DISCIPLINA: ANLISE BACTERIOLGICA DA GUA PROFESSORA MARIA DAS
DORES COSTA DUARTE
RELATRIO DE AULA: QUANTIFICAO DE BACTRIAS HETEROTRFICAS
MESFILAS; ISOLAMENTO DE BACTRIAS (TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS);
MTODO DE GRAM.
Drio Macedo Lima e Jos Eduardo da Silva Castro Curso Tcnico
Integrado em Controle Ambiental 3ano
Joo Pessoa Novembro de 2011
Autores: Drio Macedo Lima e Jos Eduardo da Silva Castro
RELATRIO DE AULA: QUANTIFICAO DE BACTRIAS HETEROTRFICAS
MESFILAS; ISOLAMENTO DE BACTRIAS (TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS);
MTODO DE GRAM.
Relatrio de aula destinado disciplina de Anlise Bacteriolgica da
gua, ministrada pela Professora Maria das Dores Costa Duarte.
Joo Pessoa Novembro de 20112
SUMRIO1.
INTRODUO______________________________________________________4 2.
OBJETIVOS_________________________________________________________6
2.1. Quantificao de bactrias heterotrficas
mesfilas___________________6 2.2. Isolamento de bactrias (tcnica de
semeadura por estrias)_____________6 2.3. Mtodo de
Gram______________________________________________6 3.
METODOLOGIA____________________________________________________7
3.1. Quantificao de bactrias heterotrficas
mesfilas___________________7 3.1.1. Preparao da amostra e
diluies_____________7 3.1.1.1. Material_________________7 3.1.1.2.
Procedimento____________7 3.1.2. Preparao do gar Padro para
Contagem
(PCA)________________________________________________________________8
3.1.2.1. Material_________________8 3.1.2.2.
Procedimento____________9 3.1.3. Plaqueamento em
profundidade_______________9 3.1.3.1 Material_________________9
3.1.3.2 Procedimento_____________9 3.1.4. Plaqueamento em
superfcie_________________10 3.1.4.1. Material________________10
3.1.4.2. Procedimento___________10 3.1.5 Contagem das colnias e
clculo dos resultados _11 3.2. Isolamento de bactrias (tcnica de
semeadura por estrias)____________14 3.2.1.
Material_________________________________14 3.2.2.
Procedimento_____________________________14 3.3. Mtodo de
Gram_____________________________________________16 3.2.1
Material__________________________________16 3.2.2.
Procedimento_____________________________16 4. CONSIDERAES
FINAIS___________________________________________17 5.
REFERNCIAS_____________________________________________________18
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1. INTRODUOA importncia de se conhecer a composio microbiolgica
da gua nos dias atuais indiscutvel, uma vez, que vivenciamos uma
realidade na qual grande parte dos recursos hdricos existentes so
atingidos pela ao antrpica inconseqente. De acordo com a OMS
(Organizao Mundial da Sade), em todo o mundo, as doenas
transmitidas pela gua esto entre as principais causas de bito de
crianas com idade abaixo de 5 anos e, a cada ano, mais pessoas
morrem em conseqncia da gua insegura que por todas as formas de
violncia, incluindo as guerras. A qualidade da gua est intimamente
relacionada com a sade humana, animal e de ecossistemas. Neste
contexto, surge a necessidade de se realizar anlises que possam
averiguar a potabilidade dos ecossistemas de gua doce para
potencializar aes de proteo sade humana e de preservao do meio
ambiente. Nessa avaliao da qualidade microbiolgica da gua so
usualmente empregadas as bactrias do grupo coliforme, que se for
encontrada na gua pode evidenciar o risco da presena de organismos
patognicos. Mas alm desse aspecto, outras anlises, como a contagem
de bactrias heterotrficas mesfilas tambm se fazem necessrias.
Compreende-se como heterotrficas as bactrias que requerem um ou
mais compostos orgnicos, sem ser o dixido de carbono (CO2), para a
sntese de seu protoplasto. A maioria das bactrias, incluindo muitas
das bactrias associadas a sistemas de gua potvel, so heterotrficas.
Quantificar a presena dessas bactrias na gua importante quando se
quer manter o controle sob a populao bacteriana geral, uma vez que
densidades muito elevadas de microorganismos na gua podem provocar
a perda da sua qualidade, com desenvolvimento de odores e sabores
desagradveis e produo de limo ou pelcula. Alm disso, a elevada
concentrao desses organismos na gua pode representar um risco sade
humana, pois embora a maioria das bactrias da flora normal da gua
no seja patognica, algumas delas podem atuar como patgenos
oportunistas. Nesse sentido, bactrias patognicas oportunistas como
a Pseudomonas e a Elavobacterium, quando presentes em elevado grau
na gua potvel podem constituir um risco sade de pacientes
debilitados em hospitais, creches, berrios, casas de repouso, etc.
O nmero elevado de bactrias heterotrficas mesfilas tambm pode
inibir a presena de coliformes, impedindo a deteco dos mesmos,
conseqncia da produo de fatores de inibio ou de um desenvolvimento
mais intenso sobrepujando uma menor populao de coliformes. A
portaria 518 do Ministrio da Sade determina que densidades de
bactrias heterotrficas no podem estar acima de 500 UFC/ml pela
possibilidade de provocarem interferncia na deteco de coliformes.
De acordo com o livro Comentrios sobre a portaria MS N. 518/2004 a
contagem de bactrias heterotrficas presta-se, portanto, a um certo
controle de qualidade dos resultados de coliformes e cumpre ainda
um papel auxiliar de indicador da estabilidade do sistema de
distribuio. As elevaes bruscas ou acima do usual na densidade de
bactrias heterotrficas devem ser interpretadas como suspeita da
ocorrncia de anomalias. Em termos de aplicao, a determinao da
densidade de bactrias heterotrficas em guas um importante
instrumento auxiliar no controle bacteriolgico para: avaliao das
condies higinicas e de proteo de poos, fontes, reservatrios,
piscinas e sistemas de distribuio de gua para o consumo humano;
avaliao da eficincia na remoo de bactrias das diversas etapas de
operao de estaes de tratamento de gua; estimativa da biomassa de
bactrias heterotrficas presentes em
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corpos de gua; e avaliao das condies higinicas e da eficincia de
operaes de piscinas. Na identificao da composio microbiolgica da
gua tambm valido realizar o mtodo de Gram. O teste baseado na
colorao de bactrias foi desenvolvido em 1884 pelo mdico dinamarqus
Hans Christian Gram. O mtodo de Gram permite dividir as bactrias em
duas classes: Gramnegativas e Gram-positivas. Essa diferenciao fez
do mtodo uma referncia quanto ferramenta na classificao e estudo de
bactrias. A classificao da bactria nesse teste depender da parede
celular do organismo. Se for estruturalmente simples a colorao ser
positiva, se for estruturalmente complexa a colorao ser ento
negativa. A reao das bactrias tcnica de Gram expressa diferentes
caractersticas, de modo especial no que diz respeito composio
qumica, estrutura, permeabilidade da parede celular, fisiologia,
metabolismo e patogenicidade. Os organismos gramnegativos, por
exemplo, so constitudos por uma endotoxina denominada LPS
(lipopolissacardeo), que causadora da patogenicidade. A colorao de
Gram , portanto, uma etapa de confirmao, que tem por objeto
confirmar as caractersticas morfolgicas das bactrias. Entre as
bactrias gram-negativas esto: Escherichia coli, Salmonella,
Shigella, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter,
Stenotrophomonas, Bdellovibrio e Legionella. So bactrias
gram-positivas: bactrias do filo firmicutes (Bacilos,
Estreptococos, Estafilococos, Enterococos, Actinobacteria,
Listeria). A execuo do mtodo de Gram e de qualquer outro processo
de caracterizao e estudo de bactria exige que estes organismos
estejam disponveis como uma cultura pura isolada. O termo cultura
pura quer dizer que todas as clulas da cultura tm uma origem comum,
isto , so descendentes da mesma clula. A tcnica aplicada na obteno
dessas colnias isoladas a de semeadura por estrias, tambm chamada
de esgotamento de ala, esgotamento em estrias, estrias mltiplas ou
ainda estrias de esgotamento. Mas existem outras tcnicas que fazem
esse isolamento. Neste relatrio descreveremos alguns mtodos de
anlise bacteriolgica da gua, como a contagem de bactrias
heterotrficas, o mtodo de Gram e a tcnica de isolamento de
bactrias.
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2. OBJETIVOS 2.1. Quantificao de Bactrias Heterotrficas
MesfilasO mtodo tem como objetivo quantificar a presena de bactrias
heterotrficas (genericamente definidas como microorganismos que
requerem carbono orgnico como fonte de nutrientes), fornecendo
informaes sobre a qualidade bacteriolgica da gua de uma forma
ampla. O teste inclui a deteco, inespecfica, de bactrias ou esporos
de bactrias, sejam de origem fecal, componentes da flora natural da
gua ou resultantes da formao de biofilmes no sistema de distribuio,
sendo que algumas podem ser patognicas oportunistas. (COMENTRIOS
PORT. 518, 2004)
2.2. Isolamento de Bactrias (Tcnica de Semeadura por Estrias)O
mtodo tem como objetivo a obteno de colnias isoladas, adquirindo
culturas puras. A disponibilidade dessas culturas puras um
pr-requisito para a caracterizao de uma espcie microbiana no
laboratrio de microbiologia. As colnias obtidas so usadas, por
exemplo, para determinao do gram da bactria por meio do mtodo de
Gram.
2.3. Mtodo de GramO mtodo tem como objetivo classificar as
bactrias como Gram-negativas ou Gram-positivas a partir de
processos de colorao conhecidos como colorao de Gram. Esta
categorizao permite distinguir os mais variados tipos de bactrias e
que tipo de parede celular elas tem (se mais simples ou mais
complexas, com mais ou menos peptideoglicanos principal componente
da parede celular bacteriana).
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3. METODOLOGIA 3.1. Quantificao de Bactrias Heterotrficas
MesfilasA contagem pode ser feita utilizando-se os mtodos de
plaqueamento em profundidade (pour plate), superfcie (spread plate)
e filtrao em membrana. Este ltimo no foi executado durante as aulas
prticas, por isso, este relatrio descrever apenas os dois
primeiros.
3.1.1. Preparao da amostra e diluiesA amostra pode ser inoculada
pura ou diluda. A amostra diluda quando se subtende que gua est
contaminada, uma vez que o resultado de UFC (Unidades Formadoras de
Colnias) deve estar entre 25 e 250 colnias. A gua Peptonada 0,1%
(H2Op) o diluente que se costuma usar em anlise de bactrias
heterotrficas em gua e sua preparao, juntamente com o processo de
diluio, esto descritos a seguir. A Soluo de Estoque A e Soluo de
Estoque B tambm podem ser usadas como diluentes nessa
metodologia.
3.1.1.1. Materialy y y y y y y y y y y y Peptona. Balana
Digital. Vidro de Relgio. Esptula. Becker. Basto de vidro. gua
destilada. Proveta. Frascos de diluio. Autoclave. Pipetas de 10 ml
esterilizadas. Bico de Bunsen.
3.1.1.2. ProcedimentoDiluir 1 g de Peptona em 1000 ml de gua
destilada. Se desejar um volume menor de H2 Op , proporcional ao
que vai ser utilizado, necessita-se, portanto, de efetuar uma regra
de trs relacionando a quantidade que vai ser usada proporo dada.
Somase o volume gasto de H2 Op nas trs diluies (90 ml em cada
frasco) e preparamos a soluo baseados naquele nmero: Exemplo: 3
frascos x 90 ml de soluo = 270 ml As solues de diluio so preparadas
em quantidade um pouco acima do necessrio por medida de precauo a
eventuais desperdcios.7
A partir da calcula-se a massa de Peptona a ser utilizada em uma
soluo de 300 ml de gua Peptonada como no exemplo a seguir. A
proporo de Peptona a ser usada geralmente dada na embalagem do
produto. 1g ________________1000 ml X ________________300 ml X =
0,3 g de Peptona Aps a pesagem, diluio da Peptona em gua destilada
e distribuio dos 90 ml de gua Peptonada em cada frasco de diluio,
autoclava-se os mesmos durante 15 minutos a 121 C. Aps
esterilizados, um dos frascos deve receber, com o auxlio de uma
pipeta estreo, 10 ml da amostra a ser analisada, ele ser etiquetado
como frasco de diluio 10-1. Em seguida, deve-se homogeneizar a
diluio. Com outra pipeta estrea, deve-se passar, novamente, 10 ml
da amostra j diluda em 10-1 para outro frasco, que ser rotulado
como de diluio 10-2. Homogeneizar a diluio. Para diluir novamente
seguese o mesmo processo. Vale lembrar que a diluio da amostra deve
ser realizada com os cuidados e tcnicas que j so de praxe: y
Bancada sanitizada; y Utilizao de luvas, mscara e toca; y Bico de
Bunsen ligado e o mais prximo possvel de onde est se realizando a
tcnica. Nota: Na preparao da gua Peptonada, seguir sempre as
instrues do fabricante, que vem estampada no rtulo do frasco.
3.1.2. Preparao do gar Padro para Contagem (PCA) o meio de
cultura onde a amostra ser inoculada. gar R2A ou NWRI tambm so
meios de cultura usados em contagem de bactrias heterotrficas em
gua.
3.1.2.1. Materialy y y y y y y y y y y y8
gar Padro para Contagem ou Plate Count Agar desidratado. Balana
Digital. Vidro de Relgio. Esptula. Becker. Basto de vidro. gua
destilada. Proveta. Balo de fundo chato ou tubos de ensaio com
tampas rosqueveis. Algodo. Papel de Alumnio. Autoclave.
3.1.2.2. ProcedimentoPesar 20,5 gramas do meio de cultura
desidratado e dissolver em 1000 ml de gua destilada fria. Se
desejado a obteno de um volume menor de PCA, realizar uma regra de
trs tomando como base a proporo dada. Aps a diluio preciso deixar a
soluo em repouso durante 5 minutos. Em seguida, deve-se aquec-la,
agitando freqentemente com basto de vidro, at completa dissoluo do
meio (durante o aquecimento no deixar entrar em ebulio). Se
necessrio, ajustar o pH para 7,0 com Hidrxido de Sdio soluo normal
(NaOH 1N). Por fim distribuir o PCA em tubos de ensaio com tampa
rosquevel (12 ml em cada tubo) ou transferi-lo para um balo de
fundo chato tampado com algodo e papel alumnio. A esterilizao deve
ser feita a 121 C (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave durante 15
minutos. Notas: 1. Este meio, depois de frio, se solidifica. Fundir
em banho-maria antes de us-lo. 2. Devido variedade de meios de
cultura existentes no mercado, seguir sempre as instrues do
fabricante, que vem estampada no rtulo do frasco.
3.1.3. Plaqueamento em profundidadeA tcnica consiste em pipetar
primeiro a amostra na placa de Petri e em seguida adicionar o meio
de cultura fundido. Apresenta desvantagens porque o meio de cultura
previamente fundido e a uma temperatura de 44C a 46C pode causar
choque trmico nas bactrias debilitadas, e o meio de cultura
nutricionalmente rico pode afetar a recuperao dessas bactrias.
3.1.3.1. Materialy y y y y y Placas de Petri estreis. Pipetas de
1 ml e 15 ml estreis. Bico de Bunsen. PCA. Estufa Bacteriolgica.
Lupa e contador de clonias
3.1.3.2. ProcedimentoSelecionar trs diluies adequadas da amostra
e inolucar 1ml de cada diluio em placas de Petri separadas, estreis
e vazias. Em seguida, adiciona-se o meio de cultura. O mtodo
consiste em entreabir a placa e adicionar de 12 a 15 ml de PCA,
previamente fundido e resfriado a 44-46C. Misturar o inculo com o
meio de cultura movimentando suavemente as placas, numa superfcie
plana, em movimentos circulares moderados em forma de oito (8), em
torno de dez vezes consecutivas. Quando o meio de cultura se
solidificar, incubar a placa em posio invertida a 35 0,5 C durante
48 3 horas.9
A inoculao deve ser executada com os cuidados e tcnicas que j so
de praxe: y Bancada sanitizada; y Utilizao de luvas, mscara e toca;
y Bico de Bunsen ligado e o mais prximo possvel de onde est se
realizando a tcnica.
3.1.4. Plaqueamento em superfcieA tcnica consiste em inocular
primeiramente o meio de cultura e depois adicionar a amostra de gua
na superfcie do PCA j slido. Nesse mtodo o choque trmico da tcnica
do pour plate eliminado e, adicionalmente, todas as colnias se
desenvolvem na superfcie do meio de cultura, o que facilita a
visualizao e contagem, alm de permitir a pronta distino entre as
mesmas partculas ou bolhas de ar. A tcnica se limita ao fato de o
volume da amostra utilizada ser pequeno (no mximo de 0,5 ml).
3.1.4.1. Materialy y y y y y y Placas de Petri estreis. Pipetas
de 0,1 ml e 15 ml estreis. Bico de Bunsen. PCA. Ala Drigalski.
Estufa Bacteriolgica. Lupa e contador de colnias.
3.1.4.2. ProcedimentoPreparar previamente placas de PCA,
distribuindo de 12 a 15 ml do meio em cada placa de Petri. Aguardar
o meio de cultura se solidificar. Selecionar trs diluies adequadas
da amostra e inocular 0,1 ml de cada diluio na superfcie do PCA.
Usando uma ala de Drigalski, espalhar o inculo por toda a superfcie
do meio, at que o excesso de lquido seja absorvido. Se o nvel de
contaminao esperado da amostra for baixo, inocular um volume maior
(1 ml) da primeira diluio, distribuindo esse volume por quatro
placas (trs placas com 0,3 ml e uma placa com 0,1 ml). Aguardar que
as placas sequem (mnimo 15min), inverter e incubar a 35 0,5 C
durante 48 3 horas. A inoculao deve ser executada com os cuidados e
tcnicas que j so de praxe: y Bancada sanitizada; y Utilizao de
luvas, mscara e toca; y Bico de Bunsen ligado e o mais prximo
possvel de onde est se realizando a tcnica.10
3.1.5. Contagem das colnias e clculo dos resultadosNo final do
perodo de incubao devem-se selecionar as placas com 25 a 250
colnias e contar as colnias com o auxlio de uma lupa, em um
contador de colnias. Calcular o nmero de unidades formadoras de
colnia (UFC) por grama ou mililitro da amostra multiplicando o
nmero de colnias pelo inverso da diluio inoculada. Exemplo: N
placas/ diluio 1 10-1 INC 10-2 230 10-3 21 Contagem (UFC/ml ou g)
230 = 2,3 x 104 10-2
Usar notao exponencial e apenas uma casa decimal depois da
vrgula, na apresentao de todos os resultados. Caso tenham sido
utilizadas mais de uma placa por diluio (duplicata ou triplicata),
considerar como nmero de colnias a mdia aritmtica da contagem
obtida em cada uma das placas da duplicata ou triplicata. Exemplo:
N placas/ diluio 2 10-1 INC INC 10-2 230 250 10-3 21 23 Contagem
(UFC/ml ou g) 230 + 250 = 2,4 x 104 2 x 10-2
O mtodo de contagem vlido tanto para o plaqueamento em
profundidade quanto para o plaqueamento em superfcie, porm, preciso
multiplicar o resultado do spread plate por dez, para levar em
conta o volume dez vezes menor inoculado. Exemplo: N placas/ diluio
1 10-1 INC 10-2 25 10-3 14 Contagem (UFC/ml ou g) 25 = 25 x 102 x
10 = 2,5 x 104 10-2
Se foi feita a distribuio de 1 ml da primeira diluio em quatro
placas, o nmero de colnias dessa diluio a soma das quatro placas.
Se o clculo do resultado for feito com a contagem dessa diluio,
ento no necessrio multiplicar por dez. Se todas as placas
apresentarem mais de 250 colnias o tcnico nunca dever apresentar o
resultado como incontvel, pois h trs alternativas para estimar o
nmero de UFC/ml ou g. 1) Se for possvel contar todas as colnias da
placa, deve-se contar, calcular o nmero de UFC a partir da contagem
obtida e apresentar o resultado como contagem estimada.
Exemplo:
11
N placas/ diluio 1
10-1 INC
10-2 INC
10-3 370
Contagem (UFC/ml ou g) 370= 3,7 x 105 (est) 10-3
2) Se no for possvel contar todas as colnias da placa, mas o
nmero de colnias/cm2 estiver abaixo de 10, contar as colnias e, 12
quadrados de 1cm2, 6 quadrados consecutivos na vertical e 6
consecutivos na horizontal, utilizando os quadrados demarcados no
contador de colnias. Calcular o nmero mdio de colnias/cm e, a
partir da mdia/cm, determinar o nmero total de colnias na placa
(65cm2, no caso das placas de dimetro externo 100mm). Utilizar esse
nmero total de colnias para calcular o nmero de UFC que deve ser
apresentado como contagem estimada. Exemplo: N placas/ diluio 1
10-1 INC 10-2 INC 10-3 8/cm Contagem (UFC/ml ou g) 8 x 65 = 5,2 x
105 (est) 10-3
3) Se o nmero de colnias/cm for maior que 10, contar as colnias
em 4 quadrados representativos da distribuio das colnias nas
placas, tirar a mdia, represent-la em colnias/cm e calcular o nmero
de UFC da mesma forma utilizada no caso de 12 quadrados,
multiplicando a mdia por 65cm. O resultado tambm deve ser expresso
como contagem estimada. Exemplo: N placas/ diluio 1 10-1 INC 10-2
INC 10-3 21/cm Contagem (UFC/ml ou g) 21 x 65 = 1,4 x 106(est)
10-3
4) Se o nmero de colnias/cm for maior que 100, apresentar o
resultado como maior que 6.500/diluio e como contagem estimada.
Exemplo: N placas/ diluio 1 10-1 INC 10-2 INC 10-3 >100/cm
Contagem (UFC/ml ou g) >6.500 ou > 6,5 x 106(est) 10-3
Quando nenhuma placa atinge 25 colnias, deve-se contar as
colnias nas placas com nmero mais prximo de 25, calcular o nmero de
UFC e apresentar o resultado como contagem estimada. Exemplo: N
placas/ diluio 1 10-1 13 10-2 2 10-3 0 Contagem (UFC/ml ou g) 13 =
1,3 x 102 (est) 10-1
12
Se no crescerem colnias em nenhuma placa o resultado deve se
apresentado como menor que 1/diluio e valor estimado. Exemplo: N
placas/ diluio 1 10-1 0 10-2 0 10-3 0 Contagem (UFC/ml ou g)
