Evidência de Recombinação em Alpha-Papilomavírus Humano

Abordagens Computacionais

Guilherme Carvalho Leal

O Papilomavírus• Vírus de DNA dupla-fita circular

• Infecta mamíferos e aves (HPV, BPV..)

• Célula hospedeira: melanócito

• Tem variedades carcinogênicas que causam carcinoma no trato genital

[HPV: 0,5M casos/ano; 274k mortes/ano]

O Papilomavírus

O Papilomavírus• 100+ tipos de HPV conhecidos hoje

• Possibilidade de recombinação?– Viabilidade de linhagens ”engineered“– Surgimento de variações do HPV16– Grande pluralidade de tipos de HPV– Freqüente co-infecção por 2+ tipos

Recombinação• Dois alelos (um de cada gene) que

estão associados em duas regiões de uma mesma seqüência de DNA tornam-se dissociados

• Um dos dois alelos é substituído por algum outro alelo encontrados no mesmo locus em uma segunda molécula de DNA.

Recombinação• Força-chave que dirige a evolução dos

genomas

• Combinações de alelos são associadas a doenças genéticas e a resistências a drogas em patógenos

• Logo, não deve ser negligenciada

Recombinação• 2 tipos clássicos

Recombinação em HPV

• Angulo, Carvajal-Rodríguez (2007)– Estimativas de recombinação de diferentes

genes (E6, E7, L1 e L2) em diferentes grupos• GI: 14 tipos de alto risco mais comuns, n=14seqs• GII: 6 tipos de baixo risco, n=8seqs• GIII: 3 tipos de baixo risco e 5 de risco

desconhecido, n=12seqs• HPV16: n=8seqs

[clustering por critérios filogenéticos, epidemiológicos e clínicos]

Recombinação em HPV

• Mas como estimar a taxa de recombinação?

– Phylogenetics-based methods– Substitution-based methods– Model-based methods

Evolução dos Estimadores

• Coalescent likelihood estimators

– 1996-2001: full-likelihood methodsusavam toda a informação contida nos dados

(IMPRATICÁVEL!)

Evolução dos Estimadores

– 2001 em diante: pseudolikelihood methods. “aproximar a full-likelihood, em vez de computá-la”

• Hudson (2001): composite-likelihood estimator (CLE). Analisa os sítios divergentes par a par

• McVean, Awadalla & Fearnhead (2002) Extensão do CLE de Hudson.

LDhat (package) > pairwise (program)

Evolução dos Estimadores

• McVean, Awadalla & Fearnhead (2002)Assumem um modelo com:

- 2 alelos por locus- mutação reversível e simétrica- taxa de mutação por geração:homogênea nos sítios

Ou seja:- somente sítios c/ exatos 2 alelos são considerados- a identidade desses alelos (A, C, G ou T) é perdida

Testes com diversos modelos de evolução revelaram que esse método é robusto somente para pequenos “misspecifications” do modelo de mutação.

LDhat

• Ldhat (McVean, 2002): pacote de programas escrito em C para a análise de recombinação em dados de genética populacional

– Programa-chave: pairwise

pairwise

• Entrada– conjunto de alelos divergentes alinhados

– a localização de cada alelo divergente

– a taxa de mutação da população, θ = 4Nμ(N=tamanho efetivo da população;

μ=taxa de mutação por sítio por geração)

pairwise

• Processamento– Estima a “coalescence likelihood” em cada par

divergente, tratando-os separadamente.

– Pares divergentes são agrupados por equivalência, reduzindo a qtd de dados

– Likelihood Permutation Test (LPT)

pairwise

- Estima a taxa de recombinação ρ

ρ = 4Ner (diploid species) ouρ = 2Ner (haploid species) Ne = effective population size

r = genetic map distance r = dS

d= physical distance S= per site rate of recombination

pairwise**Sites file**

4 10 2>GenotypeA122110?000>GenotypeB1111201100>GenotypeC011111?112>GenotypeD2112210100

**locs file**

10 1200 L1 57 180 187 223 250 438 509 878 1034

number of sites in the alignment

number of sequences/genotypes

data is haplotype(1) or genotype(2)

number of SNPs (segregating site

s)

total length of the region analysed

model of crossing-over(L) or gene

conversion(C) is fitted

Evolução dos Estimadores

• Entretanto...– O método de McVean (2002) é limitado quanto

à realidade biológica.• Exemplo: HIV1

– Modelo de substituição GTR (General Time Reversible)

– Variação entre as taxas de mutação dos diferentes sítios

– População muito instável– Sofre importantes pressões seletivas

Evolução dos Estimadores

• Carvajal-Rodríguez, Crandall & Posada (2006)– Testaram o pairwise sob modelos

mais complexos e realísticos– Liberaram algumas das restrições a fim de

aumentar a robustez do estimador.

kpairwise

kpairwise

• As mudanças no kpairwise

– Leva em conta todos os sítios; não só aqueles com 2 alelos

– A taxa de mutação pode ser variável entre sítios

– Modelo de substituição com 6 taxas para as mudanças entre os 4 nucleotídeos (A, C, G e T) em vez de uma única taxa entre dois estados inespecíficos (1 e 0)

– Modelos populacionais que levam em conta diferentes padrões de crescimento, seleção e subdivisão

kpairwise

• Consideravelmente mais lento que o pairwise

– O número de combinações alélicas diferentes é bem maior → enumeração e tabelamento menos eficientes

– Mesmo assim, um sistema de tabelamento guarda os likelihoods para um dado θ, os parâmetros da substituição de nucleotídeos, o número de seqüências e uma grade de valores ρ. Cada vez que o algoritmo é rodado, procura-se os dados de que se precisa nas tabelas; se não encontrados, eles são calculados e então armazenados.

kpairwise

• Ainda passível de significativas subestimações da taxa de recombinação no caso de:– Crescimento exponencial– Seleção direcional– Estruturas populacionais– Amostragem não-contemporânea

• Logo, novos estimadores de recombinação, mais sofisticados, são necessários.

HIV1

Recombinação em HPV

• Resultados

– Gene com taxa de recombinação mais alta: E6

– Gene com sinal de recombinação no maior número de grupos: L2

Recombinação em HPV

• Discussão– A evidência de recombinação em HPV é

importante porque pode sugerir equívocos em filogenias baseadas nos genes em questão

– Novos tipos recombinantes podem estar sendo gerados constantemente

Links• McVean’s LDhat

– http://www.stats.ox.ac.uk/~mcvean/LDhat/

• Carvajal-Rodríguez’s kpairwise– http://darwin.uvigo.es/software/kpairwise.html