Relatório - Validação de Métodos Analiticos (1)

Relatório

Determinação dos açúcares redutores de amostras de bebidas

alcoólicas por dois métodos distintos e determinação do teor

de polifenóis.

Validação de Métodos Analíticos

Índice

Resumo...........................................................................................................................2

Objetivo............................................................................................................................2

Introdução teórica............................................................................................................3

Material de laboratório.....................................................................................................3

Reagentes.......................................................................................................................2

Amostra...........................................................................................................................2

Protocolo experimental....................................................................................................3

Cálculos e sua discussão................................................................................................6

Discussões de resultados................................................................................................8

Conclusão......................................................................................................................10

Bibliografia.....................................................................................................................11

Anexos...........................................................................................................................12

2


Resumo

O projeto desenvolvido no âmbito das disciplinas de análises químicas 2 e 3, onde se

procedeu a execução de três protocolos, era obrigatório fazer pelo menos um desses

protocolos.

O grupo decidiu realizar todos os protocolos, mais concretamente, a determinação de

açúcares redutores pelo método Smogyi-Nelson e pelo método Lane-Eynon, onde nos

foi permitido ao grupo fazer comparação de métodos bem como comparação de

resultados. Realizou-se a determinação do teor polifenóis nas distintas amostras,

vinho do porto, vinho branco e moscatel.

Também foi realizada a determinação dos polifenóis, pelo método de Folin Ciocalteau,

no qual os resultados foram obtidos pela técnica de espectrofotometria. Os dados

foram tratados em Excel e os resultados foram satisfatórios.

No final, foi realizada e última técnica a determinação dos açúcares redutores pelo

método de Smogyi-Nelson por, espectrofotometria.

Objetivo

O objetivo deste protocolo experimental foi o de determinar o teor de polifenóis pelo

método Folin Ciocalteau e a concentração de açúcares redutores totais através da

espetrofotometria pelo método Somogyi – Nelson e também pelo método Lane –

Eynon.

Introdução teórica

3


Os compostos fenólicos revestem-se de grande importância em enologia uma vez que

estão relacionados, direta ou indiretamente com a qualidade dos vinhos. São eles os

responsáveis pela cor, corpo e adstringência dos vinhos e são os grandes

responsáveis pelas diferenças entre uvas ou vinhos tintos e brancos, pela presença ou

ausência de antocianinas.

Assim, os compostos fenólicos revestem-se de fundamental importância nas

características dos vinhos.

A determinação de açúcares pelo método de Somogyi-Nelson é baseada nas

propriedades redutoras dos açúcares, pela reação dahidroxila hemiacetálica dos

monossacarídeos.O princípio do método de Somogyi-Nelson baseia-se na redução de

Cu++ a Cu+ pelo açúcar redutor comformação Cu2O, que reduz o arsenomolibdato e

produz um composto de coloração azul. O método original foi modificado a partir de

alterações de vários métodos, inclusive o colorimétrico, em que o cobre é reduzido

formando compostos coloridos que podem ser quantificados por espectrofotometria.

Material de laboratório

Agitador- Nahita 690-2;

Balança analítica – SartØrius –

0,1mg;

Balão volumétrico (100 ± 0,1)

ml;

Balão volumétrico (1000 ±

0,8095) ml;

Balão volumétrico (50 ±

0,060)ml;

Banho termostático – Nahita;

Bureta (50 ± 0,05)ml;

Caixa de Petri;

Célula – 2;

Erlenmeyer 250 ml;

Espátula;

Espectrofotómetro – ZUZI

4110RS;

4


Estufa;

Frasco de âmbar;

Funil;

Gobelé 50 ml;

Papel de filtro;

Pastilha magnética;

Pipeta volumétrica (1 ±

0,007)ml;

Pipeta volumétrica (10 ±

0,05)ml;

Pompete;

Suporte para tubos de ensaio;

Suporte universal;

Tubos de ensaio-20;

Vareta de vidro;

Vidro de relógio;

Reagentes

Tabela nº1 – Reagentes Utilizados

ReagentesFórmula

química

Massa

molar

(g.mol-1)

Frases

de

risco

Frases de

SegurançaFabricante

Pureza

(%)

Ácido sulfúrico

H2SO3 98,08 35 26-30-45 Fluka 95-97

Carbonato de cálcio

CaCO3 100,09 - - Proanalysi

Carbonato de sódio

Na2CO3 105,99 36 22-26 Riedel-de-Haen ®

99,8

5


Folin Ciocalteau

- - - - - -

Glicose C6H12O6 180,16 - - Scharlau -

Hidróxido de sódio

NaOH 40,00 35 26-37/39-45 Merck 99

Molibdato de sódio

Na2MoO4.2H2 241,95 - - Riedel-de Haen

99,5

Silicato de sódio

- - - - José M.Vaz Pereira

-

Sulfato de cobre anidro

CuSO4 159,6022-

36/38-50/53

22-60-61 Panreac 99,0

Sulfato de sódio anidro

- - - - Laborspirit -

Tartarato de sódio e potássio

C

4H4KnaO6.4H2

O282,22 - - Riedel-de-

Haen99,5

6


Amostra

Amostra de um determinado vinho: Vinho branco, vinho do Porto e Moscatel.

Técnica de amostragem: Na determinação de polifenóis, pipetou-se cerca de 2ml da

amostra diluída (1:10), e na determinação de açúcares redutores, pipetou-se cerca de

10 ml da amostra para o balão volumétrico de 100 ml.

Local: Fundação Escola Profissional de Setúbal (Laboratório).

Temperatura : Temperatura ambiente (21ºC).

Protocolo experimental

I. Determinação de polifenóis pelo método Folin Ciocalteau

I.1. Num copo de precipitação, adicionaram – se 2 ml da amostra diluída(1 :10),

10 ml de reagente Folin Ciocalteau diluído (1:9),e 8ml de carbonato de

cálcio a 75 %.

I.2. Deixou-se em banho Maria a 50ºC, por 5 minutos.

I.3. Realizaram – se as leituras das tomas a 765 nm, em espectrofotometro

UV/VIS.

I.4. Realizou-se uma curva de padrão com a solução de ácido gálico com as

seguintes concentrações 50, 100, 150, 250 e 500 mg/L.

I.5. Calculou-se o teor de polifenóis expresso em mg em equivalência ao ácido

gálico (EAG)L.

II. Determinação de açúcares redutores e totais por

espetrofotometria Versão A

Preparo de soluções

7


II.1. Pesou-se 0,050g de glicose e dissolveu-se em 20 ml de água destilada sob

agitação constante.

II.2. Transferiu-se analiticamente para um balão volumétrico de 100ml,

completou-se o volume e homogeneizou-se a solução.

II.3. Reagente de Somogyi – Nelson I( SN-I) - Dissolveram-se 4g de sulfato de

cobre anidro, 24g de carbonato de sódio anidro, 16g de bicarbonato de

sódio, 12g de tartarato duplo de potássio e 18g de sulfato de sódio anidro e

completou-se o volume para 1 lito em balão volumétrico.

2.3.1 Filtrou-se com um papel de filtro e colocou-se em frasco escuro,

devidamente identificado.

II.4. Reagente de Somogyi – Nelson II (SN-II) – Solução A- Pesou-se cerca

de 50g de molibdato de sódio em 900ml de água destilada.

II.4.1. Adicionar cerca de 42 ml de ácido sulfúrico concentrado, lentamente.

II.4.2. Reagente de Somogyi – Nelson II (SN-II) – Solução B- Pesou-se 6g de

arseniato dibásico de sódio anidro e dissolveu-se 50 ml de água destilada.

Misturou-se as soluções A e B e deixou-se em repouso por 24 horas a 37ºC,

na estufa.

Armazenou-se esta solução em frasco de âmbar por até 30 dias a 20- 25 ºC.

Preparo da amostra

II.5. Diluiu-se as amostras dos variados vinhos da seguinte forma, 10 ml de

vinho para um balão volumétrico de 100ml e perfez-se o volume do mesmo

com água destilada.

Teste de Somogyi – Nelson (SN)

II.6. Pipetou-se 1,0 ml da amostra para um tubo de ensaio e adicionou-se 2,0 ml

do reagente SN-I.

II.7. Agitou-se e aqueceu-se em banho Maria ( em ebulição) por 6 minutos.

8


II.8. Resfriou-se o tubo em banho de água fria por 5 minutos.

II.9. Adicionou-se 2,0 ml SN-II, agitou-se e deixou-se em repouso por 5 minutos

à temperatura ambiente.

II.10. Adicionaram-se 25 ml de água destilada e fez-se a leitura da absorvância

em espectrofotometro a 540 nm. Após “zerar –se” o aparelho com o branco.

II.10.1. O branco consistiu em substituir-se 1,0 ml da amostra ou padrão por água

destilada e realizou-se o teste de SN.

Observações: A amostra deve ser diluída convenientemente de maneira a que a

concentração de açúcares.

III. Determinação de açúcares redutores pelo método químico de

Lane – Eynon versão B

1º Parte – Preparação e titulação das soluções de Fehling A e B

Solução A

III.1. Pesou-se 3,4639g de sulfato de cobre, transferiu-se para um balão

volumétrico de 100ml. Perfez-se o volume com água destilada.

Solução B

III.2. Pesou-se 17,3g de tartarato de sódio e potássio e dissolveu-se em 50 ml de

água destilada. Adicionou-se 25 ml de uma solução de hidróxido de sódio a

20 %, recém – preparada. Perfez-se o volume até 100ml.

Titulação das soluções

III.3. Transferiu-se para um erlenmeyer, 10 ml de cada uma das soluções, A e B

e adicionaram-se 40 ml de água destilada.

9


III.4. Aqueceu-se até à ebulição e adicionaram-se, com o auxílio de uma bureta

de 50 ml, solução padrão de glicose 1% (m/v), mantendo –se a fervura e

sob agitação, até a solução se tornar – se incolor, aparecendo um resíduo

avermelhado no fundo do erlenmeyer.

Observações: No fundo do erlenmeyer deverá aparecer um resíduo avermelhado.

2º Parte – Determinação da quantidade de açúcares redutores totais das

amostras

III.5. Transferiu-se para balões de 100ml, 10 ml das diferentes amostras,

completou-se o respetivo volume e agitou-se.

III.6. Transferiram-se as amostras diluídas para uma amostra de 50 ml.

III.7. Colocou-se num erlenmeyer de 250 ml, com auxílio de uma pipeta 10ml,

cada uma das soluções de Fehling A e B, adicionou-se 40 mlde água

destilada.

III.8. Aqueceu-se até a ebulição.

III.9. Adicionou-se, gota a gota, a solução da bureta sobre a solução do

erlenmeyer em ebulição, agitando-se sempre, até que esta passe de azul a

incolor.

Observações: No fundo do erlenmeyer deverá ficar um resíduo vermelho de óxido de

cobre.

Cálculos e sua discussão

Determinação do teor de polifenóis

I. Cálculos das amostras (1:10)

10


x=1×10010

=10ml

II. Folin Ciocalteau (1:9)

x=1×1009

=11ml

III. Carbonato de cálcio 7,5 %

% (m/v) ¿massavolume

×100⇔7,5=massa50

×100⇔massa=3,75 g

Determinação de açúcares redutores

IV. Glicose 1%

% (m/v) ¿massavolume

×100⇔1=massa100

×100⇔massa=1g

Determinação de açúcares redutores pelo método Lane-Eynon

100 ×A × aP ×V

Açúcares redutores, expresso em %.

A=nº de ml da solução de P g da amostra

a =nº de g de glicose correspondente a 10ml das soluções de Fehling

P=massa da amostra em g

V=nº de ml da solução da amostra gasto na titulação

Vinho do Porto

11


100×100×0,069,5862×10

=¿ 6,3%

Moscatel

100×100×0,06 9,9980 ×14

=¿ 4,3%

Vinho branco

100×100×0,069,0067 ×25

=¿ 2,7 %

Discussões de resultados

Determinação de açúcares redutores

Tabela 2 – Médias obtidas no teor de polifenóis.

Média Moscatel Média Vinho Branco

Média Vinho do Porto

253,64 254,96 259,51

12


Média Moscatel Média Vinho Branco Média Vinho do Porto250.00

251.00

252.00

253.00

254.00

255.00

256.00

257.00

258.00

259.00

260.00

Teor de Polifenóis em 3 amostras de vinhos

Gráfico 1 – Gráfico referente ao tratamento e obtenção dos dados para determinação do

teor de polifenóis existente na amostra.

Análise ao gráfico

Podemos constatar que o vinho do porto, claramente, apresenta um elevado teor de

polifenóis em relação às outras duas amostras. Logo tem um elevado teor

antioxidante.

13


Determinação de açúcares redutores pelo método Smogyi-Nelson

50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.0000.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

0.120

0.140

0.160

f(x) = 0.000362790697674419 x + 0.0171860465116279R² = 0.997099169084026

Gráfico 2 – Gráfico referente à curva calibração de glicose 1%, na determinação dos açúcares

redutores pelo método Smogyi-Nelson, espectrofotometria.

Curva padrão de glicose 1%

14


Média Moscatel Média Vinho Branco Média Vinho do Porto250.00

260.00

270.00

280.00

290.00

300.00

310.00

Teor de açucares redutores pelo método Smogyi-Nelson

Gráfico 3 – Gráfico referente ao teor de açúcares redutores das respetivas amostras.

Análise do gráfico

Podemos observar que o vinho do porto, é a bebida que apresenta maior teor de

açúcares redutores em relação às outras amostras, moscatel e vinho branco.

Conclusão

Os resultados obtidos são concordantes, pois, nas duas técnicas utilizadas, pode-se

observar que o vinho do porto é a bebida com maior valor de açúcares redutores,

seguindo-se a seguir o Moscatel e depois o vinho branco.

No teor de polifenóis, podemos observar que o Vinho do Porto relativamente ao

gráfico1 é a bebida que apresenta maior atividade antioxidante, em que se confirma

de acordo com alguns estudos realizados. A antioxidade está presente na uva e seus

derivados.

15


Bibliografia

Protocolo do ISEL – Instituto Superior de Engenharia de Lisboa, referente à

determinação do teor de polifenóis.

Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição.

Apontamentos retirados durante a prática experimental.

Sitegrafia

http://serv-bib.fcfar.unesp.br/seer/index.php/alimentos/article/viewFile/

194/199

http://i-bras.net/Arquivoscientificos/AnalisesClinicas/7.pdf

http://www.ebah.pt/content/ABAAAe1uUAK/determinacao-acucares-

redutores-13-10-11

http://www.ebah.pt/content/ABAAABPY0AB/relatorio-5-laboratorio-analise-

alimentos

http://serv-bib.fcfar.unesp.br/seer/index.php/alimentos/article/viewFile/

194/199

http://www.isa.utl.pt/riav/Pdf/Memoria%20del%20Seminario%202003.3.pdf

16


ANEXO I – Curva padrão de ácido gálico

ANEXO II – Teor de polifenóis

ANEXO III - Ilustração das técnicas utilizadas

17


Anexo I

18


Gráfico 1 - Curva de calibração do ácido gálico

Observação: A reta de calibração representada foi realizada, em Formação em

Contexto de trabalho de 2ºano.

0 100 200 300 400 500 6000

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6f(x) = 0.0011454234904049 x + 0.00126544760373748R² = 0.995662881330385

Curva de Calibração

Concentração (mg/L)

Abso

rvân

cia (A

)

19


Anexo II

20


Determinação dos polifenóis

1ºensaio 13/05 1ª serieAmostra Absorvância ConcentraçãoMoscatel 0,455 258,75

Vinho Branco 0,452 257,05Vinho do Porto 0,448 254,77

2º ensaio Amostra Absorvância ConcentraçãoMoscatel 0,445 253,07


3º ensaio Amostra Absorvância ConcentraçãoMoscatel 0,438 249,09


21

Média MoscatelMédia Vinho

Branco Média Vinho do Porto253,64 254,96 259,51


Anexo III

22


Fig 4- Finalização da titulação de Lane- Eynon

Fig1- Reagente Somogyi -

Nelson I / II

Fig2 - Glicose após saída da

estufa

Fig 3- Soluções preparadas para o teor de

polifenóis e Folin Ciocalteau

23

Fig5 - Tubos com as amostras em banho

maria Somogyi – Nelson, para a realização

da espectrofotometria


24

Fig6 - Processo para as leituras no espectrofotometro, teor de

polifenóis

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