Relatório de Bioquímica

Introdução

Este relatório conta com os dados a respeito das práticas realizadas na disciplina de

Bioquímica I.

Prática I

Filtração Molecular

Nesta prática foram demonstrados os princípios da cromatografia de filtração em gel aplicada

à separação de proteínas.

A cromatografia de filtração em gel separa as proteínas com base no seu tamanho. A

coluna é constituída por uma matriz de pequenas esferas porosas empacotadas.

Ao fazer passar a solução de proteínas pela matriz da coluna, as moléculas pequenas

entram nos poros das esferas demorando a atravessá-los, enquanto que as grandes passam

entre as esferas sendo separadas primeiramente.

Na nossa prática foi-se utilizado Albumina (66 KD) e Verde de Bromo cresol ( 300 D) o

VBC em pH 4 reage especificamente com a albumina, tendo a cor mais intensa quanto a

concentração da proteína.Foi observado a eluência numa coluna de S-dex G-25, que apresenta

poros pequenos para a passagem da molécula de Albumina pelo interior da coluna, de modo

que o esperado é a eluência rápida da proteína, passando pelas laterais da coluna, entre os

poros.

Foram feitas três soluções e cada grupo presente na prática ficou com uma delas.

Solução 1 – Verde de Bromo cresol

Solução 2 - Verde de Bromo cresol (em maior quantidade) + Albumina

Solução 3 - Verde de Bromo cresol + Albumina (em maior quantidade)

Nosso grupo ficou com a solução 3.

Aplicamos 0,5 mL de Albumina + Verde de Bromo cresol na coluna e eluimos com citrato de

sódio 0,1M pH4 . A seguir fomos coletando o material que eluia e, frações de 1mL cada, no

total de 6 frações.

As frações iniciais eram mais claras, pois a Albumina complexada com o Verde de

Bromo cresol ainda não tinha percorrido toda a coluna, à medida que coletávamos notou-se

que se tornavam mais coloridas, indicando a rápida eluência do complexo, que por ter grande

tamanho (e massa) eluiu pelas paredes da coluna.

As seguintes perguntas foram propostas no Roteiro de Prática:

1- Qual a importância do estudo da interação ligante-proteína ?

2- Qual a importância do estudo dos sítios de ligação da albumina ?

3- Como a filtração molecular pode ser empregada nesses estudos ?

4- Como a interação verde de bromocresol-albumina pode ser empregadana quantificação da albumina ?

5- Discorrer sobre 3 métodos empregados no estudo da interação ligante-macromolécula.

Respostas:

1- A importância do estudo se dá no fato de que proteínas são entre suas várias funções,

importantes transportadores de substâncias no organismo, como fármacos, que se ligam

aos seus sítios ativos específicos possibilitando a ação dos mesmos no corpo. Na prática

observamos a complexação do Verde de Bromo Cresol nos sítios da Albumina.

2- A albumina é uma das proteínas mais abundantes no plasma e líquido tecidual e

também a mais importante no que concerne a ligação a fármacos, pois se liga a uma

quantidade abundante deles, fazendo dela uma proteína de interesse especial já que é

amplamente utilizada e importante para a industria de medicamentos e pesquisas.

3- A filtração molecular pode ser utilizada num estágio inicial de visualização da

capacidade de complexação da proteína com o ligante que se pesquisa, pode ser utilizada

para a separação da albumina com componentes plasmáticos, levando-se em conta o

tamanho esperado das moléculas e assim, utilizando colunas cromatográficas especificas

até se obter a proteína.

4- Sabendo-se que o Verde de bromo cresol se complexa de forma eficiente com a

albumina, utiliza-se o complexo corado que exibe um espectro de absorção diferente do

corante no seu estado livre, permitindo assim a dosagem da Albumina.

5- A) Método de Biureto: Utilizando-se cobre em meio alcalino, este se complexa com

proteínas, formando um quadrado planar com a ligação peptídica que apresenta absorção

nas bandas de 270nm e 540 nm. O método é aplicado para determinar a concentração de

proteínas totais.

B) Método de Lowry: Usando-se o reagente de Folin-Ciocalteau na presença de

catalisador de Cobre II, há uma redução que produz composto com absorção máxima à

750nm, tendo sido melhorado por Sargent e passando a ter uma absorção ainda melhor à

690nm.

C) Método de Bradford: Método baseado na interação entre o corante BG-250 e

macromoléculas protéicas que contem aminoácidos de cadeias laterais básicas ou

aromáticas. No pH de ração o equilíbrio desloca o corante para a forma aniônica, que

absorve fortemente em 595nm. É um método rápido e sensível.

Prática II

Interação Proteína Ligantes e Aplicações

Nessa prática observou-se a complexação do Verde de Bromo cresol com a albumina

em diferentes concentrações, bem como seu espectro; O mesmo foi feito com a Gelatina.

Em posse de 8 tubos de ensaio ( 4 para cada proteína) adicionamos 0,5 mL de água em

todos eles, depois disso 0,5 mL de gelatina em um tubo e 0,5 de albumina em outro, obtendo-

se um total de 1 mL de cada; Foi então iniciado do processo : homogeneizava-se e depois

transferia-se 0,5 mL para o tubo seguinte, até obter nos tubos de cada proteína as diluições de

1/2, 1/4 ,1/8 e 1/16, sendo então as respectivas concentrações:

Adicionou-se então 0,5 mL de Verde de Bromo cresol em acetato de pH4. Escolhemos três

comprimentos a partir do gráfico que segue a baixo e foram feitas as medidas de

absorbâncias.

Escolhemos os comprimentos de 300nm, 450nm e 640nm, que nos pareciam os

maiores segundo o gráfico e, portanto de melhor absorbância.

Abaixo, têm-se os valores observados ao espectrofotômetro e gráfico dos dados

obtidos.

Tabela de Absorbância

Concentraçã

o

(proporção)

BSA

Absorbância

no

comprimento

de onda

300nm

BSA

Absorbância

no

comprimento

de onda

450nm

BSA

Absorbância

no

comprimento

de onda

640nm

Gelatina

Absorbância

no

comprimento

de onda

300nm

Gelatina

Absorbância

no

comprimento

de onda

450nm

Gelatina

Absorbância

no

comprimento

de onda

640nm

1/2 0,555 0,000 0,394 0,350 0,090 0,080

1/4 0,293 0,000 0,370 0,160 0,056 0,040

1/8 0,243 0,000 0,312 0,295 0,050 0,036

1/16 0,082 0,000 0,180 0,055 0,000 0,059

Concentração X Comprimento de Onda

0 1/10 1/ 5 3/10 2/ 5 1/ 2 3/ 5

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0,450

f(x) = 0,123x + 0,016R² = 0,938

f(x) = 0,101 ln(x) + 0,489R² = 0,891

Curva de calibração externa de BSA e gelatina em diferentes comprimentos de onda.

Absorbância X Concentração (proporcional à solução concentrada).

BSA 640nm

Regressão logarítmica de BSA 640nm

Gelatina 640nm

Regressão linear de Gelatina 640nm

Concentração (proporcional)

Abso

rbân

cia

Interpretação dos resultados

O gráfico de bromocresol ligado a albumina apresenta uma curva que mais seassemelha a uma curva logarítmica, porque pelo espectro é possível observar queexistem diferenças de absorbância entre o verde de bromocresol sozinho e eleligado a albumina, como a concentração de albumina vai diminuindo pelametade a cada diluição, porém e´adicionado a mesma quantidade de verde debromocresol em todas as diluições, já era de se esperar que a relações gráficasentre as diluições não fosse linear.

A gelatina não apresenta nenhum tipo de ligação com o verde de bromocresol,e isso justifica os gráficos entre as diluições, ele basicamente se comporta comouma adição de padrão, e as variações gráficas são em função apenas daconcentração da gelatina, porque foi adicionado a mesma quantidade debromocresol em todas as diluições.

Prática III

Nesta prática realizamos o método de quantificação da Albumina com Verde de

Bromo cresol e de Lowry com objetivo de comparação dos métodos. E também quantificação

de uma gelatina para observação das diferenças.

O método de ensaio da proteína de Lowry para a determinação da concentração da

proteína é um dos ensaios os mais veneravelmente e os mais amplamente utilizados da

proteína. O método de Lowry foi descrito primeiramente em 1951 por Lowry e outros (Lowry

e outros, 1951).

O método é baseado em ambos a reação do biureto, em que as ligações de peptídicas

das proteínas reagem com o cobre sob circunstâncias alcalinas para produzir Cu+, que reage

com

o reagente do Folin, e a reação do Folin-Ciocalteau, que é compreendida deficientemente mas

phosphomolybdotungstate são reduzidos essencialmente ao azul do heteropolymolybdenum

pela oxidação cobre-catalisada de ácidos aminados aromáticos. As reações conduzem a uma

cor azul forte, que dependa em parte do índice da tirosina e do triptofano. O método é pena

sensível a aproximadamente 0.01 magnésio de proteína/mL, e é usado melhor em soluções

com concentrações na escala 0.01-1.0 mg/mL da proteína.

Foram feitas diluições da albumina em 1/2, 1/4, 1/8 e 1/16 com grandes cuidados na

homogeneização e adicionados os corantes para quantificações pelos métodos de Lowry e

VBC, os valores obtidos de absorbância foram:

Concentração Absorbância de Albumina + Verde de

Bromo cresol

Absorbância da Albumina pelo

Método de Lowry0,877 0,432

0,819 0,320

0,721 0,182

0,629 0,151

0,438 0,114

0,451 0,037

Gráfico de interpretação dos resultados:

0 1/ 8 1/ 4 3/ 8 1/ 20,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

f(x) = 1,452x + 0,013R² = 0,990

f(x) = 0,132 ln(x) + 0,525R² = 0,987

Gráfico comparando curvas de calibração de BSA com o método de Lowry.Absorbância X Concentração (proporcional à solução concentrada).

BSARegressão logarítmica de BSAMétodo de LowryRegressão linear de Método de Lowry

Concentração (proporcional)

Abso

rbân

cia

Gelatina

Branco 0,455 0,076 1/32 0,471 0,224 1/16 0,513 0,238 1/ 8 0,604 0,363 1/ 4 0,692 0,507 1/ 2 0,778 0,648

Concentração ( Proporcional à concentração

original )

Absorbância Verde de

bromocresol 600nm

Absorbância método de Lowry

660 nm

0 1/16 1/ 8 3/16 1/ 4 5/16 3/ 8 7/16 1/ 20,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

f(x) = 0,92x + 0,14R² = 0,95

f(x) = 0,32x + 0,1R² = 0,96

f(x) = 0,11 ln(x) + 0,39R² = 0,99

Curva de calibração comparativa entre verde de bromocresol e método de Lowry para gelatina + AlbuminaAbsorbância X Fração da concentração original

Verde de bromocresol 600nmRegressão logarítmica de Verde de bromocresol 600nmAbsorbância do método de Low ry subtraído da absorbância do verde de Bromocresol ( A -bsorbância da gelatina isolada )Regressão linear de Absorbân -cia do método de Low ry subtra -ído da absorbância do verde de Bromocresol ( Absorbância da gelatina isolada )Método de Low ry 660nmRegressão linear de Método de Low ry 660nm

Concentração ( Fração da original )

Abso

rbân

cia

A partir dos dados coletados pôde-se concluir a respeito da análise da Albumina e da gelatina

com os métodos empregados:

Nessa prática foi possível visualizar um exemplo de diferença de métodos de

quantificação de proteínas, entre o método de Lowry e o uso de verde de bromo cresol. O

primeiro é um método mais sensível, porém ele não consegue distinguir a gelatina da

albumina, que o verde de bromo cresol consegue, por causa da ligação com os sítios da

albumina. A junção dos dois métodos possibilita saber a concentração isolada de cada um. A

partir das equações encontradas provenientes dos pontos se calcula a concentração de

misturas.

Resumo do Artigo “Structural Basis of The Drug-binding Specificity of Human Serum

Albumin”

O artigo discorre sobre o método de análise cristalográfica em Albumina humana

complexada com drogas e moléculas de pequenas toxinas. Com estudos que se baseiam nos

ligandos, para descobrir características da ligação entre albumina e fármacos, mostrando a

amplitude de moléculas que esta proteína é capaz de transportar e a importância do

detalhamento e precisão no trabalho com a mesma.

A Albumina é uma proteína em grande concentração no sangue, resultante do

metabolismo de alimentos protéicos no fígado, encontrada de forma abundante no plasma e

líquidos teciduais; ela se liga de forma notável a uma grande variedade de medicamentos,

restringindo assim a livre concentração de ativos. O maior problema relacionado à interação

Albumina-ligantes é a superação da afinidade de ligação dos compostos de chumbo para

HSA, representando grande desafio no desenvolvimento de drogas.

A albumina é um monômero contendo três domínios helicoidais homólogos (I, II e

III), cada um subdividido em subdomínios A e B.

A análise cristalográfica da proteína mostra que há dois sítios de ligação principais e

numerosos sítios de ligação secundários. Entre sua gama de ligantes endógenos encontram-se

ácidos graxos não esterificados, bilirrubina, hemina e tiroxina, sendo que os ligantes

relacionados a ácidos graxos são os ligantes primários da proteína, que são capazes de alterar

a polaridade dela e aumentar o volume do sítio de drogas 1. Estes resultados esclarecem a

interpretação dos dados acumulados sobre as drogas ligantes e fornecem um modelo útil para

os esforços de design modular de interações com HSA.

Um dos fatores mais importantes que afetam a distribuição, concentração ativa de

muitas drogas administradas é sua combinação com a albumina do soro humano;

Com a leitura do artigo achamos de grande importância ressaltas características sobre

o sítio 1, subdomínio II e sítio 2, subdomínio III de ligação.

A principal região de ligação está na região central do sitio 1 e parece possuir apnas

um subcompartimento que apenas é acessado por ligantes que induzem movimentos nas

cadeias laterais da proteina.

A entrada para o sitio 2 está “rodada” mais distante da entrada para o sitio de droga

( em comparação com o sitio I, dominio II), e deixa a entrada para este bolso de ligação mais

exposto a solvente; variações na estrutura da água podem ajudar fazendo com que o bloso de

ligação no sitio II seja mais adaptável.

As diferenças aumentam entre os sítios aumentam , embora os dois subdominios dos

sitios de ligação das drogas sejam subdominios estruturalemnte similares ,estes são embalados

em contexto diferente do restante da proteína.

A baixo seguem características gerais:

Características gerais do Sítio 1, subdomínio II:

É um bolso de ligação que está dentro do subdomínio II A.

Seletividade por fármacos lipofílicos com centro de carga negativa

Apresenta alterações conformacionais como resultado de ligação nas cadeias laterais

com ácidos graxos, como expansão do sítio.

Características gerais do Sítio 2, subdomínio III:

Sítio 2 é menos que o sítio 1.

Seletividade: Fármacos lipofílicos com carga negativa periférica.

Bolso de ligação se expande para acomodar fármaco; e apesar de ser um bolso de

ligação menor pode se ligar a duas moléculas de ácidos graxos de cadeia longa ou uma

de tiroxina.

De Forma Geral, ligantes com ácidos graxos são conhecidos (além de tudo citado no

artigo) com uma grande mudança conformacional na HSA, envolvendo rotações dos dominios

I e III relativos ao dominio II, o que sugere um possivel mecanismo de interação alostérica

ente locais de ligação de ácidos graxos.