Universidade de Évora

Escola de Ciências e Tecnologias

BIOQUÍMICA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

5ºSEMESTRE

Licenciatura em Bioquímica

2013/2014

1 | P á g i n a

............................................................................................................................. 3

................................................................................................................................. 4

.......................................................................................................................... 6

3.1. ........................................................................................................................ 6

3.1.1. ....................................................................................................... 6

3.1.2. .................................................................... 6

3.1.3 .............................................................................. 7

3.1.4. ............................................................................... 7

3.1.5. ............................................................................................................ 7

3.2. ....................................................................................... 9

1. Obtenção do Material Biológico .................................................................................. 9

2. Produção de Maças Transgénicas ................................................................................ 9

3. Preparação das Amostras de Maçãs .......................................................................... 12

4. Extração dos compostos fenólicos das maçãs transgénicas ..................................... 13

5. Identificação dos Compostos Fenólicos por LC-MS ................................................... 13

6. Quantificação dos Compostos Fenólicos pelo Método de HPLC .............................. 14

7. Atividade Antioxidante dos Extratos de Maças......................................................... 14

8. Experiências Nutricionais em Ratos de Laboratório ................................................. 15

9. Parâmetros Hematológicos, Bioquímicos e Imunológicos do Sangue dos Ratos ..... 15

3.3. ................................................................................................. 16

3.3.1. ........................................................................................................... 16

3.3.2. ................................................................................................................... 16

3.3.3. ..................................................................... 17

.................................................................................... 18

............................................................................................................. 19

......................................................................... 19

......................................................................................... 20

................................................................................................... 21

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............................................................................................. 21

............................................................................................................................ 21

............................................................................................... 22

........................................................................................... 22

..................................................................................................................... 23

............................................................................................ 24

.............................................................................................. 24

............................................................................. 24

................................................................................................... 25

......................................................................................................................... 25

............................................................................. 26

.................................................................................... 27

Figura 1-Reação do DNA polimerase em PCR, quando na presença de DNA, primers e

nucleótidos. ................................................................................................................................. 19

Figura 2-Desnaturação térmica, correspondendo á primeira etapa do ciclo ao qual ocorre

separação da dupla cadeia de DNA. ............................................................................................ 22

Figura 3-Hibridação ou Annealing, correspondendo á segunda etapa do ciclo, á qual ocorre,

por complementaridade a definição do segmento a amplificar. ................................................ 22

Figura 4-Extensão, correspondendo á terceira etapa do ciclo ao qual se verifica o

prolongamento das cadeias pela DNA polimerase de acordo com a complementaridade das

bases. ........................................................................................................................................... 23

Figura 5-No fim do ciclo coexistem duas cadeias de DNA idênticas á original, resultado da

amplificação. ............................................................................................................................... 23

Figura 6-Termociclo, equipamento capaz de amplificar de forma automatizada sequências de

DNA. ............................................................................................................................................ 24

Tabela 1-Caracterização dos reagentes químicos envolvidos. .................................................... 7

Tabela 2-Etapas do PCR a programar no termociclo. ................................................................ 12

Tabela 3-Lista de reagentes e orçamento correspondente, com e sem o IVA aplicado á taxa

atual............................................................................................................................................. 18

3 | P á g i n a

Os antioxidantes são moléculas que podem reagir em segurança com os radicais

livres, de modo a neutralizar ou terminar as reacções em cadeia que levam à danificação

de moléculas essenciais para o ser humano. Os radicais livres são responsáveis por

inúmeras doenças, sendo que se encontra comprovado que os antioxidantes ajudam a

prevenir e até a combater estas doenças. Dentro das doenças que os antioxidantes

ajudam a prevenir é de destacar o cancro (de vários tipos), a arteriosclerose, doenças

cardíacas, a doença de Alzheimer, diabetes, artrite reumatóide, entre muitas outras. Os

antioxidantes podem encontrar-se em vários alimentos, como as maçãs, batatas,

tomates, entre muitos outros. Dentro dos antioxidantes que se encontram presentes nos

alimentos, encontram-se os compostos fenólicos antioxidantes, como os ácidos

fenólicos e os flavonóides, que, nas plantas, são produzidas pela via metabólica

fenilpropanoide. A biossíntese dos compostos fenólicos depende essencialmente de três

enzimas: chalcona sintase (CHS), chalcona isomerase (CHI) e dihidroflavonol redutase

(DFR). Estudos comprovam que altos níveis de antioxidantes na dieta podem proteger

contra danos oxidativos ao organismo, sendo que os compostos fenólicos também são

de grande importância na protecção das plantas contras ameaças bióticas e abióticas,

aumentando a produtividade das plantas.

As maçãs (Malus domestica) são frutos comuns, que fazem parte da dieta de

grande parte da população do planeta, estando comprovado que são alimentos ricos em

antioxidantes. Devido ao seu elevado teor em antioxidantes, as maçãs podem ser muito

vantajosas para a saúde humana, sendo que há um ditado antigo, “an apple a day keeps

the doctor away” - uma maçã por dia mantém o doutor afastado. Embora as maçãs já

apresentem elevados teores em antioxidantes, a manipulação genética das mesmas, de

modo a se tentar sobreexpressar as enzimas acima referidas, pode levar a um aumento

da sua capacidade antioxidante, fazendo com as maçãs sejam uma fonte nutritiva mais

eficiente, e ainda ajudar a proteger as próprias macieiras contra ameaças, garantindo

uma melhor produtividade das árvores. Existem várias variedades de maçãs, sendo que

cada uma delas apresenta diferentes níveis de compostos fenólicos e, por sua vez, de

antioxidantes, sendo que com este estudo se pode transformar maçãs com mais baixos

4 | P á g i n a

teores fenólicos, em alimentos mais ricos em antioxidantes e, assim, mais benéficos

para a saúde.

Gerais: Produção de maçãs transgénicas, para sobreexpressão de antioxidantes,

e avaliação da sua eficácia como fontes nutritivas mais eficientes.

Específicos:

o Conhecer:

Os Termos: promotores, terminadores, genes, enzimas de

restrição, plantas transgénicas,

O Enunciado: Etapas envolvidas no PCR,

Os Conceitos: Desnaturação, Hibridação, Transgénese,

organismos geneticamente modificados, transgénicos;

Os Compostos: que não interferem com as propriedades físicas

dos nossos frutos e podem ser utilizados durante o procedimento

para a produção das plantas transgénicas, sem alterar as

propriedades antioxidantes;

O Procedimento Experimental: que leva à montagem dos

métodos necessários à realização do objetivo: produção de maçãs

transgénicas, para sobreexpressão de antioxidantes; e avaliação

da actividade antioxidante de modo às maçãs serem fontes

nutritivas mais eficientes.

o Compreender:

Processo de produção envolvida na transformação das maçãs;

O funcionamento de um termociclo;

o Aplicar:

Conhecimentos adquiridos em segurança de laboratório;

Uso correcto de material de laboratório.

5 | P á g i n a

o Executar:

A produção dos cinco tipos de maçãs transgénicas, com recurso

aos promotores e vectores adequados;

O PCR e o Northern Blot, para seleccionar as plantas

transgénicas, nas condições adequadas;

A extracção, identificação e quantificação dos compostos

fenólicos, nas condições adequadas;

As experiências nutricionais em ratos de laboratório e às

respectivas análises resultantes;

o Dar Valor:

À Agrobacterium como meio simples de criação de plantas

transgénicas;

Ao PCR como técnica de amplificação;

Ao uso de controlos, negativos e positivos, na realização do PCR;

Aos ciclos de temperatura utilizados durante a realização do

PCR;

À electroforese como técnica suplementar de análise dos

resultados obtidos;

Aos métodos utilizados na extracção, identificação e

quantificação dos compostos fenólicos;

Aos resultados obtidos pelas experiências nutricionais em ratos

de laboratórios;

6 | P á g i n a

3.1. Produção de maçãs transgénicas para sobreexpressão de CHI, CHS e DFR,

responsáveis pela sobreexpressão de antioxidantes.

Avaliação da capacidade antioxidante das maçãs transgénicas produzidas.

Verificação do uso das maçãs transgénicas, com uma maior sobrexpressão de

antioxidantes, como fonte nutritiva mais eficiente, em ratos de laboratório.

3.1.1.

Maçãs de três variedades diferentes: Fuji (as que possuem maior quantidade de

antioxidantes); Gala (das maçãs mais comuns, encontrando-se no meio da

tabela de teores em antioxidantes); e as Empire (maçãs produzidas inicialmente

a partir de clonagem, sendo as que apresentam menor quantidade de

antioxidantes).

3.1.2.

Tipo CHS, com sobreexpressão de chalcona sintase (base de dados

EMBL/GenBank, número de acesso X58339);

Tipo CHI, com sobreexpressão de cDNA de Petunia hybrida, codificando

chalcona isomerase (base de dados EMBL/GenBank, número de acesso

X14589);

Tipo DFR, com sobreexpressão de cDNA de P. hybrida, codificando

dihidroflavonol 4-redutase (base de dados EMBL/GenBank, número de acesso

X15537);

Tipo W95, com sobreexpressão de CHI e DFR;

Tipo W92, com sobreexpressão dos três cDNA de cevada e petúnia.

7 | P á g i n a

3.1.3

Aqui apresentam-se os reagentes químicos que apresentam mais cuidado no seu

manuseamento e quais os cuidados a ter no mesmo.

Reagente Caracterização/Observação

Brometo de

etídeo

Usado como agente intercalante usado como marcador de ácidos

nucleicos. Deve ser usado luvas no seu manuseamento, pois é

mutagénico.

Azoto

líquido

Cuidado para o líquido não entrar em contacto directo com a pele, pois

pode levar ao seu congelamento. O vapor libertado não tem qualquer

efeito na pele.

Catamina Trata-se de um anestésico utilizado essencialmente em animais. Deve-

se ter cuidado no seu manuseamento, evitando a sua inalação.

Tabela 1-Caracterização dos reagentes químicos envolvidos.

3.1.4.

Este trabalho científico encontra-se dividido em duas partes: a produção das

maçãs transgénicas; e a avaliação da capacidade antioxidante das maçãs transgénicas.

A produção das maçãs transgénicas deve ser realizado num laboratório onde se

tenha acesso ao material necessário, sendo que este deve encontrar-se num clima

temperado, com os terrenos adequados para a plantação das macieiras transgénicas. A

plantação das maçãs pode ser feito fora do âmbito do laboratório, caso não estejam

disponíveis os terrenos precisos para este efeito, sendo que neste caso é preciso fazer

um seguimento detalhado da maturação e crescimento das macieiras transgénicas.

A avaliação da capacidade antioxidante das maçãs transgénicas deve ser

realizado num laboratório com as devidas condições de segurança, onde esteja

disponível ou se tenha acesso a tudo o equipamento e material necessário. O laboratório

onde se procede ao estudo da avaliação da capacidade antioxidante das maçãs

transgénicas, pode ser o mesmo onde se procede à produção das maçãs transgénicas,

desde que apresente as devidas condições.

3.1.5.

Este projecto é um trabalho que consiste em duas partes: a produção de plantas

transgénicas e a avaliação da capacidade antioxidante das maçãs transgénicas em ratos

8 | P á g i n a

de laboratório. A primeira parte tem meses estipulados, pois as macieiras têm épocas

para plantação e colheita.

Primeiro apresenta-se o calendário que é necessário respeitar para a produção

das maceiras transgénicas.

Jan Fev Mar Abril Maio Jun Julho Agosto Setem Out Novem Dezem

→ Pesquisa bibliográfica

→ Produção das plantas transgénicas em laboratório

→ Plantação das macieiras transgénicas

As macieiras devem crescer durante 2 anos antes da colheita das primeiras

amostras. Após passado esse tempo, pode-se proceder à colheita das amostras de maçãs

transgénicas das várias variedades, cada uma na sua época apropriada (apresentada na

calendarização seguinte), que se encontrem em estados de maturação semelhantes.

De seguida, encontra-se uma possível calendarização para a segunda parte do

trabalho, avaliação da capacidade antioxidante das maçãs transgénicas em ratos de

laboratório.

Agosto Setem Out Novem Dezem Jan Fev Mar Abril Maio Junho Julho

→ Pesquisa bibliográfica

→ Colher e preparar amostras de maçãs Gala.

→ Colher e preparar amostras de maçãs Fuji e Empire.

→ Extração dos componentes fenólicos das maçãs

→ Identificação dos compostos fenólicos pro LC-MS

→ Quantificação dos compostos fenólicos por

HPLC

→Atividade antioxidante dos extractos

de maçãs

Experiências nutricionais em ratos de laboratório←

Parâmetros hematológico, bioquímicos e imunológicos do sangue do rato←

Realização do artigo←

Durante o período de investigação irão ser entregues relatórios mensais à entidade reguladora da

investigação.

9 | P á g i n a

3.2.

Nota I: Vão ser avaliadas a sobreexpressão de antioxidantes de três variedades de

maçãs diferentes, Fuji, Gala e Empire, que apresentam características semelhantes, no

entanto, as suas conhecidas propriedades fenólicas são diferentes.

1. Obtenção do Material Biológico

1.1. Obter amostras dos três tipos de maçãs a estudar, Fuji, Gala e Empire, que se

encontrem em estados de maturação semelhantes e ainda possuam folhas, sendo

que umas vão ser usadas como controlo e outras vão ser transformadas em

plantas transgénicas (procedimento apresentado no ponto 2.

1.2. Crescer as maçãs de controlo (que não são transgénicas) e as maçãs

transgénicas, num clima temperado, onde as maças estejam expostas a, pelo

menos, 6 horas de luz solar por dia, num local com bom escoamento de água.

1.3. Deixar as maceiras crescerem pelo menos dois anos, antes de começar o estudo.

1.4. Quando as maçãs se encontrarem em estado de maturações semelhantes,

recolher pelo menos 10 amostras de cada um dos três tipos de maçãs a estudar,

de várias árvores diferentes, sem misturar as amostras obtidas de árvores

diferentes.

2. Produção de Maças Transgénicas

Nota II: Neste estudo, são utilizados cinco tipos de plantas transgénicas, produzidas do

mesmo modo, mas com genes diferentes: tipo CHS, sobreexpressão de cDNA de cevada

codificando chalcona sintase (base de dados EMBL/GenBank, número de acesso

X58339); tipo CHI, sobreexpressão de cDNA de Petunia hybrida codificando chalcona

isomerase (base de dados EMBL/GenBank, número de acesso X14589); tipo DFR,

sobreexpressão de cDNA de P. hybrida codificando dihidroflavonol 4-redutase (base de

dados EMBL/GenBank, número de acesso X15537); tipo W95, sobreexpressão de CHI

e DFR; e, por último, tipo W92, sobreexpressão dos três cDNAs de cevada e petúnia.

2.1. Construir os vetores construtores (plasmídeo), usando um vetor pBin, contendo

o respectivo cDNA, e orientado no sentido, sobre o controlo do promotor 35S e

10 | P á g i n a

do terminador OCS, como apresentado na figura 1. Para as plantas controlo

utilizar um vetor vazio.

Figura 1. Representação esquemática dos vectores utilizados para a preparação de maçãs

transgénicas. (a) CHS; (b) CHI; (c) DFR; (d) W95, construtor de dois genes (CHI e DFR); (e) W92,

construtor de três genes (CHS, CHI, DFR).

2.2. Inserir o vetor na Agrobacterium tumefaciens, estirpe C58C1:pGV2260, para

cada um dos cinco tipos de planta transgénica, do seguinte modo:

2.2.1. Colocar o plasmídeo (vetor criado no passo anterior) em contacto com as

células de Agrobacterium.

2.2.2. Acoplar a gene resistente ao antibiótico canamicina, para promover a

inserção do plasmídeo nas células de Agrobacterium.

2.2.3. Verificar a integridade do plasmídeo por análise com enzimas de

restrição.

2.3. Danificar as folhas da maçã, por exemplo, procedendo ao seu corte, e colocar

em contacto com as células de Agrobacterium, agora já contendo o plasmídeo

desejado.

2.4. Aguardar cerca de 10 minutos.

Nota III: 10 minutos deve ser suficiente para a Agrobacterium integrar o seu DNA nas

células expostas das folhas de maçã. Caso ache necessário, pode esperar mais um

pouco.

2.5. Retirar as folhas e cresce-las num meio indutor de callus (meio contendo

antibiótico).

Nota IV: As únicas células que vão crescer no meio contendo antibiótico são as células

transformadas que contem os genes resistentes ao antibiótico e o gene de interesse.

2.6. Transferir para um meio de regeneração, de modo a regenerar as folhas

danificadas anteriormente.

11 | P á g i n a

Nota V: Caso a variedade de maçã a estudar não seja susceptível à integração do DNA

por Agrobacterium, pode-se utilizar um método alternativo, Biobalística, que dispara

pequenas partículas douradas, que estão cobertas de DNA, para a planta, podendo levar

a obtenção de células integradas.

2.7. As células indiferenciadas, começam-se a diferenciar e obtém-se folhas e até

haste.

Nota VI: Pode ajudar-se à diferenciação mais rápida das folhas e das hastes, por adição

de hormonas, como, por exemplo, citoquina, que ajuda a planta a crescer e as folhagens

a alongar, e auxina, que ajuda as raízes a crescer.

2.8. Enxertar as folhas ou hastes transgénicas obtidas num porta-enxerto de

macieira.

Nota VII: Proceder de modo semelhantes para os cinco tipos de plantas de maçãs

transgénicas, referidas na nota II, com os respectivos genes, e para as três variedades de

maçãs estudadas.

2.9. Proceder a análise por PCR de modo a pré-seleccionar as plantas transgénicas,

usando gene neomicina fosfotransferase (npt II) como marcador e usando

primers específicos para o gene resistente à canamicina, do seguinte modo:

2.9.1. Extrair o DNA genómico de folhas in vitro usando DNeasy Plant Mini

Kit (Qiagen, Hiden, Germany), de acordo com as recomendações do

fabricante.

2.9.2. Preparar uma mistura de reacção com um volume final de 25 μl, com os

seguintes constituintes: Tampão de PCR (contendo MgCl2) 10x, com uma

concentração de 1x; dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) numa

concentração final de 200 μmol/L; Primer Forward (5’-

CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA-3’) e Primer Reverse (5’-

CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG-3’), ambos com uma concentração

final de 0,40 μmol/L; AmpliTaq Gold DNA Polymerase, numa

concentração final de 2,0 UI; e 5 μL DNA Template.

2.9.3. Preparar, pelo menos, um controlo negativo, que não possua o gene que

se deseja detectar, e dois controlos positivos, que possuam o gene que se

deseja detectar, de modo a garantir que não ocorreu nenhum erro.

2.9.4. Seguir os ciclos de temperatura, de acordo com a seguinte tabela:

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Fase Temperatura Tempo Nº de ciclos

Ativação/Desnaturação inicial 95ºC 1 minuto 1

Desnaturação 95ºC 25 segundos

35 Anelação 60ºC 30 segundos

Extensão 72ºC 45 segundos

Extensão Final 72ºC 4,20 minutos 1

Tabela 2-Etapas do PCR a programar no termociclo.

Nota VIII: Se necessário guardar o produto final do PCR a 4ºC.

2.9.5. Visualizar os fragmentos obtidos por PCR em gel de agarose 1% (p/v),

preparado com TBE e brometo de etídeo. Iniciar a electroforese a uma

diferença de potencial constante de 80 V, durante 2-2,5h. Visualizar num

transluminador de UV.

2.10. Finalmente seleccionar as plantas transgénicas por análise Northern blot,

do seguinte modo:

2.10.1. Preparar o RNA total a partir das folhas de árvores novas, usando o

método de hidroclorato de guanidina.

2.10.2. Submeter os fragmentos de RNA obtido anteriormente, a electroforese

em gel de agarose (1,5% (p/v) agarose, 15% (v/v) formaldeído).

2.10.3. Transferir o RNA para membranas de nylon.

2.10.4. Remover os filtros e lava-los com três vezes com 0,1x SSC e 0,1% SDS,

durante 30 minutos a 65ºC.

2.10.5. Hibridizar as membranas de nylon durante a noite, a 42ºC, com sondas de

cDNA marcadas radioactivamente.

2.10.6. Proceder a autoradiografia, de modo a verificar os resultados obtidos.

2.11. Deixar crescer as macieiras transgénicas seleccionadas, pelo menos, dois anos,

antes de proceder à colheita das maçãs para se começar o estudo (como foi

indicado no ponto 1).

3. Preparação das Amostras de Maçãs

Nota IX: Este procedimento deve ser feito para as maçãs de controlo e as transgénicas.

3.1. Pelar 10 maçãs, de cada tipo, com um pelador próprio, obtendo-se peles com 1-

2 mm de espessura.

3.2. Guardar as peles e a polpa separadamente, após pesagem.

13 | P á g i n a

3.3. Moer, desfazendo completamente, as peles e a polpa das maçãs, separadamente,

num almofariz, com recurso a azoto líquido.

3.4. Transferir as amostras moídas para uma proveta com 70% de metanol aquoso,

com um rácio de 1:1 (p/v).

3.5. Homogeneizar a mistura usando um misturador de Polytron.

3.6. Filtrar inicialmente através de um papel de filtro de Whatman nº1, sob vácuo.

3.7. Filtrar novamente através de um filtro seringa Acrodisc 0,45μm.

3.8. Guardar o filtrado final a -20ºC, até posterior uso.

4. Extração dos compostos fenólicos das maçãs transgénicas 4.1. Pesar 1g de filtrado seco para um tubo de ensaio.

4.2. Adicional 20 mL de 80% de metanol aquoso e 1% de HCl e agitar a suspensão

com cuidado.

4.3. Proceder a ultra-sons, dos tubos duas vezes durante 15 minutos.

4.4. Deixar os tubos à temperatura ambiente (≈20ºC), durante 24h, na escuridão.

4.5. Centrifugar o extrato durante 10 minutos, a 20.878g.

4.6. Recolher os sobrenadantes e guardar a 4ºC, para ser utilizado dentro de 24

horas.

5. Identificação dos Compostos Fenólicos por LC-MS

Nota X: A identificação dos compostos fenólicos dos extractos de maçãs foi feita

usando um sistema LC-MS, consistindo em um módulo de separação de um

cromatógrafo liquido de alta-eficiência (HPLC) Waters gradiente 2690, detector de

absorvância ultravioleta-visível (UV-Vis) com sistema de díodos 996, e um

espectrómetro de massa quadrupole, equipado com uma fonte de ionização (ESI)

eletrospray ZQ-spray.

5.1. Proceder à separação numa coluna Symmetry C18 de 5μm a 20ºC.

Nota XI: A fase móvel é composta pelo solvente A (10% de ácido fórmico) e pelo

solvente B (100% de metanol).

5.2. Eluir a coluna inicialmente isocraticamente com 85% de eluente A (0-1 min) e

depois eluir com um gradiente linear durante 41 minutos, baixando eluente A

até 0%.

5.3. Entre os 42 e 51 minutos, continuar a diminuir para 0% o eluente A.

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5.4. Utilizar uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, a temperatura do capilar a 300ºC, o

gás de revestimento e o gás de auxiliar a 50 e 5 unidades, respectivamente, e a

voltagem a 3 kV para ionização negativa e 0,1 kV para ionização positiva.

5.5. Proceder à análise usando um scan MS de m/z de 100 a 1000.

6. Quantificação dos Compostos Fenólicos pelo Método de HPLC

Nota XII: A análise foi realizada numa coluna cromatográfica liquida Merck-Hitachi L-

7455, com um detector de díodo array (DAD) e uma bomba quaternária L-7100,

equipada com um sistema de libertação multisolvente D-7000 e amostrador L-7200.

6.1. Proceder à separação numa coluna Phenomenex Synergi Fusion RP-80ª 150 x

4.6 mm (4 μm), com uma fase móvel composta por solvente A (2,5% ácido

acético) e solvente B (acetonitrilo), e o forno a uma temperatura de 30ºC.

6.2. Correr o programa inicialmente com um gradiente linear de 0% do eluente B,

até ao final de 36 minutos se ter 25% de eluente B, a uma taxa de fluxo de 1.0

mL/min.

6.3. Seguidamente lavar e recondicionar a coluna.

6.4. Seguir os seguintes comprimentos de onda: 280 nm para os flavonóides e as

dihidrichalconas, 320 nm para as hidroxicinamates, 360 nm para os glicosídeos

flavonóides e 520 nm para as antocianinas.

6.5. Obter curvas de calibração, usando epicatequina, catequina, quarcetina-3-O-

rhamnoside, ácido clorogénico, floretina-2’-O-glucósido e procianidina B2, C1

e B1 como padrões.

7. Atividade Antioxidante dos Extratos de Maças

7.1. Extrair 150 mg da polpa e das peles, separadamente, das maçãs com 0,1% de

HCl em solução de metanol.

7.2. Diluir o extrato numa gama de 25000 e 35000 vezes, com água.

7.3. Analisar utilizando um método quimiluminescente.

7.4. Realizar as experiências num volume final de 250 μL, contendo Tris-HCl 0,1M

(pH 9.0) e dihidrocloreto 2,2’-azobis (AAPH).

7.5. Injetar a solução de luminol (100 μM) e os extractos diluídos.

7.6. Contar os protões produzidos na reacção com um luminímetro microplaca

EG&G Berthold LB96P, a 30ºC.

15 | P á g i n a

Nota XIII: O potencial antioxidante é definido como a quantidade de estrato de maçã

que inibe quimiluminescência luminal por 50% e é expresso como o IC50.

8. Experiências Nutricionais em Ratos de Laboratório

Nota XIV: Este estudo deve ser feito de modo a verificar se as maçãs transgénicas

apresentam uma maior eficiência como fonte nutritiva. Realizar com ratos machos com

peso médio de 220g, mantidos em jaulas individuais (com controlo de comida ingerida),

numa sala com temperatura constante de 21ºC, humidade de 60% e em ciclos de 12h de

luz/escuridão.

8.1. Alimentar os ratos ad libitum com uma dieta contendo 30% das maçãs

transgénicas cozidas e secas, cada grupo consumindo a sua variedade, e um

grupo controlo, suplementada com uma mistura de minerais de 3,5%.

8.2. Pesar e registar o peso dos animais uma vez por semana e verificar a sua

situação de saúde todos os dias.

8.3. Após terminar a experiencia de alimentação, manter os ratos em jejum durante

12 horas.

8.4. Pesar os ratos e sacrifica-los com uma overdose de cetamina (50 mg.kg-1 bw).

8.5. Recolher o sangue do coração para posterior análise e preparar e pesar os

seguintes órgãos: cérebro, fígado, intestino delgado, rins e coração.

8.6. Congelar e guardar o fígado e o cérebro a uma temperatura de -70ºC até

posterior análise química.

8.7. Recolher as fezes durante os sete dias da experiencia de digestibilidade.

8.8. Congelar as fezes e secar a 60º. Após retirar o cabelo presente, triturar e analisar

quimicamente segundo o método AOAC.

9. Parâmetros Hematológicos, Bioquímicos e Imunológicos do Sangue

dos Ratos

9.1. Proceder a análise morfológica do sangue em tubos contendo anticoagulantes

(EDTA) e com métodos padrões de laboratório usando um analisador

hematológico ABACUS, Diatron.

9.2. Para proceder a análise bioquímica e imunológica, centrifugar o sangue a 4500

rpm, durante 10 minutos.

9.3. Congelar e guardar o soro a -70ºC.

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9.4. Analisar os parâmetros bioquímicos no soro sanguíneo

espectrofotometricamente usando um analisador Vitros, sistema Ektachem DT-

60-II com um módulo DT, DTE e DTSC, com recurso à colecção Johnson &

Johnson Clinical Diagnostics.

9.5. Determinar as concentrações de IgE, IgA, IgM e IgG no soro sanguíneo, usando

um método quimiluminescente, com um analisador Immulete 2000.

9.6. Analisar a concentração de soro IL-4 com o método de ELISA.

9.7. Analisar os resultados de modo a determinar os resultados obtidos.

3.3.

3.3.1. Vortex;

Termociclo;

Tina de electroforese horizontal e respectivas fontes de energia;

Transluminador de UV;

Equipamento para Northern Blot;

Autoradiografia;

Misturador de Polytron;

Sistema de vácuo;

Ultra-sons;

Centrifugadora;

Equipamento de LC-MS;

Sistema de HPLC;

Espectrofotómetro;

Balança analítica;

Ultracongelador.

3.3.2. Placas de Petri;

Erlenmeyers;

17 | P á g i n a

Bisturi ou faca;

Micropipetas e respectivas pontas;

Eppendorfs;

Varetas;

Membranas de nylon;

Pinças;

Sondas de cDNA marcadas radioactivamente;

Filtros;

Pelador ou faca;

Almofariz;

Provetas;

Filtro de papel Whatman nº1;

Filtro seringa Acrodisc 0,45μm;

Tubos de ensaio;

Pipetas de Pasteur;

Cuvetes;

Materiais necessários para proceder ao sacrifício dos animais;

Seringas.

3.3.3.

Quantidade Pureza

(%)

Entidade

Fornecedora

Preço

(€)

DNeasy Plant Mini Kit 1Kit --- Qiagen 129,17

Tampão de PCR 25ml --- Sigma 291,17

Primer Forward 1 Set --- Sigma 38,13

Primer Reverse 1Set --- Sigma 38,13

AmpliTaq Gold DNA

Polymerase 100ml --- Greener 69,65

DNA Template 1 Kit --- TaqMan 279,46

Agarose 1% 100g --- Sigma-Aldrich 174,94

Ácido bórico 500g --- Sigma 35,28

EDTA 100g --- Sigma-Aldrich 14,52

Tris 250g 99,8 Sigma 81,79

Brometo de etídeo 10 ml --- Sigma 39,02

dNTPs 2UMOL --- Sigma 104,00

MgCl2 100g 98 Sigma 48,20

18 | P á g i n a

TBE 250g 98 Aldrich 33,30

Formaldeído 25mL --- Sigma-Aldrich 26,30

SSC 1L --- Sigma 68,80

SDS 25g 98,5 Sigma 37,40

Metanol 1L 99,9 Fluka 57,80

HCL 100mL 36,5-38 Sigma 50,70

Ácido fórmico 100mL 95 Sigma-Aldrich 34,20

Ácido acético 500mL 99,7 Sigma-Aldrich 51,30

Acetonitrilo 100mL 99,8 Sigma-Aldrich 54,00

AAPH 25g 97 Aldrich 35,00

Luminol 5g 97 Sigma 69,10

Cetamina 10mL --- Sigma 85,90

Total

(sem IVA) 1947,16

Total

(com IVA) 2395,00

Tabela 3-Lista de reagentes e orçamento correspondente, com e sem o IVA aplicado á taxa atual.

Propõe-se financiamento deste projecto científico à Fundação da Ciência e

Tecnologia (FCT), no âmbito da área Bioengenharia, Biotecnologia e Bioquímica.

Neste projecto é desejado produzir plantas transgénicas, mais especificamente, maçãs de

três variedades diferentes, de modo a provocar a sobreexpressão de antioxidantes. Os

antioxidantes são moléculas que se ligam aos radicais livres presentes no organismo,

ajudando a prevenir e a combater várias doenças, como o cancro, doenças cardíacas,

osteoporose, entre muitas outras. Aqui é proposto a manipulação genética das maçãs, de

modo a se obter uma maçã com um maior conteúdo em antioxidantes, com vista a estas

serem uma fonte nutritiva mais eficiente, sendo que a manipulação genética também

ajuda a proteger as plantas contra ameaças externas. Este estudo pode ser usado para

transformar um fruto de consumo relativamente comum, numa fonte nutritiva mais

eficiente, para um melhor efeito para a saúde humana.

19 | P á g i n a

A reação da polimerase em cadeia corresponde

a um método de amplificação e detenção de

sequências de DNA, possibilitando a obtenção de

múltiplas cópias, num processo rápido, simples e

automatizado, sem o recurso a um organismo vivo.

Este método baseia-se na utilização da capacidade do

DNA polimerase (figura 1) em formar polímeros de

nucleótidos pela adição destes a uma extremidade 3’-

OH iniciadora (primer), permitindo assim a síntese de

uma cadeia de DNA complementar a uma cadeia

molde. A possibilidade de delinear uma sequência

iniciadora especifica (primer) complementar á cadeia

molde permite definir uma região a amplificar.

Apesar da necessidade de quantidades

mínimas de material genético verifica-se uma

amplificação viável, por inúmeras vezes e em pouco

tempo, fazendo com que este método permita uma

detenção fiável de marcadores genéticos relacionados

com doenças infeciosas, cancerianas e genéticas.

Figura 1-Reação do DNA polimerase em PCR, quando na presença de DNA, primers

e nucleótidos.

20 | P á g i n a

Purificação da Taq polimerase de uma bactéria termófila.

Remoção da intervenção humana no processo, ao introduzir um

enzima resistente a altas temperaturas, contribuindo para simplificar e

encurtar o processo.

Desenvolvimento de oligonucleotídos manufaturados por Kary Mullis da

empresa Cetus com vista á pesquisa e desenvolvimento de projetos internos;

Avanços no desenvolvimento de protótipos de sintetizadores

automáticos de oligonucleótidos.

Divulgação das experiências de Mullis envolvendo a

sintese de oligonucleotídos.

Kary Mullis propõe a síntese de oligonucleotídos baseando se no método

de sequenciamento de DNA de Sanger;

A dificuldade da aplicação do método para um local específico do genoma

levou Mullis a adicionar um segundo conjunto de primers;

Aplicações repetidas de polimerases conduziu a uma reação em cadeia de

replicação para um segmento específico do genoma (PCR);

Inclusão de ciclos térmicos, direcionados para pequenos segmentos de um

gene clonado.

PerkimElmer, uma outra empresa biotecnológica lança um termociclo,

instrumento capaz de regular a temperatura da reação de forma

programada

21 | P á g i n a

Por forma a proceder á amplificação de sequências de DNA por PCR, devem

estar presentes os seguintes componentes:

Cadeia de DNA Molde: Amostra de DNA que contém a sequência alvo.

No inicio da reação, a elevada temperatura aplicada faz com que as cadeias

da molécula original de DNA se separem;

DNA polimerase-Enzima responsável pela síntese de novas cadeias de

DNA compleamentares com a sequência alvo. O enzima mais usado é o

Taq polimerase (da bactéria Thermis aquaticus) e a Pfu DNA polimerase

(da bactéria Pyrococcus furiosus). Embora estruturalmente diferentes,

estes enzimas possuem duas características que os tornam adequados á sua

utilização em PCR:

o Poder formar novas cadeias de DNA, a partir de uma cadeia

modelo e primers;

o Serem resistentes a elevadas temperaturas.

Primers-Fragmentos de oligonocleótidos sintéticos complementares á

sequencia alvo. Correspondendo ao componente ao qual a DNA

polimerase inicia a extensão de uma nova cadeia a partir de uma das

extremidades;

Nucleotídos (dNTPS ou desoxinucleótidos trifosfato)-Unidades

individuais de bases distintas que representam componentes essenciais á

síntese de uma nova cadeia pela DNA polimerase.

O PCR processa-se em três etapas, no qual, em conjunto definem um ciclo

que se repete um número específico de vezes. Assim, um ciclo consiste nas

seguintes etapas:

22 | P á g i n a

A desnaturação térmica

processa-se a uma temperatura elevada

(em geral para temperaturas superiores

a 90ºC), ao qual ocorre separação da

dupla cadeia de DNA em dois

filamentos. A separação dos dois

filamentos ou cadeias de DNA (figura

2) verificam-se uma vez estes são

mantidos por pontes de hidrogénio,

forças relativamente fracas que sofrem

rutura a elevadas temperaturas, ao passo que as ligações entre nucleótidos, por serem

ligações covalentes, mais fortes, permanecem intactas.

Com o objetivo de amplificar

um segmento de DNA de interesse, são

introduzidos primers que marcam as

extremidades da sequência alvo. São

designados dois tipos de primers, um

para cada cadeia simples de DNA

produzida na etapa de desnaturação.

O inicio da sequência de DNA alvo é

marcada pelos primers que se ligam

(hibridam) com a sequencia complementar, definindo uma região (figura 3). A

temperatura de annealing ou hibridação encontra-se normalmente entre os 40ºC e 65ºC,

dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. A definição rigorosa da

temperatura permite que estas sequências iniciadoras se liguem á sequência alvo com

elevada afinidade.

Figura 2-Desnaturação térmica, correspondendo á primeira etapa do ciclo ao qual ocorre separação da dupla cadeia de

DNA.

Figura 3-Hibridação ou Annealing, correspondendo á segunda etapa do ciclo, á qual ocorre, por complementaridade a

definição do segmento a amplificar.

23 | P á g i n a

Após a ligação dos primers às

sequências de DNA, a temperatura

aumenta para 72ºC ao qual o enzima Taq

polimerase replica a cadeia de DNA

(figura 4). O processo de síntese é

iniciado numa zona com cadeia dupla,

onde os primers se encontram ligados, e

ao qual ocorre incorporação de

nucleótidos complementares à sequência.

Esta etapa inicia-se pela extremidade 3’

do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples.

No final do primeiro ciclo de

PCR verifica-se a existência de duas

novas cadeias e DNA idênticas á

original (figura 5). Como a DNA

polimerase não reconhece o final da

sequência, as novas cadeias

sintetizadas têm o seu inicio definido

pelo primer, mas a sua extremidade

3’ indefinida leva á formação de

fragmentos de diferentes tamanhos. No ciclo que se segue esta cadeia vai servir de

molde à síntese de uma nova cadeia, limitando o primer a outra extremidade da cadeia.

A cadeia de DNA sintetizada a partir deste molde, terá então o comprimento definido

pelos primer. Estas cadeias desigmam se de Amplicons.

Ao fim de alguns ciclos, as cadeias de DNA que correspondem ao tamanho da

sequência alvo, encontram-se presentes em maior quantidade do que as sequencias de

tamanho variável, isto é, a sequência flanqueada pelos primers corresponde àquela que

se amplia.

Figura 4-Extensão, correspondendo á terceira etapa do ciclo ao qual se verifica o prolongamento das cadeias pela DNA

polimerase de acordo com a complementaridade das bases.

Figura 5-No fim do ciclo coexistem duas cadeias de DNA idênticas á original, resultado da amplificação.

24 | P á g i n a

O conjunto das três etapas referidas ocorre

num termociclo (figura 6), um equipamento que

controla e alterna de forma cíclica as temperaturas

automaticamente, durante períodos programados de

tempo para um determinado número de ciclos.

O PCR pode ser aplicado ao nível da sequenciação de segmentos de DNA,

genotipagem, avaliação da expressão de genes, clonagem, entre muitas outras

aplicações.

Apesar de poder ser aplicado de uma forma alargada a um grande número de

áreas apresenta algumas limitações, que fazem com que a quantificação dos produtos de

PCR não seja confiável, tais como:

Determinação da quantidade inicial da sequência alvo só é possivel para uma

fase exponencial da reação de PCR;

Esta fase exponencial pode ser dificultada pela presença de inibidores da

reação de polimerização, verificar-se um reagente que limita essa reação,

ocorrer a acumulação de moléculas de pirofosfato, o auto-anelamento.

Organismos transgênicos são aqueles que receberam material genéticos de

outros organismos, mediante o emprego de técnicas de engenharia genética, como a

tecnologia de DNA recombinante. A geração de transgênicos visa obter organismos

com características novas ou melhoradas relativamente ao organismo original. A

manipulação genética combina características de um ou mais organismos de uma forma

que provavelmente não aconteceria na natureza. Assim podem ser combinados

os moléculas de DNA de organismos que não se cruzariam por métodos naturais.

Figura 6-Termociclo, equipamento capaz de amplificar de forma

automatizada sequências de DNA.

25 | P á g i n a

Frequentemente há uma certa confusão entre organismos transgênicos

e Organismos Geneticamente Modificados (OGM), e os dois conceitos são tomados, de

forma equivocada, como sinônimos. Ocorre que OGMs e transgênicos não são

sinônimos. Os transgênico correspondem a organismos geneticamente modificados, mas

nem todos os OGM são transgênicos. OGM é um organismo que teve o

seu genoma modificado em laboratório, sem todavia receber material genético

(RNA/DNA) de outro organismo. Transgênico é um organismo que foi submetido a

técnicas específicas de inserção de material genético de outro organismo (que pode até

ser de espécie diferente).

Alimentos transgénicos são alimentos produzidos a partir de organismos

cujo embrião foi modificado em laboratório, pela inserção de pelo menos um gene de

outra espécie. Alguns dos motivos de modificação desses alimentos são para que as

plantas possam resistir às pragas (insetos, fungos, vírus, bactérias e outros) e

a herbicidas. O mau uso de pesticidas pode causar riscos ambientais, tais como o

aparecimento de plantas resistentes a herbicidas e a poluição dos terrenos e lençóis de

água.

O uso de herbicidas, inseticidas e outros agrotóxicos pode diminuir com o uso

dos transgênicos, já que eles tornam possível o uso de produtos químicos corretos para o

problema.

A primeira aplicação dos organismos transgênicos e dos organismos

geneticamente modificados é a própria investigação científica. A expressão de um

determinado gene de um organismo em outro organismo pode facilitar a compreensão

da função desse gene. Posteriormente, organismos transgênicos, como plantas e

animais, foram desenvolvidos para estudos, e também vários produtos obtidos a partir

de transgênicos foram desenvolvidos e comercializados. O primeiro produto

comercializado foi a insulina, produzida a partir de uma modificação

da bactéria Escherichia coli, o final dadécada de 1970). Atualmente, alimentos

transgênicos são utilizados para consumo animal e humano.

26 | P á g i n a

AAPH: Dihidrocloreto-2,2’-azobis

cDNA: Ácido desoxirribonucleico complementar

CHI: Chalcona isomerase

CHS: Chalcona sintase

DAD: Detector de díodo array

DFR: Dihidroflavonol redutase

DNA: Ácido desoxirribonucleico

EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético

ESI: Fonte de ionização electrospray

HCl: Ácido clorídrico

HPLC: Cromatografia líquida de alta eficiência

LC: Cromatografia líquida

MS: Espectrometria de massa

MgCl2: Cloreto de magnésio

npt II: Gene neomicina fosfotransferase

PCR: Reação em cadeia da polimerase

RNA: Ácido ribonucleico

SDS: Dodecil sulfato de sódio

SSC: Tampão salino citrato de sódio

TBE: Tris-Borato-EDTA

UV: Ultravioleta

Vis: Visível

27 | P á g i n a

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