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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM
BIOCIÊNCIA ANIMAL
FERNANDA VICCINI
INVESTIGAÇÃO MOLECULAR DE PAPILOMAVÍRUS EM CARCINOMA DE
CÉLULAS ESCAMOSAS EM PELE E MUCOSA DE CÃES
Cuiabá 2019
FERNANDA VICCINI
INVESTIGAÇÃO MOLECULAR DE PAPILOMAVÍRUS EM CARCINOMA DE
CÉLULAS ESCAMOSAS EM PELE E MUCOSA DE CÃES
Dissertação apresentada à UNIC, como requisito oficial para a obtenção do título de Mestre em Biociência Animal. Orientador: Prof. Dr. Alexandre Mendes Amude
Cuiabá 2019
FICHA CATALOGRÁFICA Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
V631i VICCINI, Fernanda Investigação molecular de papilomavírus em carcinoma de células escamosas em pele e mucosa de cães. / Fernanda Viccini - Cuiabá, MT 2019 Xi. f.; cm. 55 p.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-graduação em Ensino de stricto sensu, como requisito oficial para obtenção do título de Mestre em Biociência Animal. Área de concentração em Saúde Animal. Universidade de Cuiabá - UNIC, 2019. Orientador: Prof. º Dr. Alexandre Mendes Amude
1. Neoplasia. 2. Vírus. 3. Queratinócitos. CDU: 619:616.9:636
FERNANDA VICCINI
INVESTIGAÇÃO MOLECULAR DE PAPILOMAVÍRUS EM CARCINOMA DE
CÉLULAS ESCAMOSAS EM PELE E MUCOSA DE CÃES
Dissertação apresentada à UNIC, no Mestrado em Biociência Animal, área e concentração em Saúde Animal como requisito oficial para a obtenção do título de Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:
BANCA EXAMINADORA
___________________________________ Prof. Dr. Alexandre Mendes Amude
UNIC
__________________________________ Profª. Drª. Glaucenyra Cecília Pinheiro da Silva
UNIC
__________________________________ Prof. Dr. Carlos Eduardo Fonseca Alves
UNESP
Cuiabá, 11 de setembro 2019.
Dedico este trabalho ao meu amado e eterno pai. Sei o quanto está orgulhoso,
mesmo que do outro lado da vida.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, pois sei que nada disso seria possível se não tivesse a permissão dele.
Aos meus pais por terem me concedido o que tenho de mais precioso: a vida. Obrigada por tudo. Sei que sempre fizeram o melhor que podiam nas condições que tinham.
A toda minha família pelo carinho, torcida, segurança e confiança depositadas em meus sonhos.
Ao meu marido Cesar Guimaraes Galli Jr, por todo apoio e incentivo na minha busca constante por conhecimento. Eu te amo.
Ao meu orientador Prof. Alexandre Mendes Amude, não só pela trajetória no mestrado, mas sim por todo ensinamento compartilhado desde a graduação. Obrigada por ter me incentivado a entrar nessa vida da pesquisa, com certeza foi uma experiência incrível.
À Profª. Michele Lunardi, por toda ajuda e incentivo na realização deste trabalho. Você foi uma chave muito importante para que esse trabalho acontecesse. Agradeço também a toda equipe do laboratório de biologia molecular da Universidade de Cuiabá, em especial a Glaucenyra Cecília Pinheiro, por toda ajuda nesses últimos meses. Muito obrigada por toda dedicação e empenho que teve comigo.
INVESTIGAÇÃO MOLECULAR DE PAPILOMAVÍRUS EM CARCINOMA DE
CÉLULAS ESCAMOSAS EM PELE E MUCOSA DE CÃES
RESUMO
VICCINI, F. Investigação molecular de papilomavírus em carcinoma de células
escamosas em pele e mucosa de cães. 2019. Dissertação (Mestrado Biociência
Animal) – Universidade de Cuiabá, Cuiabá, 2019.
Com o aumento da expectativa de vida dos animais de companhia, veio também a maior incidência de doenças, entre elas, o câncer. Os tumores cutâneos são as neoplasias mais encontradas nos animais domésticos e o carcinoma de células escamosas (CCE) representa um grande vilão nesse complexo tumoral. O CCE ocorre com mais frequência na pele, leitos ungueais, mucosas orais e oculares. O papilomavírus (PV) apresenta intenso epiteliotropismo por células epiteliais escamosas cutâneas e de mucosas. Já foi relatada a infecção do PV em vários tumores cutâneos e de mucosas, sejam eles malignos ou benignos, sendo o CCE o tumor onde o PV tem sido mais descrito. Alguns estudos também detectaram o PV em casos isolados de carcinomas in situ e várias placas epidérmicas pigmentadas em cães. Estes estudos, em sua grande maioria, foram realizados em casos isolados, ou lesões em regiões específicas como CCE orais. O presente estudo é inédito no Brasil, quando se trata da relação do CCE e PV em lesões neoplásicas cutâneas e de mucosas. Foram selecionados 27 blocos parafinados de CCE de cães; 23 de pele, 03 de leitos ungueais e 01 de mucosa oral. A partir desses blocos foram realizados exames de PCR para detecção molecular do PV. Os resultados encontrados confirmaram um percentual de 29,6 % de positividade, que também é o maior percentual verificado até o presente momento. Demonstrando que existe esta correlação e que baseado nas técnicas utilizadas a incidência da associação do PV ao CCE pode ser ainda subestimada. Palavras-chave: Neoplasia, vírus, queratinócitos.
ABSTRACT VICCINI, F. Molecular investigation of the Papilomavirus in squamous carcinoma cells on the skin and mucosa of dogs.2019. Dissertação (Mestrado Biociência Animal) – Universidade de Cuiabá, Cuiabá, 2019.
As the life expectancy of companion animals grows, so does the greater incidence of diseases, among them, cancer. Cutaneous tumors are the most found neoplasias in domestic animals and the Squamous Cell Carcinoma (SCC) represents a great villain in this tumorous complex. The SCC occurs more frequently on the skin, on the nail beds and on the oral and eye mucosas. The papillovirus (PV) presents intense epithelialtropism for cutaneous and mucosal epithelial squamous cells. It has already been related in several cutaneous and mucosal tumors, be them malignant or benign. Being the SCC, the tumor where the PV has been more described. A few studies have also detected PV in isolated cases of carcinoma in situ and in several pigmented epidermal moles in dogs. These studies were carried out most of the time in isolated cases or in specific region injures, like oral SCC. There aren’t studies that evaluate the participation of PV in cutaneous and mucosal neoplastic injures in Brazil yet. In this study, 27 dog’s paraffined blocks of SCC have been selected; 23 of skin, 03 of nail beds, 01 of oral mucosa. From these blocks onwards PCR exams were performed for molecular detection of PV. The final results confirmed a percentage of 29.6% of positivity, which is also the highest percentage verified until now. Showing that there is a correlation and based on the techniques used, the incidence of PV associated with SCC may be yet underestimated.
Keywords: Neoplasia, virus, keratinocytes.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Trabalhos que relataram a correlação de CCE com a infecção viral pelo
PV. ............................................................................................................................ 32
Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizado na amplificação dos genes de
papilomavirus em carcinomas de pele e mucosas de cães. ..................................... 46
Tabela 3. Marcação de banda em amostras parafinadas e congeladas utilizando os
diferentes Primers. .................................................................................................... 48
Tabela 4. Marcação do primer MY09/11 nas amostras. ............................................ 49
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Papiloma oral.. ........................................................................................... 16
Figura 2. Papiloma oral. ............................................................................................ 16
Figura 3. Papiloma cutâneo em região de orelha. ..................................................... 17
Figura 4. Placas pigmentadas.. ................................................................................. 19
Figura 5. Carcinoma in situ interdigital.. .................................................................... 21
Figura 6. Carcinoma in situ facial. ............................................................................. 21
Figura 7. Ceratose actínica.. ..................................................................................... 23
Figura 8. Ceratose actínica.. ..................................................................................... 23
Figura 9 Carcinoma basocelular em focinho.. ........................................................... 24
Figura 10. CCE em dígito.. ........................................................................................ 27
Figura 11. CCE em região ventral..............................................................................27
Figura 12. CCE em superfície de córnea.. ................................................................ 28
Figura 13. CCE oral .................................................................................................. 29
Figura 14. Representação esquemática de como a ação do papilomavírus pode
promover CEC em pele lesada pelo sol . .................................................................. 30
LISTA DE ABREVIATURAS
BISC Carcinoma bowenoide in situ
CCE Carcinoma de Células escamosas
CPV Canis familiaris papilomavirus
DNA Ácido desoxirribonucleico
FFEP Fixadas em formol e embebidas em parafina
HPV Papiloma vírus humano
ICTV Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus
PV Papilomavírus
UV Raio ultravioleta
UVA Raio ultravioleta B
UVB Raio ultravioleta A
ICTV
Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 11
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 12
2.1 PAPILOMAS VÍRUS CANINO ................................................................................... 12
2.1.1Taxonomia ..................................................................................................... 13
2.1.2 Infecção Viral ............................................................................................... 14
2.1.3 Papiloma Oral .............................................................................................. 16
2.1.4 Papiloma Cutâneo ....................................................................................... 17
2.1.5 Placas Virais Pigmentadas ........................................................................ 18
2.2 A PELE E O CÂNCER ................................................................................................ 19
2.3 CARCINOMAS CUTÂNEOS ..................................................................................... 20
2.3.1 Carcinoma Bowenoide ............................................................................... 21
2.3.2 Ceratose Actínica ........................................................................................ 22
2.3.3 Carcinoma Basocelular .............................................................................. 24
2.3.4 Carcinoma de células escamosas ............................................................ 25
2.4 CARCINOMA DE CELULA ESCAMOSADE MUCOSAS ..................................... 28
2.4.1 Olho ........................................................................................................... 28
2.4.2 Cavidade oral ........................................................................................... 29
2.5 ATUAÇÃO DO PAPILOMAVIRUS NA ONCOGÊNESE ....................................... 30
3 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 33
4 OBJETIVOS ........................................................................................................... 41
4.1 OBJETIVO GERAL ..................................................................................................... 41
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................... 41
5. ARTIGO ................................................................................................................ 42
INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 43
MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 44
DIAGNÓSTICO MOLECULAR ........................................................................................ 44
Extração de ácido Nucleico .......................................................................................... 44
Reação de cadeia da polimerase ................................................................................ 45
RESULTADOS .......................................................................................................... 47
VALIDAÇÃO DA SELEÇÃO DOS PRIMERS E PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO
DE DNA E REAÇÃO DA PCR ......................................................................................... 47
DISCUSSÃO ............................................................................................................. 51
CONCLUSÃO ........................................................................................................... 53
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 54
11
INTRODUÇÃO
Existem diversas doenças neoplásicas, todavia, nenhuma possui origem única,
são provenientes de causas variadas. Desta forma, o estudo das neoplasias é de
fundamental importância para a compreensão de suas causas, tipos e formas de
tratamento (DIAS et al., 2015). O grande número de tumores cutâneos em cães se
deve ao fato que a pele é o maior órgão do corpo e representa a barreira física entre
o ambiente e organismo (JONES et al., 2000). Além de possuir exposição direta aos
fatores oncogênicos, propiciando as formações neoplásicas (MEDLEAU et al., 2009).
As neoplasias se caracterizam como novas formações que indicam um
crescimento anormal do tecido e que acaba se desenvolvendo mais rápido que os
tecidos normais em sua volta, de forma descoordenada e persistente (ALMEIDA et al.,
2005). Dentre as neoplasias mais frequentes em cães domésticos, é possível citar os
carcinomas de células escamosas (CCE), que apresenta elevada prevalência em
pacientes de idade avançada (SOUZA et al., 2006).
O CCE é um tumor maligno que afeta as células produtoras de queratina, ou
seja, os queratinócitos. Também pode ser descrito como carcinoma de células
espinhosas, carcinoma espinocelular ou carcinoma epidermóide. Sua patogenia está
associada principalmente a exposição à luz UV, falta de pigmentação na epiderme e
alopecia (RIBEIRO et al., 2010). Além disso, a pele possui inúmeras células e há um
alto índice de renovação celular sendo susceptível a mutações (MURPHY, 2006).
O PV canino já é bem caracterizado por induzir neoformações benignas
provocadas pela infecção de células epiteliais por PV espécie específico. Sabe-se que
estes possuem oncogenes virais responsáveis pelo crescimento e divisão das células
epiteliais do hospedeiro, assim como pela indução de um quadro de instabilidade
genética e mutações cromossômicas, podendo resultar em replicação e diferenciação
celular, resultando em neoplasias malignas (HNILICA, 2009).
12
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 PAPILOMAVÍRUS CANINO
Verrugas foram registradas no folclore durante séculos em seres humanos.
Uma causa viral de verrugas foi confirmada em 1907, e o primeiro papilomavírus
humano (PV) foi totalmente sequenciado em 1982 (DANOS et al., 1982). A primeira
evidência de que os PV podem causar câncer foi relatada estudos em coelhos em
1935 (ROUS; BEARD, 1935). Isto foi seguido em 1981 em demonstração de avanço
que os PV causam a maioria dos cânceres de colo de útero em humanos (ZUR
HAUSEN et al., 1981).
Nos cães, as verrugas transmissíveis foram observadas pela primeira vez em
1898, com uma etiologia viral confirmada em 1959 (NICHOLLS, 1999). Usando
microscopia de luz e eletrônica, a evidência da etiologia da PV foi sugerida em 1969
e o primeiro PV canino foi totalmente sequenciado em 1994 (DELIUS et al., 1994). Em
contraste, como os PV raramente causam papilomas em gatos, a primeira evidência
da doença induzida pela PV nesta espécie não foi relatada até 1990 (CARNEY et al.,
1990), entretanto, o primeiro PV de gatos domésticos foi totalmente sequenciado em
2002 (TACHEZY et al., 2002).
Nos anos subsequentes à estes estudos iniciais de PV, tipos adicionais de PV
foram identificados e associados com uma gama alargada de doenças caninas e
felinas. Além do mais, é sabido que os fatores do hospedeiro desempenham um papel
significativo na determinação de que a doença causará um quadro clinicamente
relevante (MUNDAY, 2017). As lesões na cavidade oral são a principal forma de
apresentação clínica da papilomatose em cães. A papilomatose oral ocorre
preferencialmente nos lábios, língua, palato, mucosa da faringe e esôfago. Papilomas
oculares ocorrem em conjuntiva, córnea e margem palpebral. As lesões se
desenvolvem nos cães predominantemente entre um a cinco meses, regredindo na
maioria dos casos quatro a oito semanas após o início das lesões, podendo,
ocasionalmente, tenderem a cronicidade (CHAMBERS, 1959; CALVERT, 1990).
13
2.1.1Taxonomia
A papilomatose canina é uma doença infectocontagiosa causada por um vírus
da família Papillomaviridae, gênero Lambda papilomavírus (CALVERT, 2006). Esta
família pode ser considerada uma das mais antigas e extensas, com uma grande
diversidade genética, sendo o Papilomavírus humano (HPV) o que possui mais tipos
identificados, com 205 tipos descritos até o momento no banco de dados
Papilomavirus Episteme (VAN DOORSLAER, 2013).
O Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus (ICTV) classifica os PVs
quanto ao gênero de acordo com o alfabeto grego. Já as espécies possuem o mesmo
nome do gênero mais uma numeração arábica ao final deste nome, o que vai
diferenciá-las. Os gêneros de CPV aprovadas pelo ICTV são: Chipapilomavírus
(ChiPVs), Lambda papilomavírus (LambdaPVs) e Taupapilomavírus (TauPVs). E as
espécies aprovadas são: ChiPV 1; ChiPV 2; ChiPV 3; TauPV 1; TauPV 2; LambdaPV
2; e LambdaPV 3. Para identificação de um novo tipo, deve-se ter uma diferença de
mais de 10% em relação ao tipo mais próximo já conhecido. Diferenças entre 2 e 10%
entre as sequências definem um novo subtipo e menos de 2% uma nova variante (DE
VILLIERS et al., 2004).
Os papilomavírus são altamente espécie/tecido – específicos, são vírus
icosaédricos pequenos, não envelopados, que infectam os estratificados epitélio
escamoso de muitas espécies de mamíferos, seres humanos, animais domésticos e
selvagens, assim como algumas espécies aviárias e reptilianas. Seu genoma circular
de DNA de cadeia dupla tem cerca de 8000 pares de bases e inclui cinco ou seis
quadros de leitura aberta precoce (E) e dois tardios (L) (MUNDAY; PASAVENTO,
2017). A ausência de envelope confere maior resistência do vírus no ambiente.
Apresentam termo estabilidade e são resistentes ao pH ácido, ao éter e aos solventes
lipídicos (CALVERT, 2006).
Na comunidade científica os PV são conhecidos pela nomenclatura
baseada no nome científico do hospedeiro e o tipo de papilomavirus identificado. Para
o papilomavírus canino é utilizado o nome “Canis familiaris papilomavírus” (CPV)
acrescentando ao final do nome, a numeração da identificação do tipo, com exceção
para o CPV1 que também é conhecido como “Canis familiaris oral papilomavírus 1”
(BERNARD et al., 2010). Atualmente, 18 tipos Canis familiaris papilomavirus (CPV)
foram totalmente sequenciados e classificados como Lambapapillomavirus,
14
Taupapillomavirus e Chipapillomavirus. No entanto, sequências curtas dos tipos de
PV foram amplificados a partir de cães e gatos, sugerindo que os novos tipos de PV
serão reconhecidos de ambas as espécies no futuro (LUFF, 2012; MUNDAY, 2016).
2.1.2 Infecção Viral
Os vírus da família Papillomaviridae infectam diferentes espécies de mamíferos
e aves e caracterizam-se pela propriedade oncogênica, que é responsável pela
produção de lesões tumorais benignas e malignas, nos epitélios cutâneos e mucoso.
A infecção por membros da família Papillomaviridae ocasionam enfermidades
semelhantes nas diversas espécies acometidas e está amplamente distribuída em
todo o mundo (ALFIERI et. al, 2002).
No ciclo de infecção do PV, que acompanha o ciclo celular dos ceratinócitos,
primeiramente, os genes iniciais do vírus são expressos no núcleo das células na
camada basal da epiderme e há a replicação do DNA viral; depois a expressão destes
genes fica baixa e o genoma do vírus epissomal, ocorrendo centenas de amplificações
do DNA viral por célula (LANGE; FAVROT, 2011; LANGE, 2013; YHEE, 2010).
Para o início, bem-sucedido, de infeção produtiva, as partículas infecciosas
precisam penetrar nas células da camada basal, o que requer na maioria dos casos,
a ruptura do epitélio. Contudo, em todos os casos, a infeção inicial é seguida por um
período de latência viral, durante o qual o genoma viral sofre replicação como
elementos extra cromossômicos autônomos. Após a diferenciação de células basais
no epitélio em maturação, a expressão dos genes do capsídeo é induzida a produzir
vírus maduro e as correspondentes lesões macroscópicas visíveis. O desfecho da
infeção por PV depende da patogenicidade intrínseca da cepa de PV e da imunidade
do hospedeiro e também da sua base genética (FAVROT, 2015).
A diferenciação dos ceratinócitos resulta na expressão das proteínas PV E6
e E7 que promovem replicação da célula suprabasal normalmente pós-mitótica e
permitir a amplificação em larga o genoma viral. Expressão das proteínas do capsídeo
PV (L1 e L2) e a montagem viral ocorre quando a célula infectada atinge o epitélio
superior. Vírus carregados de papiloma queratinócitos maduros são desprendidos da
superfície epitelial com a subsequente ruptura de essas células, liberando virions
infecciosos (DOORBAR et al., 2012).
15
A apresentação clínica de uma infecção por PV é largamente determinada
pelo grau de proliferação induzida pelo PV. A maioria dos tipos de PV aumenta apenas
levemente a proliferação celular e a replicação ocorre, lentamente na ausência de
lesões visíveis (DOORBAR et al., 2012). Alternativamente, uma minoria dos tipos de
PV aumenta acentuadamente a replicação celular, resultando em produção de um
grande número de partículas virais. Tais infecções causam epitelialidade marcada
pela hiperplasia que é visível clinicamente como um papiloma (verrugas) (MUNDAY,
2014). Como a maioria da replicação viral ocorre nas camadas epiteliais externas na
ausência de lise celular, as infecções por PV frequentemente causam apenas uma
fraca resposta imune do hospedeiro (DOORBAR, 2006).
No entanto, quando ocorre uma reação imunológica, a resposta pode ser
subdividida em humoral e imunidade mediada por células. A produção de anticorpos
IgG circulantes bloqueia a entrada do PV para as células basais, prevenindo novas
infecções por este tipo de PV, embora os não influenciam a resolução de uma infecção
por PV estabelecida (NICHOLLS, 1999). O desenvolvimento de uma resposta
mediada por células resulta na resolução de infecções estabelecidas. Como há
variação intra-individual no tempo de resposta do organismo, para montar uma
resposta mediada por células, há também uma variação no tempo para resolver um
papiloma clinicamente visível. Como relatado anteriormente, a resolução também
pode ser adiada em animais imunossuprimidos (DOORBAR, 2017).
Na maioria dos cães e gatos, a infecção por PV é inaparente (MUNDAY,
2011; LANGE, 2011). Estas infecções geralmente não resultam em hiperplasia
epitelial visível, porque o sistema imunológico é capaz de impedir o PV de modificar a
regulação normal das células epiteliais. No entanto, se houver mudanças no
hospedeiro há maior expressão da proteína PV, a hiperplasia epitelial resultante em
produzir uma lesão. Atualmente, os fatores do hospedeiro que determinam se a
infecção por PV causar uma lesão hiperplásica visível são pouco compreendidas
(EGAWA; DOORBAR, 2017).
No entanto, a imunossupressão parece predispor ao desenvolvimento de
algumas lesões induzidas por PV (CALLAN et al., 2005) e a freqüência aumentada de
placas pigmentadas em certas raças de cão (NARAMA et al., 2005; LUFF et al., 2016)
sugere que fatores genéticos também podem influenciar se uma infecção por PV
permanece assintomática ou resulta em doença clínica.
16
2.1.3 Papiloma Oral
Papilomas orais causados pelo CPV-1 (anteriormente chamado de PV oral
canina) são comuns em cães jovens e ou imunocomprometidos (LANGE; FAVROT,
2011). A epidemiologia da infecção pelo CPV-1 é pobremente entendida. Existem
relatos de surtos de papilomatose oral canina, sugerindo que a doença pode ser
adquirida através do contato com cães afetados. No entanto, uma vez que os cães
são comumente infectados de forma inaparente pelo CPV-1, evitar cães com
papilomas pode não sersuficiente para prevenir a doença (LANGE et al., 2011).
A papilomatose oral, demonstradas nas figuras 1 e 2, é caracterizada pelo
aparecimento de pequenos papilomas pedunculados (1 – 2 cm de comprimento) na
cavidade oral, podendo estender-se desde a gengiva até o palato. Os animais podem
apresentar também lesões ao redor da boca e olhos. As implicações dessa forma de
papilomatose são a dificuldade de alimentação e o mal estar. Todavia, a maioria dos
cães não apresentam sinais de doença, embora haja relatos raros de doença extensa
que interfere com a alimentação ou respiração (ALFIERI, 2002).
A histopatologia revela uma massa exofítica composta por epitélio dobrado
espessado, muitas vezes com numerosas alterações celulares induzidas por PV. A
maioria dos papilomas orais caninos regride espontaneamente e a excisão cirúrgica
raramente é necessária. A regressão é devido ao desenvolvimento de uma célula
mediada por resposta imune. Em papilomas induzidos experimentalmente, a
resolução tipicamente ocorre dentro de 8 semanas. No entanto, a resolução dos
Figura 2. Papiloma oral. Fonte: MOURA,2012. Figura 1. Papiloma oral. Fonte: REGALADO IBARRA, 2018.
17
papilomas naturais parece ser mais variável, com resolução que pode levar até 12
meses em alguns cães (NICHOLLS; STANLEY, 1999).
Numerosos tratamentos para acelerar a resolução de papilomas orais foram
propostos, mas a maioria não foi avaliada em estudos apropriados. Há relatos raros
de papilomas orais persistentes e repetidamente recorrentes. Acredita-se que estes
se desenvolvam devido a uma resposta imune ineficaz mediada por células contra
células (ALFIERI, 2002). A maioria dos cães não tem outros sinais detectáveis de
imunossupressão, sugerindo uma deficiência imunológica específica para PVs. Estes
cães podem desenvolver papilomatose extensa e pode estar predisposto a CCE
(REGALADO, 2016).
2.1.4 Papiloma Cutâneo
Os papilomas cutâneos caninos têm sido associados aos CPV-1, 2, 6 e 7
(LANGE, 2009). A maioria se desenvolve em cães jovens, presumivelmente no
momento da primeira infecção pelo PV causal. Os papilomas cutâneos podem ser
únicos ou múltiplos. Podem ocorrer em qualquer parte do corpo, mas são mais
comuns na face, ouvidos, como demonstrado na figura 3, e extremidades (GROSS et
al., 2005).
Histologicamente, papilomas podem ser subdivididos em papilomas
exofíticos, nos quais a epiderme dobrada se projete acima da superfície da pele e
papilomas invertidos, nos quais o epitélio dobrado está contido dentro de uma
estrutura em forma verrucosa (CAMPBELL, 1988; MUNDAY, 2017). A resolução
espontânea é esperada, embora os papilomas persistentes tenham sido observados
Figura 3. Papiloma cutâneo em região de ouvido. Fonte: MUNDAY, 2017.
18
e a progressão de papilomas invertidos induzidos por CPV-2 para CCE foi relatada
em vários cães em uma colônia de pesquisa de cães imunocomprometidos
(GOLDSCHMIDT et al., 2006).
2.1.5 Placas Virais Pigmentadas
Placas pigmentadas caninas estão associadas a um número de tipos de
Chipapillomavirus (TOBLER, 2008; LANGE, 2012; LUFF et al., 2015). A papilomatose
também pode se desenvolver na forma de placas pigmentadas múltiplas que ocorrem
com maior freqüência em cães mais jovens, assim como em adultos, com maior
severidade observada em algumas raças (MEDLEAU, 2009).
É provável que cães freqüentemente infectados de forma assintomática seja
por esses tipos de PV, mas apenas desenvolvem-se placas quando os fatores do
hospedeiro permitem aumento da replicação do PV. O papel do hospedeiro no
desenvolvimento da doença é ilustrado pela predisposição a placas observadas em
cães recebendo terapia imunossupressora e em cães da raça pug (NARAMA et al.,
2005). No entanto, como as placas pigmentadas também ocorrem em cães de outras
raças sem qualquer doença imunossupressora identificável, os fatores precisos do
hospedeiro para formação da placa são desconhecidos. As placas são tipicamente
escuras, múltiplas e de 1-10 mm de diâmetro. Elas são mais comuns em região ventral
como demonstrado na figura 4, face medial de membro pélvico, pescoço e tronco
(MUNDAY et al., 2011).
A histopatologia revela acantose epidérmica moderada, hiperceratose, uma
típica aparência da superfície da pele e pigmentação da melanina epidérmica e
dérmica proeminentes. Acredita-se ser uma doença hereditária com características
autossômicas dominantes que surge como lesões que progridem sem sinais de
regressão. As placas pigmentadas múltiplas são raras e conhecidas como a forma
familiar da papilomatose. O principal diagnóstico diferencial é o melanoma. Acredita-
se na existência de um PV indeterminado associado a múltiplas placas virais
pigmentadas em cães (MEDLEAU, 2009).
19
Figura 4. Placas pigmentada em região ventral do abdome. Fonte: TOBLER, 2007.
Geralmente, as placas pigmentadas são consideradas esteticamente
indesejáveis, mas não tem um impacto negativo na saúde. No entanto, as placas
pigmentadas podem sofrer transformação maligna para um CCE (MUNDAY et al.,
2011; LUFF et al.,2016). Embora a transformação maligna tenha sido relatada apenas
em placas que foram associados ao CPV-9, 12 e 16. O número de casos publicados
sugere que o potencial maligno não pode ser excluído para placas causadas por
outros tipos de PV. Cães com placas pigmentadas devem ser avaliados para excluir
qualquer doença imunossupressora. Embora o tratamento muitas vezes não seja
necessário, a excisão cirúrgica das placas é possível. Um cão com numerosas placas
virais foi submetido ao tratamento com terapia a laser, evidenciando sucesso. Placas
devem ser observadas cuidadosamente para qualquer evidência de transformação
maligna (MUNDAY et al., 2011).
2.2 A PELE E O CÂNCER
Nos últimos anos, a incidência de várias doenças em animais de companhia
aumentou, assim como a expectativa de vida que foi prolongada. Entre essas
doenças, a incidência de câncer em cães vem aumentando em particular
(MEIRELLES et al., 2010). Em contrapartida ao avanço da área oncológica é exigido
do médico veterinário que atua no atendimento clínico diário, a atualização dos seus
conceitos, os quais devem estar sedimentados sobre uma base sólida. É essencial
todo conhecimento que envolva desde a formação, classificação, os mecanismos de
invasão local e metástase. Tais informações estruturam as tomadas de decisões
20
frente a cada caso e permitem a leitura e entendimento dos artigos atuais publicados
sobre o assunto (GUEDES, 1998; BALDIN, 2005; WITHROW, 2007).
Os tumores cutâneos são as neoplasias mais frequentemente encontrados nos
animais domésticos. A prevalência nesta região do corpo deve-se ao fato de que a
pele, além de ser o maior de todos os órgãos, é constituída, juntamente com o tecido
subcutâneo, por uma grande variedade de células suscetíveis ao desenvolvimento de
neoplasias (HAUCK, 2013).
A pele tem um alto índice de renovação celular, o que aumenta as chances de
ocorrência de mutações, e pode propiciar o surgimento de tumores (MEIRELLES et
al., 2010). Apresenta inúmeras estruturas anatômicas, que incluem a epiderme (que
contém camadas de ceratinócitos com melanócitos, células de Langherhans e as
células de Merkel), a derme que contém células do tecido conjuntivo (fibroblastos),
células hematopoiéticas (mastócitos, histiócitos), anexos epidérmicos (folículos
pilosos, glândulas sudoríparas e sebáceas), nervos, vasos sanguíneos e os vasos
linfáticos, além dos granulócitos, linfócitos, monócitos e os plasmócitos, comprovando
assim a alternância entre os tipos celulares em um mesmo local e a possibilidade de
que quaisquer tecido ou célula poder originar tumorações benignas ou malignas
(KRAEGEL, 2004).
A neoplasia formada no epitélio cutâneo é denominada de CCE que possui
várias sinonímias, como carcinoma espinocelular, carcinoma escamocelular ou
carcinoma epidermóide. É uma neoformação maligna de células epidérmicas, das
quais se diferenciam para ceratinócitos, de crescimento lento e não necessariamente
metastático, comum em felinos, bovinos, caninos, equinos, relativamente incomum
em ovinos e raro em caprinos e suínos. (GOLDSCHMIDT, 2002; SOUZA, 2005;
SCOPEL, 2007).
2.3 CARCINOMAS CUTÂNEOS
Existem duas classificações para os carcinomas cutâneos. A primeira é
denominada carcinoma in situ, que compreende o carcinoma de Bowenoide e a
ceratose actníca. E respectivamente, o carcinoma invasivo, que compreende o
carcinoma basocelular e o carcinoma de células escamosas (WITROW, 2013).
21
2.3.1 Carcinoma Bowenoide
O carcinoma de células escamosas multicêntrico in situ, em cães (figura 6 e 7)
e gatos, é denominado doença bowenoide ou carcinoma bowenoide in situ (BISC).
Essa doença foi inicialmente descrita em humanos em 1912 e desde então, tem sido
relatada em outras espécies. É causada por papilomavírus humanos (HPV) capazes
de induzir a carcinogênese de colo de útero. Semelhante tem se detectado de forma
crescente variantes caninas e felinas de papilomavírus em lesões do tipo BISC em
ambas as espécies (WITHROW, 2013).
Na histopatologia, a doença de bowenoide é semelhante aos carcinomas
epidermóides convencionais, diferindo principalmente por ser uma neoplasia restrita
a epiderme e folículo piloso (SOUZA, 2005). O carcinoma bowenoide in situ pode ser
dividido em histotipos irregulares não hiperceratóticos e verrucoso hiperceratótico. A
principal característica histopatológica além da displasia é a ausência de invasão da
membrana basal (in situ). Tem como principal diagnóstico diferencial a ceratose
actínica. Às vezes se faz necessário a realização de exame imunohistoquímica para
diferenciação das duas afecções (DALECK, 2016).
As lesões em geral são em forma de placas crostosas ou verrucosas, solitárias
ou múltiplas, podendo ser alopécicas e eritematosas. Ocorrem tanto em áreas
pigmentadas como nas desprovidas de despigmentação. Afetam principalmente face,
pescoço, membros torácicos e dígitos. As lesões não tratadas em pacientes humanos
com doença de bowenoide podem evoluir para CCE. No caso de lesões solitárias, a
exérese cirúrgica é recomendada, assim como a criocirurgia ou a remoção a laser.
Figura 6. Carcinoma in situ interdigital. Fonte: MUNDAY, 2017.
Figura 5.Carcinoma in situ facial. Fonte: DALECK, 2016
22
Porém, novas lesões podem se originar após o procedimento cirúrgico. Como
imunomodulador, pode-se utilizar imiquimode 5 % creme tópico a cada 24 a 48 horas
de 2 a 3 semanas. O prognóstico muitas vezes é reservado devido a novas lesões se
desenvolverem (WITHROW, 2013).
2.3.2 Ceratose Actínica
A ceratose actínica é uma proliferação pré-maligna de ceratinócitos
epidérmicos atípicos em cães e gatos expostos a luz solar. A exposição crônica e
excessiva a luz ultravioleta, gera danos diretos e indiretos ao DNA dos ceratinócitos
epidérmicos que podem sofrer transformação maligna e progredir para o CCE.
Sequência de DNA viral, isto é, PV, foram encontrados em ceratose actínicas de cães
e gatos (HAUCK, 2013). É caracterizada por hiperplasia epidérmica com displasia e
atipia dos ceratinócitos, hiperceratose para ceratose, aumento do índice mitótico,
inflamação dérmica, comedões actínicos, furunculose actínica, elastose e fibrose
solar. O marco central é a ausência de invasão da membrana basal da epiderme pelos
ceratinócitos atípicos. O principal diagnóstico diferencial é o BISC (WITHROW, 2013).
O fator etiológico de maior importância é a excessiva exposição à luz UV, que
provoca consequências imunológicas locais e sistêmicas. Ocorrem alterações as
funções e características morfológicas das células de Langerhans, além de influenciar
a produção de citocinas na pele (LEBWOHL, 2003). O estresse fotooxidativo
provocado por raios UVA, indiretamente, causa mutações características no DNA. Por
outro lado, a radiação UVB age diretamente na formação de dímero de timina e
transições C→T OU CC→TT no DNA e RNA. A ausência de mecanismos adequados
de reparação nestas alterações no DNA representa o início das mutações nos
ceratinócitos que podem progredir no desenvolvimento da ceratose actínica
(STOCKFLETH; KERL, 2006).
O gene supressor tumoral p53 é um dos principais alvos do dano solar.
Sequências de DNA viral do PV, foram encontradas em ceratoses actínicas de cães
e gatos (DELLECK, 2016). O PV atua como co-carcinógeno na etiopatogenia da
ceratose actínica em humanos e estimula a proliferação epitelial em várias espécies
animais (MUNDAY et al., 2007).
Em até 1 % dos pacientes humanos não submetidas a fotoproteção, há
evolução da lesão pré-maligna para o CCE. Em cães, é comum ser encontrada intensa
23
displasia epidérmica contígua a zonas com carcinoma francamente invasivo. A
ceratose é encontrada em cães das raças Dálmata, American Staffordshire Terrier,
Beagle, BassetHound e Bull Terrier que apresentam predisposição a lesões actínicas
(SCOTT et al., 2001). As lesões ocorrem principalmente em cães mais velhos, mas a
doença também foi observada em idade inferior a dois anos (GROSS et al., 2005).
O aspecto clínico é extremamente variável. A incidência de ceratose actníca
varia conforme a localização geográfica do ambiente em que o paciente vive, assim
como o hábito de se expor a luz solar. As lesões são observadas em áreas
cronicamente expostas ao sol e na maioria dos casos ocorrem em regiões menos
pigmentadas e com poucos pêlos, representado nas figuras 7 e 8, como abdômen
ventral, lateral e flanco (GROSS et al., 2005). Os clínicos têm relacionado que
pacientes que apresentam ceratose actníca também apresentam hipotireoidismo. Isso
pode explicar a intensa necessidade que esses cães têm de buscar a luz solar, por
conta da termofilia que costumam apresentar (DALECK, 2016).
Em decorrência da cronicidade, as lesões variam de eritema focal com crostas
e descamação, pápulas e máculas mal definidas, placas e nódulos ceratóticos, firmes,
com crostas escurecidas. Erosões e úlceras com crostas hemorrágicas podem
ocorrer. Piodermite secundária com furunculose actínica são achados comuns e são
oriundos de comedões actínicos (DALECK, 2016).
As lesões iniciais apresentam melhora clínica com o uso de fotoprotetores e
evitando-se exposição solar. Caso não regridam, o recomendado é retirar por
completo o paciente da exposição solar, assim como vestir roupas e utilizar filtro solar
com fator de proteção 30 ou superior, em base gel para o corpo e na forma de filtro
labial para o focinho e plano nasal, se possível, a cada 4 horas. Se houver prurido ou
dor, glicocorticóides tópicos ou por via oral são benéficos. Preconiza-se a hidratação
Figura 8.Ceratose actínica. Fonte: VICCINI, 2017.
Figura 7.Ceratose actínica. Fonte: VICCINI, 2017.
24
da pele com o uso de xampus contendo uréia de 4 a 6 % em banhos semanais ou de
sprays para uso diário a base de uréia a 3% e aloe vera a 2% e de ampolas contendo
ceramidas para uso semanal, após banho. Lesões avançadas requerem a utilização
de retinóides sistêmicos ou administração tópica de 5-fluoruracila ou do imiquimode 5
% creme de 2 a 3 vezes/semana como opções de controle das lesões. Como outra
modalidade de tratamento, pode-se optar por criocirurgia ou remoção cirúrgica
(SCOTT et al., 2001). O prognostico é variável e depende do grau de diferenciação e
do local das lesões. Deve-se sempre considerar a possibilidade de progressão do
quadro para CCE, que torna o prognostico pior (WITHROW, 2013; DALECK, 2016).
2.3.3 Carcinoma Basocelular
O carcinoma basocelular é um carcinoma invasivo (figura 9), definido como um
tumor de baixo grau de malignidade originário da camada basal da epiderme
interfolicular ou folicular. Em humanos a exposição solar crônica, mutações gênicas e
vias de sinalização especificas participam da carcinogênese. Os carcinomas
basocelulares são raros, representando menos de 0,35 e 1,25% dos tumores
cutâneos em cães e gatos, respectivamente. Ocorrem com maior frequência em cães
com 8 anos e gatos com 10 anos (BLANCA et al., 2016).
Os carcinomas de células basais, geralmente apresentam-se como placas
firmes ou nódulos umbilicados, que medem de milímetros a centímetros. As lesões
nos cães são localizadas no tronco, especialmente em regiões de pele glabra. São
divididos em padrão sólido, ceratinizante (ceratótico) e com predomínio de células
claras. Localizam-se na derme, apresentam configuração em placa e continuidade
Figura 9. Carcinoma basocelular em focinho. Fonte: WITHROW, 2013.
25
com a epiderme. As células que os compõe são similares as células basais da
epiderme e folículos pilosos. O pleomorfismo celular e atipia são mínimos, o que
confere a esses tumores aspecto histológico pseudobenigno. O índice mitótico é de
moderado a alto, com eventuais figuras de mitose atípicas. Podem-se observar zonas
de diferenciação escamosa, centros de necrose e formação de fendas estromais arte-
fatuais. Os diagnósticos diferenciais incluem: adenomas/carcinomas ductulares
sólido-císticos, epiteliomas sebáceos, tricoblastomas e carcinoma sebáceos
epiteliomatosos (DALECK, 2016).
A excisão cirúrgica com ampla margem é o tratamento de escolha, quando
possível. A radioterapia e a criocirurgia podem auxiliar no tratamento quando a
exérese neoplásica completa não for possível. O prognóstico é bom, porém em alguns
casos, pode haver lesões metastáticas (WITHROW, 2013).
2.3.4 Carcinoma de células escamosas
O CCE, carcinoma espinocelular ou carcinoma epidermóide é uma neoplasia
epitelial maligna do tecido cutâneo e subcutâneo, comum em cães e gatos, que tem
origem nos ceratinócitos (SCOTT et al., 2001). Possuí crescimento lento, alta
invasividade local, porém não é necessariamente metastático, todavia, quando as
mesmas ocorrem o fazem tardiamente (HOLANDA et al. 2009).
É também classificado como carcinoma invasivo. Os ceratinócitos são as
células mais abundantes da epiderme. Encontram-se nos 5 estratos que a constituem.
São mais numerosos nos estratos mais superficiais, ou seja, o estrato córneo da
epiderme possui maior percentagem de ceratinócitos do que o estrato basal. Os
tonofilamentos de queratina, juntamente com os desmossomas, são essenciais para
a coesão entre as células e para conferir resistência ao atrito (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2004).
Produzem queratina, mas essa queratina não é semelhante em todas as
camadas da epiderme, pois a sua composição vai-se modificando à medida que os
ceratinócitos se diferenciam. Assim, o estrato mais próximo da derme, o estrato basal,
tem ceratinócitos menos diferenciados que sintetizam queratina de baixo peso
molecular, enquanto os ceratinócitos dos estratos mais superficiais, logo mais
diferenciados, sintetizam queratina de maior peso molecular. Quando chegam ao
26
estrato córneo, os ceratinócitos estão transformados em placas sem vida que
descamam continuamente (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
A gênese do CCE requer uma série de acontecimentos a nível celular (como
mutações genéticas ocorridas ao acaso) que acontecem em uma ou duas células. O
processo genético que leva à malignidade das células é constituído por 3 passos:
iniciação, promoção e a proliferação. Na iniciação, um fator etiológico atua no
crescimento ou regulação celular, interagindo com o material genético. Durante a
promoção do tumor, fatores adicionais criam um ambiente que favorece a proliferação
das células mutadas. Por último, a progressão tumoral consiste em acontecimentos
genéticos e epigenéticos que dão capacidade aos ceratinócitos para invadir o estroma
(GILSON, 1998).
Existem muitos fatores que estão associados ao desenvolvimento CCE,
incluindo a exposição prolongada à luz UV, falta de pigmento na epiderme, perda de
pêlos ou cobertura de pêlos muito esparsa nos locais afetados. Sabe-se que já existe
correlação do CCE com a presença de PV, como demonstrado em cerca de metade
dos casos de CCE nasais em gatos em estudo específico (GOLDSCHMIDT, 2006).
Indivíduos imunossuprimidos apresentam um risco maior de desenvolverem a
neoplasia. A luz solar, além de seus efeitos sobre o DNA, também parece exercer um
efeito imunossupressor direto e, pelo menos, transitório sobre a pele, afetando a
função normal de vigilância das células de Langerhans (MURPHY, 2000).
As lesões do CCE cutâneo podem ser solitárias ou múltiplas. Normalmente são
solitárias, exceto quando os tumores se encontram associados a lesões solares.
Nesses casos as lesões podem ser múltiplas (RODASKI; WERNER, 2008). Quando
o CCE é causado por dano solar na pele as lesões tumorais podem ser
acompanhadas de eritema, descamação seguida de formação de crostas,
adelgaçamento da epiderme (lesões pré-neoplásicas) e ainda por outros tumores
cutâneos que também sejam induzidos pela radiação solar, como hemangiomas e
hemangiossarcomas dérmicos (NORTHRUP; GIEGER, 2010).
Este tipo de tumor, por norma, é localmente invasivo, infiltra a derme e os
tecidos subcutâneos subjacentes, mas metastiza lentamente. Metástases nos
linfonodos regionais ou no pulmão são encontradas em casos avançados ou em
neoplasias pouco diferenciadas, como as variantes acantolítica ou de células
fusiformes. Se houver metastização para linfonodos regionais está indicada a
extirpação dos mesmos (SCOTT et al., 2001).
27
Os tumores podem ser de dois tipos: produtivos ou erosivos. Os produtivos
possuem aspecto papilar de tamanho variável com aspecto de couve-flor (figura 10 e
11), normalmente com superfície ulcerada e sangram com facilidade. Os erosivos são
os mais comuns e são formados por úlceras cobertas com crostas, que se tornam
profundas e formam crateras (FERNANDES, 2001). Histologicamente observa-se que
a lesão se estende através da derme estando ou não associada à proliferação ou
espessamento da epiderme, formando ilhas, cordas e trabéculas de células epiteliais
neoplásicas que demonstram um grau variável de diferenciação escamosa (WEISS et
al. 1974).
Entre os diagnósticos diferenciais de CCE encontram-se: epitelioma cornificado
intracutâneo, papiloma escamoso, carcinoma basoescamoso (RASKIN, 2003),
melanoma, mastocitoma, hemangioma ou hemangiossarcoma cutâneo, tumores do
folículo piloso, tumores das glândulas sebáceas; além de outras enfermidades como
a leishmaniose, dermatofitose, pênfigo e processos alérgicos (CRYSTAL, 2004).
As mesmas recomendações dadas para a ceratose actínica são úteis no
controle da progressão do CCE. Adicionam-se modalidades de quimioterapia
intralesional utilizando-se, carboplatina na dose de 1,5 mg/cm³ a cada 7 dias até a
remissão. Usa-se também fototerapia, criocirurgia e eletroquimioterapia, de acordo
com o tamanho, a localização e a progressão das lesões. A quimioterapia sistêmica
pode ser realizada, embora seus resultados isoladamente não sejam animadores.
Pode-se usar carboplatina na dose de 250 mg/m² a cada 21 dias de 4 a 6 sessões ou
a doxorrubicina na dose de 30 mg/m² também a cada 21 dias, de 4 a 6 sessões. O
prognóstico depende da localização e do grau de diferenciação do CCE, considerando
Figura 11. CCE em dígito. Fonte: MUNDAY, 2017.
Figura 10. CCE em região ventral. Fonte: WITHROW, 2013.
28
ruim nos casos em que as narinas estão envolvidas, e é reservado quando o abdome
é acometido (DALECK, 2016).
2.4 CARCINOMA DE CELULA ESCAMOSADE MUCOSAS
2.4.1 Olho
O CCE surge no epitélio conjuntival do limbo, da conjuntiva bulbar, da terceira
pálpebra, ou da epiderme das pálpebras como na figura 12, ocorrendo com maior
freqüência no gato e em outras espécies (bovina e equina), do que no cão. O fato de
ser uma neoplasia rara em cães é sem dúvida peculiar e, até o momento sem
explicações científicas definitivas. Essa neoplasia epidérmica pode ser multifocal e
apresentar aspecto macroscópico similar ao de um papiloma (exofítico) ou, ainda
erosivo com destruição do tecido orbital e/ou penetração variável nos tecidos do bulbo
do olho (DALECK, 2016).
O CCE ocorre com frequência em conjunto com inflamação crônica da margem
palpebral e da conjuntiva. O crescimento da neoplasia não segue uma regra
especifica, mas tende a ser circunferencial ao redor da margem palpebral, resultando
por vezes em fissura da pálpebra quando envolvida por uma massa tumoral grande.
O aspecto avermelhado, úmido, ulcerado e crostoso são característicos e de
observação muito comum na clínica. As metástases podem ocorrer na doença
avançada. Em cães só CCE dificilmente acomete o bulbo do olho. O papiloma
escamoso é incidente em mucosa oral e parece ser exclusivo da conjuntiva e o
papiloma reativo ocorre geralmente na margem palpebral. A etiologia de ambos os
papilomas é desconhecida e o prognóstico é excelente, sendo a terapêutica idêntica
à do papiloma viral (DUBIELZIG, 2011).
Figura 12. CCE em superfície de córnea. Fonte: DALECK, 2016.
29
2.4.2 Cavidade oral
O CCE é o tumor de cavidade oral mais comum em gatos e o segundo em cães
(figura 13). Alguns fatores de risco foram relatados em felinos, como o uso de coleira
antipulgas, alta ingestão de alimentos enlatados, especialmente de atum em conserva
e exposição a fumaça de cigarro na casa de proprietários. Invasão óssea é frequente
e normalmente grave e extensa, sobretudo em gatos. Já as taxas de metástases
dependem da localização do tumor, por exemplo, na forma não tonsilar é de
aproximadamente 20 %, com tumores na região rostral apresentando baixa taxa de
metástases e na região caudal da língua e na tonsila com um alto potencial
metastático. O carcinoma tonsilar tem evidencias dez vezes maior em cães que vivem
na zona urbana que na rural, possivelmente em razão de agentes poluentes
ambientais (DALECK, 2016).
O prognóstico para cães com CCE quando localizados na parte rostral, em
geral, é bom. O controle local do tumor, geralmente é um desafio importante, embora
as metástases para linfonodos regionais sejam relatadas em até 10% e nos pulmões
em 3 a 33%. Ao contrário, dos CCE das amígdalas e base da língua são altamente
metastáticos, com metástase relatada em até 73%. A recorrência locoregional é muito
comum. A cirurgia é o tratamento mais indicado para o tratamento de CCE
(WITHROW, 2013).
Figura 13. CCE oral. Fonte: REGALADO, 2018.
30
2.5 ATUAÇÃO DO PV NA ONCOGÊNESE
Os mecanismos moleculares induzidos pelos vírus sobre a célula transformada
ainda não são bem compreendidos. Sugere-se que o vírus possa ser o responsável
pelos eventos iniciais da carcinogênese, mas não pela continuidade da transformação
fenotípica. Também não está claro como os fatores carcinogênicos estão envolvidos
nos diferentes estágios de desenvolvimento dos papilomas e carcinomas (DOORBAR,
2001).
A provável associação causal entre a oncogênese viral e a transformação
maligna dos ceratinócitos é substanciada pela progressão tumor de carcinomas
bowenoides in situ e placas epidérmicas pigmentadas positivas para PV em CCE;
existe amplificação de genes associados aos PV em amostras de CCE; e há maior
freqüência de detecção de produtos de amplificação gênica de PV em tumores de
áreas fotoprotegidas comparados àqueles de áreas fotoexpostas. Mutações do gene
supressor tumoral p53 e a supressão da proteína p53, passíveis de detecção imuno-
histoquímicas em cães e gatos, também podem participar no processo de
carcinogênese. Doenças que causem despigmentação e favoreça raios UV, isto é,
pênfigo eritematoso, vitiligo e lúpus eritematoso discoide, podem predispor os
pacientes a dano actínico e, consequentemente, ao desenvolvimento de CCE (figura
14) (DALECK, 2016).
Todavia, sabe-se que um processo importante no câncer induzido por PV é
a integração acidental do PV com as proteinas E6 e E7 no DNA do hospedeiro,
resultando em crescimento celular rápido e descontrolado, inibição da apoptose,
Figura 14.Representação esquemática de como a ação do papilomavírus pode promover CCE em pele lesada pelo sol (Adaptado de MUNDAY; KIUPEL, 2010).
31
perda de telomerase e interrupção de processos que garantam a montagem precisa
de DNA hospedeiro replicado . Essas células geneticamente instáveis que se dividem
rapidamente acumulam mutações adicionais, resultando em progressão maligna
(DOORBAR et al., 2012).
Embora haja evidências acumuladas de que as PV podem causar câncer em
cães e gatos (MUNDAY, 2011; LUFF, 2016), as funções precisas do PV com E6
canino e felino e as proteínas E7 não foram completamente determinadas. Além disso,
algumas neoplasias demonstraram conter infecções produtivas, sugerindo que o DNA
do PV não pode ser integrado ao DNA hospedeiro (MUNDAY et al., 2015).
O PV causa proliferações benignas cutâneas e em mucosas, que em geral
são auto limitantes. Nos cães, a infecção por PV pode causar múltiplas placas
epiteliais e verrugas em uma variedade de locais na pele, incluindo a mucosa,
membranas mucocutâneas da cavidade oral, conjuntiva, córnea, lábios, pênis e vulva.
Após um período de incubação de 1 ou 2 meses, as lesões benignas geralmente não
suscitam em problemas sérios e até mesmo papilomatose oral grave mostra uma
regressão espontânea. Contudo, alguns casos são refratários ao tratamento, e os
CCE da pele e da gengiva também foram associados à infecçao ao PV (ZAUGG et
al., 2005).
Hoje já se sabe que essas lesões causadas pelo vírus podem progredir para
tumores malignos em cães (FAVROT, 2015). Em humano isso já é muito descrito. O
vírus induz uma ampla gama de infecções. Algumas são comensais, enquanto outros
causam transformações neoplásicas. Nos seres humanos, certos PV de mucosas
estão causalmente associados com câncer de colo de útero e um subconjunto de
câncer de cabeça e pescoço. A associação causal entre PV cutâneo e câncer de pele
são menos estabelecidos. Contudo, pacientes com doença genética estão em maior
risco de câncer de pele associado ao PV, sugerindo que PV podem desempenhar um
papel na carcinogênese (LUFF et al., 2016).
Até o momento 12 trabalhos estudaram a correlação da ocorrência do CCE
aliada a infecção viral pelo PV. Dentre eles, destaca-se MUNDAY com 6 trabalhos
desenvolvidos. Segue um breve levantamento de dados obtidos por esses trabalhos:
32
Tabela 1. Trabalhos que relataram a correlação de CCE com a infecção viral pelo PV.
AUTOR/ANO Nº DE AMOSTRAS
CLASSIFICAÇÃO LOCALIZAÇÃO
(+) (-)
LUFF, 2018 (LEÃO MARINHO)
01 CCE Pele 1+PCR e Imuno 0
MUNDAY, 2018 01 CCE Cavidade oral 1+ PCR 0
LUFF, 2016 02 CCE Pele 2+ PCR e Imuno
0
MUNDAY, 2016
01 CCE Cavidade oral 1+PCR e Imuno 0
MUNDAY, 2015
28
CCE
Gengiva
Tonsila
0
0
20
8
MUNDAY, 2015 01 CCE Cavidade oral 1+PCR IMUNO P 16
0
PORCELLATO, 2014
78
Papiloma/ CCE, melanoma,
ameloblastoma, adenocarcinoma,
hiperplasia
Cavidade oral 3/33 PCR e Imuno
30 CCE
MUNDAY, 2012
20
20
20
02
CCE
Hemangiossarcoma
Pele saudável
Placas virais
Pele
Pele
Pele
Pele
1+ PCR
0
0
1+
19
20
20
1
MUNDAY, 2010 5 CCE Pele 5 + PCR 0
ZAUGG, 2005
42
CCE in situ
CCE invasivo
CCE invasivo
Pele
Pele
Mucosa
2 +
2+
5+
0
15
18
CALLAN, 2005 01 CCE Pele 1+ Imuno 0
TEIFKE, 1997 54 CCE Pele, cavidade oral
3 +PCR e imuno
51
33
3 REFERÊNCIAS
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41
4 OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral deste trabalho é estudar, por técnicas moleculares, a
ocorrência da infecção pelo PV em lesões de CCE da pele, leito ungueal e mucosa
oral de cães.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar a frequência de ocorrência de PV em amostras de lesões de CCE;
Realizar um estudo comparativo dos achados histopatológicos e avaliação do
grau de malignidade e diferenciação celular dessas lesões a partir de duas
populações, uma com lesão associada à detecção do PV e outra com lesões
livres dessa associação.
42
5. ARTIGO
INVESTIGAÇÃO MOLECULAR DE PAPILOMA VÍRUS EM CARCINOMA DE
CÉLULAS ESCAMOSAS EM PELE E MUCOSA DE CÃES
RESUMO
VICCINI, F. Investigação molecular de papilomavírus em carcinoma de células
escamosas em pele e mucosa de cães. 2019. Dissertação (Mestrado Biociência
Animal) – Universidade de Cuiabá, Cuiabá, 2019.
Com o aumento da expectativa de vida dos animais de companhia, veio também a maior incidência de doenças, entre elas, o câncer. Os tumores cutâneos são as neoplasias mais encontradas nos animais domésticos e o carcinoma de células escamosas (CCE) representa um grande vilão nesse complexo tumoral. O CCE ocorre com mais frequência na pele, leitos ungueais, mucosas orais e oculares. O papilomavírus (PV) apresenta intenso epiteliotropismo por células epiteliais escamosas cutâneas e de mucosas. Já foi relatada a infecção do PV em vários tumores cutâneos e de mucosas, sejam eles malignos ou benignos, sendo o CCE o tumor onde o PV tem sido mais descrito. Alguns estudos também detectaram o PV em casos isolados de carcinomas in situ e várias placas epidérmicas pigmentadas em cães. Estes estudos, em sua grande maioria, foram realizados em casos isolados, ou lesões em regiões específicas como CCE orais. O presente estudo é inédito no Brasil, quando se trata da relação do CCE e PV em lesões neoplásicas cutâneas e de mucosas. Foram selecionados 27 blocos parafinados de CCE de cães; 23 de pele, 03 de leitos ungueais e 01 de mucosa oral. A partir desses blocos foram realizados exames de PCR para detecção molecular do PV. Os resultados encontrados confirmaram um percentual de 29,6 % de positividade, que também é o maior percentual verificado até o presente momento. Demonstrando que existe esta correlação e que baseado nas técnicas utilizadas a incidência da associação do PV ao CCE pode ser ainda subestimada. Palavras-chave: Neoplasia, vírus, queratinócitos.
43
INTRODUÇÃO
Existem diversas doenças neoplásicas, todavia, nenhuma possui origem única,
são provenientes de causas variadas. Desta forma, o estudo das neoplasias é de
fundamental importância para a compreensão de suas causas, tipos e formas de
tratamento (DIAS et al., 2015). O grande número de tumores cutâneos em cães se
deve ao fato que a pele é o maior órgão do corpo e representa a barreira física entre
o ambiente e organismo (JONES et al., 2000). Além de possuir exposição direta aos
fatores oncogênicos, propiciando as formações neoplásicas (MEDLEAU et al., 2009).
As neoplasias se caracterizam como novas formações que indicam um
crescimento anormal do tecido e que acaba se desenvolvendo mais rápido que os
tecidos normais em sua volta, de forma descoordenada e persistente (ALMEIDA et al.,
2005). Dentre as neoplasias mais frequentes em cães domésticos, é possível citar os
carcinomas de células escamosas (CCE), que apresenta elevada prevalência em
pacientes de idade avançada (SOUZA et al., 2006).
O CCE é um tumor maligno que afeta as células produtoras de queratina, ou
seja, os queratinócitos. Também pode ser descrito como carcinoma de células
espinhosas, carcinoma espinocelular ou carcinoma epidermóide. Sua patogenia está
associada principalmente a exposição à luz UV, falta de pigmentação na epiderme e
alopecia (RIBEIRO et al., 2010). Além disso, a pele possui inúmeras células e há um
alto índice de renovação celular sendo susceptível a mutações (MURPHY, 2006).
O PV canino já é bem caracterizado por induzir neoformações benignas
provocadas pela infecção de células epiteliais por PV espécie específico. Sabe-se que
estes possuem oncogenes virais responsáveis pelo crescimento e divisão das células
epiteliais do hospedeiro, assim como pela indução de um quadro de instabilidade
genética e mutações cromossômicas, podendo resultar em replicação e diferenciação
celular, resultando em neoplasias malignas (HNILICA, 2009).
44
MATERIAL E MÉTODOS
Para execução deste trabalho foram utilizados 27 casos previamente
diagnosticados como CCE pelo laboratório Centro Veterinária de Diagnóstico
Anatomopatológico e Biologia (Cevepat), Botucatu – SP, entre o período de 2016 a
2018. Os 27 casos foram classificados como: CCE de boca (n = 01), CCE tegumentar
(n = 24) e CCE ungueal (n = 02). Os blocos parafinados contendo tecidos
representativos das lesões neoplásicas foram encaminhados ao Laboratório de
Biologia Molecular da Universidade de Cuiabá para processamento e diagnóstico
molecular da infecção pelo PV.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Uso de Animais da
Universidade de Cuiabá, sob protocolo 030/2018.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Extração de ácido Nucleico
Para extração de ácidos nucléicos, secções teciduais fixadas em formal e
embebidas em parafina (FFEP) foram processadas; as amostras foram
desparafinadas, submetidas ao processo de digestão enzimática com proteinase K e
posterior extração de DNA.
Para tal, brevemente, foram obtidos 3 secções frescas de 5 micras dos blocos
parafinados contendo as lesões representativas dos diferentes CCE para extração de
ácido nucléico. As secções de lesões FFEP foram desparafinadas seguindo
protocolos químicos utilizando banhos de xilol e álcool absoluto seguindo o seguinte
protocolo: o material foi submetido a 3 banhos com 1 ml de xilol absoluto, seguido de
agitamento por 2 minutos no vórtex e centrifugação a 15000 RCF à 25 graus por 3
minutos. Em seguida, dados mais 3 banhos com álcool absoluto, agitação no vórtex
por dois minutos e centrifugação a 15000 RCF a 25 graus por 3 minutos. Após tais
procedimentos de banho, foi realizada secagem em banho seco a 35 graus durante
10 minutos. Adicionado então 90 ul do Buffer ATL e 20 ul de proteinase K, em seguida,
agitação no vórtex por 15 segundos e overnight. Após 24 horas a 56 graus em bloco
45
seco, o produto da digestão enzimática foi extraído usando o kit DNeasy Blood &
Tissue (Qiagen), segundo instrução do fabricante.
Reação de cadeia da polimerase
Para validação da PCR utilizada nesse estudo e seleção dos oligonucleotídeos
iniciadores a serem empregados no estudo, a amplificação e detecção do DNA do
CPV foram testadas em tecidos congelados (n = 2) e secções teciduais FFEP (n = 6)
de lesões benignas induzidas pelo PV, utilizando 5 pares de oligonucleotideos
iniciadores (Tabela 1), selecionados para amplificação de fragmentos parciais dos
genes L1, E1, E7 do PV. As reações foram conduzidas nas concentrações de primers,
Mg, dNTPs e Platinun taq DNA polimerase, seguindo protocolos previamente
estabelecidos nos trabalhos consultado referenciadores de cada oligonucleotídeos
iniciadores.
Todas as lesões tiveram previamente o diagnóstico histopatológico confirmado
de formações induzidas por PV em bovinos (lesões papilomatosas em pele – flanco,
sacro e tórax) e caninos (papiloma oral e placa pigmentada CPV-linked). A PCR de
duas lesões foi realizada em duplicata, sendo uma amostra da lesão congelada e outra
amostra da lesão FFEP (um papiloma bovino cutâneo e uma placa pigmentada CPV-
linked proveniente de um canino).
Os oligonucleotideos iniciadores que exibiram os melhores resultados nessa
etapa foram então escolhidos e empregados nas reações de PCR das amostras
clínicas (n = 27) e controles positivos da extração e reação. Como controle negativo
da extração e reação foi utilizado água Milli-Q. Como controle interno da extração, foi
utilizado um par de oligonucleotídeos (GAP3/GAP4) selecionado para amplificação de
um fragmento parcial de 248 PB do gene GAPDH.
46
Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizado na amplificação dos genes de papilomavirus em carcinomas de pele e mucosas de cães.
Primers Sequência dos
Primers (5’ -3’)
Especificidade Fragmento/
Gene alvo
Referência
FAP 59 TAACWGTIGGICAYCCWTATT Não específico 480/L1 Labruna et
al.
(2004)
FAP 64 CCWATATCWVHCATITCICCATC Canino 480/L1 Luff et.al
(2016)
MY11 GCMCAGGGWCATAAYAATGG Não específico 450/L1 Munday et. al
(2016)
MY09 CGTCCMARRGGAWACTGATC Não específico 450/L1 Munday et. al
(2016)
CP4 ATGGTACARTGGGCATWTGA Não específico 450/E1 Munday et. al
(2018)
CP5 GAGGYTGCAACCAAAAMTGRCT Canino 450/E1 Munday et.al
(2018)
CANPVF CTTCCTGAWCCTAAYMAKTTTGC Canino 400/L1 Luff et.al
(2016)
CPVJMF GTAGCAGTAGGGGGCTGCACA Não especifico 242/L1 Munday et. al
(2012)
CPVJMR ACTGTCGGAAGCACCACACCGTGG Não especifico 242/L1 Munday et.al
(2012)
GAP 3 AATGCCTCCTGCACCACC Não específico 248/ GAPDH Munday et. al
(2012)
GAP 4 ATGCCAGTGAGCTTCCCG Não específico 248/ GAPDH Munday et. al
(2012)
47
RESULTADOS
VALIDAÇÃO DA SELEÇÃO DOS PRIMERS E PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO DE
DNA E REAÇÃO DA PCR
Os resultados da validação da seleção dos primers e protocolos de extração de
DNA e reação da PCR encontram-se descritos na tabela 03.
Nas amostras de papilomatose oral foi possível identificar o fragmento
GAP3/GAP4, porém, não foi possível encontrar reação de PCR positiva em nenhum
do primers selecionados.
A placa pigmentada, foi uma das amostras processadas em “duplicata” –
material congelado/material FFEP. O controle da extração (GAP3/GAP4) foi positivo
em ambas as situações, porém a qualidade da banda de 248 PB foi nitidamente pior
(menor intensidade) no material parafinado. Com o par de primers FAP59/64 não
houve resultado positivo, em ambas as situações. Empregando o par MY09/11,
obtivemos resultado positivo com amplificação de um fragmento de 450 PB, no
entanto, nitidamente a qualidade e intensidade da banda proveniente do material
FFEP foi pior. Com o par CPVJMR/MF, não obtivemos resultados positivos. Utilizando
o primers CP4/5, encontramos resultado positivo com a detecção de um fragmento de
450 PB, apenas no material congelado. Já com os pares de primers CanPVf/FAP64,
obteve-se resultado positivo, com amplificação de um fragmento de 400 PB em ambas
as situações. Mais uma vez, o resultado FFEP foi inferior.
No material do bovino com papiloma cutâneo em região de tórax, que também
foi processado em “duplicata”, o controle de extração (GAP3/GAP4) foi positivo em
ambas as situações, porém, a qualidade da banda de 248 PB foi nitidamente pior
(menor intensidade) no material FFEP. O par de primers FAP59/64 positivou com
amplificação de um fragmento de 480 PB na amostra congelada e negativou na
amostra FFEP. Já com o par de primers MY09/11 positivou com amplificação de um
fragmento de 450 PB na amostra congelada e teve como resultado negativo na
amostra FFEP, bem como no FAP59/64. As amostras processadas com o par de
primers CPVJMF/MR, positivou com amplificação de um fragmento de 242 PB em
ambas as amostras, tanto congelada quanto FFEP, todavia a qualidade e intensidade
da banda proveniente do material FFEP foi pior quando comparado na amostra
congelada. Usando os primers CP4/5, houve resultado positivo com amplificação de
48
um fragmento de 450 PB na amostra congelada, porém, com intensidade e qualidade
de banda menor. Enquanto no material FFEP, não houve resultado positivo. Os
primers CanPVf/FAP64 gerou resultado positivo amplificando um fragmento de 400
PB apenas no material congelado. Evidenciando novamente em resultado do material
FEEP inferior.
As outras duas lesões papilomatosas em bovinos, sendo uma de região de
flanco e outra de região sacral, ambas FFEP, obtiveram resultados negativos com o
GAP, demonstrando a inadequada extração de DNA. No entanto, em ambas as
amostras FFEP, tivemos positividade em diferentes situações utilizando os primers
MY09/11, CPVJMF/MR e CP4/5 (tabela 3). Os oligonucleotideos iniciadores que
exibiram os melhores resultados nessa etapa foram os pares de primers MY09/11 e
CANPV/FAP64.
Tabela 3. Marcação de banda em amostras parafinadas e congeladas utilizando os diferentes Primers.
PRIMERS
AMOSTRAS GAP3/GAP4 FAP59/64 MY09/11 CPVJMR/MF CP4/5 CanPVf/
FAP64
Cão - papilomatose
oral FFEP
+ - - - - -
Cão - papilomatose
oral FFEP
+ - - - - -
Cão placa -
pigmentada
congelada
+
forte
- +
forte
- + +
forte
Cão - placa
pigmentada FFEP
+
fraco
- +
fraco
- - +
Bovino - papiloma
cutâneo tórax
congelado
+ + + + forte +
fraca
+ forte
Bovino - papiloma
cutâneo tórax FFEP
+ muito
fraco
- - + - -
Bovino - papiloma
cutâneo flanco FFEP
- - + + fraco - -
Bovino - papiloma
cutâneo sacro FFEP
- - - + fraco +
fraco
-
49
RESULTADO DAS AMOSTRAS
De um total de 27 amostras utilizadas para a pesquisa, o material genético viral
do PV foi encontrado em 8 destas. Sendo 6 amostras de pele e 2 amostras de dígito
testadas no primers MY09/11. Abaixo segue a tabela com a descrição dos resultados
obtidos.
Tabela 4. Marcação do primer MY09/11 nas amostras.
Nº
BLOCO
SEXO RAÇA IDADE LOCAL DIAGNOSTICO GAP MY0911
H-382-
17 C
M Pitbull NI Pele
abdome
CCE bem
diferenciado
- -
H-450-
17 C
F SRD 12 a Pele
membro
CCE bem
diferenciado
- -
H-512-
17 C
F SRD 6 a Pele
abdome
CCE bem
diferenciado
- -
H-541-
17 C
M Buldogue 8 a Pele
abdome
CCE
moderadamente
diferenciado
+ -
H-594-
17 (1) C
M SRD 10 a Pele
abdome
CCE bem
diferenciado
+ -
H-622-
17 C
F Labrador 10 a Pele
mama
CCE bem
diferenciado
- -
H-799-
17 C
F Fox
Paulistinha
5 a Pele
abdome
CCE bem
diferenciado
- -
H-813-
17 C
F SRD 11 a Pele
abdome
CCE bem
diferenciado
+ MUITO
FRACO
-
H-931-
17 C
F N.I 12 a Pele
abdome
CCE
moderadamente
diferenciado
+ +
H-946-
17 (1) C
F Dálmata 5 a Pele
abdome
CCE bem
diferenciado
+ -
50
H-961-
17 C
F SRD 2 a Pele
abdome
CCE bem
diferenciado
+ -
H-1002-
17 C
F SRD N.I Pele
abdome
CCE bem
diferenciado
+ -
H-1086-
17 (1) C
F Pitbull 6 a Pele
abdome
CCE bem
diferenciado
- +
H-1244-
17 C
F SRD 9 a Pele
abdome
CCE bem
diferenciado
- -
H-1274-
17 C
F SRD N.I Pele
abdome
CCE bem
diferenciado
- -
H-1072-
16 C
F Jack
Russel
5 a Pele
abdome
CCE
moderadamente
diferenciado
+ -
H-1029-
16 C
F Dálmata 5 a Pele
abdome
CCE bem
diferenciado
+ -
H-837-
16 C
F SRD 8 a Pele
Membro
CCE
moderadamente
diferenciado
+
FRACO
+
H-829-
16 C
M Cocker 14 a Pele
Tronco
CCE
moderadamente
diferenciado
- +
FRACO
H-800-
16 C
M Lhasa Apso 11 a Pele
Tronco
CCE bem
diferenciado
+ +
H-633-
16 (1) C
F SRD 10 a Pele
abdome
CCE bem
diferenciado
+ -
H-568-
16 C
F Fox
Paulistinha
10 a Pele
abdome
CCE
moderadamente
diferenciado
- -
H-280-
17 C
M Schnauzer 9 a Dígito CCE bem
diferenciado
+ +
H-837-
17 (1) C
F SRD 12 a Dígito CCE
moderadamente
diferenciado
+
FRACO
-
51
DISCUSSÃO
O PV é um vírus epiteliotrópico e cosmopolita (FAVROT, 2011). A infecção pelo
PV tem sido associado com algumas neoplasias cutâneas em cães e gatos, benignas
e malignas (MUNDAY, 2011). O vírus apresenta intenso epiteliotropismo por células
epiteliais escamosas cutâneas e de mucosas e essa replicação viral associada a
propriedades oncogênicas virais poderiam levar a transformação neoplásico
(CALVERT, 1998).
A provável associação causal entre oncogênese viral e transformação maligna
dos ceratinócitos é substanciada pela amplificação de genes do PV em amostras de
carcinomas de células escamosas (MUNDAY, 2016; LUFT, 2016). Adicionalmente,
também tem sido verificado maior freqüência na detecção de produtos de amplificação
gênica de PV em CCE de áreas fotoprotegidas comparados àqueles de áreas
fotoexpostas (FAVROT, 2015). Alguns estudos também já descreveram a positividade
para PV em alguns carcinomas in situ e placas epidérmicas pigmentadas em cães
(MUNDAY et al., 2011; LUFF et al.,2016).
A realização deste trabalho é de grande relevância, uma vez que, no Brasil até
o momento, não há estudos evidenciando a detecção do PV em CCE em cães. E no
âmbito internacional, os dados ainda são insuficientes para provar a relação causal
do PV com o CCE. Desta forma, este estudo contribuirá com dados de grande
impacto, no meio científico. Esta pesquisa obteve resultado que é provindo do trabalho
com maior número de amostras (27) de CCE de pele e mucosas já estudado, e com
H-976-
16 C
F Rottweiler 7 a Dígito CCE
moderadamente
diferenciado
+
FRACO
+
H-859-
16 C
F SRD 8 a Dígito CCE
moderadamente
diferenciado
+ +
H-461-
17 C
F SRD 16 a Mucosa
oral
CCE - -
52
o maior número de positividade de PV, totalizando 08 positivos, representando 29,6
%.
Esperava-se a detecção viral do PV nas lesões papilomatosas diagnosticadas
histologicamente com os primers utilizados. No entanto, o primer FAP59/64, não teve
resultado positivo nas amostras FFEP, porém positivou a amostra congelada do
bovino com papilomatose cutânea no tórax. Em contrapartida os pares de primers
MY09/11 e CanPVf/FAP64, detectaram o material viral em amostras congeladas e
FFEP do canino com placa viral pigmentada, sendo então o MY09/11 um dos primers
de escolha para a pesquisa, devido à amplificação tanto material congelado como
FFEP.
Diante disto, presumivelmente exista algum fator não identificado, que durante
o processo de fixação/parafinação e ablocamento do material, inviabilize o ácido
nucléico viral. O fator que sustenta esta hipótese é justificado pela amostra congelada
do bovino com papilomatose cutânea em tórax que positivou no primer FAP59/64,
entretanto, negativou em amostra FFEP.
Outra razão que sustenta esta hipótese é a demonstração de resultados do
primer MY09/11, que quando testado em amostras congeladas e FFEP, evidenciou
marcação de banda com coloração mais intensa no material congelado, enquanto no
FFEP marcou com intensidade bastante inferior. Demonstrando que o uso de
amostras FFEP pode não ser o melhor tipo de espécime clínico, uma vez que poderia
gerar um resultado falso negativo.
Alguns autores já pesquisaram a relação do PV com CCE usando o primers
FAP59/64. Munday 2012, avaliou um total de 20 amostras de CCE de pele,
positivando apenas uma destas. Isso demonstra 0,2 % de positividade no total de
amostras. No ano de 2015, Munday realizou outro estudo avaliando um número de
28 amostras de CCE oral, não encontrando o vírus em nenhuma das amostras. Já
Regallado, 2018 avaliou uma única amostra de CCE de pele, tendo como resultado
positivo. A partir disto, os resultados dos estudos prévios usando FAP59/64 devem
ser revistos, especialmente com uso de amostras FFPE.
53
CONCLUSÃO
Este é o trabalho que investiga a relação do PV com CCE e que possui o maior
número de amostras investigadas. Encontrou-se uma porcentagem de 29,6 %, que
também é o maior percentual verificado até o presente momento, sendo que existe
possibilidades da taxa de ocorrência ser ainda maior, devido ao fato de todos os
estudos prévios terem sido feitos com material parafinado. Os nossos resultados em
matéria de padronização em amostra congelada sugerem que as mesmas podem ter
uma viabilidade superior e novos estudos devem ser feitos com a perspectiva de
aumentar ainda a porcentagem desta associação entre a infecção pelo PV e o CCE.
54
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