UNIVERSIDADE DE SÃO PAULOESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA “LUIZ DE QUEIROZ”

Disciplina: Microbiologia e Biotecnologia do Solo Departamento de Ciência do Solo

Docentes: Elke Jurandy Bran Nogueira CardosoFernando Dini Andreotte

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICASAMONIFICADORES

Aluna: Patricia D. C. Schaker

PIRACICABA, MAIO 2011.

1

Introdução

A presente prática foi realizada com a finalidade de quantificar os microrganismos amonificadores em solo nativo e agrícola. O processo pelo qual o nitrogênio circula através das plantas e do solo pela ação de organismos vivos é conhecido como ciclo do nitrogênio. Este ciclo é um dos mais importantes nos ecossistemas terrestres, isto porque o nitrogênio é usado pelos seres vivos para a produção de moléculas complexas necessárias ao seu desenvolvimento tais como aminoácidos, proteínas e ácidos nucléicos.

O principal repositório de nitrogênio é a atmosfera, que é composta por aproximadamente 78% de nitrogênio, onde este elemento se encontra sob a forma de gás (N2). Outros repositórios consistem em matéria orgânica nos solos e oceanos. Apesar de extremamente abundante na atmosfera o nitrogênio é frequentemente o nutriente limitante do crescimento das plantas. Isto acontece porque as plantas apenas conseguem usar o nitrogênio sob as formas de íon amônio (NH4

+), íon nitrito (NO2-) e

íon nitrato (NO3-), cuja existência não é tão abundante. Estes compostos são obtidos

através de vários processos tais como a fixação e amonificação e nitrificação. Os microrganismos estão diretamente envolvidos no ciclo do nitrogênio e a

quantificação de grupos importantes dá a indicação de como os processos estão ocorrendo. Assim, a amonificação ou degradação dos compostos nitrogenados orgânicos é um dos passos da mineralização do nitrogênio e permite sua disponibilização para as plantas. Muitos microrganismos quimiorganotróficos são capazes de efetuar esta transformação, tanto em condições aeróbias quanto anaeróbias. Neste ultimo caso, as taxas de transformação são mais lentas. A formação de amônio é tipicamente o resultado de um processo de excreção de N celular durante a decomposição de formas orgânicas de N (Cardoso et al. 1992). Assim, sua quantificação nos solos fornece um indicativo do processo de mineralização do nitrogênio e do ciclo deste elemento no solo.

Objetivo

Avaliar a variação do número de microrganismos amonificadores em solo nativo e agrícola, e a resposta desta classe de microrganismos ao uso do solo.

Métodos

Foi utilizado o protocolo descrito por Sarathchandra (1978), com algumas modificações. Inicialmente o solo proveniente de área nativa e de cultura anual foi peneirado e as raízes foram removidas. Em seguida pesou-se 10 gramas de solo e adicionados em frasco de Erlenmeyer contendo 90 mL de solução salina (NaCl 0,85%) estéril, correspondendo à diluição 10-1. Em seguida foram preparadas as diluições

2

seriadas de 10-2 a 10-6 em solução salina. Para tanto foram tomados 1000 µL da diluição 10-1 após homogeneização, e passados para um tubo de ensaio contendo 9 mL de solução salina, correspondendo então à diluição 10-2. O mesmo procedimento foi realizado para as diluições 10-3 a 10-6.

Em seguida, em tubos estéreis contendo 2 mL do meio de cultura para amonificadores (Tabela 1), foram adicionados 100 µL das diluição 10-2 a 10-6, com quatro repetições. Estes tubos foram incubados durante sete dias a 28ºC. Após este período foi realizada a avaliação de crescimento pela mudança da coloração do meio de laranja para rosa de cada um dos tubos, e, a partir dos dados de positivo ou negativo para o crescimento, obtemos o NMP (número mais provável) de microrganismos por grama de solo (Woomer, 1994).

O método baseia-se no princípio de que o meio utilizado apresenta apenas nitrogênio orgânico, que é indisponível para a grande maioria das plantas. Se houver microrganismos amonificadores no solo estes irão utilizar as proteínas e os aminoácidos como fonte para suas próprias proteínas e liberam o excesso de nitrogênio sob a forma de amônio (NH4

+) no meio, que ficará disponível. Com a produção do NH4+ haverá

também a produção o íon OH-, que promove o aumento do pH do meio, ocasionando a mudança da coloração do mesmo de laranja para rosa.

Tabela 1. Composição do meio de cultura utilizado para indicação de atividade amonificante. Composto Função Quantidade

Caseína hidrolisada Fonte de nitrogênio orgânico

10 g

Extrato de levedura Fonte de nitrogênio orgânico

0,1 g

Fosfato de potássio monoácido

Fonte de Micronutrientes (especialmente K)

1,0 g

Sulfato de magnésio Fonte de Micronutrientes(especialmente Mg)

0,1 g

Sulfato ferroso Fonte de Micronutrientes(especialmente Fe)

0,01 g

Sulfato de Manganês Fonte de Micronutrientes(especialmente Mn)

0,01 g

Vermelho Fenol Indicador de pH 0,01 gÁgua destilada ou

deionizadaSolvente 1000 mL

Resultados e discussão

3

A maior parte do nitrogênio encontrado  no solo provém de materiais orgânicos mortos, nos quais existe sob a forma de compostos orgânicos complexos, tais como proteínas, aminoácidos, ácidos nucléicos e nucleotídeos.  Entretanto, estes compostos nitrogenados são, em geral, rapidamente decompostos em substâncias mais simples por organismos que vivem nos solos.  As bactérias saprófitas e várias espécies de fungos são os principais responsáveis pela decomposição de materiais orgânicos mortos.  Estes microrganismos utilizam as proteínas e os aminoácidos como fonte para suas próprias proteínas e liberam o excesso de nitrogênio sob a forma de amônia (NH3), no processo de amonificação. Em geral, a amônia produzida por amonificação é dissolvida na água do solo, onde se combina a prótons para formar o NH4

+ e OH-. Assim, a amonificação, também chamada de mineralização, é o processo que retorna o nitrogênio incorporado (orgânico) para a forma de amônia (inorgânico).

Na tabela 2 é apresentado o número de tubos que apresentaram crescimento para cada uma das diluições utilizadas (10-2 a 10-6), o respectivo NMP e os valores utilizados para o cálculo do Log das unidades formadoras de colônia por grama de solo fresco, bem como o resultado final.

Tabela 2. Número Mais provável de microrganismos amonificadores por grama de solo nativo e agrícola. Parâmetros utilizados para obtenção do valor.

Solo nativo Solo AgrícolaR1 R2 R1 R2

10-2 4 4 4 410-3 4 4 4 410-4 4 4 4 010-5 4 4 2 010-6 1 1 1 0NMP correspondente 38,44 38,44 9,39 2,31Valor inoculado (µL) 100 100 100 100Fator de multiplicação 10000*10 10000*10 10000*10 1000*10Valor real UFC/g solo 3844000 3844000 939800 23110Log UFC/g solo 6,58 6,58 5,97 4,36Média Log UFC/g solo 6,58 5,16

Foi possível observar que em solo nativo há aproximadamente 10 vezes mais microrganismos amonificadores que em solo agrícola. Este comportamento pode ser devido à maior diversidade microbiológica neste primeiro ambiente, possibilitando a conversão de uma maior quantidade de nitrogênio orgânico em mineral, já que esta função é realizada por uma grande gama de microrganismos. A amonificação no solo, e especialmente neste tipo de ambiente onde há maior disponibilização de matéria morta é

4

de extrema importância para a ciclagem do nitrogênio entre a atmosfera e o solo, e evitar seu acúmulo no solo.

A mineralização do nitrogênio é dependente de fatores ambientais como a temperatura, umidade, aeração e, principalmente da composição química dos restos culturais, especialmente da relação C/N, teores de lignina, celulose, hemicelulose e polifenóis. Assim, este processo é influenciado pelos fatores que controlam o crescimento e atividade dos microrganismos, especialmente a qualidade e quantidade de resíduos culturais no solo.

Além de ser utilizado pelas plantas, o NH4+ pode seguir por outras vias, até ser

oxidado a NO3- (nitrato) pelo processo de nitrificação, onde microrganismos quimiolitotróficos utilizam o NH4

+ como fonte de energia, pode também ficar preso à CTC do solo, aderido a argila (disponível) ou volatilizar dependendo das condições ambientais. O nitrato produzido pelo uso do amônio pode ser lixiviado, utilizado pelas plantas, ou, em condições de anaerobiose, ser utilizado por microrganismos específicos que o utilizam como receptor final de elétrons na cadeia respiratória anaeróbia, sendo transformado em nitrogênio gasoso novamente ou óxido nitroso, um gás potencialmente causador do efeito estufa.

Assim, o passo da amonificação é de extrema importância para que o ciclo do nitrogênio ocorra, permitindo que este elemento volte à atmosfera e seja novamente fixado por meio do processo de fixação biológica no nitrogênio, ou outros processos de fixação menos frequentes. Áreas nativas, por apresentarem maior diversidade de substratos passíveis de decomposição que contém nitrogênio orgânico, assim como uma maior diversidade de microrganismos, possibilitam o desenvolvimento de um maior número de amonificadores, em comparação com as condições de agricultura, onde há uma menor quantidade de substrato para decomposição microbiana, o que pode ter influenciado a presença de uma menor quantidade de microrganismos amonificadores neste tipo de solo.

Conclusão

O maior número de microrganismos amonificadores em solo nativo pode ser devido à maior disponibilidade de substratos passíveis de decomposição contendo nitrogênio neste ambiente, o que induz o desenvolvimento desta classe de organismos. Além disso, é conhecida a característica da maior diversidade de microrganismos em solos nativos, e uma vez que muitas classes de microrganismos são capazes de realizar a amonificação, espera-se que seja encontrado um número mais elevado de amonificadores em solos nativos que agrícolas.

5

Referências

Cardoso, E. J. B. N.; Tsai, S. M.; Neves, M. C. P. 1992. Microbiologia do Solo. Sociedade Brasileira de Ciência do Solo. Campinas. 360 p.

Moreira, F. M. de S.; Siqueira, J. O. 2006. Microbiologia e Bioquímica do Solo. 2ª ed. Editora UFLA, Lavras. 729 p.

Woomer, P. L. Most probable number counts. In: WEAVER et al.. Methods of soil analysis. Soil Science Society of America Journal, U.S.A – SSSA book series, n.5, p.59 – 79. 1994.

Sarathchandra, U. Nitrification activities and the changes in the populations of nitrifying bacteria in soil perfused at two different H-ion concentrations. Plant and Soil, The Hague, v.50, n.1, p.99-111, July 1978.

6