Relatório
Determinação dos açúcares redutores de amostras de bebidas
alcoólicas por dois métodos distintos e determinação do teor
de polifenóis.
Validação de Métodos Analíticos
Índice
Resumo...........................................................................................................................2
Objetivo............................................................................................................................2
Introdução teórica............................................................................................................3
Material de laboratório.....................................................................................................3
Reagentes.......................................................................................................................2
Amostra...........................................................................................................................2
Protocolo experimental....................................................................................................3
Cálculos e sua discussão................................................................................................6
Discussões de resultados................................................................................................8
Conclusão......................................................................................................................10
Bibliografia.....................................................................................................................11
Anexos...........................................................................................................................12
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Validação de Métodos Analíticos
Resumo
O projeto desenvolvido no âmbito das disciplinas de análises químicas 2 e 3, onde se
procedeu a execução de três protocolos, era obrigatório fazer pelo menos um desses
protocolos.
O grupo decidiu realizar todos os protocolos, mais concretamente, a determinação de
açúcares redutores pelo método Smogyi-Nelson e pelo método Lane-Eynon, onde nos
foi permitido ao grupo fazer comparação de métodos bem como comparação de
resultados. Realizou-se a determinação do teor polifenóis nas distintas amostras,
vinho do porto, vinho branco e moscatel.
Também foi realizada a determinação dos polifenóis, pelo método de Folin Ciocalteau,
no qual os resultados foram obtidos pela técnica de espectrofotometria. Os dados
foram tratados em Excel e os resultados foram satisfatórios.
No final, foi realizada e última técnica a determinação dos açúcares redutores pelo
método de Smogyi-Nelson por, espectrofotometria.
Objetivo
O objetivo deste protocolo experimental foi o de determinar o teor de polifenóis pelo
método Folin Ciocalteau e a concentração de açúcares redutores totais através da
espetrofotometria pelo método Somogyi – Nelson e também pelo método Lane –
Eynon.
Introdução teórica
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Validação de Métodos Analíticos
Os compostos fenólicos revestem-se de grande importância em enologia uma vez que
estão relacionados, direta ou indiretamente com a qualidade dos vinhos. São eles os
responsáveis pela cor, corpo e adstringência dos vinhos e são os grandes
responsáveis pelas diferenças entre uvas ou vinhos tintos e brancos, pela presença ou
ausência de antocianinas.
Assim, os compostos fenólicos revestem-se de fundamental importância nas
características dos vinhos.
A determinação de açúcares pelo método de Somogyi-Nelson é baseada nas
propriedades redutoras dos açúcares, pela reação dahidroxila hemiacetálica dos
monossacarídeos.O princípio do método de Somogyi-Nelson baseia-se na redução de
Cu++ a Cu+ pelo açúcar redutor comformação Cu2O, que reduz o arsenomolibdato e
produz um composto de coloração azul. O método original foi modificado a partir de
alterações de vários métodos, inclusive o colorimétrico, em que o cobre é reduzido
formando compostos coloridos que podem ser quantificados por espectrofotometria.
Material de laboratório
Agitador- Nahita 690-2;
Balança analítica – SartØrius –
0,1mg;
Balão volumétrico (100 ± 0,1)
ml;
Balão volumétrico (1000 ±
0,8095) ml;
Balão volumétrico (50 ±
0,060)ml;
Banho termostático – Nahita;
Bureta (50 ± 0,05)ml;
Caixa de Petri;
Célula – 2;
Erlenmeyer 250 ml;
Espátula;
Espectrofotómetro – ZUZI
4110RS;
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Validação de Métodos Analíticos
Estufa;
Frasco de âmbar;
Funil;
Gobelé 50 ml;
Papel de filtro;
Pastilha magnética;
Pipeta volumétrica (1 ±
0,007)ml;
Pipeta volumétrica (10 ±
0,05)ml;
Pompete;
Suporte para tubos de ensaio;
Suporte universal;
Tubos de ensaio-20;
Vareta de vidro;
Vidro de relógio;
Reagentes
Tabela nº1 – Reagentes Utilizados
ReagentesFórmula
química
Massa
molar
(g.mol-1)
Frases
de
risco
Frases de
SegurançaFabricante
Pureza
(%)
Ácido sulfúrico
H2SO3 98,08 35 26-30-45 Fluka 95-97
Carbonato de cálcio
CaCO3 100,09 - - Proanalysi
Carbonato de sódio
Na2CO3 105,99 36 22-26 Riedel-de-Haen ®
99,8
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Validação de Métodos Analíticos
Folin Ciocalteau
- - - - - -
Glicose C6H12O6 180,16 - - Scharlau -
Hidróxido de sódio
NaOH 40,00 35 26-37/39-45 Merck 99
Molibdato de sódio
Na2MoO4.2H2 241,95 - - Riedel-de Haen
99,5
Silicato de sódio
- - - - José M.Vaz Pereira
-
Sulfato de cobre anidro
CuSO4 159,6022-
36/38-50/53
22-60-61 Panreac 99,0
Sulfato de sódio anidro
- - - - Laborspirit -
Tartarato de sódio e potássio
C
4H4KnaO6.4H2
O282,22 - - Riedel-de-
Haen99,5
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Validação de Métodos Analíticos
Amostra
Amostra de um determinado vinho: Vinho branco, vinho do Porto e Moscatel.
Técnica de amostragem: Na determinação de polifenóis, pipetou-se cerca de 2ml da
amostra diluída (1:10), e na determinação de açúcares redutores, pipetou-se cerca de
10 ml da amostra para o balão volumétrico de 100 ml.
Local: Fundação Escola Profissional de Setúbal (Laboratório).
Temperatura : Temperatura ambiente (21ºC).
Protocolo experimental
I. Determinação de polifenóis pelo método Folin Ciocalteau
I.1. Num copo de precipitação, adicionaram – se 2 ml da amostra diluída(1 :10),
10 ml de reagente Folin Ciocalteau diluído (1:9),e 8ml de carbonato de
cálcio a 75 %.
I.2. Deixou-se em banho Maria a 50ºC, por 5 minutos.
I.3. Realizaram – se as leituras das tomas a 765 nm, em espectrofotometro
UV/VIS.
I.4. Realizou-se uma curva de padrão com a solução de ácido gálico com as
seguintes concentrações 50, 100, 150, 250 e 500 mg/L.
I.5. Calculou-se o teor de polifenóis expresso em mg em equivalência ao ácido
gálico (EAG)L.
II. Determinação de açúcares redutores e totais por
espetrofotometria Versão A
Preparo de soluções
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Validação de Métodos Analíticos
II.1. Pesou-se 0,050g de glicose e dissolveu-se em 20 ml de água destilada sob
agitação constante.
II.2. Transferiu-se analiticamente para um balão volumétrico de 100ml,
completou-se o volume e homogeneizou-se a solução.
II.3. Reagente de Somogyi – Nelson I( SN-I) - Dissolveram-se 4g de sulfato de
cobre anidro, 24g de carbonato de sódio anidro, 16g de bicarbonato de
sódio, 12g de tartarato duplo de potássio e 18g de sulfato de sódio anidro e
completou-se o volume para 1 lito em balão volumétrico.
2.3.1 Filtrou-se com um papel de filtro e colocou-se em frasco escuro,
devidamente identificado.
II.4. Reagente de Somogyi – Nelson II (SN-II) – Solução A- Pesou-se cerca
de 50g de molibdato de sódio em 900ml de água destilada.
II.4.1. Adicionar cerca de 42 ml de ácido sulfúrico concentrado, lentamente.
II.4.2. Reagente de Somogyi – Nelson II (SN-II) – Solução B- Pesou-se 6g de
arseniato dibásico de sódio anidro e dissolveu-se 50 ml de água destilada.
Misturou-se as soluções A e B e deixou-se em repouso por 24 horas a 37ºC,
na estufa.
Armazenou-se esta solução em frasco de âmbar por até 30 dias a 20- 25 ºC.
Preparo da amostra
II.5. Diluiu-se as amostras dos variados vinhos da seguinte forma, 10 ml de
vinho para um balão volumétrico de 100ml e perfez-se o volume do mesmo
com água destilada.
Teste de Somogyi – Nelson (SN)
II.6. Pipetou-se 1,0 ml da amostra para um tubo de ensaio e adicionou-se 2,0 ml
do reagente SN-I.
II.7. Agitou-se e aqueceu-se em banho Maria ( em ebulição) por 6 minutos.
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Validação de Métodos Analíticos
II.8. Resfriou-se o tubo em banho de água fria por 5 minutos.
II.9. Adicionou-se 2,0 ml SN-II, agitou-se e deixou-se em repouso por 5 minutos
à temperatura ambiente.
II.10. Adicionaram-se 25 ml de água destilada e fez-se a leitura da absorvância
em espectrofotometro a 540 nm. Após “zerar –se” o aparelho com o branco.
II.10.1. O branco consistiu em substituir-se 1,0 ml da amostra ou padrão por água
destilada e realizou-se o teste de SN.
Observações: A amostra deve ser diluída convenientemente de maneira a que a
concentração de açúcares.
III. Determinação de açúcares redutores pelo método químico de
Lane – Eynon versão B
1º Parte – Preparação e titulação das soluções de Fehling A e B
Solução A
III.1. Pesou-se 3,4639g de sulfato de cobre, transferiu-se para um balão
volumétrico de 100ml. Perfez-se o volume com água destilada.
Solução B
III.2. Pesou-se 17,3g de tartarato de sódio e potássio e dissolveu-se em 50 ml de
água destilada. Adicionou-se 25 ml de uma solução de hidróxido de sódio a
20 %, recém – preparada. Perfez-se o volume até 100ml.
Titulação das soluções
III.3. Transferiu-se para um erlenmeyer, 10 ml de cada uma das soluções, A e B
e adicionaram-se 40 ml de água destilada.
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Validação de Métodos Analíticos
III.4. Aqueceu-se até à ebulição e adicionaram-se, com o auxílio de uma bureta
de 50 ml, solução padrão de glicose 1% (m/v), mantendo –se a fervura e
sob agitação, até a solução se tornar – se incolor, aparecendo um resíduo
avermelhado no fundo do erlenmeyer.
Observações: No fundo do erlenmeyer deverá aparecer um resíduo avermelhado.
2º Parte – Determinação da quantidade de açúcares redutores totais das
amostras
III.5. Transferiu-se para balões de 100ml, 10 ml das diferentes amostras,
completou-se o respetivo volume e agitou-se.
III.6. Transferiram-se as amostras diluídas para uma amostra de 50 ml.
III.7. Colocou-se num erlenmeyer de 250 ml, com auxílio de uma pipeta 10ml,
cada uma das soluções de Fehling A e B, adicionou-se 40 mlde água
destilada.
III.8. Aqueceu-se até a ebulição.
III.9. Adicionou-se, gota a gota, a solução da bureta sobre a solução do
erlenmeyer em ebulição, agitando-se sempre, até que esta passe de azul a
incolor.
Observações: No fundo do erlenmeyer deverá ficar um resíduo vermelho de óxido de
cobre.
Cálculos e sua discussão
Determinação do teor de polifenóis
I. Cálculos das amostras (1:10)
10
Validação de Métodos Analíticos
x=1×10010
=10ml
II. Folin Ciocalteau (1:9)
x=1×1009
=11ml
III. Carbonato de cálcio 7,5 %
% (m/v) ¿massavolume
×100⇔7,5=massa50
×100⇔massa=3,75 g
Determinação de açúcares redutores
IV. Glicose 1%
% (m/v) ¿massavolume
×100⇔1=massa100
×100⇔massa=1g
Determinação de açúcares redutores pelo método Lane-Eynon
100 ×A × aP ×V
Açúcares redutores, expresso em %.
A=nº de ml da solução de P g da amostra
a =nº de g de glicose correspondente a 10ml das soluções de Fehling
P=massa da amostra em g
V=nº de ml da solução da amostra gasto na titulação
Vinho do Porto
11
Validação de Métodos Analíticos
100×100×0,069,5862×10
=¿ 6,3%
Moscatel
100×100×0,06 9,9980 ×14
=¿ 4,3%
Vinho branco
100×100×0,069,0067 ×25
=¿ 2,7 %
Discussões de resultados
Determinação de açúcares redutores
Tabela 2 – Médias obtidas no teor de polifenóis.
Média Moscatel Média Vinho Branco
Média Vinho do Porto
253,64 254,96 259,51
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Validação de Métodos Analíticos
Média Moscatel Média Vinho Branco Média Vinho do Porto250.00
251.00
252.00
253.00
254.00
255.00
256.00
257.00
258.00
259.00
260.00
Teor de Polifenóis em 3 amostras de vinhos
Gráfico 1 – Gráfico referente ao tratamento e obtenção dos dados para determinação do
teor de polifenóis existente na amostra.
Análise ao gráfico
Podemos constatar que o vinho do porto, claramente, apresenta um elevado teor de
polifenóis em relação às outras duas amostras. Logo tem um elevado teor
antioxidante.
13
Validação de Métodos Analíticos
Determinação de açúcares redutores pelo método Smogyi-Nelson
50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.0000.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
0.120
0.140
0.160
f(x) = 0.000362790697674419 x + 0.0171860465116279R² = 0.997099169084026
Gráfico 2 – Gráfico referente à curva calibração de glicose 1%, na determinação dos açúcares
redutores pelo método Smogyi-Nelson, espectrofotometria.
Curva padrão de glicose 1%
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Validação de Métodos Analíticos
Média Moscatel Média Vinho Branco Média Vinho do Porto250.00
260.00
270.00
280.00
290.00
300.00
310.00
Teor de açucares redutores pelo método Smogyi-Nelson
Gráfico 3 – Gráfico referente ao teor de açúcares redutores das respetivas amostras.
Análise do gráfico
Podemos observar que o vinho do porto, é a bebida que apresenta maior teor de
açúcares redutores em relação às outras amostras, moscatel e vinho branco.
Conclusão
Os resultados obtidos são concordantes, pois, nas duas técnicas utilizadas, pode-se
observar que o vinho do porto é a bebida com maior valor de açúcares redutores,
seguindo-se a seguir o Moscatel e depois o vinho branco.
No teor de polifenóis, podemos observar que o Vinho do Porto relativamente ao
gráfico1 é a bebida que apresenta maior atividade antioxidante, em que se confirma
de acordo com alguns estudos realizados. A antioxidade está presente na uva e seus
derivados.
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Validação de Métodos Analíticos
Bibliografia
Protocolo do ISEL – Instituto Superior de Engenharia de Lisboa, referente à
determinação do teor de polifenóis.
Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição.
Apontamentos retirados durante a prática experimental.
Sitegrafia
http://serv-bib.fcfar.unesp.br/seer/index.php/alimentos/article/viewFile/
194/199
http://i-bras.net/Arquivoscientificos/AnalisesClinicas/7.pdf
http://www.ebah.pt/content/ABAAAe1uUAK/determinacao-acucares-
redutores-13-10-11
http://www.ebah.pt/content/ABAAABPY0AB/relatorio-5-laboratorio-analise-
alimentos
http://serv-bib.fcfar.unesp.br/seer/index.php/alimentos/article/viewFile/
194/199
http://www.isa.utl.pt/riav/Pdf/Memoria%20del%20Seminario%202003.3.pdf
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Validação de Métodos Analíticos
ANEXO I – Curva padrão de ácido gálico
ANEXO II – Teor de polifenóis
ANEXO III - Ilustração das técnicas utilizadas
17
Validação de Métodos Analíticos
Anexo I
18
Validação de Métodos Analíticos
Gráfico 1 - Curva de calibração do ácido gálico
Observação: A reta de calibração representada foi realizada, em Formação em
Contexto de trabalho de 2ºano.
0 100 200 300 400 500 6000
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6f(x) = 0.0011454234904049 x + 0.00126544760373748R² = 0.995662881330385
Curva de Calibração
Concentração (mg/L)
Abso
rvân
cia (A
)
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Validação de Métodos Analíticos
Anexo II
20
Validação de Métodos Analíticos
Determinação dos polifenóis
1ºensaio 13/05 1ª serieAmostra Absorvância ConcentraçãoMoscatel 0,455 258,75
Vinho Branco 0,452 257,05Vinho do Porto 0,448 254,77
2º ensaio Amostra Absorvância ConcentraçãoMoscatel 0,445 253,07
Vinho Branco 0,451 256,48Vinho do Porto 0,461 262,16
3º ensaio Amostra Absorvância ConcentraçãoMoscatel 0,438 249,09
Vinho Branco 0,442 251,36Vinho do Porto 0,460 261,59
21
Média MoscatelMédia Vinho
Branco Média Vinho do Porto253,64 254,96 259,51
Validação de Métodos Analíticos
Anexo III
22
Validação de Métodos Analíticos
Fig 4- Finalização da titulação de Lane- Eynon
Fig1- Reagente Somogyi -
Nelson I / II
Fig2 - Glicose após saída da
estufa
Fig 3- Soluções preparadas para o teor de
polifenóis e Folin Ciocalteau
23
Fig5 - Tubos com as amostras em banho
maria Somogyi – Nelson, para a realização
da espectrofotometria
Validação de Métodos Analíticos
24
Fig6 - Processo para as leituras no espectrofotometro, teor de
polifenóis