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Recombinação genéticaRecombinação genética
Prof. Dra. Adriana DantasProf. Dra. Adriana Dantas
UERGS – Bento GonçalvesUERGS – Bento Gonçalves
Introdução Introdução • Exatidão de replicação do DNA e do reparo dos danos Exatidão de replicação do DNA e do reparo dos danos
para manutenção da informação genética garante para manutenção da informação genética garante sua sua transmissão dos progenitores a sua proletransmissão dos progenitores a sua prole
• Recombinação importante para a Recombinação importante para a geração de geração de diversidade genéticadiversidade genética, crucial para a evolução., crucial para a evolução.
• Diferenças genéticas entre os indivíduos provêem o Diferenças genéticas entre os indivíduos provêem o material inicial essencial para seleção natural, a qual material inicial essencial para seleção natural, a qual permite que as espécies evoluam e adaptem-se a permite que as espécies evoluam e adaptem-se a mudanças nas condições ambientais.mudanças nas condições ambientais.
Recombinação geral ou Recombinação geral ou recombinação entre recombinação entre homólogoshomólogos• Permite que genes sejam rearranjados em Permite que genes sejam rearranjados em
diferentes combinações.diferentes combinações.
• Resulta na troca de genes entre Resulta na troca de genes entre cromossomos homólogos pareados cromossomos homólogos pareados durante a meiose.durante a meiose.
• Envolvida em rearranjos de seqüências Envolvida em rearranjos de seqüências especificas de DNA que alteram a especificas de DNA que alteram a expressão genica durante o expressão genica durante o desenvolvimento e diferenciaçao celular.desenvolvimento e diferenciaçao celular.
Recombinação geralRecombinação geral
• A quebra e a religação de duas duplas hélices de DNA homologas geram duas moléculas de DNA que sofreram entrecruzamento (crossed).
• Na meiose, este processo permite que cada cromossomo contenha uma mistura de genes maternos e paternos.
Diacinese
Zigóteno
Diplóteno
Prófase I
Paquíteno
Leptóteno
Meiose IMeiose IFase: Profase I (sub-fases)Fase: Profase I (sub-fases)Leptóteno – inicia-se a individualização dos cromossomos estabelecendo a condensação (espiralização);
Zigóteno – aproximação dos cromossomos homólogos;
Paquíteno – máximo grau de condensação dos cromossomos, os braços curtos e longos ficam mais evidentes e definidos, dois desses braços, em respectivos homólogos, se ligam formando estruturas denominadas bivalentes ou tétrades. Momento em que ocorre o crosing-over, isto é, troca de segmentos (permutação de genes) entre cromossomos homólogos;
Diplóteno – começo da separação dos homólogos, configurado de regiões quiasmas (ponto de intercessão existente entre os braços entrecruzados, portadores de características similares);
Diacinese – com separação definitiva dos homólogos, já com segmentos trocados.
Recombinação na meioseRecombinação na meiose
(1) Duas moléculas de DNA homologas, (1) Duas moléculas de DNA homologas, geralmente oriundas de diferentes geralmente oriundas de diferentes cromossomos, se entrecruzam cromossomos, se entrecruzam (crossover), isto é, suas duplas hélices (crossover), isto é, suas duplas hélices são clivadas, e as duas extremidades são clivadas, e as duas extremidades são unidas as fitas opostas são unidas as fitas opostas correspondentes, formando duas correspondentes, formando duas hélices intactas, cada uma composta hélices intactas, cada uma composta por partes das duas moléculas DNA por partes das duas moléculas DNA iniciais.iniciais.
Recombinação na meioseRecombinação na meiose
(2) O sitio da permuta (isto é, local em (2) O sitio da permuta (isto é, local em que a dupla hélice vermelha é ligada que a dupla hélice vermelha é ligada a dupla hélice cinza) pode ocorrer a dupla hélice cinza) pode ocorrer em qualquer lugar das seqüência em qualquer lugar das seqüência nucleotídeos homologas das duas nucleotídeos homologas das duas moléculas participantesmoléculas participantes
Recombinação na meioseRecombinação na meiose
(3) No local da permuta, a fita de DNA (3) No local da permuta, a fita de DNA de uma molécula de DNA é pareada de uma molécula de DNA é pareada a fita da segunda molécula DNA, a fita da segunda molécula DNA, criando uma criando uma junção de heteroduplex junção de heteroduplex (quiasmas)(quiasmas) que une as duas hélices. que une as duas hélices.
Esta região de heteroduplex pode Esta região de heteroduplex pode conter vários nucleotídeos.conter vários nucleotídeos.
Recombinação de meioseRecombinação de meiose
(4) Nenhuma seqüência de (4) Nenhuma seqüência de nucleotídeos é alterada no local da nucleotídeos é alterada no local da troca, normalmente ocorre alguma troca, normalmente ocorre alguma replicação de DNA, mas os eventos replicação de DNA, mas os eventos de clivagem e a religação acontecem de clivagem e a religação acontecem de modo tão preciso que nenhum de modo tão preciso que nenhum nucleotídeo é período ou adicionado.nucleotídeo é período ou adicionado.
Como essa junção heteroduplex é formada e como as duas regiões homologas reconhecem uma a outra no local do crossover?
• Reconhecimento ocorre durante um Reconhecimento ocorre durante um processo chamado processo chamado sinapse de DNAsinapse de DNA
• Ocorre a formação de pares de bases Ocorre a formação de pares de bases entre as fitas complementares das entre as fitas complementares das duas moléculas de DNAduas moléculas de DNA
Sinapse de DNASinapse de DNA• Essencial para recombinação geral na meiose,Essencial para recombinação geral na meiose,
• É necessária apenas uma quebra em uma das É necessária apenas uma quebra em uma das duas fitas de uma hélice de DNA, para produzir duas fitas de uma hélice de DNA, para produzir uma fita exposta para a sinapse,uma fita exposta para a sinapse,
• Ocorre a Ocorre a quebra de uma ligação fosfodiesterquebra de uma ligação fosfodiester permite que uma das extremidades separe-se de permite que uma das extremidades separe-se de sua fita complementar, liberando-a para formar sua fita complementar, liberando-a para formar uma pequena heteroduplex com uma segunda uma pequena heteroduplex com uma segunda hélice de DNA intacta – assim iniciando a sinapse.hélice de DNA intacta – assim iniciando a sinapse.
Recombinação Recombinação E.coliE.coli
• A recombinação geral requer vários tipos de enzimas A recombinação geral requer vários tipos de enzimas especializadas, alem de proteínas (DNA polimerase, especializadas, alem de proteínas (DNA polimerase, ligase e proteínas SSB)ligase e proteínas SSB)
• Em especial a proteína Em especial a proteína RecARecA de E. coli tem função central de E. coli tem função central na recombinação entre cromossomo.na recombinação entre cromossomo.
• A proteína A proteína RecARecA catalisa a reação de sinapse de DNA de catalisa a reação de sinapse de DNA de várias etapas entre uma dupla hélice e uma região de fita várias etapas entre uma dupla hélice e uma região de fita simples de DNA homologa.simples de DNA homologa.
• Estudos em bactérias, levou ao desenvolvimento do Estudos em bactérias, levou ao desenvolvimento do modelo molecular de recombinação - Modelo de Holliday modelo molecular de recombinação - Modelo de Holliday (1964). (1964).
Modelo de HollidayModelo de Holliday
• A recombinação é iniciada pela introdução A recombinação é iniciada pela introdução de cortes em posições idênticas nas duas de cortes em posições idênticas nas duas moléculas de DNA parental.moléculas de DNA parental.
• As fitas de DNA clivadas sofrem As fitas de DNA clivadas sofrem desenrolamento parcial, e cada uma desenrolamento parcial, e cada uma dessas junta a outra molécula por dessas junta a outra molécula por pareamento de bases complementares pareamento de bases complementares com fitas entrecruzadas.com fitas entrecruzadas.
Modelo de HollidayModelo de Holliday
• Após a formação de junção de Holliday, a junção das Após a formação de junção de Holliday, a junção das fitas entrecruzadas gera moléculas recombinantes.fitas entrecruzadas gera moléculas recombinantes.
• Pode gerar dois diferentes isômeros:Pode gerar dois diferentes isômeros:– Heteroduplex recombinantesHeteroduplex recombinantes– Heteroduplex não recombinantesHeteroduplex não recombinantes
• Entretanto, esse modelo não explica como a Entretanto, esse modelo não explica como a recombinação é iniciada por cortes simultâneos em recombinação é iniciada por cortes simultâneos em ambas as moléculas parentais, na mesma posiçãoambas as moléculas parentais, na mesma posição–
Estrutura molecular de um Estrutura molecular de um junção de Hollidayjunção de Holliday
Recombinação por quebra de Recombinação por quebra de dupla fitadupla fita
• Ambas as fitas de DNA Ambas as fitas de DNA sofrem ressecção por sofrem ressecção por nucleases que digerem o nucleases que digerem o DNA no sentido 5’ para DNA no sentido 5’ para 3’, produzindo 3’, produzindo extremidades de fita extremidades de fita simples.simples.
• Estas fitas invadem outra Estas fitas invadem outra molécula parental por molécula parental por pareamento homologo pareamento homologo de bases.de bases.
Enzimas envolvidas na Enzimas envolvidas na recombinação homologarecombinação homologa
• A proteína central – A proteína central – RecARecA..• Promove a troca de fitas entre DNAs homólogos, Promove a troca de fitas entre DNAs homólogos,
levando a formação de heteroduplex.levando a formação de heteroduplex.
• A ação da A ação da RecA RecA tem três estágios:tem três estágios:– RecARecA se liga ao DNA de fita simples, recobrindo e se liga ao DNA de fita simples, recobrindo e
formando um filamento de proteína com o DNAformando um filamento de proteína com o DNA– RecA ligada ao DNA de fita simples se liga a uma RecA ligada ao DNA de fita simples se liga a uma
segunda molécula de DNA de fita dupla, formando um segunda molécula de DNA de fita dupla, formando um complexo entre dois DNAs.complexo entre dois DNAs.
– Segue-se um pareamento especifico, por Segue-se um pareamento especifico, por complementariedade de bases, da fita simples de DNA complementariedade de bases, da fita simples de DNA com seu complemento, e forma um heteroduplex.com seu complemento, e forma um heteroduplex.
Proteinas de Proteinas de E. coliE. coli envolvidasenvolvidas• Após a formação de uma junção de Holliday, um complexo Após a formação de uma junção de Holliday, um complexo
de três outras proteínas envolve-se com a recombinação:de três outras proteínas envolve-se com a recombinação:– RuvA, B e CRuvA, B e C
• A A RuvARuvA reconhece a junção de recruta a reconhece a junção de recruta a Ruv BRuv B, que age , que age como um motor que direciona a migração do sitio da como um motor que direciona a migração do sitio da junção no qual as fitas se entrecruzam, onde serão junção no qual as fitas se entrecruzam, onde serão cortadas e reunidas,cortadas e reunidas,
• A A RuvCRuvC resolve a junção através da clivagem de fitas resolve a junção através da clivagem de fitas entrecruzadas,entrecruzadas,
• A junção das fitas cortadas, através da ligação, completa A junção das fitas cortadas, através da ligação, completa
o processo de duas moléculas recombinantes.o processo de duas moléculas recombinantes.
RuvA DNA-Binding RuvA DNA-Binding SurfaceSurface
RuvA RuvB DNA ComplexRuvA RuvB DNA Complex
The interaction of The interaction of RuvCRuvC with with Holliday junctionHolliday junction
Mecanismos moleculares da Mecanismos moleculares da recombinação genéticarecombinação genética
• Recombinação homóloga durante o Recombinação homóloga durante o reparo do DNAreparo do DNA
• Recombinação entre cromossomos Recombinação entre cromossomos bacterianos durante a troca de bacterianos durante a troca de material genéticomaterial genético
Recombinação geralRecombinação geral
• Também conhecida como recombinação Também conhecida como recombinação homologa a permuta homologa a permuta ocorre entre um par de ocorre entre um par de seqüência de DNA homologas.seqüência de DNA homologas.
• Estas seqüências estão localizadas em duas Estas seqüências estão localizadas em duas copias do mesmo cromossomo, apesar de outros copias do mesmo cromossomo, apesar de outros tipos de moléculas de DNA.tipos de moléculas de DNA.
• Essencial para correta segregação cromossômica Essencial para correta segregação cromossômica que ocorre durante a meiose de bacterias, que ocorre durante a meiose de bacterias, fungos, plantas e animaisfungos, plantas e animais
Troca genética entre Troca genética entre procariotosprocariotos• Não ocorre entre dois genomas inteiros (como Não ocorre entre dois genomas inteiros (como
ocorre nos eucariotos)ocorre nos eucariotos)
• Ocorre entre um genoma completo, derivado de Ocorre entre um genoma completo, derivado de F- (fator de fertilidade nas fêmeas, são F- (fator de fertilidade nas fêmeas, são receptoras) – chamado de receptoras) – chamado de endogenotoendogenoto
• Genoma incompleto , derivado do doador, Genoma incompleto , derivado do doador, chamado chamado exogenoto.exogenoto.
• Forma um diplóide parcial ou Forma um diplóide parcial ou merozigoto.merozigoto.
Crossing-over entre exogenoto Crossing-over entre exogenoto e um merozigotoe um merozigoto
a+
a-
exogenoto
endogenoto
merozigotomerozigoto
a+
a-
exogenoto
endogenoto
a+
a-
exogenoto
endogenoto
merozigotomerozigoto
a+
a- a+ a-
inviável
a+
a-
a+
a-a- a+ a-
inviável
a+
a-
a+
a-
inviável
viável
a+
a-
a+
a-
a+a+
a-a-a-
inviável
viável
(a)
(b)
(a)Um único crossing leva a cromossomo linear parcialmente diplóide
(b) Um numero par de crossing leva a um anel mais um fragmento linear
a+
a-
exogenoto
endogenoto
merozigotomerozigoto
a+
a-
exogenoto
endogenoto
a+
a-
exogenoto
endogenoto
merozigotomerozigoto
a+
a- a+ a-
inviável
a+
a-
a+
a-a- a+ a-
inviável
a+
a-
a+
a-
inviável
viável
a+
a-
a+
a-
a+a+
a-a-a-
inviável
viável
(a)
(b)
(a)Um único crossing leva a cromossomo linear parcialmente diplóide
(b) Um numero par de crossing leva a um anel mais um fragmento linear
Crossing-over de Crossing-over de merozigotomerozigoto
• Um único crossing seria muito útil Um único crossing seria muito útil para gerar recombinantes viáveis, para gerar recombinantes viáveis, pois o anel é quebrado para produzir pois o anel é quebrado para produzir um cromossomo estranho, linear, um cromossomo estranho, linear, parcialmente diplóide.parcialmente diplóide.
• Para haver um anel intacto é preciso Para haver um anel intacto é preciso um numero par de crossingum numero par de crossing
Recombinação sitio-Recombinação sitio-especificaespecifica
• Ocorre entre seqüências de DNA especificas, homologas somente em Ocorre entre seqüências de DNA especificas, homologas somente em uma pequena região.uma pequena região.
• Bacteriófago Bacteriófago recombina com recombina com E. coliE. coli
• Interage com o cromossomo bacteriano, formando um pró-fago que é Interage com o cromossomo bacteriano, formando um pró-fago que é mantido como parte do genoma bacteriano (processo chamado mantido como parte do genoma bacteriano (processo chamado lisogenia)lisogenia)
• DNA de DNA de E.coliE.coli e bacteriófago sofrem recombinação em sitio chamado e bacteriófago sofrem recombinação em sitio chamado attatt (ligação: do inglês (ligação: do inglês attachmentattachment).).
• Recombinação do sitio Recombinação do sitio attPattP (do fago) x (do fago) x attBattB (bactéria), os quais tem (bactéria), os quais tem aproximadamente 240 e 25 nucleotídeos de comprimento, aproximadamente 240 e 25 nucleotídeos de comprimento, respectivamente.respectivamente.
Processo de recombinaçãoProcesso de recombinação• O processo é mediado por uma proteína de O processo é mediado por uma proteína de
chamada integrase (chamada integrase (IntInt), a qual se liga aos sítios ), a qual se liga aos sítios attPattP e e attBattB, formando o complexo , formando o complexo Int-attPInt-attP se liga a attB. se liga a attB.
• Os fagos e as bactérias trocam as fitas de DNA em Os fagos e as bactérias trocam as fitas de DNA em uma região central de 15 nucleotídeos compartilhada uma região central de 15 nucleotídeos compartilhada entre os dois sítios.entre os dois sítios.
• A proteína A proteína IntInt introduz cortes desalinhados na região introduz cortes desalinhados na região central homologa entre central homologa entre attBattB e e attPattP, catalisa a troca , catalisa a troca das fitas, e liga as fitas quebradas, integrando o DNA das fitas, e liga as fitas quebradas, integrando o DNA de de no cromossomo de no cromossomo de E. coli.E. coli.
