Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de … · Dificuldade de entender como comunidades fúngicas interagem no interior da planta Wagner & Lewis, 2003 ... seqüências

TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA

LGN 5799 LGN 5799 -- SEMINSEMINÁÁRIOS EM GENRIOS EM GENÉÉTICA TICA E MELHORAMENTO DE PLANTASE MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de PPrograma de Póóss--GraduaGraduaçção em ão em GenGenéética e Melhoramento de Plantastica e Melhoramento de Plantas

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

Aline Silva RomãoAline Silva Romão

Orientador: Dr. Welington Luiz de AraOrientador: Dr. Welington Luiz de Araúújojo

ANANÁÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA LISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DURANTE A INTERADURANTE A INTERAÇÇÃO FUNGOÃO FUNGO--PLANTAPLANTA


Interações Fungo-PlantaInterações Fungo-Planta

PatPatóógenosgenos

MutualistasMutualistas

• fungos biotróficos

• fungos hemibiotróficos

• fungos necrotróficos

• fungos endofíticos

• fungos epifíticos

• fungos micorrízicos

• fungos da rizosfera

endófitoendófito

patógenopatógeno

epifíticoepifítico

micorrizamicorriza


Dificuldade de entender como comunidades Dificuldade de entender como comunidades ffúúngicasngicas interagem no interior da plantainteragem no interior da planta

Wagner & Lewis, 2003

Interações Fungo-PlantaInterações Fungo-Planta


Análise da Expressão GênicaAnálise da Expressão Gênica

• Estudo de genes específicos

- Nothern-blot

- RT-PCR (Reverse Transcription – PCR)

- PCR quantitativo (qPCR)

• Estudo do transcriptoma

AbordagensAbordagens


Hospedeiro Microrganismo

Transcriptoma da Interação

Birch & Kamoun, 2000

Genes induzidos

Genes reprimidos

Genes com expressão constitutiva

Genes não expressos na interação

Transcriptoma da InteraçãoTranscriptoma da Interação


Transcriptoma da InteraçãoTranscriptoma da Interação

Métodos de análise da expressão gênica diferencial

Hospedeiro Interação Fungo

modificado de Birch & Kamoun, 2000


Análise da Expressão Gênicaem Larga Escala

Análise da Expressão Gênicaem Larga Escala

Base do mBase do méétodotodo

•• SAGESAGE•• MPSSMPSS•• ORESTESORESTES

•• ESTsESTs

•• cDNAcDNA--AFLPAFLP•• DifferentialDifferential Display Display •• HibridizaHibridizaçção Subtrativa ão Subtrativa Supressiva Supressiva •• RDARDA

•• MacroarranjosMacroarranjos de de cDNAcDNA•• OligoOligo--microarranjosmicroarranjos•• MicroarranjosMicroarranjos de de cDNAcDNA•• HibridizaHibridizaçção Subtrativaão Subtrativa

SeqSeqüüenciamentoenciamentoPCRPCRHibridizaHibridizaççãoão

Diversas metodologias disponíveis

limitações específicas e plataforma de dados distintas


399

74

746

9

485

824

3637

116

1821

794

2802

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

cDNA-m

icroarra

y

oligo-

micr

oarra

y SHcD

NA-AFL

P DD

SSH

RDATOGA

SAGEMPSS

ORESTES

nº

pu

blic

açõ

es

HibridizaHibridizaççãoão

PCRPCR

SeqSeqüüenciamentoenciamento

Pesquisa feita na base de dados PubMed >http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?dh=pubmed>. Acesso em 02 jun 07.


• Microarranjos de cDNA

• Differential Display (DD)

• Análise Serial da Expressão Gênica (SAGE)

• PCR quantitativo (qPCR)

Análise da Expressão GênicaAnálise da Expressão Gênica


Microarranjos de cDNAMicroarranjos de cDNA

Permite a análise simultânea da expressão de centenas a milhares de genes em um único experimento

(Schena et al., 1995)(Schena et al., 1995)

PrincPrincíípiopio

cDNAs marcados hibridizam, com alta sensibilidade e especificidade, com seqüências de genes conhecidos imobilizadas em um substrato sólido

• Permite estudar as mudanças nos níveis de expressão gênica de um

hospedeiro em resposta à colonização por um fungo (e vice-versa).

• Fornece visão molecular dos eventos que seguem a infecção.


Preparo das lâminas Preparo das lâminas Passo 1Passo 1

estrutura genômica anotada

amplificação das sondas

por PCR

“spotting”das sondas na lâmina

até 20000 genes

0,05-0,15cm

modificado de Ehrenreich, 2006

Microarranjos


Passo 2Passo 2 Preparo das amostras Preparo das amostras

amostra A amostra B

extração de RNA total

RT-PCR e marcação

com corante fluorescenteCy5 Cy3


Microarranjos


Passo 3Passo 3 Hibridização e LeituraHibridização e Leituraamostra A amostra B

+

hibridização

leitura da fluorescência

Cy5 – 532 nmCy3 – 635 nm

imagens cruas

análise das imagens

saída digital

amostra A > B

amostra B > A

amostra A ~ B


Microarranjos


Passo 4Passo 4 Análise dos Dados DigitaisAnálise dos Dados Digitais


Análise de imagem: determinação da margem dos sinais dos spots e quantificação dos dados de fluorescência

Correção do background e seleção dos sinais de qualidade

Transformação dos dados

Normalização dos dados

Teste para expressão diferencial

Análise de agrupamento ou interpretação biológica

Armazenamento dos dados in local ou em

bancos de dados públicos

experimentos

gen

es

Microarranjos


• “Spotting” mesma sonda múltiplas vezes num mesmo arranjo

• Marcar e hibridizar várias vezes (ex. “dye swap”)

• Repetir condições experimentais e extração de RNA (3x pelo menos)

Aspectos importantesAspectos importantesRepetições

Origem das sondas para análise de arranjos de DNA

• Coleções de ESTs

• ORFs de seqüências genômicas

• Seqüências sintetizadas na lâmina (Biochip)

• Bibliotecas de cDNA

• Fragmentos de DNA genômico (lâminas “cegas”)

Microarranjos


Principais Vantagens da TécnicaPrincipais Vantagens da Técnica

Microarranjos

Análise global da expressão gênica;

Visão da expressão de milhares de genes simultaneamente;

Análises rápidas;

Análise da expressão de genes que atuam em um caráter complexo;

Dados digitais;

Fácil manuseio;

Reagentes seguros.


Necessidade de conhecimento prévio de seqüências genômicas/ESTs;

Sistema fechado;

Necessidade de grandes quantidades de mRNA para cada hibridização;

Alto custo e alta demanda técnica;

Sensibilidade das sondas é questionada (tamanho e “cross-hybridization”);

Baixa reprodutibilidade;

Necessidade de validação dos genes diferencialmente expressos por

métodos independentes (ex. Nothern-blot; qPCR).

Pontos CríticosPontos Críticos

Microarranjos


Differential Display (DD) Differential Display (DD) (Liang & Pardee , 1992)(Liang & Pardee , 1992)


Uso de um número limitado de primers curtos e arbitrários em combinação com primers oligo-dT ancorados para amplificar e visualizar

de forma sistêmica a grande maioria dos mRNAs de uma célula.

DD combina três técnicas moleculares comuns:• RT-PCR• PCR• Eletroforese em gel de poliacrilamida


RT-PCR RT-PCR Passo 1Passo 1

Amostra X Amostra Y

RNA total RNA total

População de mRNAs

RT-PCR

Primers => oligo-dT ancorados

Notação H-T11M

H = sítio de restrição da enzima HindIII (AAGCTT)

T11 = seqüência de 11 timinas (T)

M = Guanina (G), Citosina (C) ou Adenina (A)

Ex. 5’ – AAGCTTTTTTTTTTTC-3’H T11 M

modificado de Liang et al., 2007

O uso de oligo-dT ancorados resulta em três subpopulações de cDNA, cada qual representa 1/3 dos possíveis mRNAs expressos na amostra

Differential Display


Amplificação por PCR Amplificação por PCR Passo 2Passo 2

PCR

Subpopulação de cDNAs

• Combinação dos primers oligo-dT ancorados (H-T11M) com um grupo de primers arbitrários (H-AP)

PRIMERS ARBITRÁRIOS (H-AP)

• Curtos (13 bases) e aleatórios

H = sítio de restrição da enzima HindIII (AAGCTT)

AP = 7 bases com combinações aleatórias

Ex. 5’ – AAGCTTGATTGCC-3’H AP

• Nº possível de primers arbitrários:

47 > 16.000 combinações de bases

• Cada primer tem a probabilidade de reconhecer50-100 mRNAs

Nº primers arbitrários (n)

Nº Reações PCR

Probabilidade de detecção P=1-(0.96)n

20 3x20 = 60 56% 30 3x30 = 90 71% 40 3x40 = 120 80% 80 3x80 = 240 96%

modificado de Liang et al., 2007


TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGAmodificado de Liang et al., 2007


Eletroforese Eletroforese Passo 3Passo 3

Amostra X Amostra Y

Produtos de amplificação

Eletroforese Análise fluorescência

banda representa mRNAdiferencialmente expresso

Excisão da banda

Clonagem

Seqüenciamento

Para cada combinação de primers!

Gel de poliacrilamida desnaturante• melhor resolução de bandas

• permite fácil recuperação dos transcritos

• acomoda grande nº amostras

Reamplificação



Análise da expressão gênica diferencial;

Simplicidade técnica;

Sensibilidade;

Alta reprodutibilidade;

Baixo custo;

Sistema aberto.



Alta incidência de falsos positivos em sistemas com muitas variáveis;

Alta intensidade de trabalho;

Dados não digitais (geralmente);

Desconhecimento imediato dos genes diferencialmente expressos;

Não permite leitura ampla e simultânea de muitos transcritos;

Necessidade de validação dos genes diferencialmente expressos por métodos independentes (ex. Nothern-blot; qPCR).

Pontos CríticosPontos Críticos



2 Princípios Básicos

11ºº PrincPrincíípiopio -- Uma seqüência de nucleotídeos (tag) de 9-10pb possuiinformação suficiente para identificação de um transcrito único.

Uma seqüência de apenas 9 pb pode distinguir49 = 262.144 transcritos

Análise Serial da Expressão Gênica (SAGE)Análise Serial da Expressão Gênica (SAGE)(Velculescu, 1995)(Velculescu, 1995)

Madden et al., 2000

~ 256pb


22ºº PrincPrincíípiopio - Ligação (concatenação) dos tags permite análiseeficiente dos transcritos de um modo serial, pelo seqüenciamento de múltiplos tags contidos em um único clone.

Análise Serial da Expressão Gênica (SAGE)Análise Serial da Expressão Gênica (SAGE)

Madden et al., 2000

64 a 96 amostras por corrida(1600-2400 tags por corrida)

2 corridas por dia(3200-4800 tags por dia)

Seqüenciadores múltiplos

Análise paralela Análise paralela

Análise paralela

Análise Serial


mRNA

cDNA

RT-PCR

Síntese do DNA complementar (cDNA) a partir de mRNA, utilizando-se como iniciador uma seqüência oligo-d(T) biotinilada

SAGE

Passo 1Passo 1

Ho Song & Wyse, 2004; Madden et al., 2000


cDNA

Fragmentos de cDNA

DIGESTÃO

Digestão com endonuclease (enzima de ancoramento -NlaIII). A maioria dos cDNAs deve ser cortada pelomenos uma vez.

44 = 256 bases

cDNA ligado a estreptavidina

CAPTURA

As frações dos cDNAs mais próximas à extremidade 3´são capturadas por ligação da biotina dos iniciadorescom estreptavidina ligada à partículas magnéticas.

SAGE

Passo 2Passo 2



Divisão daamostra de cDNAs em

duas partes

cDNAs ligados a estreptavidina

LIGAÇÃO

Adaptador A Adaptador B

Cada metade dos cDNAs é ligada nas extremidades a um adaptador distinto, mas ambos contendoseqüência de reconhecimento para enzima de restrição do tipo IIS (enzima de tagging – BsmFI).

DIGESTÃO

cDNAs ligados a estreptavidina e adaptador

cDNAs ligados a adaptador

Digestão com enzima BsmFI, que corta a uma distânciadefinida a partir do seu sítio de reconhecimento. Daclivagem resulta a liberação dos adaptadores ligados a um pedaço curto de cDNA (9-10pb + sítio NlaIII).

SAGE

Passo 3Passo 3



cDNAs ligados a adaptador

LIGAÇÃO

AMPLIFICAÇÃO

Após terem suas extremidades reparadas pela enzimaKlenow, as duas frações de cDNAs são ligadas pela enzimaT4 DNA ligase.

Amplificação das ditags usandoiniciadores complementares aosadaptadores.

SAGE

Passo 4Passo 4



CLONAGEMSEQÜENCIAMENTOCONTAGEMANOTAÇÃO DAS tags

grande quantidade de ditags

DIGESTÃO

LIGAÇÃO

concatâmeros

Após fracionamento dos concatâmeros por tamanhovia eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, coleta-se frações de 300-500pb e 500-1000pb e introduz-se separadamente em vetores para quesejam clonadas e depois seqüênciadas.

A clivagem com enzima de ancoramento (NlaI) libera os adaptadores das ditags e cria extremidadescoesivas.

SAGE

Passo 5Passo 5



SAGE

Passo 6Passo 6 Análise dos Dados DigitaisAnálise dos Dados DigitaisArquivos com seqüências

dos clones SAGE

Seqüências de referência (genes conhecidos do EMBL/NCBI

GenBank) ou ESTs

Projeto dos perfis de abundância das tags

Banco de dados de tags de referência espécie-específico

Comparação do projeto e verificação da identidade com tags de referência

tags candidatas para maiores investigações

Extração e tabulação das tagsa) remoção das ditags em duplicatab) extração das tags a partir das ditags

Extração das tags e anotação

Geração de relatórios

Filtragem e classificação

Tuteja & Tuteja, 2004


▶ Comprimento das tags;

▶ Necessidade de grande quantidade de material inicial (mRNA);

▶ Tipo de enzima de restrição IIS (BsmFI) que nem sempre produz fragmentos de um mesmo comprimento;

↘ Long Sage, SuperSage e GLGI

↘ MiniSage, MicroSage

↘Temperatura constante à 65ºC

Pontos CríticosPontos CríticosSAGE

▶▶ Construção das bibliotecas envolve muitos passos;

�� Alto custo com seqüenciamento;

�� Necessidade de validação dos genes diferencialmente expressos por métodos independentes (ex. Nothern-blot; qPCR).


▶ Detecção de genes pouco expressos;

▶ Dados gerados são passíveis de múltiplas comparações;

▶ Aplicável nas mais diferentes áreas;

▶ Não requer conhecimento prévio dos genes de interesse nem do genoma;

▶ Geração de dados digitais qualitativos e quantitativos.


SAGE

▶ Permite leitura ampla da expressão gênica;


TÉCNICA Comparação

entre amostras

Diferenças detectáveis Sensibilidade Complexidade Custo

Detecção de novos

genes Confiabilidade

Intensidade de

trabalho

Análise da

expressão global

Microarranjos de cDNA 2 (ou mais) >2 vezes média depende/alta alto geralmente

não média média sim

Differential Display ilimitada 1,1-1vezes

ou mais alta baixa baixo/médio sim média alta não

SAGE ilimitada todas média baixa baixo/médio sim alta alta sim

Microarranjos X DD X SAGEMicroarranjos X DD X SAGE

modificado de Stein & Liang, 2002 e Spira, 2005


PCR Quantitativo (qPCR)PCR Quantitativo (qPCR)

• Se baseia na técnica de PCR (Mullis, 1986), com adequações para um nível de sensibilidade muito maior.

• Técnica descrita como quantitativa porque consegue realizar a avaliação do nº de moléculas produzidas ciclo a ciclo.

Estratégia para monitorar e quantificar em tempo real o aumento de moléculas de RNA,

cDNA ou DNA durante a PCR



Molécula alvo, durante a amplificação, emite fluorescência e um leitor no termociclador captura a fluorescência ciclo a ciclo.

A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumenta na proporção direta da quantidade de produto da PCR

Os valores da fluorescência são gravados durante cada ciclo e representam a quantidade de

produto amplificado

PCR Quantitativo (qPCR)PCR Quantitativo (qPCR)


• Corantes especiais;

• Procedimentos de otimização;

• Termociclador com sistema ótico;

• Computador com programa para aquisição de dados e análise final da reação.

Requisitos do qPCRRequisitos do qPCR

Applied BiosystemsBio-Rad Roche

qPCR


Sistemas de Fluorescência Sistemas de Fluorescência

Fluoróforos são moléculas que absorvem e emitem luz em um comprimento de onda específico

• Corantes que se ligam a dsDNA

• Sondas de hibridização

• Sondas de hidrólise

• Sondas do tipo grampo (“hairpin”)

TIPOS

qPCR

TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGAWong & Medrano, 2005

Corantes dsDNA

SYBR Green ISYBR Green I

Sondas de Hibridização

Sondas do tipo “grampo”

Moléculas BeaconMoléculas Beacon ScorpionScorpion Sunrise primersSunrise primers LUX primersLUX primers

Sondas de Hidrólise

TaqManTaqMan


Curva padrãoCurva padrão

declividade reflete a eficiência de amplificação (E)

Construção: a partir de diluições seriadas e em condições otimizadas

(sem limitação de reagentes)

(logN) concentração inicial

qPCR


Curva de Amplificação Curva de Amplificação

fase linear

fase exponencial

(log)

platô

CT (Cycle Threshold) => ciclo na qual a reação atinge o limiar da fase exponencial

Este ponto permite a quantificação exata e reprodutível baseado na fluorescênciaNovais & Pires-Alves, 2004

qPCR


Tn=T0(E)n

• Tn= Número de moléculas de DNA

no ciclo de referência (CT)

• T0= Número inicial de moléculas DNA

• E = Eficiência da PCR (0<E<1)

CT é diretamente proporcional ao logde quantidade inicial de DNA / RNA

QuantificaçãoQuantificaçãoCurva de amplificação

(logN) concentração inicial

TnTn

Curva padrão

qPCR


AplicaçõesAplicações• Avaliação quantitativa dos níveis de expressão de genes;

• Análise de “splicing” alternativo;

• Diagnósticos clínicos;

• Análise de seqüências virais, bacteriana, fúngicas ou de protozoários a partir de várias fontes;

• Análise de mutações;

• Discriminação alélica em DNA genômico;

• Detecção de transgênicos;

• Análise de patógenos em alimentos.

qPCR



• Quantifica expressão gênica com alta precisão;

• Método rápido e independente de processos pós-PCR;

• Alta sensibilidade e facilidade na quantificação;

• Alta reprodutibilidade e acurácia;

• Melhor controle de qualidade no processo e menor risco de contaminação (qualitativo).

qPCR


OBJETIVOS

• Determinar o perfil de expressão gênica de plantas de arroz colonizadas por um fungo simbionte (Glomus intraradices), através de microarranjos;

• Comparar a expressão gênica em resposta ao fungo simbionte com a expressão em resposta à patógenos (Magnaporthe grisea e Fusariummoniliforme)

• Comparar a resposta à colonização por fungos entre monocotiledôneas e dicotiledôneas.


METODOLOGIAInfecção pelo simbionte:

• Raízes de Oryza sativa cv. Nipponbare (45 plantas, 6 semanas) inoculadas com

Glomus intraradices;

Infecção pelos patógenos:

• Raízes de Oryza sativa cv. Nipponbare (plântulas com 10 dias) foram inoculadas com os patógenos Magnaporthe grisea linhagem Guy 11 e Fusarium moniliforme. Raízes foram coletadas 2, 4 e 6 dias após inoculação.

Análise de expressão gênica por microarranjos:

• RNAtotal foi isolado de raízes infectadas;

• Uso do GeneChip (sySYNG003a) de genoma de arroz (Syngenta, Basel) - ~50.000

genes.

PCR em Tempo Real:

• Validação dos dados de microarranjos e testes de expressão gênica com patógenos.


RESULTADOS

Transcriptoma de arroz em resposta à colonização micorrízica

Genes regulados pela colonização micorrízica – aqueles que apresentaram uma mudança de expressão de 3 vezes (reprimidos ou induzidos) em relação às plantas controle.

• 256 genes regulados pela colonização micorrízica:

- 20 genes foram reprimidos (3 a 14 vezes)

- 236 genes foram induzidos (3 a 203 vezes)

• Controle positivo (acúmulo de transcritos específicos do fungo micorrízico):

- gene OsPT11 presente no chip => apresentou aumento de expressão de 154 vezes.

MICROARRANJOS


RESULTADOS

Validação dos dados de Microarranjos

qPCR

• Teste da expressão de 224 genes (dos 256 candidatos):

- Indução (1,5 a 300.000 vezes) => 209 genes

- Repressão (2,4 a 23 vezes) => 15 genes

• Gene controle positivo (OsPT11) => apresentou indução de 1500 vezes em relação às plantas controle.


RESULTADOS

Transcriptoma de arroz em resposta à patógenos

• Teste da expressão dos 224 genes regulados pela colonização micorrízicasem raízes infectadas por M. grisea e F. moniliforme:

Figura 1. Esquema da visão geral dos genes de arroz regulados pela colonização micorrízica em comparação com a resposta aos patógenos. Números em preto representam genes induzidos; números em cinza representam genes reprimidos.

Expressão diferencial de 95 genesem resposta à colonização micorrízica

e um ou ambos os patógenos.

qPCR


RESULTADOS

Genes regulados pela colonização micorrízica são conservados entre monocotiledôneas e dicotiledôneas?

• tBlastX foi conduzido entre 625 genes de dicotiledôneas (descritos anteriormente como regulados por micorrizas) e os 224 genes de arroz:

- 96 genes foram identificados:76 apresentaram mesmo padrão de expressão em mono e dico

- 44 genes de arroz regulados especificamente por micorrizas- 25 genes relacionados com colonização geral por fungos

- 20 genes apresentaram padrão de expressão oposto entre mono e dico


CONCLUSÕES

• 43% dos genes avaliados apresentaram respostas similares para G. intraradices, M. grisea e F. moniliforme;

• A indução do gene OsAM205 durante as três interações fungo-planta avaliadas sugere que esse seja um fator de transcrição envolvido na regulação da reposta de plantas à diferentes infecções fúngicas;

• Foi possível observar certa conservação da resposta transcricional do arroz colonizado por simbiontes e patógenos;

• Os padrões de expressão observados refletem uma resposta geral de plantas à colonização por fungos, sugerindo que apesar da divergência filogenética, mono e dico possuem mecanismos conservados de resposta à colonização.


OBJETIVO

• Isolar genes, do patógeno Penicillium expansum e de maçãs, induzidos durante a interação fungo-planta via DD RT-PCR.


METODOLOGIA

DD RT-PCR

• Penicillium expansum Link, isolado CMP1;

• Frutos (maçãs) pré-tratadas (imersão em água a 37ºC por 4 dias) inoculados com

20µL de suspensão de esporos ou água esterilizada;

• Isolamento RNA: - a partir de culturas de P. expansum cultivadas em pectina de maçã

- a partir de cilindros (16x6mm) de tecido dos frutos infectados

- a partir de cilindros (16x6mm) de tecido dos frutos sadios

• Amplificações DD: combinação entre 15 oligonucleotídeos

Clonagem

Dot-blot

Nothern-blot

Southern-blot


• Reamplificação – Clonagem - Dot-blot - Nothern-blot => 26 genesprovavelmente diferencialmente expressos.

CARACTERIZAÇÃO

RESULTADOS

Genes expressos durante a interação fungo-planta

DD RT-PCR

• Combinação de 15 primers => ~ 1450 bandas

98 bandas mais intensas ou exclusivamente presentes em maçãs infectadas


• Seqüenciamento dos 26 cDNAs

• 20 cDNAs - BLAST contra banco de dados não-redundante e dbEST EMBL:

RESULTADOS

Caracterização dos cDNAs selecionados

- 9 não apresentaram qualquer homologia (P>0,0001) com seqüências do banco de dados (tanto de nucleotídeos como de aminoácidos);

- 7 apresentaram homologia com genes de fungos;

- 4 apresentaram homologia com seqüências de plantas;

• Validação dos 20 cDNAs como diferencialmente expressos => Nothern-blot- 18 apresentaram maior nível de expressão em maçãs infectadas do que nos controles;

- 2 (similares à manitol desidrogenase) apresentaram maior nível de expressão em culturas de P. expansum.

• Determinação da origem dos 18 cDNAs => Southern-blot- Correlação perfeita com dados de homologia de seqüências;

- Determinação da origem dos 8 transcritos que não apresentaram homologia com seqüências do banco de dados: 7 derivaram do fungo e 1 da maçã.


RESULTADOS

Análises das seqüências dos clones de maçã e de P. expansum isolados por DD RT-PCR a partir de maçãs infectadas.


• Através de DD RT-PCR foi possível identificar 12 genes diferencialmente expressos em resposta à interação P. expansum-maçã:

- 8 genes associados com processo de infecção do fungo- 4 genes associados à resposta de defesa dos frutos

CONCLUSÕES

• A maioria dos genes isolados do fungo estavam expressos tanto in planta como in vitro, entretanto, a expressão desses genes era muito maior durante o processo de infecção;

• Apenas um cDNA do fungo apresentou similaridade a genes de poligalacturonases (PG), enzimas extensivamente descritas como fatores de patogenicidade;

• A maioria dos outro genes apresentou similaridade com proteínas provavelmente envolvidas na adaptação ao ambiente hospedeiro;

• Dois genes de maçãs expressos durante a interação fungo-planta correspondiam com putativos PP2C e β-glucosidase (enzima envolvida na liberação de compostos tóxicos a partir de precursores glicosilados inativos).


OBJETIVOS

• Análise dos perfis de expressão gênica simultaneamente, de arroz

(hospedeiro) e Magnaporthe grisea (patógeno), pela técnica de

SuperSAGE;

• Avaliar e comparar a capacidade do estudo da expressão gênica por

meio da técnica de SuperSAGE.


METODOLOGIA

Fonte de inóculo

• Folhas de Oryza sativa L. cv. Norin1 infectadas com fungo M. grisea raça

007.

Material Vegetal:

• Dois cultivares de arroz, cv. Kakehashi (susceptível) e cv. Himenomochi

(resistente), foram inoculadas com fungo M. grisea raça 007. Folhas foram

coletadas 10 dias após a inoculação.

SuperSage

• Análise dos mRNAs extraídos de folhas de arroz infectadas por M. grisea.


RESULTADOS

Perfil de expressão gênica em folhas de arroz infectadas

• Obtenção de 12.119 “SuperSAGE tags” ;

• 7.546 tags diferentes => correspondem a genes diferentes

• Identificação dos genes: blast das tags (26pb) contra banco de dados

completo do GenBank (cDNAs, ESTs, genomas);

• Na maioria dos casos apenas uma seqüência se alinhou perfeitamente

com a seqüência da tag (26pb) de SuperSage;

Informação das tags é suficiente para identificar o gene de origem


• Genes relacionados com a fotossíntese foram os mais expressos nas

folhas de arroz.

RESULTADOS

Perfil de expressão gênica em folhas de arroz infectadas

Tabela 1. Os 10 genes que apresentaram maior expressão em folhas de arroz infectadas.


RESULTADOS

Perfil de expressão gênica em M. grisea

• Blast das tags apenas contra genoma de M. grisea;

•74 tags supostamente derivam de mensagens de M. grisea = 0,6% dos

transcritos avaliados;

• 35 tags diferentes alinharam com genes putativos de M. grisea, sendo

que não houve homólogos no genoma do arroz;

• Metade das tags referem-se ao gene hidrofobina;

• Os genes da nucleoside-diphosphate kinase e da

proteína ribossomal 60S contribuíram com 2 tags cada.


RESULTADOS

Perfil de expressão gênica em M. grisea

Tabela 2. Alguns genes de M. grisea expressos em folhas de arroz infectadas.


RT-PCR• Amplificação dos genes de hidrofobina, nucleoside-diphosphate kinase e proteína ribossomal 60S utilizando cDNA isolado de folhas infectadas dos seguintes cultivares: Norin1 (susceptível); Kakehashi (susceptível) e Himenomochi(resistente).

Figura 1. (A) RT-PCR dos genes hidrofonina, nucleoside-diphosphate kinase e proteína ribossomal 60S, de M. grisea, a partir cDNA do cv. Norin1. (B) RT-PCR dos genes de M. grisea a partir do cDNA dos cv. Kakehashi e cv. Himenomochi, ambos falso inoculados (-) e inoculados com M. grisea raça 007 (+).

RESULTADOS

Validação de genes expressos por M. grisea


CONCLUSÕES

• SuperSAGE abre a possibilidade de estudar diretamente a expressão

gênica de dois organismos simultaneamente.

• Os resultados mostraram que o gene da hidrofobina é o mais

expresso em M. grisea infectando folhas de arroz => hidrofobina é

necessária para formação de apressório durante a infecção do fungo;

• Os dados gerados por SuperSAGE são compatíveis com os dados do

SAGE convencional e fornecem perfis de expressão gênica bastante

confiáveis;

• Genes relacionados com a fotossíntese foram os mais expressos nas

folhas de arroz.


bioinformática

bioquímica

Função

Proteoma

TranscriptomaMetaboloma

genética

citologiafisiologia

bioquímica estrutural

Genômica FuncionalGenômica FuncionalCONSIDERAÇÕES FINAIS

modificado de Vukmirovic & Tilghman, 2000


ESTsESTs

SAGE

SAGE

RDARDA

Mic

roar

ranj

os

Mic

roar

ranj

os

SSHSSH

CONSIDERAÇÕES FINAIS

BIOINFORMÁTICABIOINFORMÁTICA

para análise de ligação em cruzamentos experimentaisGENES CANDIDATOSGENES CANDIDATOS

MPSS

MPSS

DDDDcDNA-AFLP

cDNA-AFLP

TRANSCRIPTOMA

MELHORAMENTO

modificado de Camargo, 2006


Obrigada Obrigada

pela pela

Atenção! Atenção!

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