Repositório Institucional da Universidade de Aveiro: Home · DNA 50pb. A presença do fragmento de 99pb é indicativa do polimorfismo IL1A-889 e o fragmento de 200pb do polimorfismo

palavras-chave

Periodontite, PCR em tempo real, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Treponema denticola e Prevotella intermedia, polimorfismos, IL-1A(C-889T), IL-1B(C+3953)

resumo

O presente estudo visa optimizar a metodologia de PCR em tempo real para a identificação de 5 bactérias que contribuem para a iniciação e/ou progressão de diversas formas de periodontite. Nos pacientes com periodontite foram ainda estudados os polimorfismos do gene IL-1, que têm vindo a ser relacionados com uma maior susceptibilidade de desenvolvimento da doença.

Foram analisadas, por PCR em tempo real, amostras da placa bacteriana infragengival de indivíduos doentes (n=14) e indivíduos saudáveis (n=6), no sentido de identificar diferenças respeitantes à presença de Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Treponema denticola e Prevotella intermedia. Todas as bactérias analisadas foram identificadas por PCR em tempo real, que mostrou ser uma técnica mais sensível e económica quando comparada com um kit de Hibridização comercial (Micro-Ident). Observou-se uma elevada prevalência dos microrganismos periodontais em todos os pacientes, não tendo sido detectada a bactéria A. actinomycetemcomitans em cerca de 50% dos casos analisados. Nos indivíduos saudáveis foram detectados T. forsythia, T. denticola e P. intermedia, mas nunca P. gingivalis. Alguns destes indivíduos apresentavam níveis detectáveis de A. Actinomycetemcomitans.

Nos pacientes com periodontite foram também analisados os polimorfismos IL-1A(C-889T) e IL-1B(C+3953T), pela metodologia de PCR-RFLP,verificando--se que cerca de 50% dos indivíduos estudados eram homozigóticos para o alelo 1 do polimorfismo IL-1B(C+3953T). Os restantes 50% possuíam o alelo 2 (associado à periodontite agressiva), 21% dos quais em homozigotia. No caso do polimorfismo IL-1A(C-889T), 42,9% dos pacientes eram homozigóticos para o alelo 1 e os restantes possuíam o alelo 2 (14,3% em homozigotia).

O PCR em tempo real mostrou ser uma técnica de elevada sensibilidade que permite a rápida identificação dos microrganismos associados à doença periodontal. A população estudada apresenta diferenças relativamente aos polimorfismos IL-1A(C-889T) e IL-1B(C+3953T).

keywords

Periodontitis, real-time PCR, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Treponema denticola e Prevotella intermedia, polymorphisms, IL-1A(C-889T), IL-1B(C+3953)

abstract

The aim of this study was to develop a real-time polymerase chain reaction (PCR) methodology for the detection of 5 bacterial species that have been correlated with several periodontitis forms. We also intended to study the IL-1 gene polymorphisms in patients with confirmed periodontitis, since some studies suggest that host genes are important for disease susceptibility.

The presence of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Treponema denticola and Prevotella intermedia was analyzed by real-time PCR in order to identify differences between subgingival plaque samples of patients with periodontitis and healthy individuals. 14 patients with periodontitis and 6 healthy individuals were included in the study. All bacterial species were identified by real-time PCR, which was shown to be a more sensitive and less expensive technique, when compared with a commercial hybridization kit (Micro-Ident). A high prevalence of the periodontal microorganisms was found in all patients studied; however A. actinomycetemcomitans was not present in about 50% of these patients. In healthy individuals, T. forsythia, T. denticola and P. intermedia were detected, but P. gingivalis was not found. Some of these individuals showed detectable levels of. A. Actinomycetemcomitans.

Gene polymorphisms IL-1A(C-889T) and IL-1B(C+3953T) were analyzed in all the patients diagnosed with periodontitis, by the PCR-RFLP methodology. About 50% of the individuals were homozygous for allele 1 of the polymorphism IL-1B(C+3953T), while the remaining 50% presented allele 2 (21% being homozygous), which has been correlated with severe periodontitis. For IL-1A(C-889T) polymorphism, about 42,9% of the individuals were homozygous for allele 1, while the remaining presented allele 2 (14,3% being homozygous)

Real-time PCR was found to be a highly sensitivity technique allowing the rapid identification of periodontal microorganisms. In the present work we found significant differences regarding gene polymorphisms IL-1A(C-889T) and IL-1B(C+3953T), in the studied population.

i

ÍÍNNDDIICCEE GGEERRAALL

LLIISSTTAA DDEE FFIIGGUURRAASS ........................................................................................................................................................................................ IIIIII

LLIISSTTAA DDEE TTAABBEELLAASS ............................................................................................................................................................................................ VV

LLIISSTTAA DDEE AABBRREEVVIIAATTUURRAASS .......................................................................................................................................................................... VVII

LLIISSTTAA DDEE BBAACCTTÉÉRRIIAASS .................................................................................................................................................................................. VVIIII

II.. IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO ............................................................................................................................................................................................ 11

I.1. A Doença Periodontal......................................................................... 2

1.1. Aspectos Gerais .............................................................................. 2

1.2. Caracterização microbiológica .......................................................... 3

1.2.1. Flora saudável ........................................................................ 3

1.2.2. Gengivite ............................................................................... 4

1.2.3. Periodontite ............................................................................ 5

1.3. Factores de Virulência ..................................................................... 6

1.4. Susceptibilidade genética ................................................................. 8

1.5. Patologias Sistémicas ..................................................................... 10

I.2. Diagnóstico Bacteriano ..................................................................... 13

I.3. Objectivos do Trabalho ..................................................................... 17

IIII.. MMAATTEERRIIAALL EE MMÉÉTTOODDOOSS .................................................................................................................................................................... 1188

II.1. Selecção de Pacientes ....................................................................... 19

II.2. Colheita de amostras ........................................................................ 19

II.3. Extracção de DNA de Amostras Infragengivais ..................................... 20

3.1. Com o kit QIAamp® DNA Mini Kit ..................................................... 20

3.2. Com a matriz InstaGeneTM Matrix .................................................... 21

II.4. Extracção de DNA de Amostras de saliva ............................................. 21

II.5. Quantificação de DNA ....................................................................... 21

II.6. Reacções de Amplificação por PCR Convencional .................................. 22

II.7. Reacções de Amplificação por PCR em Tempo Real ............................... 23

II.8. Digestão do DNA com Enzimas de Restrição ........................................ 24

8.1. Digestão com NcoI......................................................................... 24

8.2. Digestão com TaqαI ....................................................................... 24

II.9. Concentração das Amostras .............................................................. 24

II.10. Electroforese em Gel de Agarose ........................................................ 24

II.11. Electroforese Capilar ........................................................................ 25

II.12. Análise de DNA por Hibridação Reversa (Kit micro-IDent®) .................... 25

ii

IIIIII.. RREESSUULLTTAADDOOSS EE DDIISSCCUUSSSSÃÃOO ........................................................................................................................................................ 2266

III.1. Selecção do Tipo de Amostra e do método de extracção de DNA ............ 28

III.2. Detecção de microrganismos periodontais ........................................... 31

III.3. Análise dos polimorfismos IL1A (C-889T) e IL1B (C+3953T).................. 39

III.4. Caracterização microbiológica e susceptibilidade genética dos pacientes

estudados ................................................................................................ 47

IIVV.. CCOONNCCLLUUSSÕÕEESS EE PPEERRSSPPEECCTTIIVVAASS FFUUTTUURRAASS .......................................................................................................................... 5522

BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFIIAA .................................................................................................................................................................................................. 5555

AANNEEXXOOSS ................................................................................................................................................................................................................ 7799

iii

LLIISSTTAA DDEE FFIIGGUURRAASS

Figura 1 – Recolha de placa bacteriana infragengival. ...................................... 20

Figura 2 – Programa de amplificação por PCR convencional para a detecção dos

microrganismos periodontais. ......................................................................... 22

Figura 3 – Programa de amplificação por PCR convencional para a detecção

conjunta dos polimorfismos IL-1A(C-889T) e IL-1B(C+3953T). .......................... 23

Figura 4 – Programa de amplificação por PCR em tempo real para a detecção dos

microrganismos periodontais. ......................................................................... 23

Figura 5 – Diagrama para implementação de dois novos testes no laboratório de

diagnóstico molecular e respectivo faseamento (Etapas A, B, C e D). Análise 1 –

Detecção de microrganismos periodontais. Análise 2 – Análise dos polimorfismos

IL-1A(C-889T) e IL-1B(C+3954T). .................................................................. 27

Figura 6 – Electroforese em Gel de Agarose 2% corado com brometo de etídio. (a)

A presença dos fragmentos de 80pb e 99pb é indicativa da presença de A.

actinomycetemcomitans e P. intermedia. (b) Os fragmentos de 127pb, 67pb e

122pb são indicativos da presença de T. forsythia, P. gingivalis e T. denticola,

respectivamente. M – Marcador de DNA 50bp; 1,2 e 3 – Amostras; Aa – A.

actinomycetemcomitans; Pi – P. intermedia; Tf – T. forsythia ; Pg – P. gingivalis ;

Td – T. denticola. ......................................................................................... 33

Figura 7 – Análise dos microrganismos periodontais com o kit Micro-IDent® da

HAIN Lifescience. 1, 2 e 3 – Amostras; NTC – Amostra controle em que foi

analisada água em vez de amostra; CC – Controlo conjugado; CA – Controlo de

Amplificação; Aa – A. actinomycetemcomitans; Pi – P. intermedia; Tf – T. forsythia;

Pg – P. gingivalis; Td – T. denticola; IC – Indicador colorido. ............................. 33

Figura 8 – Curvas de amplificação (a) e de dissociação (b) dos agentes

Porphyromonas gingivalis (Pg), Tannerella forsythia (Tf), Actinobacillus

actinomycetemcomitans (Aa), Treponema denticola (Td) e Prevotella intermedia

(Pi), por PCR Tempo Real no AB 7300. (c) Electroforese em Gel de Agarose 2%

corado com brometo de etídio. A presença dos fragmentos de 80pb, 99pb, 127pb,

67pb e 122pb confirmam a presença de Aa, Pi, Tf, Pg e Td, respectivamente. M –

Marcador de DNA 50bp.................................................................................. 36

iv

Figura 9 – Análise de produtos de amplificação relativos aos polimorfismos IL1A-

889 e IL1B+3953 em gel de Agarose 2% corado com brometo de etídio. (a) Após

amplificação com Ta=56ºC. (b) Após amplificação com Ta=52ºC. M – Marcador de

DNA 50pb. A presença do fragmento de 99pb é indicativa do polimorfismo IL1A-889

e o fragmento de 200pb do polimorfismo IL1B+3953. ....................................... 41

Figura 10 – Análise de produtos de amplificação relativos ao polimorfismo IL1A-

889 em gel de Agarose 2% corado com brometo de etídio, resultantes de diferentes

misturas de reacção. M – Marcador de DNA 50bp; Ai – 10µL de Amostra; A’i – 20µL

de Amostra. Em ambos os casos com i=1, 2 e 3, correspondendo a uma

concentração dos primers na mistura de reacção de 15µM, 30µM e 45µM,

respectivamente. A presença do fragmento de 99pb é indicativa do polimorfismo

IL1A-889. .................................................................................................... 42

Figura 11 – Esquema representativo dos fragmentos obtidos após digestão com

NcoI dos alelos 1 e 2 para o polimorfismo IL1A-889. ......................................... 43

Figura 12 – Esquema representativo dos fragmentos obtidos após digestão com

TaqααααI dos alelos 1 e 2 para o polimorfismo IL1B+3953. ..................................... 44

Figura 13 – Análise por PCR-RFLP do polimorfismo IL1B+3953 em gel de agarose

2% corado com brometo de etídio. M – Marcador de DNA 50bp; D – Amostras de

pacientes com periodontite; C – Amostras controlo de indivíduos saudáveis. A

presença do fragmento de 182pb é indicativa do alelo 2 (Amostras D1 e D4),

enquanto que o conjunto dos fragmentos de 85pb e 97pb indica a presença do alelo

1 (todas as amostras da figura). As amostras D1 e D4 são heterozigóticas e as

restantes são homozigóticas para o alelo 1. ..................................................... 44

Figura 14 – Análise por PCR-RFLP do polimorfismo IL1A-889 por electroforese num

bioanalisador Agilent 2100 Bioanalyzer. L – Marcador de DNA 15bp; Samplei –

Amostra; linha verde – primeiro pico/fragmento do marcador (15pb); linha lilás –

último pico do marcador (1500pb). ................................................................. 46

v

LLIISSTTAA DDEE TTAABBEELLAASS

Tabela 1 – Complexos bacterianos (tabela adaptada de Socransky et al29). ......... 5

Tabela 2 – Tabela com a sequência dos primers utilizados no presente estudo para

a detecção de Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), Prevotella intermedia

(Pi), Tannerella forsythia (Tf), Porphyromonas gingivalis (Pg) e Treponema

denticola (Td). F – Primer directo, R – Primer Reverso, Tm – Temperatura de fusão.

.................................................................................................................. 31

Tabela 3 – Temperaturas de dissociação dos fragmentos de amplificados de cada

bactéria, resultantes da análise individual por PCR Tempo Real. ......................... 37

Tabela 4 – Tabela com a sequência dos primers utilizados no presente estudo para

a análise dos polimorfismos. F – Primer directo, R – Primer reverso, Tm –

Temperatura de fusão. .................................................................................. 40

Tabela 5 – Enzimas de restrição utilizadas na detecção dos polimorfismos IL1A-

889 e IL1B+3953 e respectivas condições de reacção. ...................................... 43

Tabela 6 – Resumo dos resultados referentes à frequência dos agentes

patogénicos nos indivíduos estudados. ............................................................ 47

Tabela 7 – Resumo dos resultados referentes à frequência dos polimorfismos IL1A-

889 e IL1B+3953. ........................................................................................ 50

vi

LLIISSTTAA DDEE AABBRREEVVIIAATTUURRAASS

BSA Albumina de soro bovino

CDT Toxina de distensão citoletal

DNA Ácido desoxirribonucleico

dNTP Trifosfato Desoxirribonucleótido

g Abreviatura que representa a Força centrífuga relativa (RCF), que não

tem unidades.

IL Interleucina

LPS Lipopolissacarídeo

min Minutos

mL Mililitro

mm Milímetro

n Número de indivíduos

ng Nanograma

MgCl2 Cloreto de magnésio

MPM Metaloproteinases de matriz

NTC Amostra controle em que foi analisada água em vez de amostra (No

Template Control)

Pb Pares de bases

PCR Reacção de polimerase em cadeia

PGE2 Prostaglandinas E2

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA Ácido ribonucleico

rpm Rotações por minuto

TNF-α Factor de necrose tumoral alfa

TAE Tris-Acetate-EDTA

Ta Temperatura de annealing

U Unidades

V Volts

µL Microlitros

ºC Graus célcius

vii

LLIISSTTAA DDEE BBAACCTTÉÉRRIIAASS

No decorrer do presente trabalho, e de forma a facilitar a leitura do mesmo, as

bactérias serão referidas sob a(s) forma(s) abreviada(s):

A. actinomycetemcomitans (Aa) – Actinobacillus actinomycetemcomitans

A. georgiae – Actinomyces georgiae

A. israelli – Actinomyces israelli

A. naeslundii – Actinomyces naeslundii

A. viscosus – Actinomyces viscosus

C. concisus – Campylobacter concisus

C. ochracea – Capnocytophaga ochracea

C. rectus – Campylobacter rectus

E. corrodens – Eikenella corrodens

E. nodatum – Eubacterium nodatum

F. nucleatum – Fusobacterium nucleatum

M. micros – Micromonas micros

P. gingivalis (Pg) – Porphyromonas gingivalis

P. intermedia (Pi) – Prevotella intermedia

P. micros – Peptostreptococcus micros

P. nigrescens – Prevotella nigrescens

T. denticola (Td) – Treponema denticola

T. forsythia (Tf) – Tannerella forsythia

T. socranskii – Treponema socranskii

S. anginosus – Streptococcus anginosus

S. constellatus – Streptococcus constellatus

S. gordonni – Streptococcus gordonni

S. intermedius – Streptococcus intermedius

S. mitis – Streptococcus mitis

S. noxia - Selenomonas noxia

S. oralis – Streptococcus oralis

S. sanguis – Streptococcus sanguis

V. parvula – Veillonella parvula

W. recta – Wolinella recta

1

I. Introdução

“Temo o que desconheço. E, por uma

questão de orgulho e por ter consciência

de que o desconhecido é perigoso,

esforço-me por apreender o máximo possível.”

Richard Bach em Estranho à TerraEstranho à TerraEstranho à TerraEstranho à Terra

UNIVERSIDADE DE AVEIRO INTRODUÇÃO

TESE DE MESTRADO 2

II.. IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO

II..11.. AA DDOOEENNÇÇAA PPEERRIIOODDOONNTTAALL

11..11.. AAssppeeccttooss GGeerraaiiss

A doença periodontal é uma das principais causas de perda dentária na população

humana a nível mundial. Trata-se de uma infecção crónica dos tecidos periodontais

(gengiva, ligamento periodontal, cemento radicular e osso alveolar), decorrente de

acumulação de placa bacteriana com níveis de prevalência elevados de bactérias

Gram-negativas.1

Esta patologia, contrariamente a outras doenças infecciosas, apresenta uma

evolução descontínua, resultante da resposta inflamatória e imune do hospedeiro à

presença das bactérias e seus produtos.

Em termos gerais, actualmente a doença periodontal pode ser classificada em

diversas formas distintas, tais como as doenças gengivais, de entre as quais se

destaca a gengivite, diversas formas de periodontite, os abcessos do periodonto, as

deformidades adquiridas ou desenvolvidas, entre outras.2

A gengivite é uma inflamação superficial da gengiva em que o epitélio de união se

mantém unido ao dente, não havendo perda de inserção. Esta manifesta-se

clinicamente por alteração da cor (edema), da textura (flacidez) e por hemorragia

espontânea (ou ao escovar os dentes) da margem gengival. A principal causa é a

acumulação de bactérias (placa) entre a gengiva e o dente, sendo que, as

estruturas do periodonto se encontram fragilizadas, possibilitando um maior acesso

dos agentes bacterianos agressores e/ou dos seus produtos às áreas subjacentes.3

A periodontite, por sua vez, ocorre quando as alterações verificadas na gengivite

progridem até haver migração apical do epitélio de união, formando cavidades

profundas entre a raiz do dente e o osso subjacente (bolsas periodontais), propícias

à acumulação de placa bacteriana ao nível dos tecidos mais profundos. Nesta fase

os dentes podem apresentar mobilidade e, em casos extremos, podem ser

avulcionados. Dentro da periodontite podem ainda ser distinguidos dois tipos,

consoante o modo de progressão: a periodontite agressiva, que afecta indivíduos

saudáveis e é caracterizada por uma perda severa de inserção clínica associada à

rápida destruição óssea alveolar, e a periodontite crónica, caracterizada pela

inflamação dos tecidos de suporte dos dentes e perda progressiva de inserção


TESE DE MESTRADO 3

conjuntiva. O início da periodontite crónica pode ocorrer em qualquer idade,

todavia, esta patologia é mais frequente em adultos.4

Alguns autores consideram que a periodontite é uma das infecções mais invulgares

do organismo humano.5 Não só existem diferenças microbiológicas qualitativas e

quantitativas entre os pacientes, como estas diferenças são mediadas por uma

série de factores de risco, que podem modificar a resposta de cada paciente frente

aos agentes patogénicos.6-10

A idade, a higiene oral, o tabagismo, o stresse, o défice de imunocompetência

(neutropenia), a susceptibilidade genética e algumas doenças sistémicas, como a

diabetes mellitus, são factores de risco que, quando combinados, parecem estar

relacionados com a progressão da doença periodontal.9-11

No presente trabalho será dada prioridade à caracterização microbiológica

associada à patologia, uma vez que a presença de determinados microrganismos na

flora bacteriana infragengival tem vindo a ser relacionada com a periodontite.12-16

Será dado ainda ênfase ao papel da susceptibilidade genética e de algumas

patologias sistémicas na patogénese da periodontite.

11..22.. CCaarraacctteerriizzaaççããoo mmiiccrroobbiioollóóggiiccaa

1.2.1. Flora saudável

A cavidade oral humana é um ecossistema complexo habitado por,

aproximadamente, 700 espécies de bactérias.17 Em parte, esta diversidade deve-se

à variedade de estruturas anatómicas da cavidade oral, como os dentes, estruturas

rígidas que não sofrem descamação, e as mucosas. A implantação dos dentes na

gengiva cria, pelo menos, dois habitats diferentes no periodonto: infragengival e

supragengival. Do mesmo modo, as mucosas das diversas regiões da boca

apresentam características diferentes, originando distintos habitats e, em

consequência, uma flora microbiana indígena de constituição diversa.18,19

Na região periodontal, os microrganismos formam um biofilme denso denominado

de placa bacteriana, cuja composição é variável, de acordo com a região onde se

forma e com a sua própria evolução.20,21


TESE DE MESTRADO 4

A placa bacteriana que caracteriza a flora saudável é constituída

predominantemente por cocos e bacilos Gram-positivos; tais como o S. sanguis, S.

mitis, S. oralis, S. gordonni, A. viscosus, A. naeslundii e pequenas quantidades de

P. intermédia e F. nucleatum; em equilíbrio dinâmico com o sistema de defesa do

hospedeiro.22 Estes aderem à superfície dentária através de complexos proteicos,

as adesinas, que reconhecem e se ligam aos receptores proteicos aí presentes.

Outras bactérias ainda, como a Actinobacillus viscosus, possuem uns apêndices

finos na sua superfície, denominados de fímbrias, que auxiliam no processo de

aderência.23

Estas bactérias ocupam locais específicos e produzem produtos que dificultam a

permanência e potencial colonização por parte de outras espécies não nativas e

potencialmente patogénicas. Por exemplo, a S. sanguis, a V. parvula e a C.

ochracea, são reconhecidas como sendo bactérias protectoras ou benéficas ao

hospedeiro, por inibirem o crescimento de bactérias periodontopatogénicas como a

A. actinomycetemcomitans.24 Apesar disso, muitas das bactérias indígenas são

potenciais parasitas ou patogénicos oportunistas que, no caso de entrarem na

circulação sanguínea, poderão provocar infecções graves em órgãos vitais como o

coração ou o cérebro.

1.2.2. Gengivite

A placa bacteriana aumenta com o contínuo crescimento dos organismos aderidos,

com a adesão de novas bactérias e, com a síntese de polímeros extracelulares. Os

resíduos do metabolismo destas bactérias e as próprias bactérias acabam por

afectar a gengiva, causando a sua inflamação.

A gengivite está associada a uma população bacteriana diversificada (10 a 20 vezes

maior à encontrada na flora saudável) com um ligeiro aumento de bactérias Gram-

negativas que, na sua maioria, aderem às bactérias preexistentes na placa

supragengival bacteriana.25

As bactérias Gram-positivas mais predominantes são A. viscosus, A. naeslundii,

S. sanguis, S. mitis e P. micros. Em indivíduos com gengivite foram ainda

encontrados níveis reduzidos de A. actinomycetemcomitans, presença de C.

gingivalis e E. corrodens e um aumento expressivo de F. nucleatum, P. intermedia,

V. parvula e W. recta.24,26,27 Foram observadas ainda nos quadros de gengivite, as

presenças de S. anginosus, C. concisus, T. socranskii, A. naeslundii III e S. sanguis

I.26 Segundo Tanner, Kent e Maiden,28 as bactérias A. georgiae, A. naeslundii, A.


TESE DE MESTRADO 5

israelli, Actinomyces IG, V. parvula, C. ochracea, S. noxia e P. nigrescens

encontram-se directamente associadas com a gengivite.

1.2.3. Periodontite

À medida que a espessura da placa bacteriana continua a aumentar vão sendo

criadas condições anaeróbicas nas camadas mais profundas. Condições estas

responsáveis pelo crescimento e multiplicação de bactérias Gram-negativas nestas

camadas, cujas fontes de nutrientes provêm dos tecidos periodontais e sanguíneo.

Deste modo, e à medida que a placa bacteriana envelhece e se torna madura,

ocorrem mudanças ecológicas que promovem a colonização secundária por

bactérias Gram-negativas anaeróbias estritas.

Socransky et al.,29 identificaram cerca de 30 espécies de bactérias, organizadas em

5 “complexos bacterianos”, que parecem coexistir numa relação favorável (Tabela

1).

Complexo vermelho

Complexo laranja

Complexo verde

Complexo amarelo

Complexo púrpura

P. gingivalis

T. denticola

T. forsythia

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nucleatum

Campylobacter spec. (rectus,

showae, gracilis)

E. nodatum

S. constellatus

E. corrodens

C. concisus

Capnocytophaga spec.

(gingivalis, ochracea, sputigena)

Streptococcus spec. (sanguis, oralis, mitis, gordonii,

intermedius)

Actinomyces odontolyticus

Veillonella parvula

Tabela 1 – Complexos bacterianos (tabela adaptada de Socransky et al29).

A. actinomycetemcomitans, devido ao seu elevado potencial patogénico, foi

posteriormente associada ao complexo vermelho.30

Segundo Feng et. al.31, os complexos verde e amarelo não estão associados a

doenças periodontais, enquanto que o complexo púrpura está associado à

hemorragia à sondagem e em estreita relação com os complexos laranja e

vermelho, fortemente associados com a doença periodontal.


TESE DE MESTRADO 6

As bactérias constituintes do complexo vermelho e A. actinomycetemcomitans, são

consideradas as mais virulentas e com maior poder de destruição do que qualquer

outra espécie do biofilme dental. Estas são capazes de colonizar a placa

infragengival, invadir o organismo e produzir uma elevada carga de proteases e

exotoxinas, capazes de induzir respostas imunitárias altamente destrutivas.31,32

Estas bactérias estão geralmente associadas à forma localizada e generalizada da

Periodontite Agressiva, estando presentes em amostras de placa infragengival e

supragengival, células epiteliais e tecido conjuntivo de pacientes periodontalmente

comprometidos.25

Na Periodontite Crónica, por sua vez, a microbiota é descrita como sendo de maior

diversidade, podendo ser constituída por mais de 150 espécies de bactérias, de

entre as quais se encontra um elevado número de espécies Gram-negativas.

Segundo Moore et al. as bactérias mais predominantes nesta patologia são

P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, W. recta,

E. corrodens, T. denticola e P. micros.33

11..33.. FFaaccttoorreess ddee VViirruullêênncciiaa

Aparentemente o grau de virulência das bactérias presentes na flora oral é um

factor basilar no carácter destrutivo da patologia no hospedeiro. Este é determinado

por uma série de características microbiológicas, de entre as quais a capacidade de

penetrar e aderir às diferentes superfícies,34 a capacidade de interacção com o meio

ambiente, activando ou desactivando determinados factores de virulência35 e a

capacidade de subjugar ou de evitar os mecanismos de defesa do organismo.36,37

De um modo geral, as bactérias Gram-negativas possuem uma parede celular

composta por uma camada de peptidoglicano e três outros componentes que a

envolvem externamente: uma lipoproteína, a membrana externa e um

lipopolissacarídeo (LPS).38 O LPS é uma endotoxina de carácter patogénico, que

activa desproporcionadamente o sistema imunitário e a vasodilatação, induzindo a

produção de moléculas biologicamente activas, tais como as metaloproteinases de

matriz (MPM), as prostaglandinas E2 (PGE2) de monócitos ou macrófagos que, por

sua vez, induzem a libertação de citocinas, como a interleucina 1 beta (IL-1β), a

interleucina 6 (IL-6) e o factor de necrose tumoral alfa (TNF-α).39-41


TESE DE MESTRADO 7

Enquanto que a activação local das MPM latentes produz uma inflamação acelerada

e a destruição do tecido conjuntivo, a libertação de IL-1β, IL-6 e TNF-α são

intermediários importantes na reabsorção óssea local.42

Existem, no entanto, particularidades associadas a determinadas espécies, como as

identificadas no complexo vermelho, que lhes confere um carácter mais virulento. A

A. actinomycetemcomitans, por exemplo, tem uma virulência tal que é capaz de

produzir uma diversidade de factores nocivos ao hospedeiro. De entre os quais a

leucotoxina A, uma toxina capaz de matar os neutrófilos e os macrófagos humanos

por lise celular,43,44 a epiteliotoxina,45 que auxilia o microrganismo a penetrar nas

barreiras epiteliais, a toxina indutora de reabsorção óssea,36 a toxina de distensão

citoletal (CDT),46 conhecida por interromper o ciclo celular bem como por induzir a

apoptose dos linfócitos T e B,47,48 a toxina indutora de apoptose,49 a bacteriocina,

capaz de destruir outras espécies bacterianas e, a colagenase, responsável pela

destruição do colagénio. 22

A A. actinomycetemcomitans também produz o péptido 2-kDa, que induz

directamente a expressão de IL-6 pelos fibroblastos através da estimulação directa

da transcrição do gene IL-6, levando à rápida reabsorção óssea.50

A A. actinomycetemcomitans é um microrganismo Gram-negativo anaeróbio

facultativo.51 A P. gingivalis, por sua vez, é um bacilo Gram-negativo anaeróbio

estrito assacarolítico que possui fímbrias na sua superfície, que a auxiliam na

aderência a células epitéliais,52 fibronectina e fibrinogénio,53 bem como a

componentes salivares, como as proteínas ricas em prolina.54 Existem ainda

registos de que as suas fímbrias se ligam às integrinas αvβ3- e α5β1-, impedindo a

normal resposta e reparação das células, amplificando portanto os danos do tecido

gengival na doença periodontal.55,56 A P. gingivalis também possui a capacidade de

aderir a outras bactérias comensais para formar o biofilme, tal como a S.

gordonii.57 Sabe-se ainda que esta bactéria produz diversas proteases, como a

fosfolipase A, que induz a reabsorção óssea58 e a gingipaína, que degrada

facilmente as proteínas protectoras do hospedeiro, como as imunoglobinas.59,60

Curiosamente, a P. gingivalis possui um LPS com estrutura e interacção pouco

comum, capaz de bloquear o reconhecimento dos agentes patogénicos pelo sistema

imunitário.61-63

A T. denticola possui uma elevada capacidade de aderir a uma grandiosa

diversidade de proteínas celulares e proteínas da matriz, como a fribronectina64 e o

colagénio,65 bem como às células epitéliais,66 à hidróxiapatite (película adquirida)67

e aos fibroblastos.68 Capacidade esta, resultante de uma maior superfície de


TESE DE MESTRADO 8

aderência das suas proteínas.65,69 A T. denticola também tem a capacidade de se

mover em fluidos viscosos, o que, aparentemente, lhe confere vantagem ecológica

uma vez que possibilita a sua penetração nas bolsas periodontais e nos tecidos

adjacentes.70

Diversas espécies da microbiota oral interagem ainda em relações sinergísticas,

facilitando a agregação de outras espécies ou, em relações antagonistas,

prevenindo a agregação ou eliminando a(s) bactéria(s) em causa. Por exemplo, Ali

et al.71 verificaram a presença de P. intermedia em sítios que também albergavam

F. nucleatum, sendo que a presença deste microrganismo favorecia também o

crescimento de P. gingivalis e T. forsythia. Davey et al.72 identificaram ainda uma

relação sinergística entre T. denticola e P. gingivalis, em que ocorria uma

cooperação para o crescimento de ambas durante a formação do biofilme dentário.

Por outro lado, diversos autores afirmam que existe uma relação antagonista entre

A. actinomycetemcomitans e S. sanguis, na medida em que A.

actinomycetemcomitans produz uma bacteriocina que inibe o crescimento de S.

sanguis e esta, por sua vez, produz peróxido de hidrogénio, que destrói a A.

actinomycetemcomitans.73-75

Esta capacidade que a S. sanguis possui em inibir o crescimento da A.

actinomycetemcomitans faz com que seja reconhecida como sendo uma bactéria

protectora ou benéfica ao hospedeiro no seu habitat natural.24

Outros microrganismos também parecem desempenhar papel importante na

patogénese da doença periodontal, apesar de que esse papel não está tão claro

quanto para as espécies descritas acima.76,77 Entre eles destacam-se P.

intermedia,78,79 F. nucleatum,78,80 C. rectus,81,82 Eikenella corrodens,82 M. micros, S.

intermedius80 e espécies de Capnocytophaga.83

11..44.. SSuusscceeppttiibbiilliiddaaddee ggeennééttiiccaa

Apesar de se acreditar que os factores microbiológicos e outros factores ambientais

exercem um papel fundamental na iniciação e progressão da doença periodontal,

existem fortes evidências de que os factores genéticos, na medida em que

modulam a forma como os indivíduos respondem à sua microflora, também

possuem um papel determinante na predisposição e progressão desta

patologia.84-90


TESE DE MESTRADO 9

Entre os factores hereditários reconhecidos como responsáveis por um aumento da

susceptibilidade encontram-se os polimorfismos ao nível da interleucina-1 (IL-1),

uma citocina pro-inflamatória importante na iniciação e mediação das respostas

inflamatórias agudas.91 A IL-1 é produzida por macrófagos activados, células

endoteliais, células epiteliais, fibroblastos e condrócitos. Além de actuar como

mediadora da inflamação local, também pode ter efeitos sistémicos, produzindo

alterações neurológicas, metabólicas, hematológicas e endócrinas. Por isso, para

que da sua actividade não resulte o desenvolvimento de patologias, é importante

que a sua produção se encontre mediada por uma regulação adequada.92

Acredita-se que a IL-1 seja a citocina crucial na patogénese da doença

periodontal.93 Diversos autores observaram níveis elevados desta citocina em

tecidos gengivais de pacientes com periodontite,94-96 facto este que suporta a teoria

de que a produção local desta interleucina contribui para a destruição dos tecidos

periodontais.

A família da interleucina-1 é constituída por 9 genes localizados em cluster no

cromossoma 2. Duas citocinas, IL-1α e IL-1β, resultantes da acção de 2 destes

genes, IL-1A e IL-1B, são responsáveis pelas actividades pro-inflamatórias da

IL-1.97,98 Enquanto que a IL-1α parece concentrar-se na membrana celular, a IL-1β

é secretada para o meio extracelular e parece ser a principal responsável pelas

actividades da IL-1.92 Na família da IL-1 existe ainda um terceiro gene, o IL-1RN,

que controla a síntese da proteína antagonista à IL-1A, a IL-1ra.99,100

Foram estudados alguns polimorfismos da IL-1 relativamente ao risco que estes

podem representar no desenvolvimento e progressão da doença periodontal.101 De

entre esses polimorfismos destacam-se o IL-1A(C-889T) e o IL-1B(C+3954T),

também referido na literatura como +3953.

IL-1A(C-889T) representa o polimorfismo do gene IL-1A que ocorre na posição

-889 do promotor do gene IL-1A, caracterizado pela substituição de uma base

citosina (C) por uma base timina (T), originando dois tipos de alelos possíveis: o

alelo C e o alelo T, também referidos como alelo 1 e alelo 2, respectivamente.102 A

IL-1B(C+3953T), por sua vez, representa o polimorfismo na posição +3953 do

exon 5 do gene IL-1B, caracterizado pela substituição de uma base C por uma T,103

igualmente identificados como o alelo 1 e alelo 2, respectivamente.

Shirodaria et al.104 verificaram que pacientes que possuíam o alelo 2 do

polimorfismo IL-1A(C-889T) apresentavam elevados níveis da proteína IL-1α.

Sendo este aumento 4 vezes maior que o normal em pacientes fumadores com


TESE DE MESTRADO 10

periodontite agressiva. Kornman et al.97 realizaram um estudo com pacientes

europeus fumadores para os polimorfismos IL-1A(C-889T) e IL-1B(C+3953T) e

verificaram que o alelo 2, em ambos os polimorfismos, era significativamente mais

frequente em pacientes com periodontite num estado mais avançado (67%), do

que em pacientes saudáveis ou num estado inicial da patologia (22%). Di Giovani

et al.,105 por sua vez, mostraram que, enquanto os pacientes homozigóticos para o

alelo 1 do gene IL-1B(+3953) produziram cerca de 5,2 ng/ml de IL-1β, quando

estimulados por componentes bacterianos, os pacientes homozigóticos para o

polimorfismo associados à periodontite (alelo 2) produziram cerca de 4 vezes mais

IL-1β do que o normal (19,9 ng/ml). E que os indivíduos em heterozigotia para o

mesmo polimorfismo produziram, aproximadamente, duas vezes mais IL-1β (12,4

ng/ml).

Existem ainda evidências de que a presença simultânea dos dois alelos 2 dos

polimorfismos IL-1A(C-889T) e IL-1B(C+3953T) em pacientes com doença

periodontal, não só aumenta o risco de uma progressão mais agressiva da

patologia, como também proporciona o aumento de microrganismos

patogénicos.97,106 Em ambos os polimorfismos a presença do alelo 2 foi ainda

relacionada à severidade e/ou progressão de algumas doenças. Nomeadamente, a

artrite reumatóide juvenil102 e a doença de Alzheimer107, no caso do polimorfismo

IL-1A(C-889T) e, a asma108 e complicações hepáticas109, para o polimorfismo

IL-1B(C+3953T).

11..55.. PPaattoollooggiiaass SSiissttéémmiiccaass

Como resultado da resposta do tecido local a enzimas e toxinas das bactérias

periodontais no biofilme infragengival, ocorre a ulceração do epitélio da bolsa,

criando uma significativa porta de entrada das bactérias para a circulação

sanguínea. Em condições normais, a entrada de bactérias ou dos seus produtos na

corrente sanguínea, raramente causa sintomas sistémicos, com excepção de um

possível aumento da temperatura do corpo.110 No entanto, em condições

patológicas, em que o sistema imunitário se encontre fragilizado, a presença das

bactérias periodontais pode provocar infecções graves em órgãos vitais.

Segundo Willians e Offenbacher, a Medicina Periodontal é um novo ramo da

Periodontia que relaciona as doenças sistémicas com a doença periodontal,

procurando descrever a forma como a doença periodontal pode influir a saúde


TESE DE MESTRADO 11

sistémica de um indivíduo ou, por outro lado, como o comprometimento sistémico

pode influenciar a saúde periodontal.111

11..55..11.. DDooeennççaass CCaarrddiioovvaassccuullaarreess

Deshpande et. al112 demonstraram que a P. gingivalis pode invadir o coração e as

células endoteliais da aorta de bovinos, assim como as células endoteliais da veia

umbilical do ser humano. As enzimas proteolíticas da P. gingivalis libertadas em

grandes quantidades, podem activar o factor X, a protrombina e a C-Reactina,

aumentando a tendência de trombose. Além disso, esta bactéria apresenta na sua

superfície um antígeno semelhante ao colagénio, capaz de activar e aglutinar

plaquetas e, desse modo, contribuir para uma hipercoagulação e trombose.113 Para

além da P. gingivalis, foram ainda detectadas a presença de P. intermedia, T.

forsythensis e A. actinomycetemcomitans em placas de ateroma.114

Outros estudos demonstraram ainda que indivíduos com periodontite têm maior

probabilidade de desenvolver doenças cardiovasculares115-121 como, por exemplo, a

doença coronária116,119, o enfarte do miocárdio120 e complicações cérebro-

vasculares.115,121

Pensa-se que muitos mecanismos podem contribuir para a associação entre a

doença periodontal e as doenças cardiovasculares, tais como: a acção directa dos

agentes infecciosos na formação do ateroma, a predisposição genética e outros

factores de risco em comum para estas patologias.122,123 No entanto, não está ainda

determinado, com exactidão, qual o mecanismo que as relaciona.

11..55..22.. DDiiaabbeetteess MMeelllliittuuss

A diabetes mellitus é uma deficiência metabólica caracterizada pela hiperglicemia

(elevada taxa de açúcar no sangue), que resulta da diminuição ou ausência de

secreção de insulina. A longo prazo as complicações podem afectar os olhos, os

rins, os nervos, os vasos sanguíneos e o periodonto.124

Diversos estudos revelam que indivíduos com diabetes mellitus não só têm um

elevado risco de sofrer de Doença Periodontal, como também, quando presente,

esta patologia apresenta-se na vertente mais rápida e agressiva.11,125,126

Outros estudos demonstraram ainda que, ao submeter pacientes diabéticos a um

tratamento periodontal, não só se verificaram melhorias no estado periodontal,

como também estas melhorias estavam associadas a uma diminuição da

necessidade de insulina até 50%.127-129 Especialmente nos casos de pacientes


TESE DE MESTRADO 12

diabéticos mal controlados, o tratamento periodontal resultou numa melhoria do

controlo metabólico.11

11..55..33.. IInnffeeccççõõeess RReessppiirraattóórriiaass

As doenças respiratórias infecciosas, tal como a pneumonia e a bronquite são

doenças comuns de elevado custo, principalmente em pacientes hospitalizados e

idosos. Pensa-se que a infecção respiratória esteja associada, pelo menos em

parte, à aspiração de bactérias orofaríngeas para o trato respiratório inferior e falha

do mecanismo de defesa do hospedeiro, no que respeita à eliminação das bactérias

contaminantes.130

Terpenning et. al131 demonstraram que, quando a P. gingivalis estava presente na

placa bacteriana e na saliva de pacientes idosos, existia um risco maior sofrerem de

pneumonia por aspiração.

Outros estudos evidenciam ainda a existência de uma relação entre a Doença

Periodontal e o risco acrescido de desenvolver pneumonia bacteriana, bem como o

risco de desenvolver uma Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica.132-134

11..55..44.. PPaarrttoo PPrreemmaattuurroo

O nascimento de bebés de baixo peso continua a ser a principal causa de

morbilidade perinatal. Muitos são os factores que podem estar relacionados com o

nascimento de bebés prematuros com baixo peso, como a idade, o peso, o

tabagismo, as infecções genitourinárias, a hipertensão, etc.

Os produtos bacterianos como o lipopolissacarídeo, presente na membrana

bacteriana, e os produtos da reacção inflamatória do próprio paciente, como o

TNF-α e a PgE2, têm sido identificados como os principais elos de ligação entre a

doença periodontal e o parto prematuro.135

Trabalhos realizados em animais revelaram que a presença de P. gingivalis

aumentava o número de mortes fetais e diminuía o peso do recém-nascido.136 De

igual modo, grande parte dos estudos clínicos realizados em humanos tem apoiado

esta teoria de que a doença periodontal pode ser um factor significante para o

nascimento de uma criança prematura.137-140 No entanto, existem outros estudos

que não confirmam esta associação.141-144


TESE DE MESTRADO 13

Resumidamente, numa perspectiva de cuidados de saúde, a prevenção e o

tratamento da periodontite pode revelar-se importante, não só no que respeita à

saúde oral, como à prevenção no agravamento de patologias sistémicas.

II..22.. DDIIAAGGNNÓÓSSTTIICCOO BBAACCTTEERRIIAANNOO

Existem 3 passos fundamentais na Medicina Dentária: o diagnóstico, o tratamento

e os procedimentos de reabilitação oral.145

O diagnóstico tradicional da doença periodontal é normalmente realizado através da

análise de uma série de informações recolhidas do paciente durante a realização do

exame periodontal. De entre as quais os dados pessoais (idade, sexo, etc.), o

historial médico, o historial de eventuais complicações periodontais, a sondagem

periodontal (isto é, a medição da profundidade clínica das bolsas periodontais, da

perda de inserção clínica, hemorragia à sondagem, etc.), a visualização radiográfica

do nível de suporte ósseo periodontal e, outras observações consideradas

importantes, como por exemplo, o grau de inflamação, a presença de placa

bacteriana, de cálculos dentários, a mobilidade dentária, etc.146

O tratamento consiste na remoção mecânica da placa supra e infragengival, higiene

oral e, em alguns casos, cirurgia periodontal e tratamento com agentes

antimicrobianos locais ou sistémicos.145

A reabilitação oral é feita apenas quando a saúde oral é restabelecida. Nesta etapa

recorre-se à regeneração periodontal com a utilização, entre outros, de enxertos

ósseos e à colocação de implantes dentários para compensar as perdas

dentárias.147

A identificação das bactérias presentes na flora bucal do doente, mais

especificamente nas bolsas periodontais, pode tornar-se numa ferramenta, não só

de extrema importância na selecção do tratamento mais adequado ao indivíduo,

como também, de grande interesse no acompanhamento da evolução do

tratamento aplicado ao paciente. Consoante as espécies de bactérias detectadas

pode ser aplicada uma terapia mais dirigida com antisépticos ou antibióticos

específicos mais adequados ao tratamento, aumentando assim a eficácia.147 Por

exemplo, sabe-se que a A. actinomycetemcomitans não é susceptível à terapia com

clindamicina,148 pelo que quando é necessário erradicar este agente existem outros

antibióticos, como a amoxicilina, que revelam maior eficácia.149-154


TESE DE MESTRADO 14

O diagnóstico bacteriano pode ser especialmente útil antes de definir qual o

tratamento a aplicar a um doente com periodontite agressiva, ou no

acompanhamento de familiares de pacientes com periodontite agressiva, uma vez

que podem ser susceptíveis de contrair a mesma patologia em tenra idade, bem

como nos casos de periodontite refractária, ou seja nos casos em que ocorre a

perda rápida de inserção clínica e reabsorção óssea mesmo sob terapia intensiva.

Pode ainda ser útil realizar um diagnóstico bacteriano, especialmente em pacientes

com um historial de periodontite, antes de aplicar implantes dentários, de forma a

garantir a eliminação das bactérias exógenas e reduzir a possibilidade de infecção

peri-implantária, que pode vir a resultar na perda do implante.

Em pacientes com recorrência da patologia pode-se ainda efectuar ao diagnóstico

bacteriano, a qualquer momento do tratamento, de forma a fazer um ponto de

situação da etiologia e readaptar, se necessário, o tratamento às necessidades do

paciente.147

Existe uma elevada diversidade de métodos que podem ser utilizados na detecção

e/ou identificação de bactérias. Temos, por exemplo, as técnicas microscópicas, a

cultura bacteriana, os testes imunológicos, as técnicas moleculares, entre outros.

As técnicas microscópicas de fundo escuro e de contraste de fase permitem

distinguir diferenças de tamanho, forma e mobilidade dos microrganismos

presentes na placa bacteriana, no entanto não permitem diferenciar entre as

espécies bacterianas.155-159 A cultura bacteriana, por sua vez, é capaz de identificar

os diversos microrganismos periodontais, podendo também ser utilizada em

estudos de susceptibilidade bacteriana aos diferentes antibióticos.160-162 Por outro

lado, o facto de muitas bactérias serem de difícil cultivo,163 desta técnica incluir

inúmeros passos, de ser de custo elevado e de ser necessário 10 ou mais dias para

obter os resultados finais,164 faz com que esta metodologia não seja de eleição

quando se pretende um método sensível e rápido para a análise simultânea de um

elevado número de amostras.

Os testes imunológicos, como a imunofluorescência, a reacção de ELISA e a

citometria de fluxo, baseiam-se na utilização de anticorpos específicos contra

antigénios do microrganismo a identificar. São métodos mais rápidos e sensíveis

que a cultura bacteriana,165,166 no entanto, a principal desvantagem prende-se com

o facto de poderem existir reacções cruzadas que levam à existência de falsos

positivos. Por exemplo, sabe-se que as bactérias do grupo Haemophili ligam-se aos

anticorpos utilizados para a detecção de A. actinomycetemcomitans. 167


TESE DE MESTRADO 15

Em contrapartida, as técnicas moleculares, baseadas sobretudo na análise de DNA

e RNA, permitem identificar com maior sensibilidade os microrganismos

periodontais. Estas metodologias não requerem que as bactérias estejam vivas

para a sua detecção, pelo que não são necessárias condições especiais de

transporte de amostras para manter viáveis as bactérias. De entre as diversas

técnicas moleculares existentes, a reacção em cadeia de polimerase (PCR, do inglês

Polimerase Chain Reaction) é uma metodologia que merece destaque. Esta permite

a amplificação enzimática in vitro de fragmentos específicos de DNA, explorando a

capacidade de duplicação do DNA. Nesta reacção é usada uma cadeia simples de

DNA como molde para a síntese de novas cadeias complementares sob a acção de

uma enzima termoestável, a Taq polimerase do DNA. Esta enzima é capaz de

adicionar os nucleótidos presentes na reacção, segundo a cadeia molde, na

presença de iniciadores ou primers específicos (sequências de DNA de cadeia

simples), desenhados de modo a serem complementares às extremidades 3’ das

cadeias do fragmento de DNA alvo.168

Recentemente foi desenvolvida uma variante da reacção de PCR, a metodologia de

PCR em tempo real que, por sua vez, combina no mesmo aparelho, a amplificação

e a detecção dos segmentos específicos do DNA, pelo que dispensa a necessidade

de visualização dos amplicons em sistemas de gel. Esta técnica baseia-se sobretudo

na monitorização dos produtos de amplificação através da utilização de um

fluorócromo, ao ligar-se às moléculas de DNA de cadeia dupla amplificada, emite

fluorescência, permitindo a sua detecção e visualização no sistema computacional

acoplado ao aparelho. Este aumento de fluorescência é proporcional à quantidade

de DNA amplificado.169

A reacção de PCR em tempo real destaca-se por ser uma técnica rápida, específica

e de elevada sensibilidade (limite de detecção de 5 cópias), que requer apenas um

processamento simples da amostra. Para além de que não são necessárias análises

pós-PCR para a detecção dos microrganismos, o que diminui a possibilidade de

existir uma contaminação cruzada dos produtos de PCR.170 Estas vantagens são

especialmente importantes em situações de diagnóstico, onde o resultado tem que

ser rápido e específico.

Deve-se referir ainda que, numa perspectiva de procurar garantir a eficácia do

tratamento periodontal, o diagnóstico microbiano pode ainda ser complementado

com dados relativos ao grau da resposta imunitária de cada paciente, revelador da

susceptibilidade do indivíduo para uma progressão mais agressiva ou mais

controlada da doença. Desta forma, a associação do diagnóstico microbiano à


TESE DE MESTRADO 16

detecção de polimorfismos genéticos relacionados com a progressão da

periodontite, pode vir a ser uma mais-valia para a adequação do tratamento e

acompanhamento posterior do paciente.


TESE DE MESTRADO 17

II..33.. OOBBJJEECCTTIIVVOOSS DDOO TTRRAABBAALLHHOO

Dada a importância da análise microbiológica nos pacientes com periodontite,

pretende-se optimizar um método molecular que permita, através da análise de

ácidos nucleicos, identificar os microrganismos patogénicos presentes na cavidade

bucal dos pacientes. Para isso, pretende-se utilizar uma metodologia de PCR em

tempo real para a identificação de 5 bactérias que contribuem para a iniciação e/ou

progressão de diversas formas de periodontite, nomeadamente a Porphyromonas

gingivalis, a Tannerella forsythia, a Actinobacillus actinomycetemcomitans, a

Treponema denticola e a Prevotella intermedia. Estas bactérias, em particular as

que fazem parte do complexo vermelho, são consideradas por vários autores como

sendo as mais virulentas e com maior poder de destruição do que qualquer outra

espécie do biofilme dental.31,32

Por outro lado, o trabalho desenvolvido tem também como intuito estudar dois

polimorfismos do gene IL-1, nomeadamente os polimorfismos IL-1A(C-889T) e

IL-1B(C+3954T), que têm vindo a ser relacionados com uma maior susceptibilidade

de desenvolvimento da doença.

18

II. Material e Métodos

“Não existem erros. Os acontecimentos que atraímos a nós,

por mais desagradáveis que sejam, são necessários para aprendermos

o que necessitamos de aprender. Todos os passos que damos

são necessários para chegarmos aonde escolhemos chegar.”

Richard Bach em A Ponte para a EternidadeA Ponte para a EternidadeA Ponte para a EternidadeA Ponte para a Eternidade

UNIVERSIDADE DE AVEIRO MATERIAL E MÉTODOS

TESE DE MESTRADO 19

IIII.. MMAATTEERRIIAALL EE MMÉÉTTOODDOOSS

IIII..11.. SSEELLEECCÇÇÃÃOO DDEE PPAACCIIEENNTTEESS

As amostras infragengivais foram obtidas de indivíduos que recorreram às

consultas de Estomatologia da Faculdade de Medicina Dentária da Universidade de

Coimbra, após consentimento informado (Anexo 1).

O projecto de investigação foi submetido à comissão de ética para a saúde dos

Hospitais da Universidade de Coimbra, tendo sido aprovado.

Foram seleccionados um total de 20 indivíduos para o estudo, tendo em conta os

critérios de inclusão e exclusão previamente definidos (Anexo 2). No grupo teste

(n=14) todos os indivíduos evidenciaram a presença de bolsas periodontais com

profundidade de sondagem>5mm, com perda de inserção clínica e com hemorragia

à sondagem, em pelo menos um dente em cada quadrante. O grupo de controlo

(n=6) foi constituído por indivíduos não afectados por periodontite.

Nenhum dos doentes ou controlos possuíam doenças sistémicas que pudessem

afectar a situação periodontal nem tiveram terapêutica antibiótica há menos de 6

meses e terapêutica periodontal há menos de 1 ano.

As amostras de saliva foram obtidas por auto-colheita de 4 voluntários saudáveis,

após consentimento informado.

IIII..22.. CCOOLLHHEEIITTAA DDEE AAMMOOSSTTRRAASS

As amostras infragengivais foram colhidas recorrendo a pontas de papel #45

esterilizadas da Unidente. Para cada indivíduo seleccionado foram utilizadas cerca

de 8 pontas para a colheita, duas por quadrante, tendo em conta o local mais

afectado e tentando evitar locais muito hemorrágicos, no caso dos doentes.

Para evitar contaminação cruzada, a colheita foi feita após a limpeza e secagem da

superfície supragengival. De seguida a ponta de papel esterilizada foi colocada na

bolsa periodontal em toda a sua profundidade e deixada ficar por 10 segundos

(Figura 1). Após remoção da ponta, foi colocada uma outra ponta no mesmo local

por mais 10 segundos. As pontas foram depois colocadas num único tubo

esterilizado e transportadas à temperatura ambiente para o laboratório. Sempre

que as amostras não eram processadas de imediato armazenavam-se a -20ºC.


TESE DE MESTRADO 20

Figura 1 – Recolha de placa bacteriana infragengival.

Na colheita de amostras de saliva os indivíduos realizaram uma auto-raspagem das

bochechas com os dentes durante um minuto antes de colher a saliva (mínimo

5mL) para um tubo estéril.

IIII..33.. EEXXTTRRAACCÇÇÃÃOO DDEE DDNNAA DDEE AAMMOOSSTTRRAASS IINNFFRRAAGGEENNGGIIVVAAIISS

33..11.. CCoomm oo kkiitt QQIIAAaammpp®® DDNNAA MMiinnii KKiitt

A extracção de DNA das amostras infragengivais com o kit QIAamp® DNA Mini Kit

da QIAGEN foi efectuada de acordo com as indicações do fabricante, utilizando o

protocolo para sangue e fluidos corporais, com ligeiras modificações.

Combinou-se, por amostra, 180µL de Tampão ATL e 20µL de Proteinase K num

tubo e misturou-se. Adicionou-se 200µL dessa solução um novo tubo contendo as

pontas de papel e, após homogeneização por 30 segundos, a mistura foi incubada a

70ºC por 10 min. Posteriormente foi adicionado 200µL de Tampão AL, a mistura foi

homogeneizada durante 15 segundos e incubada a 95ºC por 5min. Adicionou-se

200µL de Etanol a 99%, homogeneizou-se por 15 segundos e fez-se um spin breve.

A mistura foi depois transferida para uma coluna identificada. Após centrifugação a

6000g durante 1min, a solução foi descartada e a coluna foi reinserida num novo

tubo. Procedeu-se à adição de 500µL de Tampão AW1 e nova centrifugação a

6000g durante 1min. A solução foi descartada, a coluna reinserida num novo tubo,

foi adicionado 500µL de Tampão AW2 e, procedeu-se à centrifugação da coluna à

velocidade máxima por 3min. Foi descartado o tubo de recolha e a coluna

reinserida num novo tubo para centrifugar 1min à velocidade máxima. O tubo foi,

de novo, descartado e a coluna foi colocada num novo tubo identificado. Foi

adicionado Tampão AE (200µL para a extracção de DNA a partir de 1 ou 2 pontas


TESE DE MESTRADO 21

de papel e 400µl para a extracção de DNA a partir de 3 ou 4 pontas), deixou-se

incubar à temperatura ambiente por 1min e centrifugou-se a 6000g durante 1min.

A coluna foi descartada e a amostra de DNA foi armazenada a -20ºC até à sua

análise.

33..22.. CCoomm aa mmaattrriizz IInnssttaaGGeenneeTTMM MMaattrriixx

A extracção de DNA das amostras infragengivais com a matriz InstaGeneTM Matrix

da BIO-RAD foi realizada de acordo com as indicações do fabricante, utilizando o

protocolo para a preparação de DNA de bactérias, com algumas modificações.

As pontas de papel (2 a 8) foram colocadas em 1mL de água estéril autoclavada

num tubo identificado, homogeneizadas num vortex e centrifugadas durante 1min a

11.000rpm. O sobrenadante e as pontas foram removidos, adicionou-se 200µL de

Matriz InstaGeneTM Matrix ao precipitado e o produto foi incubado a 56ºC durante

30min. Homogeneizou-se durante 10 segundos e colocou-se o tubo a incubar a

100ºC durante 8 min. Voltou-se a homogeneizar a amostra por 10 segundos e

centrifugou-se a 11.000rpm durante 3min. Foi retirado o sobrenadante para um

novo tubo identificado e a amostra de DNA foi guardada a -20ºC até à sua análise.

IIII..44.. EEXXTTRRAACCÇÇÃÃOO DDEE DDNNAA DDEE AAMMOOSSTTRRAASS DDEE SSAALLIIVVAA

A extracção de DNA das amostras de saliva foi realizada recorrendo ao método de

extracção com a matriz InstaGeneTM Matrix da BIO-RAD, consoante descrito no

ponto anterior para a extracção de DNA de amostras infragengivais (3.2), com a

excepção de que, no primeiro passo, a saliva era logo centrifugada a 11.000rpm

durante 3min.

IIII..55.. QQUUAANNTTIIFFIICCAAÇÇÃÃOO DDEE DDNNAA

A quantidade e a pureza das amostras de DNA foram determinadas pela leitura da

densidade óptica a 260nm e 280nm num espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000

UV-Vis da ThermoScientific, de acordo com as especificações do fabricante.


TESE DE MESTRADO 22

IIII..66.. RREEAACCÇÇÕÕEESS DDEE AAMMPPLLIIFFIICCAAÇÇÃÃOO PPOORR PPCCRR CCOONNVVEENNCCIIOONNAALL

As reacções de amplificação por PCR convencional foram realizadas num

termociclador AB 9800 Fast PCR da Applied Biosystems.

Os primers utilizados para a detecção dos microrganismos e para a detecção dos

polimorfismos foram sintetizados pela empresa alemã MWG GmbH e encontram-se

descritos nos capítulos III.2 e III.3, respectivamente.

Para a detecção dos microrganismos periodontais (Aa, Pi, Pg, Td e Tf) foram

misturados sequencialmente num tubo apropriado, 5µl de tampão de PCR sem

MgCl2 (10x), 4µL de dNTPs com dUTP (stock 2,5mM), 2µL de MgCl2 (stock 50mM),

0,5µL de cada primer (stock 30µM), 0,3µL de Taq platina (5U/µL) da Invitrogen e

20µL de amostra de DNA. O volume final da reacção de amplificação foi de 50µL.

As condições de amplificação foram as descritas na Figura 2. Um passo inicial de

5min de desnaturação a 95ºC, seguido por 10 ciclos de desnaturação a 95ºC por

30s e annealing a 58ºC por 2min, mais 20 ciclos de desnaturação a 95ºC durante

25s, annealing a 53ºC a 40s e a extensão a 70ºC durante 40s. No final, a extensão

a 70ºC foi prolongada por 8min.

95ºC 95ºC 95ºC 05:00 00:30 0:25 70ºC 70ºC

58ºC 0:40 8:00

02:00 53ºC

00:40

x 10 ciclos x 20 ciclos

Figura 2 – Programa de amplificação por PCR convencional para a detecção dos

microrganismos periodontais.

Para a detecção dos polimorfismos IL-1A(C-889T) e IL-1B(C+3953T), regra geral,

foram misturados sequencialmente num tubo apropriado, 5µl de tampão de PCR

sem MgCl2 (10x), 4µL de dNTPs com dUTP (stock 2,5mM), 2µL de MgCl2 (stock

50mM), entre 0,5 e 1,5µL de cada primer (stock 30µM), 0,3µL de Taq platina

(5U/µL) da Invitrogen e 20µL de amostra de DNA, num volume final de 50µL.

As condições de amplificação foram as que se encontram na Figura 3. Um passo

inicial de 3min de desnaturação a 94ºC, seguido por 45 ciclos de desnaturação de


TESE DE MESTRADO 23

94ºC durante 30s, annealing a 52 ou 56ºC por 40s e extensão a 72ºC durante

1min. No final a extensão a 72ºC foi prolongada por 5min.

94ºC 94ºC 03:00 00:30 72ºC 72ºC 52 ou 56 ºC 01:00 5:00

00:40

x 45 ciclos

Figura 3 – Programa de amplificação por PCR convencional para a detecção conjunta dos

polimorfismos IL-1A(C-889T) e IL-1B(C+3953T).

Para a detecção do polimorfismo IL-1A(C-889T) foram ainda testadas as seguintes

condições de amplificação: um passo inicial de desnaturação a 96ºC durante 1min,

seguido por 40 ciclos de desnaturação a 96ºC por 1min, annealing a 46ºC por 1min

e extensão a 72ºC durante 1min. No final a extensão a 72ºC foi prolongada por

4min.171

IIII..77.. RREEAACCÇÇÕÕEESS DDEE AAMMPPLLIIFFIICCAAÇÇÃÃOO PPOORR PPCCRR EEMM TTEEMMPPOO RREEAALL

As reacções de amplificação por PCR em tempo real foram efectuadas num sistema

AB 7300 real time PCR da Applied Biosystems.

Num volume final de 25µL foi adicionado, sequencialmente, 12,5µl da mistura

reaccional Power SYBR Green® da Applied Biosystems (2x) e 0,25µL de cada primer

(stock 10µM) e 5 a 6µL de DNA.

As condições de amplificação usadas estão apresentadas na Figura 4. Um passo

inicial de 10min de desnaturação a 95ºC, seguido por 35 ou 50 ciclos a 95ºC por

15s e a 60ºC por 1min. No final dos ciclos de amplificação foi acrescentado um

programa para a curva de dissociação, tal como indicado na figura.

95ºC 95ºC 95ºC 95ºC

10:00 00:15 60ºC 00:15 60ºC 00:15

01:00 01:00

x 35 ou 50 ciclos Curva de dissociação

Figura 4 – Programa de amplificação por PCR em tempo real para a detecção dos

microrganismos periodontais.


TESE DE MESTRADO 24

IIII..88.. DDIIGGEESSTTÃÃOO DDOO DDNNAA CCOOMM EENNZZIIMMAASS DDEE RREESSTTRRIIÇÇÃÃOO

88..11.. DDiiggeessttããoo ccoomm NNccooII

A 20µL de amostra adicionou-se 3µL de tampão de enzima 10x concentrado e

0,2µL de enzima NcoI (10 U/µL) da New England Biolabs. A esta mistura foi

adicionada água ultra pura para um volume final de 30µL. A reacção decorreu a

37ºC durante 1h30min e terminou com a inactivação da enzima a 65ºC durante

20min.

88..22.. DDiiggeessttããoo ccoomm TTaaqqααααααααII

A 20µL de amostra adicionou-se 3µL de tampão de enzima 10x concentrado, 0,3µL

de BSA (100µg/mL) e 0,3µL de enzima NcoI (20 U/µL) da New England Biolabs. A

esta mistura foi adicionada água ultra pura para um volume final de 30µL. A

reacção decorreu a 65ºC durante 1h30min e terminou com a inactivação da enzima

a 80ºC durante 20min.

IIII..99.. CCOONNCCEENNTTRRAAÇÇÃÃOO DDAASS AAMMOOSSTTRRAASS

As amostras foram colocadas num concentrador a vácuo Savant DNA120 da

Thermo Electron Corporation e deixadas a concentrar (~10x) durante,

aproximadamente, 10min, com uma taxa de secagem (dry rate) de 43ºC.

IIII..1100.. EELLEECCTTRROOFFOORREESSEE EEMM GGEELL DDEE AAGGAARROOSSEE

A electroforese em gel de agarose foi realizada da seguinte forma: Para um gel de

2%, dissolveu-se 1g de agarose em 50ml de TAE 1x (40mM Tris/acetato; 1mM

EDTA) e deixou-se arrefecer. Juntou-se 5µL de brometo de etídeo (10mg/mL) e

colocou-se a solução no suporte de electroforese, deixando a agarose polimerizar.

Preparou-se depois a tina de electroforese, enchendo-a com tampão TAE 1X até

cobrir o gel. Retirou-se o pente cuidadosamente e aplicou-se as amostras e os

marcadores de peso molecular conhecido. Ao preparar as amostras adicionou-se

1/10 do seu volume de tampão 10x concentrado (0,1 M EDTA pH 8,0; 1% SDS;

20% Ficoll 400; 0,25% azul de bromofenol; 0,25% xileno cianol). Este tampão

confere a densidade à amostra e permite controlar a migração das amostras no


TESE DE MESTRADO 25

decorrer da electroforese. Para um gel de agarose de cerca de 90cm2, aplicou-se

uma diferença de potencial de 120V durante 30min.

IIII..1111.. EELLEECCTTRROOFFOORREESSEE CCAAPPIILLAARR

A análise dos produtos de digestão com a enzima NcoI foi feita, por electroforese

capilar, num bioanalisador Agilent 2100 Bioanalyzer da Agilent Thecnologies,

segundo as instruções do fabricante (protocolo Agilent DNA 1000 Kit Guide),

utilizando 1µL de amostra e o microchip agilent DNA 1000.

IIII..1122.. AANNÁÁLLIISSEE DDEE DDNNAA PPOORR HHIIBBRRIIDDAAÇÇÃÃOO RREEVVEERRSSAA ((KKIITT MMIICCRROO--IIDDEENNTT®®))

A análise de DNA por hibridação reversa foi feita recorrendo ao kit micro-IDent® da

HAIN Lifescience consoante as especificações do fabricante no protocolo

micro-IDent® – Teste de Genética Molecular para a Identificação de Cinco Espécies

Bacterianas Periodontopatogénicas.

O teste micro-IDent® permitiu a identificação genética combinada de cinco espécies

bacterianas periodontopatogénicas, nomeadamente Actinobacillus

actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia,

Tannerella forsythia e Treponema denticola.

O procedimento completo é dividido em 3 passos: extracção de DNA a partir de

amostras infragengivais, uma amplificação multiplex com primers biotinilados e

uma hibridação reversa.

A hibridação inclui os seguintes passos: desnaturação química dos produtos de

amplificação; hibridação dos amplicons, em cadeia única e marcados com biotina,

às sondas ligadas à membrana; lavagem adstringente; adição de um conjugado de

streptavidina/fosfatase alcalina e, finalmente, uma reacção com produção de cor

mediada pela fosfatase alcalina. Um modelo, incluído no kit, assegura uma

interpretação fácil e rápida do padrão de bandas obtido.

26

III. Resultados e Discussão

“Não é o desafio que define quem somos

nem o que somos capazes de fazer.

O que nos define é o modo como enfrentamos esse desafio:

podemos deitar fogo às ruínas, ou construir um caminho através delas,

passo a passo, rumo à liberdade.”

Richard Bach em Nada ao AcasoNada ao AcasoNada ao AcasoNada ao Acaso

UNIVERSIDADE DE AVEIRO RESULTADOS E DISCUSSÃO

TESE DE MESTRADO 27

IIIIII.. RREESSUULLTTAADDOOSS EE DDIISSCCUUSSSSÃÃOO

Neste trabalho pretendeu-se optimizar um método molecular – baseado na reacção

de PCR – para detecção de microrganismos patogénicos associados à periodontite e

ainda analisar dois polimorfismos (dos genes IL1A e IL1B) associados à progressão

e severidade da doença.

A metodologia deverá ser utilizada na rotina laboratorial, pelo que a selecção das

técnicas envolvidas nas diferentes etapas irá depender da sensibilidade e

reprodutibilidade analítica das mesmas e ainda de outros factores, tais como:

tempo e facilidade da técnica, a possibilidade de automatização, a minimização dos

riscos de contaminação com moléculas resultantes do PCR e os custos associados.

Para além da parte analítica, inerente às metodologias de análise escolhidas e

respectivas técnicas de detecção (electroforese, fluorescência, hibridação, etc.),

outros aspectos tiveram que ser considerados, nomeadamente o tipo de amostra

biológica que se iria testar, como seria efectuada a extracção dos ácidos nucleicos

da amostra, o número e tipo de testes que se pretendia realizar a partir da mesma

amostra e, finalmente, como é que os resultados dos diferentes testes poderiam ser

integrados (Figura 5). No caso concreto são dois os testes a implementar, a

detecção de microrganismos periodontais (Análise 1) e a análise dos polimorfismos

IL-1A(C-889T) e IL-1B(C+3953T) (Análise 2), que preferencialmente deverão ser

efectuados a partir da mesma amostra biológica e, se possível, recorrendo ao

mesmo método de extracção.

Tipo de amostra

Extracçãodos ácidos nucleicos

Fase analítica

Análise e detecção

Análise 1

Integração de resultados

ETAPA A

ETAPA B

ETAPA C ETAPA D

Análise 2

Tipo de amostra

Extracçãodos ácidos nucleicos

Fase analítica

Análise e detecção

Análise 1

Integração de resultados

ETAPA A

ETAPA B

ETAPA C ETAPA D

Análise 2

Figura 5 – Diagrama para implementação de dois novos testes no laboratório de diagnóstico

molecular e respectivo faseamento (Etapas A, B, C e D). Análise 1 – Detecção de

microrganismos periodontais. Análise 2 – Análise dos polimorfismos IL-1A(C-889T) e

IL-1B(C+3954T).


TESE DE MESTRADO 28

Neste trabalho a discussão dos resultados encontra-se estruturada em quatro

capítulos principais: selecção do tipo de amostra e do método de extracção de DNA,

detecção de microrganismos periodontais, análise dos polimorfismos IL-1A(C-889T)

e IL-1B(C+3954T) e caracterização microbiológica e susceptibilidade genética dos

pacientes estudados. Estes capítulos correspondem às etapas A, B, C e D indicadas

na figura acima.

IIIIII..11.. SSEELLEECCÇÇÃÃOO DDOO TTIIPPOO DDEE AAMMOOSSTTRRAA EE DDOO MMÉÉTTOODDOO DDEE EEXXTTRRAACCÇÇÃÃOO DDEE DDNNAA

Existem fortes evidências de que o início da periodontite ocorre nas bolsas

periodontais e que os microrganismos são os principais factores responsáveis pelo

seu desenvolvimento. Deste modo, a monitorização da ocorrência de bactérias

periodontopatogénicas através da análise de amostras das bolsas periodontais é

considerada como uma metodologia razoável no controlo da patologia.78,150,172-176

Assim, optou-se por analisar amostras infragengivais, colhidas com pontas de papel

estéreis para a detecção dos microrganismos periodontais e ainda para o estudo

dos polimorfismos IL1-A(C-889T) e IL-1B(C+3954T), associados à periodontite.

Para além da placa bacteriana, estas amostras deverão também conter células

epiteliais dos pacientes, o que permitirá o isolamento do DNA genómico para a

análise da susceptibilidade genética.

As amostras infragengivais foram obtidas de indivíduos que recorreram às

consultas de Estomatologia da Faculdade de Medicina Dentárias da Universidade de

Coimbra, tendo em conta rigorosos critérios de rejeição e inclusão (Anexo 2).

Foram testados 2 métodos de extracção distintos: o QIAamp® DNA Mini Kit da

QIAGEN e a matriz InstaGeneTM Matrix da BIO-RAD, ambos com diferenças

marcantes no modo e tempo de processamento, bem como nos custos associados.

O kit QIAamp® DNA Mini Kit permite a purificação de mais de 50µg de DNA a partir

de amostras biológicas variadas. A amostra é sujeita a uma lise celular, mediada

pela proteinase K, de seguida passa por uma coluna de sílica, à qual se ligam os

ácidos nucleicos e, após algumas lavagens com um tampão apropriado, o DNA é

finalmente, eluído da coluna. Por outro lado, o método de extracção da BioRad com

a matriz InstaGeneTM Matrix consiste simplesmente numa lise celular por incubação

da amostra na presença da matriz, a diversas temperaturas. Neste método,

relativamente mais rápido e simples que o anterior, os produtos da lise celular, que


TESE DE MESTRADO 29

interferem com a amplificação de PCR, ligam-se à matriz, enquanto o DNA

permanece solubilizado no sobrenadante, que posteriormente é separado da matriz.

Uma mesma amostra foi processada em simultâneo, utilizando os 2 métodos de

extracção acima referidos. As pontas de papel, usadas na colheita de amostra

infragengival, foram colocadas num tubo com 1mL de água ultra pura e agitadas

num vortex durante 15 minutos, de modo a libertar todos os constituintes celulares

e bacterianos. Desta mistura homogénea, metade foi extraída com a matriz

InstaGeneTM Matrix e a outra metade foi extraída com o Kit QIAamp® DNA Mini Kit,

de acordo com as indicações dos fabricantes. O volume de amostra de DNA obtido

no final de cada protocolo de extracção foi de 180 µL com a InstaGeneTM Matrix e

400µL com o QIAamp® DNA Mini Kit.

A pureza do DNA, bem como a quantificação das amostras, foi efectuada pela

leitura de absorvância a 260nm e 280nm, tal como descrito no capítulo II.5.

A concentração da amostra de DNA isolada com o QIAamp® DNA Mini Kit foi de

6,16 ng/µL e a razão entre as leituras de absorvância a 260nm e a 280nm foi de

1,11. No caso da amostra de DNA obtida com a matriz InstaGeneTM Matrix a

concentração de DNA foi de 8,68 ng/µL e a razão entre as leituras de absorvância a

260nm e a 280nm foi de 1,36. A razão das absorvâncias a 260nm e a 280nm indica

o grau de pureza do DNA, devendo ser de, aproximadamente, 1,8 para soluções

puras. Em ambas as amostras, a razão 260/280 aponta para que possam estar

presentes proteínas e/ou outras substâncias. A concentração de DNA, apesar de

baixa, é semelhante para os dois casos.

As duas amostras de DNA foram posteriormente analisadas por PCR, quer para a

presença de bactérias periodontais, quer para análise dos polimorfismos genéticos

(capítulos III.2 e III.3), não tendo sido observadas diferenças nas reacções de

amplificação. Desta forma, o método de extracção escolhido, para analisar as

restantes amostras, foi a matriz InstaGeneTM Matrix. Esta metodologia adequa-se

melhor a um trabalho de rotina, não só porque apresenta um custo menos elevado,

mas também porque é de execução mais prática e rápida. Acresce que, o facto de

não ser necessário transferir o sobrenadante inúmeras vezes ao longo do processo,

como acontece com o QIAamp® DNA Mini Kit, reduz ainda a possibilidade de

contaminação entre amostras.


TESE DE MESTRADO 30

Depois de optimizadas as condições de detecção dos microrganismos periodontais e

dos polimorfismos genéticos em amostras colhidas para pontas de papel (capítulos

III.2 e III.3), foi também estudada a hipótese de realizar outro tipo de colheita,

nomeadamente saliva, de forma a facilitar a colheita deste tipo de amostras e,

quem sabe, equacionar a possibilidade de uma auto colheita para o diagnóstico.

O uso da saliva como método de diagnóstico tem sido alvo de diversas

pesquisas.177 Esta, para além de ser de fácil colheita, contém bactérias de

diferentes partes da boca, incluindo as superfícies mucosas e as placas infra e

supragengivais. Para além disso, existem registos de que a detecção de

determinados microrganismos na saliva pode reflectir a presença destes

microrganismos nas bolsas periodontais e na placa dentária.18,178-182 Umeda et al.181

compararam a detecção em PCR de A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T.

forsythensis e P. intermedia recorrendo à colheita por saliva e à colheita com

pontas de papel, obtendo respectivamente 20%, 48%, 55% e 43% destes

microrganismos na saliva e, 27%, 48%, 44% e 31%, respectivamente, na amostra

infragengival.

Alguns autores,181,183,184 afirmam mesmo que o facto de se detectarem as mesmas

bactérias periodontais na saliva e na placa infragengival suporta a ideia de que

ocorre uma dispersão das bactérias da placa infragengival para a saliva.

Para o estudo das amostras de saliva foram utilizadas 4 amostras de indivíduos

saudáveis, as quais foram estudadas, quer para a presença das bactérias

periodontais, quer para os polimorfismos genéticos. No entanto, os resultados não

foram tão satisfatórios quanto os resultados obtidos com amostras da placa

infragengival, colhidas com pontas de papel. Na análise por PCR em tempo real dos

microrganismos periodontais resultaram curvas de dissociação pouco definidas,

levantando dúvidas, em alguns casos, quanto à presença de determinados agentes

bacterianos. Na análise por PCR-RFLP dos polimorfismos IL-1A(C-889T) e

IL1B(C+3953T), os resultados também suscitaram dúvidas de interpretação.

Podem ser avançadas diversas razões para as dificuldades observadas quando se

utilizam amostras de saliva, tais como: a existência de uma menor concentração de

bactérias e do DNA genómico na saliva, dificultando a sua análise; a metodologia

de extracção poderia não estar optimizada para o tipo de amostra em questão,

diminuindo a qualidade de DNA genómico e do DNA bacteriano; e, uma vez que

foram analisadas amostras de indivíduos diferentes dos indivíduos estudados com o

método de colheita por pontas de papel, aqueles podiam possuir quantidades

reduzidas de agentes patogénicos, dificultando a sua análise. Serão necessários


TESE DE MESTRADO 31

estudos adicionais para avaliar a viabilidade de se utilizar amostras de saliva para

este tipo de análises.

Assim, no decorrer deste trabalho, foram usadas, como referido anteriormente,

amostras da placa infragengival colhidas com pontas de papel para a detecção dos

microrganismos periodontais e análise dos polimorfismos IL-1A(C-889T) e

IL-1B(C+3953T), utilizando como método de extracção de DNA a matriz

InstaGeneTM Matrix da BIO-RAD.

IIIIII..22.. DDEETTEECCÇÇÃÃOO DDEE MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS PPEERRIIOODDOONNTTAAIISS

Na detecção de microrganismos periodontais pretendeu-se utilizar um método

baseado na reacção de PCR, de preferência usando um método de amplificação em

tempo-real, pelas vantagens que esta metodologia apresenta relativamente ao PCR

convencional.170

A sequência dos primers utilizados para cada agente em estudo encontra-se na

Tabela 2.

Bactéria Sequencias dos primers Tm (ºC)

Referência

Aa F: 5’-GAACCTTACCTACTCTTGACATCCGAA-3’ 63,4 185

R: 5’-TGCAGCACCTGTCTCAAAGC-3’ 59,4

Pi F: 5’-CGGTCTGTTAAGCGTGTTGTG-3’ 59,8 185

R: 5’-CACCATGAATTCCGCATACG-3’ 57,3

Tf F: 5’-GGGTGAGTAACGCGTATGTAACCT-3’ 62,7 186

R: 5’-ACCCATCCGCAACCAATAAA-3’ 55,3

Pg F: 5’-GCGCTCAACGTTCAGCC-3’ 57,6 187

R: 5’-CACGAATTCCGCCTGC-3’ 54,3

Td F: 5’-CCGAATGTGCTCATTTACATAAAGGT-3’ 60,1 188

R: 5’-GATACCCATCGTTGCCTTGGT-3’ 59,8

Tabela 2 – Tabela com a sequência dos primers utilizados no presente estudo para a

detecção de Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), Prevotella intermedia (Pi),

Tannerella forsythia (Tf), Porphyromonas gingivalis (Pg) e Treponema denticola (Td). F –

Primer directo, R – Primer Reverso, Tm – Temperatura de fusão.

Embora o objectivo do trabalho seja utilizar na rotina a metodologia de PCR em

tempo real, é importante que o laboratório disponha de uma técnica alternativa de


TESE DE MESTRADO 32

análise. Assim sendo, os primers foram testados, quer por PCR em tempo real,

quer por PCR convencional seguido de análise em gel de agarose.

Os resultados obtidos, com ambas as técnicas, foram validados por comparação

com os resultados obtidos nas mesmas amostras, recorrendo a um kit comercial

para detecção molecular de microrganismos periodontais – o kit Micro-IDent® da

HAIN Lifescience.

Para o PCR convencional foram preparadas 5 misturas de reacção (uma por cada

agente a pesquisar) num volume final de 50µL de reacção, tal como indicado no

capítulo II.6. Paralelamente, foram preparadas 5 reacções controle, que serviram

de controlos negativos NTC (No Template Control), nos quais o DNA molde era

substituído por água ultra pura. Foi testado um programa de amplificação único

(descrito no capítulo II.6) para a detecção conjunta dos 5 agentes em estudo (Aa,

Pg, Pi, Td e Tf) em amostras de 3 indivíduos com periodontite. No final da reacção

os produtos de amplificação foram analisados por electroforese em gel de agarose

2%, corado com brometo de etídio.

Todas as amostras apresentavam os fragmentos de 99pb, 127pb, 67pb e 122pb

indicativos, respectivamente, da presença das bactérias P. intermedia185, T.

forsythia186, P. gingivalis187 e T. denticola188 e, em apenas uma das amostras

(amostra 3) foi detectada a presença do fragmento de 80pb correspondente a A.

actinomycetemcomitans185 (Figura 6). No caso de P. intermedia (1Pi, 2Pi e 3Pi)

observou-se também a presença de uma banda muito ténue acima de 200pb

(Figura 6.a). No entanto esta banda não interfere com a interpretação dos

resultados, uma vez que a banda específica de cerca de 99pb (característica da

existência de Pi) é bastante mais forte, sendo este resultado inequívoco.


TESE DE MESTRADO 33

Figura 6 – Electroforese em Gel de Agarose 2% corado com brometo de etídio. (a) A

presença dos fragmentos de 80pb e 99pb é indicativa da presença de A.

actinomycetemcomitans e P. intermedia. (b) Os fragmentos de 127pb, 67pb e 122pb são

indicativos da presença de T. forsythia, P. gingivalis e T. denticola, respectivamente. M –

Marcador de DNA 50bp; 1,2 e 3 – Amostras; Aa – A. actinomycetemcomitans; Pi – P.

intermedia; Tf – T. forsythia ; Pg – P. gingivalis ; Td – T. denticola.

Os mesmos resultados foram obtidos quando as amostras 1, 2 e 3 foram analisadas

com o kit Micro-IDent® da HAIN Lifescience (Figura 7). Note-se, no entanto, que

com o kit Micro-IDent®, a presença das bactérias Pi e Td, na amostra 2, é indicada

por uma linha ténue, enquanto que na análise em gel de agarose 2% dos produtos

de amplificação correspondentes a Pi e Td, os mesmos são facilmente identificados

(Figura 6 - a e b).

Figura 7 – Análise dos microrganismos periodontais com o kit Micro-IDent® da HAIN

Lifescience. 1, 2 e 3 – Amostras; NTC – Amostra controle em que foi analisada água em vez

de amostra; CC – Controlo conjugado; CA – Controlo de Amplificação; Aa – A.

actinomycetemcomitans; Pi – P. intermedia; Tf – T. forsythia; Pg – P. gingivalis; Td – T.

denticola; IC – Indicador colorido.

Apesar ser possível detectar as bactérias periodontais por PCR convencional

seguido de análise em gel de agarose, o facto desta metodologia necessitar de uma

a) b)


TESE DE MESTRADO 34

análise posterior dos produtos amplificados faz com que o processamento de uma

elevada quantidade de amostras seja um processo moroso e trabalhoso. Deste

modo, e porque se pretende desenvolver uma metodologia rápida e prática de

detecção para utilizar na rotina de um laboratório, interessava optimizar as

condições para a detecção das 5 bactérias periodontais por PCR em tempo-real. Por

outro lado, como já foi referido, a utilização de PCR em tempo real minimiza a

possibilidade de contaminação com amplicons formados durante a amplificação,

uma vez que as placas ou tubos de reacção não são abertos para posterior análise

pós-PCR.

Dos vários sistemas de amplificação em PCR tempo real, foi escolhido um método

que utiliza o composto fluorescente SYBR Green®, uma vez que a sua utilização

permite uma detecção de baixo custo, sensível e de fácil utilização, ideal para a

rotina de laboratório. Este composto tem a capacidade de se intercalar entre a

cadeia dupla de DNA e, com a excitação da luz emitida pelo sistema óptico do

termociclador, emitir uma fluorescência verde.

No início da amplificação, as moléculas livres do fluorocromo apresentam uma

fluorescência fraca, produzindo um sinal mínimo (ruído), que é subtraído durante a

análise instrumental. Após a ligação dos primers, as moléculas de SYBR Green®

começam a ligar-se à dupla cadeia e vão-se intercalando à medida que a enzima

Taq polimerase catalisa a reacção de extensão. Desta forma, a reacção é

monitorizada continuamente, pois o aumento da fluorescência é observado em

tempo real à medida que são produzidas novas moléculas. A detecção da

fluorescência no final de cada ciclo permite monitorizar a quantidade crescente de

DNA amplificado.189-191

Por cada amostra analisada foram preparadas 5 reacções de amplificação num

volume final de 25µL, uma por cada agente bacteriano em estudo, de acordo com o

indicado no capítulo II.7.

A análise de PCR em tempo real permitiu identificar todos os microrganismos

periodontais – Pg, Tf, Aa, Td e Pi.

Uma vez que se observou que as curvas de amplificação começavam a surgir entre

o ciclo 15 e 25, o programa de amplificação foi reduzido para 35 ciclos, em vez dos

50 ciclos inicialmente testados, de forma a diminuir o tempo de análise (Figura

8.a). Esta diminuição do número de ciclos é ainda vantajosa na medida em que

reduz a probabilidade de ocorrer amplificação não específica resultante de ligações

do SYBR Green® com outros produtos de cadeia dupla. Na Figura 8.b estão


TESE DE MESTRADO 35

seleccionadas as 5 curvas de amplificação (para os 5 agentes em estudo) relativas

à amostra 3. A identificação dos produtos de amplificação é feita através da análise

das curvas de dissociação, que correspondem à temperatura na qual metade da

cadeia de DNA está desnaturada e a outra metade se mantém em cadeia dupla.169

Cada amplicon apresenta uma temperatura de dissociação específica, que varia

com o número de ligações GC, com o comprimento e com a sequência do

fragmento amplificado.192 Neste caso, as temperaturas de dissociação foram de

81,1-82,3ºC para Pg, de 79,4-79,7ºC para Tf, de 76,3-77,4ºC para Aa, de 81,7-

82,3ºC para Td e de 79,4-80,3ºC para Pi (Figura 8.b). Note-se, no entanto, a

presença de uma lomba pouco definida, para além do pico de dissociação de Td,

que poderá corresponder a produtos inespecíficos, mas que não interfere com a

interpretação dos resultados.

Os produtos amplificados por PCR tempo-real foram separados numa electroforese

em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídio, que permitiu confirmar a

presença dos fragmentos de 67pb, 127pb, 80pb, 122pb e 99pb, indicativos,

respectivamente, da presença de Pg, Tf, Aa, Td e Pi (Figura 8.c).


TESE DE MESTRADO 36

Figura 8 – Curvas de amplificação (a) e de dissociação (b) dos agentes Porphyromonas

gingivalis (Pg), Tannerella forsythia (Tf), Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa),

Treponema denticola (Td) e Prevotella intermedia (Pi), por PCR Tempo Real no AB 7300. (c)

Electroforese em Gel de Agarose 2% corado com brometo de etídio. A presença dos

fragmentos de 80pb, 99pb, 127pb, 67pb e 122pb confirmam a presença de Aa, Pi, Tf, Pg e

Td, respectivamente. M – Marcador de DNA 50bp.

O PCR em tempo real provou ser um método sensível, rápido e eficaz na detecção

dos 5 agentes patogénicos descritos, podendo ser facilmente utilizado na rotina de

um laboratório para o diagnóstico destes agentes.

Uma variante da reacção de PCR é o PCR multiplex, no qual dois ou mais

fragmentos específicos são amplificados simultaneamente na mesma reacção,

utilizando dois ou mais pares de primers. O PCR multiplex tem a vantagem de,

numa única reacção, permitir obter informação sobre múltiplos fragmentos de

interesse. Contudo a técnica tem de ser optimizada para que se consiga igual

eficiência e sensibilidade na amplificação de todos os fragmentos, uma vez que os


TESE DE MESTRADO 37

diferentes pares de primers podem interferir na eficiência das reacções de

amplificação promovidas por outros pares de primers.

Alguns investigadores têm avaliado a possibilidade de utilizar reacções multiplex

com a técnica de PCR em tempo real, com SYBR Green®.193-195 Fukushima et al.193

testaram inclusive, com sucesso, diversos duplexes para a detecção de bactérias.

Apesar de não existirem registos deste tipo de estudos para agentes patogénicos

periodontais, decidiu-se testar, neste trabalho, uma análise de diversos multiplex,

recorrendo à técnica de PCR em tempo real com SYBR Green®. A escolha recaiu na

detecção simultânea de bactérias, cujos fragmentos de amplificação tivessem

apresentado diferenças nas temperaturas de dissociação aquando da análise

individual por PCR em tempo real (Tabela 3).

Temperatura de Dissociação (ºC)

A. actinomycetemcomitans 76,3 - 77,4

T. forsythia 79,4 - 79,7

P. intermedia 79,4 - 80,3

P. gingivalis 81,1 - 82,3

T. denticola 81,7 - 82,3

Tabela 3 – Temperaturas de dissociação dos fragmentos de amplificados de cada bactéria,

resultantes da análise individual por PCR Tempo Real.

Para o estudo, foi escolhida uma amostra em que estivessem representados os 5

microrganismos. As condições de reacção e o programa de amplificação foram os

mesmos que se encontram descritos neste capítulo para a detecção individual dos

microrganismos.

Foram estudadas as associações Aa/Tf, Pi/Td, Aa/Td e Aa/Pg. Enquanto que na

análise individual de Aa, Tf, Td e Pi as temperaturas de dissociação, após

amplificação dos fragmentos, foram, respectivamente, 77,3ºC, 79,8ºC, 82,3ºC e

80,1ºC, na análise multiplex Aa/Tf e Pi/Td apenas se detectou um pico de

dissociação a 79,8ºC e a 82,3ºC, respectivamente. Nas associações multiplex Aa/Td

e Aa/Pg não se obteve qualquer produto de amplificação, talvez devido a possíveis

interacções entre os primers da mistura.

Ainda pouco se conhece acerca do mecanismo que leva à ligação do SYBR Green®

ao DNA. No entanto, Zipper et al.196 sugerem que a fluorescência, resultante da

interacção de SYBR Green® com o DNA, depende da razão dos complexos

DNA/SYBR Green®. O fluorocromo intercala-se e liga-se ao DNA quando esta razão


TESE DE MESTRADO 38

é superior a 0,15. Giglio et al.197 demonstraram ainda que, por PCR em tempo real,

o SYBR Green tem tendência a ligar-se a amplicons maiores e com uma maior

percentagem de ligações G-C, o que faz com que seja difícil detectar múltiplos

amplicons em reacções multiplex.

Tendo em consideração os estudos destes autores, os resultados obtidos para os

multiplexs Aa/Tf e Pi/Td parecem fazer sentido, uma vez que, entre Aa (80pb) e Tf

(127pb) e, entre Pi (99pb) e Td (122pb) apenas são identificados os picos de

dissociação correspondentes aos amplicons de maior tamanho, Tf e Td,

respectivamente. Giglio et al.197 também levantaram a possibilidade de que, para

efectuar uma detecção multiplex por PCR em tempo real, se deverá aumentar a

concentração de SYBR Green na reacção, dado que a saturação deste fluorocromo

pode fazer com que este se ligue também a fragmentos mais pequenos. Assim,

serão necessários estudos adicionais para optimizar a metodologia de PCR em

tempo real por multiplex, para a detecção das bactérias periodontais.


TESE DE MESTRADO 39

IIIIII..33.. AANNÁÁLLIISSEE DDOOSS PPOOLLIIMMOORRFFIISSMMOOSS IILL11AA ((CC--888899TT)) EE IILL11BB ((CC++33995533TT))

O estudo da susceptibilidade genética pode ser, para além do diagnóstico

microbiológico, uma mais-valia para garantir a eficácia de um tratamento

periodontal. Diversos autores têm referido uma associação entre a progressão e

severidade da doença periodontal com a presença dos polimorfismos IL-1A(C-889T)

e IL-1B(C+3953T).97,104-106 Estes polimorfismos são conhecidos por interferirem

directamente com a resposta inflamatória do hospedeiro, contribuindo para um

aumento da inflamação dos tecidos e, consequentemente, com um aumento do

risco de uma progressão mais agressiva da patologia, devido à maior facilidade de

invasão dos microrganismos. Deste modo, uma identificação do grau de

susceptibilidade genética, ou seja, uma identificação do grau de susceptibilidade

para uma progressão mais agressiva ou mais controlada da doença, pode ser um

factor determinante para o sucesso de um tratamento, uma vez que permite

determinar o grau de acompanhamento de cada paciente, bem como, um

tratamento paralelo numa eventual necessidade de modelar as respostas

inflamatórias do indivíduo. Tratam-se de razões suficientes para a inclusão neste

trabalho da análise dos polimorfismos IL-1A(C-889T) e IL-1B(C+3953T), doravante

denominados de IL1A-889 e IL1B+3953, respectivamente.

A análise dos polimorfismos IL1A-889 e IL1B+3953 foi efectuada por PCR-RFLP

(RFLP, de Restriction Fragment Length Polymorphism). Esta técnica consiste na

amplificação por PCR do fragmento de DNA a analisar, seguida pela digestão do

amplicon usando enzimas específicas de restrição. Os diferentes fragmentos

resultantes da digestão podem ser separados, por exemplo, por electroforese em

gel de agarose de acordo com o seu tamanho e visualizados com brometo de

etídio.168

Neste trabalho foram utilizados primers específicos (Tabela 4), que permitem

amplificar as regiões polimórficas dos genes de interesse (IL-1A e IL-1B), onde

estão localizados os polimorfismos IL1A-889 e IL1B+3953, respectivamente.


TESE DE MESTRADO 40

Gene alvo

Sequencia do primer Tm (ºC)

Referência

IL-1A F: 5’-TGTTCTACCACCTGAACTAGGC-3’ 62,7 171

R: 5’-TTACATATGAGCCTTCCATG-3’ 53,2

IL-1B F: 5’-CTCAGGTGTCCTCGAAGAAATCAAA-3’ 61,3 198

R: 5’-GCTTTTTTGCTGTGAGTCCCG-3’ 59,8

Tabela 4 – Tabela com a sequência dos primers utilizados no presente estudo para a análise

dos polimorfismos. F – Primer directo, R – Primer reverso, Tm – Temperatura de fusão.

Apesar de na literatura estarem descritas condições de amplificação distintas para

cada um dos polimorfismos,171,198 neste trabalho estudou-se a possibilidade de

utilizar um programa único para a amplificação simultânea dos fragmentos

específicos de cada gene. A utilização de um mesmo programa de amplificação

permite optimizar recursos e reduzir tempo de resposta, factor de elevada

importância quando se pretende introduzir um teste de diagnóstico na rotina de um

laboratório de serviços.

O programa utilizado para a amplificação conjunta de ambos os genes foi adaptado

de programas referidos na literatura171,198, tendo em conta a adequação às

temperaturas de fusão dos primers, e encontra-se descrito no capítulo II.6 (Secção

II. Material e Métodos). As condições de reacção também estão descritas no

capítulo II.6.

Os produtos de amplificação foram analisados por electroforese em gel de agarose

2% corado com brometo de etídio, que permitiu visualizar os fragmentos de 99pb e

de 200pb, correspondentes aos polimorfismos IL1A-889 e IL1B+3953

respectivamente (Figura 9). Numa primeira fase foi testado um programa de

amplificação com temperatura de annealing de 56ºC. No entanto, enquanto que no

caso do polimorfismo IL1B+3953 se conseguiu identificar facilmente o fragmento

de 200pb, correspondente à sequência de interesse, no caso do polimorfismo

IL1A-889 o fragmento de 99pb obtido era muito ténue (Figura 9.a). A reduzida

eficiência da reacção de PCR, no caso do polimorfismo IL1A-889, pode dever-se ao

facto da temperatura de annealing utilizada no programa de PCR (56ºC) ser

superior à temperatura de fusão do primer IL1A_R (53,2ºC), não permitindo um

emparelhamento eficiente deste primer à cadeia de DNA molde e,

consequentemente, dar origem a uma quantidade reduzida de produto. Assim, foi

testado um programa de amplificação com uma temperatura de annealing inferior

(52ºC), o que permitiu aumentar ligeiramente a quantidade de produto amplificado

(fragmento de 99pb) no caso do polimorfismo IL1A-889 (Figura 9.b).


TESE DE MESTRADO 41

99pb

200pb

99pb

200pb

M IL-1A IL-1B(a) (b)

99pb

200pb

99pb

200pb

M IL-1A IL-1B(a) (b)

Figura 9 – Análise de produtos de amplificação relativos aos polimorfismos IL1A-889 e

IL1B+3953 em gel de Agarose 2% corado com brometo de etídio. (a) Após amplificação com

Ta=56ºC. (b) Após amplificação com Ta=52ºC. M – Marcador de DNA 50pb. A presença do

fragmento de 99pb é indicativa do polimorfismo IL1A-889 e o fragmento de 200pb do

polimorfismo IL1B+3953.

Foram ainda testadas (para o polimorfismo IL1A-889) diferentes condições de

reacção, quer variando a quantidade de DNA molde na reacção (10 e 20µL), quer

utilizando diferentes concentrações de primers (15 µM, 30 µM e 45 µM). No entanto,

não foram observadas diferenças significativas na quantidade de produto

amplificado quando se duplicou a quantidade de DNA na reacção de PCR, apenas se

verificando um ligeiro aumento de produto amplificado nos casos em que foi

utilizada uma concentração dos primers a 45 µM, casos A3 e A’3, que é

independente da quantidade de DNA molde (Figura 10).


TESE DE MESTRADO 42

Figura 10 – Análise de produtos de amplificação relativos ao polimorfismo IL1A-889 em gel

de Agarose 2% corado com brometo de etídio, resultantes de diferentes misturas de reacção.

M – Marcador de DNA 50bp; Ai – 10µL de Amostra; A’i – 20µL de Amostra. Em ambos os

casos com i=1, 2 e 3, correspondendo a uma concentração dos primers na mistura de

reacção de 15µM, 30µM e 45µM, respectivamente. A presença do fragmento de 99pb é

indicativa do polimorfismo IL1A-889.

Mesmo utilizando as condições de amplificação do polimorfismo IL1A-889, descritas

na literatura (ver capítulo II.6),171 não se observaram melhorias na quantidade de

produto amplificado.

Deste modo, as restantes amostras foram amplificadas utilizando as condições

optimizadas anteriormente, ou seja, o programa de amplificação conjunto com a

temperatura de annealing de 52ºC, usando primers à concentração de 15µM e

45µM para IL1B+3953 e IL1A-889, respectivamente.

A detecção dos polimorfismos IL1A-889 e IL1B+3953 foi efectuada por análise dos

fragmentos obtidos após digestão dos produtos amplificados com as enzimas de

restrição NcoI e Taq1, respectivamente.171,198 As reacções de digestão foram

efectuadas num volume final de 30µl, utilizando 20µl de produto amplificado. As

condições de reacção, bem como as sequências de DNA reconhecidas pelas duas

enzimas estão indicadas na Tabela 5.


TESE DE MESTRADO 43

Polimorfismo Enzima Local de clivagem Condições de Reacção

IL1A-889 NcoI 5’…C��CATGG…3’ Incubação: 37ºC, 90 min.

3’…GGTAC��C…5’ Inactivação: 65ºC, 20 min.

IL1B+3953 TaqαI 5’…T��CGA…3’ Incubação: 65ºC, 90 min.

3’…AGC��T…5’ Inactivação: 80ºC, 20 min.

Tabela 5 – Enzimas de restrição utilizadas na detecção dos polimorfismos IL1A-889 e

IL1B+3953 e respectivas condições de reacção.

O polimorfismo IL1A-889 ocorre na posição -889 do promotor do gene IL-1A e

caracteriza-se pela substituição de uma base citosina (C) por uma base timina (T),

originando dois tipos de alelos: alelo 1 e alelo 2, respectivamente.102 No alelo 2, a

substituição de uma base C por uma base T destrói o local de reconhecimento da

enzima NcoI, o que faz com que o fragmento de 99pb obtido na reacção de PCR

não possa ser clivado. O alelo 1, por sua vez, é identificado pela presença de dois

fragmentos de 83pb e 16pb, resultantes da digestão com NcoI (Figura 11).

83pb 16pb

Alelo 1

NcoI

C

99pb

T Alelo 2

83pb 16pb

Alelo 1

NcoI

C

83pb 16pb

Alelo 1

NcoI

C

99pb

T Alelo 2

Figura 11 – Esquema representativo dos fragmentos obtidos após digestão com NcoI dos

alelos 1 e 2 para o polimorfismo IL1A-889.

O polimorfismo IL1B+3953, por sua vez, caracteriza-se pela substituição de uma

base C na posição +3953 (exão 5) por uma base T, igualmente identificados como

o alelo 1 e alelo 2, respectivamente.103 Neste caso, a reacção de PCR origina um

fragmento de 200pb que, após digestão com TaqαI, resulta em fragmentos

distintos, permitindo distinguir entre os alelos. A substituição de uma base C por

uma base T, no alelo 2, destrói um lugar de reconhecimento da enzima TaqαI,

permitindo distinguir os dois alelos (Figura 12).


TESE DE MESTRADO 44

97pb 85pb12pb

Alelo 1

TaqαI

C

TaqαI

182pb12pb

T

TaqαI

Alelo 2

97pb 85pb12pb

Alelo 1

TaqαI

C

TaqαI

182pb12pb

T

TaqαI

Alelo 2

Figura 12 – Esquema representativo dos fragmentos obtidos após digestão com TaqαI dos

alelos 1 e 2 para o polimorfismo IL1B+3953.

A análise por PCR-RFLP do polimorfismo IL1B+3953, para algumas das amostras

em estudo, encontra-se na Figura 13. Após a reacção de digestão com a enzima

TaqαI foi possível distinguir claramente os alelos do polimorfismo IL1B+3953 por

separação em gel de agarose 2%. O alelo 1 caracteriza-se pela presença dos

fragmentos 97pb e 85pb (que não se conseguem distinguir neste gel) e o alelo 2

pelo fragmento de 182pb. O fragmento de 12pb, existente em ambos os alelos, é

pouco perceptível, devido ao seu pequeno tamanho.

97pb85pb

M D1 D2 C1D4D3 C2

182pb

97pb85pb97pb85pb

M D1 D2 C1D4D3 C2

182pb

M D1 D2 C1D4D3 C2

182pb

Figura 13 – Análise por PCR-RFLP do polimorfismo IL1B+3953 em gel de agarose 2%

corado com brometo de etídio. M – Marcador de DNA 50bp; D – Amostras de pacientes com

periodontite; C – Amostras controlo de indivíduos saudáveis. A presença do fragmento de

182pb é indicativa do alelo 2 (Amostras D1 e D4), enquanto que o conjunto dos fragmentos

de 85pb e 97pb indica a presença do alelo 1 (todas as amostras da figura). As amostras D1 e

D4 são heterozigóticas e as restantes são homozigóticas para o alelo 1.


TESE DE MESTRADO 45

No caso do polimorfismo IL1A-889, foi utilizada a enzima de restrição NcoI e os

produtos de digestão foram analisados, numa fase inicial, por electroforese em gel

de agarose 2%, corado com brometo de etídeo. No entanto, devido à pequena

diferença de tamanho dos fragmentos característicos dos alelos 1 e 2, de 83pb e

99pb, respectivamente (Figura 11), não foi possível distinguir os dois alelos.

Assim, os fragmentos de digestão com NcoI foram analisados posteriormente por

electroforese capilar num bioanalisador Agilent 2100 Bioanalyzer. Neste sistema,

que permite analisar 12 amostras em simultâneo, os fragmentos movimentam-se

num gel (constituído por um polímero linear e um fluorocromo) ao longo dos

microcanais do microchip, através da aplicação de elevadas voltagens.199 O

bioanalisador Agilent 2100 Bioanalyzer, ao contrário do sistema convencional de

electroforese em gel de agarose, permite a visualização dos resultados à medida

que vai ocorrendo a migração.

Devido à reduzida quantidade de produto digerido, resultante da reduzida eficiência

da reacção de PCR para este polimorfismo (Figura 9.b), só foi possível efectuar a

análise com o bioanalisador Agilent 2100 Bioanalyzer depois de concentrar as

amostras digeridas, cerca de 10x, num concentrador a vácuo Savant DNA120.

A análise dos produtos digeridos com NcoI no bioanalisador Agilent 2100 permitiu

distinguir o fragmento de 83pb, característico do alelo 1 (amostras 1 a 7), e o

fragmento de 99pb, que caracteriza o alelo 2 (amostras 2, 7 e 8), e assim

identificar as amostras homozigóticas e heterozigóticas (Figura 14).


TESE DE MESTRADO 46

Figura 14 – Análise por PCR-RFLP do polimorfismo IL1A-889 por electroforese num

bioanalisador Agilent 2100 Bioanalyzer. L – Marcador de DNA 15bp; Samplei – Amostra;

linha verde – primeiro pico/fragmento do marcador (15pb); linha lilás – último pico do

marcador (1500pb).

A metodologia utilizada para a análise dos polimorfismos IL1A-889 e IL1B+3953

permitiu diferenciar os alelos 1 e 2 de ambos os polimorfismos e identificar o perfil

de susceptibilidade genética dos indivíduos em estudo, resultados apresentados no

capítulo III.4. Porém, antes de implementar estas metodologias na rotina do

laboratório, é necessário realizar um estudo de custo/benefício de forma a avaliar a

viabilidade económica da utilização destas técnicas. No caso do polimorfismo

IL1A-889, a necessidade extra de concentrar as amostras e de recorrer a um

sistema de electroforese capilar para a análise deste polimorfismo, incrementa os

custos da análise, devido aos custos associados aos equipamentos e aos reagentes

específicos deste tipo de electroforese. Torna-se assim necessário equacionar todas

as variáveis, incluindo a dimensão do próprio mercado, antes de introduzir estas

metodologias na rotina.


TESE DE MESTRADO 47

IIIIII..44.. CCAARRAACCTTEERRIIZZAAÇÇÃÃOO MMIICCRROOBBIIOOLLÓÓGGIICCAA EE SSUUSSCCEEPPTTIIBBIILLIIDDAADDEE GGEENNÉÉTTIICCAA DDOOSS

PPAACCIIEENNTTEESS EESSTTUUDDAADDOOSS

Foram analisadas, pelas metodologias descritas nos pontos III.2 e III.3 do presente

trabalho, amostras da placa bacteriana infragengival de 14 indivíduos doentes e 6

indivíduos saudáveis. Sendo que, dos indivíduos doentes, 9 eram homens (64%) e

5 eram mulheres (36%), com idade média de 54 anos. Apenas 2 doentes fumavam

à altura da colheita. Nos indivíduos saudáveis, a idade média rondava os 31 anos,

sendo metade destes indivíduos do sexo masculino. O quadro geral dos resultados

da análise microbiológica e da análise dos polimorfismos IL1A-889 e IL1B+3953

encontra-se no anexo 3.

A Tabela 6 resume os resultados relativos à análise microbiológica em termos

percentuais. Realça-se que em 50% dos pacientes com periodontite não foi

detectada a bactéria A. actinomycetemcomitans. No entanto, as bactérias T.

forsythia, T. denticola e P. intermedia foram encontradas em todos os pacientes

com periodontite e em cerca de 86% destes detectou-se P. gingivalis. Nalguns

indivíduos saudáveis foram também detectadas as bactérias T. forsythia, T.

denticola e P. intermedia, mas nunca P. gingivalis. Alguns destes indivíduos

apresentavam também níveis detectáveis de A. actinomycetemcomitans.

Agentes Patogénicos

Aa Tf Pi Td Pg

Indivíduos com periodontite

50,0% 100,0% 100,0% 100,0% 85,7%

Indivíduos saudáveis

66,7% 83,3% 100,0% 66,7% 0,0%

Tabela 6 – Resumo dos resultados referentes à frequência dos agentes patogénicos nos

indivíduos estudados.

Todas as bactérias estudadas têm sido associadas à doença periodontal pois são

encontradas, com maior prevalência e em quantidades superiores, em indivíduos

doentes do que em indivíduos saudáveis.8,28,200-205

A bactéria A. actinomycetemcomitans tem sido referida como um importante

agente etiológico da periodontite agressiva localizada em diversas populações.206-209

Bragd et al.210 e Rams et al.8 sugerem mesmo que a A. actinomycetemcomitans

apresenta uma patogenicidade de tal maneira elevada que, mesmo níveis baixos

dessa espécie poderiam ser danosos ao periodonto. No entanto, curiosamente,


TESE DE MESTRADO 48

alguns estudos sugerem que a prevalência desta bactéria encontra-se associada à

idade, decrescendo significativamente com o aumento desta.155,211,212 Sendo que,

num destes estudos, realizado por Slots et al.212 foi registada, em pacientes, uma

prevalência deste agente de 74,4% num grupo com idades compreendidas entre os

15 e os 24 anos, comparativamente com os 38,7% detectados num grupo entre os

25 e os 34 anos de idade.

Alguns investigadores distinguem ainda a bactéria A. actinomycetemcomitans em 6

sorotipos: a, b, c, d, e e f, consoante o polissacarídeo presente na superfície da

bactéria e os seus produtos.51,213-215 Acredita-se que existam diferenças, ao nível da

virulência, entre os vários sorotipos da bactéria. Por exemplo, estudos realizados

demonstraram que o sorotipo b tem uma maior capacidade para induzir a

libertação da interleucina IL-1 do que os sorotipos a e c.216 Sabe-se, no entanto,

que a maioria dos pacientes é afectada por apenas um sorotipo, que se mantém

estável ao longo do tempo, e não por múltiplos sorotipos.214,217-219 Uma limitação do

presente estudo é a impossibilidade de discriminar entre os diferentes sorotipos de

A. actinomycetemcomitans pelo que não é possível tirar conclusões acerca do papel

destas espécies nas diferentes manifestações da doença periodontal.

T. forsythia, P. intermedia e T. denticola foram detectados em todos os doentes do

presente estudo, sendo que P. intermedia foi ainda detectado nos 6 indivíduos

saudáveis. A elevada prevalência destes agentes em doentes pode indicar uma

relação com a periodontite. T. forsythia tem sido relacionada com um aumento do

risco de perda de inserção clínica por um factor de 2.45 - 5.3. 204,220,221 No entanto,

ainda existe pouca informação relativa a esta bactéria e qual o papel que

desempenha na patologia.

Diversos estudos têm ainda sugerido a existência de uma associação entre a

doença periodontal e a presença de P. intermedia e T. denticola.78,155,222,223 No

entanto, P. intermedia tem sido detectada, não só em casos de periodontite

moderada e avançada como também em pacientes já controlados. 155,224 Neste

trabalho não foram observadas diferenças entre os indivíduos doentes e a

população controle (indivíduos saudáveis) quanto à presença de P. intermedia, uma

vez que esta bactéria foi encontrada em todos os indivíduos. Contudo, é importante

sublinhar que o reduzido número de indivíduos incluídos no estudo, não permite

fazer qualquer avaliação com significado estatístico.

Num estudo publicado em 2004, Mayanagi et al.,225 recorrendo a amostras de placa

infragengival, detectaram por PCR a presença de A. actinomycetemcomitans, T.

forsythia, T. denticola e P. intermedia em, respectivamente, 41%, 70%, 23% e


TESE DE MESTRADO 49

18% de indivíduos saudáveis. No entanto, não detectaram a bactéria P. gingivalis

na população saudável. Os resultados obtidos no presente trabalho vão de encontro

aos obtidos por Mayanagi et al., no que diz respeito à ausência de P. gingivalis em

indivíduos saudáveis.

P. gingivalis é uma das bactérias periodontais mais investigadas. Diversos autores

afirmam mesmo que existe uma associação entre esta bactéria e a doença

periodontal, entre os quais Mayanagi et al.225 e Ximénez-Fyvie et al.201, que

detectaram o microrganismo em mais de 40% das amostras dos pacientes com

periodontite. Outros autores encontraram ainda uma prevalência de 10-30% em

indivíduos saudáveis adultos.78,226 Sabe-se também que existem diferentes estirpes

de P. gingivalis que exibem graus diversos de capacidade invasiva.227 As estirpes

W83 e W50 foram consideradas de elevada virulência em estudos realizados com

animais, no entanto, não existem evidências convincentes que associem a

periodontite a uma determinada estirpe da P. gingivalis.226,228 P. gingivalis possui

diversos factores de virulência, que desempenham um papel importante no

desenvolvimento da patologia, pelo que é questionável a importância da detecção

de uma estirpe específica para o diagnóstico bacteriano.

No presente estudo a P. gingivalis foi detectada em 85,7% dos pacientes,

acompanhada da presença de T. forsythia, T. denticola e P. intermedia, o que pode

confirmar uma possível correlação entre P. gingivalis e estas bactérias.

A elevada sensibilidade da metodologia de PCR em tempo real pode encontrar-se

directamente relacionada com a detecção de A. actinomycetemcomitans, T.

forsythia, P. intermedia e T. denticola em indivíduos saudáveis neste estudo.

Diversos autores já afirmaram que, com técnicas suficientemente sensíveis, podem

ser detectadas espécies patogénicas em indivíduos saudáveis ou em locais da boca

saudáveis de indivíduos doentes.229-231 No entanto, estes resultados confirmam a

ideia de que as bactérias são necessárias, mas não são suficientes, para o

desenvolvimento da patologia. Existem outros factores de risco, como fumar, o

stress, as doenças sistémicas, a susceptibilidade genética, a resposta imunitária,

entre outros, que podem ser cruciais à iniciação e desenvolvimento da periodontite.

Não obstante, colocam-se ainda diversas questões. Será que os indivíduos

saudáveis possuem estirpes menos virulentas das bactérias detectadas? Será que

existe um limite máximo de concentração das bactérias para a iniciação e evolução

da doença? Existindo, será que este limite é fixo por agente ou variável com o

conjunto de bactérias? Trata-se de questões complexas, para as quais ainda não

existem respostas unânimes. Haffajee et al.,232 afirmam por exemplo, que existem


TESE DE MESTRADO 50

limites de concentração abaixo dos quais, certos locais do periodonto se encontram

inactivos, mesmo após colonização por um determinado patogénio e, acima dos

quais se observa actividade. Afirmam ainda que este limite é de 5x105 bactérias

para a P. gingivalis e de 1x104 bactérias para a A. actinomycetemcomitans. No

entanto, o valor limite pode não ser independente da presença de outras espécies

virulentas ou, até mesmo, do mecanismo de defesa do hospedeiro. Levanta-se

igualmente a possibilidade das espécies de bactérias encontradas em indivíduos

saudáveis poderem corresponder a subtipos não virulentos ou clones da mesma

bactéria.233

No que diz respeito à susceptibilidade genética, a análise dos polimorfismos

IL1A-889 e IL1B+3953 por PCR-RFLP mostrou que o alelo 1 de ambos os

polimorfismos se encontrava presente em todos os indivíduos saudáveis. No caso

do polimorfismo IL1A-889 em homozigotia em 66,7% dos controlos e para o

polimorfismo IL1B+3953 em cerca de 83% (Tabela 7). Nenhum indivíduo saudável

possuía o alelo 2 (associado à periodontite) em homozigotia para qualquer um dos

polimorfismos.

Polimorfismos IL-1

IL1A-889 IL1B+3953

1\1 1\2 2\2 1\1 1\2 2\2

Indivíduos com periodontite

42,9% 35,7% 14,3% 50,0% 28,6% 21,4%

Indivíduos saudáveis

66,7% 33,3% 0,0% 83,3% 16,7% 0,0%

Tabela 7 – Resumo dos resultados referentes à frequência dos polimorfismos IL1A-889 e

IL1B+3953.

Por outro lado, constatou-se que cerca de 50% dos pacientes eram homozigóticos

para o alelo 1 do polimorfismo IL1B+3953. Os restantes 50% possuíam o alelo 2

deste polimorfismo, 21% dos quais em homozigotia.

No caso do polimorfismo IL1A-889, 42,9% dos pacientes eram homozigóticos para

o alelo 1 e os restantes possuíam o alelo 2 (14,3% em homozigotia).

Em ambos os polimorfismos estudados, a presença do alelo 2 é referida como

responsável pelo aumento da produção de IL-1α e IL-1β, respectivamente, e,

consequentemente pelo aumento da susceptibilidade do indivíduo ao

desenvolvimento e progressão da periodontite.97,104,106


TESE DE MESTRADO 51

O estudo da susceptibilidade genética pode ser uma ferramenta importante no

tratamento da periodontite. Por exemplo, tendo em conta a tabela geral de

resultados (anexo 3), e apesar de ser necessário ter sempre em conta que existem

outros factores importantes para o início e progressão da doença, identifica-se a

necessidade de acompanhar, de uma forma mais frequente, a evolução do

tratamento dos pacientes 9 e 19, homozigóticos para o alelo 2 de ambos os

polimorfismos, bem como do paciente 13, homozigótico para o alelo 2 do

polimorfismo IL-1B(C+3953T) e heterozigótico para o polimorfismo IL-1A(C-889T),

uma vez que estes possuem uma maior susceptibilidade para a evolução da

periodontite.

A análise conjunta dos resultados, da microbiologia e da susceptibilidade genética,

poderá fornecer informações importantes para o médico dentista no que diz

respeito, quer à adequação terapêutica (que dependerá dos microrganismos

presentes e do grau de resposta inflamatória do indivíduo), quer no

acompanhamento posterior do paciente.

52

IV. Conclusões e

Perspectivas Futuras

“Se evitares os problemas,

jamais poderás dizer que os superaste.”

Richard Bach em Uma Aventura de EspíritoUma Aventura de EspíritoUma Aventura de EspíritoUma Aventura de Espírito

UNIVERSIDADE DE AVEIRO CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS

TESE DE MESTRADO 53

IIVV.. CCOONNCCLLUUSSÕÕEESS EE PPEERRSSPPEECCTTIIVVAASS FFUUTTUURRAASS

Actualmente, em Portugal, o diagnóstico e classificação da doença periodontal

baseiam-se, exclusivamente, nos métodos tradicionais de recolha da história

clínica, de sondagem periodontal, de visualização radiográfica e de outras

observações consideradas importantes. Estes dados nem sempre são suficientes

para alcançar o sucesso no tratamento da periodontite.

O enriquecimento do diagnóstico com a monitorização microbiológica e com o teste

de susceptibilidade genética permite, não só, estabelecer um plano de tratamento

personalizado e compatível com os preceitos terapêuticos periodontais actuais,

como também, definir o acompanhamento médico necessário em cada situação.

A amplificação por PCR em tempo real provou ser um método sensível, rápido e

eficaz na detecção dos 5 agentes patogénicos descritos (Aa, Pi, Td, Tf e Pg),

podendo ser facilmente utilizado na rotina de um laboratório para o diagnóstico

destes agentes.

O PCR em tempo real com SYBR Green não permitiu, no entanto, a detecção dos

microrganismos num sistema multiplex, o que poderia tornar a análise mais

vantajosa e prática de implementar na rotina laboratorial. A optimização de

análises multiplex aos agentes periodontais, por PCR tempo real, deverá ser

considerada no futuro, quer variando a concentração de SYBR Green® nas reacções,

como sugerido por Giglio et al.197, quer utilizando outras abordagens experimentais,

como por exemplo sondas Taqman® Probe, específicas para cada um dos

microrganismos.

A técnica de PCR-RFLP, usada para a análise dos polimorfismos IL1A-889 e

IL1B+3953, permitiu identificar o perfil genético dos pacientes em estudo para

estes polimorfismos. Porém, comparando com a técnica de PCR em tempo real, a

metodologia de PCR-RFLP exige mais tempo e recursos, tanto físicos (equipamentos

e reagentes) como humanos. Seria importante equacionar a possibilidade de

analisar estes polimorfismos por PCR em tempo real utilizando sondas específicas

como, por exemplo, a Taqman® Probe, que permitem fazer descriminação alélica e

identificar polimorfismos/mutações.

Dados os critérios rigorosos de selecção de pacientes para este estudo não foi

possível incluir, no período estipulado para a realização do trabalho, um número

suficiente de indivíduos que permitisse tirar conclusões, com significado estatístico,

acerca das características microbiológicas e genéticas da população portuguesa

UNIVERSIDADE DE AVEIRO CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS

TESE DE MESTRADO 54

relativamente à periodontite. Apesar de diversos autores afirmarem que a presença

das bactérias Aa, Td, Tf, Pg e Pi e dos polimorfismos IL1A-889 e IL1B+3953, se

encontram directamente relacionadas com a periodontite, é necessário realizar um

estudo mais alargado à população portuguesa.

Para além do exposto anteriormente, outras propostas consideradas interessantes,

numa perspectiva de trabalho futuro, são:

- Optimização da detecção de microrganismos e polimorfismos genéticos com

amostras obtidas por outros métodos de colheita mais simples, que facilitem a

auto-colheita (swab, saliva, etc.).

- Estudos quantitativos na detecção das bactérias periodontais (Aa, Td, Tf, Pg e Pi),

de forma a poder tirar conclusões acerca do significado clínico das quantidades

relativas encontradas em doentes e indivíduos saudáveis e determinar o(s) limite(s)

de concentração aceitáveis dos microrganismos na população saudável.

- Investigação, na população portuguesa, de outros agentes microbianos (Exemplo:

P. micros,33 F. nucleatum,70,78 e C. rectus81,82) e outros polimorfismos associados à

periodontite (Exemplo: IL1B-511234 e IL6-174235).

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79

AnexosAnexosAnexosAnexos

ANEXO 1 – Consentimento Informado

INFORMAÇÕES AO PACIENTE SOBRE O ESTUDO “ Caracterização molecular dos microrganismos associados à periodontite numa população de doentes portugueses” A periodontite é uma doença causada pela presença de bactérias nas superfícies dentárias e que leva à destruição dos tecidos que envolvem os dentes, os quais são responsáveis por manter os dentes fixos nos maxilares. A periodontite é a principal causa de perda dos dentes em indivíduos adultos. Geralmente, a periodontite não provoca dor, mesmo em casos avançados, sendo os sintomas mais frequentes o sangramento gengival e a mobilidade dentária. Se não for efectuado qualquer tratamento, a doença evolui cronicamente e os dentes acabam por cair. O tratamento da periodontite envolve a realização de sessões de raspagem e alisamento das raízes dentárias afectadas pela doença para eliminar as bactérias e os cálculos aí existentes. No entanto, dependendo da extensão da infecção, poderão ser necessários procedimentos cirúrgicos para aceder a locais mais profundos ou, em casos muito avançados, estará indicada a extracção dos dentes afectados. A presença de determinado tipo de bactérias na superfície das raízes dentárias parece estar na origem da periodontite. Tudo indica que estas bactérias possam, em conjunto, ser responsáveis pelo processo da inflamação que causa a destruição dos tecidos que suportam os dentes, daí ser extremamente importante a sua identificação, não só para ajudar no diagnóstico dos diferentes tipos de periodontite, mas também para escolher o tratamento mais adequado e verificar se, depois do tratamento, essas bactérias desapareceram. O objectivo deste estudo é desenvolver um método simples para identificar o(s) tipo(s) de bactérias que estão presentes em volta dos dentes afectados por periodontite. Por outro lado, existem alguns factores que aumentam o risco de um doente desenvolver periodontite mais rapidamente e mais grave. Alguns exemplos desses factores são o tabaco, algumas doenças crónicas como a diabetes e algumas características genéticas do indivíduo, já descritas. Por isso, este estudo também vai analisar a presença de algumas dessas características, para ajudar a identificar os factores de risco associados à periodontite, entre a população portuguesa.

Médica responsável pelo estudo: Doutora Isabel Poiares Baptista …………………………………………………………………………………………………………………………………………………. CONSENTIMENTO INFORMADO * Li e compreendi a informação constante deste documento sobre o estudo molecular da periodontite no qual vou participar. * Compreendo que os resultados deste teste não são diagnósticos, mas apenas irão ser incluídos num estudo de investigação médica. * Autorizo que me seja efectuada uma recolha de amostra para este estudo. Nome:__________________________________________________ Data: ___/___/___ Assinatura:__________________________________ Idade: Fumador: S N Observações:

CÓDIGO:

ANEXO 2 – Critérios de Inclusão e Exclusão

A. DOENTES

Critérios de inclusão:

1. Indivíduos caucasianos, com progenitores caucasianos.

2. Terem periodontite (presença de bolsas periodontais com profundidade de sondagem > 5mm com perda de inserção clínica e com hemorragia à sondagem, em pelo menos um dente em cada quadrante).

3. Sem doenças sistémicas que possam afectar a situação periodontal

4. Possuam pelo menos 20 dentes na cavidade oral, distribuídos pelos quatro

quadrantes.

5. Com idade superior a 20 anos.

6. Sem história de tratamento de doença periodontal. 7. Terem dado o seu consentimento informado.

Critérios de exclusão:

1. Patologias da cavidade oral, excepto cáries ou doença periodontal. 2. Gengivite Ulcerativa Necrosante.

3. Uso de aparelho ortodôntico.

4. Gravidez ou aleitamento. 5. Hepatite. 6. Diabetes.

7. Infecção por HIV.

8. Doenças hematológicas.

9. Quimioterapia.

10. História de doenças que comprometam gravemente a função imune.

11. Condição médica que requeira profilaxia antibiótica.

12. Terapêutica crónica com AAS ou AINES há mais de 3 anos.

13. Terapêutica antibiótica há menos de 6 meses.

14. Terapêutica periodontal há menos de 1 ano.

ANEXO 2 – Critérios de Inclusão e Exclusão

B. CONTROLOS

Critérios de inclusão

1. Indivíduos caucasianos, com progenitores caucasianos.

2. Sem doença periodontal

3. Sem doenças sistémicas que possam afectar a situação periodontal

4. Possuam pelo menos 20 dentes na cavidade oral.

5. Com idade superior a 20 anos.

6. Sem história de tratamento de doença periodontal. 7. Terem dado o seu consentimento informado.

Critérios de exclusão

1. Patologias da cavidade oral, excepto cáries. 2. Gengivite Ulcerativa Necrosante.

3. Uso de aparelho ortodôntico

4. Gravidez ou aleitamento 5. Hepatite 6. Diabetes

7. Infecção por HIV

8. Doenças hematológicas

9. Quimioterapia

10. História de doenças que comprometam gravemente a função imune

11. Necessidade de profilaxia antibiótica

12. Terapêutica crónica com AAS ou AINES há mais de 3 anos

13. Terapêutica antibiótica há menos de 6 meses

14. Terapêutica periodontal há menos de 1 ano.

ANEXO 3 – Caracterização microbiológica e susceptibilidade genética dos pacientes estudados – Quadro Geral

Amostra

Diagnóstico periodontal

Agentes Patogénicos Polimorfismos

N.º Tipo Sexo Fumador? Idade Aa Tf Pi Td Pg IL1A -889

IL1B +3953

1 P M sim 53 Periodontite crónica generalizada avançada + + + + + 1 \ 2 1 \ 2

2 P F Não 46 Periodontite crónica generalizada moderada + + + + + 1 \ 1 1 \ 1

3 P M Não 52 Periodontite crónica generalizada avançada

+ + + + + 1 \ 1 1 \ 1

4 P M sim 56 Periodontite crónica generalizada avançada

+ + + + + 1 \ 1 1 \ 2

5 C M Não - - - + + + - 1 \ 2 1 \ 1

6 C M Não 51 - + + + - - 1 \ 2 1 \ 1

7 C M Não 33 - + + + + - 1 \ 1 1 \ 2


- + + + + 1 \ 2 1 \ 1

9 P M Não 59 Periodontite crónica generalizada moderada - + + + + 2 \ 2 2 \ 2

10 P M Não - Periodontite crónica localizada moderada - + + + + 1 \ 1 1 \ 1

11 P M Não 51 Periodontite agressiva generalizada avançada

+ + + + + 1 \ 1 1 \ 2

12 P M Não 66 Periodontite crónica generalizada moderada

- + + + + 1 \ 1 1 \ 1

13 P F Não 42 Periodontite crónica localizada ligeira + + + + - 1 \ 2 2 \ 2

14 C F Não 25 - + + + + - 1 \ 1 1 \ 1

15 C F Não 23 - - - + - - 1 \ 1 1 \ 1

16 C F Não 23 - + + + + - 1 \ 1 1 \ 1

17 P F Não 47 Periodontite crónica generalizada avançada + + + + + 1 \ 1 1 \ 1

18 P F Não - Periodontite agressiva localizada avançada - + + + - 1 \ 2 1 \ 1


- + + + + 2 \ 2 2 \ 2

20 P F Não 55 Periodontite crónica localizada ligeira

- + + + + 1 \ 2 1 \ 2

Resultados referentes à frequência dos agentes patogénicos e dos polimorfismos

IL1A-889 e IL1B+3953 nos indivíduos estudados. P – Indivíduo com periodontite; C –

Indivíduo saudável; F – Feminino; M – Masculino; Aa – A. Actinomycetemcomitans; Pi –

P. intermedia; Tf – T. forsythia; Pg – P. gingivalis; Td – T. denticola.

Documents

Repositório Institucional da Universidade de Aveiro: Home · DNA 50pb. A presença do fragmento de 99pb é indicativa do polimorfismo IL1A-889 e o fragmento de 200pb do polimorfismo