Materiais e métodos

1- Obtenção da reta de calibração:

Materiais:

6 tubos de ensaio Solução padrão de glicose 0,01 M Água Reagente R (corrosivo) Banho Maria

Metodologia:

Primeiramente pipetou-se a solução de glicose para preparar os 6 tubos, cada um contendo uma quantidade diferente. No tubo branco não é adicionado a glicose, enquanto no primeiro, segundo, terceiro, quarto e quinto tubo são adicionados 0,2 mL, 0,4 mL, 0,6 mL, 0,8 mL e 1,0 mL, respectivamente.

Em seguida adicionou-se água, sendo a quantidade de 1,0 mL no tubo branco, 0,8 mL no primeiro tubo, 0,6 mL no segundo tubo, 0,4 mL no terceiro tubo, 0,2 mL no quarto tubo e no primeiro tubo não foi adicionado água.

O reagente R já preparado foi adicionado em seguida sendo 1,0 mL em cada tubo.Após a adição do reagente R, os tubos foram colocados em banho maria por 5 minutos. Em seguida, os tubos foram resfriados e completados com água destilada até a marca dos 10 mL.

Os resultados de absorbância foram analisados e anotados para calcular a velocidade inicial e obter a reta de calibração.

2- Análise da concentração de enzima:

Materiais:

5 tubos de ensaio Solução de sacarose (substrato) 0,3 M em tampão acetato 0,05 M, pH 4,7 Solução de invertase (enzima), em tampão acetato 0,05 M, pH 4,7 Tampão acetato 0,05 M, pH 4,7 Reagente R Banho maria

Metodologia:

Inicialmente foram preparados os 5 tubos com enzimas na seguinte quantidade:Tubo Branco: 0,0 mL, tubo 1: 0,2 mL, tubo 2: 0,3 mL, tubo 3: 0,4 mL, tubo 4: 0,5 mL.

A solução tampão foi adicionada em seguida, sendo 0,5 mL, 0,3 mL, 0,2 mL,0,1 mL, nos tubos branco, tubo 1, tubo 2 e tubo 3. O tubo 4 não recebeu adição de solução tampão.

Após a adição da solução tampão, foram adicionados 0,5 mL de substrato em cada tubo. Sendo que, a fim de analisar a formação de produto no espaço de tempo de 5 minutos, então o tubo branco foi o primeiro a ser colocado e, após 1 minuto, adicionou-se essa quantidade de substrato no tubo 1. Após mais 1 minuto, o substrato foi adicionado no tubo 2 e assim sucessivamente. Ao final, todos os tubos tiveram 5 minutos de reação e foram incubados por 5 minutos.

Em seguida o reagente R foi adicionado ( 0,1 mL por tubo) e os tubos foram colocados em banho maria por 5 minutos e novamente foram completados com água destilada até atingir 10 mL por tubo.

Os resultados de absorbância obtidos foram analisados na plotagem do gráfico.

3- Velocidade enzimática versus temperatura:

Materiais:

5 tubos de ensaio Solução de sacarose (substrato) 0,3 M em tampão acetato 0,05 M, pH 4,7 Solução de invertase (enzima), em tampão acetato 0,05 M, pH 4,7 Tampão acetato 0,05 M, pH 4,7 Reagente R Banho maria

Metodologia:

Novamente foram utilizados 5 tubos, onde apenas um tubo (o branco) continha solução tampão, sendo uma quantidade de 0,5 mL.

Nos demais tubos ( 1, 2, 3 e 4) foi adicionado, em cada um, 0,5 mL de enzima. Enquanto que no tubo branco não foi adicionado a enzima.

Repetiu-se o procedimento anterior, onde a cada 1 minuto era adicionado 0,5 mL de substrato em cada tubo. Totalizando 5 minutos de reação em cada tubo.

Logo após a adição de cada substrato em cada tubo, o mesmo foi incubado por 5 minutos nas temperaturas determinadas. Sendo elas: ambiente para os tubos branco e tubo 2, 0o C para o tubo 1, 60oC e 96oC para os tubos 3 e 4, respectivamente.

A reação foi contida ao adicionar, passado os 5 minutos de incubação, 1 mL de reagente R em cada tubo. Após a adição, os tubos foram mantidos em banho maria por 5 minutos.

Em seguida, completou-se os tubos com água destilada até atingir 10 mL e os levou para análise de absorbância

4- Determinação de Velocidade máxima e Km da invertase:

Materiais:

10 tubos de ensaio Solução de sacarose (substrato) 0,3 M em tampão acetato 0,05 M, pH 4,7 Solução de invertase (enzima), em tampão acetato 0,05 M, pH 4,7 Tampão acetato 0,05 M, pH 4,7 Reagente R Banho maria

Metodologia:

Primeiramente os tubos foram numerados e 1,0 mL da enzima foi adicionada em 9 tubos, ficando apenas o tubo branco sem a adição da mesma. Em seguida a solução tampão foi adicionada nos tubos, com exceção do tubo branco e do tubo 9. A quantidade de solução tampão adicionada foi: 0,9 mL no tubo 1, 0,8 mL no tubo 2, 0,7 mL no tubo 3, 0,6 mL no tubo 4, 0,5 mL no tubo 5, 0,4 mL no tubo 6, 0,3 mL no tubo 7 e 0,2 mL no tubo 8.

Repetindo o processo anterior, o substrato foi adicionado em cada tubo a cada 1 minuto. Sendo 1,0 mL no tubo branco, 0,1 mL no tubo 1, 0,2 mL no tubo 2, 0,3 mL no tubo 3, 0,4 mL no tubo 4, 0,5 mL no tubo 5, 0,6 mL no tubo 6, 0,7 mL no tubo 7, 0,8 mL no tubo 8, 1,0 mL no tubo 9.

Ao final do procedimento, todos os tubos foram incubados por 5 minutos cada e em seguida adicionou-se 1,0 mL de reagente R em cada tubo. Após a adição do reagente, os tubos foram colocados em banho maria por mais 5 minutos. Decorridos os 5 minutos, água destilada foi adicionada em cada tubo, em uma quantidade suficiente para completar 10 mL.

Todos os valores obtidos a partir da medição de absorbância foram usados nos cálculos e plotagem dos gráficos.