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PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA LIPOFORINA E SEU PAPEL
NO TRANSPORTE DE LIPÍDEOS NEUTROS NA HEMOLINFA DE
LARVAS DA BROCA DA CANA-DE-AÇÚCAR Diatraea saccharalis
(LEPIDOPTERA: PYRALIDAE).
WENDEL MATTOS POMPILHO
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE – DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
MAIO – 2006
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA LIPOFORINA E SEU PAPEL
NO TRANSPORTE DE LIPÍDEOS NEUTROS NA HEMOLINFA DE
LARVAS DA BROCA DA CANA-DE-AÇÚCAR Diatraea saccharalis
(LEPIDOPTERA: PYRALIDAE).
WENDEL MATTOS POMPILHO
Orientadora: Prof. a Dra. Marílvia Dansa de Alencar CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
MAIO – 2006
“Dissertação apresentada ao Centrode Biociências e Biotecnologia daUniversidade Estadual do NorteFluminense como parte dasexigências para a obtenção do títulode Mestre em Biociências eBiotecnologia, área de concentraçãoBiologia Celular”.
"Algo é só impossível até que alguém duvide e acabe provando o
contrário”.
Albert Einstein
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Ilson e Maria Aparecida, que sempre acreditaram na realização
de meu sonho. Obrigado mãe por não medir esforços para que os obstáculos
encontrados fossem superados. Agradeço por tudo o que fez por mim durante estes
quatro anos.
A professora Marílvia, pela orientação e amizade.
Ao Beto, pelas sugestões que muito contribuíram na elaboração deste trabalho.
E pelo auxílio na aquisição de novos conhecimentos.
Flávia e Carol, obrigado pela amizade e paciência.
Ao professor Carlos Logullo e seu grupo (Boca, Léo, Josi, Ninja e Eldo).
A Cíntia, pelas caronas até a Rural pela alegria no laboratório.
A Inês, pela companhia e auxilio nos momentos difíceis.
Aos técnicos do LQFPP, Jucélia, Cristóvão, Izabela, pela assistênca na
execução dos experimentos.
A professora Olga e seu grupo.
As professoras Elenir, Kátia. Aos amigos do setor de Bioquímica Vegetal.
Ao professor Mauri da UFRRJ e sua equipe por fornecer as larvas de D.
saccharalis.
A todos professores e alunos do Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de
Insetos da UFRJ, especialmente: A professora Geórgia, pela paciência e pela força. Ao
professor Mário, pela motivação. A professora Kátia, pelas dicas. Ao amigo Petter, pela
ajuda na execução dos experimentos.
Aos companheiros da República Tutanheta: Bill, Tadeu, e aos ex-companheiros:
Pablo, Fred, Jovem (Alex), Anderson.
Por fim agradeço a Deus, pela saúde e força nestes dois anos.
Sumário
ÍNDICE DE FIGURAS............................................................................................. viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.................................................................. x
RESUMO................................................................................................................. xi
ABSTRACT.............................................................................................................. xii
1 – INTRODUÇÃO................................................................................................... 1
1.1 - Os Insetos como Modelo de Estudo............................................................... 1
1.2 - Diatraea saccharalis........................................................................................ 2
1.3 – As Lipoproteínas e o Transporte de Lipídeos em Vertebrados...................... 4
1.4 - Lipoforina – A lipoproteína dos Insetos........................................................... 6
1.5 – Partícula Transferidora de Lipídeos - LTP………….........….…..…………….. 10
1.6 - Estoque e Mobilização de Lipídeos em Insetos.............................................. 11
2 – OBJETIVOS...................................................………… .................................... 17
3 – MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................. 18
3.1 - Obtenção das Larvas de Diatraea saccharalis................................................ 18
3.2 - Coleta de Hemolinfa, Corpo Gorduroso e Ovário........................................... 19
3.3 – Obtenção de Hemolinfa Metabolicamente Marcada com 3H.......................... 20
3.4 – Isolamento da Lipoforina................................................................................ 20
3.5 - Eletroforese em Gel de Poliacrilamida............................................................ 21
3.6 - Cromatografia de Filtração em Gel................................................................. 21
3.7 - Determinação da Massa Molecular da Lipoproteína Purificada por PAGE de
Poro Limite..............................................................................................................
21
3.8 - Dot Blot............................................................................................................ 22
3.9 - Determinação da Densidade da Lipoforina..................................................... 22
3.10 – Extração de Lipídeos da Lipoforina de Larvas de D.saccharalis.................. 23
3.11 – Identificação dos Lipídeos em Cromatografia de Camada Fina (TLC)........ 23
3.13 - Quantificação de Proteínas........................................................................... 24
3.14 - Quantificação de Açúcar............................................................................... 25
4 – RESULTADO..................................................................................................... 26
4.1 – Ultracentrifugação da Hemolinfa de Diatraea saccharalis.............................. 26
4.2 – Análise das Frações do Gradiente................................................................. 27
4.2.1 – Absorbância................................................................................................. 27
4.2.2 - Densidade e Concentração de Proteínas.................................................... 28
4.2.3 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida........................................................ 29
4.2.4 – Radioatividade............................................................................................. 32
4.3 - Dot Blot............................................................................................................ 33
4.4 - Análise da Fração Nove.................................................................................. 34
4.5 – Massa Molecular da Partícula e suas Subunidades....................................... 35
4.6 – Composição da Lipoforina.............................................................................. 38
4.7 – Identificação dos Fosfolipídios....................................................................... 38
4.8 - Identificação dos Lipídios Neutros.................................................................. 40
4.6 – Quantificação de Lipídeos Totais na Hemolinfa e Corpo Gorduroso de
larvas de Diatraea saccharalis................................................................................
42
4.7 – Transporte de Lipídeos Neutros na Hemolinfa de Larvas de Diatraea
saccharalis na Hemolinfa........................................................................................
43
4.8 – Acúmulo de Lipídeos Neutros no Corpo Gorduroso de Larvas de Diatraea
saccharalis...............................................................................................................
45
4.9 – Acúmulo de Lipídeos Neutros no Ovário dos Insetos Adultos....................... 46
5 – DISCUSSÃO.................................................................................................... 47
6 – CONCLUSÃO.................................................................................................... 54
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 57
Lista de Abreviaturas e Siglas
• ABS Absorbânica
• ApoLp I Apolipoforina I
• ApoLp II Apolipoforina II
• ApoLp III Apolipoforina III
• AMPc Adenosina Monofosfato cíclico
• AKH Hormônio Adpocinético
• BSA Albumina sérica bovina
• DAB Diaminobenzidina
• DAG Diacilglicerol
• DPM Dosagem por minuto
• EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético
• Lf Lipoforina
• Lf- H3 Lipoforina-H3
• HDL Lipoproteína de alta densidade
• HDLp Lipoforina de alta densidade
• HPLC Cromatografia Líquido de Alto Desempenho
• IDL Lipoproteína de densidade intermediária
• LDL Lipoproteína de baixa densidade
• LTP Partícula de Transferência de Lipídeos
• PBS Tampão Fosfato de Sódio
• SDS Dodecil Sulfato de Sódio
• SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de
SDS
• TAG Triacilglicerol
• TLC Cromatografia em camada fina
• KBr Brometo de Potácio
• kDa QuiloDalton
• VLDL Lipoproteína de densidade muito baixa
• VHDLp Lipoforina de densidade muito baixa.
Resumo
Diatraea saccharalis é a principal praga da cana-de-açúcar. As larvas alimentam-
se do colmo da planta, sendo a sacarose o principal componente de sua dieta. O
metabolismo e o transporte de lipídeos é essencial para o crescimento e o
desenvolvimento dos diferentes tecidos. A hemolinfa dos insetos contém uma
lipoproteína majoritária e análoga a dos vertebrados, denominada lipoforina. O
envolvimento desta lipoproteína no transporte de lipídeos em outras espécies foi
extensivamente estudado, porém na literatura há uma carência de informação sobre a
lipoforina de D. saccharalis. Usando ultacentrifugação em gradiente isopícnico de KBr
purificamos a lipoforina da hemolinfa de larvas de D. saccharalis. Neste trabalho
caracterizamos a lipoforina. A densidade da lipoforina foi de 1,122 g/mL. A análise
química mostrou uma composição de proteínas correspondendo a 46%, lipídeos
correspondendo a 49% e 5% de açúcar. A massa molecular da lipoforina em sua forma
nativa, foi estimada em torno de 710 kDa, de acordo com o procedimento de
eletroforese em gel de poliacrilamida porolimite. A análise da lipoforina em SDS-PAGE
mostrou a presença de duas apolipoforinas, apoLp I e apoLp II de massa molecular de
250, 90 kDa, respectivamente. A lipoforina purificada de larvas de D. saccharalis
apresentou a composição de fosfolipídeos e lipídeos neutros da lipoforina da foi
revelada por cromatografia em camada fina (TLC). Os fosfolipídeos foram identificados
em TLC unidimensional e bidimensional, foram detectadas as presenças de:
fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, lisofofatidilcolina e
esfingomielina. A TLC unidimensional para identificar lipídeos neutros revelou a
presença de colesterol esterificado, triacilglicerol, 1,3 – Diacilglicerol e 1,2 –
Diacilglicerol. Foi acompanhado o transporte de lipídeos na hemolinfa destes insetos
usando lipoforina – H3.
Abstract
Diatraea saccharalis is an important pest in sugarcane culture. Larvae D.
saccharalis feed mainly on sucrose from the host plant. The lipid metabolism and its
transport are essential to support the for growth and development of the different insect
tissues. Lipophorin is a major lipoprotein in the insect hemolymph. The role of this
protein in the transport of lipids is extensively known in several insect species, but there
is a lack of information about D. saccharalis lipophorin in the literature. We purified the
lipophorin from the hemolymph of D. saccharalis larvae using a isopycnic KBr density
gradient ultracentrifugation. In this work, we are characterizing this lipophorin. The
density of this lipoprotein is 1,122g/mL, similar to the Manduca lipophorin. The chemical
analysis of the purified lipophorin showed that it is composed by approximately 46%
protein, 49% lipid and 5% sugar. The molecular mass of the lipophorin in its native form
is approximately 710 kDa. The analysis of the lipophorin by SDS-PAGE showed that it is
composed by 250 and 90 kDa apoproteins. The composition of phospholipids and
neutral lipids of the D. saccharalis lipophorin was assayed by thin layer chromatography
(TLC). The phospholipid was identified by unidimensional and bidimensional TLC. We
detected the presence of phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine,
phosphatidylserine, phosphatidylinositol, lisophophatidylcoline and sphingomyelin. The
neutral lipids had been identified in unidimensional TLC. We detected the presence of
cholesterol esther, 1,3-triacylglycerol, 1,2-diacylglycerol and diacylglycerol. The
transport of lipids in hemolymph of these insects using lipophorin - H3 was folloied.
1 - Introdução 1.1 - Os Insetos como Modelo de Estudo
Os insetos representam a forma de vida animal mais abundante no planeta, com
cerca de um milhão de espécies organizadas em aproximadamente 800 famílias e
distribuídas em 32 ordens (HOY, 1994).
O sucesso adaptativo deste grupo a diferentes ambientes é uma das causas de
sua diversidade. Tal sucesso pode ser atribuído, principalmente, à evolução da
Holometabolia (CISNE, 1974). Insetos holometabólicos são aqueles que apresentam
metamorfose completa; ovo larva pupa (ou crisálida) adulto.
Os insetos apresentam um sistema circulatório totalmente aberto, onde a
hemolinfa corre livremente no interior da cavidade corporal – a hemocele, banhando
órgãos e tecidos. A circulação é facilitada por órgãos tubulares pulsáteis, coração e
vasos dorsais. Os insetos não apresentam hemoglobina ou outras moléculas
carreadoras de oxigênio na hemolinfa. Quanto à composição química da hemolinfa,
estudos revelam uma considerável variação, sendo alguns dos maiores constituintes:
água; sais inorgânicos; materiais nitrogenados; ácidos orgânicos; carboidratos; lipídeos;
aminoácidos; proteínas; pigmentos; gases e hemócitos (MUTTKOWSKI, 1923;
SNODGRASS, 1993). O sistema respiratório tem sua origem em poros localizados no
tórax e abdômen. Estes poros estão ligados a tubos quitinizados – as traquéias, as
quais estão espalhadas por toda a cavidade corporal dos insetos, distribuindo oxigênio
a todos os órgãos (LAW & WELLS, 1989).
O sistema imune e o sistema hemostático dos insetos diferem marcadamente
daqueles encontrados em mamíferos. Imunoglobulinas não são encontradas nestes
organismos e a coagulação da hemolinfa não envolve fibrina ou proteínas similares
(LAW & WELLS, 1989). Além disso, os insetos possuem tecidos análogos, em função,
aos tecidos presentes em vertebrados. O corpo gorduroso é encontrado disperso por
todo corpo dos artrópodes. Este tecido é responsável pela síntese da maioria das
proteínas hemolinfáticas e atua como principal órgão de armazenamento de gordura,
glicogênio e proteínas. Tendo suas funções reguladas por hormônios. O corpo
gorduroso combina características similares ao fígado e tecido adiposo dos vertebrados
(LAW & WELLS, 1989).
Além da importância econômica e médica, outros fatores contribuem na escolha
dos insetos como modelo experimental, entre eles: fácil manipulação; grande número
de indivíduos disponíveis para ensaios experimentais; muitas espécies se reproduzem
facilmente e produzem um grande número de descendentes; rápido ciclo de vida de
algumas espécies, tais como Musca domestica, o que permite a análise em diversas
fases de seu desenvolvimento (LAW & WELLS, 1989).
Descobertas cientificamente importantes foram observadas pela primeira vez em
insetos e posteriormente demonstradas em outros modelos, tais como mamíferos.
Dentre estas descobertas temos: a elucidação do mecanismo de ação de hormônios
esteróides através de experimentos com ecdisona (SCHELLER & KARLSON, 1977); a
identificação do processo de endocitose mediada por receptores (ROTH & PORTER,
1964; TELFER, 1960 e 1961); estudos de biologia molecular identificando genes
“homeobox” em Drosophila e sua homologia com vertebrados (AKAM, 1989); a
descoberta das secropinas, peptideos antibacterianos (BOMAN & HULTMARK, 1987);
citocromo c (KEILIN, 1966) e a abservação do processo de seleção natural em
mariposas (Biston betularia) (FISHER, 1933).
1.2 - Diatraea saccharalis
Diatraea saccharalis (Figura 1) é um inseto pertencente à ordem Lepidoptera,
sendo a principal praga da cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) e causadora de
grandes prejuízos para esta cultura. Este inseto tem sua origem na América Central e
América do Sul (LONGO & HENSLEY, 1972).
Os ovos de D. saccharalis medem aproximadamente 1,16 mm de comprimento e
0,75 mm de largura. E são depositados agrupados e sobrepostos como as escamas de
um peixe (Figura 1A). Um conjunto de ovos pode conter de 20 a 50 ovos e são
depositados na superfície da folha da planta. Inicialmente são brancos, mas
apresentam cor laranja com o passar do tempo. A duração do estágio de ovo é de
quatro a seis dias (HOLLOWAY et al., 1928).
As larvas recém eclodidas dirigem-se para as gemas da planta onde penetram
no colmo e alimentam-se de seu interior, sendo a sacarose o principal componente de
sua dieta. As larvas apresentam a cabeça na cor marrom, o corpo de cor amarelo-
palha, com pontos marrons em cada um de seus segmentos (Figura 1B) (HOLLOWAY
et al., 1928).
O número de estádios das larvas de D. sacharalis é completamente variável,
havendo relatos de três a dez, sendo o padrão cinco. Essa variação parece estar
relacionada com a estação do ano. A duração de cada estádio é de aproximadamente
3-6, 4-8, 6-9, 4-6, e 4-9 dias para os estádios de um a cinco, respectivamente. Estes
dados se referem a larvas que se alimentam da cana-de-açúcar em condições naturais.
Quando mantidas em dietas artificiais, a maioria das larvas tende a apresentar seis
estádios (HOLLOWAY et al. 1928). O tempo de desenvolvimento das larvas até o
estágio pupal varia entre 25 a 30 dias. As larvas alcançam um comprimento de
aproximadamente 2-4, 6-9, 10-15, 15-20, 20-30 mm durante os estádios de um a cinco,
respectivamente (ROE., 1982).
A fase de pupa ocorre dentro da planta, em uma galeria cavada pela larva
(Figura 1C). A larva limpa e expande esta galeria antes da fase de pupa, deixando
somente uma fina camada de tecido vegetal, que será quebrada ao término da
metamorfose. A crisálida é de cor marrom, alongada e fina, mede de 16 a 20 mm de
comprimento e a duração do estágio pupal é de oito a nove dias (HOLLOWAY et al.,
1928).
Os adultos, de cor amarelada (Figura 1D), possuem uma extensão de asa que
varia de 18 a 28 mm para os machos e de 27 a 39 mm para as fêmeas. Eles
apresentam hábitos noturnos permanecendo escondidos durante o dia. O ovoposição
começa no final da tarde continuando durante todo noite. As fêmeas podem colocar os
ovos por até quatro dias. A duração do estágio adulto é de três a oito dias
(HOLLOWAY et al., 1928).
1.3 – As Lipoproteínas e o Transporte de Lipídeos em Vertebrados
O termo lipídeo é amplamente usado para descrever um grupo de compostos de
origem biológica, que apesar de quimicamente diferentes entre si, exibem como
característica comum o fato de serem imiscíveis em água e solúveis em solventes
orgânicos (HEMMING & HAWTHORNE, 1986). A natureza hidrofóbica dos lipídeos é a
base de suas principais funções biológicas, destacando-se entre elas as de reserva
energética e como componentes de membranas biológicas. Alguns lipídeos apresentam
ainda funções especiais, como por exemplo: hormonais (hormônios esteróides)
(RAMWELL & SHAW, 1970); regulador da ação de hormônios (prostaglandinas)
ABCD
Figura 1: Diferentes estádios da Diatraea saccharalis. (A) Ovo; (B) Larva; (C) Pupa; (D) Adulto.
Imagens retiradas de http://insects.tamu.edu/extension/bulletins/mp-1777.html
A B
C D
(BERGSTROM,1967); segundo mensageiro (fosfatidilinositol) (DIVECHA & IRVINE.,
1995); e receptores de superfície celular (glicolipideos) (HOKIN., 1985).
Em vertebrados, a gordura absorvida da dieta e os lipídeos sintetizados pelo
organismo são transportados entre os vários tecidos e órgãos para armazenagem ou
utilização (WIRTZ, 1991). Os lipídeos são transportados pela circulação como
componentes das lipoproteínas (Figura 2), partículas globulares que consistem de um
cerne apolar de lipídeos neutros (como triacilgliceróis e ésteres de colesterol),
envolvidos por uma camada anfifílica de proteínas, fosfolipídeos e colesterol
(ELDESTEIN et al., 1979). A porção protéica de uma lipoproteína é conhecida como
apolipoproteína (apoLp) ou apoproteína, e tem a função de estabilizar os lipídeos,
podendo representar de 1% a 60% da constituição de diferentes lipoproteínas (MAYES,
1996).
De acordo com suas funções e propriedades físicas, as lipoproteínas de
mamíferos são classificadas em: quilomícrons, lipoproteínas de densidade muito baixa
(VLDL), lipoproteína de baixa densidade (LDL), lipoproteína de alta densidade (HDL) e
lipoproteína de densidade intermediária (IDL) (BEUCLER & TURPIN, 2001). Durante o
transporte através dos capilares, lipídeos provenientes da alimentação são
primeiramente empacotados nos quilomicrons. A maior parte do conteúdo lipídico desta
partícula é liberada para os tecidos, adiposo e muscular, por meio de uma lipoproteína
lípase. Os remanescentes de quilomícrons são captados pelo fígado. Lipídeos
endógenos e colesterol do fígado são liberados para os músculos e para os adipócitos
pelas VLDL. A extração de lipídeos das VLDL converte gradualmente parte delas em
LDL, as quais transportam o colesterol para os tecidos extra-hepáticos ou são captadas
novamente pelo fígado. O fígado capta remanescentes das LDL, VLDL e quilomicrons
por meio do processo de endocitose mediada por receptores. O excesso de colesterol
nos tecidos extra-hepáticos é transportado de volta ao fígado como HDL (SEIDEL,
1973).
1.4 - Lipoforina – A lipoproteína dos Insetos
O transporte de lipídeos no sistema circulatório, via lipoproteína, não é uma
exclusividade de vertebrados. A hemolinfa dos insetos contém uma lipoproteína
majoritária denominada lipoforina (Lf) (CHINO et al., 1969, CHINO et al 1981a). A
lipoforina é responsável pelo transporte de lipídeos de seus sítios de síntese ou
absorção para os sítios de utilização (SOULAGES & WELLS, 1994).
Além de diacilglicerol (CHINO et al., 1969; CHINO & KITASAWA, 1981a), a
lipoforina transporta fosfolipídeos, colesterol, hidrocarbonetos e ácidos graxos livres
(CHINO et al., 1969; CHINO & GILBERT, 1971; GONDIM et al., 1989; SOULAGES &
WELLS, 1994; ATELLA et al., 2000). Porém, em Aedes aegypti os lipídeos neutros são
transportados sob a forma de triacilglicerol (FORD & VAN HEUSDEN, 1994). A
Figura 2: Lipoproteína de baixa densidade (LDL). (Adaptado de VOET et
al.,1999).
lipoforina também está relacionada ao transporte de outros ligantes hidrofóbicos, como
o hormônio juvenil, feromônios e carotenos (BLACKLOCK & RYAN, 1994; SOULAGES
& WELLS, 1994; VAN DER HORST et al, 1993).
Em espécies que têm a capacidade migratória ou aquelas que voam por horas
sem parar, tais como Locusta migratoria e Manduca sexta, a lipoforina possui um papel
fisiológico fundamental. Durante longos períodos de vôo, os carboidratos fornecem
energia apenas nos primeiros 30 minutos; após este período os lipídeos tornam-se a
fonte primária de energia (BEENAKKERS et al., 1984).
A lipoforina tem a habilidade de funcionar como um transportador de lipídeos
reutilizável, ou seja: ela é capaz de entregar lipídeos seletivamente a diversos órgãos
sem ser endocitada e degradada, e logo em seguida é reabastecida e novamente
distribui lipídeos entre os tecidos (VAN HEUSDEN et al, 1987; VAN DER HORST, 1990;
RYAN & VAN DER HORST, 2000; CANAVOSO et al, 2001).
Além do papel no transporte, a lipoforina é capaz de entregar ou receber,
seletivamente, lipídeos a tecidos específicos (Figura 3). Por exemplo: entregar
diacilglicerol (DAG) para o corpo gorduroso e ovócitos e recebê-lo do próprio corpo
gorduroso e intestino e, ainda, distribuir hidrocarbonetos e carotenóides para a cutícula
(ARRESE et al., 2001). Essa interação da lipoforina com tecidos distintos é mediada por
receptores específicos (BAUERFEIND & KOMNICK, 1992 a,b; GONDIM & WELLS,
2000).
Figura 3: Esquema mostrando o complexo de entrega seletiva de lipídeos.A lipoforina (Lp) está associada a célula por meio de um receptor de membrana
(R). Os lipídeos são transferidos para célula via “partícula transferidora de
lipídeos” (LTP) e fatores específicos de transferência (FT), os quais são
proteínas de membrana. Estão ilustrados: FT D - fator de transferência de
diacilglicerol (DAG) e FTE – fator de transferência de Esterol (Adaptado de
ARRESE et al, 2001).
Lp LTP
R FTD FTS
DAG Esterol
HEMOLINFA
INTRACELULAR
Lp LTP
R FTD FTS
DAG Esterol
HEMOLINFA
INTRACELULAR
A lipoforina é sintetizada no corpo gorduroso, um órgão que atua no
armazenamento de lipídeos e carboidratos, e ainda é o principal sítio de síntese
protéica em insetos. De acordo com a espécie, a lipoforina pode ser secretada na
hemolinfa como uma partícula deficiente em lipídeos, que será abastecida em outros
sítios (LAW & WELLS, 1989; RYAN & VAN DER HORST, 2000; CANAVOSO et al.,
2001), ou como uma partícula madura, completa em seu conteúdo lipídico (VAN DER
HORST et al., 1993).
A lipoforina pode existir em várias formas com respeito ao seu conteúdo relativo
de lipídeos, que se reflete no tamanho e na densidade da partícula. Sendo assim, a
lipoforina pode ser classificada como LDLp (lipoforina de baixa densidade), (HDLp
lipoforina de alta densidade) (BLACKLOCK e RYAN, 1994; RYAN & VAN DER HORST,
2000) ou VHDLp (lipoforina de densidade muito alta) (BEENAKKERS et al., 1988).
A porção protéica da lipoforina é tipicamente constituída de duas
apolipoproteínas: apolipoforina I (apoLp-I, ~ 240 kDa) e apolipoforina-II (apoLp-II, ~ 80
kDa), presentes na razão molar de 1:1 (VAN DER HORST, 1990; BLACKLOCK &
RYAN, 1994; RYAN & VAN DER HORST, 2000; CANAVOSO et al., 2001). Em
algumas espécies de insetos pode ocorrer a adição de outra apoproteína, a
apolipoforina III (apoLp-III, ~ 17 kDa) (VAN HEUSDEN et al, 1984). É o caso das
espécies M. sexta e L. migratoria, que têm várias moléculas de apoLp-III associada à
LDLp presente em adultos durante o vôo (VAN DER HORST et al.,1981; KAWOOYA et
al., 1984; RYAN & LAW, 1984; WELLS et al., 1985). O papel dessa última apoproteína
ainda não está totalmente elucidado, embora pareça que ela funcione na estabilização
da lipoforina quando esta é abastecida de lipídeos (KAWOOYA et al., 1984; WELLS et
al., 1985; HAUNERLAND & BOWERS, 1986).
Estudos da biossíntese de lipoforina revelaram que as apolipoforinas I e II se
originam de um precursor comum, explicando a estequiometria de 1:1 dessas
apolipoproteínas (WEERS et al., 1993).
1.5 – Partícula Transferidora de Lipídeos – LTP Ryan et al., (1986a) observaram que ao longo do desenvolvimento de M. sexta
ocorrem populações de lipoforina com densidades variadas. Tal observação levou a
identificação de um fator de interconversão destas populações (RYAN et al., 1986b).
Este fator foi denominado Partícula Transferidora de Lipídeos (LTP do inglês: “Lipid
Transfer Particle”) (RYAN et al., 1986 a,b). LTP é uma lipoproteína de alta densidade
(RYAN et al., 1986b) e formada por três apolipoproteínas: apoLTP-I (350 kDa), apoLTP-
II (85 kDa) e apoLTP-III (60 kDa). A massa de proteínas corresponde a 86% da
partícula. Os lipídeos somam 14% da massa total e os carboidratos correspondem a 5%
da massa de proteína (RYAN et al., 1986b).
A LTP foi identificada e purificada da hemolinfa de outras espécies, tais como L.
migratória (HIRAYAMA & CHINO, 1990), P. americana (TAKEUCHI & CHINO, 1993),
Manduca sexta (CAPURRO & DE BIANCHI, 1990) and B. mori (TSUCHIDA et al.,
1997). A LTP é sintetizada no corpo gorduroso e secretada para a hemolinfa (VAN
HEUSDEN et al., 1996). Esta lipoproteína está presente no ovócito dos insetos onde
tem a função de converter a HDLp do adulto em VHDLp dos ovos (LIU & RAYAN,
1991). Porém, não está determinado se a LTP é sintetizada no ovócito ou transportada
para o mesmo (LIU & RAYAN, 1991).
Análise por microscopia eletrônica mostrou que a LTP possui uma cabeça
esférica e uma cauda cilíndrica longa e articulada (RYAN et al.,1990a; TAKEUCHI e
CHINO, 1993; TSUCHIDA et al., 1997). A localização das três subunidades da partícula
e a função específica de cada uma delas não está bem elucidada, mas dados
demonstram que as três apoproteínas são necessárias para a atividade da LTP (VAN
HEUSDEN et al., 1996).
O mecanismo de ação da LTP no plasma tem sido amplamente estudado. Uma
das hipóteses propõe que a transferência de lipídeos é mediada através de um
complexo de doador e receptor, onde a LTP atua como uma lançadeira (TALL, 1995).
Estudos in vitro têm mostrado a capacidade da LTP de transferir DAG (entre
lipoforinas obtidas de diferentes estágios do desenvolvimento de Manduca sexta), HDLp
(de larvas) e LDLp (de adultos) (RYAN & LAW., 1987). Ensaios in vitro usando TAG -
marcado de corpo gorduroso de adultos de M. sexta ou DAG – marcado de intestino
médio de larvas mostraram que a transferência é inibida quando no ensaio é adicionado
anticorpo anti - LTP e é restaurada ao acrescentar mais LTP (VAN HEUSDEM & LAW,
1989). Este experimento revela o papel essencial da LTP em promover a transferência
de DAG.
A LTP também tem a capacidade de transferir DAG entre lipoforinas de espécies
diferentes (RYAN et al, 1988b; CAPURRO & DE BIANCHI, 1990; TAKEUCHI & CHINO,
1993), entre HDLp ou LDLp para a vitelogenina, uma lipoproteína presente na
hemolinfa de fêmeas (TSUCHIDA et al., 1997), e entre lipoforina e lipoproteínas
humanas HDL (RYAN et al., 1992) e LDL (RYAN et al., 1990b; ANDOS et al., 1990;
SINGH et al., 1992). A LTP também atua na transferência de outros lipídeos de HDLp
para LDLp, incluindo fosfolipídeos (TSUCHIDA et al., 1997); carotenóides ( TSUCHIDA
et al., 1998) e hidrocarbonetos (TAKEUCHI & CHINO, 1993).
1.6 - Estoque e Mobilização de Lipídeos em Insetos
Durante a alimentação, lipídeos assimilados da dieta pelo intestino são
transportados para outros tecidos através da lipoforina presente na hemolinfa
(CANAVOSO et al., 2001).
A digestão de lipídeos provenientes da dieta ocorre no intestino médio, onde o
triacilglicerol (TAG), principal componente lipídico da dieta, é hidrolisado em ácidos
graxos livres e monoacilglicerol pela ação da TAG lipase, como demonstrado em M.
sexta (figura 4) (WEINTRAB & TIETZ, 1973, 1978; TSUCHIDA & WELLS, 1988;
HOFFMAN & DOWNER, 1979; ARRESE & WELLS., 1997; ARRESE et al., 2001).
Os ácidos graxos e monoacilgliceróis são absorvidos pelos enterócitos e
convertidos em DAG, TAG e fosfolipídeos. O DAG pode ser convertido em TAG, o que
serve como reserva de ácidos graxos ou o DAG pode ser secretado para hemolinfa
(CANAVOSO & WELLS, 2000). Paralelamente ao processo de absorção dos lipídeos
da dieta, DAG e outros lipídeos, como os fosfolipídeos, são transferidos do enterócito
para a hemolinfa (CANAVOSO & WELLS, 2000; ATELLA et al., 2000; CANAVOSO et
al., 2001), onde são transferidos diretamente para a lipoforina preexistente na hemolinfa
sem que haja síntese “de novo” dessa lipoproteína durante o processo (CANAVOSO et
al., 2001).
A transferência de lipídeos dos enterócitos para a lipoforina, é mediada por
receptores na superfície do tecido. Esse processo ocorre sem que a partícula seja
endocitada e é facilitado pela presença da LTP (ATELLA et al., 2000).
Após se abastecer no intestino, a lipoforina, carregada de lipídeos, percorre a
hemolinfa até atingir o corpo gorduroso ou outros sítios de utilização ou estoque de
lipídeos, onde os componentes lipídicos podem ser descarregados (CANAVOSO et al.,
2001). Ao entregar lipídeos para o corpo gorduroso, a lipoforina interage com esse
tecido através de sítios de ligação de alta afinidade, já identificados no corpo gorduroso
de M. sexta e R. prolixus (TSUCHIDA & WELLS, 1990; PONTES et al., 2002; GONDIM
& WELLS., 2000).
Ao contrário do que acontece em vertebrados, a lipoforina não é internalizada
pelas células, nem suas apoproteínas são acumuladas. Ela apenas transfere seus
lipídeos para os tecidos (CHINO & KITASAWA, 1981a; CHINO, 1985).
A transferência de lipídeos para o corpo gorduroso é facilitada pela LTP (VAN
HEUSDEN & LAW, 1989) e sua mobilização é sinalizada pela liberação de um
peptídeo, o hormônio adipocinético (AKH), liberado pela glândula corpora cardiaca
(Figura 5) (BEENAKKERS et al.,1985).
O AKH se liga a um receptor no corpo gorduroso (ZIEGLER et al., 1995),
desencadeando uma via de transdução de sinal que promove tanto a ativação da
adenilato ciclase quanto um aumento de Ca+2 e dos níveis de AMPc (ARRESE et al.,
1999; VAN DER HORST et al., 2001). Esses mensageiros desencadeiam, por
fosforilação, a ativação de uma lípase (TGA lípase), a qual converte triacilglicerol em
diacilglicerol (KATAGIRI, 1985; KAWOOYA et al., 1991; CANAVOSO & WELLS, 2000;
CANAVOSO et al., 2001).
DAG é transferido para a HDLp circulante através de sua ligação a receptores na
superfície do corpo gorduroso em um processo facilitado pela LTP (PRASAD et al.,
1986; RYAN et al., 1988a,b, VAN HEUSDEN & LAW, 1989; VAN ANTWERPEN et al.,
1989; HIRAYAMA & CHINO,1990). Simultaneamente com a captura de DAG pela
lipoforina, moléculas de apoLp-III se associam com a partícula lipoprotéica (WELLS et
al., 1987). A partícula de lipoforina resultante, maior e menos densa (LDLp), tem uma
grande capacidade para transportar DAG do corpo gorduroso para os músculos do vôo
(GILBERT & CHINO, 1974; CHINO & KITAZAWA, 1981b; CHINO, 1985; SHAPIRO et
al., 1988; VAN ANTWERPEN et al., 1988). No músculo de vôo uma lipoproteína lipase
hidrolisa DAG, originando glicerol e ácidos graxos livres, usados como fonte de energia
pelo músculo (VAN HEUSDEN, 1993). Assim que DAG é removido da LDLp, as
moléculas de apoLp-III dissociam-se da superfície da partícula, regenerando HDLp, que
retorna para o corpo gorduroso onde será recarregada com DAG (GILBERT & CHINO,
1974; CHINO & KITAZAWA, 1981b; CHINO, 1985, VAN HEUSDEN et al., 1987).
Em M. sexta, 40% do peso seco dos ovos é constituído de lipídeos, sendo 1%
deste total, proveniente de biossíntese e outros 5%, associados à vitelogenina, o
restante é entregue pela LDLp e HDLp ao ovócito. Da porcentagem total de lipídeos,
90% são entregues aos ovócitos mediado por uma lipoforina lipase, em processo similar
ao descrito para o músculo de vôo. O processo ainda envolve a endocitose seletiva de
HDLp. Os lipídeos da HDLp são extraídos com auxílio de uma lipase e da LTP,
resultando em uma lipoforina de altíssima densidade (VHDLp) a qual é armazenada no
corpo vitelínico. Durante todo este processo as subunidades da HDLp não são
degradadas (KAWOOYA & LAW., 1988 a; KAWOOYA et al., 1988 b) (Figura 6).
Figura 4: Esquema mostrando a absorção de ácidos graxos em enterócitos dointestino médio, a síntese de diacilglicerol nas células do intestino e otransporte do mesmo para o corpo gorduroso, onde é armazenado. AG - ácido
graxo livre; AP - via do ácido fosfatídico; DAG - diacilglicerol; LTP - partícula
A
INTESTINO MÉDIO
síntese eAG AP
CORPO GORDUROSOSíntese e secreção de
lipoforina nascente (nLp); estoque de
nL
nL
TAG
Transportador de ácido graxo livre Receptor Lipoforina
LÚMEN INTESTINAL Digestão da
HEMOLINFA Transferência
de DAG do intestino para
lipoforina; t d
Figura 5: Esquema mostrando a produção de lipoforina de baixadensidade (LDLp) pelo corpo gorduroso e entrega de lipídeos nomúsculo de vôo. AKH - hormônio adipocinético; ApoLp-IIIapolipoforina III; DAG - diacilglicerol; HDLp - lipoforina de alta
AKH
cAMP +
PKA
P
TAG
DAG
ApoLp
LDL LD
L
HD
HDDAG
ÁC. GRAXO
ENERGI
MÚSCULO
CÉLULA DO CORPO HEMOLINFA
Gota
TAG-LT
R
Lipoforina
Figura 6: Entrega de lipídeos ao ovócito: Os lipídeos são entregues ao
ovócito principalmente pela lipoforina de baixa densidade (LDLp) em um
mecanismo que requer a atividade de uma lipoforina lípase. Uma outra rota
de menor importância: envolve a endocitose da lipoforina de alta densidade
(HDLp) a qual é delipidada dentro da célula e a lipoforina de muito alta
LD
Lp LDLp
HD
HEMOLINFA
Lipoforina
TA
DA
Gota
A
HDLp Lipase LTP VHDL
AC
TA
Ovo
OÓCITO CORPO
HD
Endocit
2 – OBJETIVOS
2.1 - Identificar, purificar e caracterizar a lipoforina de Diatraea saccharalis;
2.2 - Investigar o papel da lipoforina no transporte de lipídeos neutros.
3 – Materiais e Métodos 3.1 - Obtenção das Larvas de Diatraea saccharalis
As larvas de D. saccharalis foram obtidas na Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro (Campus Leonel Miranda), cedidas pelo Professor Mauri Lima Filho.
As lagartas foram criadas artificialmente em cortes de cana, os quais foram
trocados seguidamente para evitar aparecimento de fungos. Após a emergência dos
adultos, estes foram reunidos em casais e colocados em manta de vidro forrada com
papel de cera e posta sobre placas de Petri com sílica úmida e recobertas com papel de
filtro. Os adultos foram mantidos a temperatura de 28 oC e 60% de umidade relativa,
com um fotoperíodo de 12 h claro e 12 h escuro.
Os ovos foram coletados e desinfectados com solução de cloreto de mercúrio 1%
por 3 min. Em seguida, foram transferidos para o seguinte meio artificial (HENSLEY &
HAMMOND., 1986): Água destilada (1,558 mL); Aureomicina (0,50 g); Sais de Wesson
(18,0 g); Caseína (54,0 g) Sacarose (90,0 g); Germe de trigo (54,0 g); Cloreto de colina
(1,8 g); Solução vitamínica (18,0 mL*); Ácido ascórbico (7,2 g); FormaldeÍdo 37,2% (0,9
mL); Metil-p-hidroxibenzoato (2,7 g); Bacto-agar (36 g).
(*) A solução vitamínica consta das seguintes vitaminas, dissolvidas em 1.000
mL de água destilada: Niacinamida (1 g); Pantotenato de cálcio (1 g); Riboflavina (0,5
g); Tiamina (0.25 g); Piridoxina (0,25 g); Ácido fólico (0,1 g); Biotina (0,02 g); Vitamina
B12 1000 mg/cc (2 mL).
O meio artificial, depois de pronto, foi transferido para tubos de vidro tampados
com algodão. Os tubos foram previamente esterilizados a 150 oC por 3 h, em estufa. A
temperatura de incubação dos ovos foi de 28 oC e 60% de umidade relativa com um
fotoperíodo de 12 h claro e 12 h escuro. Os ovos eclodiram em um período de 4 a 9
dias.
3.2 - Coleta de Hemolinfa, Corpo Gorduroso e Ovário
Larvas do quinto instar (vinte dias) de D. saccharalis foram mantidas sobre gelo
até que todos os seus movimentos fossem interrompidos. Em seguida, foi feita uma
incisão no dorso da larva, e a hemolinfa foi coletada com um capilar. Em média foram
obtidos 25 µL de hemolinfa por larva. Os insetos adultos (20 dias) foram colocados em
Placa de Petri e mantidos sobre o gelo até que todos os seus movimentos fossem
interrompidos. Em seguida, a cabeça foi removida cuidadosamente com auxílio de uma
pinça e um capilar foi imediatamente inserido na parte exosta do protorax para coleta da
hemolinfa. Em média, foram coletados 5 µL de hemolinfa por inseto adulto.
Durante a coleta o material foi mantida no gelo na presença de uma solução de
NaCl 0,15 M contendo 5mM de EDTA e uma mistura dos inibidores de protease, PMSF
1mM e Benzamidina 1 mM na presença de 1 mM de feniltiocarbamida.
Os hemócitos foram removidos por centrifugação a 11.000 xg, por 10 minutos, e
o sobrenadante foi congelado em nitrogênio líquido e mantido no freezer.
Para a coleta do corpo gorduroso, as larvas foram presas com alfinete
entomológico em uma placa de Petri preenchida com parafina. Foi feita uma incisão ao
longo da cavidade corpórea com uma pequena tesoura. Em seguida as cabeças,
intestinos e túbulos de Malpighi foram retirados com o auxílio de uma lupa
estereoscópica e pinças de dissecação. A carcaça do inseto foi então macerado em 750
µL de tampão fostato de sódio 20 mM pH 7,4 em um Poter de 3 mL, sobre gelo. Em
seguida, a cutícula deste inseto foi lavada com 250 µL do mesmo tampão e retirada da
solução com uma pinça. O corpo gorduroso foi congelado e armazenado em nitrogênio
líquido.
Para coleta do ovário, fêmeas adultas foram presas com alfinete entomológico
em uma placa de Petri preenchida com parafina. Foi feita uma incisão ao longo do
abdômen, com o auxílio de uma pequena tesoura. Em seguida, o ovário foi retirado com
o auxílio de uma lupa estereoscópica e pinças de dissecação. O ovário foi macerado
em tampão fostato de sódio 20 mM pH 7,4 e imediatamente congelado em nitrogênio
líquido.
3.3 – Obtenção de Hemolinfa Metabolicamente Marcada com 3H
Larvas de D. saccharalis (5o estádio) foram alimentadas artificialmente com uma
solução de H3-palmitato em metanol (1µCi/µL) administrando diretamente pela via oral
com o auxílio de uma seringa Hamilton. Seis horas após a alimentação das larvas, a
hemolinfa foi coletada como descrito anteriormente.
3. 4 – Isolamento da Lipoforina
O método para ultracentrifugação da hemolinfa, ou hemolinfa-3H, foi adaptado de
CAPURRO et al. (1996). A hemolinfa (3 mL) foi diluída para 5 mL usando tampão
fosfato de sódio 100mM, NaCl 0,15 M, pH 7,2, EDTA 5 mM e 44% de KBr (p/v), na
presença ou ausência de 0,1% de “Sudam black” em etilenoglicol (CHUNG et al., 1986).
Sobre esta solução, foram adicionados mais 5 mL do mesmo tampão descrito acima,
porém sem KBr. Este material foi ultracentrifugado a 100.000 xg por 16h a 4oC em uma
centrífuga HITACHI (himac CP 85 Β) com o rotor P2852. As frações foram coletadas a
partir do topo do gradiente, em um total de 20 frações de 500 µL cada. Após a
separação, às frações foram dialisadas contra tampão fosfato de sódio 100mM, NaCl
0,15 M, pH 7,4 contendo 5 mM de EDTA, perfazendo 5 trocas de tampão. Este
experimento foi realizado com 10 amostras diferentes.
Após a ultracentrifugação foi estimado o índice de refração (IR) da luz em KBr de
cada uma das frações do gradiente usando um refratômetro (Milton Roy Company). O
equipamento foi calibrado com água ultra pura (ρ = 1,00 g/ml) e KBr 50% em PBS (ρ =
1,32 g/ml).
O IR foi convertido em densidade usando-se a fórmula: ρ = a. x η- b, onde ρ é a densidade, η
equivale ao índice de refração, a corresponde ao valor 6,4786 e b corresponde ao valor 7,6431
(a e b são constantes que dependem do sal usado para o estabelecimento do gradiente).
A radioatividade das frações foi estimada por cintilação líquida, usando Bray com líquido de
cintilação (BRAY, 1960).
A absorbância das frações foi estimada em 452nm – para hemolinfa na ausência de “Sudam Black” e 605 nm – para hemolinfa na presença de “Sudam Black”. Foi usado um espectrofotômetro SHIMADZU UV mini 1240. Este experimento foi realizado com 10 amostras diferentes.
3.5 - Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
As frações do gradiente foram analisadas por eletroforese em géis de poliacrilamida, em um gradiente de concentração variando de 3 a 22% na presença de SDS (LAEMMLI, 1970) ou de 3 a 15% em condições não desnaturantes (DAVIS, 1964), e coradas com “coomassie blue” (DUNN & CRISP, 1994). Os géis foram corridos em amperagem constante de 30 mA.
3.6 - Cromatografia de Filtração em Gel
A cromatografia foi realizada em HPLC (Shimadzu LC10AT) utilizando uma
coluna de filtração em gel Superose 6 GL 10/300. A coluna foi equilibrada em tampão
Tris - HCl 20 mM, NaCl 1 M , pH 8,0 em um fluxo de 0,5 mL/min. O volume aplicado foi
de 50 µL de amostra.
3.7 - Determinação da Massa Molecular da Lipoproteína Purificada por PAGE de Poro Limite
A determinação da massa molecular da lipoforina foi estimada por eletroforese
em gel de poliacrilamida (NICHOLS et al., 1986). Foi usado um gel de separação de 3 a
20% (20 mL) e um gel de empacotamento de 3,3% (5 mL). A corrida foi realizada a 100
V por 24 horas. Os padrões usados foram: Tiroglobulina (669 kDa); apoferritina (440
kDa); β-amilase (200 kDa); BSA (66 kDa); Citocromo c (14 kDa).
3.8 – “Dot Bloting”
Experimentos de “Dot Blotting” foram realizados segundo procedimento padrão
descrito para “western blotting” (TOWBIN et al., 1979). Foram aplicados diretamente na
membrana de nitrocelulose 5 µg de lipoforina de Rhodinius prolixus, 15 µg da fração 9
do gradiente e 15 µg de BSA. A membrana foi incubada por 1 h com tampão TBS tween
molico - Tris 10 mM; NaCl; 0,01% de tween 20, pH 7,0, contendo 2 % de leite Molico
desnatado. O tampão foi filtrado. Após, a membrana foi incubada por mais 2 h com o
mesmo tampão contendo o anticorpo primário (policlonal), anti-lipoforina de R. prolixus,
numa diluição de 1:10000. Após esta etapa, a membrana foi lavada exaustivamente em
TBS e incubada por 1 h com o anticorpo secundário (anti-coelho) conjugado com
peroxidase, em uma diluição de 1:2000. A membrana foi então lavada exaustivamente
com PBS e revelada com diaminobenzidina (DAB) e peróxido de hidrogênio.
O anticorpo anti-lipoforina de R.prolixus foi obtido com a Professora Geórgia
Atella do Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Insetos do Instituto de Bioquímica
Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
3.9 - Determinação da Densidade da Lipoforina
A fração correspondente a lipoforina foi diluída em 5mL de PBS e aplicadas em
um segundo gradiente usando 5 mL de uma solução de NaCl 0,15 contendo KBr 50%
(p/v). Este material foi ultracentrifugado a 100.000 xg por 16h a 4oC. As frações foram
coletadas a partir do topo do gradiente, em um total de 20 frações de 500 µL cada, e
suas absorbâncias estimadas a 452 nm. Após o fracionamento foi estimado o índice de
refração (IR) da luz em KBr de cada uma das frações usando um refratômetro (Milton
Roy Company). O equipamento foi calibrado usando água ultra pura (ρ = 1,00 g/ml) e
KBr 50% em PBS (ρ = 1,32 g/ml).
O IR foi convertido em densidade usando a fórmula: ρ = a. x η- b, onde ρ é a
densidade, η equivale ao índice de refração, a corresponde ao valor 6,4786 e b
corresponde ao valor 7,6431 (a e b são constantes que dependem do sal usado para o
estabelecimento do gradiente). O mesmo método foi usado para determinação da
densidade de outras lipoforinas (GONDIM et al., 1989).
3.10 – Extração de Lipídeos da Lipoforina de Larvas de D. saccharalis.
A extração dos lipídeos foi realizada de acordo com BLIGH e DYER (1959). Para
realizar a extração dos lipídeos, foi usada uma alíquota de lipoforina correspondente a
30 µg. A esta alíquota foi adicionada a solução de extração: metanol, clorofórmio e
água (2:1:0,8; v:v:v). O material foi agitado em vórtex durante 2 h, de 5 em 5 min. Em
seguida, o material foi centrifugado a 22.000 xg, por 20 min a temperatura ambiente. O
sobrenadante foi coletado e armazenado a 4oC. Ao precipitado foram adicionados 2 mL
da solução de extração acima, seguido de agitação por mais 1 h em intervalos de 5 min.
O material foi novamente centrifugado, sendo o sobrenadante combinado com o
coletado anteriormente e a estes adicionados 1 mL de clorofórmio e 1 mL de água. Este
material foi rigorosamente agitado em vórtex por 30 segundos e centrifugado a 22.000
xg por 15 min a temperatura ambiente. A fase orgânica (fundo do tubo) foi coletada com
uma seringa de ponta longa. Logo após, foi seca sob atmosfera de nitrogênio. O
material foi transferido para tubos e pesado em uma balança analítica (gravimetria). Em
seguida foi ressuspenso em 60µL de clorofórmio para serem aplicados em placas de
TLC.
3.11 – Identificação dos Lipídeos em Cromatografia de Camada Fina (TLC)
As amostras de lipídeos foram analisadas por cromatografia de camada fina
(TLC) em placas de sílica de dimensões de 20 cm X 20 cm.
Na TLC unidimensional de fosfolipídeos, os solventes usados foram: acetona, metanol, ácido acético, clorofórmio, água (15: 13: 12: 40: 8; v: v: v: v: v) e a corrida foi interrompida quando restaram aproximadamente 4 cm para o final da placa.
Para a TLC bidimensional de fosfolipídeos, os solventes usados foram na
primeira dimensão: clorofórmio, metanol, amônia (hidri-amônia) (130: 60: 15; v: v: v). A
corrida foi interrompida quando restaram aproximadamente 4 cm para o final da placa.
Antes de correr a segunda dimensão, a placa foi mantida em temperatura ambiente por
60 minutos. Na segunda dimensão os solventes usados foram: clorofórmio, metanol,
acetona, ácido acético, água (100: 20: 40: 30: 10; v: v: v: v: v). A corrida foi interrompida
quando restaram aproximadamente 4 cm para o final da placa (YAVIN & ZUTRA, 1977).
Os lipídeos neutros também foram analisados por TLC usando-se como solvente
hexano, éter etílico e ácido acético (60: 40: 1; v: v: v). A corrida foi interrompida quando
restaram aproximadamente 4 cm para o final da placa (KAWOOYA & LAW, 1988).
Após as cromatografias, as placas de TLC foram incubadas em solução de ácido
fosfórico 10% e sulfato de cobre 8% e posterior aquecimento em estufa a 100oC, ou
coradas com vapores de iodo. As placas de TLC foram imediatamente digitalizadas ou
fotografadas.
Para a determinação da radioatividade associada aos lipídeos, as manchas correspondentes a cada classe de lipídeos foram raspadas da placa de sílica, e logo após os lipídeos foram re-extraídos da sílica. A radioatividade foi estimada por cintilação líquida.
3.13 - Quantificação de Proteínas
A quantidade de proteína das frações e da lipoforina foram estimadas de acordo
com o método de LOWRY et al (1951), com modificações: foi usada uma solução de
SDS (3,3%), substituindo a água e albumina sérica bovina Como padrão.
3.14 - Quantificação de Açúcar
A quantidade açúcar da lipoforina foi estimada de acordo com o método de
Dubois (1956) que usa glicose como padrão.
4 – RESULTADOS 4.1 – Ultracentrifugação da Hemolinfa de Diatraea saccharalis O passo inicial para isolar a lipoforina presente na hemolinfa de larvas de D.
saccharalis foi a ultracentrifugação em gradiente isopícnico de KBr na presença ou
ausência de “Sudam black”, ou usando hemolinfa metabolicamente marcada com 3H
(hemolinfa-H3). O perfil do gradiente, ao final da ultracentrifugação, é mostra na figura 7,
onde é possível observar duas regiões enriquecidas com um pigmento amarelo. Estas
regiões foram denominadas; A - I – fração de coloração amarela próxima ao topo do
gradiente; A - II – segunda fração amarela próxima ao fundo do gradiente.
Após a adição de “Sudam black” ficou notório que as regiões anteriormente citadas
sofreram a ação deste corante (Fig 1B).
A B
A - I
A - II
4.2 – Análise das Frações do Gradiente 4.2.1 - Absorbância
A figura 8 mostra o perfil espectrofotométrico da 20 frações do gradiente.
Foram obtidos dois picos de absorção, um na fração 9 e outro na fração 15,
para ambos os comprimentos de onda.
4.2.2 – Densidade e Concentração de Proteínas
Figura 7: Perfil da hemolinfa de D. saccharalis após a ultracentrifugação emgradiente isopícnico de KBr. Ultracentrifugação de 3 mL de hemolinfa de
D.saccharalis em gradiente isopícnico de KBr na presença ou ausência de
“Sudam black”, ou usando hemolinfa metabolicamente marcada com 3H
(hemolinfa-H3). (A) Na ausência de corantes durante a centrifugação; (B) Na
presença de “Sudam Black” durante a centrifugação. O experimento foi realizado
em 3 amostras distintas.
Figura 8: Perfil espectrofotométrico da hemolinfa de larvas de D.saccharalis após a ultracentrifugação isopícnica em gradiente de KBr. O gradiente foi fracionado em vinte partes de 500 µL cada.
Após o fracionamento partiu-se para a análise por espectrofotometria
das mesmas. O experimento foi realizado em 3 amostras distintas.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
ABS 452 nm ABS 605 nm
Frações
AB
S
A-I
A-II
Como parte da análise, foi estimada a densidade e a concentração de
proteína para cada uma das frações.
Alíquotas de 20 µL, de cada uma das frações do gradiente, foram
analisadas em um refratômetro e obtidos o valor do índice de refração da
luz em KBr. Estes valores foram convertidos às densidades, como descrito
em materiais e métodos. A densidade do gradiente variou de 1,025 g/mL a
1,355 g/mL sendo a densidade da lipoforina 1,122 g/mL (figura 9). A quantidade de proteínas das frações foi estimada pela metodologia de
LOWRY (1951) com descrito em materiais e métodos. A partir da fração de
número 7 foram encontrados valores significativos na concentração de
proteína.
4.2.3 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida 4.2.3 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
A figura 10 mostra as frações do gradiente submetidas à eletroforese em
condições não-desnaturantes em gel de poliacrilamida, variando de 3 – 15%, onde
observamos uma população variada de proteínas para as frações 15 – 17. Na figura 11
observamos o perfil eletroforético das mesmas frações por SDS-PAGE em gradiente de
concentração de 6 – 22%, ambos corados por azul de coomassie. Foram usados 5 µg
de cada uma das frações do gradiente e 1µg de hemolinfa. Como pode ser percebido
na figura 11 a fração 7 a 9 (marcadas) estão enriquecidas com uma proteína que se
Figura 9: Concentração de Proteínas e Densidade das Frações do Gradiente.As frações do gradiente foram analisadas em um refratômetro sendo obtidos os
valores do índice de refração da luz em KBr. Estes valores foram convertidos às
densidades das mesmas. A concentração de proteínas foi pela estimada pela
metodologia de LOWRY (1951). O experimento foi realizado com 6 amostras
distintas.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200123456789
1011121314
Concentraçâo de Proteínas
0.951.001.051.101.151.201.251.301.351.401.45
Densidade
Frações
Con
cent
raçã
o de
Prot
eína
s em
µg
Densidade g/cm
3
encontra praticamente isolada das outras, a qual acredita-se que apresenta duas
subunidades majoritárias.
Figura 10: Padrão de distribuição de proteínas por eletroforese em gel depoliacrilamida (3 – 15%) em condições não desnaturantes. Foram usados 5
µg de cada uma das frações do gradiente e 1µg de hemolinfa. O corante usado foi
o azul de coomassie. Os números sobre as raias representam as frações do
A-I H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17
A-II
4.2.4 – Radioatividade
Hemolinfa-H3 foi ultrancentrifugada em gradiente isopícnico de KBr, como descrito
anteriormente.
Figura 11: Padrão de distribuição de proteínas por SDS-PAGE (6 – 22% de
poliacrilamida). Foram usados 5 µg de cada uma das frações do gradiente e 1µg
de hemolinfa. O corante usado foi o azul de coomassie. Os números sobre as
raias representam as frações do gradiente, do topo para o fundo do tubo.
H – Hemolinfa total.
H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 A-I A-II
Foram usados 5 µl de cada fração para estimar a radioatividade associada às
mesmas. É possível observar um pico de radioatividade associado à fração de número
9 (Figura 12).
4.3
- Dot
Blo
t
Foi
veri
fica
do,
por
“do
t blot”, a
reatividade
imunológica
cruzada da
proteína
associada à
fração nove
do gradiente com anticorpo anti-lipoforina de R. prolixus. Sendo possível observar o
reconhecimento do anticorpo a proteína em questão (Firura 13).
Para fins de controle, foi verificada a reatividade da mesma fração ao anticorpo
secundário e não foi detectada uma resposta positiva.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200
2.5×10 3
5.0×10 3
7.5×10 3
Hemolinfa FraçõesFrações
DPM
/ µl d
e am
ostr
a
A-II
A-I
Figura 12: Radioatividade Associada às Frações do Gradiente. Hemolinfa-H3
foi ultrancentrifugada em gradiente isopícnico de KBr. Após o fracionamento do
gradiente 5 µl de cada fração foram usados para estimar a radioatividade
associada. A-I – fração de cor amarela próxima ao topo do gradiente; A-II – fração
de cor amarela próxima ao fundo do gradiente. O experimento foi realizado com 2
amostras distintas.
4.4 - Análise da Fração Nove
Para observar o grau de homogeneidade da proteína encontrada na fração 9, uma
alíquota de 50 µg da fração foi submetida à cromatografia de filtração em gel em HPLC
(figura 14A) e 15 µg da mesma fração foi submetida à eletroforese em condições não
desnaturantes e corado com azul de coomassie (figura 14B).
Figura 13: Dot Blot. Após a ultracentrifugação da hemolinfa de larvas de
D.saccharalis em gradiente isopícnico de KBr foi testada a reatividade
imunológica da fração 9 ao anticorpo policonal anti-lipoforina de Rhodnius
prolixus. 1 – Lipoforina de R. prolixus (5 µg). 2 – BSA (15 µg) controle negativo.
3 - Fração 9 do grandiente de KBr (15 µg). 4 – Fração 15 do grandiente de KBr
(15 µg) O experimento foi realizado com 3 amostras distintas.
1 2 3 4
A figura 14A revela um pico majoritário de absorção a 280 nm e na figura 14B é
possível observar, na raia 2, a presença de uma única banda de proteína.
4.5 – Massa Molecular da Partícula e suas Subunidades
Para estimar a massa molecular da partícula, em sua forma nativa, foi usada a
técnica de gel poro limite, como descrita em material e métodos. Foi possível
estabelecer que a massa da lipoforina de D.saccharalis é de aproximadamente 710
kDa, como pode ser observado na figura 15. Os padrões usados foram; tioglobulina
669 kDa, ferritina 440 kDa, albumina 66 KDa e catalase 232 KDa.
Ainda foi comparado o tempo de retenção da lipoforina de R. prolixus com a
lipoforina de D. saccharalis, em uma cromatografia de filtração em gel. Foi observado
um tempo de retenção muito próximo para ambas as partículas (dado não
demonstrado).
Uma alícota de lipoforina foi submetida a SDS-PAGE para observar o perfil
eletroforético das apolipoproteínas I e II. Foi usado um tampão de amostra contendo
SDS (Dodecil sulfato de sódio) e beta-mercaptoetanol. Um padrão comercial com as
seguintes massas: 250; 160; 50; 35; 25 e 10 kDa. A massa estimada para a apoLp I foi
de 250 kDa e para a apoLp II foi de 90 kDa (Fig 16).
0 1.0×103 2.0×103 3.0×103 4.0×103 5.0×1030
25
50
75
100
Tempo (seg)
AB
S 28
0 nm
*
1 2
B A
Figura 14: Perfil Cromatográfico em Coluna de Gel Filtração da Fração Novedo Gradiente Isopícnico em KBr da Hemolinfa de Larvas de D. saccharalis.
(A) Uma aliquota de 50 µg da fração foi submetida à cromatografia de filtração em
gel em HPLC. (B) Padrão de distribuição de proteínas por eletroforese em gel de
poliacrilamida (3 – 15%) em condições não desnaturantes. 1 – Hemolinfa total
(10 µg). 2 – Fração nove do gradiente isopícnico de KBr (20 µg). O experimento
foi realizado com 3 amostras distintas.
0.2 0.4 0.6 0.8 1.010
100
1000
Migração (RF)
Log
Mas
sa M
olec
ular
(kD
a) Lf
710 kDa
A
B
FIGURA 15: Massa Molecular da Lipoforina de D. saccharalis. (A) Gráfico mostradando o log da massa molecular pela migração dos padrões
em PAGE de poro limite. (B) Raia mostrando a migração de uma alíquota de 10
µg de lipoforina purificada. Lf - Lipoforina. A seta indica a posição da migração da
lipoforina. O experimento foi realizado com 3 amostras distintas.
4.6 – Composição da Lipoforina
A composição química da lipoforina de D. saccharalis foi analisada levando-se
em consideração a porção protéica, lipídica e glicídica da partícula. As massas das três
classes de macromoléculas citadas acima foram determinadas como descrito em
material e métodos. Verificou-se que a lipoforina de D. saccharalis é constituída por
aproximadamente 46% de proteína, 49% de lipídio e 5% de açúcar.
4.7 – Identificação dos Fosfolipídios
FIGURA 16: Massa Molecular das Subunidades da Lipoforina de D.
saccharalis. (A) Gráfico mostradando o log da massa molecular pela migração
dos padrões em SDS - PAGE. (B) Raia mostrando a migração das subunidades
de lipoforina purificada, alíquota de 10 µg. Lf - Lipoforina. A seta indica a posição
da migração das subunidades da lipoforina. O experimento foi realizado com 3
amostras distintas.
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.710
100
1000
Migração (RF)
Log
Mas
sa M
olec
ular
(kD
a)
Lf
250
90
kDa
Feita a extração dos lipídios da lipoforina, a próxima etapa foi à análise da
composição dos mesmos. Os lipídios presentes na lipoforina de larvas de D. saccharalis
foram analisados por cromatografia de camada fina (TLC), unidimensional e
bidimensional para os fosfolipídios e unidimensional para lipídios neutros. A quantidade
de lipídios usada em cada uma das TLCs, foi o correspondente a 100 µg de proteína.
Os fosfolipídios identificados na TLC unidimensional foram: fosfatidilinositol,
fosfatidilserina, lisofofatidilcolina, fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina (Dado não
mostrado).
Os fosfolipídeos identificados na TLC bidimensional foram: esfingomielina,
fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina (Figura 17). Percebemos a
presença de algumas moléculas não identificadas de acordo com os padrões
conhecidos.
1a D
NI*
2a D
•
Figura 17: TLC bidimensional para fosfolipídios. Os lipídeos extraídos da
4.8 - Identificação dos Lipídios Neutros
Na cromatografia de camada fina para lipídeos neutros, podemos constatar a presença de monoacilglicerol, triacilglicerol, 1,2-diacilglicerol, 1,3-diacilglicerol e colesterol esterificado (Figura 18). Constatamos a presença de algumas moléculas não identificadas de acordo com os padrões conhecidos.
Figura 18: TLC unidimensional para lipídios neutros Os lipídios neutros foram
analisados por TLC em placa de sílica de 8 X 20 cm. Os solventes usados foram:
hexano, éter etílico e ácido acético (60: 40: 1; V: V: V). Ds – Lipídios extraídos da
lipoforina de D.saccharalis; AG - Acilglicerol; MG – Monoacilglicerol; TAG –
Triacilglicerol; CH – Colesterol Esterificado; NI – Não identificado.
1,2-DG
1,3-DG
CHTG
N
DsTGAG DG CH
NI
AG
Para estimar a quantidade de lipídeos neutros encontrados na lipoforina de D. saccharalis foi usado uma alíquota da lipoforina-H3 (Lf- H3) purificada (Figura 19). Os lipídeos foram retirados da sílica como descrito em materiais e métodos. Foi observado que a maior parte da radioatividade associada a lipoforina estava na forma de DAG e uma pequena parte permaneceu na origem da placa de sílica.
4.9 – Quantificação de Lipídeos Totais na Hemolinfa e Corpo Gorduroso de larvas de Diatraea saccharalis
A quantidade de lipídeos presente na hemolinfa e no corpo gorduroso foi
estimada por pesagem (Figura 20). A hemolinfa apresentou uma média de 21,85 µg/µl
de lipídeos, já o corpo gorduroso apresentou 69 µg de lipídeos por larva.
OR CE CO AG DG TG0
2.5×104
5.0×104
7.5×104
1.0×105
DPM
Figura 19: Quantidade de Lipídeos Neutros Associados a Lipoforina de D.
saccharalis. Feita uma TLC usando os lipídeos extraídos da lipoforina-H3 a
próxima etapa foi re-extrair a mancha correspondente a cada uma da classe de
lipídeos e estimar a radioatividade associa por cintilação líquida. CE – Colesterol
Esterificado; OR – Origem; CO – Colesterol; AG – Acilglicerol; DAG –
Diacilglicerol; TAG – Triacilglicerol. O experimento foi realizado com 2 amostras
Figura 20: Quantidade de Lipídeos na Hemolinfa e Corpo Gorduroso deLarvas de D. saccharalis. Os lipídeos foram extraídos dos tecidos usando
metanol, clorofórmio e água (2:1:0,8; V:V:V), logo após foram quantificados por
gravimetria. O experimento foi realizado três vezes; sendo usadas nove larvas por
experimento.
Hemolinfa Corpo Gorduroso0
25
50
75
0
25
50
75µ
g/La
rva µ g/Larva
4.10 – Transporte de Lipídeos Neutros na Hemolinfa de Larvas de Diatraea
saccharalis
Para avaliar a capacidade de transporte de lipídeos neutros lipoforina de D. saccharalis, larvas
foram alimentadas artificialmente com 3H-palmitato, como descrito em materiais e métodos.
Uma alíquota de 5 µl da hemolinfa coletada foi usada para estimar a radioatividade associada
(Figura 21), sendo o restante imediatamente congelado e mantido em nitrogênio líquido. É
possível observar um pico de radioatividade seis horas após a alimentação dos insetos com 3H-
palmitato (Figura 21).
Posteriormente, com o material congelado foi realizada uma TLC. Os lipídeos neutros foram identificados, raspados e extraídos da placa de sílica. A radioatividade associada ao monoacilglicerol, diacilglicerol e triacilglicerol foi estimada (Figura 22).
0 6 12 18 24 30 36 42 480
5.0×104
1.0×105
1.5×105
2.0×105
2.5×105
3.0×105
3.5×105
Tempo (H)
DPM
/ µl d
e H
emol
infa
Figura 21: Transporte de Lipídeos Neutros na Hemolinfa de Larvas de Diatraea
saccharalis. larvas de D. saccharalis foram alimentadas artificialmente com 3H-
palmitato. A hemolinfa destes insetos foi coletada em diferentes tempos. Uma alíquota
de 5 µl da hemolinfa coletada foi usado para estimar a radioatividade associada em
cintilação líquida O experimento foi realizado três vezes; sendo usadas 4 larvas por
A maior parte da radioatividade está associada ao diacilglicerol, sendo o tempo de seis horas o máximo alcançado por este grupo de lipídeos (Figura 22).
4.11 – Acúmulo de Lipídeos Neutros no Corpo Gorduroso de Larvas de Diatraea
saccharalis
0 6 12 18 24 30 36 42 480
5.0×102
1.0×103
1.5×103
AG DG TG
Tempo (H)
DPM
Figura 22: A radioatividade associada ao monoacilglicerol, diacilglicerol etriacilglicerol presentes na Hemolinfa de Larvas de D. saccharalis. Foi
realizada uma TLC com a amostra da hemolinfa retirada dos insetos alimentados
com 3H-palmitato. Em seguida, os lipídeos neutros foram identificados, raspados
e extraídos da placa de sílica. AG – Acilglicerol; DAG – Diacilglicerol; TAG –
Triacilglicerol. O experimento foi realizado duas vezes; sendo usadas 4 amostras
distintas por ponto do gráfico.
Larvas de D. saccharalis foram alimentadas artificialmente com 3H-palmitato para
verificar a deposição de radioatividade no corpo gorduroso. As larvas foram divididas
em seis grupos de quatro insetos cada um. O corpo gorduroso destes insetos foi
extraído, como descrito em materiais e métodos, e mantidos em gelo. A radioatividade
de cada um dos grupos foi estimada. Na figura 23, notamos que já é registrada uma
certa estabilidade na curva dosagem da radioatividade associada a lipídeos neutros no
corpo gorduroso destes insetos.
4.12 – Acúmulo de Lipídeos Neutros no Ovário dos Insetos Adultos
0 6 12 18 24 30 36 42 480
5.0×103
1.0×104
1.5×104
2.0×104
Tempo (h)
DPM
/ Lar
va
Figura 23: Acúmulo de Lipídeos Neutros no Corpo Gorduroso de Larvas deDiatraea saccharalis. Larvas de D. saccharalis foram alimentadas
artificialmente com 3H-palmitato, logo após a deposição de radioatividade no
corpo gorduroso foi estimada. O corpo gorduroso destes insetos foi extraídoe
mantidos no gelo. O experimento foi realizado duas vezes; sendo quatro amostras
distintas por ponto do gráfico.
Um grupo de larvas de D. saccharalis foi alimentado artificialmente com 3H-
palmitato e seu desenvolvimento foi acompanhado até a fase adulta. As fêmeas tiveram
a hemolinfa e os ovários coletados, como descrito em materiais e métodos. Na figura 24
podemos observar uma alta dosagem de radioatividade no ovário e uma baixa dosagem
na hemolinfa.
Figura 24: A radioatividade associada a Hemolinfa e Ovário de D.
saccharalis. Os tecidos foram coletados e tiveram a radioatividade associada
estimada por cintilação líquida. O experimento foi realizado duas vezes; sendo
usado 6 larvas para cada experimento.
Hemolinfa Ovário0
1.0×104
2.0×104
3.0×104
DPM
/ µg
de p
rote
ína
5 – Discussão
A cultura de cana-de-açúcar é de grande importância econômica e social para o
Brasil. Para a safra de 2004/2005 a área colhida totalizou 4.765.000 de hectares,
distribuídos por vários estados do país. O destino da produção da cana é o setor sucro-
alcooleiro, onde 60% da produção tem como destinado a fabricação de álcool e 40% à
fabricação de açúcar, gerando cerca de um milhão e trezentos mil empregos diretos e
três milhões indiretos (Fonte: UNICA - União da Agroindústria Canavieira de São
Paulo). As larvas de D. saccharalis se alimentam do colmo da cana-de-açúcar, onde
abrem galerias que deixam a planta frágil aos ventos, o que pode levar ao tombamento
deste vegetal. Além disso, outros prejuízos indiretos são causados pelas larvas, uma
vez que através dos orifícios e galerias penetram fungos, como Colletotrichum falcatum,
o qual é o agente causador da podridão vermelha do colmo, podendo abranger toda a
região compreendida entre as diversas galerias (NÍVIA,1997).
Além da importância econômica, a D. saccharalis apresenta um volume
considerável de hemolinfa e fácil manuseio o que torna, este inseto, um excelente
modelo de experimental.
A hemolinfa de D. saccharalis apresenta uma coloração amarela intensa. Essa
característica não é exclusividade desta espécie. O bicho da seda (Bombyx mori), por
exemplo, também apresenta a hemolinfa nesta cor devido à presença de carotenóides
(TSUCHIDA, 1998). Com a capacidade de conferir cor à carcaça dos insetos, os
carotenóides encontrados na hemolinfa são retirados da dieta (CANAVOSO et al.,
2001). A cor de um inseto está diretamente relacionada com sua sobrevivência, pois
possibilita a camuflagem; e também atua na reprodução como um atrativo sexual
(EDMUNDS, 1974). Em D. saccharalis a presença de carotenos na hemolinfa,
possivelmente, está relacionada a sua cor amarelo-palha (Figura 1B e 1D).
A hemolinfa dos insetos contém uma lipoproteína majoritária denominada
lipoforina (CHINO et al., 1969), mesmo em insetos com uma alimentação pobre em
lipídeos, como ocorre em mosquitos adultos que se alimentam de açúcar. Nestes
animais o glicogênio é sintetizado por 6 a 8 horas depois da alimentação. Após este
período há uma troca de síntese de glicogênio para síntese de lipídeos, sendo possível
a estes insetos acumularem mais lipídeos que glicogênio (VAN HANDEL, 1984). A
síntese de lipídeos é controlada pelo sistema neurossecretório destes insetos (VAN
HANDEL, 1984). Da mesma forma, a D. saccharalis, que se alimenta exclusivamente
de cana de açúcar apresenta a mesma proteína majoritária com características
semelhantes àquelas descritas para outras espécies.
O conteúdo lipídico diferenciado de uma lipoproteína permite a separação desta
partícula quando submetida à ultracentrifugação em gradiente de KBr (CHINO et al
1981). Para purificar a lipoforina de D. saccharalis uma alíquota de sua hemolinfa foi
ultracentrifugada na ausência (figura 7A) ou presença de “Sudan Black” (figura 7A). Na
figura 7A observamos duas regiões distintas de intensa cor amarela, que foram
identificadas em A-I (região próxima ao topo do gradiente) e A-II (região próxima ao
fundo do gradiente). A cor amarela observada em A-I e A-II, provavelmente deriva de
carotenóides. Como descrito para M. sexta (VAN DER HORST et al, 1993) e B. mori
(TSUCHIDA, 1998) carotenóides estão associados a lipoforina, logo a próxima etapa é
identificar qual região contém a lipoforina de D.saccharalis.
Na figura 7B, observamos a marcação com “Sudam Black” em A-I e A-II. Esta
metodologia não discriminou as duas bandas protéicas, mostrando pouca eficiência na
identificação da lipoforina. Entretanto, é possível a existência de duas populações de
lipoforina na hemolinfa de D. saccharalis.
A análise do perfil do gradiente por espectrofotometria confirma a presença das
regiões anteriormente citadas, onde observamos dois picos de absorbância distintos
denominados A-I (fração 9) e A-II (fração 15) para os comprimentos de onda 452 e 605
nm (Figura 8). Este perfil de absorção é semelhante ao encontrado em Bombyx mori,
cuja lipoforina apresenta carotenóides (TSUCHIDA, 1998), indicando a presença destes
também na lipoforina de D. saccharalis.
A lipoforina pode existir em várias formas com respeito a sua densidade: LDLp
[lipoforina de baixa densidade], HDLp [lipoforina de alta densidade], (BLACKLOCK e
RYAN, 1994; RYAN e VAN DER HORST, 2000) ou VHDLp [lipoforina de densidade
muito alta] (BEENAKKERS et al., 1988). Esta variação é atribuída às diferenças no
tamanho e no conteúdo de lipídeos da partícula. A figura 9, revela uma densidade de
1,122 g/mL para a fração A-I, sendo esta densidade semelhante à HDLp (BLACKLOCK
e RYAN, 1994; RYAN e VAN DER HORST, 2000) e àquela encontrada para lipoforinas
de Periplaneta americana (CHINO et al., 1981b ), Locusta migratória (CHINO &
KITASAWA., 1981c.) e Aedes aegypti (FORD & VAN HEUSDEN., 1994.). A fração A-II
apresentou uma densidade de 1,294 g/mL, compatível com a densidade descrita para
LTP – “Lipid Transfer Particle” em outros insetos (TSUCHIDA, 1997).
As frações do gradiente foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida
em condições não-desnaturantes (Figura 10) e desnaturantes/redutoras (Figura 11). As
figuras revelam um perfil protéico diferenciado para A-I e A-II. Um bom indicativo da
presença de lipoforina em A-I foi a observação de duas subunidades majoritárias,
associadas à proteína de baixa densidade encontrada nesta região (Figura 11). Como
descrito para outras espécies a lipoforina é constituída por duas apoproteínas, apoLp I,
apoLp II. (CHINO, et al. 1981a; CHINO e KITASAWA, 1981; WELLS et al., 1985).
Com um perfil eletroforético (SDS-PAGE) bastante diferente de A-I, a segunda
região amarela (A-II) revelou a presença de várias bandas proteicas (Figuras 10 e 11).
Estas podem ser subunidades de uma lipoproteína de alta densidade contendo
carotenóides associados, ou várias proteínas com essa mesma característica. Nesta
região observamos a existência de uma elevada concentração de proteínas com faixa
de peso molecular muito próxima aquela encontrada para a arilforina. Arilforina são
proteínas sintetizadas no corpo gorduroso dos insetos e secretadas para hemolinfa.
Normalmente, encontrada na forma hexamérica com subunidades em torno de 80 kDa
que apresentam carotenóides em algumas espécies (RYAN, 1985; TELFER,1983). Tal
proteína tem a função de reserva de aminoácidos, os quais são necessários para o
desenvolvimento do inseto adulto (KANOST et al., 1990).
Para identificar qual das frações (AI ou AII) era aresponsável pelo transporte de
lipídeos, os animais foram alimentados com H3- palmitato. A hemolinfa-H3 foi coletada e
submetida a ultracentrifugação em gradiente isopícnico de KBr. A radiotividade
associada ao ácido graxo foi encontrada principalmente na fração AI, confirmando que
este deve ser o pico de lipoforina deste inseto (figura 12).
A presença de lipoforina em A-I foi confirmada por “dot blot”, que usou um
anticorpo policlonal primário anti-lipoforina obtida a partir da lipoproteína de R. prolixus.
A fração AI da hemolinfa de D. saccharalis mostrou uma boa reatividade ao anticorpo
de lipoforina de R.prolixus (Figura 13).
Assim como para outras espécies (CHINO, et al. 1981a; CHINO & KITASAWA,
1981; WELLS et al., 1985) a ultracentrifugação em gradiente de KBr provou ser um
método bastante eficiente no isolamento da lipoforina da hemolinfa de larvas de D.
saccharalis, sendo possível obtê-la homogênea em uma única etapa. Uma análise por
cromatografia de filtração em gel revelou a presença de um pequeno contaminate e/ou
degradação (Figura 14A) a qual não é observada em eletroforese não-desnaturante
(Figura 14B). É possível que o coquetel de inibidores de proteases utilizado no
processo de purificação da lipoforina não tenha sido suficiente para evitar a ação de
alguma classe de proteases.
A massa molecular da lipoforina em sua forma nativa, foi estimada em torno de
710 kDa, de acordo com o procedimento de eletroforese em gel de poliacrilamida poro
limite (Figura 15). Assim como descrito para Locusta migratoria e Manduca sexta
(CHINO & KITASAWA, 1981; PATTNAIK et al., 1979), a lipoforina de D.saccharalis é
uma lipoproteína de alto peso molecular.
A análise de A-I em SDS-PAGE revelou duas subunidades de lipoforina. Essas
apolipoproteínas apresentaram massa molecular de 250, 90 kDa (Figura 16). Em R.
prolixus, a lipoforina é constituída de três apoproteínas, apoLp I, II, III, as quais
apresentam massa molecular de 226, 86, 16, kDa respectivamente (GONDIM et al.
1989). O papel da apoLp III não é totalmente conhecido, porém, a presença desta
apolipoproteína é relatada apenas para insetos adultos, onde elas parecem atuar
durante o vôo, provavelmente na estabilização da partícula (KAWOOYA et al., 1984;
WELLS et al., 1985; HAUNERLAND & BOWERS, 1986). No caso de D. saccharalis não
foi possível detectar a presença da terceira subunidade, a apoLp III, pois em nossos
experimentos foram utilizados apenas insetos na idade de larva. Ainda analisando as
amostras por SDS-PAGE, observamos com freqüência a presença de uma banda
próxima a 50 kDa, tanto para a lipoforina de D. saccharalis quanto para a lipoforina de
R. prolixus (dado não mostrado). Esta banda provavelmente corresponde a um produto
de degradação das partículas, visto que em R. prolixus não foi descrito a presença de
uma apoLp com esta massa molecular(GONDIN et al., 1989).
Em geral, a lipoforina apresenta 30 - 50% de seu peso de lipídios e apenas uma
pequena quantidade de açúcar. Para a lipoforina de R. prolixus, por exemplo, 51.7% de
sua massa são proteínas, 47.6% são lipídios e apenas 0.7% açúcares (GONDIM et al.
1989). A lipoforina purificada de larvas de D. saccharalis apresentou composição de
proteínas correspondendo a 46% da massa total da partícula, enquanto a fração de
lipídios corresponde a 49%, dados estes muito similares aos descritos para outras
espécies de insetos. Por outro lado a lipoforina de D. saccharalis apresenta um elevado
conteúdo de açúcar (5%) em relação às outras espécies.
Como mencionado anteriormente, a lipoforina é um excelente veículo de
transporte das seguintes moléculas: diacilglicerol (CHINO et al., 1969; CHINO &
KITASAWA, 1981), fosfolipídeos, colesterol, hidrocarbonetos e ácidos graxos livres
(CHINO et al., 1969; CHINO & GILBERT, 1971; GONDIM et al., 1989; SOULAGES &
WELLS, 1994; ATELLA et al., 2000). A composição de fosfolipídios e lipídios neutros da
lipoforina de D. saccharalis foi revelada por cromatografia em camada fina (TLC). Os
fosfolipídios foram identificados por TLC (uni e bidimensional). Por esta metodologia foi
possível detectar a presença de fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina,
fosfatidilinositol, lisofofatidilcolina e esfingomielina (Figura 17).
A TLC unidimensional para identificar lipídios neutros revelou a presença de
colesterol esterificado, triacilglicerol, 1,3 – Diacilglicerol e 1,2 – Diacilglicerol. A
composição lipídica (Figura 18), apresentada pelas TLCs, deixou bem claro que a
lipoforina de D.saccharalis é constituída pelas mesmas classes de lipídios que as
lipoforinas de outras ordens de insetos (CHINO et al, 1981).
Nos insetos os lipídeos assimilados da dieta pelo intestino são transportados
para outros tecidos através da lipoforina presente na hemolinfa (CANAVOSO et al.,
2001). A digestão de lipídeos provenientes da dieta ocorre no intestino médio, onde o
triacilglicerol (TAG), principal componente lipídico da dieta, é hidrolisado em ácidos
graxos livres e monoacilglicerol pela ação da TAG lipase (WEINTRAB & TIETZ, 1973;
WEINTRAB & TIETZ, 1978; TSUCHIDA & WELLS, 1988; HOFFMAN & DOWNER,
1979; ARRESE & WELLS., 1997; ARRESE et al., 2001). Os ácidos graxos e
monoacilgliceróis são absorvidos pelos enterócitos e convertidos em DAG, TAG e
fosfolipídeos. O DAG pode ser convertido em TAG, o que serve como reserva de ácidos
graxos ou o DAG pode ser secretado para hemolinfa associado a lipoforina
(CANAVOSO & WELLS, 2000). Em nossos experimentos constatamos que a maior
parte da radioatividade presente na hemolinfa de laravas de D. saccharalis estava na
forma de DAG – H3 (Figura 19) associado a lipoforina (Figura 18). Sendo assim, foi
possível usar o DAG – H3 como um marcador para lipoforina.
Na figura 20, usando hemolinfa e corpo gorduroso de insetos não alimentados
com palmitato-H3 encontramos uma quantidade significativa de lipídeos circulando na
hemolinfa de larvas de broca da cana-de-açúcar quando comparada àquela encontrada
no corpo gorduroso. Essa quantidade de lipídeos encontrados na hemolinfa destes
insetos deve-se ao fato deles alimentarem-se continuamente (HOLLOWAY et al. 1928).
Para avaliar a capacidade de transporte de lipídeos pela lipoforina, larvas de
D.saccharalis foram alimentadas com 3H-palmitato. Seis horas após a alimentação
constatamos um pico de radioatividade na hemolinfa (Figura 21). A radioatividade
absorvida pelo intestino destes insetos é rapidamente liberada para hemolinfa, na forma
de DAG – H3 associado a lipoforina (Figura 22). Sendo assim, fica constatada a função
de transporte de lipídeos da lipoproteína purificada da hemolinfa de D. saccharalis.
No intestino dos insetos, os ácidos graxos e monoacilgliceróis são absorvidos
pelos enterócitos e convertidos em DAG, TAG e fosfolipídeos. O DAG pode ser
convertido em TAG (reserva de ácidos graxos) ou o DAG pode ser secretado para
hemolinfa via lipoforina (CANAVOSO & WELLS, 2000; CANAVOSO et al., 2001). A
figuras 22 mostra que a radioatividade do H3-palmitato ingerido pelas larvas de
D.saccharalis pode ser encontrada principalmente na forma de DAG, confirmando a
presença de lipoforina na hemolinfa destes insetos.
Nas figuras 21 e 22, no tempo de 24 horas após a alimentação com 3H-palmitato
observamos um substancial queda da radioatividade na hemolinfa. Como mencionado
na introdução, a lipoforina abastece com lipídeos no intestino, percorre a hemolinfa até
atingir o corpo gorduroso onde os componentes lipídicos são armazenados (Figura 4)
(CANAVOSO et al., 2001). O acúmulo de radioatividade no corpo gorduroso de larvas
da D. saccharalis foi acompanhado e pode ser observado na figura 23. A observação
das figuras 21 e 23 deixa evidente que a radioatividade ingerida pelas larvas e
detectada na hemolinfa está sendo armazenada no corpo gorduroso destes insetos.
Em lepidópteras, a maior parte da energia que será usada para a manutenção da
vida e reprodução no estágio adulto, é acumulada durante a fase larval, já que estes
animais não se alimentam quando adultos. Em comparação com as larvas, observamos
que fêmeas adultas de D.saccharalis apresentam uma quantidade bastante reduzida de
corpo gorduroso e hemolinfa. Porém, a maior parte da cavidade abdominal do inseto é
ocupada pelos ovários. Durante esse processo de crescimento dos ovos, os lipídeos
são fornecidos pela lipoforina a partir de lipídeos estocados no corpo gorduroso na fase
larval. Isso pode ser confirmado pela observação da transferência da radioatividade
associada a DAG e fornecida aos animais ainda como larvas, para o ovário de fêmeas
adultas (Figura 24). Esse resultado mostra o papel do corpo gorduroso como tecido de
estoque de lipídeos e a ação da lipoforina como distribuidora do estoque nos momentos
de baixa disponibilidade via alimentação.
6 – Conclusões
• A ultracentrifugação em gradiente isopícnico de KBr foi eficiente para isolar a
lipoforina de larvas D.saccharalis;
• A lipoforina de D.saccharalis apresentou uma densidade igual a 1,122 g/mL e
massa molecular de 710 kDa.
• Foram identificadas duas subunidades para alipoforina; apolipoforinas, apoLp I e
apoLp II, com massas moleculares de 250 kDa e 90 kDa, respectivamente;
• A massa de proteínas corresponde a 46% da partícula. Os lipídeos somam 49%
da massa total e os carboidratos correspondem a 5% da massa de proteína.
• Os fosfolipídeos identificados na lipoforina de D.saccharalis foram:
fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol,
lisofosfatidilcolina e esfingomielina;
• Os lipídeos neutros: colesterol esterificado, triacilglicerol, 1,3 – Diacilglicerol e 1,2
– Diacilglicerol;
• Foi encontrada a quantidade de 25 µg/larva de lipídeo para a hemolinfa de D.
saccharalis e 75 µg/ larva de lipídeo para o Corpo gorduroso;
• Nas primeiras seis horas após a alimentação de larvas com 3H-palmitato, os
lipídeos atingem a hemolinfa de D. saccharalis, principalmente na forma de DAG;
• Os lipídeos transportados pela lipoforina de D. saccharalis são acumulados no
corpo gorduroso e, provavelmente, serão utilizados na fase adulta do inseto nos
processos de ovogênese.
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