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CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MODALIDADE DE PRODUÇÃO QUÍMICO-BIOLÓGICA.
PRODUÇÃO DE POLI-BETA-HIDROXIBUTIRATO ATRAVÉS
DE GLUCONACETOBACTER DIAZOTROPHICUS.
Rômulo dos Santos Aguiar.
Rio de Janeiro
2012
RÔMULO DOS SANTOS AGUIAR.
Aluno do curso de Ciências biológicas.
Matrícula: 0913800198
PRODUÇÃO DE POLI-BETA-HIDROXIBUTIRATO
ATRAVÉS DE GLUCONACETOBACTER DIAZOTROPHICUS.
Trabalho de conclusão de curso apresentado
ao curso de graduação em Ciências
Biológicas – Modalidade de produção
químico-biológica, da Universidade Estadual
da Zona Oeste, como requisito parcial para
obtenção do título de Bacharel em Ciências
Biológicas sob orientação da professora
Vânia Lúcia Muniz de Pádua.
Orientadora: Dr. Vânia Lúcia Muniz de Pádua.
Laboratório de Biologia - UEZO
Co-orientadora: Dr. Cristiane Pimentel Victório
Laboratório de Biologia – UEZO
Rio de Janeiro
Dezembro de 2012
A282 Aguiar, Rômulo dos Santos.
Produção de poli-beta-hidroxibutirato através de
Gluconacetobacter diazotrophicus / Rômulo dos Santos
Aguiar. — 2012.
31 f.; 30 cm.
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em
Ciências Biológicas)— Centro Universitário Estadual
da Zona oeste, Rio de Janeiro, 2012.
Bibliografia: f. 22-24.
1. Cana-de-açúcar. 2. Polihidroxibutirato. 3.
Plástico biodegradável. I. Título.
CDD 633.61
ii
PRODUÇÃO DE POLI-BETA-HIDROXIBUTIRATO ATRAVÉS DE
GLUCONACETOBACTER DIAZOTROPHICUS.
Elaborado por Rômulo dos Santos Aguiar.
Aluno do curso de Ciências Biológicas da UEZO
Este trabalho de graduação foi analisado e aprovado com grau:__________
Rio de Janeiro, _____ de dezembro de 2012.
_______________________________________________________
Doutor: Ronaldo Figueiró Portella Pereira (Examinador 1) – UEZO.
_______________________________________________________
Mestre: Adriano Arnóbio José da Silva e Silva (Examinador 2) – UEZO.
_______________________________________________________
Dra. Vânia Lúcia Muniz de Pádua (presidente) – UEZO.
RIO DE JANEIRO, RJ-BRASIL
DEZEMBRO/2012
iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter me proporcionado esta oportunidade única
de poder cursar uma instituição de nível superior, sem Ele provavelmente não chegaria
nem no início dessa caminhada, pois é dEle que provém minha força, minha ousadia e
inspiração.
Agradeço a minha orientadora, professora Vânia, por sua orientação, por me
transmitir seus conhecimentos, por sua paciência no decorrer desse trabalho,
principalmente por me ensinar que os valores éticos para execução de um trabalho
acadêmico se estendem além de uma sala de aula e a todos os meus professores que
colaboraram com a construção do meu aprendizado ao longo de toda minha trajetória
acadêmica.
Agradeço também a minha mãe Rosângela, minha heroína, por todo apoio e
compreensão oferecido durante esses quatro anos, mesmo quando discordávamos de algo,
ela sempre soube o que é o melhor para mim.
Aos meus colegas da turma 2009.1, foram quatro anos de parceria,
companheirismo, aprendizado e crescimento mútuo. Vou sentir saudades das festinhas
surpresas que já nem eram tão surpresas, das caminhadas até o centro de Campo Grande
com a “Célula coesa” (Rafael – O arrogante, Marcelle – A que se acha feia, Yasmim – A
Benhê, Alessandra – A eterna folhinha, Pedro – Pai de todos, Agatha – A pequenininha,
Felipe – O distraído e sem contar que ninguém esquecerá do famoso “bate aqui... coração”.
Além da “célula”, agradeço as amizades que construi ao longo do tempo, Juliana Chal,
Cristiane Farinelle, Cristiane Porto, Nataly, Ezaine, Valéria, Ranúzia, Bárbara, Josílio,
Vanessa, Tamires, Amanda e Luana.
Agradeço também a ajuda e companheirismo de todos os meus queridos amigos,
Diogo Wosny, Ramon, Zé, Sônia, David, Rodrigo, Tony e Gisele, que tornaram meus dias
os mais divertidos e mais felizes, amo vocês e não abro mão.
Ao Nathan Regis que tem estado sempre ao meu lado, não deixando com que eu
desanime ou olhe pra trás, acreditando em mim, mesmo quando eu não tinha motivos para
acreditar... Adoro-te garoto!
A toda equipe de colaboradores, técnicos e laboratoristas que estão sempre nos
auxiliando com experimentos, preparo de soluções e até mesmo, dicas para elaboração do
trabalho de conclusão de curso.
E que a paz de Deus que excede todo entendimento abençoe a todos que de alguma
forma contribuíram para a conclusão desse trabalho.
iv
Resumo
Os produtos plásticos derivados do petróleo são amplamente utilizados na medicina, na
indústria alimentícia, brinquedos, utensílios domésticos etc. Entretanto, a exigência das leis
ambientais e a conscientização da sociedade mundial em preservar o meio ambiente têm
levado a pesquisas de novos produtos que utilizem recursos renováveis. A obtenção de
plásticos biodegradáveis, dentre eles o polihidroxibutirato (PHB) adquirido a partir de
sistemas bacterianos, constitui-se em uma importante e inovadora proposta para a
substituição dos plásticos convencionais. A Gluconacetobacter diazotrophicus é uma
bactéria que interage naturalmente com a cana-de-açúcar, promovendo a fixação de
nitrogênio atmosférico, além, de produzir fitorreguladores, promovendo o
desenvolvimento da vegetal. Após análise do genoma, completamente sequenciado, foram
identificadas proteínas envolvidas na biossíntese do polímero biodegradável,
demonstrando assim que G. diazotrophicus, possui potencial para produção de
polihidroxibutirato. O objetivo principal desse trabalho é avaliar o potencial de produção
do biopolímero pela bactéria, através de análise in silico das proteínas envolvidas na via do
metabolismo do butanoato, tornando uma investigação útil para os demais, no sentido de
que seja inovador e relevante, podendo assim, futuramente empregar G. diazotrophicus a
indústria do plástico biodegradável.
Palavras-chave: Cana-de-açúcar, polihidroxibutirato, plástico biodegradável.
v
Abstract
The plastic products derived from petroleum are widely used in medicine, food, toys,
household items etc. However, the requirement of environmental laws and awareness of
society in preserving the global environment have led to research new products that use
renewable resources. Obtaining biodegradable plastics, among them polyhydroxybutyrate
(PHB) purchased from bacterial systems, constitutes an important and innovator proposal
for substitution of conventional plastics. The Gluconacetobacter diazotrophicus is a
bacterium that interacts naturally with cane sugar, promoting the fixation of atmospheric
nitrogen, in addition, to produce plant hormones, promoting the development of the plant.
After analysis of the genome completely sequenced were identified proteins involved in
the biosynthesis of the biodegradable polymer, thus demonstrating that G. diazotrophicus,
has potential for production of polyhydroxybutyrate. The main objective of this study is to
evaluate the potential for biopolymer production by the bacterium through in silico
analysis of proteins involved in metabolism via butanoate, making research useful for
others, in the sense that is innovative and relevant, and thus can in future employ G.
diazotrophicus industry of biodegradable plastic.
Keywords: Sugarcane, polyhydroxybutyrate, plastic biodegradable.
vi
SUMÁRIO
Página
Resumo............................................................................................................................iv
Abstract............................................................................................................................v
1. Introdução....................................................................................................................1
1.1. Gluconacetobacter diazotrophicus................................................................1
1.2. O que é plástico?............................................................................................3
1.3. Os diferentes tipos de plásticos.....................................................................5
1.3.1. Polipropileno...................................................................................5
1.3.2. Polietileno.......................................................................................6
1.3.3. Poliestireno.....................................................................................6
1.3.4. Polibutileno.....................................................................................7
1.3.5. PVC (Policloreto de vinila)............................................................7
1.4. Processos de reaproveitamento e destino dos resíduos plásticos..................8
1.4.1 Incineração.......................................................................................8
1.4.2 Reciclagem.......................................................................................9
1.4.3. Plásticos Biodegradáveis................................................................9
2. Justificativa.................................................................................................................13
3. Objetivos.....................................................................................................................13
3.1. Objetivos gerais............................................................................................13
3.2. Objetivos específicos....................................................................................13
4. Materiais e métodos....................................................................................................14
4.1. Análise in silico.....................................................................................14
4.2. Quantificação de PHB............................................................................15
5. Resultados e discussão................................................................................................17
6. Conclusão....................................................................................................................21
Referências Bibliográficas...............................................................................................22
1
1 – INTRODUÇÃO:
1.1 – Gluconacetobacter diazotrophicus:
A Gluconacetobacter diazotrophicus (figura 1) é uma bactéria encontrada nos
espaços intercelulares de diversas plantas de famílias como Poaceae, Convolvulaceae,
Rubiaceae e Bromeliaceae, além de interagir naturalmente com a cana-de-açucar, onde é
bastante abundante e considerada modelo de estudo de interação planta-bactéria (Muñoz-
Rojas e Caballero-Mellado, 2003). Uma vez presente no tecido vegetal, a G.
diazotrophicus, estabelece uma relação benéfica com a planta, produzindo fitorreguladores,
dentre eles vitaminas, hormônios e outras substâncias de interesse vegetal, possuindo ainda
ação antagonista a agentes patogênicos, além de fixar nitrogênio atmosférico, sendo
responsável por até 70% do nitrogênio incorporado a biomassa vegetal (Muñoz-Rojas e
Caballero-Mellado, 2001).
O aumento da contribuição ao desenvolvimento vegetal pode levar à redução do
uso de fertilizantes e adubos nitrogenados, acarretando na diminuição dos custos de
produção e gerando um impacto ambiental e social positivo, reduzindo a contaminação do
ar e das águas pluviais em decorrência do acúmulo de nitratos e outros produtos tóxicos.
Além disso, um de seus hospedeiros naturais, a cana-de-açúcar, apresenta uma importância
significativa no setor agrícola, uma vez que o Brasil é atualmente o seu maior produtor
Figura 1: Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5
2
mundial, com produção de cerca de 27 milhões de toneladas de açúcar e 17 bilhões de
litros de álcool/ano, (Conab, 2005) levando a uma economia de 29,16 milhões de U$
dólares/ano no país (Döbereiner, 1992; Baldani et al., 1997; Olivares, 1997; James e
Olivares, 1998).
Muitas bactérias patogênicas, simbiontes e comensais são capazes de transitar entre
a vida no ambiente e no hospedeiro, e devem adaptar-se às mudanças repentinas na
disponibilidade de nutrientes, assim como à resposta de defesa secundária do hospedeiro
(Jefferson, 2004). G. diazotrophicus, por exemplo, deve-se adaptar à interação com
insetos, esporos de fungos e principalmente a diferentes espécies de plantas e em diferentes
circunstâncias. Um exemplo particularmente importante da adaptação bacteriana é a
capacidade de crescer como biofilme como parte de uma comunidade séssil encoberta de
polímeros secretados pela própria bactéria (Jefferson, 2004). O ciclo de desenvolvimento
de um biofilme, embora organizado com fases distintas, ocorre com uma liberdade
fenotípica que permite que as bactérias se adaptem às alterações impostas pelo ambiente ao
qual estão submetidas. A transição entre um estado e outro é feita de maneira controlada e
é altamente complexa sob o ponto de vista fisiológico, bioquímico e molecular (O’ Toole
et al., 1999). O biofilme parece ser um modo de crescimento bacteriano que fornece as
condições básicas para que permaneça em um nicho favorável, enquanto as culturas
planctônicas seriam na verdade um artefato in vitro (Jefferson, 2004).
A formação de biofilme por G. diazotrophicus pôde ser observada sobre lã-de-vidro
através de microscopia eletrônica de varredura, onde foi analisado o padrão de biofilme de
uma bactéria selvagem e uma mutante deficiente na formação de biofilme (Figura 2)
A B C
D E F
A B
Figura 2: Estudo comparativo por microscopia eletrônica de varredura do padrão de biofilme
formado pela bactéria selvagem (A) e a mutante EAL na formação de biofilme (B). Pádua et al.,
2010
3
O genoma de G. diazotrophicus PAL5 foi depositado pela primeira vez no banco de
genomas do NCBI (Nacional Center for Biotechnology information) em dezembro de 2007
e atualizado em julho de 2008, sendo composto por 3.944.163 pares de nucleotídeos
dispostos em um único cromossomo circular (número de acesso AM889285; 3,944,163 bp)
e dois plasmídeos (Plasmídeo pGDIPal5I com número de acesso AM889287 e tamanho
38,818 bp e plasmídeo pGDIPal5II com número de acesso AM889286 e tamanho 16,610
bp) (Bertalan et al., 2009). Após o sequenciamento de seu DNA e durante o trabalho de
anotação do seu genoma, foram identificadas sequencias codificantes de proteínas
componentes de vias biológicas importantes para a formação de biofilme, sendo que
algumas eram compartilhadas com aquelas que estão ligadas à síntese de um polímero da
família dos polihidroxialcanoatos, um bioplástico. Os bioplásticos são importantes no
mecanismo bacteriano relacionado à adaptação e sobrevivência, conforme sugerido abaixo,
e o biofilme também. A identificação de rotas metabólicas ligadas à síntese de
polihidroxialcanoatos é uma forte sugestão de que G. diazotrophicus, possui potencial para
ser empregada na indústria dos plásticos biodegradáveis.
1.2 – O que é o Plástico?
A palavra plástico deriva do grego plastikó, “próprio para ser moldado ou
modelado”. (Andrade et al.2001). São materiais macromoleculares que podem ser
moldados sob ação de temperatura e pressão; são basicamente constituídos por ligações
covalentes entre carbonos que se repetem ao longo de uma cadeia denominada cadeia
polimérica. (Mano e Mendes, 1999).
Os produtos plásticos derivados do petróleo são largamente utilizados na construção
civil, medicina, no setor automobilístico, na indústria farmacêutica, alimentícia, utensílios
domésticos, brinquedos, calçados etc. O plástico é um produto muito versátil e ganhou um
grande espaço no mercado por ser um material barato, leve e durável e tornando-se
indispensável em nosso cotidiano, (Cangemi et al. 2005) o plástico possui propriedades
interessantes como o isolamento térmico e elétrico, além de ser resistente à corrosão.
Entretanto, devido às inúmeras vantagens e benefícios que os produtos plásticos nos
oferecem, o uso dos mesmos vem aumentando significativamente nos últimos anos em
4
todo o mundo conforme mostra a tabela 1, chegando a mais de duzentos e sessenta e cinco
milhões de toneladas de plástico produzidos por ano no mundo (Plastics Europe, 2011),
consequentemente aumentando a quantidade de resíduos plásticos descartados no meio
ambiente (Franchetti e Marconato, 2006). Devido a sua alta durabilidade e resistência, os
plásticos sintéticos podem levar décadas e até séculos degradando no ambiente, além disso,
a ausência de leis ambientais e conscientização da sociedade mundial em preservar o meio
ambiente, tem tornado, o acúmulo desses resíduos ocasionados pelo descarte inadequado
um dos grandes agravos ambientais de nosso século.
O consumo de plásticos no Brasil tem se tornado cada vez mais crescente. Segundo
dados da ABIPLAST (2010), o brasileiro possui um consumo per capita médio de 28 kg de
plástico por ano. Ainda com base nessa pesquisa foi observada uma produção de quase 5,2
milhões de toneladas de plástico de origem petroquímica no ano de 2009, quando também
foi registrado um consumo de 5,4 milhões de toneladas, como ilustram respectivamente as
figuras 3 e 4.
Tabela 1: Produção mundial de plásticos em milhões de toneladas.
Fonte: Plastics Europe, 2011.
5
1.3 – Os diferentes tipos de plástico:
Os plásticos são divididos em dois grandes grupos: os plásticos termorrígidos e os
termoplásticos.
Os plásticos termorrígidos, como o próprio nome sugere, são plásticos que uma vez
moldados e endurecidos, não podem ser novamente fundidos. Desta forma estes plásticos
não oferecem condições para serem reaproveitados através da reciclagem, como é o caso
de plásticos usados na indústria automobilística, em telhas transparentes etc. (Guamá et al.
2008).
Os termoplásticos por sua vez são sensíveis à temperatura, podendo ser facilmente
moldados sob ação de temperatura e pressão. O processo pode ser repetido várias vezes,
tornando viável a reciclagem dos mesmos (Parente, 2006). Os principais termoplásticos
são: Polipropileno, polietileno, poliestireno, polibutileno e o PVC ou policloreto de vinila.
Figura 3: Produção do setor de produtos plásticos no Brasil (em
milhões de toneladas). Fonte: ABIPLAST, 2010.
Figura 4: Consumo aparente de produtos plásticos no Brasil (em
milhões de toneladas). Fonte: ABIPLAST, 2010.
6
1.3.1 – Polipropileno:
O polipropileno (PP) tem origem no grupo dos polímeros poliolefínicos e é um dos
mais importantes plásticos de massa. De aspecto transparente ou opaco, incolor ou colorido
em todas as cores e tonalidades, embora a sua cor natural seja o branco leitoso, é obtido a
partir da polimerização do propileno, que resulta da destilação do petróleo, num
procedimento semelhante ao do polietileno de alta densidade (PEAD), isto é, sob pressão e
na presença de catalisadores (Santos et al., 2004). O polipropileno é amplamente
empregado em todo o mundo no setor automobilístico, utensílios domésticos, brinquedos,
embalagens, isolamentos de cabos elétricos, dentre outras funções atendidas pelas suas
características de baixa densidade associada a alta rigidez e dureza. A estrutura química do
polipropileno é mostrada abaixo.
1.3.2 – Polietileno:
O polietileno é considerado o polímero mais comum, pela cadeia simples (CH2-
CH2)n. Possui alta produção em escala mundial, sendo o polímero mais barato. O
polietileno é sintetizado a partir da polimerização do etileno. São flexíveis, parcialmente
cristalinos e inertes à maioria dos produtos químicos comuns, devido a sua natureza
parafínica, seu alto peso molecular e sua estrutura parcialmente cristalina. Além disso, os
polímeros etilênicos podem não apresentar toxicidade, podendo ser usados em contato com
alimentos e produtos farmacêuticos (Coutinho et al, 2003).
Figura 5: Estrutura química do polipropileno
7
1.3.3 – Poliestireno:
O poliestireno é um plástico que se obtém através da polimerização do estireno (um
líquido oleoso, incolor e de forte odor). Caracteriza-se por ser um material muito frágil,
apesar das vantagens que são: Resistência a humidade, brilhante, inodoro e não ser
prejudicial à saúde (Gorni, 2003). O poliestireno é amplamente empregado na indústria por
ser um material leve, econômico e de fácil manuseio, sendo utilizado na construção civil e
confecção de caixas térmicas para armazenamento de bebidas e alimentos, sendo
popularmente conhecido como isopor (Costa, 2007). Na figura 6, é mostrada a estrutura
química do poliestireno.
1.3.4 – Polibutileno:
O polibutileno caracteriza-se por ser um termoplástico de elevada resistência
mecânica, tal característica, o permite ser usado em tubulações e sistemas de tubos
aquecidos, uma vez que ele permite com que a velocidade do fluído aumente sem causar
problemas de abrasão. Possui elevada flexibilidade mesmo a baixas temperaturas e
Figura 6: Estrutura química do poliestireno
8
resistência a alguns agentes químicos como o cloro e agentes físicos como radiação UV
(Cobrigas, 2009).
1.3.5 – PVC (Policloreto de vinila):
O PVC é o material ideal para as mais diversas aplicações. É o único termoplástico
que não é 100% derivado do petróleo, contendo em peso, 57% de cloro e 43% de eteno
(Nunes et al, 2002).
O policloreto de vinila consiste em um plástico que se obtém por polimerização do
cloreto de vinilo. A fórmula geral do PVC é (CH2-CHCl)n. É um material termoplástico
tenaz e rígido, mas que por ação de plastificantes pode se tornar flexível e elástico (Gorni,
2003).
Devido a sua resistência à corrosão é empregado na elaboração de placas, tubos,
placas, folhas e peças moldadas para torneiras e materiais de construção, isolantes de cabos
elétricos e também um ponto de partida para fabricação de fibras e vernizes. Apesar de ser
um termoplástico de vasta aplicação, em elevadas temperaturas pode liberar cloreto de
hidrogênio que acumula-se na atmosfera, gerando assim um grave problema relacionado à
eliminação dos seus desperdícios (Vieira, 2001).
Atualmente, o PVC é o segundo termoplástico mais consumido em todo o mundo,
com uma demanda mundial superior a 27 milhões de toneladas no ano de 2001, sendo a
capacidade mundial de produção de resinas de PVC estimada em cerca de 31 milhões de
toneladas/ano. Dessa demanda total, o Brasil foi responsável pelo consumo de cerca de
2,5% de resinas de PVC. Esses dados mostram o potencial de crescimento da demanda de
resinas de PVC no Brasil, uma vez que o consumo per capita, na faixa de 4,0 kg/hab/ano,
ainda é baixo quando comparado ao de outros países (Nunes et al, 2002).
1.4 – Processos de reaproveitamento e destino dos resíduos plásticos:
Todos os plásticos possuem em comum o fato de não serem biodegradáveis, pois
são de origem petrolífera, podendo levar até séculos degradando no ambiente. Mas existe
uma crescente demanda por sua produção e consumo, resultando na elaboração de algumas
9
estratégias que visam minimizar os impactos causados pelo acúmulo de resíduos plásticos.
Algumas das estratégias empregadas são citadas abaixo:
1.4.1– Incineração:
É o termo usado para designar a combustão do lixo municipal. Um incinerador
apropriadamente projetado e operado permite que a redução de volume de material a ser
aterrado seja substancial. Em muitos países, a incineração é realizada para a conversão de
resíduos plásticos em energia. Deve-se levar em conta que o valor energético dos plásticos
é equivalente ao de um óleo combustível (37,7 MJ/kg) e, por esta razão, podem-se
constituir em valiosa fonte energética (Cepis, 2004).
Apesar da vantagem citada acima, a incineração ainda não é utilizada em grande
escala devido ao elevado custo dos fornos de aquecimento e por ser um método
potencialmente arriscado. Alguns plásticos como o cloreto de polivinila (PVC), quando em
combustão liberam na atmosfera gases tóxicos, como o ácido clorídrico (HCl), uma
substância tóxica, que quando acumulada na atmosfera pode gerar chuva ácida (Franchetti
e Marconato, 2006). A reação da combustão do PVC está representada abaixo:
1.4.2 – Reciclagem:
É um método viável de reaproveitamento dos resíduos plásticos oriundos de lixões,
sucatas e sistemas de coleta seletiva que são fundidos e transformados em novos produtos
que poderão futuramente ser comercializados (Cangemi et al., 2005).
Os programas de educação desenvolvidos nas escolas, comunidades e empresas
estão dando suporte para a implantação de projetos de coleta seletiva, os quais, além de
auxiliarem na geração de empregos e na conservação do meio ambiente, fornecem também
matéria-prima de melhor qualidade para a indústria de reciclagem (Pires, 2002).
A reciclagem de plásticos envolve um grande trabalho prévio de separação,
identificação e limpeza dos materiais. Apesar desta demanda, o material reciclado é cerca
de 50% mais barato que o polímero na forma virgem. No mundo, cerca de 20% dos
2[CH2CHCl]n + 5O2 → 2HCl + 4CO2 + 2H2O
10
plásticos são reciclados. No Brasil, a reciclagem vem crescendo em volume e aumentando
a diversidade e qualidade dos produtos reciclados (Franchetti e Marconato, 2006).
Apesar da grande vantagem apresentada pela reciclagem, ainda há grandes desafios
tais como:
►Dificuldade na separação dos diversos tipos de plásticos.
►Escassez de indústrias interessadas em comprar o material separado.
►Dificuldade em garantir um fornecimento contínuo de matéria – prima de boa qualidade
aos compradores.
1.4.3 – Plásticos Biodegradáveis:
Os plásticos biodegradáveis, também denominados plásticos biológicos ou
bioplásticos, foram descobertos há cerca de 10 anos e ainda possuem uma participação
mínima no mercado internacional (Franchetti e Marconato, 2006). Diferente dos plásticos
convencionais derivados do petróleo, os bioplásticos uma vez lançados no meio ambiente,
são degradados por microrganismos em um curto espaço de tempo, podendo com relativa
facilidade integrar-se totalmente à natureza, sem causar danos à mesma, representando
assim uma alternativa sustentável. Uma substância é biodegradável se os microrganismos
presentes no meio ambiente forem capazes de convertê-la a substâncias mais simples,
existentes naturalmente em nosso meio (Snyder, 1995).
Em função de ser um material biodegradável, o bioplástico é considerado uma
alternativa interessante para minimizar os impactos decorrentes de resíduos plásticos.
Pesquisas com bioplástico vêm ocorrendo em todo o mundo, algumas envolvendo testes
empregando óleo de mamona, cana-de-açúcar, beterraba, ácido lático, milho e proteína de
soja, entre materiais de origem vegetal (Viveiros, 2003) e de origem microbiana (Squio e
Aragão, 2004; Franchetti e Marconato, 2006).
Polímeros da família dos polihidroxialcanoatos (PHAs), que são produzidos por
algumas bactérias a partir de açúcares, possuem propriedades semelhantes às dos plásticos
petroquímicos, com a vantagem de poderem ser biodegradados por microrganismos
11
presentes no meio ambiente, em curto espaço de tempo, após o descarte. O principal
representante dos PHAs é o poli-β-hidroxibutirato (PHB), semelhante ao polímero
sintético, polipropileno (PP), em propriedades físicas e mecânicas (Franchetti e Marconato,
2006). O polihidroxibutirato (Figura 7) serve a muitas bactérias como uma maneira de
armazenar no interior celular, materiais que podem servir de reserva para obtenção de
carbono e como fonte de energia para o caso de ausência de algum nutriente, podendo
acumular até 90% de seu peso seco (Figura 8).
Estes biopolímeros possuem propriedades físico-químicas e termoplásticas muito
similares aos plásticos de origem petroquímica. São completamente biodegradáveis e
biocompatíveis, produzidos a partir de matérias-primas renováveis, podendo ser reciclados
e incinerados sem a geração de produtos tóxicos, o que os torna de grande aplicabilidade
Figura 7: Estrutura química do polihidroxibutirato.
Figura 8: Fotomicrografia eletrônica de células bacterianas contendo grânulos do polímero
biodegradável, da família dos polihidroxialcanoatos (PHA) acumulados no seu interior.
Fonte: SILVA et al., 2007.
12
em relação aos plásticos petroquímicos e possíveis candidatos a sua substituição (Byrom,
1987; Hanggi, 1995; Steinbuchel & Fuchtenbusch, 1998).
O PHB pode ser amplamente utilizado na produção de embalagens de produtos de
limpeza, higiene pessoal, recipientes para ferramentas agrícolas e vasos para mudas de
plantas. Além disso, por ser biocompatível e facilmente absorvido pelo organismo humano,
pode ser empregado na área médico-farmacêutica, prestando-se à fabricação de fios de
sutura, próteses ósseas e cápsulas que liberam gradualmente medicamentos na corrente
sanguínea (Bohmert et al., 2002).
Algumas bactérias encontradas livremente na natureza - solo, água, plantas e
efluentes - são responsáveis pela transformação de substratos em polihidroxialcanoatos
(Byrom, 1987), e vem se tornando um valioso objeto de estudo nos últimos anos. Dentre os
microrganismos produtores de PHAs, existe a bactéria Cupriavidus necator (Figura 9), que
atualmente possui um amplo emprego na indústria dos bioplásticos, produzindo um
polímero de alto peso molecular utilizando uma grande variedade de substratos orgânicos
como frutose, glicose, acetato, lactato, glutamato, entre outros (Fiorese, 2008). Além dessa
bactéria existem outros microrganismos produtores de PHA já descritos, como por
exemplo Burkholderia sacchari, Bacillus megaterium e Pseudomonas oleovarans. Alguns
microrganismos estão sendo foco de estudos avaliativos sobre o potencial de produção do
polímero biodegradável, como é o caso da Gluconacetobacter diazotrophicus, o nosso
objeto de estudo.
Figura 9: Cupriavidus necator em fase de produção. Fonte: AMPE,
1995; SUDESH et al., 2000.
13
2 – JUSTIFICATIVA:
Considerando a grande demanda mundial de produtos plásticos e o constante apelo por
uma política de conservação do meio ambiente, o presente trabalho busca elucidar como
um interessante caminho pode ser traçado a partir do potencial desenhado na estrutura do
genoma de G. diazotrophicus, podendo ser empregada na indústria do plástico
biodegradável, utilizando como substrato principal, o bagaço da cana-de-açúcar.
3 – OBJETIVOS:
3.1 – Objetivos gerais:
Abrir espaço para novas pesquisas qualitativas, a fim de avaliar o potencial de
produção de biopolímero plástico por G. diazotrophicus, contribuindo futuramente para a
preservação ambiental e para o aumento do conhecimento e o desenvolvimento de soluções
tecnológicas e inovadoras para a substituição dos plásticos que causam poluição.
3.2 – Objetivos específicos:
O presente trabalho tem como principal objetivo, realizar a análise in silico das
proteínas relacionadas na síntese de PHB com posterior quantificação por cromatografia
gasosa, através do método descrito por Riss e Mai, 1988.
14
4 – MATERIAIS E MÉTODOS:
4.1. Análise in silico:
A sequência da proteína poly-beta-hydroxybutyrate polymerase de Cupriavidus
necator (sinônimo Ralstonia eutropha) H16 (P23608.1) do Genkbank, um banco de dados
de sequências de DNA e de aminoácidos localizado no Centro Nacional de Informação
Biotecnológica – NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), foi empregada como base para
identificação do seu ortólogo no genoma de G. diazotrophicus. O NCBI fornece um
conjunto de ferramentas de bioinformática para analisar estas sequencias de DNA e de
aminoácidos, como o Blast (Basic Local Aligment Search Tool), que permite comparar a
sequencia de interesse, com base na similaridade identificada em um “alinhamento local”,
com todas as sequências de domínio público depositadas no Banco (Altschul et al., 1997).
Há várias modalidades de BLAST. A modalidade adotada neste trabalho foi o
tBLASTx, onde a informação Query (segmento de DNA pesquisado e usado como isca) e
base de dados (Subject) são sequências de nucleotídios. Antes mesmo de verificar a
homologia, o programa realiza as seis traduções possíveis de cada sequência de
nucleotídios, ou seja, tanto a seqüência pesquisada quanto cada uma das presentes na base
de dados são transformadas em seis proteínas. Esta etapa é interessante já que as proteínas
de dois organismos são mais parecidas entre si que os nucleotídios que as codificam. Após
realizar todas as traduções possíveis, o programa faz alinhamentos entre seus resultados e
devolve para proteína Query - proteína Subject. Nesta análise, apenas uma das seis leituras
possui significado biológico; as demais geram resultados que são descartados.
Neste trabalho só existe interesse em comparar a sequencia de interesse de C.
necator H16 àquelas depositadas no Banco e derivadas de G. diazotrophicus PAL5. C.
necator foi adotada como ponto de partida já que acumula o biopolímero em até 90% de
seu peso seco, quando exposta a altas concentrações de açúcar (Pohlmann et al., 2006).
O resultado da análise por BLAST serviu para a identificação de sequências com
similaridade suficiente dentro do Banco Query de G. diazotrophicus permitindo atribuir a
mesma função do segmento de DNA usado para a busca (derivada de C. necator), que teve
a função conhecida experimentalmente.
Um parâmetro calculado pelo BLAST é mostrado como valor "E". Este valor
15
expressa o grau de similaridade, sendo que quanto menor, menor a chance da identidade
achada na comparação das sequencias ser por acaso.
Além do BLAST, a análise in silico prosseguiu empregando outras Bases de dados
mais comuns como as que são abrigadas pelo Instituto TIGR - Instituto para Pesquisa em
Genômica (www.biochipnet.com/node/2103) e o banco de dados de proteínas Pfam
(http://pfam.sanger.ac.uk/).
Com base no programa Clustaw, abrigado no Instituto de Bioinformática Europeu -
European Molecular Biology Laboratory (EBI– EMBL) (http://www.ebi.ac.uk/), as
sequencias identificadas como PHB sintase em G. diazotrophicus, bem como a sequência
de C. necator utilizada como isca e outras sequencias ortólogas derivadas de bactérias já
integradas à indústria e produtoras do biopolímero de interesse foram alinhadas. O Clustaw
realiza múltiplos alinhamentos com sequenciais de DNA e de proteínas para a construção
das árvores filogenéticas. Embora o programa permita a personalização dos parâmetros de
alinhamento múltiplo para a construção da árvore filogenética, este trabalho utilizou a
configuração padrão oferecida, já que atendia às necessidades. As aproximações evolutivas
apresentadas através das árvores filogenéticas são uma maneira de entender a relação entre
os dados usados na comparação.
O banco KEGG (http://www.genome.ad.jp/kegg) é a representação computacional
completa da célula e do organismo, permitindo a predição, com altos níveis de
complexidade, dos processos celulares a partir de informações moleculares e genômicas.
Este Banco possui dados de genomas e de vias metabólicas de várias espécies; sendo
também útil para o estudo das vias relacionadas à produção de PHB em G. diazotrophicus
e de bactérias relacionadas, com interesse industrial.
4.2 Quantificação de PHB:
Para quantificação da massa de PHB acumulado pela bactéria seguiu-se o método
da propanólise visando a posterior análise por cromatografia gasosa, segundo método
descrito por Riss e Mai (1988). Este método é baseado na hidrólise e transesterificação do
P(3HB) com propanol e ácido clorídrico, levando à formação de um éster, o 3-
hidroxibutirato de propila, que é quantificado por cromatografia gasosa.
16
Foram utilizadas culturas de G. diazotrophicus PAL5 cultivadas em meio DYGS
com a seguinte composição em g L-1
: Glicose, 2; peptona, 1,5; extrato de levedura, 2;
KH2PO4, 0,5; MgSO4.7H2O, 0,5; ácido glutâmico, 1,5; completados com água destilada até
1000 ml; pH 6,0; à 30ºC, durante 24 horas em tubos Falcon de 30 ml. Em seguida, o meio
contendo a cultura foi lavado com água destilada estéril, em uma proporção 1:10
(meio/água), e sucessivamente foram realizadas duas centrifugações à 4000rpm à 5 ºC por
20 minutos cada uma.
A massa de bactérias obtidas após a centrifugação foi lavada duas vezes com água
destilada estéril e posteriormente transferida para tubos de vidro com vedação, com auxílio
de 2 ml de propanólise.
A propanólise consiste numa solução com proporção de 1 ml de ácido clorídrico: 4
ml de propanol, totalizando 5 ml de solução.
Após a transferência do pellet bacteriano com auxílio da propanólise, para os tubos
de vidro, foram adicionados 2 ml de dicloroetano, os tubos foram vedados e aquecidos em
banho-maria a 100 ºC durante 2 horas. Após o tempo de aquecimento, retirou-se do banho,
para resfriamento, o reagente dos tubos foi evaporado por completo, mesmo os tubos
estando hermeticamente fechados, tornando-se necessária a repetição do experimento mais
duas vezes, porém, ainda assim não foi obtido sucesso. Segundo Riss e Mai, após as duas
horas de aquecimento, os tubos deveriam ser retirados do banho-maria, e após
resfriamento, adicionados 4 ml de água destilada estéril, tornando-se possível a observação
de uma separação de fases: Uma fase orgânica e uma fase aquosa. Da fase orgânica, eram
extraídos 2 ml e desse volume eram adicionados 0,2 ml de uma solução de 40mg/ml de
benzoato de etila em propanol que funciona como um padrão interno para a cromatografia
gasosa. Após o preparo das amostras, alíquotas de 0,2 µl eram injetadas no cromatógrafo
gasoso e quantificadas.
17
5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO:
O alinhamento por BLAST da proteina PHB polymerase da R. eutropha H16 com a da
G. diazotrophicus PAL 5 revelou uma similaridade significativa, conforme evidenciado na
figura 9.
Foi realizada uma análise complementar a partir da busca de domínios conservados
funcionais, usando as bases de dados mais comuns como os abrigados pelo Instituto TIGR-
Instituto para Pesquisa em Genômica (www.biochipnet.com/node/2103) e o banco de
dados de proteínas Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/).
A análise revelou similaridade com o domínio TIGR01836: PHA_synth_III_C (E-
value: 2.20e-34), correspondente a função sintase de ácido poli (R)-hidroxialcanóico classe
III, subunidade PHAc . Este representa a subunidade PHAc de uma forma heterodimérica
ácido de Poli hidroxialcanóico sintase (PHA). Excetuando-se os PHAc de Bacillus
megaterium, todos os membros exigem Pha e (TIGR01834) para a atividade e são
designadas de classe III. Esta enzima constrói polímeros de ésteres de carbono para
armazenamento de energia que se acumulam nas inclusões bacterianas.
Figura 9: Matriz de ponto (alinhamento local por Blast2 seq) mostrando similaridade entre as sequências
de poly-beta-hidroxibutirato sintase de Ralstonia eutropha H16, uma bactéria produtora de PHB e de G.
diazotrophicus (similaridade = 5/9 = 56%) A relação ao nível de sequência sugere funções comuns.
18
Com base nos resultados obtidos através da análise dos domínios conservados,
tornou-se possível construir uma árvore filogenética baseada na proteína poli-beta-
hidroxibutirato sintase de G. diazotrophicus e ortólogos de bactérias produtoras de PHB
(Figura 12).
Figura 10: Domínios conservados na proteína “poli-beta-hidroxibutirato polimerase” (PhaC) de G.
diazotrophicus. Superfamília Pha_N representa a região N-terminal de PhaC. O domínio PHA_synth_III_C está
normalmente presente no heterodímero PhC classe III, junto ao transportador PhaE, que não está presente em G.
diazotrophicus. Sintases de PHA da classe IV assemelham-se aos da classe III, requisitando, entretanto o
regulador PhaR (ver figura 11).
Figura 11: Domínios conservados na proteína “Regulador de síntese de polihidroxialcanoato”. PHB/PHA
“accumulation regulator” (PHB_acc) é o domínio de ligação direta do PHA ao DNA. O repressor de síntese de
polihidroxialcanoato PhaR regula a sua própia expressão, a produção da cobertura dos grânulos de PHB e das
enzimas que direcionam o fluxo de carbono para a produção de polímeros PHB para armazenamento.
Pseudomonas sp. 61-3 (patent 5968805) Pseudomonas sp.
Ralstonia eutropha Azohydromonas lata
Rhodobacter sphaeroides (patent 5849894) Vibrio sp.
Sinorhizobium meliloti (patent 7829697) Rhodospirillum rubrum
Gluconacetobacter diazotrophicus Azospirillum sp. Acidiphilium multivorum Xanthomonas campestris
89
100
67
100
92 53
54
54
100
0.2 Figura 12: Filograma comparativo entre diferentes espécies produtoras de PHB.
19
A árvore filogenética representada na figura 13 faz uma comparação entre a
proteína PHB sintase em diferentes espécies de microrganismo produtores de PHB sendo
alguns atualmente empregados na indústria. Foi realizado alinhamento múltiplo utilizando
o programa Clustal através do método Neighbor-Joining. O alinhamento computou os
domínios conservados e informações de similaridade.
A via metabólica do butanoato (figura 13) foi construída a partir dos bancos de
dados do genoma de G. diazotrophicus (http://www.kegg.jp/kegg/docs/plea.html). Onde
temos em destaque a poli-beta-hidroxibutirato sintase (2.3.1) e a acetoacetyl-CoA
reductase (1.1.1.36), que participam promovendo de forma eficaz a ligação do
hidroxibutiril-CoA a uma molécula de polihidroxialcanoico.
Figura 13: Via do metabolismo do butanoato (butirato).
20
Após a ligação das moléculas de hidroxibutiril-CoA e polihidroxialcanoico, reações de
oxiredução, ocorrem obtendo-se como produto final, o polihidroxibutirato + coenzima A
conforme ilustra a figura 14.
Figura 14: Hidroxibutiril sofre oxiredução, a fim de se obter coenzima A e polihidroxibutirato.
21
6 – CONCLUSÃO:
A análise usando EMBOSS Needle com as seqüências de Ralstonia eutropha H16 e
Gluconacetobacter diazotrophicus descreveu um ótimo alinhamento global revelando 56%
de similaridade entre ambas, indicando relação estrutural e funcional. Procedimentos
adicionais são necessários para uma caracterização mais detalhada, mas G. diazotrophicus
apresenta potencial para a produção de polihidroxibutirato, apresentando grandes
perspectivas de ser empregada na indústria de bioplástico, utilizando como fonte de
carbono principal o açúcar da cana, integrando-o à indústria de cana-de-açúcar, podendo
assim ser usado na elaboração de produtos que não irão prejudicar o ambiente, causados
pelos produtos plásticos convencionais que levam anos para serem completamente
degradados no ambiente.
22
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