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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
DANILO TANCLER STIPP
ROTAVÍRUS SUÍNO GRUPO C (PoRV-C): ANÁLISE FILOGENÉTICA DO GENE VP6 DE ESTIRPES
VIRAIS BRASILEIRAS E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE INFECÇÕES SINGULARES E MISTAS (PoRV-A e PoRV-B)
EM UM SURTO DE DIARRÉIA EM LEITÕES LACTENTES.
Londrina/PR 2011
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
ROTAVÍRUS SUÍNO GRUPO C (PoRV-C): ANÁLISE FILOGENÉTICA DO GENE VP6 DE ESTIRPES
VIRAIS BRASILEIRAS E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE INFECÇÕES SINGULARES E MISTAS (PoRV-A e PoRV-B)
EM UM SURTO DE DIARRÉIA EM LEITÕES LACTENTES.
DANILO TANCLER STIPP
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal (Área de Concentração: Sanidade Animal) da Universidade Estadual de Londrina como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciência Animal.
Orientador: Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri
Londrina 2011
DANILO TANCLER STIPP
ROTAVÍRUS SUÍNO GRUPO C (PoRV-C): ANÁLISE FILOGENÉTICA DO GENE VP6 DE ESTIRPES VIRAIS BRASILEIRAS E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE INFECÇÕES SINGULARES E MISTAS (PoRV-A e PoRV-B) EM UM SURTO DE
DIARRÉIA EM LEITÕES LACTENTES.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal (Área de Concentração: Sanidade Animal) da Universidade Estadual de Londrina como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciência Animal.
Comissão Examinadora:
Prof. Dr. Marcos Bryan Heinemann Universidade Federal de Minas Gerais
Prof. Dr. Marco Antônio Bacellar Barreiros Universidade Federal do Paraná
Prof. Dra. Roberta Lemos Freire Universidade Estadual de Londrina
Prof. Dr. João Luis Garcia
Universidade Estadual de Londrina
Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri Universidade Estadual de Londrina
Londrina, 22 de julho de 2011.
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Virologia Animal, Departamento
de Medicina Veterinária Preventiva, Centro de Ciências Agrárias da Universidade Estadual de
Londrina, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciência Animal pelo
Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal (Área de Concentração: Sanidade Animal),
sob orientação do Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri.
Os recursos financeiros para o desenvolvimento do projeto foram obtidos junto às
agências e órgãos de fomento à pesquisa, abaixo relacionados:
1. CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / MCT
2. CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / MEC
3. FAP/PR: Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e
Tecnológico do Paraná / SETI
4. FINEP: Financiadora de Estudos e Projetos / MCT
DEDICATÓRIA
A Deus
À minha amada esposa Rejane Alves Mira
Aos meus queridos pais Paulo José Marconi Stipp e Ana Maria Tancler Stipp
À minha querida irmã Aline Tancler Stipp
À minha avó paterna Ada M. Stipp (in memorian)
Aos meus avôs maternos Geraldo Tancler (in memorian) e Nilza T. Tancler
À grande amiga e colega Dalíria do Prado (in memorian)
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me iluminado ao longo deste trabalho, tornando possível a
concretização desse sonho. À minha amada esposa Rejane, pela compreensão e muita paciência; carinho e,
principalmente, pelo amor e companheirismo ao longo de mais esta jornada; lembranças e sentimentos que jamais se apagarão de minha memória e coração. Sempre te amarei.
Aos meus queridos pais Paulo e Ana Maria, e à minha querida irmã Aline; pelo apoio
em todos os momentos, sempre me auxiliando no que fosse necessário. Amo vocês. Aos meus tios Antônio Carlos M. Stipp e Mara Regina Stipp Balarin, pelos conselhos
e por me mostrarem o caminho a ser seguido em minha carreira acadêmica, profissão esta digna e extremamente gratificante.
A todos os meus familiares, em especial meus padrinhos Francisco e Carmem Tancler,
e Rogério Tancler; ao meu tio Sérgio Henrique Tancler; e aos meus avós Geraldo Tancler (in memorian), Nilza T. Tancler e Ada Stipp (in memorian), que sempre estarão em meu coração; agradeço a todos pelo respeito e confiança nos momentos presentes.
Ao professor e orientador Prof. Dr. Amauri A. Alfieri pela oportunidade concedida e
confiança em mim depositada. Agradeço-o por todos os conselhos que recebi, pelo excelente convívio ao longo desses dez anos desde os tempos da Graduação; e pelo exemplo de profissionalismo a ser seguido. Agradeço-o ainda pela paciência no decorrer da realização deste “parto distócico”. Meu muito obrigado!
À professora Dra. Alice Fernandes Alfieri pela orientação, atenção, confiança, e
amizade em mais esta jornada. A todos os professores do curso de graduação em Medicina Veterinária e do Programa
de Pós-graduação em Ciência Animal, em especial aos professores: Caio Abércio da Silva, Edson Luis A. Ribeiro, Ernst E. Müller, Italmar T. Navarro, Julio Augusto N. Lisboa, Julio Cesar de Freitas, Laurenil Gaste, Marcelo M. Seneda, Marilda C. Vidotto, Milton H. Yamamura, Nilva Maria F. Mascarenhas, Odilon Vidotto, Pedro Luíz de Camargo; muito obrigado pela amizade, conhecimento e formação acadêmica científica.
Aos membros da Comissão Examinadora na banca de defesa: Prof. Dr. Marcos Bryan
Heinemann, Prof. Dr. Marco Antônio Bacellar Barreiros, Prof. Dr. João Luis Garcia e Profa. Dra. Roberta L. Freire pelas valiosas contribuições ao presente trabalho.
À Elis Lorenzetti, Kerlei Cristina Médici e Thaís Neris da Silva Medeiros pela ajuda
indispensável, consideração e amizade durante todo o período de desenvolvimento deste trabalho. À grande amiga Maria Yoshie, meu muito obrigado pelos ensinamentos, puxões de orelha e momentos que jamais serão esquecidos.
À grande amiga Dalíria do Prado (in memorian) pelos ensinamentos, pelo exemplo de
integridade e profissionalismo. Que Deus a abençoe. Saudades... sempre em nossos corações.
Aos funcionários da Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-graduação (PROPPG) e Centro de Ciências Agrárias (CCA) pelo auxílio e atenção durante a realização dos trabalhos. A todos os funcionários do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva (DMVP) em especial ao José Aldivino (Microbiologia), José Roberto e Joãozinho (Patologia Clínica), por cada conversa, risadas e cumprimentos pelos corredores. Aos secretários do DMVP e Pós-Graduação, Reinaldo e Helenice, respectivamente, pela paciência e atenção.
Aos meus grandes amigos que acompanharam minha jornada ao longo deste período
de trabalho: Alexandre Redson Soares da Silva, Bruno Garcia Botaro, Danilo Laurenti Ferreira e Rafael Felipe Vieira, pelos conselhos, confiança, respeito e companheirismo, além dos momentos de descontração e muitas risadas; pessoas às quais serei eternamente grato.
Aos eternos amigos e colegas que conheci e convivi no “lab”: Alexandre Amude,
Betinha, Flora Kano, Jonas Espíndola, Juliana Dias, Marlise Claus, Michele Lunardi, Stellamaris Dezen, meu muito obrigado por toda ajuda e consideração, jamais me esquecerei de vocês. Aos demais amigos Aline Barry, Bruno Mazzer, Ceília de Souza, Claudia Tozato, Karina Flaiban, Kledir Spohr, Luciana Takemura, Patrícia Nunes da Silva, Rodrigo Otonel, Vanessa “Japa” Hashimoto, pessoas que certamente ficarão guardadas no lado esquerdo do peito, meu muito obrigado pela amizade em todos estes anos de convivência.
A todos os estagiários e bolsistas de iniciação científica do laboratório de Virologia
Animal da UEL que colaboraram com o desenvolvimento deste trabalho. À Universidade Estadual de Londrina pela estrutura e suporte fornecidos. Aos meus amigos e colegas de trabalho da Faculdade Integrado de Campo Mourão, ao
qual tenho muito orgulho e carinho por ter feito parte desta Instituição, em especial o meu agradecimento a Bruno Menarin, Claudia Gebara, Clóvis Bassani, Damaris, Franciele Baptista, Julio César Severino, Ludmila Moroz, Paulo Emílio Prohmann, Roberta R. Fernandes, Roberta Toledo, Rodrigo Yanaka, Sabrina Rodigheri, Vitor S. Sartori e a todos os meus orientados e demais alunos.
À Universidade Federal da Paraíba (UFPB / CCA), minha nova casa, à qual tenho me
dedicado neste último ano e, se Deus quiser, permitirá que eu continue meu trabalho até o fim de minha vida. Meu muito obrigado aos meus novos amigos e colegas de trabalho e profissão da UFPB, pessoal “arretado demais”: Abraão R. Barbosa, Alexandre José Alves, Daniela Lafetá, Fabiana Satake, o flamenguista doente George D. Santos, Katerin B. Grondona, o “pó de arroz” carioca Luis Felipe Souza da Silva, o “coxa branca” fanático e enciclopédia do futebol brasileiro Luiz Eduardo Buquera, o vascaíno Michel Alves da Silva, o pernambucano “Susie” da Ilha do Retiro Rafael Lima, o amigo e sofredor “gambá” Ricardo R. Guerra, o grande amigo e tricolor “bambi” paulista Rodrigo N. Pereira, o amigo e “cabra” bom Suedney de Lima Silva, a chefia do Departamento de Ciências Veterinárias, Suzana A. Costa de Araújo e Valeska P. de Melo (obrigado pela liberação das atividades – e paciência – para o desenvolvimento do presente trabalho).
Por fim, agradeço a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização
deste trabalho; meu muito obrigado.
RESUMO
STIPP, D.T. Rotavírus suíno grupo C (PoRV-C): Análise filogenética do gene VP6 de estirpes virais brasileiras e diagnóstico molecular de infecções singulares e mistas (PoRV-A e PoRV-B) em um surto de diarréia em leitões lactentes. 2011. 110f. Tese (Doutorado em Ciência Animal, Área de Concentração: Sanidade Animal) - Universidade Estadual de Londrina, Londrina. 2011. A diarreia neonatal é o principal problema sanitário que acomete leitões lactentes em todo o mundo. A diarréia é um problema multifatorial, determinada pela imunidade do hospedeiro, manejo zootécnico e agentes infecciosos como bactérias (Escherichia coli enterotoxigênica, Clostridium perfringens tipo C), protozoários (Cryptosporidium spp e Isospora suis) e vírus (rotavírus, coronavírus e calicivírus). O rotavírus suíno (PoRV) é descrito como a principal etiologia viral de enterite em leitões lactentes e recém desmamados em todo o mundo. O PoRV do sorogrupo C (PoRV-C) se distingue dos outros sorogrupos de PoRV pelas características antigênicas da proteína estrutural VP6 que é o principal alvo em técnicas de diagnóstico e análises moleculares. Este estudo teve por objetivo analisar a heterogeneidade genética de 15 estirpes de PoRV-C obtidas de episódios de diarreia em leitões provenientes de cinco estados brasileiros e descrever a participação de diferentes sorogrupos de rotavírus em um surto de diarreia em leitões em um rebanho vacinado contra a rotavirose. A diversidade genética das estirpes de PoRV-C foi analisada pela amplificação, sequenciamento e análise molecular de um produto com 1353 pb do gene da VP6. Filogeneticamente, as estirpes de PoRV-C avaliadas foram agrupadas em três clusters formados exclusivamente por estirpes de PoRV-C de origem suína, distintas das estirpes virais de origem bovina e humana. Em um surto de diarreia neonatal foram colhidas 15 amostras de fezes diarreicas de leitões lactentes com 1 a 4 semanas de idade. A presença de PoRV-A, PoRV-B e PoRV-C foi avaliada por técnicas moleculares (RT-PCR e SN-PCR). PoRV foi identificado em 14 (87,5%) amostras fecais sendo 81,2%, 56,2% e 18,7% das amostras positivas para o PoRV-C, PoRV-A e PoRV-B, respectivamente. Infecções mistas, ocasionadas por mais de um sorogrupo de PoRV, foram predominantes ocorrendo em 9 (64,3%) amostras fecais avaliadas. A associação mais frequente envolveu a presença de PoRV-A e PoRV-C. A caracterização molecular das estirpes de PoRV-A identificadas no surto demonstrou a presença do genotipo G4P[6]. Os resultados permitiram identificar, pela primeira vez, grande variabilidade genética no gene 5 (VP6) de estirpes virais brasileiras de PoRV-C indicando que, a exemplo de PoRV-A, existe diversidade molecular nas estirpes virais circulantes. O estudo de avaliação da infecção pelo rotavírus em rebanhos suínos regularmente vacinados contra a rotavirose demonstrou a importância do constante monitoramento da etiologia das diarreias neonatais em rebanhos vacinados, particularmente com relação à etiologia múltipla envolvendo diferentes grupos antigênicos de PoRV. Destaca-se ainda a importância da genotipagem das estirpes de PoRV-A identificadas nas amostras de fezes diarreicas de leitões de rebanhos vacinados com o objetivo de esclarecer as possíveis causas de falhas vacinais. Palavras-chave: suínos, diarréia, rotavírus grupo C, diagnóstico, filogenia.
ABSTRACT STIPP, D.T. Porcine rotavirus group C (PoRV-C): Phylogenetic analyses of VP6 gene of wild-type Brazilian strains and molecular diagnosis of single and mixed (PoRV-A and PoRV-B) infections in a diarrhea outbreak in suckling piglets. 2011. 110p. Thesis (Doctor’s Degree in Animal Science) – Londrina State University, Londrina. 2011. Neonatal diarrhea is the major piglet health problem in pig productions worldwide. Diarrhea is the result of the association of several factors that include host immunity, management procedures and infectious agents as bacteria (enterotoxigenic Escherichia coli, Clostridium perfringens type C), protozoa (Cryptosporidium spp and Isospora suis) and virus (rotavirus, coronavirus and calicivirus). Porcine rotavirus (PoRV) is the main cause of viral enteritis in suckling and weaned piglets. Porcine rotavirus group C (PoRV-C) is distinguished from other rotavirus groups by antigenic features of the structural protein VP6 that constitutes a frequent target of diagnostic assays and molecular analysis. The aim of the present study was to analyze the genetic heterogeneity of 15 PoRV-C strains from five Brazilian states and to describe the involvement of different rotavirus serogroups in an outbreak of diarrhea in piglets from a herd vaccinated against rotavirosis. The genetic diversity of the PoRV-C strains was investigated by amplification, sequencing and molecular analysis of a 1,353 bp VP6 gene product. Phylogenetically, the PoRV-C strains analyzed were ranged in three clusters exclusively formed by PoRV-C of porcine lineages, different from bovine and human virus strains. In a neonatal diarrhea outbreak episode, 15 diarrheic fecal samples were collected from piglets from 1 to 4-weeks-old. The presence of PoRV-A, PoRV-B and PoRV-C was analyzed by molecular techniques (RT-PCR and SN-PCR assays). PoRV was detected in 14 (87.5%) samples, where 81.2%, 56.2%, and 18.7% were positive to PoRV-C, A, and B, respectively. Mixed infections, caused by more than one PoRV serogroups, were predominant in 9 (64.3%) fecal, samples. The most frequent association involved the presence of PoRV-A and PoRV-C. The molecular characterization of wild-type PoRV-A strains detected in the diarrhea outbreak identified the presence of G4P[6] genotype. The results showed for the first time, a great genetic variability of gene 5 (VP6) of Brazilian PoRV-C strains, indicating that, like PoRV-A, the existence of molecular diversity among circulating PoRV-C strains. The study of rotavirus infection in a pig herd regularly vaccinated against rotavirosis demonstrates the importance of a constantly neonatal diarrhea etiology screening in vaccinated herds, particularly regarding to mixed etiology involving multiple antigenic PoRV groups. Note also the importance of genotyping of the PoRV-A strains identified in diarrheic fecal samples from piglets of vaccinated herds in order to clarify the possible causes of vaccine failure. Keywords: Swine, diarrhea, rotavirus, rotavirus group C, diagnosis, phylogeny.
SUMÁRIO
1 - REVISÃO DE LITERATURA
Rotavirose suína ........................................................................................................ 15 Rotavírus ................................................................................................................... 18 História e taxonomia ................................................................................................. 18 RV-A ......................................................................................................................... 18 RV-B ......................................................................................................................... 20 RV-C ......................................................................................................................... 21 Caracterização eletroforética e características das proteínas constituintes das camadas interna, intermediária e externa do capsídeo do RV-C. .............................
23
Perfil eletroforético do RV-C e diversidade genômica ............................................. 23 Proteína VP6 ............................................................................................................. 24 Proteína VP4 ............................................................................................................. 24 Proteína VP7 ............................................................................................................. 25 Epidemiologia da rotavirose suína ............................................................................ 26 Diagnóstico do rotavírus grupo C ............................................................................. 30 Profilaxia e controle .................................................................................................. 34 Referências ................................................................................................................ 35
2. OBJETIVOS
2.1. Geral ................................................................................................................. 49 2.2. Específicos ...................................................................................................... 49
3. ARTIGOS PARA PUBLICAÇÃO
3.1 VP6 gene heterogeneity of group C porcine rotavirus strains.
Abstract .................................................................................................................... 52 Introduction .............................................................................................................. 53 Materials and Methods ............................................................................................. 55 Results ...................................................................................................................... 59 Discussion ................................................................................................................ 69 References ................................................................................................................ 72
3.2 Porcine rotavirus group C (PoRV-C) single and mixed infections (PoRV-A, PoRV-B) as cause of a piglet diarrhea outbreak in vaccinated pig herd.
Abstract .................................................................................................................... 78 References ................................................................................................................ 86
4. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 93
5. ANEXOS
A. Lista de reagentes ............................................................................................ 95 B. Soluções e tampões ......................................................................................... 97 C. Protocolo de técnicas ....................................................................................... 101
LISTA DE FIGURAS
VP6 gene heterogeneity of group C porcine rotavirus strains. Fig.1. Neighbor-Joining (Tamura-Nei model) tree based on complete sequences of VP6
gene of 15 Brazilian PoRV-C wild-type strains (●) described in this study and eight reference strains acquired from GenBank with complete RV-C VP6 sequences. The names of RV-C strains and GenBank accession numbers are listed in Table 2. The scale bar is proportional with the phylogenetic distance. ......................................... 61
Fig.2. Phylogenetic tree of the VP6 gene of the Brazilian PoRV-C strains showing its genetic relationship with other RV-C strains. RV-A srains CMP12/03 (Porcine), KJ9-1 (Bovine) and PA169 (Human); and RV-B strains RUBV282 (Bovine) and WH-1 (Human), were used as out-groups. The shape markers of Brazilian PoRV-C are according to the pig herds State location (Mato Grosso do Sul [▼], Minas Gerais [■], Paraná [▲], Rio Grande do Sul [●] and Santa Catarina [♦]).The names, original hosts and GenBank accession numbers of RV-A, B and C strains are listed in Table 2. The number adjacent to the node represents the bootstrap value. Scale bar shows genetic distance expressed as nucleotide substitutions per site. ............................... 62
12
LISTA DE TABELAS
VP6 gene heterogeneity of group C porcine rotavirus strains. Table 1. Brazilian PoRV-C wild-type strains with VP6 gene sequences performed in the
study, their origin and year collected. ................................................................. 56 Table 2. GenBank accession numbers of the VP6 genes of the Brazilian PoRV-C
strains, reference RV-C strains and out group strains used in phylogenetic and sequence analyses. ....................................................................................... 59
Table 3. Estimates of evolutionary divergence between the Brazilian PoRV-C and out-
group RV-A reference strains. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown ........................................................ 64
Table 4. Estimates of evolutionary divergence between Porcine I clustered strains. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown. …………………………………........................................................ 65
Table 5. Estimates of evolutionary divergence between Porcine II clustered strains. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown. ……..………………………………………………………….... 66
Table 6. Estimates of evolutionary divergence between Porcine III clustered strains. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown. .….…………………………………………………………….... 67
Table 7. Estimates of evolutionary divergence between Porcine I, Porcine II, Porcine III, Bovine and Human clusters. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown. ………………….………..…….... 68
Table 8. Nucleotide and deduced amino acid sequence comparison of the VP6 of the Brazilian PoRV-C strains with that of the other strains. …………………... 68
Porcine rotavirus group C (PoRV-C) single and mixed infections (PoRV-A, PoRV-B) as cause of a piglet diarrhea outbreak in vaccinated pig herd. Table 1. Groups of porcine rotavirus (PoRV) identified by RT-PCR assay in a diarrhea
outbreak in weaning piglets. .......................................................................... 83
13
LISTA DE QUADROS
Revisão de Literatura Quadro 1. Frequência de detecção do rotavírus suíno grupo A em fezes de leitões ..... 28
Quadro 2. Frequência de detecção do rotavírus suíno grupo B em fezes de leitões ..... 29
Quadro 3. Frequência de detecção do rotavírus suíno grupo C em fezes de leitões ..... 30
14
1. REVISÃO DE LITERATURA
15
Rotavirose suína
As diarreias neonatais constituem importante problema sanitário que afeta a produção
de rebanhos suinícolas, independentemente do nível de tecnificação da criação, sendo
observadas tanto em países desenvolvidos quanto em desenvolvimento. Os prejuízos
econômicos determinados pelas diarreias podem comprometer a longevidade da exploração
econômica de suínos devido aos aumentos nas taxas de morbidade e mortalidade; bem como,
pelas despesas adicionais de mão de obra e medicação com o tratamento dos animais
enfermos. Os episódios de diarreia em animais jovens determinam ainda alterações
consideráveis nas taxas de conversão alimentar e de ganho de peso, ocasionando problemas
de manejo em consequência da desuniformidade dos lotes. A desidratação, o desequilíbrio
eletrolítico e a acidose são os sinais clínicos mais frequentes. Os animais doentes se
apresentam imunossuprimidos, predispondo-os a outras infecções, principalmente as
respiratórias (PAUL; LYOO, 1993; WIELLER et al., 2001; CALDERATO et al., 2001;
ALFIERI et al., 2007).
Em leitões, as diarreias ocorrem tanto em animais lactentes quanto recém-
desmamados. As fases de maternidade e creche representam o período de maior desafio à
sanidade entérica dos leitões (KATOULI et al., 1995). A imaturidade imunológica e falha na
proteção passiva são as principais causas da maior susceptibilidade dos animais na
maternidade (SPENCER et al., 1989). No período pós-desmame, a primeira e a segunda
semanas constituem-se em fatores de risco para diarreias, principalmente devido às alterações
de ordem social e alimentar a que os animais são expostos em decorrência do manejo
(MELIN et al., 2000; ALFIERI et al., 2007).
A etiologia das diarreias é complexa e fatores ambientais, nutricionais e vários agentes
infecciosos como vírus, bactérias, parasitas e toxinas bacterianas podem estar envolvidos
nesta síndrome. A importância relativa dos agentes etiológicos é variável e o predomínio de
16
um determinado agente em rebanhos, regiões ou mesmo a sua distribuição sazonal, está
relacionada com a intensidade e a regularidade com que medidas de caráter higiênico-
sanitário são adotadas (JANKE, 1989; JOHNSON et al., 1992; CICIRELLO; GLASS, 1994;
ALFIERI et al., 2007).
As causas infecciosas mais comuns das diarreias em suínos nos períodos do pré e do
pós-desmame no Brasil são representadas pelos enteropatógenos Escherichia coli, rotavírus,
Isospora suis, Cryptosporidium spp e Clostridium perfringens. Estes agentes causam diarreia
cuja intensidade pode variar desde branda a grave, podendo culminar com a morte dos
animais comprometidos (MELIN et al., 2004). As variações nos sinais clínicos e nas taxas de
morbidade e de mortalidade são devidas às diferenças na virulência e/ou na dose infecciosa do
patógeno; da associação entre microrganismos; de aspectos relacionados ao hospedeiro como
o estatus imunológico e a idade; e de fatores relacionados ao meio ambiente e ao manejo
como limpeza, desinfecção, umidade e ventilação, entre outros (ALFIERI et al., 2007). A
semelhança dos sinais clínicos, independentemente do agente etiológico, impossibilita a
determinação da etiologia com base apenas nos parâmetros clínicos (DRIESEN et al., 1993).
Com relação à etiologia viral das diarreias, os rotavírus (RV) são considerados a
principal causa de infecções entéricas em mamíferos e em aves jovens em todo o mundo. A
gama de hospedeiros é extensa e, além de seres humanos, inclui várias espécies de animais de
produção destacando-se, principalmente pelo impacto econômico que representa ao setor
produtivo, as infecções em leitões, bezerros e em aves jovens como frangos de corte e perus
(McNULTY, 1978; ESTES et al., 1981; HO et al., 1988; ESTES; COHEN, 1989; ALFIERI et
al., 2007).
A rotavirose suína caracteriza-se por comprometer animais jovens, entre a segunda e a
quarta semanas de vida (BOHL, 1978; UTRERA et al., 1984; WIELER et al., 2001; ALFIERI
et al., 2007). A morbidade da rotavirose suína é alta, principalmente nas primoinfecções,
17
porém a mortalidade é variável e oscila entre 7-20% (BOHL, 1978). As matrizes prenhes,
quando portadoras, eliminam o RV por meio das fezes para o ambiente, principalmente nos
dias que antecedem ao parto, sendo fonte de infecção para os leitões (RUBIO et al., 1988).
Em infecções naturais os animais eliminam o RV tanto nas fezes normais quanto diarréicas
(DEWEY et al., 2003).
A transmissão dos RV ocorre por via fecal-oral, com a ingestão de água e/ou
alimentos contaminados com fezes. Há relatos da possibilidade da transmissão por aerosóis,
principalmente quando as condições de umidade e ventilação do ambiente são favoráveis
(COOK et al., 1996; KAPIKIAN et al., 2001). Os RV são, geralmente, espécie-específicos,
porém a ocorrência de infecções entre diferentes espécies animais, denominadas infecções
heterólogas, tem sido demonstrada (COOK et al., 2004).
O RV se replica, principalmente, em ambientes com grande concentração de animais e
com condições de higiene desfavoráveis, infectando as células epiteliais das vilosidades
intestinais (KAPIKIAN et al., 2001). Somente partículas com tripla camada protéica
conseguem aderir-se aos enterócitos. O RV apresenta tropismo por enterócitos maduros das
porções média e alta das vilosidades do intestino delgado, principalmente terço final de jejuno
e inicial de íleo, de animais e de seres humanos jovens (LUNDGREN; SVENSSON, 2001).
No processo de replicação viral ocorre a lise das células infectadas. A redução da capacidade
de absorção dos enterócitos e a descamação do epitélio intestinal, com atrofia das vilosidades,
causam o quadro diarréico (KAPIKIAN et al., 2001).
Os sinais clínicos iniciam por volta do terceiro dia pós-infecção e os animais podem
excretar o vírus por até oito dias após o início dos sinais clínicos (DEWEY et al., 2003). Os
animais apresentam, principalmente, diarreia de consistência pastosa à líquida e de curta
duração, em média por três dias. A desidratação é frequente em leitões muito jovens, onde a
infecção é mais grave (THEIL et al., 1985a).
18
Rotavírus
Histórico e taxonomia
Os RV são membros da família Reoviridae e pertencem ao gênero Rotavirus. A
partícula viral é de simetria icosaédrica, com aproximadamente 70 a 90 nm de diâmetro, não
apresenta envelope lipoprotéico e o capsídeo é constituído por três camadas concêntricas de
proteínas. O genoma viral é formado por 11 segmentos de RNA fita dupla (dsRNA) que
codificam seis proteínas estruturais (VP – viral protein) e seis proteínas não-estruturais (NSP
– non-structural protein). A nomenclatura das VPs (VP1; VP2; VP3; VP4; VP6 e VP7) e das
NSPs (NSP1; NSP2; NSP3; NSP4; NSP5; NSP6), presentes em partículas virais maduras, são
seguidas por números em ordem decrescente da massa molecular. As proteínas VP1, VP2 e
VP3 formam a camada interna, ou core, do capsídeo viral; a proteína VP6 constitui a camada
intermediária, e as proteínas VP4 e VP7 formam a camada externa do capsídeo (ESTES;
COHEN, 1989; MIDTHUN; KAPIKIAN, 1996). A proteína VP4 tem função essencial no
ciclo de replicação do vírus, incluindo a ligação ao receptor celular e a penetração em células
hospedeiras. A função da VP7, durante a interação inicial, ainda não está bem estabelecida
(ZARATE et al., 2004).
Com base na especificidade antigênica da VP6 os RV são classificados em sete grupos
sorológicos (sorogrupos) denominados de A a G. Todos os membros de cada sorogrupo,
independentemente da espécie animal de origem, apresentam seu próprio antígeno comum
que é antigenicamente distinto entre os sorogrupos (ESTES; COHEN, 1989).
Rotavírus grupo A (RV-A)
A proteína VP4 exerce influência direta na patogenicidade e na atenuação das estirpes
de RV-A e apresenta epítopos neutralizantes que, juntamente com a VP7, estão associados à
19
neutralização sorotipo-específica e à proteção contra a infecção. Com isso, à semelhança do
vírus influenza, os RV apresentam classificação sorológica binária onde devem ser
consideradas, simultaneamente, as especificidades antigênicas das proteínas VP4 e VP7,
formadoras da camada externa do capsídeo viral (HOSHINO et al., 1985; OFFIT et al., 1986).
Para a padronização da nomenclatura, os sorotipos de RV-A relacionados à VP4, são
denominados sorotipos “P” devido a sua susceptibilidade à clivagem proteolítica. Os
sorotipos relacionados ao polipeptídeo VP7, por ser de constituição glicoproteica, são
denominados sorotipos “G” (ESTES; COHEN, 1989).
A identificação por métodos sorológicos dos sorotipos G e P de RV-A apresenta uma
série de limitações como: i) alta taxa de amostras não sorotipadas nos levantamentos
epidemiológicos; ii) grande número de infecções mistas ou variantes antigênicas; iii) não
caracterização de sorotipos P por meio de ensaios imunoenzimáticos comerciais (ALFIERI,
1999). Com isso, a genotipagem passou a ser utilizada como uma técnica alternativa à
sorotipagem dos RV-A. Atualmente são reconhecidos 24 genotipos G (G1 a G24) e 33
genotipos P (P[1] a P[33]) demonstrando a ampla diversidade antigênica desse grupo de RV
(KAPIKIAN et al., 2001; MARTELLA et al., 2006; KHAMRIN et al., 2007; URSU et al.,
2009; COLLINS et al., 2010).
Os genotipos de RV-A mais frequentemente encontrados em suínos são G3, G4, G5 e
G11 que estão associados com P[6] ou P[7] (WINIARCZYK et al., 2002; BARREIROS et al.,
2003). Outros P tipos têm sido descritos em RV isolados ou presentes em amostras fecais
como P7[5]; P1A[8]; P[13]; P12[19]; P14[23] (LIPRANDI et al., 2003; MARTELLA et al.,
2005). As principais combinações entre os genotipos G e P de RV-A suíno são G5P[7]
(OSU), G4P[6] (Gottfried), G11P[7] (YM), e G3P[7] (CRW8) (BARREIROS et al., 2003;
PARRA et al., 2008).
20
Apesar da caracterização dos RV, particularidades sobre a replicação do genoma viral
e as diversas fases que envolvem a morfogênese ainda não foram esclarecidas (ARNOLDI et
al., 2007). A proteína NSP2, assim como a proteína NSP5 participam nos processos de
formação do viroplasma e de replicação viral durante infecções naturais (CAMPAGNA et al.,
2005; SILVESTRI et al., 2004). A NSP5 apresenta massa relativamente pequena (21,7 kDa)
quando comparada com outras proteínas, assumindo a forma de um octâmero quando em
solução. Análises moleculares utilizando a proteína NSP2 como sequência alvo têm
demonstrado resultados satisfatórios na detecção do RV-B de origem humano e animal
(GOUVEIA et al, 1991).
Uma proteína não-estrutural de grande relevância é a NSP4, devido ao seu
envolvimento com a morfogênese viral e sua atividade enterotóxica (MARTELLA et al.,
2003). Estudos com a proteína NSP4 do RV-A, sugerem a sua classificação em cinco
genogrupos: i) genogrupos A, B e C isolados de leporinos, equinos, bovinos, suínos, símios,
caninos e felinos e seres humanos nos quais análises filogenéticas mostram o agrupamento
das estirpes sempre em um mesmo ramo, sugerindo evolução constante entre estas estirpes
virais; ii) genogrupos D e E, encontrados somente em camundongos e aves, respectivamente
(CIARLET et al., 2000).
Rotavírus grupo B (RV-B)
Tanto a caracterização antigênica e molecular quanto a prevalência dos RV-B ainda
não estão bem esclarecidas (TSUNEMITSU et al., 1999), principalmente devido à dificuldade
de adaptação desse grupo de RV em culturas celulares (THEIL; SAIF, 1985). Estudos
moleculares, direcionados aos genes que codificam as proteínas do capsídeo interno, indicam
particularidades nos RV-B quando comparados aos RV-A e RV-C (CHEN et al., 1991).
21
A variação genética existente entre as estirpes de RV-B ainda é pouco caracterizada,
porém análises de nucleotídeos e de aminoácidos têm demonstrado grande diversidade em
estirpes de RV-B em relação aos RV-A (45,2% de identidade) e RV-C (26,4% de identidade)
(CHANG et al., 1997; CHEN et al., 2002). Análises moleculares demonstraram também
grande variabilidade na proteína VP7 de estirpes do RV-B provenientes de diferentes
hospedeiros e de diversas regiões do mundo (CHEN et al., 1991; PEDRIC et al., 1991;
EIDEN; ALLEN, 1992; CHANG et al., 1997; KANG et al., 2005; ALFIERI et al., 2007).
Técnicas de hibridização molecular têm sido utilizadas para avaliar a diversidade
genética em estirpes de RV-B. O sequenciamento dos genes 4 (VP4), 6 (NSP1), 8 (NSP2), 9
(VP7) e 11 (NSP5) dos protótipos indianos CAL (Calcutá) e ADRV (adult diarrhea
rotavirus), e de algumas estirpes virais provenientes de surtos de diarreias em seres humanos,
revelaram grande diversidade antigênica nas estirpes de RV-B (SEN et al., 2001; KELDAR;
ZADE, 2004; JIANG et al., 2005; ALAM et al., 2006).
A identificação de segmentos genômicos homólogos, utilizando a técnica de
hibridização com probes, indicou que as estirpes de RV-B IDIR (infant diarrhea rats) e
ADRV estão intimamente associadas quando comparadas com o gene correspondente da
estirpe padrão Nemuro GBR (group B rotavirus) (TSUNEMITSU et al., 2005). Estes dados
são importantes para o estabelecimento das relações antigênicas entre as diferentes estirpes de
RV-B existentes e sua relação com os outros grupos de RV (EIDEN et al., 1992).
Rotavírus grupo C (RV-C)
Os RV-C foram, primeiramente, descritos na década de 80 (SAIF et al., 1980; BOHL
et al., 1982), onde algumas estirpes de RV detectadas em episódios diarreicos em suínos e em
outras espécies, como aves, apresentavam em comum um grupo de antígenos, detectado por
métodos sorológicos como imunofluorescência e técnicas de ELISA (Enzyme-linked
22
immunossorbent assay). Estes agentes, por apresentarem morfologia semelhante aos RV,
porém sem grupo antigênico comum às estirpes caracterizadas anteriormente, eram
denominados “pararotavírus”, rotavírus “não-grupo A” ou “rotavírus atípicos” (WOODE et
al., 1976; THOULESS et al., 1977).
Desde então, os RV-C têm sido identificados em humanos, bovinos, caninos e animais
silvestres, como furões (RODGER et al., 1982; TORRES-MEDIAN, 1987; TSUNEMITSU et
al., 1991; OTTO et al., 1999). Em humanos, infecções por RV-C têm sido associadas com
episódios esporádicos e também em surtos de gastroenterites em todo o mundo, determinando
sua importância como patógeno entérico (BRIDGER et al., 1986; SZUCS et al., 1987;
ARISTA et al., 1990; CAUL et al., 1990; SAIF; JIANG, 1994; JIANG et al., 1995; KUZUYA
et al., 1998; SCHNAGL et al., 2004; KUZUYA et al., 2005; RAHMAN et al., 2005;
BANYAI et al., 2006).
Assim como nos RV-A, a diversidade genômica dos RV-C também é decorrente de
mutação pontual, ressortimento e rearranjo. A mutação pontual consiste em alterações na
sequência de nucleotídeos que ocorrem durante a replicação do genoma. A acumulação de
mutações pontuais tem sido observada em isolados obtidos durante uma única epidemia de
RV-A (PALOMBO et al., 1993). Estas alterações levam à substituições nos aminoácidos da
proteína codificada, podendo alterar o sítio antigênico, resultando em estirpes resistentes aos
anticorpos neutralizantes produzidos contra as estirpes parentais. Ressortimento consiste em
mudanças no genoma que ocorrem devido a trocas de segmentos de dsRNA entre diferentes
estirpes virais (ESTES; COHEN, 1989). Este fenômeno pode ocorrer quando uma célula é
coinfectada por duas estirpes virais distintas, de forma que a progênie viral será constituída
por uma população contendo diferentes combinações dos genes parentais (TANIGUCHI;
URASAWA, 1995). Alterações em porções significativas da sequência em um mesmo
segmento genômico, muitas vezes na forma de deleções ou duplicações, são denominadas de
23
rearranjo. Estas alterações levam a modificações na massa molecular dos segmentos de
dsRNA, resultando em perfil eletroforético distinto daquele original (GONZÁLES et al.,
1989). Portanto, estes três mecanismos parecem ser responsáveis pela grande variabilidade e
complexidade dos RV.
Caracterização eletroforética e características das proteínas constituintes das camadas
interna, intermediária e externa do capsídeo do RV-C.
Perfil eletroforético do RV-C e diversidade genômica
O perfil de migração do dsRNA na técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida
(silver stained-polyacrylamide gel electrophoresis, ss-PAGE) permite a diferenciação dos RV
em sete eletroferogrupos distintos (A-G), correspondentes aos sorogrupos (RODGER et al.,
1981; ESTES et al., 1984). O padrão genômico básico do RV-C consiste de classes ou regiões
de diferentes massas moleculares contendo os segmentos de dsRNA de 1 a 4 (Classe I); 5, 6 e
7 (Classe II); 8 e 9 (Classe III) e segmentos 10 e 11 (Classe IV). Esta disposição é
frequentemente representada como 4-3-2-2, indicando o número de segmentos genômicos
encontrados em cada classe do dsRNA do RV-C.
Uma importante característica dos RV-C, que os diferencia do padrão genômico dos
RV-A é a migração dos segmentos 5 (58,6 kDa, NSP1), 6 (48,1 kDa, VP6) e 7 (34,7 kDa,
NSP3) em forma de triplet ou trinca, devido às suas respectivas massas moleculares serem
próximas. Por outro lado, o RV-A apresentam um triplet composto pelos segmentos 7, 8 e 9,
ausente no perfil eletroforético do RV-C. Contudo, o perfil genômico por ss-PAGE, não deve
ser utilizado como único método de classificação dos RV, pois alterações no genoma viral,
como rearranjo, podem levar a alterações no padrão de migração dos segmentos (SAIF;
JIANG, 1994).
24
Proteína VP6
A proteína estrutural VP6, considerada a principal estrutura protéica localizada na
superfície da partícula viral, representando 50% a 60% da massa total dos virions, é
codificada pelo segmento genômico 6. A proteína VP6 apresenta arranjo em 260 unidades
morfológicas, T=13, e estas apresentam estrutura trimérica e tubular. Evidências desta
estrutura já haviam sido descritas por Gorziglia et al. (1985), sendo encontradas 780
moléculas de VP6 por virion. Jiang et al. (1990) propuseram que a VP6 no RV-C não
apresenta estrutura trimérica, mas sim tetramérica. Em estudo desenvolvido por Tosser et al.
(1992) foi demonstrada a possível existência de pontes de ligação de dissulfeto na forma
monomérica da VP6 em RV-C.
A atividade biológica da proteína VP6 também vem sendo alvo de estudos
bioquímicos e moleculares. Estudos demonstraram que a VP6 está implicada na forma de
ação da transcriptase celular, uma vez que a remoção do capsídeo interno, do qual a VP6 faz
parte, resulta na perda da atividade enzimática (BICAN et al., 1982; SANDINO et al., 1986;
SANDINO et al.; 1988). Reciprocamente, a VP6 não está presente em partículas subvirais que
expressam a atividade de replicação do vírus (MANSELL; PATTON, 1990). A VP6 é
considerada uma das proteínas mais imunogênicas e antigênicas, sendo a mais frequentemente
detectada em métodos diagnósticos e ensaios imunológicos. A proteína ainda está envolvida
na classificação do RV em grupos e subgrupos, com base em seus epítopos (THOULESS et
al.,1982; GREENBERG et al., 1983).
Proteína VP4
O sucesso da propagação viral de estirpes virais de origem suína (Cowden) e bovina
(Shintoku) de RV-C determinou avanço considerável nos estudos moleculares deste grupo de
rotavírus. No entanto, devido à natureza biológica dos RV-C em cultura celular, apenas uma
25
quantidade limitada de dsRNA é disponível para a caracterização molecular. Poucos estudos
puderam determinar a atividade biológica da VP4 do RV-C de maneira específica. Em um
estudo realizado por Fielding et al. (1994), foi demonstrado que o gene da VP4 está
relacionado com a capacidade de replicação do RV-C em cultura celular, ainda mais que a
clivagem da proteína aumenta sua habilidade de penetração celular, sendo uma das
características determinantes de suscetibilidade tecidual.
Alta taxa de conservação tem sido observada nas sequências do gene da VP4 em
estirpes de RV-C identificados em humanos provenientes de diferentes partes do mundo. A
maior diferença foi observada comparando-se as estirpes humanas de RV-C com as estirpes
virais identificadas em bovinos e suínos (FIELDING et al., 1994; ADAH et al., 2002;
SCHNAGL et al., 2004).
Proteína VP7
De forma semelhante ao capsídeo intermediário (VP6) são encontradas 780 moléculas
da proteína VP7, por partícula viral, arranjadas de forma trimérica (T=13). Esta proteína é
glicosilada e constitui a base da camada protéica externa do capsídeo viral. A partir da VP7
são projetadas as espículas de VP4 (PRASAD; CHIU, 1994). A proteína VP7 é um dos
principais antígenos presentes na partícula viral, capaz de induzir a formação de anticorpos
neutralizantes, considerados de importância na proteção da diarreia causada pelo RV
(HOSHINO et al., 1985).
A proteína VP7 é a principal glicoproteína externa e apresenta alto grau de
variabilidade (sorotipo / genotipo G) entre as diferentes estirpes de RV humano e animal.
Ainda assim, há variação significativa entre as sequências do gene que codifica a VP7 de
estirpes de RV isoladas de humanos e animais (JIANG et al., 1991). Por outro lado, a análise
26
de sequências do gene da VP7 do RV-C demonstraram alta taxa de conservação entre as
estirpes isoladas em diferentes partes do mundo (GRICE et al., 1994).
Epidemiologia da rotavirose suína
Em todo o mundo, independentemente do grau de tecnificação do manejo
implementado, as diarreias em leitões alojados na maternidade e na creche ocasionadas pelos
RV são constantes. Considerando a frequência das diarréias, os RV-A assumem grande
importância na epidemiologia das diarreias neonatais em suínos (SAIF; JIANG, 1994).
Porém, nessas etapas da criação dos leitões as diarreias ocasionadas por RV-B e RV-C
destacam-se como as de maior ocorrência em comparação com outras espécies animais
(ALFIERI et al., 1996; CHANG et al., 1997).
Os suínos compreendem a espécie de mamíferos onde, além da soroprevalência, as
taxas de ocorrência de diarreia determinada por RV-C são as mais altas. Em algumas
situações a infecção pode apresentar caráter enzoótico, sugerindo ainda que a maioria das
infecções são sub-clínicas ou, simplesmente, não são detectadas pelos métodos de
diagnósticos rotineiramente utilizados (CHASEY; DAVIS, 1984; DEBOUCK et al., 1984;
SIGOLO DE SAN JUAN et al., 1986; SAIF, 1990; SAIF; JIANG, 1994, MÉDICI et al.,
2010).
Estudos epidemiológicos descrevendo a distribuição mundial do RV-C, especialmente
em humanos, revelam a característica emergente deste patógeno (CAUL et al., 1990;
KUZUYA et al., 2005; BÁNYAI et al., 2006; IIZUKA et al., 2006; ; STEYER et al., 2006;
KUZUYA et al., 2007; ESONA et al., 2008; MÉDICI et al., 2010). As infecções singulares ou
em associação com outros enteropatógenos, têm sido relatadas em leitões lactentes e recém-
desmamados (SAIF et al., 1980; SIGOLO DE SAN JUAN et al., 1986; MORIN et al., 1990;
SAIF; JIANG, 1994; KIM et al., 1999; MARTELLA et al., 2007, MÉDICI et al., 2011).
27
Apesar do número limitado de estudos que envolvem a prevalência do PoRV-C, estudos
mostram que a prevalência de anticorpos anti-PoRV-C é alta nos rebanhos, com taxas
variando de 28 a 70% em leitões com até oito semanas de idade, podendo alcançar taxas de 79
a 100% em animais adultos (TERRETT et al., 1987; TSUNEMITSU et al., 1992; SAIF;
JIANG, 1994). No entanto, o significado epidemiológico destes estudos é limitado com
relação à distribuição geográfica (SAIF et al., 1980; SIGOLO DE SAN JUAN et al., 1986;
MORIN et al., 1990; SAIF; JIANG, 1994; WILL et al., 1994; KIM et al., 1999; MARTELLA
et al., 2007; COLLINS et al., 2008). Os quadros 1, 2 e 3 apresentam dados relativos à
frequência de diagnóstico de RV-A, B e C, respectivamente, em leitões.
28
Quadro 1: Frequência mundial de detecção do rotavírus suíno grupo A em fezes de leitões.
Local
Técnica Rebanhos Amostras
Referência Total Positivos (%) Total Positivas (%)
Japão PAGE 10 - 845 142 (16,8) Sanekata et al. (1996)
Tailândia PAGE 3 - 557 23 (4,1) Pongsuwanna et al. (1996)
Alemanha EM 24 5 (20,8) 149 6 (4,0) Wieller et al. (2001)
Brasil PAGE - - 99 53 (55,5) Barreiros et al. (2003)
Espanha IPX - - 98 32 (32,6) Martella et al. (2005)
Coréia do Sul RT-PCR 38 5 (13,2) 157 57 (36,3) Song et al. (2006)
Irlanda RT-PCR 4 3 (75,0) 292 19 (6,5) Collins et al. (2010) EM (Microscopia eletrônica); IPX (imunoperoxidase indireta); RT-PCR (Reação em cadeia da polimerase, precedida de transcrição reversa); PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida).
29
Quadro 2: Frequência mundial de detecção do rotavírus suíno grupo B em fezes de leitões.
Local
Técnica Amostras
Referência Total Positivas (%)
África do Sul PAGE 65 3 (4,6) Geyer et al. (1996)
Canadá PAGE 120 56 (46,7) Magar et al. (1991)
EUA ELISA 4 2 (50,0) Vonderfecht et al. (1994)
EUA PAGE 96 6 (6,2) Will et al. (1994)
EUA PAGE 90 9 (10,0) Janke et al. (1990)
EUA IF 44 10 (23,0) Theil et al. (1985)
México PAGE 256 41 (4,8) Morilla et al. (1991)
Japão SN-PCR 845 41 (4,8) Sanekata et al. (1996)
China RT-PCR 20 4 (20,0) Gouveia et al. (1991)
Tailândia PAGE 557 1 (0,2) Pongsuwanna et al. (1996)
Austrália PAGE 16 3 (18,7) Nagesha et al. (1981) ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay); IF (Imunofluorescência indireta); PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida); RT-PCR (Reação em cadeia da polimerase, precedida de transcrição reversa); SN-PCR (Semi-nested PCR).
30
Quadro 3: Frequência de detecção do rotavírus suíno grupo C em fezes de leitões.
Local
Técnica Amostras
Referência Total Positivas (%)
África do Sul PAGE 65 7 (10,8) Geyer et al. (1996)
Canadá PAGE 120 6 (5,0) Magar et al. (1991)
EUA ELISA 4 1 (25,0) Vonderfecht et al. (1994)
EUA PAGE 96 5 (5,2) Will et al. (1994)
EUA RT-PCR 11 11 (100,0) Kim et al. (1999)
Brasil RT-PCR 34 17 (50,0) Alfieri et al. (1999)
Itália RT-PCR 188 54 (28,7) Martella et al. (2007)
Japão RT-PCR 845 29 (3,4) Sanekata et al. (1996)
Tailândia PAGE 557 2 (0,3) Pongsuwanna et al. (1996)
China RT-PCR 7 3 (42,8) Gouveia et al. (1991)
Austrália PAGE 16 7 (43,7) Nagesha et al. (1981) ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay); RT-PCR (Reação em cadeia da polimerase, precedida de transcrição reversa); PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida).
Diagnóstico do rotavírus sorogrupo C
Vários métodos de diagnóstico laboratorial para o RV-C foram desenvolvidos,
tanto para a detecção da partícula viral quanto de proteínas e do ácido nucléico. Assim
como para o RV-A, os métodos variam quanto à especificidade, sensibilidade,
facilidade de execução e custo final do diagnóstico (ALFIERI et al., 1999).
O isolamento do RV em cultivo celular somente foi difundido e utilizado como
técnica de diagnóstico, após a utilização do tratamento do inóculo viral com enzimas
proteolíticas, como a tripsina, que aumentam a probabilidade da propagação in vitro do
31
RV (SATO et al., 1981). O cultivo celular é uma técnica ainda bastante utilizada para o
isolamento do RV-A.
As estirpes de RV-C, assim como as de RV-B, são de difícil adaptação em
cultivo celular e a tentativa de isolamento viral é uma técnica laboriosa, demorada e que
requer a presença de partículas virais infectantes. Apesar desses inconvenientes, o
isolamento do RV-C em cultivo celular é uma técnica de fundamental importância para
a disponibilização de estirpes virais selvagens para estudos complementares de caráter
antigênico e molecular (TERRET et al., 1987; SAIF et al., 1988; TSUNEMITSU et al.,
1991).
A microscopia eletrônica (ME) é um importante método de diagnóstico para a
identificação de estirpes virais não-cultiváveis em amostras clínicas (NAKATA et al.,
1987). Como a quantidade de partículas víricas eliminadas por um animal na fase aguda
da doença é muito grande, principalmente nas infecções pelo RV-A, é possível a
visualização direta do RV pela microscopia eletrônica. A integridade da partícula viral
depende dos procedimentos utilizados no preparo da amostra sendo que o RV-B é o
menos estável. A ME é uma técnica altamente específica e permite a visualização da
morfologia característica dos RV, porém o emprego deste método na detecção do RV-C
ainda não foi descrita.
O ensaio imunoenzimático (ELISA), devido à sua alta sensibilidade, facilidade
de execução e ao grande número de amostras que podem ser analisadas
simultaneamente, assim como pela rapidez na obtenção dos resultados, é uma técnica
amplamente difundida para o diagnóstico do RV-A. No entanto, a utilização para a
detecção do RV-C determina resultados pouco confiáveis. Isto se deve ao fato de que
não há o reconhecimento adequado do antígeno específico VP6 do RV-C, determinando
resultados falso-negativos, caracterizando-a como metodologia de baixa sensibilidade.
32
Outro aspecto é a possibilidade de reações inespecíficas ou a presença de inibidores no
material fecal que podem diminuir a sensibilidade do teste (JURE et al., 1988). Devido
à grande antigenicidade, a proteína VP6 tem sido utilizada como base para elaboração
de “kits” comerciais de ELISA para o diagnóstico etiológico do RV-A. Por outro lado,
devido à grande heterogeneidade e baixa similaridade do gene da VP6 entre as estirpes
circulantes de RV-C de origem humana e animal, o uso de testes imunoenzimáticos
comerciais determinam resultados inconclusivos, já que não detectam o antígeno VP6
específico dos RV-C (XU et al., 1990; KUZUYA et al., 1996).
A técnica de ss-PAGE é uma das técnicas mais utilizadas para a detecção dos
segmentos do ácido nucléico (dsRNA) do RV. Por meio da análise do perfil de
migração dos 11 segmentos genômicos do RV, a técnica de PAGE apresenta a
vantagem adicional de possibilitar a determinação do eletroferotipo da estirpe viral e,
consequentemente, a identificação dos grupos A, B e C (KALICA et al., 1976;
HERRING et al., 1982). Contudo, a eletroferotipagem, apesar de ser extremamente
importante na definição de grupo ou eletroferogrupo, não possibilita a definição do
sorotipo viral. Estirpes virais de um mesmo sorotipo podem apresentar perfis
eletroforéticos diferentes, enquanto que estirpes com perfis semelhantes podem
pertencer a diferentes sorotipos (BEARDS, 1982; MARKOWSKA-DANIEL et al.,
1996). Contudo, o perfil de migração do dsRNA define o eletroferotipo, sendo
denominado de padrão genômico (RODGER et al., 1981; ESTES et al., 1984; ESTES;
COHEN, 1989). Esta característica de migração determina a classificação dos RV-C,
como também dos RV-B (4-2-2-3), como sendo rotavírus atípicos. Isto se deve por não
apresentarem o triplet característico dos RV-A (CHASEY et al., 1984; MCNULTY et
al., 1984; PEDLEY et al., 1986; KAPIKIAN et al., 2001; HOSHINO; KAPIKIAN,
1994).
33
A limitação pela baixa sensibilidade, assim como na técnica de ELISA, também
é observada na técnica de PAGE. Estudos demonstraram que para o sucesso da detecção
do dsRNA viral são necessários no mínimo 108 a 1010 partículas virais por mililitro de
fezes. A baixa quantidade de partículas virais de RV-B e RV-C, associadas ainda à
presença de inibidores nas fezes, pode determinar resultados falso-negativos (KUZUYA
et al., 1996; XU et al., 1990).
A RT-PCR é uma técnica altamente sensível para a detecção de genes do RV-C.
A RT-PCR não exige a viabilidade da partícula viral, pois a análise é feita pela
amplificação de partes do genoma, minimizando os problemas ocasionados por falhas
na conservação das amostras fecais que diminuem a infectividade ou promovem a
degradação das proteínas virais. Adicionalmente, resultados conclusivos podem ser
obtidos em poucas horas. Por outro lado, substâncias inibidoras encontradas nas fezes
podem alterar a eficiência da RT-PCR. Porém, métodos eficazes de extração do RNA e
o uso de controles internos na reação da PCR podem contornar esse inconveniente. A
RT-PCR tem demonstrado ser um método altamente sensível e específico na detecção
do RV-C de diferentes origens, utilizando para isso oligonucleotídeos iniciadores
específicos do grupo C, principalmente com base no gene que codifica a proteína VP6.
Mesmo apresentando alta sensibilidade e especificidade, o método tem sido utilizado
apenas em alguns estudos (CAUL et al., 1990; QIAN et al., 1991; GOUVEA et al.,
1991; JIANG et al., 1995; KUZUYA et al., 2005; BÁNYAI et al., 2006; IIZUKA et al.,
2006; STEYER et al., 2006; KUZUYA et al., 2007; ESONA et al., 2008; MEDICI et
al., 2010).
A RT-PCR tem contribuído ainda para otimizar o diagnóstico das rotaviroses,
possibilitando estimar a prevalência das infecções, bem como a definição dos
34
sorotipos/genotipos de RV circulantes em uma população ou rebanho, além de sua
distribuição geográfica e sazonal (DESSELBERGER et al., 2001).
Paralelamente, a RT-PCR tem demonstrado ser uma técnica eficiente na
identificação de estirpes virais com genotipos incomuns e também de infecções mistas,
com estirpes de RV pertencentes a diferentes genotipos (HEIDE et al., 2005).
Profilaxia e controle
Algumas características do RV como a resistência da partícula viral às condições
ambientais e aos produtos químicos como os desinfetantes; a possibilidade de infecções
subclínicas; assim como da transmissão interespécie, fazem com que os episódios de
diarreia causados pelo RV-C apresentem particularidades não encontradas em outras
infecções entéricas ocasionadas por bactérias ou protozoários, ou mesmo por RV de
outros grupos. Consequentemente, a profilaxia das rotaviroses não se restringe apenas
na adoção de medidas higiênico-sanitárias, pois o RV-C pode ser responsável por surtos
de diarreia com impacto em saúde pública e em sanidade animal mesmo em países
desenvolvidos e/ou em criações com manejo zootécnico e sanitário adequados
(MARTELLA et al., 2007; COLLINS et al., 2008; JEONG et al., 2009).
De modo geral, assim como outras medidas profiláticas, a vacinação de fêmeas
no terço final da gestação é uma das principais condutas a serem implantadas no
desenvolvimento de um programa sanitário que inclui o controle e profilaxia da diarreia
de leitões lactentes. Devido a prevalência estatisticamente superior das diarreias pelo
RV-A, em relação às ocasionadas por RV-B e/ou RV-C, somente são disponíveis no
mercado vacinas contra o RV-A. Resultados satisfatórios, com redução tanto na
frequência quanto na intensidade de diarreia, têm sido observados quando programas
imunoprofiláticos utilizando vacinas polivalentes são incluídos no manejo sanitário de
35
fêmeas bovinas gestantes. O sucesso do emprego da vacinação é amplamente observado
e estabelecido na saúde pública, visto que estas vacinas apresentam 74% de eficácia,
sendo responsáveis por redução nas taxas de morbidade e mortalidade de crianças em
países em desenvolvimento (MUNOS et al., 2010).
Considerando que: i) além do grupo A, os grupos B e C de RV também
contribuem com episódios de diarreias em leitões lactentes e recém-desmamados; ii) as
infecções pelos grupos B e C de RV podem ocorrer tanto de forma singular quanto,
principalmente, de forma mista; iii) a não disponibilidade de imunógenos para o
controle e profilaxia das rotaviroses ocasionadas pelos RV-B e RV-C; iv) a não
disponibilidade de técnicas de diagnóstico com sensibilidade e especificidade adequadas
para o uso na rotina laboratorial para RV-B e RV-C; v) o desconhecimento da
epidemiologia da rotavirose suína ocasionadas por RV-B e RV-C; vi) a alta frequência
de ocorrência de diarreias em leitões lactentes em todo o Brasil, e vii) o impacto
sanitário das diarreias neonatais na suinocultura brasileira; a avaliação da frequência de
diagnóstico do RV-A, B e C, tanto em infecções singulares quanto mistas, em episódios
de diarreias em leitões lactantes é de fundamental importância para a definição tanto do
impacto da infecção na produção de leitões quanto para a definição dos principais
aspectos epidemiológicos da infecção.
Referências
ADAH, M.I.; WADE, A.; OSETO, M.; KUZUYA, M.; TANIGUCHI, K. Detection of human group C rotaviruses in Nigeria and sequence analysis of their genes encoding VP4, VP6, and proteins. Journal of Medical Virology, v.66, p.269– 275, 2002. ALAM, M.M.; KOBAYASHI, N.; ISHIMO, M.; AHMED, M.S.; AHMED, M.U.; PAUL, S.K.; MUZUMDAR, B.K.; HUSSAIN, Z.; WANG, Y.H.; NAIK, T.N. Genetic analysis of an ADRV-N-like novel rotavirus strain B 219 detected in a sporadic case of adult diarrhea in Bangladesh. Archives of Virology, v.152, p.199-208, 2006.
36
ALFIERI, A.A.; ALFIERI, A.F.; TAKIUSHI, E.; LOBATO, Z.I.P. Reoviridae. In FLORES, E.F. (Org.). Virologia Veterinária, Santa Maria: Editora da UFSM; p.773-807, 2007. ALFIERI, A.A.; LEITE, J.P.G.; ALFIERI, A.F.; JIANG, B.; GLASS, R.I.; GENTSCH, J.R. Detection of field isolates of human and animal group C rotavirus by reverse transcription polymerase chain reaction and digoxigenin-labeled oligonucleotide probes. Journal of Virological Methods, v.83, p.35-43, 1999. ALFIERI, A.A.; LEITE, J.P.G.; NAKAGOMI, O.; KAGA, E.; WOODS, P.A.; GLASS, R.I.; GENTSCH, J.R. Characterization of human rotavirus genotype P[8]G5 from Brazil by Probe-Hybridization and Sequence. Archives of Virology, v.141, p.2353-2364, 1996. ARISTA, S.; GIOVANNELLI, L.; PISTOIA, D.; CASCIO, A.; PAREA, M.; GERNA, G. Electropherotypes, subgroups and serotypes of human rotavirus strains causing gastroenteritis in infants and young children in Palermo, Italy, from 1985 to 1989. Research Virology, v.141, p.435–448, 1990. ARNOLDI, F.; CAMPAGNA, M.; EICHWALDT, C.; DESSELBERGER, U.; BURRONE, O.R. Interaction of rotavirus polymerase VP1 with nonstructural protein NSP5 is stronger than that with NSP2. Journal of Virology, v.85, p.2128-2137, 2007. BÁNYAI, K.; JIANG, B.; BOGDAN, A.; HORVATH, B.; JAKAB, F.; MELEG, E.; MARTELLA, V.; MAGYARI, L.; MELEGH, B.; SZUCS, G. Prevalence and molecular characterization of human group C rotaviruses in Hungary. Journal of Clinical Virology, v.37, p.317–322, 2006. BARREIROS, M.A.B.; ALFIERI, A.A.; ALFIERI, A.F.; MÉDICI, K.C.: LEITE, J.P.G. An outbreak of diarrhoea in one-week-old piglets caused by group A rotavirus genotypes P[7],G3 and P[7],G5. Veterinary Research Communications, v.27, p.505–512, 2003. BEARDS, G.M. Polymorphism of genomic RNAs within rotavirus serotypes and subgroups. Archives of Virology, v.7, p.465-470, 1982. BICAN, P.; COHEN, J.; CHARPILIENNE, A.; SCHERRER, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. Journal of Virology, v.43, p.1113-1117, 1982. BOHL, E.H.; HOHLER, E.M.; SAIF, L.J.; CROSS,R.F.; AGNES, A.G.; THEIL, K.W. Rotavirus as a cause of diarrhea in pigs. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.172, p. 458-463, 1978. BOHL, E.H., SAIF, L.J., THEIL, K.W.A., AGNES, G., CROSS, R.F. Porcine pararotavirus: detection, differentiation from rotavirus, and pathogenesis in gnotobiotic pigs. Journal of Clinical Microbiology, v.15, p.312–319, 1982.
37
BRIDGER, J. C. Novel rotaviruses in animals and man. In: Ciba Foundation Symposium Novel diarrhea viruses, Chichester, UK. Anais... v.128, p.5-23, 1987. BRIDGER, J.C.; PEDLEY, S.; MCCRAE, M.A. Group C rotaviruses in humans. Journal of Clinical Microbiology, v.23, p.760–763, 1986. BROWN, D.W.G.; BEARDS, G.M.; GUANG-MU, C.; FLEWETT, T.H. Prevalence of Antibody to Group B (Atypical) Rotavirus in Humans and Animals. Journal of Clinical Microbiology, v.25, p.316-319, 1987. CALDERARO, F.F.; BACARRO, M.R.; MORENO, A.M.; FERREIRA, A.J.P.; JEREZ, A.J.; PENA, H.J.F. Frequência de agentes causadores de enterites em leitões lactentes provenientes de sistemas de produção de suínos do Estado de São Paulo. Arquivos do Instituto Biológico de São Paulo, v.68, p.29-34, 2001. CAMPAGNA, M.; EICHWALD, C.; VASCOTTO, E.; BURRONE, O.R. RNA interference of rotavirus segment 11 mRNA reveals the essential role of NSP5 in the virus replicative cycle. Journal of General Virology, v.86, p.1481-1487, 2005. CAUL, E.O.; ASHLEY, C.R.; DARVILLE, J.M.; BRIDGER, J.C. Group C rotavirus associated with fatal enteritis in a family outbreak. Journal of Medical Virology, v.30, p.201–205, 1990. CHANG, K.O.; PARWANI, A.V.; SMITH, D.; SAIF, L.J. Detection of group B rotavirus in fecal samples from diarrheic calves and adult cows and characterization of their VP7 genes. Journal of Clinical Microbiology, v.35, p.2107-2110, 1997. CHASEY, D.; BRIDGER, J.C.; McCRAE, M.A. A new type of atypical rotavirus and villous epithelial cell syncytia in piglets. Journal of Comparative Pathology, v.100, p.217-222, 1986. CHASEY, D.; DAVIES, P. Atypical rotaviruses in pigs. Veterinary Record, v.114, p.16-17, 1984. CHEN, G.M.; WERNER-ECKERT, R.; TAO, H.; MACKWO, E.R. Expression of the major inner capsid protein of group B rotavirus ADVR: primary characterization of genome segment 5. Virology, v.128, p.820-829, 1991. CHEN, Z.; LAMBDEN, P.R.; LAU, J.; CAUL, E.O.; CLARKE, I.N. Human group C rotavirus: completion of the genome sequence and gene coding assignments of a non-cultivatable rotavirus. Virus Research, v.83, p.179-187, 2002. CIARLET, M.; LIPRANDI, F.; CONNER, M.E.; ESTES, M.K. Species specifity and interspecies relatedness of NSP4 genetic groups by comparative NSP4 analyses of animal rotaviruses. Archives of Virology, v.145, p.371-383, 2000. CICIRELLO, H.G.; GLASS, R.I. Current concepts of the epidemiology of diarrheal diseases. Seminary Pediatric Infection Disease, v.5, p.163-167, 1994.
38
COLLINS, P.J.; MARTELLA, M.; O’SHEA, H. Detection and characterization of group C rotaviruses in asymptomatic piglets in Ireland. Journal of Clinical Microbiology, v.46, p.2973–2979, 2008. COLLINS, P.J.; MARTELLA, V.; SLEATOR, R.D.; FANNING, S.; O’SHEA, H. Detection and characterisation of group A rotavirus in asymptomatic piglets in southern Ireland. Archives of Virology, v.155, p.1247–1259, 2010. COOK, N.; BRIDGER, J.; KENDALL, K.; GOMARA, M.I.; EL-ATTAR, L.; GRAY, J. The zoonotic potencial of rotavirus. Journal of Infeccious Disease, v.48, p.289-302, 2004. COOK, S.M.; GLASS, R.I.; LeBARON, C.W.; MEI-SHANG, H. Global seasonality of rotavirus infectious. Bulletin of the World Health Organization, v.68, p.171-177, 1996. DeBOUCK, P.; CALLEBAUT, P.; PENSAERT, M. The pattern of rotavirus and pararotavirus excretion in pigs in closed swine herds. In: 4th International Symposium on Neonatal Diarrhea, Saskatchewan, Canada, Proceedings… p.77-89, 1984, DESSELBERGER, U.; ITURRIZA-GOMARA, M.; GRAY, J. Rotavirus epidemiology and surveillance. In: Novartis Foundation Symposium, 2001. Anais… v.238, p.125-127, 2001. DEWEY, C.; CARMAN, S.; PASMA, T.; JOSEPHSON, G.; McEWEN. Relationship between group A porcine rotavirus and management practices n swine herds in Ontario. Canadian Veterinary Journal, v.44, p.649-653, 2003. DRIESEN, S.J.; CARLAND, P.G.; FAHY, V.A. Studies on preweaning piglet diarrhoea. Australian Veterinary Journal, v.70, p.259-262, 1993. EIDEN, J.J.; ALLEN, J.R. Identification of cognate genes among heterologous strains of group B rotavirus. Journal of Virology, v.66, p.1232– 1235, 1992. ESONA, M.D.; HUMPHREY, C.D.; DENNEHY, P.H.; JIANG, B. Prevalence of group C rotavirus among children in Rhode Island, United States. Journal of Clinical Virology, v.42, p.221–224, 2008. ESTES, K.; COHEN, J. Rotavirus gene structure and function. Microbiological Review, v.53, p.410-449, 1989. ESTES, M.K.; GRAHAM, D.Y.; DIMITROV, D.H. The molecular epidemiology of rotavirus gastroenteritis. Progress in Medical Virology, v.29, p.1-22, 1984 ESTES, M.K.; GRAHAN, D.Y.; MASON, B.B. Proteolytic enhancement of rotavirus infectivity: molecular mechanisms. Journal of Virology, v.38, p.879-888, 1981. FIELDING, P.A.; LAMBDEN, P.R.; CAUL, E.O.; CLARKE, I.N. Molecular characterization of the outer capsid spike protein (VP4) gene from human group C rotavirus. Virology, v.204, p.442–446, 1994.
39
GEYER, A.; SEBATA, T.; PEENZE, I.; STEELE, A.D. Group B and C porcine rotavirus identified for the first time in South African. Journal of the South African Veterinary Association, v.67, p.115-116, 1996. GORZIGLIA, M.; LARREA, C.; LIPRANDI, F.; ESPARZA, J. Biochemical evidence for the oligomeric (possibly trimeric) structure of the major inner capsid polipeptide (45K) of rotavirus. Journal of General Virology, v.66, p.1889-1900, 1985. GOUVEIA, V.; ALLEN, J.R.; GLASS, R.I.; FANG, Z.Y.; BREMONT.M.,; COHEN, J.; McCRAE, M.A.; SAIF, L.J.; SINARACHATANANT, P.; CAUL, E.O. Detection of group B and C rotavirus by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, v.29, p.519-523, 1991. GREENBERG, H.; McAULIFFE, V.; VALDESUSO, J.; WYATT, R.; FLORES, J.; KALICA, A.; HOSHINO, Y.; SINGH, N. Serological analysis of the subgroup protein of rotavirus using monoclonal antibodies. Infection and Immunity, v.39, p.91-99, 1983. GRICE, A.S.; LAMBDEN, P.R.; CAUL, E.O.; CLARKE, I.N. Sequence con- servation of the major outer capsid glycoprotein of human group C rotaviruses. Journal of Medical Virology, v.44, p.166–171, 1994. HEIDE, R.V.; KOOPMANS, M.P.G.; SHEKARY, N.; HOUWERS, D.J.; VAN DUYNHOVEN, Y.T.H.P.; Van der POEL, W.H.M. Molecular characterization of human and animal group A rotaviruses in the Netherlands. Journal of Clinical Microbiology, v.2, p.669-675, 2005. HERRING, A.J.; INGLIS, N.F.; OJEB, C.K.; SNODGRASS, D.R.; MENZIES, J.D. Rapid diagnosis of rotavirus infection by direct detection of viral nucleic acid in silver-stained polyacrylamide gels. Journal Clinical Microbiology, v.16, p.473-477, 1982. HO, M.S.; GLASS, R.I.; PINSKY, P.F.; ANDERSON, L.J. Rotavirus as a cause of diarrheal morbidity and mortality in the Unites State. Journal of Infectious Diseases, v.158, p.1112-1116, 1988. HOSHIMO, Y.; KAPIKIAN A.Z. Rotavirus antigens. Current Topics in Microbiological Immunological, v.185, p.179-227, 1994. HOSHIMO, Y.; SERENO, M.M.; MIDTHUN, K.; FLORES, J.; KAPIKIAN, A.Z.; CHANNCK, R.M. Independent segregation of two antigenic specificities (VP 3 and VP 7) involved in neutralization of rotavirus infectivity. Proceedings of the National Academy of Sciences, v.82, p.8701-8704, 1985. IIZUKA, S.; TABARA, K.; KAWAMUKAI, A.; ITOGAWA, H.; HOSHINA, K. An outbreak of group C rotavirus infection in an elementary school in Shimane prefecture, Japan, February 2006. Japanese Journal of Infectious Diseases, v.59, p.350–351, 2006. JANKE, B.H. Symposium on neonatal calf diarrhea. Veterinary Medicine, v.84, p.803-810, 1989.
40
JANKE, B.H.; NELSON, J.K.; BENFIELD, D.A.; NELSON, E.A. Relative prevalence of typical and atypical strain among rotavirus from diarrheic pigs in conventional swine herds. Journal of Veterinary Investigation, v.2, p.308-311, 1990. JEONG, Y.; PARK, S.; HOSMILLO, M.; SHIN, D.; CHUN, Y.; KIM, H.; KWON, H.; KANG, S.; WOO, S.; PARK, S.; KIM, G.; KANG, M.; CHO, K. Detection and molecular characterization of porcine group C rotaviruses in South Korea. Veterinary Microbiology, v.138, p.217-24, 2009. JIANG, B.M.; DENNEHY, P.H.; SPANGENBERGER, S.; GENTSCH, J.R.; GLASS, R.I. First detection of Group C rotavirus in fecal specimens of children with diarrhea in the United States. Journal of Infectious Diseases, v.172, p.45–50, 1995. JIANG, B.; QIAN, Y.; TSUNEMITSU, H.; GREEN, K.Y.; SAIF, L.J. Analysis of the gene encoding the outer capsid glycoprotein (VP7) of group C rotaviruses by Northern and dot blot hybridization. Virology, v.184, p.433–436, 1991. JIANG, B.M.; SAIF, L.J.; KANG, S.Y.; KIM, J.H. Biochemical characterization of the structural and nonstructural polypeptides of a porcine croup C rotavirus. Journal of Virology, v.64, p.3171-3178, 1990. JIANG, B.; WANG, Y.; GLASS, R.I.; FANG, Z.Y. The evolution of human group B rotaviruses: correlation and an update. Journal of Clinical Virology, v.34, p.158-159, 2005. JOHNSON, M.W.; FITZGERALD, G.R.; WELTER, M.W.; WELTER, C.J. The six most common pathogens responsible for diarrhea in newborn pigs. Veterinary Medicine, v.31, p.382-386, 1992. JURE, M.N.; MORSE, S.S.; STARK, D.M. Identification of nonspecific reaction in laboratory rodent specimens tested by rotazyme Rotavirus ELISA. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science, v.38, p.273-278, 1988. KALICA, A.R.; GARON, C.F.; WYATT, R.G.; MEBUS, C.A.; VAN KIRK, D.H.; CHANOCK, R.M.; KAPIKIAKAN, A.Z. Differentiation of human and calf reovirus-like agents associated with diarrhea using polyacrylamide gel electrophoresis of RNA. Virology, v.74, p.86-92, 1976. KANG, G.; KELKAR, S.D.; CHITAMBAR, S.D.; RAY, P.; NAIK, T. Epidemiological profile of rotaviral infection in India: challenges for the 21st century. Journal of Infectious Diseases, v.192, p.120-126, 2005. KAPIKIAN, A.Z.; HOSHINO, Y.; CHANOCK, R.M. Rotaviruses. In KNIPE, D.M.; HOWLEY, M. (Ed.). Fields Virology, Philadelphia: Lippincott Williams; Wilkins, Philadelphia, p.1787-1833, 2001.
41
KATOULI, M.; LUND, A.; WALLGREN, P.; KÜHN, I.; SODERLIND, O.; MÖLLBY, R. Phenotypic characterization of intestinal Escherichia coli of pigs during suckling, postweaning and fattering periods. Applied and Environmental Microbiology, v.61, p.778-783, 1995. KELKAR, S.D.; ZADE, J.K. Group B rotavirus similar to strain CAL-1 have circulating in Western India since 1991. Epidemiological and Infection, v. 132, p.745-749, 2004. KHAMRIN, P.; MANEEKAN, N.; PEERAKONE, S.; CHAIN-IT, W.; YAGYI, F.; OKITSU,S.; USHIJIMS, H. Novel porcine rotavirus of genotype P[27] shares new phylogenetic lineage with G2 porcine rotavirus strain. Virology, v.10, p.243-252, 2007. KIM, Y.; CHANG, K.O.; STRAW, B.; SAIF, L.J. Characterization of group C rotaviruses associated with diarrhea outbreak in feeder pigs. Journal of Clinical Microbiology, v.37, p.1484–1488, 1999. KUZUYA, M.; FUJII, R.; HAMANO, M.; NAKAMURA, J.; YAMADA, M.; NII, S.; MORI, T. Molecular analysis of outer capsid glycoprotein (VP7) genes from two isolates of human group C rotavirus with different genome electropherotypes. Journal of Clinical Microbiology, v.34, p.3185–3189, 1996. KUZUYA, M.; FUJII, R.; HAMANO, M.; NISHIJIMA, M.; OGURA, H. Detection and molecular characterization of human group C rotaviruses in Okayama prefecture, Japan, between 1986 and 2005. Journal of Medical Virology, v.79, p.1219–1228, 2007. KUZUYA, M.; FUJII, R.; HAMANO, M.; YAMADA, M.; SHINOZAKI, K., SASAGAWA, A.; HASEGAWA, S.; KAWAMOTO, H.; MATSUMOTO, K.; KAWAMOTO, A.; ITAGAKI, A.; FUNATSUMARU, S.; URASAWA, S. Survey of human group C rotaviruses in Japan during the winter of 1992 to 1993. Journal of Clinical Microbiology, v.36, p.6–10, 1998. KUZUYA, M.; HAMANO, M.; NISHIJIMA, M.; FUJII, R.; OGURA, H.; TANAKA, M.; ODA, A.; KUSAKA, S.; NAITOU, M. An outbreak of acute gastro-enteritis caused byhumangroup C rotavirus in a welfare institution in Okayama prefecture. Japanese Journal of Infectious Diseases, v.58, p.255–257, 2005. LIPRANDI, F.; GELDER, M.; BATISTAS, Z.;LOPEZ, J.A.; PUJOL, F.H.; LUDERT, J.E.; JOELSSON, D.B.; CIARLET, M. A novel type of VP4 carried by a porcine rotavirus strain. Virology, v.315, p.1658-1661, 2003. LUNDGREN, O.; SVENSSON, L. Pathogenesis of rotavirus diarrhea. Microbes and Infection, v.3, p.1145-1156, 2001. MAGAR, R.; ROBISON, Y.; MORIN, M. Identification of atypical rotaviruses in outbreaks of preweaning and postweaning diarrhea in Quebec swine herds. Canadian Journal Veterinary Research, v.55, p.260263, 1991.
42
MANSELL, E.A.; PATTON, J.T. Rotavirus RNA replication: VP2, but not VP6, is necessary for viral replicase activity. Journal of Virology, v.64, p.4988-4996, 1990. MARKOWSKA-DANIEL, I.; WINIARCZYK, S.; GRADZKI, Z.; PEJSAK, Z. Evaluation of different methods (ELISA, IF, EM, PAGE) for the diagnosis of rotavirus infectious in piglets. Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases, v.19, p.219-232, 1996. MARTELLA, V.; BANYAI, K.; LORUSSO, E.; BELLACICCO, A.L.; DECARO, N.; CAMERO, M.; BOZZO, G.; MOSCHIDOU, P.; ARISTA, S.; PEZZOTII, G.; LAVAZZA, A.; BUONAVOGLIA, C. Prevalence of group C rotavirus in weaning and post-weaning pigs with enteritis. Veterinary Microbiology, v.123, p.26-33, 2007. MARTELLA, V.; CIARLET, M.; BANYAI, K.; LORUSSO, E.: CAVALLI, M.; CORRENTE, M.; ELIA, G.; ARISTA, S.; CAMERO, M.; DESARIO, C.; DECARO, N.; LAVAZZA, A.; BUONAVOGLIA, C. Identification of a novel VP4 genotype carried by a serotype G5 porcine rotavirus strain. Virology, v.346, p.301-311, 2006. MARTELLA, V.; CIARLET, M.; BASELGA, R.; ARISTA, S.; ELIA, G.; LORUSSO, E.; BANYAI, K.; TERIO, V.; MADIO, A.; RUGGERI, F.M.; FALCONI, E.; CAMERO, M.; DECARO, N.; BUONAVOGLIA, C. Sequence analysis of the VP7 and VP4 genes identifies a novel VP; gene allele of porcine rotavirus, sharing a common evolutionary origin with human G2 rotaviruses. Virology, v.337, p.111-123, 2005. MARTELLA, V.; CIARLET, M.; CAMARDA, A.; PRATELLI, A.; TEMPESTA, M.; GRECO, G.; CAVALLI, A.; ELIA, G.; DECARO, N.; TERIO, V.; BOZZO, G.; CAMERO, M.; BUONAVOGLIA, C. Molecular characterization of the VP4, VP6, VP7, and NSP4 genes of lapine rotaviruses in Italy: emergence of a novel VP4 genotype. Virology, v.314, p.370– 385, 2003. McNULTY, M.S. Rotaviruses. Journal of General Virology, v.40, p.1-18, 1978. McNULTY, M.S.; TODD, D.; ALLAN, G.M.; McFERRAN, J.B.; GREENE, J.A. Epidemiology of rotavirus infection in broiler chickens: recognition of four serogroups. Archives of Virology, v.81, p.113-121, 1984. MÉDICI, K.C.; BARRY, A.; ALFIERI, F.A.; ALFIERI, A.A. Porcine rotavirus groups A, B, and C identified by polymerase chain reaction in a fecal sample collection with inconclusive results by polyacrylamide gel electrophoresis. Journal of Swine Health and Production, v.19, p.146-150, 2011. MÉDICI, K.C.; BARRY, A.; ALFIERI, A.F.; ALFIERI, A.A. VP6 gene diversity in Brazilian strains of porcine group C rotavirus. Genetics and Molecular Research, v.9, p.506-513, 2010. MELIN, L.; KATOULI, M.; LINDEBERG, A.; FOSSUN, C.; WALLGREN, P. Weaning of piglets. Effects of an exposure to a pathogenic strain of Escherichia coli. Journal of Veterinary Medicine B, v.47, p.663-675, 2000.
43
MELIN, L.; MATTSSON, S.; KATOULI, M.; WALLGREN, P. Development of post-weaning diarrhoea in piglets. Relation to presence of Escherichia coli strain and Rotavirus. Journal of Veterinary Medicine B, v.51, p.12-22, 2004. MIDTHUN, K.; KAPIAKAN, A.Z. Rotavirus vaccine: an overview. Clinical Mirobiology Reviews, v.9, p.423-434, 1996. MORILLA, A.; ARRIAGA, C.; RUIZ, C.; MARTINEZ, A.G.; CIGARROA, R.; VALAZQUEZ, A. Association between diarrhoea and shedding of group A and atypical groups B to E rotavirus in suckling pigs. Annals of Veterinary Research, v.22, p.13-200, 1991. MORIN, M.; MAGAR, R.; ROBINSON, Y. Porcine group C rotavirus as a cause of neonatal diarrhea in a Quebec swine herd. Canadian Journal of Veterinary Research, v.54, p.385–389, 1990. MUNOS, M.K.; WALKER, C.L.F.; BLACK, R.E. The effect of rotavirus vaccine on diarrhoea mortality. International Journal of Epidemiology, v.39, p.56-62, 2010. NAGESHA, H.S.; HUN, C.P.; BRIDGER, J.C.; HOLMES, I.H. Atypical rotavirus in Australian pigs. Archives of Virology, v.102, p.91-98, 1981. NAKATA, S.; PETRIE, B.L.; CALOMENI, E.P.; ESTES, M.K. Electron Microscopy procedure influences detection of rotavirus. Journal of Clinical Microbiology, v.25, p.1902-1906, 1987. OFFIT, P.A.; BLAVAT, G. Identification of two rotavirus genes determining neutralization specifities. Journal of Virology, v.57, p.376-378, 1986. OTTO, P.; SCHULZE, P.; HERBST, W. Demonstration of group C rotaviruses in fecal samples of diarrheic dogs in Germany. Archives of Virology, v.144, p.2467-2473, 1999. PALOMBO, E. A.; BISHOP, R.F.; COTTON, R.G.H. Intra- and inter-season genetic variability in the VP7 gene of serotype 1 (monotype 1a) rotavirus clinical isolates. Archives of Virology, v.130, p. 57-69, 1993. PARRA, G.I.; VIDALES, G.; GOMEZ, J.A.; FERNANDEZ, F.M.; PARREÑO, V.; BOK, K. Phylogenetic analysis of porcine rotavirus in Argentina: Increasing diversity of G4 strains and evidence of interspecies transmission. Veterinary Microbiology, v.126, p.243–250, 2008. PAUL, P.S.; LYOO, Y.S. Immunogens of rotaviruses. Veterinary Microbiology, v.37, p.299-317, 1993. PEDLEY, S.; BRIDGER, J.C.; CHASEY, D.; McCRAE, M.A. Definition of two new groups of atypical rotaviruses. Journal of General Virology, v.67, p.131-137, 1986. PEDRIC, M.; MAYUR, K.; VONDERFECHT, S.; EIDEN, J.J. Comparison of group B rotavirus gene 9 and 11. Journal of General Virology, v.72, p.2801-2804, 1991.
44
PONGSUWANNA, Y.; TANIGUCHI, K.; CHIWAKUL, M.; URASAWA, T.; WAKASUGI, F.; JAYAVASU, C.; URASAWA, S. Serological and genomic characterization of porcine rotavirus in Thailand: detection of a G10 porcine rotavirus. Journal of Clinical Microbiology, v.34, p.1050-1057, 1996. PRASAD, B.V.V.; CHIU, W. Structure of rotavirus. Current Topics in Microbiology and Immunology, v.85, p.1-27, 1994. QIAN, Y.; JIANG, B.; SAIF, J.J.; KANG, S.Y.; ISHIMARU, Y.; YAMASHITA, Y.; OSETO, M.; GREEN, K.Y. Sequence conservation of gene 8 between human and porcine group C rotaviruses and its relationship to the VP7 gene of group A rotaviruses. Virology, v.182, p.562–569, 1991. RAHMAN, M.; BANIK, S.; FARUQUE, A.S.; TANIGUCHI, K.; SACK, D.A.; VAN RANST, M.; AZIM, T. Detection and characterization of human group C rotaviruses in Bangladesh. Journal of Clinical Microbiology, v.43, p.4460–4465, 2005. RODGER, S.M.; BISHOP, R.F.; BIRCH, C.; McLEAN, B.; HOLMES, I.H. Molecular epidemiology of human rotaviruses in Melborne, Australia, from 1973 to 1979, as determined by electrophoresis of genome ribonucleic acid. Journal of Clinical Microbiology, v.13, p.272-278,1981. RUBIO, P.; ALVAREZ, M.; CARMENES, P. Relacion entre la eliminatiocion de rotavirus por cerdas madres y sus camadas em condiciones de exploration conventionales. In: 10th Congress Internacional of Pig Veterinary Society, X, 1988, Rio de Janeiro. Anais... Rio de Janeiro, Associação Brasileira de Veterinarios Especialistas em Suinos, 1988, p.215. SAIF, L.J. Nongroup A rotavirus. In: L.J. SAIF; K.W. THEIL (Ed.), Viral diarrheas of man and animals: New York, CRC Press, Boca Raton, p.73-95, 1990. SAIF, L.J.; BOHL, E.H.; THEIL, K.W.; CROSS, R.F.; HOUSE, J.A. Rotavirus-like, calicivirus-like, and 23-nm virus-like particles associated with diarrhea in young pigs. Journal of Clinical Microbiology, v.12, p.105–111, 1980. SAIF, L.J.; JIANG, B. Nongroup A rotavirus of humans and animals. Current Topics in Microbiology and Immunology, v.185, p. 330-371, 1994. SAIF, L.J.; TERRETT, L.A.; MILLER, K.L.; CROSS, R.F. Serial propagation of porcine group C rotavirus (pararotavirus) in a continuous cell line and characterization of the passaged virus. Journal of Clinical Microbiology, v.26(7), p.1277-1282, 1988. SANDINO, A.M.; JASHES, M.; FAUNDEZ, G.; SPENCER, E. Role of the inner protein capsid on in vitro human rotavirus transcription. Journal of Virology, v.60, p.797-802, 1986. SANDINO, A.M.; PIZARRO, J.; FERNANDEZ, J.; FELLAY, M.C.; SPENCER, E. Involvement of structural and nonstructural polypeptides on rotavirus RNA synthesis. Archives of Biological Medicine Experimentation, v.21, p.381-392, 1988.
45
SANEKATA, T.; KUWAMOTO, Y.; AKAMATSU, S.; SAKON, N.; OSETO, M; TANIGUCHI, K,; NAKATA, S.; ESTES, M.K. Isolation of group B porcine rotavirus in cell culture. Journal of Clinical Microbiology, v.34, p.759-761, 1996. SATO, K.; INABA, Y.; SHINOZAKI, T.; FUJII, R.; MATUMOTO, M. Isolation of human rotavirus in cell culture: brief report. Archives of Virology, v.69, p.155-160, 1981. SEN, A.; KABAYASHI, N.; DAS, S.; KRISHNAN, T.; BHATTACHARYA, S. K.; NAIK, T.N. The Evolution of group B rotavirus. The Lancet, v.357, p.198-199, 2001. SCHNAGL, R.D.; BONIFACE, K.; CARDWELL, P.; McCARTHY, D.; ONDRACEK, C.; COULSON, B.; ERLICH, J.; MOREY, F. Incidence of group C human rotavirus in central Australia and sequence variation of the VP7 and VP4 genes. Journal of Clinical Microbiology, v.42, p.2127–2133, 2004. SIGOLO DE SAN JUAN, C.; BELLINZONI, R.C.; MATTION, N.; LA TORRE, J.; SCODELLER, E.A. Incidence of group A and atypical rotaviruses in Brazilian pig herds. Research in Veterinary Science, v.41, p.270–272, 1986. SILVESTRI, L.S.; TARAPOREWALA, Z.F.; PATTON, J.T. Rotavirus replication: plus-sense templates for double-stranded RNA synthesis are made in viroplasms. Journal of Virology, v.78, p.7763-7774, 2004. SONG, D.S.; KANG, B.K.; OH, J.S.; HA, G.W.; YANG, J.S.; MOON, H.J.; JANG, Y.; PARK, B.K. Multiplex reverse transcription-PCR for rapid differential detection of porcine epidemic diarrhea virus, transmissible gastroenteritis virus, and porcine group A rotavirus. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.18, p.278-281, 2006. SPENCER, B.T.; HOWELL, P.G.; HILLMAN, K.; MURDOCH, T.A.; SPENCER. R.J.; STEWARD, C.S. Some husbandry factors influencing weaning stress in piglets. Journal of the South African Veterinary Association, v.60, p.62-64. 1989. STEYER, A.; POLJSAK-PRIJATELJ, M.; BUFON, T.; SEDMAK, M.; VIDMAR, L.; MIJOVSKI, J.Z.; MARIN, J. First detection of group C rotavirus in patients with gastroenteritis in Slovenia. Journal of Medical Virology, v.78, p.1250–1255, 2006. SZUCS, G.; KENDE, M.; UJ, M. Atypical human rotaviruses in Hungary. Annales de l'Institut Pasteur / Virologie, v.138, p.391–395, 1987. TANIGUCHI, K.; URASAWA, S. Diversity in rotavirus genomes. Virology, v.6, p.123-131, 1995. TERRETT, L.A.; SAIF, L.A.; THEIL, K.W.; KOHLER, E.M. Physicochemical characterization of porcine pararotavirus and detection of virus and viral antibodies using cell culture immunofluorescence. Journal of Clinical Microbiology, v.25, p.268-272, 1987.
46
THEIL, K.W; SAIF, L.J. In vitro detection of porcine rotavirus like (group B rotavirus) and its antibody. Journal of Clinical Microbiology, v.21, n.5, p.844-846, 1985. THEIL, K.W; SAIF, L.J; MOORHEAD, P.D.; WHITMOYER, R.E. Porcine rotavirus-like virus (group B rotavirus): characterization and phathogenicity for gnotobiotic pigs. Journal of Clinical Microbiology, v.21, p.340-345, 1985. THOULESS, M.E.; BEARDS, G.M.; FLEWETT. T.H. Serotyping and subgrouping of rotavirus strains by the ELISA test. Archives of Virology, v.73, p.219-230, 1982. THOULESS, M.E.; BRYDEN, A.S.; FLEWETT, T.H.; WOODE, G.N.; BRIDGER, J.C.; SNODGRASS, D.R.; HERRING, J.A. Serological relationships between rotaviruses from different species as studied by complement fixation and neutralization. Archives of Virology, v.53, p.287-294, 1977. TORRES-MEDIAN, A. Isolation of an atypical rotavirus causing diarrhea in neonatal ferrets. The Journal of American Association of Laboratory Animal Science. v.37, p.167–171, 1987. TOSSER, G.; LABBE, M.; BREMONT, M.; COHEN, J. Expression of the major capsid protein VP6 of group C rotavirus and synthesis of chimeric single-shelled particles by using recombinant baculoviruses. Journal of Virology, v.66, p.5825-5831, 1992. TSUNEMITSU, H.; JIANG, B.; YAMASHITA, Y.; OSETO, M.; USHIJIMA, H.; SAIF, L.J. Evidence of serologic diversity within group C rotaviruses. Journal of Clinical Microbiology, v.30, p.3009–3012, 1992. TSUNEMITSU, H.; KAMIYAMA, M.; KAWASHIMA, K.; KATSUDA, K.; KOHMOTO, M.; SAIF, L.J.; SHOUJI, T.; ONODERA, T. Molecular characterization of the major capsid proten VP6 of bovine group B rotavirus and its use in seroepidemiology. Journal of General Virology, v.86, p.2569-2575, 2005. TSUNEMITSU, H.; MORITA, D.; TAKAKU, H.; NISHIMORI, T.; IMAI, K.; SAIF, L.J. First detection of bovine group B rotavirus in Japan and sequence of its VP7 gene. Archives of Virology, v.144, p.805-815, 1999. TSUNEMITSU, H.; SAIF, L.J.; JIANG, B.M.; SHIMIZU, M.; HIRO, M.; YAMAGUCHI, H.; ISHIYAMA, T.; HIRAI, T. Isolation, characterization, and serial propagation of a bovine group C rotavirus in a monkey kidney cell line (MA104). Journal of Clinical Microbiology, v.29, p.2609–2613, 1991. URSU, K.; KISFALI, P.; RIGÓ, D.; IVANICS, E.; ERDÉLYI, K.; DÁN, Á.; MELEGH, B.; MARTELLA, V.; BÁNYAI, K. Molecular analysis of the VP7 gene of pheasant rotaviruses identifies a new genotype, designated G23. Archives of Virology, v.154, p.1365–1369, 2009.
47
UTRERA, V.; DE ILJA, R.M.; GORZIGLIA, M.; ESPARZA, J. Epidemiological aspects of porcine rotavirus infection in Venezuela. Research in Veterinary Science, v.36, p.310-315, 1984. VONDERFECHT, S.L.; LINDSAY, D.A.; EIDEN, J.J. Detection of rat, porcine and human group B rotavirus in fecal specimens by solid-phase enzyme immunoassay. Journal of Clinical Microbiology, v.32, n.4, p.1107-1108, 1994. XU, L.; HARBOUR, D.; MCCRAE, M.A. The application of polymerase chain reaction to the detection of rotaviruses in faeces. Journal of Virological Methods, v.27, p.29–37, 1990. WIELER, L.H.; ILIEFF, A.; HERBEST, W.; BAUER, C.; VIELER, E.; BAUERFEIND, R.; FAILIN, K.; KLOS, H.; WENGERT, D.; BALJER, G.; ZAHNER, H. Prevalence of enteropathogens in suckling and weaned piglets with diarrhoea in Southern Germany. Journal of Veterinary Medicine B, v.48, p.151-159, 2001. WILL, L.A.; PAAUL, P.S.; PROESCHLDT, T.A.; AKTAR, S.N.; FLAMING, K.P.; JANKE, B.H.; SACKS, J.; LYOO, Y.S.; HILL, H.T.; HOFFMAN, L.J.; WU, L. L. Evaluation of rotavirus infection and diarrhea in Iowa commercial pigs based on an epidemiologic study of a population represented by diagnostic laboratory cases. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.6, p.416-422, 1994. WINIARCZYK, S.; PAUL, P.S.; MUMMIDI, S.; PANEK, R.; GRADZKI, Z. Survey of porcine rotavirus G and P genotype in Poland in the United States using RT-PCR. Journal of Veterinary Medicine B, v.49, p.373–378, 2002. WOODE, G.N.; ZHENG, S.; ROSEN, B.I.; KNIGHT, N.; GOURLEY, N.E.; RAMIG, R.F. Protection between different serotypes of bovine rotavirus in gnotobiotic calves: specificity of serum antibody and coproantibody responses. Journal of Clinical Microbiology, v.25, p.1052–1058, 1987. ZARATE, S. VP7 mediates the interaction of Rotaviruses with integrin αvβ3 through a novel integrin-binding site. Journal of Virology, v.78, n.20, p.10839-10847, 2004.
48
2. OBJETIVOS
49
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Realizar análises filogenéticas no gene VP6 de estirpes de PoRV-C
identificadas em rebanhos suinícolas de cinco estados brasileiros e
caracterizar os tipos de rotavírus envolvidos em um surto de diarreia
neonatal em leitões lactentes de um rebanho vacinado.
2.2. Objetivos específicos
Realizar análises filogenéticas do gene VP6 para a determinação da
epidemiologia molecular da rotavirose ocasionada pelo PoRV-C;
Identificar o PoRV-A (genes VP7 e VP4), PoRV-B (gene NSP2) e PoRV-C
(gene VP6) a partir de amostras de fezes diarreicas de leitões lactentes
obtidas em um surto de diarreia neonatal identificado em um rebanho
regularmente vacinado contra o PoRV-A;
Realizar análises filogenéticas para a caracterização dos genotipos G (VP7) e
P (VP4) de PoRV-A identificados no surto de diarreia em leitões lactentes.
50
3. ARTIGOS PARA PUBLICAÇÃO
51
3.1. VP6 GENE HETEROGENEITY OF GROUP C PORCINE
ROTAVIRUS TRAINS.
52
VP6 gene heterogeneity of group C porcine rotavirus strains.
Abstract
Porcine rotaviruses (PoRV) are reported as the main etiological agents in piglet
diarrhea throughout the world. Rotavirus group C (RV-C) is distinguished from other
rotavirus groups essentially by the features of VP6 protein, constituting a frequent target
of diagnostic assays and molecular heterogeneity analysis of RV-C. Overall, due to the
low number of investigation of PoRV-C, several questions remained unanswered with
regard to their epidemiological features and their genetic heterogeneity. The aim of this
study was to carry out the phylogenetic analysis of VP6 gene of Brazilian PoRV-C field
strains. Fifteen (15) wild-type PoRV-C strains identified in diarrheic fecal samples of
piglets ranging from 1 to 4 weeks old, collected between 2004 and 2010 from 12
different pig farms located in five Brazilian states were included in this study. The
genetic diversity of PoRV-C strains was investigated by sequencing of VP6 gene
amplicons with 1.353-bp length amplified by RT-PCR assay. The VP6 gene nucleotide
sequences shares 82.5% to 100% identity among Brazilian PoRV-C strains. Comparing
with other PoRV-C strains described, the Brazilian strains revealed nucleotide identity
rates of 80.4% to 93.0%, characterizing a high heterogeneity rate. The Brazilian wild-
type PoRV-C strains were classified in three distinct and well definide Porcine lineage
clusters and were detected in different pig herds at different time periods. These results
suggest that the variability of wild-type strains occur frequently and that divergent
strains are widely spread, circulating at the same time in Brazilian pig herds. The
present study describes a genetic variability in Brazilian PoRV-C strains, increasing the
possibility that there is a considerable variation in gene 5, a supposedly more conserved
gene. These find contrasts with the hypothesis that only RV strains from group A have
high genetic variability. Therefore, more in-depth epidemiological and molecular
analysis of PoRV-C throughout the country and the world will be needed to understand
their diversity as well as to develop classification schemes and specific control
measures.
Key-words: Swine, rotaviruses, VP6 protein, phylogeny.
53
INTRODUCTION
Rotaviruses are the major etiologic agents of severe, acute dehydrating diarrhea
in young animals and children (ALFIERI et al., 1999a; TAMEHIRO et al., 2003;
ALFIERI et al., 2004; ELSCHNER et al., 2005; BARMAN et al., 2006). The viruses
belong to the family Reoviridae, are triple-layered concentric capsid proteins and
contain a genome consisting of 11 segments of double-stranded RNA (dsRNA). The
middle layer capsid protein VP6 exposes group specific antigens whose characteristics
classifies rotaviruses into seven serogroups (A to G) on the basis of distinct antigenicity.
Groups A, B, and C rotaviruses are associated with acute gastroenteritis in humans and
animals while groups D, E, F, and G have been detected only in animals (SNODGRASS
et al., 1984; ESTES; KAPIKIAN, 2007).
Group C rotaviruses (RV-C) were first described in a diarrheic stool sample
from a piglet in 1980 (SAIF et al., 1980). Fecal shedding of porcine group C rotavirus
(PoRV-C) has been reported in weaning and post-weaning pigs with diarrhea either
alone or in mixed infection with other enteric pathogens (SAIF et al., 1980; MORIN et
al., 1990; SAIF and JIANG, 1994; KIM et al., 1999; MARTELLA et al., 2007).
A previous study reported 59 to 100% seroprevalence of RV-C infection in pigs
of all ages, with the antibody titer being higher in older pigs (TERRETT et al., 1987).
Molecular and serologic studies have indicated that the virus is circulating worldwide,
being an emerging pathogen (TSUNEMITSU et al., 1992; BÁNYAI et al., 2006;
IIZUKA et al., 2006; MÉDICI et al., 2010). To date, a high incidence of PoRV-C
infections in Brazilian pig herds has been described, however detection rates for RV-C
diverged more than 50% when compared reverse transcription-polymerase chain
reaction (RT-PCR) to silver stained-polyacrylamide gel electrophoresis (ss-PAGE); the
54
results showed that molecular methods are an essential tool to determine the
epidemiological role of these viruses in animal infections (ALFIERI et al., 1999b;
MÉDICI et al., 2011).
The major capsid protein of rotaviruses, VP6, is highly antigenic and
immunogenic. It is well documented that VP6 is the major structural component of
virions, accounting for approximately 51% by weight of the RV-A, and plays a key role
in virion structure by interacting with both the outer capsid proteins VP4 and VP7 and
the core protein VP2 (ESTES; KAPIKIAN, 2007). Group-antigen epitopes are detected
predominantly on VP6 in each rotavirus group (ESTES; KAPIKIAN, 2007). Antigenic
relationships correspond to the similarity in VP6 polypeptide sequences, with >87%
amino acid identity within mammalian RV-A (TANG et al., 1997).
Since RV-C is distinguished from other rotavirus groups essentially by the
features of VP6, this protein constitutes a frequent target of diagnostic assays and
molecular heterogeneity analysis of RV-C. Overall, due to the low number of
investigation of PoRV-C, several questions remained unanswered with regard to their
epidemiological features and their genetic heterogeneity.
In addition, a possible zoonotic role of animal RV-C has been postulated based
on increase seroprevalence rates to RV-C in human populations living in rural settings
(ITURRIZA-GÓMARRA et al., 2004). Direct evidence for the zoonotic potential of
PoRV-C has been gained by analysis of archival fecal samples of Brazilian children
(GABBAY et al., 2008). Furthermore, RV-C surveillance has detected interspecies
transmission between animal species; bovine strain WD534tc is actually considered a
porcine strain (CHANG et al., 1999). Therefore, the detection of animal-like RV-C in
humans has showed the potential zoonotic impact of animal RV-C for humans,
highlighting the need for a more in-depth study of the epidemiology of animal RV-C.
55
The complete molecular analysis of VP6 gene of the PoRV-C has only been
carried out in the United States (JIANG et al., 2000), Ireland (COLLINS et al., 2008)
and South Korea (JEONG et al., 2009); and partial molecular analysis carried out in
Italy (MARTELLA et al., 2007) and Brazil (MÉDICI et al., 2010). Therefore, it is
unclear if the PoRV-C circulating in other countries has distinct genetic characteristics.
Molecular comparison suggests that there is significant genetic diversity among the
PoRV-C circulating in Brazil and other countries. Due to the low number of
phylogenetic studies among PoRV-C strains, which may hide important features of
PoRV-C genetic characteristics; the aim of this study was to carry out the phylogenetic
analysis of VP6 gene of Brazilian PoRV-C field strains.
MATERIALS AND METHODS
Stool samples collection and inclusion criteria
The sampling was part of a stool sample collection (n = 588) consisted by
diarrheic and pasty feces of piglets ranging from 1 to 4 weeks old, collected between
2004 and 2010. The identification of potentially positive PoRV-C fecal samples, as a
screening method, was carried out by ss-PAGE technique according Herring et al
(1982) and Pereira et al (1983). Inconclusive ss-PAGE results, as low intensity or extra
bands (dsRNA segments) and samples with undefined or type C electropherotype were
included in the sampling to evaluate the presence of PoRV-C by RT-PCR assay
according to Alfieri et al. (1999). Thirty two fecal samples had showed type C or
inconclusive electropherotype, which 15 diarrheic fecal samples were positive to RV-C
detection by RT-PCR. The samples were obtained from 12 different pig herds from five
Brazilian states and three geographical regions. All pig farms, in a multi-site production
56
system, had a good nutritional and health management practices including all-in, all out
management (Table 1).
Table 1. Brazilian PoRV-C wild-type strains with VP6 gene sequences performed in the study, their
origin and year collected.
Strain Origin Year Region State County
BRA189/04-Po Central-West Mato Grosso do Sul São Gabriel do Oeste 2004
BRA258/04-Po South Rio Grande do Sul Gaurama 2004
BRA499/04-Po Rio Grande do Sul Três Passos 2004
BRA662/05-Po Rio Grande do Sul Santa Rosa 2005
BRA889/07-Po Santa Catarina Concórdia 2007
BRA904/07-Po Santa Catarina Concórdia 2007
BRA905/07-Po Santa Catarina Concórdia 2007
BRA634/05-Po Paraná Catanduvas 2005
BRA36/08-Po Paraná Cascavel 2008
BRA01/10-Po Paraná Itaipulândia 2010
BRA61/10-Po Paraná Itaipulândia 2010
BRA1014/10-Po South-East Minas Gerais Urucânia 2010
BRA1208/10-Po Minas Gerais Belo Horizonte 2010
BRA1033/10-Po Minas Gerais Oratórios 2010
BRA1034/10-Po Minas Gerais Oratórios 2010
RNA extraction and rotavirus detection
The dsRNA extraction was performed with a combination of the
phenol/chloroform/isoamyl alcohol (SAMBROOK; RUSSEL, 2001) silica/guanidinium
isothiocyanate (BOOM et al., 1990) methods as described by Alfieri et al. (2006). RT-
PCR and semi nested-PCR (SN-PCR) assays were performed with different
oligonucleotide primer sets for porcine rotavirus group A (GOUVEA et al., 1990;
57
GOUVEA et al., 1991; GENTSCH et al., 1992), group B (DAS et al., 1994), and group
C detection (ALFIERI et al., 1999). The amplification products were analyzed by 2%
agarose gel electrophoresis and visualized under UV light after ethidium-bromide
staining.
VP6 gene amplification, purification and sequencing.
The RT-PCR assay was performed using a modification of the BMJ41 forward
(5’ GGC TTT AAA AAT CTC ATT CAC AA 3’, [nt] 1-23) primer described by Alfieri
et al. (1999); and a reverse (5’ AGC CAC ATA GTT CAC ATT TCA 3’ [nt] 1333-
1353) primer (BÁNYAI et al., 2006). Electrophoresis analysis was carried out using an
ethidium bromide-stained 1% agarose gel that was visualized under UV light. The
samples were positive for RV-C in RT-PCR assay by amplifying a total of 1.353-bp
PCR product of gene 5 (VP6). The PCR products were purified using the GFXTM PCR
DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare UK Ltd, Little Chalfont,
Buckinghamshire, UK), quantified in a QubitTM Fluorometer (Invitrogen Life
Technologies, Carlsbad, California, USA) and sequenced in a MegaBACETM
1000/Automated 96 Capillary DNA Sequencer (GE Healthcare UK Ltd, Little Chalfont,
Buckinghamshire, UK) with Thermo Sequenase™ II DNA Polymerase and the
DYEnamic™ ET Dye Terminator Kit (GE Healthcare UK Ltd, Little Chalfont,
Buckinghamshire, UK). The amplicons were sequenced directly using forward and
reverse primers.
58
Sequence analysis
Sequence quality analysis was carried out using Phred and CAP3 softwares
(http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/). Sequence similarity searches were
performed using the BLASTn software (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), and multiple
alignment and identity matrix analysis were performed using BioEdit version 7.0.9.0
(HALL, 1999) and ClustalW softwares. Nucleotide distance and phylogenetic analysis
were performed with MEGA software version 5 (TAMURA et al., 2011). The analyses
were based on the neighbor-joining method from the model Tamura-Nei and pairwise
distance calculation (TAMURA; NEI, 1993). Bootstrapping was statistically supported
with 1,000 replicates. The referenced sequences included in the study were acquired
from the National Center for Biotechnology Information, USA (GenBank)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/) (Table 2).
59
Table 2. GenBank accession numbers of the VP6 genes of the Brazilian PoRV-C strains,
reference RV-C strains and out group strains used in phylogenetic and sequence analysis.
Strains Origin Accession
Numbers
Strains Origin Accession
numbers
BRA36/08-Po Porcine JF810441 06-146-2 Porcine FJ494692
BRA189/04-Po Porcine JF810442 06-92-1 Porcine FJ494690
BRA258/04-Po Porcine JF810443 CA-2 Porcine GQ925781
BRA499/04-Po Porcine JF810444 Cowden Porcine M94157
BRA634/05-Po Porcine JF810445 WD534tc Porcine AF162434
BRA662/05-Po Porcine JF810446 Shintoku Bovine M88768
BRA889/07-Po Porcine JF810447 Yamagata Bovine AB108680
BRA904/07-Po Porcine JF810448 Belem Human M94155
BRA905/07-Po Porcine JF810449 Bristol Human X59843
BRA1014/10-Po Porcine JF810450 Moduganari Human AF325806
BRA1208/10-Po Porcine JF810451 Preston Human M94156
BRA01/10-Po Porcine JF810452 CMP12/03 Porcine RV-A EU372798
BRA61/10-Po Porcine JF810453 KJ9-1 Bovine RV-A HM988974
BRA1033/10-Po Porcine JF810454 PA169 Human RV-A EF554130
BRA1034/10-Po Porcine JF810455 RUBV282 Bovine RV-B GQ358715
WH-1 Human RV-B AY539858
RESULTS
In previous PoRV analysis among the fecal samples, 4 (26.6%) out of 15 PoRV-
C positive fecal samples tested positive for consensual VP4 and/or VP7 PoRV-A genes.
No PoRV-B infection was found in all RT-PCR followed by SN-PCR examined fecal
samples.
An amplicon with 1,353-bp length of the PoRV-C VP6 gene was amplified by
RT-PCR assay in all the 15 fecal samples included in this study. The alignments of the
60
sequenced product indicated that the Brazilian PoRV-C wild-type strains exclusively
belonged to the porcine lineages. The BLAST search showed that all 15 sequences had
high similarity to published RV-C VP6 gene sequences.
In the phylogenetic reconstruction, five distinct clusters were formed among
RV-C strains, designated as Porcine I, Porcine II, Porcine III, Human, and Bovine
(Figure 1). The Porcine I cluster also spread into two subclusters where the
BRA1208/10-Po, BRA1014/10-Po, BRA1033/10-Po, and BRA1034/10-Po sequences
were grouped segregated from the Cowden and WD534tc subcluster, which
BRA189/04-Po, a Cowden-like strain, was included. The Porcine II cluster included
four subclusters where the BRA258/04-Po, BRA634/05-Po, and BRA01/10-Po
followed by BRA36/08-Po and BRA662/05-Po; and finally BRA499/04-Po sequences
were grouped in distinct subclusters segregated from the CA-2 strain subcluster. The
PoRV-C Brazilian strains BRA889/07-Po, BRA904/07-Po, and BRA905/07-Po formed
one subcluster of Porcine III cluster, which also was formed by a unique BRA61/10-Po
strain subcluster segregated from Korean PoRV-C 06-146-2 and 06-92-1 strains. The
Human and Bovine clusters included exclusively RV-C strains of human and bovine
origin. All Brazilian PoRV-C and references strains were clustered segregated from the
out group strains composed by human, bovine, and porcine RV-A strains (Figure 2).
61
Figure 1. Neighbor-Joining (Tamura-Nei model) tree based on complete sequences of
VP6 gene of 15 Brazilian PoRV-C wild-type strains (●) described in this study and
eight reference strains acquired from GenBank with complete RV-C VP6 sequences.
The names of RV-C strains and GenBank accession numbers are listed in Table 2. The
scale bar is proportional with the phylogenetic distance.
BR
A258
/04-
Po
BRA6
34/0
5-Po
18
BRA01/10-Po
24
BRA499/04-Po
32
CA2-Po 46
BRA36/08-Po
BRA662/05-Po
99100
06-92-1-Po
06-146-2-Po
BRA61/10-Po
BRA904/07-Po
BRA889/07-Po BRA905/07-Po
32100
100
56100
98
Cow
den-
Po
WD534tc-Bo
100
BRA189/04-Po
97
BRA1208/10-Po
BRA1014/10-Po
BRA1033/10-Po
BRA1034/10-Po
100
100
100
100
91
Shintoku-Bo
Yamagata-Bo
100
Belem-HuModuganari-H
u
87
Preston-Hu
Bristol-Hu
9910
0
0.02
Porcine II
Porcine I
Porcine III
Human
Bovine
62
Figure 2. Phylogenetic tree of the VP6 gene of the Brazilian PoRV-C strains showing
its genetic relationship with other RV-C strains. RV-A srains CMP12/03 (Porcine),
KJ9-1 (Bovine) and PA169 (Human); and RV-B strains RUBV282 (Bovine) and WH-1
BRA258/04-Po
BRA634/05-Po
BRA01/10-Po
BRA499/04-Po
CA2-Po
BRA36/08-Po
BRA662/05-Po
06-92-1-Po
06-146-2-Po
BRA61/10-Po
BRA904/07-Po
BRA889/07-Po
BRA905/07-Po
Shintoku-Bo
Yamagata-Bo
Belem-Hu
Moduganari-Hu
Preston-Hu
Bristol-Hu
Cowden-Po
WD534tc-Bo
BRA189/04-Po
BRA1208/10-Po
BRA1014/10-Po
BRA1033/10-Po
BRA1034/10-Po
CMP12/03-Po
KJ9-1-Bo
PA169-Hu
RUBV282-Bo
WH-1-Hu100
100100
100
99
78
100
100
100
100
100
99
100
94
97
62
99
7377
39
52 89
90
59
28
1914
0.1
Porcine II
Porcine I
Porcine III
Bovine
Human
RV-A
RV-B
63
(Human), were used as out-groups. The shape markers of Brazilian PoRV-C are
according to the pig herds State location (Mato Grosso do Sul [▼], Minas Gerais [■],
Paraná [▲], Rio Grande do Sul [●] and Santa Catarina [♦]).The names, original hosts
and GenBank accession numbers of RV-A, B and C strains are listed in Table 2. The
number adjacent to the node represents the bootstrap value. Scale bar shows genetic
distance expressed as nucleotide substitutions per site.
The nucleotide distances among Brazilian PoRV-C strains ranged from 0.0 to
16.83%, and between Brazilian PoRV-C and reference RV-C and RV-A strains ranged
from 6.92 to 19.24% and 45.01 to 47.83%, respectively (Table 3). Among the PoRV-C
strains grouped in Porcine I cluster, Brazilian PoRV-C strains BRA1208/10-Po and
BRA189/04-Po showed a high and low nucleotide distance rates, when compared with
the PoRV-C Cowden and WD534tc strains, respectively. Nucleotide distance rates of
Porcine I cluster strains are showed in Table 4. Brazilian PoRV-C strains grouped in
Porcine II cluster were compared to Korean PoRV-C CA-2 strain, revealing a high
nucleotide distance, showed in Table 5. Analysis of Porcine III clustered strains showed
a lower nucleotide distances, compared to other intra-clusters distances analysis (Table
6). Mean group distances of porcine clusters are showed in Table 7. Genetic distances
were variable among the Brazilian PoRV-C strains and between Brazilian and other
known PoRV strains (Table 8).
64
Table 3. Estimates of evolutionary divergence between the Brazilian PoRV-C and out-group RV-A reference strains. The numbers of base
differences per site between sequences are shown. Strain
BRA36 /08-Po
BRA189 /04-Po
BRA258 /04-Po
BRA499 /04-Po
BRA634 /05-Po
BRA662 /05-Po
BRA889 /07-Po
BRA904 /07-Po
BRA905 /07-Po
BRA1014 /10-Po
BRA1208 /10-Po
BRA01 /10-Po
BRA61 /10-Po
BRA1033 /10-Po
BRA1034 /10-Po
CMP12/03 KJ9-1 PA169
BRA36/08-Po - - - - - - - - - - - - - - - - - -
BRA189/04-Po 0,1590 - - - - - - - - - - - - - - - - -
BRA258/04-Po 0,1004 0,1558 - - - - - - - - - - - - - - - -
BRA499/04-Po 0,0988 0,1598 0,0876 - - - - - - - - - - - - - - -
BRA634/05-Po 0,0940 0,1526 0,0819 0,0948 - - - - - - - - - - - - - -
BRA662/05-Po 0,0755 0,1647 0,0980 0,1020 0,0948 - - - - - - - - - - - - -
BRA889/07-Po 0,1365 0,1430 0,1430 0,1510 0,1470 0,1470 - - - - - - - - - - - -
BRA904/07-Po 0,1365 0,1430 0,1430 0,1510 0,1470 0,1470 0,0000 - - - - - - - - - - -
BRA905/07-Po 0,1365 0,1430 0,1430 0,1510 0,1470 0,1470 0,0000 0,0000 - - - - - - - - - -
BRA1014/10-Po 0,1590 0,0948 0,1518 0,1614 0,1478 0,1582 0,1631 0,1631 0,1631 - - - - - - - - -
BRA1208/10-Po 0,1663 0,1044 0,1558 0,1687 0,1550 0,1687 0,1526 0,1526 0,1526 0,0691 - - - - - - - -
BRA01/10-Po 0,1084 0,1679 0,0859 0,0964 0,0940 0,1076 0,1494 0,1494 0,1494 0,1639 0,1590 - - - - - - -
BRA61/10-Po 0,1309 0,1510 0,1438 0,1478 0,1454 0,1454 0,0442 0,0442 0,0442 0,1606 0,1542 0,1462 - - - - - -
BRA1033/10-Po 0,1631 0,0956 0,1566 0,1663 0,1526 0,1655 0,1622 0,1622 0,1622 0,0361 0,0691 0,1687 0,1558 - - - - -
BRA1034/10-Po 0,1622 0,0948 0,1558 0,1655 0,1518 0,1647 0,1614 0,1614 0,1614 0,0353 0,0683 0,1679 0,1550 0,0008 - - - -
CMP12/03 0,4627 0,4578 0,4659 0,4715 0,4618 0,4707 0,4659 0,4659 0,4659 0,4627 0,4659 0,4691 0,4667 0,4546 0,4538 - - -
KJ9-1 0,4643 0,4594 0,4715 0,4675 0,4683 0,4771 0,4514 0,4514 0,4514 0,4618 0,4691 0,4747 0,4498 0,4635 0,4627 0,2080 - - PA169
0,4643 0,4578 0,4707 0,4699 0,4651 0,4763 0,4506 0,4506 0,4506 0,4554 0,4627 0,4755 0,4490 0,4554 0,4546 0,2112 0,0209 -
65
Table 4. Estimates of evolutionary divergence between Porcine I clustered strains. The numbers of base differences per site between PoRV-C
sequences are shown.
Strain BRA189/04-Po BRA1014/10-Po BRA1208/10-Po BRA1033/10-Po BRA1034/10-Po Cowden-Po WD534tc-Bo
BRA189/04-Po - - - - - - -
BRA1014/10-Po 0.1051 - - - - - -
BRA1208/10-Po 0.1145 0.0733 - - - - -
BRA1033/10-Po 0.1062 0.0380 0.0735 - - - -
BRA1034/10-Po 0.1052 0.0371 0.0725 0.0008 - - -
Cowden-Po 0.0744 0.0987 0.1041 0.0986 0.0977 - -
WD534tc-Bo 0.0879 0.1127 0.1150 0.1095 0.1085 0.0146 -
66
Table 5. Estimates of evolutionary divergence between Porcine II clustered strains. The numbers of base differences per site between PoRV-C
sequences are shown.
Strain BRA36/08-Po BRA258/04-Po BRA499/04-Po BRA634/05-Po BRA662/05-Po BRA01/10-Po CA2-Po
BRA36/08-Po - - - - - - -
BRA258/04-Po 0.1112 - - - - - -
BRA499/04-Po 0.1088 0.0954 - - - - -
BRA634/05-Po 0.1031 0.0887 0.1036 - - - -
BRA662/05-Po 0.0822 0.1082 0.1127 0.1040 - - -
BRA01/10-Po 0.1207 0.0934 0.1055 0.1025 0.1197 - -
CA2-Po 0.1167 0.0952 0.1052 0.1104 0.1140 0.1136 -
67
Table 6. Estimates of evolutionary divergence between Porcine III clustered strains. The numbers of base differences per
site between PoRV-C sequences are shown.
Strain BRA889/07-Po BRA904/07-Po BRA905/07-Po BRA61/10-Po 06-146-2-Po 06-92-1-Po
BRA889/07-Po - - - - - -
BRA904/07-Po 0,0000 - - - - -
BRA905/07-Po 0,0000 0,0000 - - - -
BRA61/10-Po 0,0466 0,0466 0,0466 - - -
06-146-2-Po 0,0845 0,0845 0,0845 0,0857 - -
06-92-1-Po 0,0955 0,0955 0,0955 0,0974 0,0777 -
68
Table 7. Estimates of evolutionary divergence between Porcine I, Porcine II,
Porcine III, Bovine and Human clusters. The numbers of base differences per
site between PoRV-C sequences are shown.
Strain Porcine I Porcine II Porcine III Bovine Human
Porcine I - - - - -
Porcine II 0.0883 - - - -
Porcine III 0.1033 0.0781 - - -
Bovine 0.1651 0.1517 0.1692 - -
Human 0.1498 0.1489 0.1645 0.1967 -
Table 8. Nucleotide (nt) and deduced amino acid (aa) sequence comparison of the
VP6 of the Brazilian PoRV-C strains with that of the other strains.
Strain Origin % similarity with 15 Brazilian strainsa
Nt aa
06-146-2 Porcine 83.5 - 92.2 83.5 - 97.3
06-92-1 Porcine 83.5 - 91.2 83.0 - 97.3
CA-2 Porcine 83.0 - 91.0 86.7 - 96.6
Cowden Porcine 84.2 - 93.0 83.0 - 98.6
WD534tc Bovine 82.9 - 91.6 79.4 - 94.0
Shintoku Bovine 80.4 - 82.4 80.9 - 90.6
Yamagata Bovine 80.4 - 82.2 80.9 - 91.1
Belem Human 80.6 - 82.3 80.9 - 91.1
Bristol Human 81.0 - 82.9 80.9 - 91.1
Moduganari Human 80.6 - 82.2 80.4 - 90.6
Preston Human 81.0 - 83.0 80.9 - 91.1 a The classification of Brazilian RV-C strains into 15 and 1 is based on the phylogenetic data in which
they clustered on the separate branches (Fig. 1). The nucleotide and deduced amino acid sequence
identities of VP6 among the Brazilian 15 strains were 82.5–100 and 80.4–100%, respectively.
69
DISCUSSION
RV-C has already been described as a cause of outbreaks either in weaning, post-
weaning and older pigs, in some cases leading to substantial mortality rates (TERRETT et al.,
1987; SAIF; JIANG, 1994; MARTELLA et al., 2007). In spite of these data, epidemiologic
characterization of RV-C infection is very limited. The molecular characterization of RV-C
strains is still not extensively performed, which restricts the study of these circulating strains
and may interfere on success of specific control measures implementation to RV-C in the
future.
The analysis performed in the present study was based on the complete sequence of
gene 5. In contrast to previous descriptions from Italy (MARTELLA et al., 2007) and Brazil
(MÉDICI et al., 2010), this study included the complete sequence of the gene which allows us
to compare the Brazilian with other RV-C available sequences. The molecular analyses of 15
complete VP6 gene sequences from PoRV-C wild-type strains revealed that Brazilian strains
were ranged in three clusters, revealing different characteristics regarding low or high PoRV-
C Cowden strain identity. The Brazilian strains BRA189/04-Po, BRA1014/10-Po,
BRA1208/10-Po, BRA1014/10-Po, BRA1033/10 and BRA1034/10-Po that were grouped
with the Cowden strain in the dendrogram, did not display such high variability; identity with
the prototype ranged from 89.1 to 93.0%. Recently, a comparison including Cowden and
Italian PoRV-C strains reveals a genetic heterogeneity, with nucleotide identity diverging in
almost 12% (MARTELLA et al., 2007). Some Brazilian PoRV-C strains analyzed in the
present study, considering the low PoRV-C Cowden strain identity with differences rates of
14.0 to 15.8%, the PoRV-C strains were grouped with Korean PoRV-C strains.
In this study, genetically variable PoRV-C strains were related with bovine and human
RV-C, which determines a lower identity with a variable similarity rates (80.4 to 83.0%).
70
Analysis of the complete VP6 gene of the 15 PoRV-C strains showed that they share low
nucleotide and deduced amino acid sequence identities with human RV-C, consistent with a
previous report (MARTELLA et al., 2007). This result indicates that the Brazilian PoRV-C
belong to others different genetic RV-C clusters. According to the phylogenetic analysis of
RV-C VP6 gene between Brazilian and other known PoRV-C strains, the analysis also
revealed two clusters consisting one with the Korean CA-2 PoRV-C strain, and other with
Korean 06-146-2 and 06-92-1 PoRV-C strains. However, genetic distances were variable
among the Brazilian PoRV-C strains (82.5 to 100% nucleotide and 80.4 to 100% deduced
amino acid identities) and between Brazilian and other known PoRV strains (80.4 to 93.0%
nucleotide and 79.4 to 98.6% deduced amino acid sequence identities) (Table 8). From these
results, it is unclear whether there are different sublineages within the PoRV-C lineage.
Therefore, more in-depth epidemiological analysis of PoRV-C throughout the world will be
needed to understand their diversity and evolution as well as to develop classification
schemes.
Among the Brazilian sequences, the nucleotide identity showed a wide range of values
with a surprising minimum similarity of 82.5% between two sequences. The geographical
genetic divergence of PoRV-C VP6 gene is unclear because the available GenBank sequence
data involve only a few countries. In this study, genetically variable PoRV-C was detected in
specific regions of Brazil and common features that correlated with the geographic origin of
the pig herds (Table 1).
The Brazilian strains BRA258/04-Po, BRA499/04-Po, and BRA662/05-Po were
ranged in Porcine II cluster. The analysis revealed that even from the same State origin, Rio
Grande do Sul, however, from different pig herds; the PoRV-C strains had a variable
similarity rate of 89.2–91.5%. This relationship between the Brazilian PoRV-C heterogeneity
and pig farm State location is dubious when comparing the sequenced strains obtained from
71
diarrheic fecal samples from Parana State. The sequences were analyzed and disposed in
different clusters, as observed in BRA61/10-Po (Porcine III cluster), and BRA36/08-Po,
BRA634/05-Po, and BRA01/10-Po strains (Porcine II cluster). Comparing the nucleotide
similarity rate of 85.1% between the BRA61/10-Po and BRA01/10-Po strains, it showed that
even samples belonging to different pig farms, in the same county (Itaipulândia); carried
heterologous PoRV-C strains. Nevertheless, in comparison between Brazilian PoRV-C
BRA1033/10-Po and BRA1034/10-Po, grouped in Porcine I cluster, this relationship could
not be showed even the strains belonged to the same pig farm.
A 100% nucleotide similarity rate was observed in a subcluster of Porcine III cluster
composed by Brazilian strains BRA889/07-Po, BRA904/07-Po, and BRA905/07-Po. The
strains were obtained from a single outbreak in the city of Concórdia, Santa Catarina State.
Even a period of 45 days between the diarrheic fecal samples, in which BRA889/07-Po and
BRA904/07-Po or BRA905/07-Po strains were analyzed, no nucleotide distances were
showed. In comparison with other Brazilian PoRV-C strains, the nucleotide sequences
similarity ranged from 83.5 to 95.5%, reaffirming that how near the PoRV-C strain origin,
closer and stronger are the genetic relations (MARTELLA et al., 2007). The same relation
could be determined in Porcine I cluster, which all Brazilian PoRV-C strains detected in fecal
samples from herds of Minas Gerais State, showed a variable similarity rate through
themselves (83.2–99.8%), with low rates corresponding to strains obtained from different pig
herds. The cluster also contains a Brazilian PoRV-C strain obtained from a pig herd of Mato
Grosso do Sul State, with a high similarity rate in comparison with porcine Cowden (93.0%)
and bovine WD534tc (91.6%) strains.
The genetic variation presented here, in a gene that is supposedly conserved, opens up
the possibility that RV-C is more variable than previously thought and that there is more than
one porcine genogroup based on VP6 gene classification. These strains were more similar to
72
the porcine strains already described, although their classification in the same lineage is
unanswered. These results may suggest that are new lineages and also new sublineages of
PoRV-C strains.
In the present study, it was shown that the heterogeneity in the VP6 gene from PoRV-
C was higher than expected. Previous studies have indicated that genetic similarity might
occur between strains from different host species, where porcine/bovine and porcine/human
strains demonstrated a high nucleotide similarity (CHANG et al., 1999; GABBAY et al.,
2008). With the description of more RV-C sequences from different host species, the
molecular features of VP6 will be more clearly defined. This description of the genetic
variability in porcine strains increases the possibility that there is considerable variation in
gene 5 of RV-C, supposedly a more conserved gene, which contrasts with the hypothesis that
only RV-A strains have high variability (RAHMAN et al., 2005). Furthermore, divergent
Brazilian PoRV-C strains classified in all Porcine clusters were detected in different pig herds
at different time periods (2004 to 2010), which suggest that the variability of wild-type strains
occurred frequently and that divergent strains, grouped in distinct porcine clusters lineage, are
widely spread, proving the strains are circulating at the same time in Brazilian pig herds.
From these results, it is unclear whether there are different sublineages within the
PoRV-C lineage. Therefore, more in-depth epidemiological and molecular analysis of PoRV-
C throughout the country and world will be needed to understand their diversity and evolution
as well as to develop classification schemes and specific control measures.
REFERENCES
ALFIERI, A.A.; ALFIERI, A.F.; BEUTTEMMÜLLER, E.A.; BRITO, B.G.; MÉDICI, K.C. Aspectos epidemiológicos da rotavirose suína na região sudoeste do estado do Paraná. Semina: Ciências Agrárias, v.20, p. 5-11, 1999a.
73
ALFIERI, A.A.; LEITE, J.P.G.; ALFIERI, A.F.; JIANG, B.; GLASS, R.I.; GENTSCH, J.R. Detection of field isolates of human and animal group C rotavirus by reverse transcription-polymerase chain reaction and digoxigenin-labeled oligonucleotide probes. Journal of Virological Methods, v.83, p.35-43, 1999b. ALFIERI, A.F.; ALFIERI, A.A.; BARREIROS, M.A.B.; LEITE, J.P.G.; RICHTZENHAIN, L.J. G and P genotypes of group A rotavirus strains circulating in calves in Brazil, 1996-1999. Veterinary Microbiology, v.99, p.167-173, 2004. ALFIERI, A.A.; PARAZZI, M.E.; TAKIUCHI, E.; MÉDICI, K.C.; ALFIERI, A.F. Frequency of group A rotavirus in diarrhoeic calves in Brazilian cattle herds, 1998-2002. Tropical Animal Health and Production, v.38, p.521-526, 2006. BÁNYAI, K.; JIANG, B.; BOGDÁN, A.; HORVÁTH, B.; JAKAB, F.; MELEG, E.; MARTELLA, V.; MAGYARI, L.; MELEGH, B.; SZUCS, G. Prevalence and molecular characterization of human group C rotaviruses in Hungary. Journal of Clinical Virology, v.37, p.317-22, 2006. BARMAN, P.; GHOSH, S.; SAMAJDAR, S.; MITRA, U.; DUTTA, P.; BHATTACHARYA, S.K., KRISHNAN, T.; KOBAYASHI, N.; NAIK, T.N. RT-PCR based diagnosis revealed importance of human group B rotavirus infection in childhood diarrhoea. Journal of Clinical Virology, v.36, p.222-227, 2006. BOOM, R.; SOL, C.J.; SALIMANS, M.M.; JANSEN, C.L.; WERTHEIM-VAN DILLEN, P.M.; VAN DER NOORDAA, J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology, v.28, p.495-503, 1990. CHANG, K.O.; NIELSEN, P.R.; WARD, L.A.; SAIF, L.J. Dual infection of gnotobiotic calves with bovine strains of group A and porcine-like group C rotaviruses influences pathogenesis of the group C rotavirus. Journal of Virology, v.73, p.9284-9293, 1999. COLLINS, P. J.; MARTELLA, V.; O’SHEA, H. Detection and characterization of group C rotaviruses in asymptomatic piglets in Ireland. Journal of Clinical Microbiology, v.46, p. 2973–2979, 2008. DAS, B.K.; GENTSCH, J.R.; CICIRELLO, H. G.; WOODS, P. A.; GUPTA, A.; RAMACHANDRAN, M.; KUMAR, R.; BHAN, M.K.; GLASS, R.I. Characterization of rotavirus strains from newborns in New Delhi, India. Journal of Clinical Microbiology, v.32, p.1820-1822, 1994. ELSCHNER, M.; SCHRADER, C.; HOTZEL, H.; PRUDLO, J.; SACHSE, K.; EICHHORN, W.; HERBST, W.; OTTO, P. Isolation and molecular characterization of equine rotaviruses from Germany. Veterinary Microbiology, v. 105, p.123–129, 2005. ESTES, M.K.; KAPIKIAN, A.Z. Rotaviruses. In: KNIPE, D.M.; GRIFFIN, D.E.; LAMB, R.A.; STRAUS, S.E.; HOWLEY, P.M.; MARTIN, M.A.; ROIZMAN, B. (Eds.). Fields Virology, fifth edition. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, p.1917–1974, 2007.
74
GABBAY, Y.B.; BORGES, A.A.; OLIVEIRA, D.S.; LINHARES, A.C.; BARARDI, R.M.; WANG, Y.; MASCARENHAS, J.D.P.; GLASS, R.I.; JIANG, B. Evidence for zoonotic transmission of group C rotaviruses among children in Belém, Brazil. Journal of Medical Virology, v.80, p. 1666-1674, 2008. GENTSCH, J.R.; GLASS, R.I.; WOODS, P.; GOUVEA, V.; GORZIGLIA, M.; FLORES, J.; DAS, B.K.; BHAN, M.K. Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, v.30, p.1365-1373, 1992. GOUVEIA, V.; GLASS, R.I.; WOODS, P.; TANIGUCHI, K.; CLARK, H.; FORRESTER, B.; FANG, Z.Y. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens. Journal of Clinical Microbiology, v.28, p.276-282, 1990. GOUVEA, V.; ALLEN, J.R.; GLASS, R.I.; FANG, Z.Y.; BREMONT, M.; COHEN, J.; McCRAE, M.A.; SAIF, L.J.; SINARACHATANANT, P.; CAUL, O. Detection of group B and C rotaviruses by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, v.29, p.519-523, 1991. HALL, T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, v.41, p.95-98, 1999. HERRING, A.J.; INGLIS, N.F.; OJEH, C.K.; SNODGRASS, D.R.; MENZIES, J.D. Rapid diagnosis of rotavirus infection by direct detection of viral nucleic acid in silver-stained polyacrylamide gels. Journal of Clinical Microbiology, v.16, p.473-477, 1982. IIZUKA, S.; TABARA, K.; KAWAMUKAI, A.; ITOGAWA, H.; HOSHIMA, K. An outbreak of group C rotavirus infection in an elementary school in Shimaneprefecture, Japan, February 2006. Japanese Journal of Infectious Disease, v.59, p.350–351, 2006. ITURRIZA-GÓMARRA, M.; CLARKE, I.; DESSELBERGER, U.; BROWN, D.; THOMAS, D; GRAY, J. Seroepidemiology of group C rotavirus infection in England and Wales. European Journal of Epidemiology, v.19, p.589–595, 2004. JEONG, Y.; PARK, S.; HOSMILLO, M.; SHIN, D.; CHUN, Y.; KIM, H.; KWON, H.; KANG, S.; WOO, S.; PARK, S.; KIM, G.; KANG, M.; CHO, K. Detection and molecular characterization of porcine group C rotaviruses in South Korea. Veterinary Microbiology, v.138, p.217-24, 2009. JIANG, B.; SAIF, L.J.; GENTSCH, J.R.; GLASS, R.I. Completion of the four large gene sequences of porcine group C Cowden rotavirus. Virus Genes, v.20, p.193-194, 2000. KIM, Y.; CHANG, K.O.; STRAW, B.; SAIF, L.J. Characterization of group C rotaviruses associated with diarrhea outbreaks in feeder pigs. Journal of Clinical Microbiology, v.37, p.1484-1488, 1999. MARTELLA, V.; BÁNYAI, K.; LORUSSO, E.; BELLACICCO, A.L.; DECARO, N.; CAMERO, M.; BOZZO, G.; MOSCHIDOU, P.; ARISTA, S.; PEZZOTTI, G.; LAVAZZA, A.; BUONAVOGLIA, C. Prevalence of group C rotaviruses in weaning and post-weaning pigs with enteritis. Veterinary Microbiology, v.123, p.26-33, 2007.
75
MÉDICI, K.C.; BARRY, A.; ALFIERI, A.F.; ALFIERI, A.A. VP6 gene diversity in Brazilian strains of porcine group C rotavirus. Genetics and Molecular Research, v.9, p.506-513, 2010. MORIN, M.; MAGAR, R.; ROBINSON, Y. Porcine group C rotavirus as a cause of neonatal diarrhea in a Quebec swine herd. Canadian Journal of Veterinary Research, v.54, p.385–389, 1990. PEREIRA, H.G., AZEREDO, R.S., LEITE, J.P., BARTH, O.M., SUTMOLLER, F., DE FARIAS, V.; VIDAL, M.N.. Comparison of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), immuno-electron microscopy (IEM) and enzyme immunoassay (EIA) for the rapid diagnosis of rotavirus infection in children. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.78, p.483–490, 1983. RAHMAN, M.; BANIK, S.; FARUQUE, A.S.; TANIGUCHI, K.; SACK, D.A.; VAN RANST, M.; AZIM, T. Detection and characterization of human group C rotaviruses in Bangladesh. Journal of Clinical Microbiology. v.43, p.4460–4465, 2005. SAIF, L.J.; BOHL, E.H.; THEIL, K.W.; CROSS, R.F.; HOUSE, J.A. Rotavirus-like, calicivirus-like, and 23-nm virus-like particles associated with diarrhea in young pigs. Journal of Clinical Microbiology, v.12, p.105-111, 1980. SAIF, L.J.; JIANG, B. Nongroup A rotavirus of humans and animals. Current Topics in Microbiology and Immunology, v.185, p. 330-371, 1994. SAMBROOK, J.; RUSSEL, D.W. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 2001. SNODGRASS, D.R.; HERRING, A.J.; CAMPBELL, I.; INGLIS, J.M.; HARGREAVES, F.D. Comparisson of atypical rotaviruses from calves, piglets, lambs and man. Journal of General Virology, v.65, p.909-914, 1984. TAMEHIRO, C.Y., ALFIERI, A.F., MÉDICI, K.C., ALFIERI, A.A. Segmented double-stranded genomic RNA viruses in faecal samples from broiler chicken. Brazilian Journal of Microbiology, v.34, p.349-353, 2003. TAMURA, K.; NEI, M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution, v.10, p.512-526,1993. TAMURA, K.; PETERSON, D.; PETERSON, N.; STECHER, G.; NEI, M.; KUMAR, S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution, in press, 2011. TANG, B.; GILBERT, J.M.; MATSUI, S.M.; GREENBERG, H.B. Comparison of the rotavirus gene 6 from different species by sequence analysis and localization of subgroup-specific epitopes using site-directed mutagenesis. Virology, v.237, p.89–96, 1997.
76
TERRETT, L.A.; SAIF, L.A.; THEIL, K.W.; KOHLER, E.M. Physicochemical characterization of porcine pararotavirus and detection of virus and viral antibodies using cell culture immunofluorescence. Journal of Clinical Microbiology, v.25, p.268-272, 1987. TSUNEMITSU, H.; JIANG, B.; YAMASHITA, Y.; OSETO, M.; USHIJIMA, H.; SAIF, L.S. Evidence of serologic diversity within group C rotaviruses. Journal of Clinical Microbiology, v.30, p.3009-3012, 1992.
77
3.2. PORCINE ROTAVIRUS GROUP C (PoRV-C) SINGLE AND MIXED INFECTIONS (PoRV-A, PoRV-B) AS CAUSE OF A PIGLET DIARRHEA
OUTBREAK IN VACCINATED PIG HERD.
78
Porcine rotavirus groups C (PoRV-C) single and mixed infections (PoRV-A, PoRV-B)
as cause of a piglet diarrhea outbreak in vaccinated pig herd.
Abstract
The porcine rotavirus group A (PoRV-A) is the most frequent cause of diarrhea in
suckling and weaned pigs worldwide. However, PoRV groups B and C can also infect pigs
and to cause diarrhea. The aim of this report is to describe a PoRV neonatal diarrhea outbreak
in piglets. A diarrhea outbreak with high morbidity (80%) and mortality (20%) rates occurred
in suckling (21-day-old) piglets of a Brazilian pig herd with good nutritional and health
management. The herd was regularly vaccinated for neonatal diarrhea with commercial
vaccine containing enterotoxigenic Escherichia coli fimbrial antigens (K88, K99, 987P, and
F41) and Clostridium perfringes type C toxoids besides attenuated PoRV-A G5P[7] and
G4P[6] strains. Were collected 16 diarrheic fecal samples for parasitological, bacteriological,
and virological exams. Cryptosporidum spp and Isospora suis oocysts and hemolytic E. coli
were not characterized as the major cause of the diarrhea outbreak. By RT-PCR assays 14
(87.5%) fecal samples were PoRV positives. In 5 (37.5%) fecal samples was identified only a
single PoRV genogroup and in the others 9 (64.3%) samples mixed infections, characterized
by more than one PoRV group, were revealed by RT-PCR assays. The PoRV-C was the RV
group more frequent in single as in mixed infections being identified in 13 (81.2%) fecal
samples. PoRV-A and PoRV-B were identified in 9 (56.2%) and 3 (18.7%) fecal samples,
respectively. The amplicon sequencing analyses confirmed the identity of the amplified
products by RT-PCR assays for the PoRV-A (VP7 and VP4 genes), PoRV-B (NSP2 gene),
and PoRV-C (VP6 gene). The four wild-type PoRV-A strains sequenced in this study were
classified as G4P[6] genotype and presented nucleotide identity of 88.7 to 89.3% with G4P[6]
strain of human origin (P2A serotype) and 79.7 to 80.1% with the Gottfried strain of porcine
origin (P2B serotype). This is the first report of a diarrhea outbreak in suckling piglets in a
regularly vaccinated Brazilian pig herd caused by mixed infections of PoRV-C and PoRV-B
strains of swine origin and a PoRV-A strain with antigenic characteristics (P2A-like) of
human origin.
Key-words: Pig, rotaviruses, diarrhea, diagnosis, RT-PCR, mixed infection.
79
The neonatal diarrhea is the major health problem in suckling piglets wordwide. The
diarrhea is the result of the association of several factors that include infectious agents, the
host immunity, and management procedures (MOXLEY; DUHAMEL, 1999; SAIF, 1999).
The newborn piglets are susceptible to the infection for several classes of microorganisms
such as bacteria (enterotoxigenic Escherichia coli, Clostridium perfringens type C), protozoan
(Cryptosporidium spp and Isospora suis), and virus (rotavirus, coronavirus, calicivirus)
(MORIN et al., 1983; HOLLAND, 1990; JOHNSON et al., 1992; JEONG et al., 2009).
The rotaviruses are considered the main infectious agents involved in diarrhea
outbreaks in suckling and weaned pigs throughout the world (CHANG et al., 1999). The
rotaviruses belongs to the Reoviridae family and is characterized by double-stranded RNA
(dsRNA) with 11 genomic segments and capsid composed by three concentric protein layers.
Based on the main protein (VP6) of the intermediary capsid layer, rotaviruses are classified
into seven (A to G) distinct serologic groups (ESTES; KAPIKIAN, 2007).
The porcine rotavirus group A (PoRV-A) is the more frequent virus involved in
diarrhea outbreak in piglet production units (ALFIERI et al., 2006; PARRA et al., 2008;
LINARES et al., 2009; HALAIHEL et al., 2010). The involvement of porcine rotavirus
groups B and C (PoRV-B and PoRV-C) in weaning and post-weaning diarrhea are
occasionally described (BROWN et al, 1987; TERRETT et al., 1987; SAIF; JIANG, 1994).
The lower frequency of piglet diarrhea reports caused by PoRV-B and PoRV-C could
not be consequence of the low infection rate but of the use of less sensitive diagnosis
techniques. The silver stained-polyacrylamide gel electrophoresis (ss-PAGE) is the most
practical and low cost method used for the rotavirus diagnosis in animal production
wordwide. However, this diagnosis method presents low sensitivity and, frequently, the
PoRV-B and PoRV-C infections are not identified (XU et al., 1990; MÉDICI et al., 2011).
80
The majority of the survey involving the etiological diagnostic of the suckling piglets
diarrhea involves the identification of a single microorganism. Few studies analyze multiple
microorganisms simultaneously in cases of diarrhea in weaning piglets. When these studies
are carried, most of them are cross sectional study and not drive on the objective of the
elucidation of an outbreak (ALFIERI et al., 2006; KATSUDA et al., 2006).
The aim of this report was to describe a diarrhea outbreak in nursing piglets caused by
simultaneous infections involving PoRV-A, B, and C.
The outbreak occurred in a pig farm located in the state of Santa Catarina, Brazilian
South region. The pig farm with 500 sows had a complete cycle, with confinement system
(all-in / all-out) good nutritional and health management practices. The biosafety rules were
strictly applied and evaluated. All of the sows were routinely vaccinated with a triple
commercial vaccine for neonatal diarrhea control that included enterotoxigenic Escherichia
coli fimbrial antigens (K88, K99, 987P, and F41); Clostridium perfringens type C toxoid; and
attenuated PoRV-A genotypes G5P[7] (OSU strain) and G4P[6] (Gottfried strain), according
to manufacturer recommendations. Until then, the occurrence of neonatal diarrhea in this pig
farm was with low frequency and intensity, not constituting a health problem in the herd.
Suddenly, episodes of severe and watery diarrhea increased in number and intensity.
In two weeks the morbidity and mortality rates in suckling piglets reached 80% and 20%,
respectively. The ss-PAGE technique, carried out according to Herring et al. (1982) and
Pereira (1983), in a fecal sampling (n=60) showed positive results with similar
electropherotypes of PoRV-A, B, and C. Many fecal samples present inconclusive results by
ss-PAGE such as extra bands, bands of low intensity and/or in anomalous positions. The
sampling consisted of pooled fecal samples representing one litter in the farrowing unit and
more than 50% were fecal samples with normal consistency. As the sent sampling was not
appropriate and the ss-PAGE technique results were not conclusive and a new fecal sampling
81
was collected 15 days after. The new sampling consisted of 16 diarrheic fecal samples with
watery consistency obtained of just one piglet (21-day-old) per litter. The samples were
collected separately for bacteriological, parasitological, and virological exam and immediately
transported under refrigeration condition.
For the Escherichia coli detection the samples were sown onto sheep red blood and
MacConkey agar, incubated at 37°C overnight. The identification of Cryptosporidium spp
was carried out by Ziehl Neelsen stain (HENRIKSEN; POHLENZ, 1981) and flotation
(SHEATHER, 1923) methods; and concentration of Isospora suis oocysts was determined by
method described by Henriksen and Christensen (1992), modified by Meyer et al. (1999).
The PoRV-A dsRNA detection in 10-20% (w/v) fecal samples suspensions in
Tris/Ca2+ buffer (50 mM Tris-HCl; 10 mM NaCl; 3 mM CaCl2; pH 7.2), was evaluated by
reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. For the RNA extraction was
used a combination of phenol/chloroform/isoamyl alcohol (SAMBROOK; RUSSEL, 2001)
and silica/guanidinium isothiocyanate (BOOM et al., 1990), described by Alfieri et al. (2006).
The identification of PoRV-A VP4 (P) and VP7 (G) genes was carried out by RT-PCR assay
according to Gouvea et al. (1990, 1991) and Gentsch et al. (1992), respectively. The presence
of PoRV-B and PoRV-C in fecal samples was investigated by methods described by Das et al.
(1994) for the NSP2 gene of PoRV-B and Alfieri et al. (1999) for the VP6 gene of PoRV-C.
For the evaluation of amplicons identity, the RT-PCR amplified products were
purified, quantified and sequenced. Phylogenetic and molecular evolutionary analyses were
conducted based on a neighbor-joining method from the model Kimura two-parameter and
pairwise distance calculation.
Escherichia coli strains were isolated from MacConkey and sheep blood agar medium.
However, in all diarrheic fecal samples evaluated, no hemolysis was visualized in the blood
agar. For E. coli strains isolated of diarrheic porcine fecal samples the hemolysin production
82
is an important biological indicator and, as well, serves for diagnosis improvement in spite of
colonies detection and biochemical analysis (MARTINS et al., 2000; VU-KHAC et al., 2004).
Among all 16 diarrheic fecal samples no oocysts of Isospora suis were found, been
considered negative. The results may be explained by the occurring of age resistance to
infection (WORLICZEK et al., 2009). Even with these results, I. suis cannot be neglected as a
main pathogen; however the difficulties of oocysts detection often determine in rarely
attempted investigations (MARTINEAU; DEL CASTILLO, 2000).
A low number of Cryptosporidium spp oocysts were observed in four diarrheic fecal
samples examined and, this low rate of Cryptosporidium infection was not considered the
cause of diarrhea episodes. These results can be explained by the opportunistic infection
behavior of this enteric pathogen among immunodepressive piglets, considered as an agent
determinant of secondary infections (SNODGRASS et al., 1986, GARCIA; LIMA, 1994).
The table 1 shows the distribution of PoRV RNA detection by RT-PCR assay in
porcine diarrheic fecal samples according the infection type (single or mixed). By RT-PCR
and SN-PCR, 14 (87.5%) out of 16 diarrheic fecal samples evaluated were PoRV positives. In
5 (37.5%) fecal samples was identified only a single PoRV antigenic group and in the others 9
(64.3%) samples mixed infections, characterized by more than one PoRV group. The PoRV-C
was de PoRV group more frequent in single as in mixed infections being identified in 13
(81.2%) fecal samples. PoRV-A and PoRV-B were identified in 9 (56.2%) and 3 (18.7%)
fecal samples, respectively.
83
Table 1. Groups of porcine rotavirus (PoRV) identified by RT-PCR assay in a diarrhea outbreak in weaning piglets from Santa Catarina State, 2006.
Infection PoRV group detected Nº of samples (%)
Single A 1 (6.2)
B
C 4 (25.0)
Mixed A + B
A + C 6 (37.5)
B + C 1 (6.2)
A + B + C 2 (12.5)
Negative NA 2 (12.5)
Total 16 NA – not applicable
All the sows of the herd were regularly vaccinated against neonatal diarrhea with
commercial vaccine according manufacter’s instructions. The four wild-type PoRV-A isolated
in the porcine diarrhea outbreak sequenced in this study were classified as G4P[6] genotype.
This initial results indicated vaccinal fails once the vaccine used in the herd contemplates this
genotype of PoRV-A in your composition. However, the phylogenetic analysis revealed that
the G4P[6] genotype identified in the outbreak presented nucleotide identity of 88.7 to 89.3%
with G4P[6] strain of human origin (serotype P2A) and 79.7 to 80.1% with the Gottfried
strain of porcine origin (serotype P2B).
The emergence of a different PoRV-A genotype or new genetic variants of a specific
genotype or still the re-emergence of some genotypes that were previously controlled by
vaccine can occur or spread in the population in appropriate conditions (MATTHIJNSSENS
et al., 2009). The PoRV-A diarrhea outbreak in an regularly vaccinated pig herd, described in
84
this study, provides evidence of the appearance of the P[6] genotype with characteristics of
human strains (serotype P2A-like) in suckling piglets. This find suggests that the PoRV-A
vaccine strain (genotype G4P[6], serotype P2B, Gottfried strain) did not induce heterologous
immunity for the PoRV-A genotype G4P[6], serotype P2A-like, identified in this diarrhea
outbreak.
There are many studies that related the interspecies transmission and genetic
reassortment of RV-A P[6] genotype involving human and pigs, where strains detected in
human host can have porcine origin (MASCARENHAS et al., 2006; MASCARENHAS et al.,
2007ab; MARTELLA et al., 2008; BÁNYAI et al., 2009b; STUPKA et al., 2009) or where
porcine strains can have human origin (TEODOROFF et al., 2005; MARTELLA et al.,
2006). However, in the best knowledge of the authors, this is the first report of the diarrhea
outbreak in piglets caused by PoRV-A G4P[6] (serotype P2A-like) in a vaccinated pig herd.
The identification of enteric pathogens in the neonatal diarrhea in pig farms have been
conducted worldwide. However, the majority of the surveys evaluate only one pathogen
resulting in insufficient information about the frequency and severity of the diarrhea outbreak
caused by the concomitant infections with multiple enteropathogens (ALFIERI et al., 2006;
KATSUDA et al., 2006; JEONG et al., 2009). In addition, investigations concerning on
multiple infections in porcine enteritis were reported more than 10 years ago, describing the
diarrhea occurrence in animals from different pig farms, and are doubtful to reflect the current
epidemiologic situation (MORIN et al., 1983; HOEFLING, 1989; JOHNSON et al., 1992;
DRIESEN et al., 1993). In Brazil, the involvement of different RV groups in piglet enteritis
had been described in isolate diarrhea episodes among different pig farms, but not involved in
an outbreak in a vaccinated pig herd (MÉDICI et al., 2011). Considering the variety of enteric
pathogens that can be isolated in suckling piglets, the lack of recent multiple etiological
studies compromise the successful of preventive measures.
85
In spite of, previously major reports of diarrhea outbreaks had only described the
involvement of a single rotavirus group (MORIN et al., 1990; WIELER et al., 2001; PARRA
et al., 2008; JEONG et al., 2009), the present study describes the frequency detection of single
and mixed PoRV groups A, B, and C infections in a diarrhea outbreak in suckling piglets. The
high rates of morbidity and mortality observed in this outbreak can be, partly, justified for the
simultaneous occurrence of infections with three different antigenic groups of PoRV. Chang
et al. (1999) had describe the influence of bovine RV-A and RV-C dual infections involved in
neonatal diarrhea episodes in gnotobiotic calves, where intestinal lesions, as villous atrophy
lymphoid hyperplasia were generally more severe compared with single infection lesions.
The immunity given by rotaviruses, through natural infection or antigens present in
commercial vaccines, is predominantly homotypic, acting against homologous serotypes of
rotavirus infections which the animals were exposed previously (OLIVEIRA et al., 1994).
Therefore, rotavirus human and animal (porcine and bovine) vaccines are composed of
multiple genotypes. The immune pressure induced by mass vaccination could promote
reassortment, rearrangement, and zoonotic transmission between animal and human rotavirus
strains (MATTHIJNSSENS et al., 2009). Although the virus identified in this outbreak is a
G4P[6] genotype, it belongs to another serotype. Therefore, the vaccine did not provide cross
immunity and PoRV-A also had involved in the outbreak.
The present study allows concluding that the PoRV is an important etiological agent of
diarrhea outbreak in suckling piglets even in regularly vaccinated pig herds. In these
situations, for the elucidation of the etiology and also of the vaccine failures is decisive the
use of more sensitive diagnosis techniques; to include diagnosis systems for the PoRV-B and
PoRV-C; and also to provide the genotyping of the PoRV-A strains identified in the diarrhea
outbreak.
86
REFERENCES
ALFIERI, A.A.; LEITE, J.P.G.; ALFIERI, A.F.; JIANG, B.; GLASS, R.I.; GENTSCH, J.R. Detection of field isolates of human and animal group C rotavirus by reverse transcription-polymerase chain reaction and digoxigenin-labeled oligonucleotide probes. Journal of Virological Methods, v.83, p.35-43, 1999. ALFIERI, A.A.; PARAZZI, M.E.; TAKIUCHI, E.; MÉDICI, K.C.; ALFIERI, A.F. Frequency of group A rotavirus in diarrhoeic calves in Brazilian cattle herds, 1998-2002. Tropical Animal Health and Production, v.38, p.521-526, 2006. BÁNYAI, K.; ESONA, M.D.; KERIN, T.K.; HULL, J.J.; MIJATOVIC, S.; VÁSCONCEZ, N.; TORRES, C.; FILLIPIS, A.M.B.; FOYTICH, K.R.; GENTSCH, J.R. Molecular characterization of a rare, human-porcine reassortant rotavirus strain, G11P[6], from Ecuador. Archives of Virology, v.154, p.1823-1829, 2009a. BÁNYAI, K.; BOGDÁN, A.; DOMONKOS, G.; KISFALI, P.; MOLNÁR, P.; TÓTH, A.; MELEGH, B.; MARTELLA, V.; GENTSCH, J.R.; SZUCS, G. Genetic diversity and zoonotic potential of human rotavirus strains, 2003-2006, Hungary. Journal of Medical Virology, v.81, p.362-370, 2009b. BOOM, R.; SOL, C.J.; SALISMANS, M.M.; JANSEN, C.L.; WERTHEIM-VAN DILLEN, P.M.E.; VAN DENNOORDAA, J. Rapid and simple method for the purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology, v.28, p.495–503, 1990. BROWN, D.W.; BEARDS, G.M.; CHEN, G.M.; FLEWETT, T.H. Prevalence of antibody to group B (atypical) rotavirus in humans and animals. Journal of Clinical Microbiology, v.25, p.316-319, 1987. CHANG, K.O.; NIELSEN, P.R.; WARD, L.A.; SAIF, L.J. Dual infection of gnotobiotic calves with bovine strains of group A and porcine-like group C rotaviruses influences pathogenesis of the group C rotavirus. Journal of Virology, v.73, p.9284-9293, 1999. COLLINS, P.J.; MARTELLA, V.; SLEATOR, R.D.; FANNING, S.; O’SHEA, H. Detection and characterisation of group A rotavirus in asymptomatic piglets in southern Ireland. Archives of Virology, v.155, p.1247–1259, 2010. DAS, B.K.; GENTSCH, J.R.; CICIRELLO, H. G.; WOODS, P. A.; GUPTA, A.; RAMACHANDRAN, M.; KUMAR, R.; BHAN, M.K.; GLASS, R.I. Characterization of rotavirus strains from newborns in New Delhi, India. Journal of Clinical Microbiology, v.32, p.1820-1822, 1994. DRIESEN, S.J.; CARLAND, P.G.; FAHY, V.A. Studies on preweaning piglet diarrhoea. Australian Veterinary Journal, v.70, p.259–262, 1993. ESTES, M.K.; KAPIKIAN, A.Z. Rotaviruses. In: KNIPE, D.M.; GRIFFIN, D.E.; LAMB, R.A.; STRAUS, S.E.; HOWLEY, P.M.; MARTIN, M.A.; ROIZMAN, B. (Eds.). Fields Virology, fifth edition. LippincottWilliams & Wilkins, Philadelphia, PA, p.1917–1974, 2007.
87
GARCIA, A.M.; LIMA, J.D. Prevalência de Cryptosporidium spp. em rebanhos leiteiros de Pará de Minas (MG) e sua relação com práticas de manejo. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.3, p.23-28, 1994. GENTSCH, J.R.; GLASS, R.I.; WOODS, P.; GOUVEA, V.; GORZIGLIA, M.; FLORES, J.; DAS, B.K.; BHAN, M.K. Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, v.30, p.1365-1373, 1992. GOUVEIA, V.; GLASS, R.I.; WOODS, P.; TANIGUCHI, K.; CLARK, H.; FORRESTER, B.; FANG, Z.Y. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens. Journal of Clinical Microbiology, v.28, p.276-282, 1990. GOUVEA, V.; ALLEN, J.R.; GLASS, R.I.; FANG, Z.Y.; BREMONT, M.; COHEN, J.; McCRAE, M.A.; SAIF, L.J.; SINARACHATANANT, P.; CAUL, O. Detection of group B and C rotaviruses by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, v.29, p.519-523, 1991. HALAIHEL, N.; MASÍA, R.M.; FERNÁNDEZ-JIMÉNEZ, M.; RIBES, J.M.; MONTAVA, R.; DE BLAS, I.; GIRONÉS, O.; ALONSO, J.L.; BUESA, J. Enteric calicivirus and rotavirus infections in domestic pigs. Epidemiology and Infection, v.138, p.542–548, 2010. HENRIKSEN, S.A.; CHRISTENSEN, J.P.B. Demonstration of Isospora suis oocysts in faecal samples. Veterinary Record, v.131, p.443–444, 1992. HENRIKSEN, S.A. and POHLENZ, J.F.L. Staining of cryptosporidia by modified Ziehl – Nieelsen technique. Acta Veterinaria Scandinavica, v.22, p.594-596, 1981. HERRING, A.J.; INGLIS, N.F.; OJEH, C.K.; SNODGRASS, D.R.; MENZIES, J.D. Rapid diagnosis of rotavirus infection by direct detection of viral nucleic acid in silver-stained polyacrylamide gels. Journal of Clinical Microbiology, v.16, p.473-477, 1982. HOEFLING, D. Tracking the culprits behind diarrhea in neonatal pigs. Veterinary Medicine, v.84, p.427, 1989. HOLLAND, R.E. Some infectious causes of diarrhea in young farm animals. Clinical Microbiology Reviews, v.3, p.345–375, 1990. JEONG, Y.; PARK, S.; HOSMILLO, M.; SHIN, D.; CHUN, Y.; KIM, H.; KWON, H.; KANG, S.; WOO, S.; PARK, S.; KIM, G.; KANG, M.; CHO, K. Detection and molecular characterization of porcine group C rotaviruses in South Korea. Veterinary Microbiology, v.138, p.217-24, 2009. JOHNSON, M.W.; FITZGERALD, G.R.; WELTER, M.W.; WELTER, C.J. The six most common pathogens responsible for diarrhea in newborn pigs. Veterinary Medicine, v.4, p.382–386, 1992. KATSUDA, K.; KOHMOTO, M.; KAWASHIMA, K.; TSUNEMITSU, H. Frequency of enteropathogen detection in suckling and weaned pigs with diarrhea in Japan. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.18, p. 350-354, 2006.
88
LINARES, R.C.; BARRY, A.F.; ALFIERI, A.F.; MÉDICI, K.C.; FERONATO, C.; GRIEDER, W.; ALFIERI, A.A. Frequency of group A rotavirus in piglet stool samples from non-vaccinated Brazilian pig herds. Brazilian Archives of Biology and Technology, v.52, p.63–68, 2009. MARTELLA, V.; COLOMBRITA, D.; LORUSSO, E.; DRAGHIN, E.; FIORENTINI, S.; DE GRAZIA, S.; BÁNYAI, K.; CIARLET, M.; CARUSO, A.; BUONAVOGLIA, C. Detection of a porcine-like rotavirus in a child with enteritis in Italy. Journal of Clinical Virology, v.46, p.3501-3507, 2008. MARTELLA, V.; BÁNYAI, K.; LORUSSO, E.; BELLACICCO, A.L.; DECARO, N.; CAMERO, M.; BOZZO, G.; MOSCHIDOU, P.; ARISTA, S.; PEZZOTTI, G.; LAVAZZA, A.; BUONAVOGLIA, C. Prevalence of group C rotaviruses in weaning and post-weaning pigs with enteritis. Veterinary Microbiology, v.123, p.26-33, 2007. MARTELLA, V.; BÁNYAI, K.; CIARLET, M.; ITURRIZA-GOMARA, M.; LORUSSO, E.; DE GRAZIA, S.; ARISTA, S.; DECARO, N.; ELIA, G.; CAVALLI, A.; CORRENTE, M.; LAVAZZA, A.; BASELGA, R.; BUONAVOGLIA, C. Relationships among porcine and human P[6] rotaviruses: evidence that the different human P[6] lineages have originated from multiple interspecies transmission events. Virology, v.344, p.509-519, 2006. MARTINEAU, G.P.; DEL CASTILLO, J. Epidemiological, clinical and control investigations on field porcine coccidiosis: clinical, epidemiological and parasitological paradigms. Parasitology Research, v.86, p.834–837, 2000. MARTINS, M.F.; MARTINEZ-ROSSIB, N.M., FERREIRA, A.; BROCCHIC, M.; YANOD, T.; CASTRO, A.F.P.; SILVEIRA, W.D. Pathogenic characteristics of Escherichia coli strains isolated from newborn piglets with diarrhea in Brazil. Veterinary Microbiology, v.76, p.51-59, 2000. MASCARENHAS, J.D.P.; LEITE, J.P.G.; LIMA, J.C.; HEINEMANN, M.B.; OLIVEIRA, D.S.; ARAÚJO, I.T.; SOARES, L.S.; GUSMÃO, R.H.P.; GABBAY, Y.B.; LINHARES, A.C. Detection of a neonatal human rotavirus strain with VP4 and NSP4 genes of porcine origin. Journal of Medical Microbiology, v.56, p.524-532, 2007a. MASCARENHAS, J.D.P.; LINHARES, A.C.; GABBAY, Y.B.; LIMA, C.S.; GUERRA, S.F.S.; SOARES, L.S.; OLIVEIRA, D.S.; LIMA, J.C.; MACÊDO, O.; LEITE, J.P.G. Molecular characterization of VP4 and NSP4 genes from rotavirus strains infecting neonates and Young children in Belém, Brazil. Virus Research, v.126, p.149-158, 2007b. MASCARENHAS, J.D.P.; LINHARES, A.C.; BAYMA, A.P.G.; LIMA, J.C.; SOUSA, M.S.; ARAÚJO, I.T.; HEINEMANN, M.B.; GUSMÃO, R.H.P.; GABBAY, Y.B.; LEITE, J.P.G. Molecular analysis of VP4, VP7, and NSP4 genes of P[6]G2 rotavirus genotype strains recovered from neonates admitted to hospital in Belém, Brazilian Journal of Medical Virology, v.78, p.281-289, 2006. MATTHIJNSSENS, J.; BILCKE, J.; CIARLET, M.; MARTELLA, V.; BÁNYAI, K.; RAHMAN, M.; ZELLER, M.; BEUTELS, P.; DAMME, P.V.; RANST, M.V. Rotavirus disease and vaccination: impact on genotype diversity. Future Microbiology, v.4, 1303–1316, 2009.
89
MÉDICI, K.C.; BARRY, A.; ALFIERI, F.A.; ALFIERI, A.A. Porcine rotavirus groups A, B, and C identified by polymerase chain reaction in a fecal sample collection with inconclusive results by polyacrylamide gel electrophoresis. Journal of Swine Health and Production, v.19, p.146-150, 2011. MÉDICI, K.C.; BARRY, A.; ALFIERI, A.F.; ALFIERI, A.A. VP6 gene diversity in Brazilian strains of porcine group C rotavirus. Genetics and Molecular Research, v.9, p.506-513, 2010. MEYER, C.; JOACHIM, A.; DAUGSCHIES, A. Occurrence of Isospora suis in larger piglet production units and on specialized piglet rearing farms. Veterinary Parasitology, v.82, p.277–284, 1999. MORIN, M.; MAGAR, R.; ROBINSON, Y. Porcine group C rotavirus as a cause of neonatal diarrhea in a Quebec swine herd. Canadian Journal of Veterinary Research, v.54, p.385-389, 1990. MORIN, M.; TURGEON, D; JOLETTE, J.; ROBINSON, Y.; PHANEUF, J.B.; SAUVAGEAU, R.; BEAUREGARD, M.; TEUSCHER, E.; HIGGINS, R.; LARIVÌERE, S. Neonatal diarrhea of pigs in Quebec: infectious causes of significant outbreaks. Canadian Journal of Comparative Medicine, v.47, p.11–17, 1983. MOXLEY, R.A.; DUHAMEL, G.E. Comparative pathology of bacterial enteric diseases of swine. Advances in Experimental Medicine and Biology, v.473, p.83–101, 1999. OLIVEIRA, C.S.; LINHARES, A.C.; BELLESI, N.; MASCARENHAS, J.D.; FREITAS, R.B.; GABBAY, Y.B.; MONTEIRO, T.F. Tripla infeccao por rotavirus em uma crianca de Belem, Pará. Jornal de Pediatria (Rio), v.70, p.240-242, 1994. PARRA, G.I.; VIDALES, G.; GOMEZ, J.A.; FERNANDEZ, F.M.; PARREÑO, V.; BOK, K. Phylogenetic analysis of porcine rotavirus in Argentina: increasing diversity of G4 strains and evidence of interspecies transmission. Veterinary Microbiology, v.126, p.243–250, 2008. PEREIRA, H.G., AZEREDO, R.S., LEITE, J.P., BARTH, O.M., SUTMOLLER, F., DE FARIAS, V.; VIDAL, M.N.. Comparison of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), immuno-electron microscopy (IEM) and enzyme immunoassay (EIA) for the rapid diagnosis of rotavirus infection in children. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.78, p.483–490, 1983. SAIF, L.J. Comparative pathogenesis of enteric viral infections of swine. Advances in Experimental Medicine and Biology, v.473, p.47–59, 1999. SAIF, L.J.; JIANG, B. Nongroup A rotavirus of humans and animals. Current Topics in Microbiology and Immunology, v.185, p. 330-371, 1994. SAMBROOK, J.; RUSSELL, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001. SHEATER, S.E. The detection of intestinal protozoa and mange parasites by flotation technique. Journal of Comparative Pathology, v.36, p.266-275, 1923.
90
SNODGRASS, D.R.; TERZOLO, H.R.; SHERWOOD, D.; CAMPBELL, L.; MENZIES J.D.; SYNGE, B.A. Aetiology of diarrhoea in young calves. Veterinary Record, v.119, p.31-34, 1986. STUPKA, J.A.; CARVALHO, P.; AMARILLA, A.A.; MASSANA, M.; PARRA, G.I. National Rotavirus Surveillance in Argentina: High incidence of G9P[8] strains and detection of G4P[6] strains with porcine characteristics. Infectious, Genetic and Evolution, v.9, p.1225-1231, 2009. TEODOROFF, T.A.; TSUNEMITSU, H.; OKAMOTO, K.; KATSUDA, K.; KOHMOTO, M.; KAWASHIMA, K.; NAKAGOMI, T.; NAKAGOMI, O. Predominance of Porcine Rotavirus G9 in Japanese Piglets with Diarrhea: Close Relationship of their VP7 Genes with those of Recent Human G9 Strains. Journal of Clinical Microbiology, v.43, p.1377-1384, 2005. TERRETT, L.A.; SAIF, L.A.; THEIL, K.W.; KOHLER, E.M. Physicochemical characterization of porcine pararotavirus and detection of virus and viral antibodies using cell culture immunofluorescence. Journal of Clinical Microbiology, v.25, p.268-272, 1987. VU-KHAC, H.; HOLODA, E.; PILIPCINEC, E. Distribution of virulence genes in Escherichia coli strains isolated from diarrhoeic piglets in the Slovak Republic. Journal of Veterinary Medicine B: Infectious Diseases and Veterinary Public Health, v.51, p.343–347, 2004. XU, L.; HARBOUR, D.; MCCRAE, M.A. The application of polymerase chain reaction to the detection of rotaviruses in faeces. Journal of Virological Methods, v.27, p.29–37, 1990. WIELER, L.H.; ILIEFF, A.; HERBST, W.; BAUER, C.; VIELER, E.; BAUERFEIND, R.; FAILING, K.; KLÖS, H.; WENGERT, D.; BALJER, G.; ZAHNER, H. Prevalence of enteropathogens in suckling and weaned piglets with diarrhoea in Southern Germany. Journal of Veterinary Medicine B: Infectious Disease Veterinary Public Health, v.48, p.151–159, 2001. WORLICZEK, H.L.; GERNER, W.; JOACHIM, A.; MUNDT, H.C.; SAALMÜLLER, A. Porcine coccidiosis – Investigations on the cellular immune response against Isospora suis. Parasitology Research, v.105, p.151-155, 2009.
91
4. CONCLUSÕES
92
4. CONCLUSÕES
Com base na análise do gene VP6, as estirpes de PoRV-C identificadas em rebanhos
suinícolas de cinco estados brasileiros apresentaram extensa variabilidade genética
sendo as linhagens de origem suína agrupadas em três distintos clusters;
Em surtos de diarreia neonatal em rebanhos regularmente vacinados contra o PoRV-A,
para a identificação da causa da falha vacinal, é importante caracterizar os genotipos G
(VP7) e P (VP4) das estirpes de PoRV-A identificadas;
Para o diagnóstico da etiologia viral de surtos de diarreia neonatal em rebanhos suínos
regularmente vacinados contra o PoRV-A é importante incluir técnicas de diagnóstico
que, além da identificação do PoRV-A, identifiquem também infecções ocasionadas
pelo PoRV-B e PoRV-C;
Em algumas situações específicas, como aquelas representadas por diarreia neonatal
em rebanhos suinícolas regularmente vacinados contra o PoRV-A, o PoRV-C é um
importante agente etiológico, atuando tanto em infecções singulares quanto,
principalmente, mistas incluindo o PoRV-A e o PoRV-B.
93
ANEXOS
94
ANEXO A: Lista de Reagentes
1. 100 mM dNTP Set, 4 x 250 sL; 25 smol cada (100 mM dATP Solution, 100 mM dCTP
Solution, 100 mM dGTP Solution, 100 mM dTTP Solution) (InvitrogenTM Life
Technologies, EUA)
2. 10 x PCR-Buffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KCl) (InvitrogenTM Life
Technologies, EUA)
3. 123 bp DNA Ladder (InvitrogenTM Life Technologies, EUA)
4. 2-Mercaptoetanol (C2H6O5) P.M. 78,13 (Fluka®)
5. Acetona, P.A. (CH3COCH3) P.M. 58,08 (Dinâmica®)
6. Ácido acético glacial, P.A. (CH3COOH) P.M. 60,05 (Nuclear®)
7. Ácido bórico (H3BO3) P.M. 61,83 (Reagen®)
8. Ácido clorídrico (HCl) P.M. 36,46 (Reagen®)
9. Ácido etilenodiaminotetraácido Sal di-sódico – EDTA, P.A. (C10H14N2O8Na22H2O) P.M.
372,24 (Reagen®)
10. Acrilamida P.M. 71,08 (Gibco BRL®)
11. Agar Noble (Difco®)
12. Agarose (Gibco® BRL)
13. Álcool etílico absoluto (C2H2OH) P.M. 46,07 (Nuclear®)
14. Álcool isoamílico (CH3)2CHCH2CH2OH) P.M. 88,15 (Synth®)
15. Azul de bromofenol (Sigma®, EUA)
16. Bicarbonato de sódio P.A.(NaHCO3) P.M. 84,01 (Biotec®)
17. Bis-acrilamida P.M. 154,2 (Sigma®, EUA)
18. Borohidreto de sodio P.M. 37,83 (Sigma®, EUA)
19. Brometo de etídeo (C21H20N3Br) P.M. 394,3 (Sigma®, EUA)
20. Cloreto de Calcio Puro (CaCl2) P.M. 110,94 (InvitrogenTM Life Technologies, EUA)
21. Cloreto de potássio, P.A. (KCl) P.M. 74,56 (Reagen®)
22. Cloreto de sódio, P.A. (NaCl) P.M. 58,45 (Reagen®)
23. Clorofórmio, P.A. (CHCl3) P.M. 119,38 (Dinâmica®)
24. Dióxido de silica (SiO2) P.M. 60,08 (SigmaR, EUA)
25. Dodecil Sulfato de Sódio - Lauril Sulfato de Sodio - SDS (C12H25NaO4S) P.M. 288,38
(BHD)
26. Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4) P.M. 141,96 (Synth®)
95
27. Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4 H2O) P.M. 137,99 (Reagen®)
28. Glicina, P.A. (Nuclear®)
29. Glicose (Reagen®)
30. Hidróxido de sodio P.A. (NaOH) P.M. 40,00 (Mallinckrodt Chemicals®)
31. Hidroximetil amino metano - TRIS 99% P.M. 121,14 (Merck)
32. Isotiocianato de guanidina P.M. 118,16 (InvitrogenTM Life Technologies, EUA)
33. Metanol, P.A. (CH3OH) P.M. 32,04 (Allkimia®)
34. Platinum Taq DNA Polymerase recombinant 500 unidades (InvitrogenTM Life
Technologies, BRA)
35. REACT® 2 (500 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 500 mM NaCl) (Invitrogen Life
TechnologiesTM)
36. Sacarose, P.A. – sucrose (C12H22O11) P.M. 342,3 (Reagen®)
37. Superscript TM II RNase H - Reverse Transcriptase – 200 unidades/L (InvitrogenTM Life
Technologies, EUA)
38. Triton 100 (J.T.Baker®)
96
ANEXO B: Soluções e Tampões
Hidratação da sílica
- 60 g de sílica
- Adicionar 500 mL de água MilliQ autoclavada
- Agitar lentamente e manter em repouso durante 24 h
- Por sucção, desprezar 430 mL do sobrenadante
- Ressuspender a sílica em 500 mL de água bidestilada
- Manter em repouso durante 5 h para sedimentar
- Desprezar 440 mL do sobrenadante
- Adicionar 600 L de HCl (32% w/v) para ajustar o pH (pH=2,0)
- Aliquotar e autoclavar
Solução L6
- 120 g de tiocianato de guanidina (GUSCN)
- 100 mL de TRIS-HCl 0,1 M pH 6,4
- 22 mL de EDTA 0,2 M pH 8,0
- 2,6 g de Triton x 100
Solução L2
- 120 g de tiocianato de guanidina (GUSCN)
- 100 mL de TRIS-HCl 0,1 M pH 6,4
Tampão de amostra para eletroforese em gel de agarose
- Azul de bromofenol 0,25%
- Sacarose – sucrose (C12H22O11) 45%
- Água MilliQ q.s.p. 100 mL
Tampão de amostra para eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)
- 0,2 mL azul de bromofenol 1%
- 6,0 mL SDS 10%
- 1 mL 2-mercaptoetanol
- 2,5 mL de TRIS-HCL 0,5M
97
- 6 g uréia
- Água MilliQ q.s.p. 20 mL
Tampão de corrida para gel de agarose TBE (TRIS – Ácido bórico – EDTA) 10 x [ ]
- 107,78 g TRIS (0,89 M)
- 55,03 g de acido borico (0,89 M)
- 7,45 g de EDTA (0,02 M)
- Água bidestilada q.s.p. 1 L
Tampão de corrida para PAGE
- 30 g TRIS (0,24 M)
- 14,4 g de acido aminoacético (glicina) (NH2CH2COOH) (0,19M)
- Água MilliQ q.s.p. 1L
Tampão de estabilização para o rotavírus (TRIS/Ca++ 10 x) – pH 7,2
- 12,12 g TRIS (0,89mM)
- 2,2 g cloreto de calcio (1,5mM)
- Água MilliQ autoclavada q.s.p. 1L
Fenol / clorofórmio – álcool isoamílico
- 25 mL fenol saturado
- 24 mL clorofórmio
- 1 mL álcool isoamílico
SDS 10%
- 5 g dodecilsulfato de sódio – Lauril sulfato de sódio – SDS (C12H25NaO4S)
- Água MilliQ autoclavada q.s.p. 50 mL
Lower TRIS pH 8,8 para PAGE
- 36,34 g TRIS (1,5M)
- Água MilliQ q.s.p. 200 mL
98
Upper TRIS pH 6,8 para PAGE
- 12,12 g TRIS (0,5M)
- Água MilliQ q.s.p 200 mL
Solução Acrilamida / Bisacrilamida
- 1,3 g bisacrilamida
- 50 g acrilamida
- Água MilliQ q.s.p 100 mL
Solução fixadora para PAGE
- 30 mL álcool etílico absoluto
- 1,5 mL acido acético
- Água MilliQ q.s.p. 300 mL
Solução de prata para PAGE
- 0,55 g de nitrato de prata
- Água MilliQ q.s.p. 300 mL
Solução reveladora para PAGE
- 9 g hidróxido de sodio
- 2,5 mL formaldeido
- 0,06 g borohidreto de sódio
- Água MilliQ q.s.p. 300 mL
Solução stop da coloração para PAGE
- 15 mL ácido acético P.A.
- Água MilliQ q.s.p. 300 mL
Solução conservadora para PAGE
- 15 mL álcool etílico P.A.
- Água MilliQ q.s.p. 300 mL
99
Gel inferior (7,5%) da PAGE
- 5 mL Lower TRIS
- 3 mL acrilamida/Bisacrilamida
- 50 µL TEMED
- 0,56 mL persulfato de amônio 2%
- 11,44 mL água bidestilada
Gel superior (3,5%) da PAGE
- 2,5 mL Upper TRIS
- 0,7 mL acrilamida/bisacrilamida
- 50 µL TEMED
- 0,60 mL persulfato de amônio 2%
- 6,20 mL água bidestilada
Gel de agarose 2%
- 1 g agarose
- 50 mL de tampao TEB 1x
- 30 µL de brometo de etídio
Diluição de dNTP
- solução estoque - concentração 100 mM - 100 µL de cada dNTP
- solução uso - concentração 10 mM - 10 µL da solução estoque + 90 µL de água MilliQ autoclavada
100
ANEXO C: Protocolo de Técnicas
Suspensão fecal – Extração bruta
- Pesar 1g do material fecal em balança de precisão
- Adicionar 9 mL de tampão TRIS/Ca++ 1x (para amostra liquidas estabelecer a
proporção 1:2)
- Homogeneizar
- Calibrar os tubos
- Centrifugar 2.000 x g / 5 min.
- Recolher sobrenadante
- Identificar e estocar em frascos a 4º C
Extração do RNA: Associação das técnicas fenol/clorofórmio – álcool isoamílico e
sílica / isotiocianato de guanidina
- Aliquotar 500 L da suspensão fecal
- Adicionar 50 µL de SDS 10%
- Homogeneizar em vórtex
- Banho-maria a 56o C durante 20 min.
- Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s.
- Adicionar 500 L de fenol / clorofórmio – álcool isoamílico (25:24:1)
- Homogeneizar em vórtex
- Banho-maria a 56o C durante 15 min.
- Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min.
- Recolher sobrenadante em outro tubo
- Adicionar 900 L de solução L6
- Adicionar 25 L de sílica hidratada
- Homogeneizar em vórtex
- Agitar durante 30 min. à temperatura ambiente
- Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s.
- Desprezar sobrenadante em solução contendo NaOH 10M
- Adicionar 500 L de solução L2
- Homogeneizar em vórtex
- Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s.
101
- Desprezar sobrenadante em solução contendo NaOH 10M
- Adicionar 500 L de solução L2
- Homogeneizar em vórtex
- Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s.
- Desprezar sobrenadante em solução contendo NaOH 10M
- Adicionar 1 mL de etanol a 70%
- Homogeneizar em vórtex
- Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s.
- Desprezar sobrenadante
- Adicionar 1 mL de etanol a 70%
- Homogeneizar em vórtex
- Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s.
- Desprezar sobrenadante
- Adicionar 1 mL de acetona PA
- Homogeneizar em vórtex
- Centrifugar a 10.000 g durante 1 min.
- Desprezar sobrenadante
- Secar o pellet em termo-bloco à 60oC (aproximadamente 2 min.) ou banho-maria à 56 oC
(15 min.)
- Adicionar 50 L de água DEPEC
- Homogeneizar em vórtex
- Banho-maria à 56o C durante 15 min.
- Homogeneizar em vórtex
- Centrifugar a 10.000 x g durante 2 min.
- Recolher sobrenadante em eppendorfs de 500 µL
- Estocar a -20ºC
102
Quadro 1. Primers – amplificação dos genes VP4 e VP7 (PoRV-A), NSP2 (PoRV-B) e VP6 (PoRV-C).
RV
Group
(gene)
Primer Sequence Position/Polar Product Referenc
e
A (VP7) Beg9 5´ggc ttt aaa aga gag aat ttc cgt ctg g 3´ 1-28 (+) 1062 bp (1)
End9 5´ggt cac atc ata caa ttc taa tct aag 3´ 1062-1036 (-) (1)
End9 (UK) 5´ggt cac atc atc aaa ctc taa tct 3´ 1059-1036 (-) (2)
End9 (CRW8) 5´ggt cac atc tta cag ctt taa cct 3´ 1059-1036 (-) (2)
A (VP4)
B (NSP2)
C (VP6)
Con3 5´tgg ctt cgc tca ttt ata gac a 3´ 11-32 (+) 877 bp
434 bp
270 bp
(3)
Con2 5´att tcg gac cat tta taa cc 3´ 868-887 (-)
B1
B3
B4
5´cta ttc agt gtg tcg tga gag g 3´
5´cga agc ggg cta gct tgt ctg c 3´
5´cgt ggc ttt gga aaa ttc ttg 3´
18-42 (+)
451-473 (-)
506-527 (-)
(4)
BMJ41
BMJ42
5´ggc ttt aaa aat ctc att ca 3´
5´cct cta gtt gat tga aça ta 3´
1-20 (+)
251-270 (-)
(5)
C (VP6) modBMJ41
BJB
5´ggc ttt aaa aat ctc att cac aa 3´
5´agc cac ata gtt cac att tca 3´
1-23 (+)
1333 – 1353 (-)
1353 bp
(1) GOUVEA et al., 1990; (2) GOUVEA et al., 1993; (3) GENTSCH et al, 1992; (4) DAS et al., 1994; (5) ALFIERI et al., 1999.
RT-PCR P consensual para o rotavírus grupo A
- Mix Desnaturação P tipo
con 2 (20 pmol) - 1 µL
con 3 (20 pmol) - 1 µL
Água - 3 µL
Volume final - 5 µL
- Mix Desnaturação G tipo
Beg9 (20 pmol) - 1 µL
End9 (20 pmol) - 1 µL
End9 (UK) (20 pmol) - 1 µL
End9 (CRW8) (20 pmol) - 1 µL
Água - 1 µL
103
Volume final - 5 µL
- Mix Transcrição Reversa (RT-MIX)
Tampão 10 x pH 8,4 - 2,5 µL
MgCl2 50 mM - 2,5 µL
dNTP 2,5 mM - 4,0µL
SuperScript HII® 200U/µL – 0,15µL Água - 5,85 µL
Volume final - 15 µL
- Mix Reação da Polimerase em Cadeia para P e G tipo (PCR-MIX)
Tampão 10 x pH 8,4 - 2,5 µL
dNTP 2,5 mM - 4,0µL
Platinun®Taq DNA Polymerase 5U/µL – 0,25 µL
Primer con 2 (20 pmol) – 1 µL
Primer con 3 (20 pmol) – 1 µL
Água - 16,25 µL
Volume final - 25 µL
Mix Reação da Polimerase em Cadeia para G tipo (PCR-MIX)
Tampão 10 x pH 8,4 - 2,5 µL
dNTP 2,5 mM - 4,0µL
Platinun®Taq DNA Polymerase 5U/µL – 0,25 µL
Água - 18,25 µL
Volume final - 25 µL
104
Esquema da RT-PCR para genotipo P
5l Mix desnaturação G 5l Mix desnaturação P
5 l do RNA extraido 5 l do RNA extraido
97°C / 5 min 97°C / 5 min
5 min banho gelo 5 min banho gelo
adicionar 15 L de RT-MIX adicionar 15 L de RT-MIX
42ºC / 30 min 42ºC / 30 min
adicionar 25 L de PCR MIX para G adicionar 25 L de PCR MIX para P
Ciclos:
1 ciclo (94ºC / 3 min)
40 ciclos (94ºC /45 s; 45ºC / 45 s e 72ºC / 1 min).
Extensão final 72ºC / 10 min.
50 L de amplicon G 50 L de amplicon P
RT-PCR e SN-PCR para o rotavírus grupo B
a) RT-PCR
- Mix Desnaturação
B1 (20 pmol) - 1 µL
B4 (20 pmol) - 1 µL
Água - 3 µL
Volume final - 5 µL
105
- Mix Transcrição Reversa (RT-MIX)
Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L
MgCl2 50 mM– 2,5 L
dNTP 2,5mM– 4µL
SuperScript HII RT 200U/L – 0,15 L
Água – 5,85 L
Volume final - 15 µL
- Mix Reação da Polimerase em Cadeia (PCR-MIX)
Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L
dNTP 2,5mM– 4µL
Platinun®Taq DNA Polymerase 5U/µL – 0,25 µL
Água – 18,25 L
Volume final - 25 µL
b) SN-PCR
- Mix Desnaturação
B1 (20 pmol) - 1 µL
B3 (20 pmol) - 1 µL
Água - 3 µL
Volume final - 5 µL
- Mix Semi Nested-PCR
Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L
MgCl2 50 mM– 2 L
dNTP 2,5mM– 4 µL
Platinun®Taq DNA Polymerase 5U/µL – 0,25 µL
Água – 11,25 L
Volume final - 20 µL
106
Esquema da Semi nested-PCR para o rotavírus grupo B
5L RNA extraido 5L Mix desnaturação 97ºC / 5 min banho de gelo / 5 min adicionar 15 L do RT mix
42ºC / 30 min
adicionar 25 L do PCR Mix
Ciclos: 94ºC / 3 min.
40 ciclos (94ºC / 45 s, 45ºC / 45 s, 72ºC / 1 min)
extensão final a 72ºC /10 min
Volume final 50 L de amplicon PCR Semi nested-PCR
5 L amplicon PCR 5 L Mix desnaturação Semi nested-PCR
97ºC/5 min
20 L Mix seminested PCR
Ciclos:
94ºC / 3 min
30 ciclos (94ºC/45 s; 45ºC /45 s; 72 ºC/1 min
extensão final 72ºC/10 min
Volume final 30 L de amplicon seminested PCR
107
RT-PCR para o rotavírus grupo C (270 pb)
- Mix Desnaturação
BMJ41 (20 pmol) - 1 µL
BMJ42 (20 pmol) - 1 µL
Água - 3 µL
Volume final - 5 µL
- Mix Transcrição Reversa (RT-MIX)
Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L
MgCl2 50 mM– 2,5 L
dNTP 2,5mM– 4µL
SuperScript HII RT 200U/L – 0,15 L
Água – 5,85 L
Volume final - 15 µL
- Mix Reação da Polimerase em Cadeia (PCR-MIX)
Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L
dNTP 2,5mM– 4µL
Platinun®Taq DNA Polymerase 5U/µL – 0,25 µL
Água – 18,25 L
Volume final - 25 µL
108
Esquema para a RT-PCR do rotavírus grupo C (270 pb)
5 L RNA extraido
5 L Desnaturação Mix
97ºC / 5 min
adicionar 15 L do Mix RTPCR
42ºC / 30 min
adicionar 25 L do Mix PCR
Ciclos:
3 ciclos ( 94ºC / 1 min; 40ºC / 2 min; 69ºC / 8 min)
30 ciclos (94ºC / 1 min; 40 ºC / 2 min; 72ºC / 3 min)
extensão final 72ºC / 7 min.
Volume final 50 L de amplicon
RT-PCR para o rotavírus grupo C (1353 pb)
- Mix Desnaturação
modBMJ41 (20 pmol) - 1 µL
BJB (20 pmol) - 1 µL
Água - 3 µL
Volume final - 5 µL
- Mix Transcrição Reversa (RT-MIX)
Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L
MgCl2 50 mM– 2,5 L
dNTP 2,5mM– 4µL
SuperScript HII RT 200U/L – 0,15 L
Água – 5,85 L
Volume final - 15 µL
109
- Mix Reação da Polimerase em Cadeia (PCR-MIX)
Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L
dNTP 2,5mM– 4µL
Platinun®Taq DNA Polymerase 5U/µL – 0,25 µL
Água – 18,25 L
Volume final - 25 µL
Esquema para a RT-PCR do rotavírus grupo C (1353 pb)
5 L RNA extraído
5 L Desnaturação Mix
97ºC / 4 min
adicionar 15 L do Mix RTPCR
42ºC / 30 min
adicionar 25 L do Mix PCR
Ciclos:
94ºC / 2 min
35 ciclos (94ºC / 1 min; 55 ºC / 1 min; 72ºC / 1 min)
extensão final 72ºC / 7 min.
Volume final 50 L de amplicon