Bioquímica e Fisiologia Microbiana

Ciclo celular bacteriano

Ciclo celular bacteriano

Divisão celular

Após decatenação dos cromossomas, estes migram para os pólos – proteínas Par, que se ligam ao DNA e alinham os nucleóides ao longo do eixo da célula.

Ínicio da formação do septoLocalização do septo – regulação pelo produto dos genes minC, minD, minEMutantes originam mini-células, anucleadas

Recrutamento da proteína FtsZ e formação da constrição

Formação do septo

Recrutamento de proteínasFtz, PbP3 (formação de peptidoglicano especificamente no septo), ZipA, FtsN, FtsA,…

Mutantes fts – filamentous temperature-sensitive

CELL DIVISION IN GRAM-NEGATIVE RODS

Eventos do ciclo celular em procariotas e eucariotas

Vários métodos para estudar o ciclo celular em microrganismos:

Técnica de eluição em membranasAnálise de células separadas de acordo com o seu tamanhoCitometria de fluxo

Período B: duração depende da taxa específica de crescimento

Período C: duração de cerca de 40 minutos

Período D: duração de cerca de 20 minutos

Tempo de geração ∼ 60 minutos duração B = 0Fig. a-b Overlapping replication cycles at rapid growth. a Replication of the circular bacterial chromosome starts at a unique site, oriC, and proceeds bidirectionally to the terminus, terC. The picture shows the chromosome at four different stages of replication. The circles viewed from the side appear as lines without or with branches.B the generation time of bacteria can be varied by using different growth media. The C periods of E. coli are essentially 40 min and 20 min, respectively, at 37 oC. Time “-100” means 100 min until cell division. At time 0, cell division takes place. The figure shows the time of initiation of the cell cycle at different growth rates. At generation times beyond the C + D periods (60 min), there is a period without DNA replication (B period) in the young cells. The cells are born with a non-replicating chromosome. At generation times between 30 and 60 min. DNA replication starts in the mother cell, and the cells are born with a partly replicated chromosome: hence , two origins are present in these cells, and two initiations occur in each cell during one cell cycle. Finally, at generation times between 20 and 30 min, DNA replication starts in the grandmother cell, and the cells are born with chromosomes in which there are two consecutive replication cycles, and initiation of replication takes place at four origins during each cell cycle.

Genes involved in cell division

Regulação do Metabolismo

A célula bacteriana catalisa um nº elevado de reacções (1000 – 2000), organizadas em vias metabólicas. É de importância vital para a célula a coordenação entre as várias vias metabólicas.

As vias metabólicas são reguladas ajustando a velocidade de um ou mais enzimas regulatórios da via e que determinam a velocidade global da via.

Existem basicamente duas formas de regular a velocidade com que fluem os metabolitos nas vias metabólicas:

-Quantidade de enzima

-Actividade enzimática

Actuação ao nível da quantidade de enzima:

- Transcrição/Tradução

Actuação ao nível da actividade das enzimas:

-Controlo por inibição de feedback

Feedback inhibition. The final product of a series of enzymatic reactions, metaboliten, has the property of binding to the regulatory site of the allosteric protein, enzyme1, and thereby inhibiting it. A scheme of this sort, with appropriate assignment of kinetic parameters, can guarantee that metaboliten is produced only as rapidly as it is used in some subsequent process.

Inibição simples, sequencial e cumulativa; isoenzimas

Patterns of feedback inhibition found in bacterial biosynthetic pathways.

(A)Isofunctional enzymes for the regulated reaction allow differential feedback effects by the two pathway end products.(B)Cumulative feedback inhibition involves multiple allosteric sites on the regulated enzyme, assuring that there will be some activity unless all of the end products are in excess.(C)In sequential feedback inhibition, different end products operate separately on the various branches of the pathway.(D)Inhibition plus activation uses both positive (+) and negative (-) allosteric effectors to coordinate complex pathways.

- Ligação não covalente de intermediários das vias – efectores alostéricos – estimulam ou inibem uma enzima regulatória da via metabólica.

- Modificação covalente do enzima – ligação de grupos fosfato, nucleótidos

Adaptação a alterações ambientais

ADAPTAÇÃO A ALTERAÇÕES AMBIENTAIS

Os microrganismos podem alterar a sua morfologia, o metabolismo, o padrão de transcrição de genes e o comportamento como resposta a alterações ambientais tais como a disponibilidade de carbono, azoto ou fosfato, alteração da osmolaridade e temperatura do meio, etc.

Por detrás das adaptações estão sistemas através dos quais o microrganismo monitoriza continuamente o meio ambiente e transmite sinais para alvos intracelulares específicos, tais como a maquinaria transcricional, enzimas ou componentes celulares como por exemplo os flagelos.

Na maior parte dos casos o sinal leva à activação ou inactivação de factores de transcrição no citoplasma. A activação / inactivação de factores de transcrição como resultado da transmissão de sinal ocorre geralmente por modificação covalente (fosforilação ou desfosforilação)do factor de transcrição ou por alteração conformacional por ligação de um co-indutor.

Sistemas de sinalização de 2 componentes

Incluem:1- uma histidina cinase (HK), ou cinase sensora. Recebe um sinal e autofosforila um resíduo de histidina

2- um regulador de resposta (RR). É fosforilado num resíduo aspartato pela HK-P

3- uma fosfatase, que pode ser a histidina cinase, o regulador de resposta ou uma proteína

HK + ATP KH-P + ADP

RR + HK-P RR-P (activo) + HK

RR-P + H2O RR + Pi

ESTRUTURA DA HISTIDINA CINASE

Fig. 1 Histidine kinase domain structure. (A) Schematic representation of Class I histidine structure. This classification is based on the position of the conserved histidine-containing region with respect to the catalysis and ATP-binding (CA) domain (which contains the N, G1, F and G2 conserved boxes) in the primary sequence. The conserved His residue (h) is located in the H box of the dimerization (Dim) domain adjacent to the catalysis domain. (B) Representative secondary and ribbon diagrams of sensor PAS domain. Schematic representation of the secondary structures of DOS, CitA, DcuS, and EnvZ are shown. All secondary structures presented here are based on solved structures, except for that of EnvZ, which is based on secondary structure determinations and biophysical analyses (Khorchid, Inouye, & Ikura, 2005). Ribbon diagrams of two dimeric forms of CitA periplasmic domain observed in the crystal lattice are represented with individual monomers shown in yellow or magenta. (C) Multiple alignments of representative HAMP linkers in sensory proteins. For the purpose of comparison amino acid code sequences, immediately following TM2, for seven different sensory protein (MCPs, first 2 rows; HK sensors, last 5 rows) were aligned. Numbers in the rightmost column denote the positions within the full-length protein sequences. The two predicted amphipathic helices are boxed. Helical representation of the two amphipathic helices, I and II, Shows the consensus sequence calculated: h indicates hydrophobic residues (A,C, F, I, L, M, V, W, Y), al indicates aliphatic residues (I, L, V), p indicates polar residues ((D, E, H, K, N, Q, R, S, T), s indicates small residues (A, C, S, T, D, N, V, G, P), while x indicates non-conserved residues. The hydrophobic face of the helices is shaded in grey. (D) Ribbon diagrams of the dimeric kinase core domains of EnvZ and CheY. Within each dimer, individual monmers are yellow or magenta.

MODELOS DE ACTIVAÇÃO DAS HISTIDINA CINASES

Adaptação a Variações de Osmolaridade e Temperatura

A célula utiliza várias estratégias para contrabalançar as variações de pressão osmótica do meio. Uma dessas formas é ajustar a permeabilidade da membrana externa.

Em E. coli existem 2 porinas maioritárias, OmpF e OmpC.

São geralmente sintetizadas em alternativa uma à outra. Os poros de OmpC são ligeiramente menores que os de OmpF e são sintetizados preferencialmente em condições de elevada pressão osmótica e elevadas temperaturas. Os poros mais pequenos são usados preferencialmente em meios com elevadas concentrações de substrato. Os poros maiores permitem que os substratos diluidos entrem na célula por difusão mais facilmente.

Histidina cinase: EnvZRegulador de resposta: OmpR

Modelo de osmoregulação

Assimilação de Fosfato

Em E. coli e outras espécies próximas, quando o fosfato inorgânico é abundante extracelularmente, este é transportado para a célula por um sistema de baixa afinidade, Pit.Sob limitação de fosfato, em E. coli é estimulada a transcrição de pelo menos 38 genes (a maior parte deles em operões), envolvidos na assimilação de fosfato que incluem genes que codificam:

-Uma fosfatase alcalina periplasmática;-Uma porina da membrana externa, específica para aniões, incluindo fosfato (phoE);-Um sistema de transporte de fosfato de elevada afinidade (Pst) e uma proteína necessária para a sua repressão pelo fosfato (pstSCAB-phoU);-Uma histidina cinase e o regulador de resposta (phoBR);-Catorze genes que codificam proteínas que medeiam a entrada e utilização de fosfonato;-Genes à entrada e utilização de gliceraldeído-3-P e um gene que codifica uma fosfodiesterase (ugpBAECQ)

Todos estes genes, excepto pit, são reprimidos pelo fosfato e estão no regulão PHO. Este regulão é controlado por PhoR, uma histidina cinase e um regulador de resposta PhoB.

Regulão – uma rede relativamente simples de operões controlada por uma proteína regulatória comum e o seu efector.

Modelo de regulação do regulão PHO

Sistema Arc (aerobic respiration control)

O sistema Arc consiste numa histidina cinase ArcB e num regulador de resposta ArcA. Mutações nos genes arc levam à indução de vários genes e à repressão de alguns outros, indicando que a proteína ArcA fosforilada é tanto repressora como activadora em condições de anaerobiose.

O sistema Arc é responsável por:

1 – Repressão, em condições de anaerobiose, da transcrição dos genes que codificam:

-Enzimas do TCA-Enzimas do ciclo glioxilato-Várias desidrogenases necessárias para o crescimento aeróbio (ex: piruvato desidrogenase)-Enzimas responsáveis pela oxidação de ácidos gordos -Citocromo o oxidase

2 – Indução, em condições de anaerobiose, de transcrição dos genes que codificam:

-Piruvato formato liase

3 – Indução, em condições de baixas concentrações de O2, dos genes para:

-Citocromo d oxidase, síntese de cobalamina e piruvato formato liase

Sistema Arc (aerobic respiration control)

A proteína ArcB monitoriza a concentração de O2 indirectamente e quando os níveis de O2 são suficientemente baixos, autofosforila à custa de hidrólise de ATP, tranferindo de seguida o grupo fosfato para a proteína ArcA.

Pensa-se que o controlo da actividade de fosforilação de ArcB envolverá metabolitos que aumentam a sua concentração intracelularmente na ausência de O2, tais como piruvato, acetato, lactato ou NADH, e não por acção directa do O2 sobre a proteína.

Sistema Arc (aerobic respiration control)

Sistema Arc (aerobic respiration control)

A schematic representation of signal transduction by the Arc two-component system.

Kwon O et al. J. Biol. Chem. 2003;278:13192-13195

©2003 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Sistema FNR

O gene fnr codifica uma proteína (FNR) que em condições de anaerobiose actua como regulador positivo da transcrição de vários genes expressos apenas durante o crescimento em condições de anaerobiose e repressor de genes que não são expressos em anaerobiose.

A proteína FNR parece existir em quantidades semelhantes em células de E. coli crescidas aerobica ou anaerobicamente. A proteína activa FNR é um homodímero de uma proteína Fe-S contendo um centro [4Fe-4S] sensível ao oxigénio. Quando a proteína está exposta ao O2, o centro [4Fe-4S] é oxidado e pode mesmo ser perdido da proteína. Quando tal acontece, uma fracção da FNR perde os seus centros Fe-S, tornando-se uma apoproteína. Tanto a proteína contendo um centro Fe-S oxidado como a apoproteína são inactivas. Ligam-se ao DNA com baixa afinidade e não estimulam a sua transcrição.

Sistema FNR

Regulação do metabolismo aeróbio/anaeróbio em E. coli pelos sistemas Arc, FnR e NarP e NarL

Vias básicas de metabolismo aerobico e anaerobico em E. coli

Escherichia coli

AEROBIOSE

Escherichia coli

ANAEROBIOSE