

emprego na produção animal (BAUMAN et al., 1985). A ação anabólica da bST

na glândula mamária, resulta em aumento do número de células alveolares

secretoras e ao estímulo a galactopoiese (BAUMAN, 1992; LEE et al., 2007;

PEEL et al., 1983). Por essa razão, a bST foi um dos primeiros fatores de

crescimento produzidos em grande escala para a indústria da produção animal,

visando aumentar a produção de leite em vacas leiteiras (BAUMAN, 1999).

O uso da bST tem sido proibido em alguns países como Canadá e na

União Europeia (CASTIGLIEGO et al., 2011). Até o momento, não foram

observados efeitos negativos da bST na saúde animal. Após três décadas de

38

pesquisa sobre a bST, não foram encontradas evidências científicas de que o

consumo de leite e carne de animais tratados ofereçam riscos à saúde

humana, inclusive em relação a diminuição da idade da puberdade e a

incidência de câncer de mama (RAYMOND et al., 2009).

A bST e o IGF-I participam da regulação do desenvolvimento folicular,

maturação do oócito, taxa de fertilização, desenvolvimento inicial embrionário,

função do corpo lúteo e reconhecimento materno da prenhez (HERNÁNDEZ-

CERÓN; GUTIERREZ-AGUILAR, 2013).

O número de folículos em crescimento é aumentado quando a vaca ou

novilha é tratada com bST (LUCY, 2000; LUCY et al., 1999). O mecanismo pelo

qual a bST aumenta o desenvolvimento folicular não é completamente

entendido, mas, provavelmente, resulte do efeito estimulatório da bST e/ou

fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-I), este hormônio secundário

liberado em resposta a bST (ETHERTON; BAUMAN, 1998). A bST também

atua na melhoria da qualidade do oócito e desenvolvimento embrionário

(IZADYAR et al., 1996; LUCY, 2000; LUCY et al., 1999; MOREIRA et al.,

2001a; THATCHER et al., 2001).

A administração da bST na inseminação (BILBY et al. 2006; IZADYAR et

al., 1996; MOREIRA et al., 2000), antes da transferência de embrião

(MOREIRA et al., 2001) e em vacas em balanço energético positivo e em mais

de 100 dias de lactação (BELL et al., 2008; STARBUCK et al., 2006) promoveu

aumentado na taxa de concepção. A bST utilizada na superovulação de

doadoras, determinou melhoria na qualidade dos embriões e aumento na taxa

de prenhez (LEE et al., 2007). Entretanto, alguns estudos possibilitaram

evidenciar que a utilização da bST em repetidos protocolos de superovulação

não afetou a taxa de prenhez em novilhas receptoras no momento da

transferência (HASLER et al., 2003), não aumentou a quantidade de embriões

produzidos (BORGES et al., 2001; NEVES et al., 2005) e não incrementou a

resposta ovariana quanto ao número e qualidade de embriões (MORAES

JUNIOR et al., 2008).

39

As consequências do tratamento com bST na fertilidade não são claros.

Em estudos prévios, vacas tratadas com bST tiveram um aumento no intervalo

entre parto-concepção que foi atribuído, pelo menos em partes, ao aumento do

anestro (ESTEBAN et al., 1994a; 1994b). Em contraste, bST tanto aumentou

sucesso na taxa de prenhez (MOREIRA et al., 2000; MOREIRA et al., 2001a)

como também não teve efeito (BLEVINS et al., 2006; JOUSAN et al., 2007;

SANTOS et al., 2004) quando as vacas foram inseminadas utilizando um

protocolo de IATF. O tratamento com bST aumentou a taxa de prenhez em

vacas de segundo serviço que se encontravam em estro (MORALES-ROURA

et al., 2001).

A bST pode ser particularmente efetiva em aumentar a fertilidade

durante períodos de estresse calórico. Isto porque o IGF-I, cuja secreção é

estimulada pela bST (JOUSAN et al., 2007; MCGUIRE et al., 1992), apresenta

propriedades termo protetoras e pode reduzir o efeito da temperatura elevada

no desenvolvimento e apoptose de culturas de embriões bovinos (JOUSAN;

HANSEN, 2004; 2007). De fato, a proporção de vacas lactantes em estresse

por calor que receberam embriões produzidos in vitro que se tornaram prenhes

foi maior quando os embriões foram cultivados em IGF-I antes da transferência

(BLOCK et al., 2003; BLOCK; HANSEN, 2007).

Apesar do uso da bST no verão aumentar IGF-I e melhorar resistência

embrionária ao estresse calórico, não houve efeito da bST na taxa de prenhez

em um estudo que examinou efeito da bST na fertilidade durante estresse

calórico (JOUSAN et al., 2007). Neste experimento, vacas receberam bST

todos os 14 dias iniciando 13 dias antes da IATF. A falha para observar

aumento na fertilidade causada pela bST pode ter sido promovida pelo fato do

bST também promover aumento da temperatura corporal.

Em bovinos o útero e o embrião apresentam receptores para o GH e

IGF-I que por ação endócrina, parácrina e autócrina atuam em ambas as

estruturas durante o estabelecimento da prenhez (KOLLE et al., 2001;

RHOADS et al., 2008; YASEEN et al., 2001). De fato, experimentos realizados

in vivo e in vitro permitiram evidenciar o efeito positivo do GH e IGF-I nas

40

funções uterinas aumentando a expressão de RNAm para proteínas que

constituem o histotrófo e no desenvolvimento do concepto durante o estágio de

pré e peri-implantação em muitas espécies (BILBY et al., 2006; KOLLE et al.,

2002; MARKHAM; KAYE, 2003; SPENCER et al., 1999; WHATES et al., 1998).

Assim o GH e IGF-I constituem uma importante estratégia para promover um

maior desenvolvimento do concepto e uma redução nas perdas embrionárias.

Alguns autores sugerem que tais benefícios sejam dose-dependentes (BILBY

et al., 2004; RIVERA et al., 2010).

Moreira et al. (2002) verificaram que a administração de bST

incrementou as taxas de fertilização, acelerou o desenvolvimento embrionário e

melhorou a qualidade dos embriões. Moreira et al. (2002a) administraram

500mg de bST em doadoras de embriões e/ou receptoras e verificaram que a

administração de bST aumentou a porcentagem de embriões transferíveis, o

número de blastocistos obtidos por lavagem e as taxas de prenhez. A maioria

dos trabalhos realizados com bST abordam seus efeitos em vacas leiteiras em

lactação e doadoras de embrião mestiças. Até o momento existem poucas

investigações realizadas em fêmeas de corte.

III OBJETIVOS

No presente estudo objetivou-se: avaliar o efeito da aplicação de bST,

na dose de 250 ou 500mg, no dia da IATF, na taxa de concepção aos 30 dias

de gestação (Experimento 1); verificar os efeitos da aplicação de 500mg de

bST, sete dias após a IATF, na taxa de concepção aos 30 dias de gestação

(Experimento 2) e averiguar os efeitos do bST na morfometria das glândulas

endometriais e na proporção de células esteroidogênicas luteais (Experimento

3).

41

IV HIPÓTESE

No presente estudo, a hipótese é que vacas de corte tratadas com bST,

no dia da IATF ou sete dias após a IATF, apresentam maiores taxas de

concepção e que a morfometria das glândulas endometriais e a proporção de

células esteroidogênicas luteais são alteradas por tal tratamento.

V MATERIAL E MÉTODOS

5.1 EXPERIMENTO 1

5.1.1 Local do Experimento. O experimento foi conduzido na Fazenda

Santo Antônio, localizada em Araguaiana, situada no estado do Mato Grosso.

O município apresenta latitude de 15º44'02" sul e longitude de 51º49'53" oeste,

estando a uma altitude de 269 metros, caracterizando-se como uma região de

clima tropical.

5.1.2 Animais. Neste estudo foram utilizadas vacas Nelore (n=587),

pluríparas, entre 40 e 70 dias pós-parto. O escore de condição corporal (escala

de 1 a 5) foi de 3,01 + 0,01; 3,00 + 0,01 e 3,00 + 0,01 para o grupo Controle,

bST 250 e bST 500, respectivamente. A condição ovariana foi avaliada por

ultrassonografia (Aloka Ultrasound Diagnostic Equipament, Modelo SSD-500,

Tokyo-Japão), no dia da colocação dos dispositivos, quando verificou-se 30%

das fêmeas cíclicas e 70% em anestro. As fêmeas foram mantidas em pasto de

Brachiaria brizantha com fornecimento de água e suplementação mineral ad

libitum. Os animais utilizados neste estudo foram divididos em oito lotes de

manejo, todos submetidos à IATF no mesmo dia. Os diferentes tratamentos

foram equitativamente divididos em cada lote. Todos os procedimentos

experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação

42

Animal da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Araçatuba,

Araçatuba/SP, Brasil (Protocolo número 2013/00602).

5.1.3 Sincronização das ovulações. O protocolo de sincronização dos

estros está representado na Figura 1. Foram utilizados dispositivos

intravaginais contendo 1g progesterona (DIB®; MSV Saúde Animal) associados

a uma injeção intramuscular (IM) de 2mg benzoato de estradiol (Gonadiol®;

MSV Saúde Animal) no dia da colocação do dispositivo. Os dispositivos foram

removidos oito dias após, quando as vacas foram tratadas com 0,530 mg de D-

cloprostenol (Ciosin®; MSV Saúde Animal) e 300UI eCG (Novormon®; MSV

Saúde Animal). As fêmeas foram tratadas com 1mg de benzoato de estradiol

(Gonadiol®; MSV Saúde Animal), via IM 24 horas após a remoção dos

dispositivos. Após 30 horas da última injeção as vacas foram submetidas à

IATF. O dia da IATF foi considerado o D0.

Figura 1 – Representação esquemática do delineamento referente ao Experimento 1:

colocação do dispositivo intravaginal contendo 1g P4 associado a 2mg de benzoato de

estradiol via IM (D-10); retirada do dispositivo intravaginal associado a administração

de 0,530mg de D-cloprostenol e 300UI de eCG ambos via iM (D-2); administração de

43

1mg de benzoato de estradiol via IM (D-1); IATF (D0) 30 horas após a aplicação da

última injeção; aplicação no D0 de 5ml de solução salina via SC (Grupo Controle; n =

194), 250mg bST via SC (Grupo bST 250; n=197) ou 500mg bST via SC (Grupo bST

500; n=196) e diagnóstico de gestação por ultrassonografia 30 dias após IATF (D30)

em vacas de corte

5.1.4 Procedimento de IATF. Foi utilizado o sêmen de um reprodutor da

raça Aberdeen Angus, com características físicas e morfológicas dentro dos

padrões andrológicos recomendados. As inseminações foram realizadas por

três inseminadores divididos equitativamente entre os diferentes grupos de

tratamento.

5.1.5 Tratamento com bST. Os tratamentos estão representados na

Figura 1. Durante o procedimento de IATF as vacas receberam 5ml de solução

salina (Grupo Controle; n= 194); bST (Boostin) na dose de 250mg (Grupo

bST 250; n=197) ou 500mg (Grupo bST 500; n=196), aplicados via subcutânea

(SC) na fossa ísqueo-retal.

5.1.6 Diagnóstico de Gestação. O diagnóstico de gestação foi realizado

30 dias após a IATF (D30) por ultrassonografia (Aloka Ultrasound Diagnostic

Equipament, Modelo SSD-500, Tokyo-Japão) com transdutor linear de 5mHz.

As fêmeas foram classificadas em prenhes (presença do feto) ou não prenhes

(ausência do feto).

5.1.7 Análise Estatística. Foi utilizado o programa estatístico SAS (SAS,

2003; SAS Institute, Cary, NC, USA). Os dados foram analisados por análise

de variância e os grupos foram comparados pelo Glimmix procedimento do

SAS. No modelo inicial, para análise da taxa de concepção, incluiu-se os

efeitos de tratamento, lote, ECC e as interações. Para a obtenção do modelo

estatístico final, as variáveis explanatórias foram sequencialmente removidas

através do critério estatístico de Wald, utilizando como critério de remoção o

44

valor de P > 0,20. No modelo estatístico final considerou-se apenas o efeito de

tratamento. Nas análises considerou-se um nível de significância de 5%.

5.2 EXPERIMENTO 2

5.2.1 Local do Experimento. O experimento foi conduzido na Fazenda

Jacareúna, localizada no município de São Félix do Araguaia, estado do Mato

Grosso e na Fazenda Guanabara, localizada no município de Andradina,

estado de São Paulo. O município de São Félix do Araguaia apresenta latitude

de 11º37’02” sul, longitude de 50º40’10” oeste, altitude de 195 metros e

caracteriza-se como clima tropical. O município de Andradina apresenta

latitude de 20º53’38” sul, longitude de 51º23’01” oeste, altitude de 405 metros e

caracteriza-se como clima tropical.

5.2.2 Animais. Foram utilizadas vacas Nelore (n=243), pluríparas, entre

35 e 70 dias pós-parto. O escore de condição corporal (escala de 1 a 5) foi de

2,8 + 0,01 e 2,9 + 0,01 para o Grupo Controle e bST 500 respectivamente. As

fêmeas foram mantidas em pasto de Brachiaria brizantha e Panicum maximum,

com fornecimento de água e suplementação mineral ad libitum. Todos os

procedimentos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética em

Experimentação Animal da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus

de Dracena, Dracena/SP, Brasil (Protocolo número 02/2008).

5.2.3 Sincronização das ovulações. O protocolo de sincronização dos

estros está representado na Figura 2. Foram utilizados dispositivos

intravaginais contendo 1g progesterona (DIB®; MSV Saúde Animal) associados

a uma injeção intramuscular (IM) de 2mg benzoato de estradiol (Gonadiol®;

MSV Saúde Animal) no dia da colocação do dispositivo. Os dispositivos foram

removidos oito dias após, quando as vacas foram tratadas com 112,5g de D-

cloprostenol (Preloban®; Intervet Schering-Plough) e 300UI eCG (Folligon®;

Intervet Schering-Plough). As fêmeas foram tratadas via IM com 1mg de

45

benzoato de estradiol (Gonadiol®; MSV Saúde Animal) 24 horas após a

remoção dos dispositivos. Após 30 horas da última injeção as vacas foram

submetidas à IATF.

Figura 2 – Representação esquemática do delineamento referente ao Experimento 2:

colocação do dispositivo intravaginal contendo 1g P4 associado a 2mg de benzoato de

estradiol via IM (D-10); retirada do dispositivo intravaginal associado a administração

de 112,5g de D-cloprostenol e 300UI de eCG ambos via IM (D-2); administração de

1mg de benzoato de estradiol via iM (D-1); IATF (D0) 30 horas após a aplicação da

última injeção; aplicação no D7 de 5ml de solução salina via SC (Grupo Controle; n =

124) ou 500mg bST via SC (Grupo bST 500; n=119) e diagnóstico de gestação por

ultrassonografia 30 dias após IATF (D30) em vacas de corte.

5.2.4 Procedimento de IATF. Para a realização da IATF foi utilizado o

sêmen 14 de reprodutores, com características morfológicas e funcionais

dentro dos padrões andrológicos recomendados. O sêmen de cada reprodutor

foi distribuído equitativamente entre os diferentes grupos de tratamento. A

inseminação foi realizada por dois técnicos na Fazenda Jacareúna e por dois

técnicos na Fazenda Guanabara. Os técnicos foram equitativamente

distribuídos entre os diferentes grupos de tratamento.

46

5.2.5 Tratamento com bST. Os tratamentos estão representados na

Figura 2. Sete dias após a IATF (D7), as vacas receberam 5ml de solução

salina (Grupo Controle; n= 124) ou 500mg de bST (Grupo bST 500; n=119), via

SC na fossa ísqueo-retal.

5.2.6 Diagnóstico de Gestação. O diagnóstico de gestação foi realizado

30 dias após a IATF (D30) por ultrassonografia (Aloka Ultrasound Diagnostic

Equipament, Modelo SSD-500, Tokyo-Japão) com transdutor linear de 5mHz.

As fêmeas foram classificadas em prenhes (presença do feto) ou não prenhes

(ausência do feto).

5.2.7 Análise Estatística. A análise estatística foi realizada utilizando o

programa estatístico SAS (SAS, 2003; SAS Institute, Cary, NC, USA). Os

dados foram analisados por análise de variância e os grupos foram

comparados pelo Glimmix procedimento do SAS. No modelo inicial, para

análise da taxa de concepção, incluiu-se os efeitos de tratamento, lote, ECC e

as interações. Para a obtenção do modelo estatístico final, as variáveis

explanatórias foram sequencialmente removidas através do critério estatístico

de Wald, utilizando como critério de remoção o valor de P > 0,20. No modelo

estatístico final considerou-se apenas o efeito de tratamento. O nível de

significância utilizado para todos os dados obtidos foi de 5%.

5.3 EXPERIMENTO 3

5.3.1 Local do Experimento. O experimento foi conduzido na Fazenda

São José, localizada em Birigui, situada no estado do São Paulo. O município

apresenta uma latitude 21º17'19" sul e uma longitude 50º20'24" oeste, estando

a uma altitude de 450 metros e caracteriza-se como uma região de clima

subtropical.

47

5.3.2 Animais. Foram utilizadas 20 novilhas da raça Nelore (Bos taurus

indicus) não prenhas e cíclicas. As fêmeas foram previamente avaliadas quanto

à idade, peso e escore de condição corporal. O escore de condição corporal

(escala de 1 a 5) foi de 2,80 + 0,01 e 2,80 + 0,01 para o grupo Controle e bST

500, respectivamente. A condição ovariana foi avaliada por ultrassonografia

(Aloka Ultrasound Diagnostic Equipament, Modelo SSD-500, Tokyo-Japão), no

dia da colocação dos dispositivos, quando se verificou 40% das fêmeas cíclicas

e 60% em anestro. Durante o experimento, as novilhas foram mantidas em

confinamento e recebiam uma ração contendo em sua formulação: 1.220 kg

cana de açúcar picada + 850 kg de germe de milho + 500 kg de polpa de

laranja + 340 kg de torta de algodão + 30 kg de uréia + 60 kg de núcleo mineral

(Nutri proteinado S para bovinos de corte - Cobrac). As novilhas tiveram livre

acesso a sal mineral e água. Todos os procedimentos experimentais foram

aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da

Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Araçatuba,

Araçatuba/SP, Brasil (Protocolo número 2013/00602).

5.3.3 Sincronização das ovulações. O protocolo de sincronização das

ovulações está representado na Figura 3. As fêmeas tiveram os estros

sincronizados pelo uso de um dispositivo intravaginal novo contendo 1g de

Progesterona (DIB®, MSV Saúde Animal) associado a uma injeção de 2mg de

Benzoato de Estradiol (RIC-BE®, Tecnopec) via intramuscular (IM). Após oito

dias, os dispositivos foram retirados e os animais receberam uma injeção de

0,530 mg de D-Cloprostenol (Sincrocio®, Ouro Fino) e 300UI de eCG

(Novormon®, MSV Saúde Animal), via IM. As fêmeas foram tratadas com 1 mg

de benzoato de estradiol (RIC-BE®, Tecnopec), via IM 24 horas após a

remoção dos implantes. Após 30 horas da ultima injeção as fêmeas receberam

os tratamentos, foi considerado o D0.

48

Figura 3 – Representação esquemática do delineamento referente ao Experimento 3:

colocação do dispositivo intravaginal contendo 1g P4 associado a 2mg de benzoato de

estradiol via IM (D-10); retirada do dispositivo intravaginal associado a administração

de 0,530mg de D-cloprostenol e 300UI de eCG ambos via IM (D-2); administração de

1mg de benzoato de estradiol via iM (D-1); Dia esperado para o estro (D0); aplicação

no D0 de 5ml de solução salina via SC (Grupo Controle; n = 9) ou 500mg bST via SC

(Grupo bST 500; n=11) e abate dos animais com coleta de útero e corpo lúteo (D15)

em vacas de corte.

5.3.4 Tratamento com bST. Os tratamentos estão representados na

Figura 3. As novilhas receberam 5ml de solução salina (Grupo Controle; n= 10);

ou bST (Boostin) na dose de 500mg (Grupo bST 500; n=11), aplicados via

subcutânea (SC) na fossa ísqueo-retal.

5.3.5 Coleta do Corpo Lúteo. Imediatamente após o abate das fêmeas

no D15, os ovários foram removidos, pesados separadamente e aferidos

quanto ao diâmetro. O corpo lúteo foi isolado e mensurado quanto ao diâmetro

e peso. O corpo lúteo foi segmentado em quatro cortes que foram

imediatamente acondicionados em solução fixadora de formol tamponado

49

(PAF), pH 7,0. Posteriormente os fragmentos foram lavados por seis vezes

consecutivas, a cada 12 horas, com solução de PBS pH 7,5.

5.3.6 Preparo Histológico do Corpo lúteo. Após a fixação o tecido foi

desidratado, através de imersão em uma sequência de soluções alcoólicas em

concentrações graduais e crescentes. Inicialmente imergiu-se o tecido por 60

minutos em álcool 70%; posteriormente em álcool 90% por 60 minutos, seguido

por dupla lavagem com álcool absoluto totalizando 120 minutos e finalmente

uma dupla lavagem com xilol totalizando mais 120 minutos. Após a

desidratação o tecido foi “emblocado” em parafina (Histosec). O tecido foi

submetido a secções de 6 a 8m de espessura. Posteriormente, este tecido foi

tratado com xilol novamente para remoção da parafina. Em seguida foi

reidratado e submetido à coloração com hematoxilina-eosina (HE).

5.3.7 Avaliação das células luteais esteroidogênicas. As lâminas coradas

foram submetidas a um sistema de análise de imagem computadorizada (Leco

2001, MI, EUA) acoplado a uma câmera fotográfica (Axioplan 2, Modelo: MC 80

DX - Microscope Camera, Marca: ZEISS). As imagens foram registradas com a

câmera. Posteriormente foram submetidas à análise morfométrica por um

sistema de análise de imagem computadorizada conectado a um microscópio

de luz. As células esteroidogênicas foram individualmente mensuradas quanto

ao diâmetro, onde se considerou CLP quando o diâmetro médio foi < 20m e

CLG quando foi > 20m. Para estimar a porcentagem de CLG e CLP foram

contadas 200 células no total, obtidas em 16 lâminas/animal/tempo. Tal

avaliação foi realizada automaticamente pelo Select Measurements Windows

pela medição dos campos selecionados aleatoriamente.

5.3.8 Análise estatística para avaliação do corpo lúteo. A análise

estatística foi realizada utilizando o programa estatístico SAS (2009 versão 9.2;

SAS Institute Inc., Cary, NC), considerando as vacas como unidade

experimental. Foi procedida uma análise pontual levando em conta, no modelo,

50

o efeito do tratamento (tratamento controle ou tratamento bST). Considerou-se

vaca com efeito aleatório e vaca dentro de cada tratamento. As variáveis

contínuas foram testadas quanto à normalidade utilizando o artifício “Guided

Data Analysis” do SAS e quando necessário foram transformadas, conforme a

sugestão do programa para alcançar a normalidade. Os dados foram

analisados por análise de variância. As médias foram analisadas pelo Proc

Glimmix do SAS. Em todas as análises considerou-se um nível de significância

de 5%. Todos os resultados foram apresentados na forma de média ± erro

padrão não transformados.

5.3.9 Coleta do tecido endometrial. Imediatamente após o abate das

fêmeas no D15, o sistema genital foi isolado e o corno uterino ipsolateral ao

corpo lúteo foi seccionado longitudinalmente de modo a expor o tecido

endometrial. Foi realizada uma secção do corno uterino em todo o seu

diâmetro, no terço médio do corno contralateral ao corpo lúteo. O tecido foi

imediatamente acondicionado em solução fixadora de formol tamponado (PAF),

pH 7,0 (500ml de formol 40%, 20g de NaH2PO4 + H2O, 32,5g de NaH2PO4 e 5

litros de água destilada) por 24 horas. Posteriormente, os fragmentos foram

lavados por seis vezes consecutivas, a cada 12 horas, com solução de PBS pH

7,5.

5.3.10 Preparo histológico do tecido uterino. Após a fixação o tecido foi

desidratado, através de imersão numa sequência de soluções alcoólicas em

concentrações graduais e crescentes. A graduação foi iniciada imergindo-se o

tecido por 60 minutos em álcool 70%; posteriormente em álcool 90% por 60

minutos, seguido por dupla lavagem com álcool absoluto totalizando 120

minutos e finalmente uma dupla lavagem com xilol P.A – ACS totalizando 120

minutos. Após a desidratação do tecido o material foi primeiramente incluso por

duas horas em parafina histológica (Histosec), uma hora por vez, para posterior

“emblocamento” de forma a obter blocos de resina com o fragmento de tecido

em seu interior. Após a inclusão das amostras, secções endometriais de 4µm

51

de espessura foram cortadas em micrótomo (Leica RM 2155 – Rotary

Microtome) e dispostas em lâminas de vidro previamente identificadas. Em

seguida, as lâminas foram colocadas por 2 horas em estufa sob temperatura de

56°C a 58°C, com intuito de derreter o excesso de parafina, e posteriormente

foram transferidas para cubetas de coloração para dar seguimento a

desparafinação. Na Bateria I de coloração (Bateria I: submeteram-se as

cubetas a xilol I por 10 minutos, xilol II por 10 minutos, álcool 100% I por 5

minutos, álcool 100% II por 5 minutos, álcool 90% por 5 minutos, álcool 70%

por 5 minutos). Após os passos supracitados seguiu-se com o protocolo de

coloração Hematoxilina - Eosina (HE). Nesse, as cubetas foram submetidas à

água destilada por 15 minutos, corante hematoxilina de Harris por 1 minuto,

água corrente por 4 minutos, corante eosina a 5% por 1 minuto. Após a

coloração com HE, os cortes foram desidratados com a Bateria II de coloração

(Bateria II: submeteram-se as cubetas a álcool 95% por 5 minutos, álcool

100% I por 5 minutos, álcool 100% II por 5 minutos, xilol diafranizador por 5

minutos, xilol intermediário por 5 minutos e xilol de montagem por no mínimo

15 minutos). A seguir, colocou-se sobre cada corte corado uma gota de

bálsamo do Canadá (Entellan, Marca: Merk) e cobriu-se esse com lamínula. O

tempo estimado para que o material ficasse seco e pronto para a análise por

microscopia de luz foi de 72 horas.

5.3.11 Análise morfométrica das glândulas endometriais. Após a

obtenção das lâminas histológicas coradas, estas foram submetidas a um

sistema de análise de imagem computadorizada programado a um microscópio

de luz com câmera fotográfica (Axioplan 2, Modelo: MC 80 DX - Microscope

Camera, Marca: ZEISS), com o objetivo de obter fotos tiradas de 10 campos

ópticos selecionados aleatoriamente, 5 a partir de uma região superficial do

endométrio e 5 a partir de uma região de profundidade, com uma lente de

aumento 10x. Posteriormente, as fotos foram analisadas através do “software”

Image-Pro® PLUS-The Proven SolutionTM para obtenção do número de

glândulas, perímetro (μm) e área (μm2) das glândulas endometriais superficiais.

52

Foi mensurado do número de glândulas, perímetro (μm) e área (μm2) das

glândulas endometriais profundas; assim como todas estas medidas para as

glândulas totais (superficiais + profundas). A contagem do número de glândulas

endometriais foi realizada pela leitura de 10 campos ópticos selecionados

anteriormente.

5.3.12 Análise estatística da morfometria das glândulas endometriais. A

análise estatística foi realizada utilizando o programa estatístico SAS (versão

9.2; SAS Institute Inc., Cary, NC). A análise estatística considerando a

avaliação do número de glândulas endometriais sob o efeito de tratamento em

determinado tempo, considerou-se as vacas como unidade experimental. Fez-

se uma análise pontual levando em conta, no modelo, o efeito do tratamento

(tratamento controle ou tratamento com bST). Considerou-se vaca com efeito

aleatório e vaca dentro de cada tratamento. Na análise estatística considerando

apenas efeito de tratamento (tratamento controle ou bST), considerou-se vaca

com efeito aleatório e vaca dentro de cada tratamento. As variáveis contínuas

foram testadas quanto à normalidade utilizando o artifício “Guided Data

Analysis” do SAS e quando necessário foram transformadas conforme a

sugestão do programa para alcançar a normalidade. Os dados foram

analisados por análise de variância. As médias foram analisadas pelo Proc

Glimmix do SAS. Em todas as análises considerou-se um nível de significância

de 5%. Todos os resultados foram apresentados na forma de média ± erro

padrão não transformados.

VI RESULTADOS

6.1 Experimento 1. As taxas de concepção não diferiram entre os

tratamentos (p>0,05) e foram de 59,27% (115/194), 58,37% (115/197) e

65,82% (129/196) para os grupos Controle, bST 250 e bST 500

respectivamente, conforme representado na Figura 4.

53

Figura 4 – Experimento 1: Efeito do tratamento na taxa de concepção 30 dias após a

IATF (D30), em vacas Nelore pluríparas submetidas à IATF, tratadas com 5ml de

solução salina (Grupo Controle; n= 194) ou bST (Boostin) na dose de 250mg (Grupo

bST 250; n=197) ou 500mg (Grupo bST 500; n=196), via subcutânea (SC), p>0,05

6.2 Experimento 2. As taxas de concepção não diferiram (p>0,05) entre

os tratamentos e foram de 57,3% (71/124) e 60,50% (62/119) para o Grupo

Controle e bST 500 respectivamente, conforme representado na Figura 5.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Grupo Controle Grupo bST 250 Grupo bST 500

54

Figura 5 – Experimento 2: Efeito do tratamento na taxa de concepção 30 dias após a

IATF (D30), em vacas Nelore pluríparas submetidas à IATF, tratadas com 5ml de

solução salina (Grupo Controle; n= 124) ou 500mg de bST (Grupo bST 500; n=119),

via subcutânea (SC), p>0,05.

6.3 Experimento 3. As variáveis analisadas em relação ao corpo lúteo

estão representadas na Tabela 1. As imagens utilizadas para a composição

celular do corpo lúteo estão ilustradas nas Figuras 6 e 7. Não houve diferença

(p>0.05) entre o grupo controle e bST 500 para o peso médio dos ovários

(5,405 + 0,917 vs. 6,496 + 0,479g respectivamente; p=0,2712), diâmetro do

ovário esquerdo (2,068 + 0,140 vs. 2,254 + 0,096cm respectivamente;

p=0,2734), diâmetro do ovário direito (2,250 + 0,125 vs. 2,286 + 0,124cm

respectivamente; p=0,8435), diâmetro do corpo lúteo (1,335 + 0,054 vs. 1,590

+ 0,147cm respectivamente; p=0,1737), peso do corpo lúteo (2,325 + 0,226 vs.

3,010 + 0,313g respectivamente; p=0,1172), porcentagem de CLG (12,062 +

1,778 vs. 8,772 + 1,392% respectivamente; p=0,1589) e porcentagem de CLP

(77,187 + 10,980 vs. 91,22 + 1,392% respectivamente; p=0,1538).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Grupo Controle Grupo bST 500

55

Tabela 1 – Experimento 3: Média e erro padrão do peso dos ovários, diâmetro do

ovário esquerdo, diâmetro do ovário direito, diâmetro do corpo lúteo, peso do corpo

lúteo, porcentagem de CLG e porcentagem de CLP no D15, em novilhas Nelore

tratadas com 5ml de solução salina via SC (n=9) ou com 500mg de bST (n=11) no D0

(D0=dia esperado para o estro)

Variáveis Grupo Controle

(n=9)

Grupo bST 500mg

(n=11)

Valor de

P

Peso Médio dos Ovários (g)

[(ovário esquerdo + ovário

direito)/2]

5,405 + 0,917

6,496 + 0,479

0,2712

Diâmetro Ovário Esquerdo (cm) 2,068 + 0,140 2,254 + 0,096 0,2734

Diâmetro Ovário Direito (cm) 2,25 + 0,125 2,286 + 0,124 0,8435

Diâmetro do Corpo Lúteo (cm) 1,335 + 0,054 1,590 + 0,147 0,1737

Peso do Corpo lúteo (g) 2,325 + 0,226 3,010 + 0,313 0,1172

CLG (%) 12,062 + 1,788 8,772 + 1,392 0,1589

CLP (%) 77,187 + 10,980 91,22 + 1,392 0,1538

56

Figura 6 – Experimento 3: Imagem das células luteais esteroidogênicas do corpo lúteo,

coradas por hematoxilina-eosina, em aumento de 40X, ilustrando células luteais

grandes (CLP; diâmetro < 20 μm) e células luteais pequenas (CLP; diâmetro > 20 μm)

no D15 (D0 = dia esperado para o estro) em novilhas Nelore tratadas com 5ml de

solução salina via SC (Grupo Controle; n = 9).

57

Figura 7 – Experimento 3: Imagem das células luteais esteroidogênicas do corpo lúteo,

coradas por hematoxilina-eosina, em aumento de 40X, ilustrando células luteais

grandes (CLP; diâmetro < 20 μm); células luteais pequenas (CLP; diâmetro > 20 μm),

no D15 (D0 = dia esperado para o estro) de novilhas Nelore tratadas com 500 mg de

bST via SC (Grupo bST 500; n = 11).

58

As variáveis analisadas em relação às glândulas endometriais estão

representadas na Tabela 2. As imagens utilizadas para a avaliação das

glândulas endometriais superficiais, profundas e totais estão ilustradas nas

Figuras 8 e 9. Não foi observada diferença significativa (p>0.05) entre o grupo

controle e bST 500 para as glândulas endometriais superficiais quanto ao

número (19,984 + 2,014 vs. 17,340 + 2,039 respectivamente; p=0,2596),

perímetro (208,371 + 34,713 vs. 251,536 + 17,346m respectivamente;

p=0,2437) e área (3173,54 + 659,087 vs. 3885,92 + 476,580m2

respectivamente; p=0,8435). Não foi observada diferença significativa (p>0.05)

entre o grupo controle e bST 500 para as glândulas endometriais profundas

quanto ao número (25,566 + 2,226 vs. 29,935 + 1,683 respectivamente;

p=0,2506), perímetro (170,287 + 23,807 vs. 198,817 + 10,834m

respectivamente; p=0,2437) e área (1920,89 + 254,89 vs. 2153,333 +

196,100m2 respectivamente; p=0,3806). Não foi observada diferença

significativa (p>0.05) entre o grupo controle e bST 500 para as glândulas

endometriais totais quanto ao número (45,550 + 8,063 vs. 47,275 + 2,644

respectivamente; p=0,8230), perímetro (378,658 + 55,636 vs. 450,353 +

19,632m respectivamente; p=0,1790) e área (5094,43 + 875,523 vs. 6039,253

+ 555,09m2 respectivamente; p=0,3359).

59

Tabela 2 – Experimento 3: Avaliação do número, perímetro (m) e área (m2) das

glândulas endometriais superficiais, profundas e totais em novilhas Nelore tratadas

com 5ml de solução salina via SC (n=9) ou com 500mg de bST (n=11) no D0 (D0=dia

esperado para o estro).

Variáveis Grupo Controle

(n=9)

Grupo bST 500mg

(n=11)

Valor de

P

Número de glândulas

endometriais superficiais

19,984 + 2,014

17,340 + 2,039

0,2506

Perímetro das glândulas

endometriais superficiais (m)

208,371 + 34,713

251,536 + 17,346

0,2437

Área das glândulas endometriais

superficiais (m2)

3173,54 + 659,087

3885,92, + 476,580

0,8435

Número de glândulas

endometriais profundas

25,566 + 2,226

29,935 + 1,683

0,2506

Perímetro das glândulas

endometriais profundas (m)

170,287 + 23,807

198,817 + 10,834

0,2437

Área das glândulas endometriais

profundas (m2)

1920,89 + 254,89

2153,333 +

196,100

0,3806

Número de glândulas

endometriais totais

45,550 + 8,063

47,275 + 2,644

0,8230

Perímetro das glândulas

endometriais totais (m)

378,658 + 55,636

450,353 + 19,632

0,1790

Área das glândulas endometriais

totais (m2)

5094,43 + 875,523

6039,253 + 555,09

0,3359

60

Figura 8 – Experimento 3: Imagem das glândulas endometriais superficiais, coradas

por hematoxilina-eosina, em aumento de 20X no D15 (D0 = dia esperado para o estro)

em novilhas Nelore tratadas com 500mg de bST via SC (Grupo bST 500; n = 11) ou

com 5ml de solução salina SC (Grupo Controle; n=9), respectivamente.

61

Figura 9 – Experimento 3: Imagem das glândulas endometriais profundas, coradas por

hematoxilina-eosina, em aumento de 20X no D15 (D0 = dia esperado para o estro) em

novilhas Nelore tratadas com 500mg de bST via SC (Grupo bST 500; n = 11) ou com

5ml de solução salina SC (Grupo Controle; n=9), respectivamente.

62

VII DISCUSSÃO

7.1 EXPERIMENTO 1

O uso do bST em protocolos de IATF tem sido associado a maiores

taxas de concepção em vacas de leite (MOREIRA et al., 2001), porém, são

poucos os relatos em vacas de corte. Recentemente, Albuquerque et al. (2012)

utilizaram em vacas Nelore paridas, protocolo de sincronização similar ao

utilizado neste estudo, associado a aplicação de 0 (n=294), 167 (n=304) ou

333mg (n=298) de bST no dia da IATF. A taxa de concepção encontrada foi de

37,4% no grupo controle, 45,4% para a dose de 167mg e 46% para as tratadas

com 333mg, tendo havido efeito de tratamento, embora não tenha havido efeito

de dose. É possível observar que embora tenha havido incremento na

fertilidade, a taxa de concepção do grupo controle foi menor (37,4%)

comparado à taxa usualmente encontrada em rebanhos comerciais de 49,1%.

(BARUSELLI et al., 2008; SÁ FILHO et al., 2009). Os mesmos autores

verificaram em um segundo experimento que, quando vacas Nelore foram

submetidas a IATF e receberam duas aplicações de bST, na dose de 333mg

no dia da IATF e onze dias após, a taxa de concepção não foi aumentada,

sendo de 48% no grupo controle e 42,3% no tratado. Pode-se observar, no

segundo estudo destes autores, que a taxa de concepção do grupo controle foi

maior quando comparada a taxa de concepção do primeiro estudo (48% vs.

37,4%), ou seja, quando a taxa do grupo controle foi de 48% o incremento na

fertilidade não pode ser observado.

No presente estudo, quando o bST foi administrado no dia da IATF, na

dose de 250 e 500mg, as taxas de concepção não foram aumentadas (59,27%

vs. 58,37% vs. 65,82%). Nesta ocasião, verificou-se uma maior taxa de

concepção no grupo controle (59,27%) comparada a taxa relatada em

rebanhos. Altas taxas de concepção no grupo controle também foram

evidenciadas no experimento 2 deste estudo (57,3%), ocasião que não houve

incremento na taxa de concepção. Tais evidências permitem sugerir que o bST

63

aumenta a taxa de concepção em rebanhos de corte usualmente com menores

taxas de concepção. Possivelmente, vacas com baixa condição corporal sejam

favorecidas pela aplicação de bST.

Em vários estudos evidenciou-se que a aplicação de bST promoveu um

aumento progressivo nas concentrações plasmáticas de GH e IGF-I ao longo

dos primeiros 7 dias, quando evidencia-se um pico destes hormônios,

prosseguido de um declínio diário gradual (RIBEIRO et al., 2013; ABOIN et al.,

2013). Desta forma, presume-se que a aplicação de bST no momento da IATF,

promove maiores concentrações de bST no período que coincidiria com o início

do desenvolvimento embrionário até o sétimo dia de desenvolvimento.

Kolle et al. (2001) demonstrou que receptores de GH estão presentes no

embrião a partir do estágio de duas células quando atua no metabolismo de

glicogênio e no transporte de lipídios ao embrião. Spencer et al. (1999)

demonstraram que o epitélio glandular do útero ovino respondeu a

administração intra-uterina de GH aumentando a expressão de RNAm das

proteínas que constituem o histotrófo, condição que favoreceu uma maior

produção de IFN-τ. Ribeiro et al. (2013) também verificaram que o GH e IGF-I

além de estimular a secreção de uma maior quantidade de histotrófo, iduziu a

proliferação celular e promoveu efeitos anti-apoptóticos. O aumento da

proliferação celular e o elongamento do concepto tornam-se extremamente

importantes para prevenir a luteólise e manter a gestação (SPENCER et al.,

1999). Tais ações associadas potencializariam o desenvolvimento do embrião

aumentando as possibilidades de sobrevivência embrionária. Considerando

estes relatos, no presente experimento, seria esperado um aumento na taxa de

concepção, evento que não foi caracterizado. De fato, a dose de bST para

vacas de corte não está estabelecida e as respostas dos embriões ao GH in

vitro foram usualmente dose-dependentes (MARKHAM; KAYE, 2003). Os

mesmos autores enfatizam a importância da dose de bST na subsequente

concentração de GH e IGF-I no estímulo a fertilidade. Possivelmente, a

ausência de incremento na fertilidade decorra de uma inadequada dose

64

utilizada, sugere-se que haja uma dose resposta que merece ser melhor

averiguada.

Em espécies de laboratório o excesso de IGF-I no útero afetou

negativamente a sobrevivência embrionária (PINTO et al., 2002). De fato, Bilby

et al. (1999) e Starbuck et al. (2003) relataram que a administração de bST em

vacas de corte e vacas leiteiras tipicamente aumentam as concentrações de

IGF-I mas falham em aumentar a fertilidade. Segundo Chi et al. (2000)

quantidades excessivas de IGF-I foram correlacionadas a uma maior apoptose

na massa celular interna do embrião (CHI et al., 2000). Tais efeitos negativos

seriam mediados por uma redução nos receptores de IGF nas células

embrionárias, desta forma determinando um redução na absorção de glicose

pelo embrião.

7.2 EXPERIMENTO 2

Considerando que a administração de bST foi realizada 7 dias após a

IATF, presume-se que os maiores efeitos ocorreriam do 7o ao 14o dia de

desenvolvimento do concepto, fase de elongamento do mesmo. Ribeiro et al.

(2013) trataram vacas leiteiras em lactação com 325mg de bST no dia da IA ou

a mesma dose no dia da IA e 14 dias após. Os autores verificaram que a

utilização de duas aplicações de bST reduziu a taxa de concepção quando

comparado à administração de uma única aplicação de bST, porém, promoveu

um aumento progressivo nas concentrações plasmáticas de GH e IGF-I ao

longo dos primeiros 7 dias. Os autores verificaram que o uso de duas doses

aumentou o diâmetro longitudinal da vesícula aminiótica e o tamanho do

concepto aos 34 e 48 dias de prenhez em relação ao grupo controle e única

dose, embora as taxas de concepção não tenham diferido. No presente estudo

a taxa de concepção não foi favorecida em animais tratados com 500mg de

bST sete dias após a IATF.

65

No estudo de Ribeiro et al. (2013) a dose de 325mg promoveu aumento

nas concentrações de GH e IGF-I mas não foi suficiente para alterar as

concentrações de P4. No presente estudo, no experimento 2, as concentrações

de P4 não foram alteradas no D7 e D16 em vacas de corte que receberam

500mg de bST sete dias após a IATF. De fato, os estudos com bST para

aumentar a fertilidade não relatam seus efeitos no tecido luteal e não

correlacionam seus efeitos positivos na fertilidade a maiores concentrações de

P4.

Experimentos realizados in vivo e in vitro evidenciaram que o GH e IGF-I

estimulam as funções uterinas e o desenvolvimento do concepto durante o

estágio de pré e peri-implantação em muitas espécies (WHATES et al., 1998;

SPENCER et al., 1999; KOLLE et al., 2002; MOREIRA et al., 2002;

MARKHAM; KAYE, 2003; BILBY et al., 2006). Assim GH e IGF-I constitui uma

importante estratégia para promover o maior desenvolvimento do concepto e

desta forma reduzir a mortalidade embrionária. Sugere-se que tais benefícios

são dose-dependentes (BILBY et al., 2004; RIVERA et al., 2010).

Possivelmente, no presente estudo, o aumento na taxa de concepção não

tenha sido evidenciado pela alta taxa de concepção do grupo controle,

conforme também discutido no experimento 1 e pelo uso de uma dose

inadequada de bST nas vacas de corte.

7.3 EXPERIMENTO 3

Evidenciou-se em alguns estudos in vivo e in vitro que a bST favorece o

crescimento do tecido luteal. O RNAm e a proteína do receptor de bST foram

localizados no CL (SCOTT et al., 1992) e nas CLG (LUCY et al., 1993). A

administração de bST aumentou o peso do CL (LUCY et al., 1995) e as

concentrações plasmáticas de P4 plasmática em fêmeas bovinas (GALLO;

BLOCK, 1991; SCHEMM et al., 1990). Lucy et al. (1995) trataram vacas de

leite com 25mg/dia bST (n=8) ou solução salina (n=8) por 16 dias após estro.

As vacas foram abatidas 17 dias após a injeção de bST e os ovários, útero e

66

concepto foram coletados. Verificou-se que a bST aumentou o peso do CL e o

número de folículos grandes (10 a 15 mm de diâmetro). Os mecanismos

através dos quais a bST aumenta o peso do CL não estão esclarecidos. A

diferenciação de células da granulosa, durante o período de peri-ovulação pode

ter sido estimulado porque a bST foi iniciada no dia do estro (LUCY et al.,

1995). Estudos posteriores, no entanto, não conseguiram demonstrar um efeito

positivo da bST no CL durante o período peri-ovulatório (LUCY et al., 1994).

No presente estudo, considerando os efeitos do GH e IGF-I no

crescimento dos tecidos, hipotetizou-se que a proporção de çelulas luteais

esteroidogênicas seria alterada por tal tratamento. Tal efeito não foi observado,

a proporção de CLG e CLP não foi diferente para novilhas tratadas com 500mg

de bST quando comparada ao grupo controle. Verificou-se que o peso e

diâmetro dos ovários e CL, assim como a proporção de CLG e CLP não foi

alterada me fêmeas tratadas com bST. De fato, os estudos com bST para

aumentar a fertilidade não correlacionam seus efeitos positivos na fertilidade a

maiores concentrações de P4. No estudo de Ribeiro et al. (2013) a dose de

325mg promoveu aumento nas concentrações de GH e IGF-I mas não foi

suficiente para alterar as concentrações de P4. De fato, Aboin et al. (2013)

verificaram que as concentrações séricas de P4 e catabolismo de P4 hepática

não foram afetadas pela administração BST e pelo aumento subsequente nas

concentrações de IGF-I sérico. Da mesma forma, Cooke et al. (2012) avaliaram

novilhas sem corpo lúteo, mas recebendo P4 exógena como uma abordagem

para estimar o catabolismo hepático de P4. Estes autores relataram que

novilhas que receberam 250mg de bST apresentaram semelhantes

concentrações plasmáticas de P4 e semelhante taxa de degradação de P4

hepática, no D6, D8 e D10 em relação à administração do tratamento, em

comparação com grupos que receberam solução salina.

Em bovinos o útero e o concepto apresentam receptores para o GH e

fator IGF-I, que por ação endócrina, parácrina e autócrina atuam em ambas as

estruturas durante o estabelecimento da prenhez (KOLLE et al., 2001;

RHOADS et al., 2008; YASEEN et al., 2001). De fato, experimentos realizados

67

in vivo e in vitro permitiram evidenciar o efeito positivo do GH e IGF-I nas

funções uterinas aumentando a expressão de RNAm para proteínas que

constituem o histotrófo e no desenvolvimento do concepto durante o estágio de

pré e peri-implantação em muitas espécies (BILBY et al., 2006; KOLLE et al.,

2002; MARKHAM; KAYE, 2003; SPENCER et al., 1999; WHATES et al., 1998).

Considerando os efeitos de ambos no crescimento dos tecidos e seus efeitos

positivos na secreção de histotrófo hipotetizou-se no presente estudo que a

aplicação de bST promoveria alterações na morfometria das glândulas

endometriais. Os receptores para a bST e IGF-1 estão presentes no

endométrio de vacas (WATHES et al., 1998) e em alta concentração nas

glândulas endometriais. Sugere-se que o IGF-1 regularia a atividade secretória

de tais glândulas (MOREIRA et al., 2002a). Portanto, o aumento nas

concentrações de IGF-1 em consequência do tratamento com bST exerceria

um efeito estimulatório na atividade secretória das glândulas endometriais. Tal

efeito promoveria um ambiente uterino mais favorável ao desenvolvimento do

embrião e concepto, facilitando a manutenção da gestação (MOREIRA et al.,

2002a). Entretanto, tal efeito não foi evidenciado considerando não ter havido

aumento no número, perímetro e área das glândulas endometriais superficiais,

profundas e totais. Desta forma, possivelmente a ação do bST no histotrófo

decorra da maior expressão e síntese de proteínas que constituem o mesmo

sem que haja uma promoção no número de células endometriais.

VIII CONCLUSÃO

Conclui-se que vacas tratadas com bST, no dia da IATF ou sete dias

após a IATF, não apresentam maiores taxas de concepção e que a

morfometria das glândulas endometriais e a proporção de células

esteroidogênicas luteais não são alteradas por tal tratamento.

68

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