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MARIA LUIZA DINIZ DE SOUSA LOPES
RESPOSTA IMUNE E MECANISMOS DE EVASÃO NA
CARCINOGÊNESE DE LÁBIO: UM ESTUDO IMUNOÍSTOQUÍMICO
NATAL/RN
2018
MARIA LUIZA DINIZ DE SOUSA LOPES
RESPOSTA IMUNE E MECANISMOS DE EVASÃO NA
CARCINOGÊNESE DE LÁBIO: UM ESTUDO IMUNOÍSTOQUÍMICO
NATAL/RN
2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
MARIA LUIZA DINIZ DE SOUSA LOPES
RESPOSTA IMUNE E MECANISMOS DE EVASÃO NA
CARCINOGÊNESE DE LÁBIO: UM ESTUDO IMUNOÍSTOQUÍMICO
NATAL/RN
2018
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Patologia Oral da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como parte dos requisitos para
obtenção do título de doutora em Patologia
Oral.
Orientadora: Profa. Dra. Éricka Janine
Dantas da Silveira
Coorientadora: Profa. Dra. Márcia
Cristina da Costa Miguel
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Alberto Moreira Campos - Departamento de Odontologia
Lopes, Maria Luiza Diniz de Sousa.
Resposta imune e mecanismos de evasão na carcinogênese de
lábio: um estudo imunoistoquímico / Maria Luiza Diniz de Sousa Lopes. - Natal, 2018.
94 f.: il.
Tese (Doutorado em Patologia Oral) - Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de
Pós-graduação em Patologia Oral, Natal, 2018.
Orientador: Éricka Janine Dantas da Silveira.
Co-orientador: Márcia Cristina da Costa Miguel.
1. Carcinoma de células escamosas - Tese. 2. Queilite - Tese.
3. Neoplasias labiais - Tese. 4. Evasão da resposta imune -
Tese. 5. Citotoxicidade imunológica - Tese. 6. Imunoistoquímica -
Tese. I. Silveira, Éricka Janine Dantas da. II. Miguel, Márcia
Cristina da Costa. III. Título.
RN/UF/BSO BLACK D61
Elaborado por Hadassa Daniele Silva Bulhões - CRB-313/15
DEDICATÓRIA
Ao meu marido Fred, por ser amor e fortaleza. Você, que mudou a minha vida tantas vezes,
sempre para melhor, foi essencial ao longo de todos estes anos de mestrado e doutorado. Sem
você, eu provavelmente não teria escolhido o caminho acadêmico. Sem você, eu certamente
não teria chegado até aqui. Não foram poucas as vezes em que esmoreci e foi você que me
manteve sã. Não há palavras para agradecer o que você fez por mim. Você foi incansável em
sua paciência, acolhimento, carinho e atenção. Esta conquista é nossa, meu amor.
Ao meu filho Lucas, por transformar tão maravilhosamente a minha visão de mundo. Você,
ainda em meu ventre, despertou uma serenidade e paz em mim, que eu nem sabia precisar
nestes últimos sete meses do doutorado. Obrigada, meu pequeno, por já fazer de mim uma
pessoa melhor.
Aos meus amados pais, Ivanilce e Walter, por sempre terem investido um tempo precioso na
minha educação. Obrigada por não medirem esforços e por todo o apoio e segurança que me
proporcionam.
“E há que se cuidar do broto
Pra que a vida nos dê flor e fruto.”
Milton Nascimento e Wagner Tiso
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AGRADECIMENTO ESPECIAL
À minha orientadora, Profa. Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira, deixo aqui registrado o
meu mais sincero e carinhoso agradecimento por tudo. Ainda na graduação, tive a
oportunidade de ser sua aluna da unidade de imunologia e em algumas aulas práticas na
patologia oral. Lembro que já nessa época você exercia a docência com uma dedicação
fascinante. Durante estes seis anos da pós-graduação, você sempre acreditou no meu
potencial e me deu oportunidades valiosas. Você me incentivou na realização do sonho
durante o doutorado sanduíche, e mais que isso, me ajudou a compreender e superar os meus
limites. Sou grata demais pela sua paciência com as minhas ansiedades, pelos conselhos e
torcida. Tenho convicção que a vida não poderia ter me reservado uma orientadora melhor
para essa caminhada tanto tortuosa, quanto enriquecedora. Admiro muito sua competência e
empenho em tudo que se propõe a realizar. Levarei sempre comigo sua força de vontade,
coragem e ensinamentos. Agradeço de coração pela confiança e amizade.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço à Deus e à minha família por me permitirem sonhar e realizar.
À Profa. Dra. Lélia Batista de Souza, pela sua dedicação e zelo ao Programa de pós-
graduação em Patologia Oral. Sua força, sinceridade e determinação muito me marcaram
durante a minha passagem pela patologia oral. Pode ter certeza que esta sua “afilhada” nunca
vai esquecer todos os seus ensinamentos, conselhos e também pelos momentos de
descontração. Sou muito grata pela sua confiança em mim e pelo apoio demonstrado em
diversos momentos ao longo destes anos.
À Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel, quem mesmo sem ter consciência
disto, me instigou a buscar o meu melhor sempre. Admiro demais a sua inteligência e sede de
conhecimento. Mais recentemente pude também usufruir de seus conselhos valiosos. Aprendi
com você e vou levar para a vida que a impermanência é inerente à natureza humana.
Aos demais Professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN,
Dra. Ana Miryam Costa de Medeiros, Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Dr. Bruno Cesar
de Vasconcelos Gurgel, Dr. Carlos Augusto Galvão, Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, Dr. Leão
Pereira Pinto, Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira, Dr.
Pedro Paulo de Andrade Santos, e Dra. Roseana de Almeida Freitas, pelas contribuições tão
importantes para minha formação durante as disciplinas e queridas discussões de lâminas.
Agradeço também pelas oportunidades de participar de diferentes pesquisas, o que me permitiu
agregar ainda mais aprendizado. Tenho imenso respeito e estima por todos.
À Profa. Dra. Aline Carvalho Batista da Universidade Federal de Goiás, serei
eternamente grata pela sua generosidade ao possibilitar a realização deste estudo. Seu
entusiasmo pela pesquisa é contagiante e, mesmo à distância, transpareceu em cada uma das
nossas ricas discussões científicas. Muito obrigada pela disponibilidade e parceria! Sua
motivação renovou minhas forças para persistir no sonho do doutorado.
Aos amigos queridos Luiz Juliasse, Andreia do Carmo, Hugo Costa, Denise Hellen,
Melka Sá, Thâmara Manoela, Amanda Gonzaga, alguns que já me acompanhavam de outras
épocas, outros que tive a alegria de conhecer na patologia. Chegar até aqui teria sido muito
mais difícil sem ter vocês comigo para dividir as alegrias e angústias rotineiras. Cada um, do
seu jeito e no seu tempo, foi um anjo na minha trajetória.
Aos demais colegas e amigos que conviveram comigo no programa de pós-graduação,
alguns dos quais hoje já professores, Adriana Câmara, Ana Luiza Andrade, Angélica Mandú,
Bárbara Monteiro, Caio Barros, Clarissa Demeda, Cristianne Medeiros, Dáurea Sena,
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Deborah Moreira, Eduardo Cruz, Emeline Lima, Everton Freitas, Felipe de Matos,
Fernanda Ginani, Glória França, Hellen Santos, Hianne Medeiros, Israel Leal, Jadson
Lima, Jamile Marinho, Jefferson Tenório, Joabe Pereira, Juliana Pinheiro, Keila Barroso,
Larissa Rolim, Laudenice Lucena, Laura Carvalho, Leorik Pereira, Luciana Castro, Luiz
Arthur, Maiara Moraes, Mara Luana, Marcelo Nascimento, Mariana Serpa, Mariana Xerez,
Natália Guimarães, José Nazareno, Ondina Rocha, Patrícia Peixe, Rodrigo Mafra, Rômulo
Macêdo, Roseane Vasconcelos, Salomão Israel, Stefânia Ferreira, Thais Maciel, Thalita
Santana, Tiago João, Viviane Alves e Yalit Vargas agradeço pelos diversos momentos de
aprendizado e descontração compartilhados, fundamentais para meu crescimento acadêmico
e pessoal.
Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN Graça
Galvão, Maria Lourdes Maciel, Hévio Lucena, Sandra Oliveira, Ricardo Silva, Idelzuite
Souza e Francianne Amorim, pela gentileza, simpatia e disponibilidade ao me ajudar nas
inúmeras vezes em que precisei.
Aos colegas e amigos da University of British Columbia e do BC Cancer Research
Centre, Yi Liu, David Lu, Kelly Liu, Curtis Hughesman, Cindy Cui, Sarah Zhu e em especial,
à Dra. Catherine Poh, pelos ensinamentos e acolhimento durante minha estada em Vancouver.
À equipe da Patologia Oral da Universidade Estadual da Paraíba, em especial aos
professores Dr. Cassiano Francisco Weege Nonaka e Dra. Pollianna Muniz Alves, que me
acolheu tão bem por um breve, mas muito feliz período.
Ao Prof. Dr. Kenio Costa Lima, por todos os ensinamentos no campo da bioestatística;
e ao Dr. Gustavo Martelli Palomino, por ter cedido a alíquota de um dos anticorpos para a
realização deste estudo.
À Vovó Chiquita (in memorian), ao meu cunhado Max e aos amigos Cristiano e
Daniela, que passaram algum tempo morando conosco nestes últimos anos. Obrigada pelo
apoio e por entenderem minhas ausências.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio
financeiro durante o doutorado.
10
"No porto de antes, apreensivo, eu tentava imaginar as dificuldades e lutas futuras. No de agora,
dono do tempo que eu conquistara, simplesmente admirava o que estava ao meu redor e desfrutava
do que estava feito. Não era a sensação de uma batalha ganha, de uma luta em que os obstáculos
foram vencidos. Muito mais do que isso, era o prazer interior de ter realizado algo que tanto desejei,
de ter feito e visto o que fiz e vi."
Amyr Klink
11
RESUMO
A vigilância imunológica, principalmente mediada por linfócitos T CD8+, reconhece e destrói
células malignas ou alteradas. Contudo, através de estratégias imunossupressoras, como as vias
de sinalização do ligante de morte celular programada-1 (PD-L1) e do antígeno leucocitário
humano-G (HLA-G), estas células mutadas conseguem escapar da resposta imune antitumoral.
Este estudo investigou a imunoexpressão de PD-L1, HLA-G, CD8 e granzima B (GrB) no
microambiente de carcinomas de células escamosas (CCEs) de lábio (n = 40), de queilites
actínicas (QAs; n = 55) e de mucosa labial saudável (MLS; n = 10). As amostras foram
submetidas à técnica da imunoistoquímica e as análises das imunomarcações seguiram métodos
semi-quantitativos (PD-L1 e HLA-G) e quantitativos (CD8 e GrB). A expressão das proteínas
foi comparada entre os três grupos de amostras, bem como com parâmetros clinicopatológicos
das lesões e sobrevida global dos pacientes com CCE de lábio. A correlação entre as proteínas
e o tipo do microambiente tumoral de acordo com a presença de PD-L1 e CD8 também foram
avaliados. Os testes estatísticos incluíram o exato de Fisher, Mann-Whitney, Kruskal-Wallis,
correlação de Spearman e log-rank para comparação das curvas de sobrevida global construídas
pelo método Kaplan-Meier. O nível de significância foi estabelecido em 5%. Os números de
células CD8+ e GrB+ aumentaram progressivamente de MLS para CCEs de lábio, com QAs
exibindo números intermediários (p < 0,01). A menor expressão dessas proteínas foi associada
à metástase para linfonodos e tumores pobremente diferenciados (p < 0,05). A expressão de
PD-L1 e HLA-G em células neoplásicas/ceratinócitos e estroma/tecido conjuntivo foi
significativamente maior em CCEs de lábio e QAs, em comparação com MLSs (p < 0,05). PD-
L1 não foi significativamente associado aos aspectos clinicopatológicos das lesões. A maioria
dos CCEs de lábio mostrou coexistência de células PD-L1+ e CD8+ (72,5%) no microambiente
tumoral. A expressão de PD-L1 foi diretamente correlacionada à infiltração linfocítica CD8+ e
GrB+ em CCEs de lábio (p < 0,05). A expressão das proteínas não foi associada com a sobrevida
global dos pacientes com CCEs de lábio (p > 0,05). Nossos achados sugerem que as moléculas
imunossupressoras PD-L1 e HLA-G estão consistentemente expressas desde QAs e se mantém
até fases avançadas dos CCE de lábio. A correlação entre a expressão de PD-L1 e a expressão
de CD8 e GrB nos carcinomas sugere que PD-L1 pode surgir como um mecanismo de escape
frente a uma resposta antitumoral ativa.
Palavras-chave: Carcinoma de células escamosas; Queilite; Neoplasias labiais; Evasão da
resposta imune; Citotoxicidade imunológica; Imunoistoquímica.
12
ABSTRACT
Immune surveillance, mainly mediated by CD8 + T lymphocytes, recognize and destroy
malignant or altered cells. However, through immunosuppressive strategies, such as the
signaling pathways of the programmed cell death ligand-1 (PD-L1) and human leukocyte
antigen-G (HLA-G), these mutated cells often escape the antitumor immune response. The aim
of this study was to investigate and compare the immunoexpression of PD-L1, HLA-G, CD8
and granzyme B (GrB) in the microenvironment of lip squamous cell carcinomas (LSCCs; n =
40), actinic cheilitis (ACs; n = 55), and healthy lip mucosa (HLM; n = 10). The samples were
submitted to immunohistochemistry and the analysis followed a semi-quantitative (PD-L1 and
HLA-G) and quantitative methods (CD8 and GrB). Protein expression was compared between
the three groups of samples, as well as with the lesion’s clinicopathologic parameters and
overall survival of patients with LSCC. Correlation between proteins and the type of tumor
microenvironment according to a presence of PD-L1 and CD8 were also evaluated. Statistical
tests included Fisher's exact, Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Spearman's correlation, as well
as the log-rank for comparison of the overall survival built through Kaplan-Meier method.
Significance was set at p < 0.05. The CD8+ and GrB+ cell numbers progressively increased from
HLMs to LSCCs, with ACs exhibiting intermediate numbers (p < 0.01). Lower expression of
these proteins was associated with lymph node metastasis and poor tumor differentiation (p <
0.05). PD-L1 and HLA-G expression in neoplastic cells/keratinocytes and stroma/connective
tissue was significantly higher in LSCCs and ACs, compared to HLMs (p < 0.05). PD-L1 was
not significantly associated with clinicopathological aspects of the lesions. Most LSCCs
showed coexistence of PD-L1+ and CD8+ cells (72.5%) in the tumor microenvironment. PD-
L1 was directly correlated to CD8+ and GrB+ lymphocytic infiltration in LSCCs (p < 0.05).
Proteins expression was not associated with overall survival of LSCCs patients (p > 0.05). Our
findings suggest that immunosuppressive molecules PD-L1 and HLA-G are consistently
expressed from ACs and are maintained until advanced stages of LSCCs. The correlation
between PD-L1 expression and the expression of CD8 and GrB in carcinomas suggests that that
PD-L1 may appear as an escape mechanism against an active antitumor response.
Keywords: Squamous cell carcinoma; Cheilitis; Lip neoplasms; Immune Evasion;
Immunologic cytotoxicity; Immunohistochemistry
13
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
▪ APC
▪ CCE
▪ CCL2
Célula apresentadora de antígeno
Carcinoma de células escamosas
Do inglês Chemokine (C-C motif) ligand 2
▪ CCR3
▪ CD
▪ CPD
Do inglês C-C chemokine receptor type 3
Do inglês cluster of differentiation (CD4, CD8, CD28, CD80,
CD85d, CD85j, CD86, CD158d, CD163, CD274).
Dímero de pirimidina-ciclobutano
▪ CTLA-4
▪ CXCL8
▪ CXCR5
Antígeno-4 associado ao linfócito T citotóxico
Do inglês C-X-C motif chemokine ligand 8
Do inglês C-X-C chemokine receptor type 5
▪ DNA Ácido desoxirribonucleico
▪ DPM
▪ EGFR
▪ FoxP3
▪ GrB
▪ HIF-α
▪ HLA
▪ IFN-γ:
Desordem potencialmente maligna
Receptor do fator de crescimento epidérmico
Do inglês Forkhead box P3
Granzima B
Fator indutor de hipóxia 1-alfa
Antígeno leucocitário humano
Interferon-gama.
▪ IL Interleucina
▪ ILT-2
▪ ILT-4
▪ KIR2DL4
▪ LILRB1
▪ LILRB2
▪ LTC
Transcrito tipo imunoglobulina-2
Transcrito tipo imunoglobulina-4
Do inglês Killer cell immunoglobulin-like receptors
Do inglês Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B
member 1
Do inglês Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B
member 2
Linfócito T citotóxico
▪ MHC
▪ NFκB
▪ NK
▪ NPM-ALK
Complexo de histocompatibilidade principal
Fator de transcrição nuclear kappa B
Do inglês Natural killer
Do inglês Nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase
14
▪ OMS Organização Mundial de saúde
▪ PD-1
▪ PD-L1
▪ PTEN
▪ QA
▪ ROS
▪ TAM
▪ TCR
▪ TGF-β
▪ TH
▪ TIL
▪ TNF
Receptor de morte programada 1
Ligante do receptor de morte programada 1
Fosfatase homóloga à tensina deletada no cromossomo 10
Queilite actínica
Espécies reativas de oxigênio
Macrófago associado ao tumor
Receptor de célula T
Fator de crescimento transformante beta
Do inglês T helper (TH1, TH2, TH17)
Linfócitos infiltrantes de tumor
Fator de necrose tumoral
▪ TNM
▪ TP53
▪ TRAIL
▪ Treg
Tumor-nódulo-metástase
Do inglês Tumor protein p53
Do inglês Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing
ligand
T regulatória
▪ UV
Ultravioleta
15
SUMÁRIO
1 REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................................... 15
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE FOTOCARCINOGÊNESE DE LÁBIO ... 15
1.2. QUEILITE ACTÍNICA ........................................................................................... 17
1.3 CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE LÁBIO .................................... 20
1.4 RESPOSTA IMUNE NO MICROAMBIENTE TUMORAL .................................. 23
1.4.1 Linfócitos T citotóxicos na vigilância imunológica ............................... 26
1.4.2 Mecanismos de escape à resposta imune antitumoral .......................... 29
2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 41
2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................. 41
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 411
3 ARTIGO - IMMUNE RESPONSE AND EVASION MECHANISMS IN LIP
CARCINOGENESIS: AN IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY………………42
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS……………………………………………………….76
5 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 77
ANEXOS......................................................................................................................91
15
1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE FOTOCARCINOGÊNESE DE LÁBIO
O lábio é uma estrutura anatômica composta por uma área cutânea e uma área de mucosa
oral, com uma zona de transição denominada vermelhão labial (BOTA et al., 2017). O câncer
de lábio se refere às neoplasias malignas que se originam no vermelhão de lábio, que em cerca
de 90% dos casos são do tipo carcinoma de células escamosas (CCE; LAMBERT et al., 2011).
Devido às particularidades do lábio, os CCEs desta localização são geralmente menos
agressivos que os intraorais, pois exibem uma menor tendência em desenvolver metástase para
linfonodos cervicais, porém são mais agressivos que os CCEs cutâneos (BOTA et al., 2017).
Em um contexto mais amplo, a etiologia do CCE é multifatorial e resulta da ação
acumulativa de fatores extrínsecos e/ou intrínsecos variados, como o fumo, ou associação entre
o fumo e o álcool para os CCEs intraorais e a radiação ultravioleta (UV) para os localizados em
pele (SCULLY; BAGAN, 2009; D’ORAZIO et al., 2013). O CCE de lábio se enquadra no
espectro do modelo de fotocarcinogênese observado no câncer de pele, cujo principal fator de
risco é a radiação UV, especialmente do tipo UVB, muito embora fatores sociodemográficos e
de estilo de vida, imunossupressão e susceptibilidade genética também constituam fatores de
risco (XAVIER et al., 2009; SOUZA et al., 2011; OHMAN et al., 2015; NEVILLE et al., 2016).
Destaca-se que quando comparado à pele, o lábio apresenta uma menor proteção aos efeitos
dos raios UV, uma vez que seu epitélio é mais delgado, bem como exibe uma menor quantidade
de melanina e de secreções advindas de glândulas sebáceas e sudoríparas (JADOTTE,
SCHWARTZ, 2012a; VIEIRA et al., 2012).
A exposição crônica aos raios UV do sol pode provocar danos irreversíveis no ácido
desoxirribonucleico (DNA) da célula e induzir imunossupressão, sendo considerado um fator
etiológico para várias condições patológicas humanas (HANNEMAN; COOPER; BARON,
2006). A luz UV consiste em 45% do espectro solar e de acordo com seu comprimento de onda,
é classificada de forma decrescente em UVA (320-400nm), UVB (280-320nm) e UVC (200-
280nm). Os raios UVA e UVB são os principais responsáveis pelos efeitos biológicos, uma vez
que a radiação UVC é absorvida na camada de ozônio (BEISSERT; SCHWARZ, 1999; CHEN
et al., 2014).
Os raios UVA são menos nocivos que os raios UVB, com capacidade de causar danos
indiretos ao DNA, que envolvem a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a 8-
hidróxi-2'-deoxiguanosina (8-OHdG), com consequente formação de bases de DNA oxidativas
16
e mutação de transversão de uma guanina (G) para uma timina (T) (NAKABEPPU et al., 2006).
Em contraste, a ação mutagênica dos raios UVB ocorre diretamente nas bases nucleotídicas,
resultando na formação de dímeros de pirimidina-ciclobutanos (CPDs) e fotoprodutos 6-4
pirimidina-pirimidona (64PP). Os sítios dipirimídicos são regiões de alta susceptibilidade para
mutações e lesões no DNA, como a mutação específica que compreende a transição de uma
citosina (C) em timina (T), denominada assinatura mutacional da luz UV (NISHISGORI et al.,
2015; LIMA, 2015).
As mutações induzidas pela radiação UV atingem alguns genes importantes no controle
do ciclo celular, como o TP53, que codifica a proteína p53. Em condições normais, durante
situações de estresse genotóxico ao DNA, a p53 é ativada para induzir a parada no ciclo celular
na fase G1 e permitir o reparo do dano ao DNA, ou levar a célula a apoptose ou senescência
(CHEN et al., 2014). Considerando sua importância na regulação da resposta ao estresse
genotóxico, o TP53 mutado é frequentemente encontrado no câncer humano, incluindo o CCE
de lábio (JADOTTE; SCHWARTZ, 2012a; LOPES et al., 2016).
Durante a década de 70, alguns experimentos in vivo concluíram que a radiação UV
também provoca imunossupressão capaz de inibir a rejeição de tumores em pele (SCHWARZ,
2005; KRIPKE, 2013). Dentre os mecanismos de imunossupressão induzida pela radiação UV,
destacam-se a inibição da apresentação de antígenos por células dendríticas, indução de
citocinas imunossupressoras, além de modulação de reações de hipersensibilidade do tipo tardia
(SCHWARZ, 2005). Os raios UV são responsáveis por converter o ácido trans-urônico,
naturalmente presente na camada córnea do epitélio, em ácido cis-urônico, que altera a função
e diminui o número de células apresentadoras de antígenos na pele (SCHWARZ et al., 2007;
GIBBS; TYE; NORVAL, 2008). Adicionalmente, os raios UV também induzem tolerância
imunológica antígeno-específica em um processo mediado principalmente por células T
regulatórias (Tregs) secretoras da interleucina (IL)-10, uma citocina fortemente
imunossupressora (SCHWARZ et al., 2007).
A elucidação dos mecanismos envolvidos na tumorigênese de ceratinócitos induzida
pela radiação UV é fundamental para a compreensão da patogênese do CCE de lábio e
consequentemente dos fatores prognósticos e preventivos, considerando que essa neoplasia
muitas vezes é precedida por uma desordem potencialmente maligna (DPM) denominada
queilite actínica (QA), com a qual compartilha o mesmo fator etiológico e perfil epidemiológico
(NEVILLE et al., 2016).
17
1.2 QUEILITE ACTÍNICA
A etiologia da QA foi associada com a exposição solar pela primeira vez por Ayres Jr.
(1923), que analisou cinco pacientes que exerciam atividades ao ar livre em uma região quente
da Califórnia e descreveu os principais aspectos clínicos desta entidade patológica, destacando
que a melhor forma de prevenção seria a proteção contra a luz solar.
Cavalcante, Anbinder e Carvalho (2009) relataram que indivíduos que residem em
países tropicais apresentam maior risco de desenvolver QA, devido ao maior dano causado pela
exposição à luz solar. No Nordeste Brasileiro, a prevalência de QA em indivíduos que
trabalham em praias urbanas ou em agricultores é de cerca de 15% (MARTINS-FILHO;
SILVA; PIVA, 2011; LUCENA et al., 2012).
Além da radiação UV, outros fatores de risco têm sido associados com a QA, como a
predisposição genética (JADOTTE; SCHWARTZ, 2012a) e terapia imunossupressora em
pacientes transplantados (NOLAN et al., 2012). No entanto, o efeito de fatores de risco
importantes para DPMs intraorais, como o tabagismo, ainda não está bem estabelecido para a
QA (JUNQUEIRA et al., 2009; LUCENA et al., 2012).
Tipicamente, a maioria das QAs, bem como dos CCEs de lábio, acomete o lábio inferior
de homens, com cor de pele clara e que exercem atividades profissionais associadas com
exposição crônica ao sol (KAUGARS et al., 2004; CAVALCANTE; ANBINDER;
CARVALHO, 2009; GUTIÉRREZ-PASCUAL et al., 2011; SOUZA et al., 2011; LUCENA et
al., 2012; LOPES et al., 2015; PASTUSZEK; HANSON; GRIGG, 2016; HAN et al., 2016;
BIASOLI et al., 2016). Contudo, salienta-se que o CCE de lábio geralmente surge em
indivíduos na sexta ou sétima década de vida (GUTIÉRREZ-PASCUAL et al., 2011), enquanto
a QA tende a surgir em indivíduos a partir de 40 anos, muitas vezes demorando décadas de
exposição solar crônica para que se transforme em carcinoma, fato que oferece uma vantagem
importante no ponto de vista de diagnóstico e tratamento precoce (JADOTTE; SCHWARTZ,
2012a).
Clinicamente, a QA pode se manifestar na sua forma aguda ou crônica (VIEIRA et al.,
2012; LUCENA et al., 2012). A sua forma aguda ocorre com maior frequência em indivíduos
jovens, geralmente no verão, quando a exposição à luz solar é mais intensa, apresentando-se
como uma lesão eritematosa, com vesículas, bolhas, descamação e mesmo ulceração
(SAVAGE; MCKAY; FAULKNER, 2010). Na fase aguda, a lesão tende a regredir com a
interrupção da exposição solar, enquanto a forma crônica da QA persiste durante todas as
18
estações do ano e acomete preferencialmente indivíduos com mais de 40 anos (LUCENA et al.,
2012).
A QA crônica é geralmente assintomática e caracterizada por atrofia da borda labial,
apagamento da margem entre vermelhão do lábio e porção cutânea, áreas de ressecamento,
discreta aparência rachada, geralmente com apenas uma alteração de cor (FONTES et al., 2009;
HUBER, 2010; SAVAGE; MCKAY; FAULKNER, 2010). Com a progressão da lesão, surgem
características que sugerem dano mais severo no tecido subjacente, como fissuras, além de áreas
de descamação, que podem assumir maior espessura (HUBER, 2010). Nessa fase, a lesão
também pode se apresentar ulcerada, com áreas de erosão circundada por uma área tecidual
leuco, ou eritroplásica (FONTES et al., 2009). A presença de áreas de ulcerações ou erosões
crônicas, nodularidade, sangramento, endurecimento, crostas e leucoplasia ou eritroplasia
persistente, pode sugerir a progressão para CCE de lábio (MARKOPOULOS et al., 2004;
SAVAGE; MCKAY; FAULKNER, 2010; JADOTTE; SCHWARTZ, 2012a; VIEIRA et al.,
2012).
Os aspectos histopatológicos no epitélio da QA variam desde atrofia, hiperceratose,
variados graus de displasias até carcinoma in situ do lábio. É importante ressaltar que tais
alterações displásicas podem estar presentes de forma variável em diferentes localizações do
lábio de um mesmo indivíduo, o que pode refletir diferentes fases do seu processo de evolução
(JADOTTE, SCHWARTZ, 2012a). No interior do tecido conjuntivo, usualmente se observa
degeneração basofílica das fibras colágenas, denominada elastose solar, além de outros
achados, como infiltrado inflamatório de intensidade variada e vasodilatação (FREITAS et al,
2011; VIEIRA et al., 2012).
A maioria das pesquisas evidencia que o aspecto clínico da QA não está correlacionado
com os achados histológicos, visto que áreas clinicamente mais homogêneas ou mais brandas
podem apresentar alterações histológicas significantes, o que ressalta a dificuldade de escolha
da área ideal para a realização de biópsias incisionais (KAUGARS et al., 1999; PIÑERA-
MARQUES et al., 2010; JADOTTE; SCHWARTZ, 2012a; LOPES et al., 2015). A seleção de
uma área representativa para biópsia também é destacada em estudos demonstrando que muitas
vezes, lesões clinicamente diagnosticadas como QA já tinham adquirido fenótipo maligno
quando analisadas microscopicamente (PIÑERA-MARQUES et al., 2010; MARTINS-FILHO;
SILVA; PIVA, 2011; LOPES et al., 2015).
Discute-se na literatura se o grau de displasia epitelial se encontra associado ou não a
uma maior probabilidade de transformação maligna. Warnakulasuriya et al. (2008) relatam que
a severidade da displasia epitelial está diretamente relacionada com a progressão para
19
malignidade, uma vez que corresponde às alterações citológicas e arquitetônicas observadas no
epitélio de uma DPM (WARNAKULASURIYA et al., 2008).
Em 2005, a Organização Mundial da Saúde (OMS), usando como base determinados
critérios morfológicos, classificou a displasia epitelial em leve, moderada, severa e carcinoma
in situ (BARNES et al., 2005). Este sistema é amplamente utilizado, porém a sua
reprodutibilidade tem sido questionada, especialmente devido ao fato de possuir muitas
categorias, o que dificulta a objetividade do patologista (LIU et al., 2010; CÂMARA et al.,
2016; PILATI et al., 2017). Em 2017, a OMS atualizou seu sistema de gradação (EL-NAGGAR
et al., 2017), tratando a categoria “Carcinoma in situ” como sinônimo de displasia severa;
porém por se tratar de uma atualização muito recente, ainda não há estudos publicados que a
utilizem.
Buscando minimizar o problema da reprodutibilidade, Kujan et al. (2006) propuseram
um sistema binário para gradação histológica de displasias epiteliais orais, que é baseado nos
critérios morfológicos preconizados pela OMS (BARNES et al., 2005), simplificando e
reduzindo as categorias para apenas duas: lesões de baixo risco e de alto risco de transformação
maligna. Além disso, alguns estudos têm reclassificado os casos gradados pelo sistema original
da OMS como sem displasia e displasia leve em uma categoria denominada “baixo risco” e os
casos de displasia moderada e severa, como lesões de “alto risco” (CALDEIRA; ABREU;
CARMO, 2012). No entanto, estudos recentes relatam que as lesões gradadas pelo sistema OMS
como displasias epiteliais moderadas, quando submetidas ao sistema binário de Kujan, são
igualmente distribuídas entre grupos de baixo e alto risco (NANKIVELL et al., 2013;
CÂMARA et al., 2016), reforçando a subjetividade da gradação das displasias epiteliais e a
dificuldade de manejo clínico diante de um diagnóstico de displasia epitelial moderada.
Pilati et al. (2017) comparam a gradação da OMS (BARNES et al., 2005) e o sistema
binário proposto por Kujan et al. (2006) em 58 casos de QA. Seus resultados mostraram que
que 87.5% das displasias severas e 77.4% das displasias moderadas pela OMS, foram
classificadas como alto risco no sistema binário de Kujan et al. (2006), e mostraram também
uma correlação altamente significativa entre os dois sistemas de gradação. Adicionalmente, os
autores identificaram que parâmetros como projeções em forma de gota, anisonucleose,
aumento do tamanho do núcleo, disceratose, pleomorfismo nuclear e celular, hipercromasia,
aumento no número de mitoses e perda de estratificação estavam associados com QAs de alto
risco, o que poderia ser utilizado como critério para a recategorização nos casos de displasia
epitelial moderada.
20
Várias alterações relacionadas com a QA podem ser irreversíveis, mas mesmo assim os
pacientes devem ser orientados a utilizar protetor solar labial e mudar os hábitos de exposição
solar para prevenir maiores danos. É importante acompanhar periodicamente o paciente com
QA e realizar biópsias incisionais naquelas lesões com aspecto clínico mais severo, visando
prevenir sua transformação maligna. Em casos com quadro microscópico grave, com
transformação maligna clara, métodos terapêuticos como a excisão cirúrgica (vermelhectomia),
criocirurgia e terapia fotodinâmica podem ser adotados (SHAH; DOHERTY; ROSEN, 2010;
ABAYANEH et al., 2015). Algumas terapêuticas alternativas para a QA também têm sido
associadas com eficácia, como o uso tópico de corticosteroides e diclofenaco de sódio (LIMA
et al., 2010; GONZAGA et al., 2017, no prelo) e o uso tópico do quimioterápico e imuno-
estimulante Imiquimod (SHAH; DOHERTY; ROSEN, 2010). Shah, Doherty e Rosen (2010)
relatam que independente da terapia escolhida, o ideal é que o tratamento da QA seja eficaz
para garantir que não haja o desenvolvimento de CCE de lábio.
1.3 CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE LÁBIO
A estimativa atual de incidência do CCE de lábio é de aproximadamente 0.4 em 100.000
pessoas por ano (HAN et al., 2016), ressaltando-se que em países tropicais, como o Brasil, a
incidência desta malignidade é muito alta devido ao elevado nível de radiação solar (SOUZA
et al., 2011). Contudo, tem sido observada uma redução global na incidência de CCE de lábio,
provavelmente decorrente de uma maior conscientização e uso de estratégias de bloqueio dos
raios solares, como por exemplo, o protetor solar e chapéu (MONTEIRO et al., 2013).
Na maioria dos casos, a aparência clínica do CCE de lábio é descrita como uma úlcera
persistente de bordas endurecidas, de crescimento infiltrativo, ou exofítico, com áreas
leucoplásicas e/ou eritroplásicas (MORSELLI et al., 2007; HASSON et al., 2008). São lesões
predominantemente assintomáticas, com relatos de sintomatologia dolorosa em casos de
estágios mais avançados (OCHSENIUS et al., 2003). Em geral, o diagnóstico é feito em estágio
precoce, com o tumor ainda pequeno, o que contribui para um melhor prognóstico, já que
também exibe menor probabilidade de desenvolver metástase em linfonodos cervicais
(MORSELLI et al., 2007; SENA et al., 2010; SOUZA et al., 2011; WERMKER et al., 2015;
BIASOLI et al., 2016).
Caracteristicamente, os achados histopatológicos do CCE de lábio demonstram cordões,
ilhas ou lençóis de células escamosas malignas, que romperam a membrana basal e invadiram
o tecido conjuntivo, por vezes crescendo como entidades independentes. Tais células
21
neoplásicas exibem amplo espectro de atipias, que inclui anisonucleose, anisocitose,
hipercromatismo, graus variados de pleomorfismo celular e/ou nuclear, aumento do tamanho e
número de nucléolos, figuras de mitoses típicas e/ou atípicas. A presença de disceratose
(ceratinização individual das células) e pérolas de ceratina é variável. O estroma tumoral
geralmente exibe numerosos vasos sanguíneos, grau variado de infiltrado inflamatório e
ocasionais focos de necrose. Também é frequente a presença de elastose solar e anexos
cutâneos. Com a progressão neoplásica, a invasão tumoral pode atingir estruturas adjacentes,
infiltrando tecido adiposo, nervos, músculo, osso, vasos sanguíneos ou linfáticos (NEVILLE et
al., 2016; EL-NAGGAR et al., 2017).
Tradicionalmente, um dos melhores métodos para indicar o prognóstico e o
planejamento do tratamento de neoplasias malignas é através do sistema tumor-nódulo-
metástases (TNM; SENA et al., 2010). O Sistema TNM baseia-se na avaliação de três critérios
fortemente relacionados com o prognóstico e escolha do tratamento para a neoplasia: T - a
extensão do tumor primário; N - a ausência, presença e a extensão de metástases em linfonodos
regionais; M - a ausência ou presença de metástases à distância. A partir da análise destes
aspectos, os tumores são classificados em estágios de I a IV, enfatizando-se que estágios
avançados indicam um pior prognóstico (LYDIATT et al., 2017).
Como mencionado, o CCE de lábio é amplamente considerado como uma doença de
baixa agressividade e prognóstico favorável (VIEIRA et al., 2012). De fato, quando
diagnosticado em estágios iniciais, a taxa de sobrevida global em 5 anos é de aproximadamente
70% a 90% (HASSON et al., 2008; WERMKER et al., 2015; HAN et al., 2016). Embora a
metástase para linfonodos regionais só ocorra em cerca de 9-11% em tumores de estágio
precoce (T1-T2), em tumores T3-T4 essa taxa aumenta para 52% (VANDERLEI et al., 2013).
Na presença de metástase para linfonodos, a taxa de sobrevida do paciente com CCE de
lábio declina subitamente para cerca de 50%, constituindo, portanto, o principal fator
prognóstico para este câncer (PASTUSZEK; HANSON; GRIGG, 2016). Assim, o
esvaziamento cervical, é considerado apropriado em casos de confirmação de metástases para
os linfonodos cervicais, além de ser preconizado por alguns autores como prevenção em
determinados casos com ausência de metástases clinicamente detectáveis, especialmente para
tumores maiores que 3 cm (MORETTI et al., 2011; VANDERLEI et al., 2013). Nestes últimos
casos, apesar do esvaziamento cervical oferecer a vantagem de prover um tratamento cervical
precoce com um diagnóstico patológico detalhado, evitando possíveis recorrências tardias e
orientando a necessidade de terapia pós-operatória adjuvante, trata-se de um procedimento que
causa uma morbidade significante e indesejável (VANDERLEI et al., 2013).
22
De acordo com uma recente revisão sistemática da literatura abordando CCEs de lábio
N0 (sem metástases para linfonodos) tratados estritamente por cirurgia, apenas 0.08% dos casos
apresentaram metástase para linfonodos tardia em um período de 2 anos de acompanhamento
(BANDHARI et al., 2015), sugerindo que para pacientes com pescoço clinicamente negativo,
um acompanhamento rigoroso pode ser a melhor opção. No entanto, ainda não há um consenso
no manejo clínico do paciente com CCE de lábio N0 (PASTUSZEK; HANSON; GRIGG et al.,
2016). Diante dessa controvérsia, possíveis fatores preditivos para a metástase regional têm
sido explorados na literatura, com destaque para o tamanho do tumor, margens cirúrgicas
positivas e recorrência (WERMKER et al., 2015; PASTUSZEK; HANSON; GRIGG et al.,
2016).
Neste contexto, alguns estudos têm buscado características histomorfológicas que
possam ser úteis para predizer o comportamento biológico e prognóstico de tumores com
comportamento clínico semelhante. Baseados em conjuntos de parâmetros individuais, diversos
sistemas de gradação histológica têm surgido como um complemento ao sistema TNM para o
CCE oral (SAWAZAKI-CALONE et al., 2015), mas aplicados também ao CCE de lábio
(SANTOS et al., 2014).
Em 1920, Broders criou o primeiro sistema de gradação histológica baseando-se no grau
de diferenciação celular. Desde então, vários sistemas surgiram, porém ainda não há um
consenso sobre qual deles tem o melhor poder preditivo (LOURENÇO et al., 2007). Dentre os
sistemas mais utilizados, estão o de Bryne (1998), OMS (BARNES et al., 2005) e o de
Brandwein-Gensler et al. (2005).
O sistema proposto por Bryne (1998) descreve que a análise do grau histológico de
malignidade seja realizada no front de invasão tumoral, que corresponde às áreas mais
profundamente invasivas do tumor. Segundo essa autora, importantes eventos moleculares
ocorrem no front de invasão, assim, as células malignas destas áreas seriam consideradas como
aquelas responsáveis pelo comportamento biológico da lesão maligna. Neste sistema, avaliam-
se e atribuem-se escores aos seguintes parâmetros morfológicos: grau de ceratinização,
pleomorfismo nuclear, padrão de invasão e infiltrado inflamatório. Os escores de todos os
critérios são somados para obtenção do escore total que classifica os tumores em baixo e alto
grau de malignidade.
O modelo de risco histológico proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) tem como
base uma análise multiparamétrica de peças cirúrgicas CCE orais (T1 a T4) para predizer a
sobrevida dos pacientes. Neste modelo são estabelecidos escores para o pior padrão de invasão
e resposta linfocítica do hospedeiro na interface do tumor, como também a invasão perineural.
23
Individualmente, tais parâmetros já mostraram poder como indicadores prognósticos em casos
de CCE oral, considerando associação destes com recorrência, sobrevida global e metástases
para linfonodos cervicais (RAHIMA et al., 2004; WOOLGAR, 2006; MATOS et al., 2012;
ALMANGUSH et al., 2014). A soma dos escores de cada parâmetro culmina na classificação
dos pacientes em grupos de baixo, intermediário e alto risco de recorrência local e probabilidade
de sobrevida global (BRANDWEIN-GENSLER et al., 2005).
O sistema proposto pela OMS (BARNES et al., 2005), tem como principal base o grau
de diferenciação celular, que leva em consideração o grau de ceratinização, pleomorfismo
celular, figuras de mitose. O tumor é analisado em toda a sua extensão, para em seguida ser
feita a classificação em três categorias: tumores pouco diferenciados, moderadamente
diferenciados e bem diferenciados.
Após avaliar os três sistemas de gradação explicados nos parágrafos anteriores, Santos
et al. (2014) encontraram que o modelo de risco histológico (BRANDWEIN-GENSLER et al.,
2005) e o sistema de Bryne (1998) apresentam uma associação significativa com a presença de
metástases para linfonodos regionais e estágio clínico do tumor em uma amostra de 59 CCEs de
lábio, consistindo, portanto, em boas opções para predizer o comportamento clínico do tumor.
Com relação ao tratamento de escolha para o CCE de lábio, indica-se ressecção cirúrgica
com margens de segurança e posterior reconstrução labial estética, com ou sem esvaziamento
cervical. Em casos mais agressivos, o uso da quimioterapia e/ou radioterapia tem sido associado
ao procedimento cirúrgico (GUTIÉRREZ-PASCUAL et al., 2011; NEVILLE et al., 2016).
Contudo, apesar dos avanços no diagnóstico e, principalmente, na terapêutica, com técnicas
cirúrgicas modernas, ainda há uma grande necessidade de aprofundamento no entendimento
sobre o comportamento biológico do CCE de lábio.
1.4 RESPOSTA IMUNE NO MICROAMBIENTE TUMORAL
Há muito tempo, sabe-se que o sistema imunológico humano tem a capacidade de
reconhecer e destruir clones de células malignas (BURNET, 1970). Atualmente, é bem
estabelecido que as respostas imunes inata e adaptativa podem proteger o hospedeiro contra o
desenvolvimento do tumor através de mecanismos de vigilância imunológica (SCHREIBER;
OLD; SMYTH, 2011; BREMMES et al., 2016). Isso ocorre devido a miríade de alterações
genéticas e epigenéticas características do câncer, que fornecem um conjunto diversificado de
antígenos tumorais que o sistema imunológico pode usar para distinguir as células tumorais de
suas contrapartes normais e posteriormente, destruí-las (PARDOLL, 2012).
24
Sabe-se, no entanto, que o sistema imunológico não apenas protege o hospedeiro contra
a formação de tumores, mas também é capaz de modular/editar o tumor já estabelecido,
selecionando variantes das células malignas com imunogenicidade reduzida, além de promover
o crescimento tumoral via inflamação crônica persistente. Tais fatos fundamentaram a teoria da
edição imunológica dos tumores (do inglês immunoediting), cujo processo compreende três
etapas: eliminação, equilíbrio e escape (SCHREIBER; OLD; SMYTH, 2011).
Na fase de eliminação, células transformadas são reconhecidas e destruídas pelo sistema
imune inato e adaptativo competente, antes do tumor se tornar clinicamente aparente. Se a
destruição das células tumorais for bem-sucedida, a fase de eliminação é o ponto final do
processo. No entanto, algumas variantes das células malignas podem sobreviver à eliminação
e entrar no estágio de equilíbrio, no qual o sistema imune, especialmente da imunidade
adaptativa, não é capaz de eliminar, mas consegue controlar as células tumorais, que ficam em
um estado de “dormência” que pode durar décadas. Durante o estágio de equilíbrio, o sistema
imune proporciona a pressão seletiva que resulta no crescimento das células tumorais que
adquiriram as mutações mais imunoevasivas. Assim, clones tumorais com baixa
imunogenicidade e/ou maior resistência à vigilância imunológica, conseguem crescer,
evadindo-se da resposta imunológica competente, o que caracteriza a terceira fase, o escape, na
qual o tumor cresce progressiva e visivelmente (SCHREIBER; OLD; SMYTH, 2011; MITTAL
et al., 2014; TENG et al., 2015).
Recentemente, Yagyuu et al. (2017) sugeriram que a teoria de edição imunológica dos
tumores poderia ser aplicada às desordens potencialmente malignas. Essas desordens poderiam
ser enquadradas na fase de equilíbrio, sob controle do sistema imune adaptativo, que seria
incapaz de eliminá-las, mas que preveniria o rompimento da membrana basal e consequente
invasão do tecido conjuntivo. Nesse raciocínio, uma vez que ocorre a transformação maligna,
a lesão teria conseguido romper o equilíbrio, passando para a fase de escape. Esses autores
questionam se nos casos em que DPMs regridem, esse fenômeno seria mediado pela restauração
da resposta imune antitumoral, o que representaria um novo alvo para pesquisas.
Para entender os mecanismos envolvidos na resposta imune tumoral, o estudo dos
componentes celulares e citocinas presentes no microambiente tumoral é fundamental. O
infiltrado de células imunes em tumores sólidos é composto de células do sistema imune inato
e adaptativo, que incluem células dendríticas, mastócitos, células natural killer (NK),
neutrófilos, eosinófilos, linfócitos T, linfócitos B e macrófagos, que podem estar localizados no
centro do tumor, no front invasivo ou em estruturas linfoides terciárias (FRIDMAN et al., 2012;
BREMMES et al., 2016).
25
Os componentes do sistema inato como as células NK, os macrófagos, especialmente
do fenótipo M1, e neutrófilos constituem a primeira linha imunológica de defesa contra tumores
(RUFFELL; AFFARA; COUSSENS, 2012; NIELSEN et al., 2013). Por outro lado, os
componentes do sistema imune adaptativo têm sido mais amplamente estudados, visto que os
linfócitos infiltrantes de tumor (do inglês tumor-infiltrating lymphocytes, TILs) são observados
em diversos tumores malignos, influenciando e moldando o microambiente tumoral
(NIELSEN; NELSON, 2012; TENG et al., 2015, MAO et al., 2016; LEI et al., 2016).
A presença de TILs no tumor dirigidos contra antígenos tumorais é indicativa de uma
resposta imune espontânea em pacientes com câncer. No entanto, as evidências apontam que o
fenótipo, ou mesmo a localização dos TILs no microambiente tumoral, pode determinar se eles
são benéficos ou prejudiciais para as células tumorais (PAGES et al., 2009; ANITEI et al.,
2014). Por exemplo, os linfócitos T CD8+ (linfócitos T citotóxicos, LTCs) são componentes
bem conhecidos da imunidade antitumoral, enquanto as subpopulações de linfócitos T CD4+
estão associadas a um repertório distinto de citocinas que orienta sua resposta imune global.
Efeitos antitumorais pro-inflamatórios de linfócitos T CD4+geralmente são mediados pelo
fenótipo T helper (TH)1 caracterizado pela secreção de interferon-gama (IFN)-γ e de outras
citocinas pró-inflamatórias. Já os efeitos imunossupressores são regidos principalmente por
células Treg, seus fatores de crescimento e citocinas relacionadas, tais quais o fator de
crescimento transformante (TGF)-β e IL-10; ou por células TH2 secretoras de IL-4, IL-5, tipos
celulares geralmente associados a efeitos deletérios em pacientes com câncer
(DESCHOOLMEESTER et al., 2010; GAUR et al., 2014).
Um outro fenótipo presente nos tecidos tumorais é o das células TH17, cuja resposta
imune é caracterizada pela citocina de assinatura IL-17 e fatores de transcrição RORγT e
STAT3, com polarização dependente de alguns fatores de diferenciação (TGF-β, IL-6 ou IL -
2;, KORN et al., 2009). O papel dos linfócitos TH17 no microambiente tumoral ainda é
controverso, uma vez que alguns estudos relatam que estas células podem exercer um efeito
antitumoral através da secreção de IFN-γ ou desencadeando a resposta mediada por LTCs
(TOSOLINI et al., 2011), enquanto outros enfatizam sua capacidade de estimular a angiogênese
tumoral (ZHANG et al., 2009).
Essas respostas imunes adaptativas são induzidas e reguladas por células dendríticas,
que são células apresentadoras de antígenos (APCs, do inglês antigen presenting cells) de
significância clínica importante para pacientes com câncer. As células dendríticas imaturas são
capazes de reconhecer e capturar antígenos no local do tumor primário, dando início à sua
migração para os linfonodos e maturação. As células dendríticas maduras então interagem com
26
linfócitos T CD8+, que podem se diferenciar em células T efetoras, citotóxicas, específicas
contra o antígeno. As células dendríticas também podem apresentar os antígenos tumorais a
células T CD4+naïve, estimulando sua diferenciação em TH1, TH2, TH17 e células Treg
(PALUCKA et al., 2012; COLLIN; MCGOVERN; HANIFFA, 2013).
Outros componentes importantes da resposta imune tumoral são as células que
promovem a inflamação crônica, em especial os macrófagos associados a tumores (TAMs) de
fenótipo M2, que liberam uma ampla variedade de citocinas [por ex., fator de transcrição
nuclear kappa B (NFκB), fator de necrose tumoral (TNF)-α e IL-1], quimiocinas (CCL2,
CXCL8), prostaglandinas, fatores angiogênicos e radicais livres derivados de oxigênio e
nitrogênio, que eventualmente se acumulam no microambiente tecidual (COLOTTA et al.,
2009; FELLER et al., 2013). Desta forma, a presença de inflamação crônica provê um
microambiente pró-tumoral que pode contribuir para várias características chaves da progressão
do câncer, como sobrevivência, angiogênese, invasão e metástase (FELLER et al., 2013).
Assim, de uma forma geral, a resposta imune que ocorre no microambiente tumoral é
dinâmica e heterogênea. A vigilância imunológica pode controlar ou eliminar algumas DPMs
e tumores malignos em estado precoce, mas com o tempo, ocorre uma pressão seletiva dos
clones celulares que são resistentes e escapam desta defesa, desenvolvendo um fenótipo tumoral
capaz de se camuflar do sistema de defesa do hospedeiro e também de modular os componentes
imunes do microambiente, tornando-o cronicamente inflamado, o que é favorável ao
crescimento tumoral (MANTOVANI et al., 2008).
1.4.1 Linfócitos T citotóxicos na vigilância imunológica
Dentre as principais células efetoras da vigilância imunológica contra tumores,
destacam-se as células NK e os LTCs. Nos órgãos linfoides periféricos, os receptores de células
T (TCRs, do inglês T cell receptors) presentes na superfície de células CD8+ são capazes de
reconhecer antígenos tumorais que estão ligados a moléculas do complexo de
histocompatibilidade principal de classe I (MHC-I) em células tumorais (PASCUAL-GARCIA
et al., 2016).
A molécula de MHC também é chamada de antígeno leucocitário humano (HLA),
podendo ser de classe I ou II. As proteínas do MHC-I são expressas em todas as células
nucleadas e quando células humanas sofrem alguma mutação genética e passam a expressar
proteínas estranhas no seu citoplasma, como no caso de células cancerosas. Estas proteínas são
então degradadas pelo proteassoma, liberando peptídeos tumorais que serão transportados para
27
o retículo endoplasmático, onde se associam a moléculas de MCH-I. Este complexo segue para
o complexo de Golgi, onde será internalizado em vesículas que se fundem à membrana
plasmática, culminando na expressão do peptídeo-MHC-I na superfície da célula para posterior
reconhecimento pelos TCRs dos LTCs (JOFFRE et al., 2012; ABBAS; LITCHMAN; PILLAI,
2015). A apresentação de antígenos tumorais aos LTCs também pode ocorrer de forma cruzada,
quando determinadas células apresentadoras de antígeno “profissionais”, como as células
dendríticas, conseguem absorver, processar e apresentar antígenos extracelulares com MHC-I
para os LTCs (JOFFRE et al., 2012).
Após o reconhecimento inicial do antígeno tumoral pelo LTC, é necessário um segundo
sinal, que é a interação das moléculas coestimuladoras expressas nas APCs, tais quais B7-1
(CD80) e B7-2 (CD86), com o receptor CD28 expresso na superfície da célula T (HARRIS;
RONCHESE, 1999). Essa coestimulação desencadeia sinais adicionais que influenciam a
sobrevivência, proliferação e diferenciação de células T CD8+ (ABBAS; LITCHMAN;
PILLAI, 2015).
Para que ocorra ativação das células T, deve haver um equilíbrio entre esses receptores
coestimulatórios e coinibitórios, ambos da família CD28, expressos na superfície destas células
e fundamentais para o checkpoint imunológico, uma vez que são fatores chave na regulação da
resposta imunológica (PARDOLL, 2012). Esses receptores incluem o antígeno-4 associado ao
linfócito T citotóxico (CTLA-4) e o receptor de morte programada 1 (PD-1; PARDOLL, 2012;
ABBAS; LITCHMAN; PILLAI, 2015).
Após sua ativação, as células T CD8+ seguem por um processo de diferenciação e
expansão para gerar um grande número de células efetoras que migrarão para os tecidos-alvos
(ABBAS; LITCHMAN; PILLAI, 2015). No final deste processo, os LTCs são capazes de
destruir células tumorais específicas por dois mecanismos: (1) citotoxicidade dependente do
receptor de morte FAS, TNF, ou do receptor de TRAIL; (2) citotoxicidade dependente da
secreção de grânulos (HARARI et al., 2009; DESCHOOLMEESTER et al., 2010). Além disso,
os LTCs também secretam IFN-γ, que contribui com a diferenciação de células T CD4+
auxiliares em TH1, bem como com a ativação clássica de macrófagos (ABBAS; LITCHMAN;
PILLAI, 2015).
O principal mecanismo antitumoral dos LTCs é mediado pela secreção dos grânulos
citoplasmáticos que contêm proteínas citotóxicas, como as perforinas e granzimas (ABBAS;
LITCHMAN; PILLAI, 2015). Uma vez que o LTC reconhece a célula-alvo, ocorre a formação
da sinapse imunológica, por onde ocorre a exocitose dos grânulos para o anel sináptico presente
entre as membranas do LTC e da célula-alvo. A perforina exerce sua função ao gerar poros na
28
membrana da célula-alvo, permitindo a difusão dos grânulos de granzima para o interior do
citoplasma da célula-alvo, que culmina em apoptose (D’ELISEO et al., 2010; VOSKOBOINIK
et al., 2015).
Dentre as granzimas, a granzima B (GrB) possui o efeito pró-apoptótico mais potente,
preferencialmente através da ativação direta de caspases, sendo a única considerada essencial
para a citotoxidade de LTCs in vivo (VOSKOBOINIK et al., 2015; ABBAS; LITCHMAN;
PILLAI, 2015).
A alta expressão de CD8 e GrB no microambiente tumoral tem sido apontada como um
fator favorável para o prognóstico de pacientes com diversos tipos de malignidades, incluindo
câncer de mama (MAO et al., 2016), ovário (SATO et al., 2005), colorretal (GALON et al.,
2006; PAGÈS et al., 2009), orofaringe (MEULENAERE et al., 2017), melanomas (HOUDT et
al., 2009; LADOIRE et al., 2016) e carcinoma oral (WATANABE et al., 2010; COSTA et al.,
2010; FANG et al., 2017).
Altos níveis de TILs CD8+ em CCE oral têm sido significativamente associados a
tumores não metastáticos (PEREIRA et al., 2014; FANG et al., 2017), menor estágio clínico
(CHO et al., 2011; MALEKI et al., 2011), tamanho limitado do tumor (CHO et al., 2011) e
tumores bem diferenciados (PEREIRA et al., 2014). Watanabe et al. (2010) demonstraram que
o baixo número de TILs CD8+ no interior dos ninhos neoplásicos e no estroma de CCEs orais
foi relacionado a menor sobrevida. Corroborando esses achados, Fang et el. (2017) encontraram
que altos níveis de TILs CD8+ em CCE orais foram associados com ausência de metástases
regionais e melhor sobrevida global.
Silveira et al. (2010) observaram que os TILs CD8+ foram mais expressos em CCEs de
lábio inferior, que nos tumores localizados em língua, sugerindo que a atividade linfocítica no
front de invasão de CCEs de língua e lábio inferior pode estar relacionada com diferença de
agressividade observada entre esses carcinomas. Zancope et al. (2010) relataram um aumento
na densidade de linfócitos T CD8+ em CCEs de lábio, quando comparados a CCEs orais
metastáticos e a QAs. Nesse último caso, a baixa citotoxicidade nas fases precoces da
tumorigênese de lábio pode ser interpretada como um fator favorável à transformação maligna,
ou mesmo à passagem da fase de “equilíbrio” da DPM, para o “escape”.
Em 2011, Costa et al. (2011) também realizaram uma análise comparativa de células
CD8+Perforina+ e GrB+ em CCEs de lábio, intraorais, DPMs e mucosa oral normal. Os CCEs
de lábio expressaram maior densidade de células CD8+Perforina+ e também GrB+ que CCEs
intraorais, leucoplasias, QAs, líquens planos e mucosa oral normal, destacando um
microambiente rico em atividade citotóxica neste tipo de tumor.
29
1.4.2 Mecanismos de escape à resposta imune antitumoral
Ao nível celular, muitos tumores conseguem escapar à resposta imunológica antitumoral
ao lançar mão de mecanismos que resultam na redução do reconhecimento da célula maligna
ou na resistência aos efeitos citotóxicos do sistema imune, que consistem na fase de evasão da
edição imunológica (SCHREIBER; OLD; SMYTH, 2011; Figura 1).
Figura 1. Alguns mecanismos tumorais de evasão do sistema imunológico. (A) No microambiente tumoral, há um
enriquecimento de células imunossupressoras, que incluem células Tregs, células supressoras derivadas da
linhagem mieloide (MDSC) e TAMs. (B) Interação entre ligantes coinibitórios expressos por células tumorais e
receptores coinibitórios expressos por células T ativadas. (C) Produção de citocinas imunossupressoras por células
tumorais. FONTE: adaptado de Park et al. (2016).
Apresentação defeituosa de antígenos tumorais devido à perda de proteínas MHC-I, ou
ausência de expressão de importantes antígenos tumorais, são exemplos de defeitos no processo
de reconhecimento da célula maligna pelo sistema imune. O estabelecimento de um
microambiente tumoral imunossupressivo pelo aumento de células Tregs, TAMs e/ou produção
citocinas, como TGF-β e IL-10 também são importantes mecanismos de escape (VINAY et al.,
2015; TENG et al., 2015).
Outro mecanismo de evasão das células tumorais consiste na expressão das, já
mencionadas, moléculas inibitórias do checkpoint imunológico, tais como CTLA-4, PD-1 e o
antígeno leucocitário humano não-clássico (HLA-G), que são muito importantes em situações
fisiológicas ao manter a tolerância imunológica, evitando situações de autoimunidade, uma vez
que são capazes de regular a atividade das células T. Isso é muito relevante para a biologia do
30
câncer, pois de acordo com Wang et al. (2008), a destruição tecidual imunologicamente
mediada que ocorre no microambiente de neoplasias malignas, a qual eles denominam de
“constante imunológica da rejeição”, também ocorre em outros processos patológicos, como
rejeição de aloenxertos, na resposta imune à agentes infecciosos e doenças autoimunes.
Dentre as moléculas que compõem o checkpoint imunológico, encontra-se o PD-1, uma
proteína de membrana que integra a família dos receptores CD28 e encontra-se expressa
principalmente na superfície de células T ativadas (ZANDBERG et al., 2014; SWANSON et
al., 2015). No microambiente tumoral, a ligação do PD-1 presente em células T com ligantes
específicos expressos por células tumorais, ou células estromais, resulta em apoptose ou anergia
destas células (ZOU et al., 2008). Esta ligação pode acontecer durante a primeira exposição da
célula T ao antígeno, ou durante a expansão destas células, e traduz-se em um mecanismo
potente do tumor contra a resposta imune antitumoral (FREEMAN et al., 2000; PARDOLL et
al., 2012; TAUBE et al., 2014).
O PD-L1 (B7-H1; CD273) e PD-L2 (B7-DC; CD273) são os dois ligantes do receptor
PD-1, porém PD-L1 é o mais explorado no contexto da resposta imune no câncer (ZANDBERG
et al., 2014). O PD-L1 foi primeiramente relatado em 1999, como uma proteína transmembrana
de 290 aminoácidos codificada pelo gene CD274 (DONG et al., 1999), e atualmente sabe-se
que há superexpressão desta proteína em tumores malignos sólidos de diversas localizações
anatômicas (WU et al., 2015). Vários tipos de células infiltrativas nos tumores podem expressar
o PD-L1, como células malignas, linfócitos T, linfócitos B, macrófagos, células supressoras
mieloides, células dendríticas e células endoteliais (PARDOLL et al., 2012; SHAH et al., 2016).
O estímulo necessário para expressão de PD-L1 em tumores advém de dois mecanismos
denominados de (1) resistência imunológica inata, ou mecanismo intrínseco, e (2) resistência
imunológica adaptativa, também chamada de mecanismo extrínseco (PARDOLL et al, 2012;
MINO-KENUDSON, 2016; BERRY; TAUBE, 2015; Figura 2). É provável que em ambos
mecanismos, o estímulo para PD-L1 ocorra através de vias de sinalização independentes, que
podem diferir entre pacientes ou tipos diferentes de câncer (SONG et al., 2012).
31
Figura 2. Dois mecanismos gerais de expressão de PD-L1 em células tumorais. (A) Resistência imune inata,
caracterizada pela sinalização constitucional oncogênica que pode aumentar a expressão de PDL1,
independentemente dos sinais inflamatórios no microambiente do tumor. (B) Resistência imune adaptativa: em
alguns tumores, o PD-L1 não é constitutivamente expresso, mas é induzido em resposta a sinais inflamatórios que
são produzidos por uma resposta imune antitumoral ativa. A expressão não uniforme de PD-L1, que é comumente
restrita a regiões do tumor que têm linfócitos infiltrantes, sugere que o estímulo para expressão de PD-L1 é
inflamatório, como o IFN-γ. FONTE: adaptado de Pardoll (2012).
No mecanismo de resistência imunológica inata, a superexpressão de PD-L1 é induzida
por vias de sinalização oncogênicas intrínsecas das células malignas de alguns tumores, tais
como a perda do gene supressor de tumor PTEN (fosfatase homóloga à tensina deletada no
cromossomo 10) em gliomas (PARSA et al., 2007) e em carcinomas colorretais (SONG et al,
2012); rearranjos NPM-ALK em linfomas de células grandes anaplásicas (MARZEC et al.,
2008); e mutações no gene EGFR em carcinomas de pulmão de células não-pequenas (AKBAY
et al., 2013; CHEN et al., 2015a.).
No mecanismo extrínseco, a superexpressão de PD-L1 pode ser induzida como uma
resposta ou adaptação do tumor à presença de citocinas pró-inflamatórias no microambiente
tumoral, especialmente o IFN-γ (TSUSHIMA et al., 2006; CHEN et al., 2012; SHAH et al.,
2016). Este mecanismo é interpretado como uma resistência imunológica adaptativa, no qual
as células malignas adquirem a capacidade de se defenderem da resposta imune antitumoral,
uma vez que a presença de IFN-γ desempenha um papel crucial na ativação de linfócitos T
efetores e atividade de células dendríticas, indicando processos antitumorais (MANDAI et al.,
2016).
A expressão de PD-L1 está relacionada a diversos mecanismos de evasão da resposta
imune, principalmente por induzir a apoptose de células T de forma dependente ou
independente de PD-1 (DONG et al., 2002; ZOU et al., 2008). A interação de PD-L1,
32
principalmente nas células dendríticas, com PD-1 também é capaz de causar anergia e exaustão
em células T (CURIEL et al., 2003; ZOU et al., 2008). Células T citotóxicas que sofrem
exaustão perdem sua função efetora, tornando-se incapazes de secretar moléculas citolíticas e
citocinas pró-inflamatórias como IL-2, IFN-γ e TNF-α, além de reduzirem sua taxa proliferativa
(ZOU et al., 2008; WHERRY et al., 2011; OHAEGBULAM et al., 2014).
Alguns estudos também demonstram que o PD-L1 pode se ligar ao PD-1 presente na
superfície de células Tregs e estimular a diferenciação e manutenção de função destas últimas
ao induzir a expressão de FoxP3 e TGF-β (FRANCISCO et al., 2009). Em pacientes com
melanoma, o bloqueio de PD-1 nas Tregs levou à inibição da capacidade de mediar tolerância
imunológica, sugerindo que PD-1 pode induzir diretamente na função imunossupressora destes
tipos celulares (WANG et al., 2009).
Este “escudo molecular” fornecido por PD-L1 para proteger as células tumorais da
destruição por células T citotóxicas (SONG et al., 2012), tem sido descrito como um preditor
importante do comportamento de neoplasias malignas. A maioria dos estudos demonstra uma
associação entre a superexpressão de PD-L1 e uma maior agressividade do tumor e/ou pior
prognóstico, incluindo pacientes com câncer de mama (MUENST et al., 2014), pulmão
(SHIMOJI et al., 2016), câncer nasofaríngeo (HSU et al., 2010), esofágico (HUANG et al.,
2015; CHEN et al., 2016) e colorretal (SONG et al., 2012).
A literatura demonstra que células malignas de CCE intraoral expressam
abundantemente o PD-L1, com um impacto no prognóstico de pacientes (OLIVEIRA-COSTA
et al., 2015; LIN et al., 2015; CHEN et al., 2015b; STRAUB et al., 2016; STASIKOWSKA-
KANICKA et al., 2017), embora também haja relato de que a expressão desta proteína não afeta
a sobrevida de pacientes com CCE oral (CHO et al., 2011).
Lin et al. (2015) encontraram que a alta expressão de PD-L1 foi associada a uma baixa
taxa de sobrevida global apenas em pacientes do sexo masculino e pacientes fumantes com
CCE oral. Dentre os 218 CCEs orais de estágios clínicos avançados (III/IV) com metástase para
linfonodos estudados por Chen et al. (2015), apenas tumores com necrose (medida pela
expressão de HIF-α) e expressão positiva de PD-L1 nas áreas circunjacentes à necrose foram
associados com o pior controle de doença e pior sobrevida. Esses autores também
demonstraram que após a análise multivariada, a presença de necrose e expressão de PD-L1 no
nódulo linfático metastático foram fatores prognósticos desfavoráveis significativos (CHEN et
al., 2015b).
A expressão de PD-L1 por células tumorais também foi associada com a morte
específica pela doença, recorrência tumoral e maior risco de metástase linfonodal nos 80 casos
33
de CCEs orais analisados por Straub et al. (2016). Nesta mesma linha de raciocínio,
Stasikowska-Kanicka et al. (2017) demonstraram que a expressão de PD-L1 em células
tumorais de CCEs orais foi associada com o grupo de pobre prognóstico.
Oliveira-Costa et al. (2015) relataram uma associação entre a maior expressão de
transcritos de PD-L1 com CCEs orais maiores que 4 cm e status de linfonodo regional positivo.
No entanto, em contraste com os estudos acima mencionados, estes autores demonstraram que
maiores níveis proteicos de PD-L1 nas células tumorais foi um fator prognóstico benéfico
independente no seu coorte. Adicionalmente, um ponto importante foi destacado por estes
autores: esta associação foi encontrada apenas para a expressão citoplasmática desta proteína,
enquanto que a maioria dos estudos avalia a expressão apenas na membrana, ou na membrana
e citoplasma juntos.
Malaspina et al. (2011) estudaram a expressão da proteína PD-L1 e PD-1 em leucócitos
do sangue periférico de pacientes com CCEs orais, QAs e pacientes saudáveis. Os autores
encontraram que há um aumento de células T CD4+PD-1+ e T CD8+PD-1+ em QAs, quando
comparadas aos controles. Além disso, estes autores estudaram a expressão de PD-1 em
espécimes parafinados, observando uma maior expressão de PD-1 em CCEs orais, que em
queilites actínicas.
Recentemente, Yagyuu et al. (2017) estudaram a expressão de PD-L1, CD8 e CD163
no epitélio e lâmina própria de 120 DPMs orais com dados detalhados sobre o
acompanhamento. Nas lesões morfologicamente gradadas como de alto risco, estes autores
observaram que o PD-L1 esteve expresso tanto no epitélio quando na área subepitelial,
enquanto nos casos de baixo risco, sua expressão foi restrita às células inflamatórias na lâmina
própria. A maior expressão de PD-L1 tanto no epitélio, quando na lâmina própria, foi associada
com um menor tempo livre de transformação maligna em 5 anos, e foi o único fator associado
com a transformação maligna na análise multivariável. Estes autores sugeriram que PD-L1 pode
participar da evasão do sistema imunológico em DPMs orais e que o bloqueio desta via pode
ser um potencial alvo imunoterapêutico para prevenir o câncer nesta localização.
No que diz respeito a CCEs cutâneos, o estudo de Slater et al. (2016) demonstrou uma
maior expressão de PD-L1 em casos classificados como de alto risco para o desenvolvimento
de metástase, de acordo com um conjunto de características clínicas e morfológicas (diâmetro
do tumor, grau histológico e espessura tumoral).
Gambichler et al. (2017) investigaram a expressão de PD-L1 em lesões de diferentes
estágios progressivos do CCE cutâneo e também de ceratoacantomas, observando que a
expressão foi significativamente maior em ceratinócitos e células imunes dos CCEs e dos
34
ceratoacantomas, quando comparados aos espécimes de ceratose actínica e CCEs in situ
(doença de Bowen).
Schaper et al. (2017) enfatizaram a importância de avaliar a expressão de PD-L1 em
TILs, ao relatar uma possível associação com características clínicas do tumor, visto que CCEs
cutâneos de áreas expostas ao sol revelaram uma alta expressão desta molécula nos TILs,
quando comparados aos tumores de áreas não expostas. Estes autores discutiram que este
achado pode estar relacionado à alta carga mutacional das malignidades de áreas expostas à
radiação ultravioleta.
De fato, a maioria dos estudos se concentra na análise da expressão de PD-L1 em células
tumorais, enquanto a sua expressão por células imunes infiltrando os tumores é frequentemente
negligenciada. Um estudo abrangente sobre pacientes com diferentes tipos de câncer, como
câncer de pulmão, rins, pâncreas, cabeça e pescoço, melanoma, câncer gástrico e colorretal,
demonstrou que as células imunes PD-L1+ foram mais frequentemente observadas que as
células tumorais PD-L1+ (HERBST et al., 2014).
Geralmente, as células imunes PD-L1+ em tumores incluem células mieloides
(macrófagos, células dendríticas) e células T (HERBST et al., 2014). A expressão de PD-L1
por diferentes populações de células imunes no microambiente de neoplasias malignas e DPMs
permanece pouco investigada, embora alguns estudos tenham demonstrado uma predominância
da expressão dessa proteína em TAMs (KUANG et al., 2009; LYDFORD-PIKE et al., 2013;
WEBB et al., 2016; YAGYUU et al., 2017), seguidos de células dendríticas (CHEN et al., 2007;
MU et al., 2011).
A correlação entre PD-L1 e os números de TILs CD8+ também tem sido investigada.
Em CCEs orais, uma alta expressão de PD-L1 nas células tumorais tem sido associada com a
redução no número de TILs CD8+ (CHO et al., 2011; STASIKOWSKA-KANICKA et al.,
2017), o que reforça a hipótese de que bloquear a ação de PD-L1 pode reforçar o braço efetor
da resposta imune antitumoral. Por outro lado, vários estudos têm sugerido que a expressão de
PD-L1 em CCEs orais é estimulada por IFN-γ secretado por TILs, sugerindo fortemente a
coexistência de PD-L1 e TILs em um mecanismo de resistência adaptativa no microambiente
destes tumores (TSUSHIMA et al., 2006; MALASPINA et al., 2011; CHEN et al. 2012, SHAH
et al., 2012).
Na verdade, uma correlação positiva entre PD-L1 em células tumorais e TILs tem sido
relatada em diferentes tipos de tumores. Kim et al. (2015) demonstraram que em CCEs de
pulmão, a expressão elevada de PD-L1 por células tumorais é consistentemente observada nos
casos com alta infiltração de células T CD8+. Em CCEs de laringe, a porcentagem de TILs foi
35
significativamente associada à maior expressão de PD-L1, como também uma maior densidade
de TILs e níveis de PD-L1 foi associada ao melhor prognóstico para os pacientes
(VASSILAKOPOULOU et al., 2016).
Nesta linha, muitos estudos mostraram que, em nível transcricional, uma correlação
positiva entre fatores pró-inflamatórios citotóxicos (resposta TH1 ativa, quimiocinas
CXCR5/CCR3 e grânulos citotóxicos) e imunossupressores (PD-L1, PD- 1, CTLA4) são
características não apenas de casos com prognóstico favorável, mas também de casos com uma
melhor capacidade de resposta à imunoterapia em diferentes tumores sólidos, como melanoma,
câncer de mama, de ovário, cervical e de bexiga (HERBST et al., 2014; BEDOGNETTI et al.,
2015; BEDOGNETTI et al., 2016; WEBB et al., 2016).
Considerando esse complexo microambiente tumoral, Teng et al. (2015) propuseram
uma classificação simples do microambiente tumoral em quatro categorias (Tipo I-IV) com
base na presença ou ausência de PD-L1 e TILs em melanomas:
• Tipo I: expressão PD-L1 na presença de TILs (resistência adaptativa). A expressão de
PDL1 é interpretada como uma resposta adaptativa a IFNs, especialmente IFN-γ, secretado por
células T ativadas;
• Tipo II: ausência de PD-L1 e ausência de TILs (ignorância imunológica). Acredita-se
que tumores com este microambiente estejam associados a um pior prognóstico, dada a ausência
generalizada de reação imune;
• Tipo III: expressão de PD-L1 na ausência de TILs (indução intrínseca). Neste tipo de
tumor, o PD-L1 é expresso em células cancerosas através de vias sinalização oncogênicas
intrínsecas, portanto sua expressão não depende do IFN.
• Tipo IV: presença de TILs na ausência de PD-L1, indicando que nestes tumores é mais
provável que outras vias imunossupressoras estejam atuando.
Esta classificação tem sido utilizada por pesquisas recentes (WEBB et al., 2016; OCK
et al., 2017) e embora seja mais relevante para melhor guiar a imunoterapia, ela tem o potencial
de revelar associações com aspectos clinicopatológicos e comportamento clínico do tumor.
Outra molécula inibitória do checkpoint imunológico é o HLA-G, que é uma molécula
de classe I não-clássica do MHC. Em humanos, as proteínas MHC-I são codificadas por genes
altamente polimórficos clássicos de MHC de classe Ia (HLA-A, HLA-B e HLA-C), ou por
genes menos polimórficos não-clássicos de MHC de classe Ib (HLA-E, HLA-F, HLA-G e
HLA-H; PRATHEEK et al., 2014).
O HLA-G foi primeiramente descrito por Geraghty, Koller e Orr (1987) através de
experimentos conduzidos para identificar todos os genes HLA de classe I. Estruturalmente, o
36
HLA-G é muito similar às moléculas de MHC-I clássicas, apresentando uma cadeia alfa
constituída por até três domínios, não-covalentemente ligada a uma cadeia de β2-
microglobulina (HANSEN; LEET, 1997). No entanto, diversas características peculiares de
HLA-G o diferenciam das moléculas MHC-I clássicas: (1) exibe polimorfismo gênico limitado
a 46 alelos; (2) o transcrito primário sofre splicing alternativo, que resulta em sete isoformas
proteicas diferentes, sendo quatro destas associadas à membrana celular (HLA-G1, -G2, -G3, e
-G4) e três secretadas (HLA-G5, -G6, e -G7); (3) expressão tecidual limitada a tecidos com
privilégio imune em condições fisiológicas (por ex., trofoblasto, epitélio do timo, ilhotas
pancreáticas, ceratinócitos da córnea e precursores eritroides e endoteliais), sendo induzida em
condições patológicas, tais como doenças inflamatórias, infecções virais, transformação
maligna e câncer; e (4) propriedades imunossupressoras (SHEU; SHIH, 2010; CAROSELLA
et al., 2011; KOCHAN et al., 2013).
A primeira função atribuída ao HLA-G foi observada na tolerância imunológica
materno-fetal, pela proteção do feto contra o ataque pelo sistema imunológico materno, através
da inibição da ação citolítica das células NK maternas por citotrofoblastos fetais expressando
HLA-G (ROUAS-FREISS et al., 1997; FERREIRA et al., 2017).
As funções imunossupressoras do HLA-G são exercidas através de sua ligação com
receptores inibitórios: transcrito tipo imunoglobulina-2 (ILT-2; LILRB1/CD85j), expresso em
células linfoides e mieloides; ILT-4 (LILRB2/CD85d), expresso por células mieloides e o
receptor tipo imunoglobulina das células NK, denominado KIR2DL4 (CD158d) (LEMAOULT
et al., 2005). Assim, a HLA-G tem um impacto na regulação das principais células evolvidas
na citotoxicidade contra os tumores (LTCs, células NK e APCs), como ilustrado na Figura 3.
37
Figura 3. Mecanismos de evasão imune do câncer mediados por HLA-G. (A) Interação entre o HLA-G advindo
de células tumorais e receptores nas células NK e T levam à apoptose destas últimas. (B) A função de células NK
ativadas é bloqueada diretamente pelo HLA-G de células tumorais, processo que também ocorre em células T. (C)
Na presença do HLA-G, as células T CD4+ e CD8+ perdem a capacidade de responder a antígenos e são estimuladas
a se diferenciar em células Treg. (D) Durante o contato célula-célula, as moléculas ligadas à membrana HLA-G
contidas em células tumorais são adquiridas por células NK, células T ativadas e células dendríticas por
trogocitose, resultando em imunossupressão. A expressão de HLA-G está aumentada em vários tipos de câncer
sólidos e hematológicos, sugerindo um potencial relevante para marcador diagnóstico e prognóstico. Além disso,
o HLA-G pode ser um alvo terapêutico através do bloqueio desta molécula com anticorpos específicos ou usando
peptídeos HLA-G, que resultam no aumento da resposta imune antitumoral. FONTE: adaptado de Curigliano et
al., 2013.
Quando ocorre a interação entre o HLA-G e o ILT-2 das células NK, há uma interrupção
na sinapse imunológica, o que inibe a secreção de grânulos citotóxicos e consequentemente, a
lise de células alvo (CHEN et al., 2013). Já a ligação entre HLA-G com outro receptor das
células NK, KIR2DL4, não afeta a citotoxicidade, mas induz a produção de fatores pró-
inflamatórios e pró-angiogênicos (RAJAGOPALAN et al., 2001; RAJAGOPALAN et al.,
2005).
Os efeitos inibitórios que a molécula HLA-G exerce nos linfócitos T CD8+ envolvem a
inibição da proliferação e atividade citotóxica (KAPASI et al., 2000; KOCHAN et al., 2013),
38
além de induzir apoptose destas células mediada pela via do CD95 (FOURNEL et al., 2000;
KOCHAN et al., 2013; AMODIO; ALBUQUERQUE; GREGORI., 2014). O estudo de Wiendl
et al. (2002) em uma linhagem celular de glioblastomas revelou que a presença de HLA-G em
apenas10% das células tumorais já é suficiente para inibir a citotoxidade de LTCs e prevenir a
destruição de células tumorais HLA-G-negativas.
Experimentos in vitro demonstraram que a trogocitose (transferência intercelular de
conteúdos citoplasmáticos ou fragmentos de membrana) pode representar um outro mecanismo
de imunossupressão da HLA-G (LEMAOULT et al., 2007). Através deste mecanismo, o HLA-
G de APCs pode ser facilmente adquirido por células T CD8+ ou CD4+ ativadas, ou ainda por
células NK, que imediatamente assumem um caráter regulatório e imunossupressor
(LEMAOULT et al., 2007; CAROSELLA et al., 2011). Adicionalmente, o HLA-G também é
capaz de inibir a maturação e ativação de células dendríticas, induzindo o desenvolvimento de
células dendríticas tolerogênicas secretoras de IL-10, que suprimem a atividade de células T
CD4+ e CD8+ (RISTICH et al., 2005; KOCHAN et al., 2013).
Diante de suas funções, a expressão de HLA-G por células malignas tem sido
considerada como um mecanismo de escape da vigilância imunológica, sendo frequentemente
detectada em diversos tipos de câncer em associação com pior prognóstico, incluindo
carcinoma de mama (KRUJIF et al., 2010), fígado (CAI et al., 2009), esôfago (YIE et al., 2007)
e câncer colorretal (GUO et al., 2015).
No que diz respeito ao câncer de pele, em 1999, Cabestré et al. demonstraram um alto
nível de transcrição de HLA-G em melanomas biopsiados, quando comparados à pele saudável,
bem como a inibição da citotoxicidade mediada por células NK em uma linhagem celular de
melanoma positiva para a proteína HLA-G. Contudo, a expressão proteica de HLA-G em
espécimes de melanoma tem sido descrita como amplamente variável, com estudos
demonstrando a positividade em 30% dos casos e estudos mostrando negatividade em toda a
amostra (FRUMENTO et al., 2000; BEZUHLY et al., 2008).
O estudo de Aractingi et al. (2003) avaliou a expressão de HLA-G em lesões benignas
e malignas de pele de pacientes submetidos a transplantes renais. Os resultados revelaram que
a expressão desta proteína foi frequente em CCE cutâneo invasivo e in situ, carcinoma
basocelular e em DPMs como a ceratose actínica, porém esteve ausente em lesões benignas
como ceratoacantoma, sugerindo a participação desta molécula no surgimento de malignidades
nesses pacientes imunossuprimidos.
Poucos estudos abordaram a participação do HLA-G no contexto do CCE oral, porém
os resultados mais relevantes diziam respeito à transformação de desordens potencialmente
39
malignas (FREGONEZI et al., 2012; GONÇALVES et al., 2014; GONÇALVES et al., 2015;
GONÇALVES et al., 2017). De fato, além da sua participação na progressão do câncer, o HLA-
G tem sido associado com a transformação maligna, como sugerido na década passada por
Ibrahim et al. (2004). Estes autores realizaram um estudo imunoistoquímico em 174 lesões
melanocíticas incluindo entidades benignas e malignas, cujos resultados revelaram uma
expressão de HLA-G maior em melanócitos e células imunes de melanomas, quando
comparada com nevos e lentigos, além de ser completamente negativa em pele saudável.
Quanto à análise da associação entre a expressão de HLA-G e transformação maligna
em cavidade oral, os achados são contraditórios. Fregonezi et al. (2012) encontraram uma maior
imunoexpressão de HLA-G em lesões orais benignas (n=18) e potencialmente malignas (n=16),
que em CCE oral (n=17), sugerindo que o HLA-G poderia ser uma molécula importante para a
passagem do estágio de equilíbrio para o escape em DPMs, mas uma vez que o câncer se
estabelece, outras particularidades genéticas do CCE oral poderiam estar relacionadas com a
perda desta molécula.
Utilizando uma amostra maior de carcinomas, Gonçalves et al. (2014) demonstraram
uma imunoexpressão significantemente maior de HLA-G em CCEs orais (n=60), quando
comparados à leucoplasias (n=20). Além disso, eles também observaram uma maior expressão
em lesões metastáticas e tumores com maior profundidade de invasão, bem como uma
associação desta molécula com uma tendência a um menor tempo de sobrevida dos pacientes.
Posteriormente, esse mesmo grupo de pesquisa reforçou que a expressão de HLA-G em CCEs
orais e em leucoplasias orais esteve aumentada, quando comparados ao microambiente de
mucosas orais saudáveis (GONÇALVES et al., 2015; GONÇALVES et al., 2017).
No que diz respeito à carcinogênese de lábio, Gonçalves et al. (2016) avaliaram a
expressão de HLA-G em 20 CCEs de lábio, 30 QAs e 10 mucosas saudáveis de lábio. Estes
autores encontraram que o padrão de expressão dessa molécula foi citoplasmático e membranar,
sendo mais frequente nas camadas basais e suprabasais do epitélio de QAs e nos ninhos
neoplásicos dos CCEs. Houve uma expressão significativamente maior em CCEs de lábio,
quando comparados aos dois outros grupos, refletindo que o HLA-G é um fator com potencial
para atuar na imunossupressão frequentemente observada durante a carcinogênese labial.
O estudo destas moléculas do checkpoint imunológico é de grande interesse, visto que
recentemente, o uso de anticorpos monoclonais para bloquear estas moléculas tem sido
promissor ao resultar em imunidade antitumoral melhorada em diversos tipos de câncer
(ZANDBERG et al., 2014; SWANSON; SINHA et al., 2015).
40
A literatura sugere que o microambiente das QAs e CCEs de lábio é marcado pela
presença de fatores imunossupressores (GONÇALVES et al., 2015; ROJAS et al., 2017), o que
sugere um grande potencial de evasão imunológica com possíveis alvos para imunoterapia.
Contudo, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos no escape da resposta imune que
ocorre durante a carcinogênese de lábio.
41
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a imunoexpressão das moléculas PD-L1, HLA-G, CD8 e GrB no microambiente
de CCEs de lábio, QA e mucosa labial saudável, bem como a relação destas proteínas com
parâmetros clinicopatológicos das lesões e com a sobrevida global dos pacientes com CCE de
lábio.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
✓ Avaliar, descrever e comparar a imunoexpressão de PD-L1, HLA-G, CD8 e GrB em
amostras de CCE de lábio, QAs e mucosas labiais saudáveis;
✓ Realizar a gradação histopatológica de CCEs de lábio de acordo com os sistemas de
Bryne (1998) e OMS (BARNES et al., 2005), bem como de QAs de acordo com o
sistema da OMS (EL-NAGGAR et al., 2017);
✓ Avaliar se há diferença na expressão das proteínas estudadas em relação aos parâmetros
clínicos (tamanho do tumor, presença/ausência de metástase para linfonodos ou à
distância, estágio clínico TNM e recidiva) dos CCEs de lábio e gradação histopatológica
dos CCEs de lábio e QAs;
✓ Testar a correlação entre as proteínas em CCEs de lábio e QAs, para verificar se a
expressão de moléculas do checkpoint imunológico (PD-L1 e HLA-G) exerce influência
na citotoxicidade (CD8 e GrB) na carcinogênese de lábio.
✓ Classificar o microambiente dos CCE de lábio conforme o perfil de expressão de PD-
L1 e CD8, seguindo as categorias (Tipo I-IV) propostas por Teng et al. (2015). E,
posteriormente, verificar se há associação entre os diferentes microambientes e
parâmetros clinicopatológicos dos CCEs de lábio.
✓ Avaliar se a expressão das proteínas estudadas e o tipo do microambiente tumoral
exercem influência na sobrevida global dos pacientes com CCE de lábio.
42
3 ARTIGO
Para submissão ao periódico Histopathology (ISSN 1365-2559) – Fator de impacto 3.523 (JCR®
2017) – Qualis A1.
IMMUNE RESPONSE AND EVASION MECHANISMS IN LIP CARCINOGENESIS:
AN IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY
Maria Luiza Diniz de Sousa Lopes,a Amanda Katarinny Goes Gonzaga,a Carla Mosconi,b Gustavo
Martelli Palomino,c Elismauro Francisco Mendonça,bd Aline Carvalho Batista,b Éricka Janine
Dantas da Silveiraa*
aGraduate Program in Oral Pathology, Department of Dentistry, Federal University of Rio Grande
do Norte, Natal, RN, Brazil
bDepartment of Stomatology (Oral Pathology), Dental School, Federal University of Goiás, Goiânia,
Brazil
cDivision of Rheumatology, Faculty de Medicine, University of São Paulo (FMRP-USP), Ribeirão
Preto, São Paulo, Brazil
dAraújo Jorge Hospital, Association of Cancer Combat of Goiás, Division of Head and Neck and
Department of Stomatology (Oral Pathology), Dental School, Federal University of Goiás,
Goiânia, Brazil
Running title: Immune checkpoint proteins in lip carcinogenesis
*Corresponding author: Éricka Janine Dantas da Silveira
Departamento de Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Av. Senador Salgado
Filho, 1787, Lagoa Nova, CEP 59056-000 Natal, RN, Brasil. Phone/Fax: +55843215-4138. E-mail:
43
Abstract
Aims: Programmed death ligand-1 (PD-L1) and human leukocyte antigen-G (HLA-G) are considered
immune checkpoint molecules that inhibit T-cell effectiveness, contributing to tumor immune escape.
This study investigated PD-L1, HLA-G, CD8, and granzyme B (GrB) expression at different stages
of lip carcinogenesis.
Methods and results: Forty cases of lip squamous cell carcinoma (LSCC), 55 actinic cheilitis (AC),
and 10 healthy lip mucosa (HLM) were submitted to immunohistochemistry. Semiquantitative (PD-
L1, HLA-G), and quantitative (CD8, GrB) analysis were performed. CD8+ and GrB+ cell numbers
progressively increased from HLMs to LSCC, with AC exhibiting intermediate numbers (p<0.01).
Low cytotoxic immune response was associated with lymph node metastasis and poor tumor
differentiation in LSCC (p<0.05). PD-L1 and HLA-G expression in neoplastic cells/keratinocytes and
stroma/connective tissue was significantly higher in LSCC and AC, compared to HLM (p<0.05). PD-
L1 was not associated with clinicopathological features of the lesions. HLA-G expression by
malignant cells was significantly higher in LSCCs with distant metastasis (p=0.041). Most LSCCs
showed coexistence of PD-L1+ and CD8+ cells (72.5%). PD-L1 was directly correlated to CD8+ and
GrB+ lymphocytic infiltration in LSCCs (p<0.05). Only advanced N stage, M stage, TNM clinical
stage, and poorly differentiated LSCCs were associated with lower overall survival (p<0.05).
Conclusions: PD-L1 and HLA-G-mediated immune evasion mechanisms are likely to occur from
early pre-malignant to advanced malignant stages of lip carcinogenesis, which might provide a
rationale for therapeutic blockade of these pathways. PD-L1 expression in LSCCs was correlated
with the cytotoxic markers, suggesting that that PD-L1 may appear as an escape mechanism in
response to an active antitumor response.
Keywords: tumor-infiltrating lymphocytes, PD-L1, HLA-G, cheilitis, lip carcinogenesis,
squamous cell carcinoma
44
Introduction
Lip squamous cell carcinoma (LSCC) arises from the stratified squamous epithelium and
represents the most frequent lip malignancy.1,2 LSCC usually show a less aggressive clinical course
than intraoral squamous cell carcinoma (SCC), although they may present with an unfavorable
prognosis for the patient when the disease spread to regional lymph nodes.1
Lip photocarcinogenesis is an intricate multistep process, in which ultraviolet (UV) radiation
acts both as the initiating agent and promoter of tumorigenesis.3,4 The majority of LSCC are preceded
by actinic cheilitis (AC), a potentially malignant disorder (PMD) also induced by chronic exposure
to UV radiation, that exhibits a slow and often unpredictable progression, since its clinical and
histopathological findings do not always reflect the molecular alterations.5-7
In the last decades, experimental and clinical observations have shown that chronic exposure
to UV radiation can modulate the immune response in mice and human tissues, favoring
immunosuppression.8-10 The influence of the immune system on cancer molecular basis has long been
investigated, as the immune response can recognize and destroy malignant, or altered cells via
immunosurveillance, that involves the secretion of cytotoxic granules, such as granzyme B (GrB) by
natural killer (NK) cells, and CD8+cytotoxic T lymphocytes (CTL).11 However, to avoid attack from
the immune system, some mutated cells eventually adapt, ultimately secreting factors that modulate
the microenvironment to ensure their resistance, and survival.11,12
Tumor strategies to evade immune surveillance include regulatory mechanisms, known as
“immune checkpoints”, that act as immunosuppressive signals to T cell responses.13,14 Recent
evidence has shown that PMD may also evade the host immune system by the activation of inhibitory
checkpoints, facilitating malignant transformation.15,16
Programmed death receptor ligand-1 (PD-L1) and human leukocyte antigen-G (HLA-G) are
immune checkpoint proteins frequently dysregulated by tumors and precursor disorders.15-24 In the
tumor microenvironment (TME), malignant cells and stromal cells can express PD-L1 and HLA-G,
which can bind to inhibitory receptors present in CTL and NK cells, dampening antitumor immune
45
responses.13,14,25 In this context, there is great interest in the immunotherapeutic potential represented
by the blockade of these inhibitory molecules, derived from promising clinical results in several types
of cancers after targeting PD-L1 pathway.26-28
Current evidences indicate that LSCC and AC microenvironment are rich in
immunosuppressive factors.20,29 However, there is little information about the participation and
contribution of checkpoint inhibitors to lip carcinogenesis and neoplastic progression.20,30 In this light,
this study aimed to evaluate the immunoexpression of PD-L1 and HLA-G, as well as the cytotoxic
molecules CD8 and GrB in the microenvironment of LSCC, AC and healthy lip mucosa (HLM), and
their relationship with clinicopathological factors and survival of the cancer patients.
Methods
Sample
This retrospective, cross-sectional study was approved by the ethical board of the Research
Ethics Committee of the Federal University of Goiás (UFG; Protocol No 883.912; 032/2011).
Paraffin-embedded tissue specimens of 40 LSCCs were obtained from the archives of the Anatomo
pathology and Cytopathology Division at Araújo Jorge Hospital, Goiás Combat Cancer Association,
Goiânia-GO, Brazil. Fifty-five ACs were obtained both from the Oral Pathology Laboratory at the
UFG, and from the Oral Pathology Service of the Dentistry Department at the Federal University of
Rio Grande do Norte, Natal-RN, Brazil. Also, from the Oral Pathology Laboratory at the UFG, 10
cases of HLM were obtained from patients undergoing plastic surgery on the lip or with pigmentation
in the lip mucosa and used as control. Inclusion criteria included only LSCC patients that have
undergone excisional surgical treatment, and ACs histologically diagnosed as solar elastosis,
associated or not to varying degrees of epithelial dysplasia. The exclusion criteria ruled out LSCC
patients without follow-up information, and patients submitted to radiotherapy, chemotherapy, or
other treatment before surgery. AC cases previously treated with anti-inflammatory drugs were also
excluded. Demographic and clinical data such as age, gender, ethnic group, and history of chronic
46
exposition to UV radiation were collected from medical records, and biopsy requisition forms. For
LSCC, we also collected information regarding tumor size (T stage), metastasis to local lymph nodes
(N stage), distant metastasis (M stage), TNM clinical stage, local recurrence, and outcome (overall
survival, consisting of the time from treatment initiation until death or last follow-up information).
Light microscopy
Five-µm thick histological sections were cut from the formalin-fixed paraffin-embedded
specimens and stained with hematoxylin-eosin. Slides were assessed independently by two
investigators, who were blinded to the demographic and clinical data, under light microscopy. Any
disagreement was resolved by consensus of the 2 investigators after observing the slides together in
a 5-head microscope. LSCC cases were graded according to the criteria described by World Health
Organization (WHO),31 and Bryne et al.,32 while AC samples were graded according to WHO
system.33
Immunohistochemical staining
For the immunohistochemical study, 3-µm thick sections were obtained from paraffin-
embedded tissue blocks and mounted on organosilane-coated slides (3-aminopropyltriethoxysilane;
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Deparaffinization, rehydration and antigen retrieval steps
were performed using Trilogy (Cell Marque, CA, USA) at a concentration of 1:100 in distilled water
within pascal pressure cooker for 3 minutes. Subsequently, the sections were immersed in 3%
hydrogen peroxide during 15 minutes at room temperature (RT) to block endogenous peroxidase
activity, and then incubated with protein block (Thermo Scientific, Runcorn, UK) for 5 minutes (RT).
The slides were incubated with one the following primary antibodies: anti-PD-L1 (clone E1L3N®,
Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA, dilution 1:400, overnight), anti-HLA-G (clone
MEM-G/2, Exbio, Prague, Czech Republic, dilution 1:200, overnight), anti-CD8 (clone C8/144B,
Dako, Carpinteria, CA, USA, dilution 1:800, 60’), and anti-GrB (clone GrB-7, Dako, Carpinteria,
47
CA, USA, dilution 1:100, overnight). Afterwards, the sections incubated with anti-PD-L1 and anti-
GrB were treated with the Novolink™ Max Polymer Detection System (Novocastra, Newcastle, UK).
HiDef detection HRP polymer system (Cell Marque, Rocklin, CA, USA) was used for sections with
anti-HLA-G, and ADVANCETM system (Dako, Carpinteria, CA, USA) for sections with anti-CD8.
The reactions were revealed with 3.3'-diaminobenzidine (DAB, Dako, Carpinteria, CA, USA) in a
darkroom for 5 minutes (RT). The sections were then counterstained with Harris’s hematoxylin and
coverslipped. Trophoblast sections were used as positive controls for PD-L1 and HLA-G reactions;
and oral lichen planus was used for CD8 and GrB. For negative control, the primary antibody was
replaced with 1% bovine serum albumin in buffer solution.
Immunostaining assessment
All immunohistochemical slides were scanned with a digital slide scanner system
(3DHISTECH®, Budapest, Hungary), and further analyzed by two previously trained examiners in
the Pannoramic Viewer 1.15.2 software (3DHISTECH®, Budapest, Hungary). For all markers, the
analysis of LSCCs was restricted to the tumor invasive front, whereas for AC and HLM, the whole
specimens were examined.
For PD-L1 and HLA-G, all keratinocytes and adjacent connective tissue cells (immune-
inflammatory cells, fibroblasts and endothelial cells) that exhibited brown staining in the plasma
membrane and/or cytoplasm were considered positive. Evaluation of PD-L1 and HLA-G expression
was semiquantitative and performed separately in epithelial cells and connective tissue cells, by
assigning scores adapted from Cho et al.17: score 0, 0% of positive cells; score 1, 1-25% of positive
cells; score 2, 26-50% of positive cells; and score 3, >50% of positive cells. Immunostaining pattern
was also investigated and classified as focal or diffuse.
Quantitative evaluation of CD8 and GrB densities was restricted to immune cells of
lymphocytic morphology that exhibited brown staining in the membrane and/or cellular cytoplasm.
In each case, the area with the most abundant lymphocytic expression was selected. From this area,
48
5 consecutive fields were digitally photographed at a magnification of 400x, each field corresponding
to an area of 0.0998 mm2. Cell counting was performed using the ImageJ® software (National
Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA). For each case, the sum of the positive
lymphocytes was used to calculate the mean expression of the markers (adapted from Sato et al.34).
After immunostaining analysis, the LSCC’s TME were categorized following classification
proposed by Teng et al.35 and adapted by Webb et al.36: Type I TME, tumors positive for PD-L1 and
CD8 (adaptive resistance); Type II TME, tumors negative for PD-L1 and CD8 (immunological
ignorance); Type III TME, PD-L1-positive and CD8-negative (intrinsic induction); and Type IV
TME, PD-L1-negative and CD8-positive tumors (immunological tolerance).
Statistical analysis
Associations between nominal variables were analyzed using the Fisher’s exact test. Weighted
kappa coefficient and intraclass correlation coefficient (ICC) were calculated to measure inter-
examiner agreement regarding immunohistochemical evaluation. Comparative analysis of the
markers expression was performed using the non-parametric Mann–Whitney and Kruskal-Wallis
tests, since the semiquantitative data (PD-L1 and HLA-G) consisted of ordinal variables, and the
quantitative data (GrB and CD8) was not normally distributed, as verified by Shapiro–Wilk test.
Spearman’s correlation coefficient was calculated to verify the correlation between the proteins
expression. Survival curves were constructed based on the Kaplan-Meier method and compared with
the Log-rank test. The level of significance was set at 5% (p < 0.05) for all tests.
Results
Clinicopathological data
Baseline demographic and clinicopathological characteristics of the patients are presented in
Table 1. For both LSCC and AC groups, there was a predominance of male patients, aged over 58
years, Caucasians, and subjects with a history of chronic exposure to UV radiation. With respect to
49
clinical data of LSCCs, most patients were at TNM clinical stage I (30%), and II (27.5%), with a
higher frequency of the tumor size/extent (T stage), regional lymph node metastasis (N stage), and
distant metastasis (M stage), classified as T2 (47.5%), N0 (62.5%), and M0 (92.5), respectively. Local
recurrence occurred in 8 cases of LSCC (20%). Regarding histopathological grading of the lesions,
most AC cases were classified as mild/moderate epithelial dysplasia (40% each), while most LSCC
were graded as well differentiated (47.5%) by WHO31 system, and high grade of malignancy (62.5%)
by Bryne’s32 criteria. Poorly differentiated tumors (WHO system) were significantly associated to the
presence of metastasis to local lymph nodes (p = 0.005), and advanced TNM stage (III/IV; p = 0.009;
Table 1, Supplementary information).
PD-L1 and HLA-G expression was higher in LSCC and AC than in HLM
PD-L1 immunostaining was observed in the cell membrane and/or cytoplasm of 29 LSCC
(72.5%), revealing a predominant diffuse pattern, mostly concentrated at the invasive front (Figure
1A). Among positive cases, 10 only showed positivity for PD-L1 in the stroma. Regarding AC, 13
cases (23.6%) were completely negative for PD-L1, while in positive cases, this protein revealed
preference for cells cytoplasm in a diffuse pattern along all the epithelial layers of specimens, as well
as in the connective tissue (Figure 1B). Most of the healthy lip mucosa was shown to be negative for
anti-PD-L1 (70%), while the remaining cases revealed an expression restricted to the basal layer of
the epithelium (Figure 1C).
We found good agreement between the two examiners for PD-L1 and HLA-G evaluation
(weighted kappa coefficient 0.761 and 0.8, respectively). Comparing LSCC, AC, and HLM,
significant differences in the mean rank of PD-L1 expression scores in the neoplastic
cells/keratinocytes, as well as in the stromal/connective tissue cells were observed (p = 0.024; p =
0.004, respectively). Pairwise comparison revealed a significantly higher PD-L1 expression in LSCC
[neoplastic cells: median = 1.5, interquartile range (IQR) = 3; stromal cells: median = 1; IQR = 1]
and in AC (keratinocytes: median = 1, IQR = 3; connective tissue cells: median = 1, IQR = 1), when
50
compared to HLM (keratinocytes: median = 0, IQR = 1; connective tissue cells: median = 0, IQR =
1; Figure 2A, and Figure 2B).
All LSCC and 92.7% of AC were positive for HLA-G molecule, with a predominant diffuse
cytoplasmic and/or membrane staining (Figure 1E and Figure 1F). We found that HLA-G was present
in all specimens of HLM, predominantly in the epithelium; nevertheless, in the vast majority of them,
this expression was observed only in 1-25% of the cells (score 1, Figure 1G). Comparison between
LSCC, AC, and HLM revealed significant differences in the mean rank of HLA-G expression scores
in the neoplastic cells/keratinocytes, as well as in the stromal/connective tissue cells (p = 0.033; p =
0.001, respectively). Further pairwise comparisons showed LSCC and AC to have a significantly
greater expression of HLA-G in the neoplastic cells/keratinocytes (median = 2, IQR = 2; median = 2;
IQR = 2, respectively), and in stromal/connective tissue cells (median = 1, IQR = 1; median = 2, IQR
= 2, respectively), when compared to HLM (median = 1, IQR = 0; median = 0.5, IQR = 1; Figure 2C
and Figure 2D).
Overexpression of CD8 and GrB in LSCC compared to AC and HLM
Evaluation of CD8 expression revealed that all LSCC and AC were positive, and one HLM
was negative (Figure 1I-K). This protein exhibited a membrane and cytoplasmic staining pattern
diffused throughout the tumor stroma, in contact or within tumor nests of LSCC, prominently at the
invasive front. In AC and HLM, there was a predominance of CD8+ cells in the subepithelial area.
CD8 and GrB evaluation showed excellent level of concordance between examiners (ICC: 0.993, and
0.967, respectively). Quantitative analysis revealed that the mean number of CD8+ lymphocytes in
LSCC was significantly higher (median = 130.8; IQR = 131.7) than AC (median = 15.80, IQR =
47.6), and HLM (median = 3.7; IQR = 4.6; p < 0.0001; Figure 2E).
Analyzing GrB expression, the positive lymphocytic cells exhibited a granular cytoplasmic
staining pattern. GrB positivity was observed in all LSCC (Figure 1M), 94.5% of AC (Figure 1N),
and 70% of the HLM (Figure 1O). The mean number of GrB+ cells in the LSCC group was larger,
51
ranging from 2 to 152 [median =15.6, IQR = 40.5], while AC group revealed intermediate values
ranging from 0 to 33.8 (median= 5.2, IQR= 13.4), and the HLM showed the smallest numbers,
ranging from 0 to 3.8 in (median = 0.4; IQR = 2.4). Kruskal-Wallis non-parametric test revealed
significant differences between the three groups (p < 0.0001; Figure 2F). We also observed that in all
groups, the mean numbers of GrB+ cells were lower than the mean number of CD8+ cells.
Association of immunomarkers with clinicopathological parameters
Table 2 displays the information regarding PD-L1 and HLA-G expression according to
clinicopathological characteristics of the lesions. No significant difference in PD-L1expression was
observed in relation to the clinicopathological parameters of the lesions. All the patients with LSCC
who developed distant metastasis (n = 3) showed HLA-G expression in more than 50% of the tumor
cells (score 3), while non-metastatic tumors demonstrated a significantly lower expression (median
score = 1; p = 0.041). Regarding AC histological grading, there was a significant difference between
groups, with higher HLA-G expression in the tumor cells of cases with moderate/severe dysplasia (p
= 0.031).
Comparison of CD8 and GrB mean positive cells according to LSCC and AC
clinicopathological features is described in Table 3. The mean number of CD8+ cells showed
significantly higher values in LSCC with metastasis to lymph nodes than non-metastatic tumors (p =
0.033). Mean CD8+ and GrB+ cells were larger in LSCC graded as well/moderately differentiated than
in tumors with poor differentiation (p = 0.023; p = 0.009, respectively).
PD-L1 expression was correlated with the mean number of CD8+ and GrB+ lymphocytes
Correlation results are detailed at Figure 3. PD-L1 and HLA-G expression in the neoplastic
cells/keratinocytes showed a positive correlation with their stromal/connective tissue expression in
LSCC (rho = 0.557; p < 0.0001; rho = 0.384; p = 0.014, respectively), as well as in AC (rho = 0.573;
p < 0.0001; rho = 0.725; p < 0.0001, respectively). In AC, there was a positive correlation between
52
PD-L1 and HLA-G expression in the connective tissue (rho = 0.321, p = 0.017). A highly significant
direct correlation between CD8+ cells with GrB+ cells was also observed in both LSCC (rho = 0.737,
p < 0.0001), and AC groups (rho = 0.571; p < 0.0001).
In LSCC, tumor cells expressing PD-L1 were positively correlated with CD8+ (rho = 0.377; p
= 0.011), and GrB+ cells (rho = 0.553; p < 0.0001). A significant positive correlation with CD8 (rho
= 0.496; p = 0.001) and GrB lymphocytes (rho = 0.598; p < 0.0001), was also observed for PD-L1
expression by stromal cells. Regarding AC specimens, PD-L1 expression in the connective tissue
cells was correlated to GrB (rho = 0.458; p < 0.0001).
Types of LSCC microenvironment according to PD-L1+ cells and CD8+ cells
To investigate the microenvironment types of LSCC, we categorized the tumors following
Teng et al.35 classification, after analyzing PD-L1 expression and the presence/absence of CD8+cells.
Among the 40 LSCC, only two types of TME were observed: type I tumors (PD-L1+/CD8+) in 72.5%
of the cases (n = 29), and type IV (PD-L1-/CD8+) in the remaining 27.5% (n = 11). There was no
significant association between LSCC microenvironment and clinicopathological variables (Table 2,
supplementary information).
Proteins expression was not associated with overall survival of LSCC patients
Overall survival for patients with LSCC ranged from 2 to 172 months, with a mean + standard
deviation of 53.68 + 45.22 months. For survival analysis, the proteins expression was dichotomized
as absent/low expression for PD-L1 and HLA-G (scores 0 and 1), and high expression (scores 2 or
3). The mean of CD8 (149.3) and GrB (28.2) expression was defined as a cut-off for dichotomization
in low and high expression. The expression of the proteins did not affect patients’ survival. N stage
(p = 0.008), M stage (p = 0.002), TNM clinical stage (p = 0.002), and WHO histological grading (p
= 0.008) were observed to have a significant impact on overall survival (Table 4). Kaplan-Meier
53
curves of overall survival according to the proteins expression are shown in the Supplementary
information, Figure 1.
Discussion
LSCC is widely considered a disease of low aggressiveness and favorable prognosis, with
70% to 90% 5-year overall survival rate. However, when LSCC presents with lymph node metastasis,
the survival rate declines to about 50%.1,2 In the present sample, as expected, the presence of local or
distant metastasis, advanced TNM stage, and poor morphological differentiation showed a deleterious
impact on overall survival of LSCC patients. Our findings also revealed that the histological grading
system proposed by WHO31 was associated with N stage, and TNM clinical stage, representing a
good system to provide additional information regarding LSCCs biological behavior, in contrast to
other reports.37,38 Nevertheless, clinical and histological classifications still show limited predictive
accuracy for prognosis, since the outcomes can significantly vary among patients within the same
tumor stage. One of the traditional staging systems flaws is that they fail to fairly evaluate the TME
and its relationship with the host features, including the local and systemic immune response.
Anticancer immunity is greatly mediated by tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), especially
CD8+ T lymphocytes. Indeed, there is accumulated evidence that density and distribution of TILs
have significant impact on prognosis of patients with several types of cancer.36,39-41 Compared to
intraoral SCCs, the LSCCs are thought to be generate a more robust lymphocytic response.41-43
Moreover, PMDs tend to show a lower cytotoxic activity than cancerous tissues.16 Our results
demonstrated an increase in the mean number of CD8+ and GrB+ lymphocytes in LSCCs in
comparison to AC, and HLM groups, which is in accordance to those reported by Zancope et al.,41
and Costa et al.43 According to these authors, the low cytotoxicity in the ACs can be interpreted as
part of the first changes in the lip tumorigenic microenvironment. However, within LSCC group,
CD8 and GrB expression was higher in well/moderately differentiated and non-metastatic tumors,
54
compared to their counterparts, suggesting decrease in the cytotoxic antitumor response at some point
towards the most advanced stages of the disease, as reported in other types of cancer.39,44,45
It is well established in the literature, that chronic exposure to UV sunlight is the main
etiological factor for both AC and LSCC,5 and that UV rays can induce immunosuppression.8-10
Taking these concepts together, we hypothesized that the immunoregulatory functions of the immune
checkpoint molecules PD-L1 and HLA-G may contribute to overcome the anticancer immune
response, which facilitates AC’s malignant transformation and/or LSCC’s neoplastic progression.
Our findings revealed that expression of PD-L1, and HLA-G in both neoplastic
cells/keratinocytes and stromal/connective tissue cells is frequent and similarly elevated in ACs and
LSCCs, but higher than in HLM specimens. This marked presence of HLA-G and PD-L1 starting
from precancerous lesions to established SCCs is supported by previous studies on intraoral,15,16,18,19
and lip cancer.20,30
We also found that HLA-G expression was significantly higher in keratinocytes of
moderate/severe dysplastic ACs, than in cases without dysplasia, or with mild dysplasia. Gonçalves
et al.20 reported a tendency for a progressive increase in HLA-G expression during lip tumorigenesis,
which combined to our findings, highlight that this protein may take part of the immune escape
mechanisms from the host immune defenses in this microenvironment.
HLA–G immunological properties were recently reviewed;14,25,46 it is a non-classic major
histocompatibility class Ib antigen, characterized by low polymorphism, restricted constitutive tissue
expression, and an important tolerogenic function, first described in maternal-fetal immune tolerance.
Strong evidences also support a role for HLA-G in cancer progression, inhibiting the functions of
CTL, NK, and dendritic cells, as part of the strategies used by tumors use to circumvent
immunosurveillance.14,25,47
Indeed, studies conducted with malignant neoplasms have demonstrated that HLA-G
expression is significantly associated with poor prognosis for cancer patients.18,24,48,49 In the present
sample, no significant association was verified between HLA-G and overall survival; however, there
55
was a significantly higher expression of HLA-G in neoplastic cells of LSCCs that developed distant
metastasis, compared with non-metastatic tumors. A high metastatic potential to the tumor have been
linked to HLA-G in intraoral,18 endometrial,48 esophageal,49 and nasopharyngeal carcinomas.24 In
addition to the immunoregulatory functions of HLA-G, this protein has been shown to facilitate tumor
invasiveness of ovarian cancer in vitro and in vivo, by upregulating matrix metalloproteinase-15
(MMP-15), a key factor in the proteolytic degradation of extracellular matrix.50
We additionally observed a significantly direct correlation between HLA-G expression in the
neoplastic cells/keratinocytes and stromal/connective tissue cells (mainly immune, and endothelial
cells) in both AC and LSCC groups. These findings may reflect a mechanism termed trogocytosis,
that consists of intercellular transfer of cytoplasmic contents or membrane fragments of HLA-G-
positive cells to HLA-G-negative ones, resulting in prompt transformation of immunocompetent cells
into immunosuppressive cells.25,51 We also observed that correlation between HLA-G and CD8 was
not significant, suggesting that in the lesions studied, the inhibitory effect of HLA-G might be directed
to immune cell types other than CTL, such as NK and dendritic cells.
The literature regarding PD-L1 expression in lip carcinogenesis is even scarcer than HLA-
G’s.30 PD-L1 was first reported in 1999, as a 290 amino acid transmembrane protein encoded by
CD274 gene, and is the most studied ligand of the inhibitory receptor programmed death-1 (PD-1).52
Engaging of PD-L1 to PD-1 on T cells promotes inhibition of kinases that are involved in T cell
activation, which leads to apoptosis of T cells.13,28 Moreover, in addition to PD-1, PD-L1 can bind
CD80 (B7-1), inhibiting CD80 co-stimulation on T cells.53
PD-L1 expression is observed in many malignant solid tumors,21 where it can be expressed
by a variety of cells such as cancer cells, T cells, B cells, macrophages, dendritic cells (DC) and
endothelial cells.13,54-46 Cancer-related literature has been largely focused on PD-L1 expression on
malignant cells, but current studies are also investigating the significance of PD-L1+ stromal cells.26
As mentioned, we observed a significantly higher expression of PD-L1 in LSCCs and ACs,
when compared to healthy lip mucosa, in both neoplastic cells/keratinocytes and stromal/connective
56
tissue cells. Malaspina et al.30 used flow cytometry to characterize the leukocytes present in the
microenvironment of 8 oral SCCs and 10 ACs and found a higher PD-L1+ leukocytes infiltration in
the carcinomas. Yagyuu et al.15 study showed that epithelial PD-L1 positivity in both keratinocytes
and subepithelial cells was significantly associated with malignant transformation of oral PMDs.
Consistent with these results, Gonçalves et al.16 reported an overexpression of PD-L1 in keratinocytes
and connective tissue cells of oral PMDs, compared to healthy mucosa controls.
There are two triggering mechanisms for PD-L1 expression on tumors: innate immune
resistance and adaptive immune resistance.13 In the context of innate immune resistance, upregulation
of PD-L1 is induced by intrinsic oncogenic signaling pathways on malignant cells of some tumors,
such as loss of tumor suppressor PTEN in colorectal carcinoma.57 The second mechanism is known
as adaptive immune resistance, in which upregulation of PD-L1 expression can be extrinsically
induced as a response to ongoing endogenous antitumor immunity, such as activation of TILs and
presence of inflammatory cytokines, specially IFN- γ.54-56
Considering these complex regulatory mechanisms, Teng et al.35 proposed a classification of
TME into four types based on patterns of PD-L1 expression and lymphocytic infiltration in
melanomas. According to these authors, identifying the type of TME could indicate which patient
would benefit from single-agent anti–PD-1/L1 blockade (Type I TME: PD-L1+/CD8+); or therapies
focusing on other non–PD-1/PD-L1 checkpoint receptors (Type IV TME: PD-L1-/CD8+), for
example. A recent pan-cancer study using data from 32 cancer types, including cutaneous SCCs,
found that TME type I was the most common, and that it was associated with a high tumor mutational
burden.58 Other reports have also shown this TME type to be frequent in melanomas and ovarian
cancer.35,36 Interestingly, we also found a predominance of type I TME in the studied LSCCs, which
could possibly be linked to the high genotoxic damage and mutation load of UV-induced cancers.
In line with these findings, we observed that PD-L1 expression in LSCCs was significantly
correlated with an inflammatory phenotype, characterized by a strong T-cell infiltration. A weak
indication of this phenomenon in early stages of lip carcinogenesis was also observed, as AC
57
specimens revealed a positive correlation between PD-L1 in the connective tissue cells and granzyme
B. Associations between PD-L1 expression and a higher density of T-cell infiltration in the TME of
several types of cancer have been reported by other groups.22,23,56,59-64 Kim et al.64 demonstrated that
in pulmonary SCCs tumors, high PD-L1 expression by tumor cells was consistently and significantly
found in tumors with CD8+ T cell infiltration. Similarly, in a large cohort (n=1491), Droeser et al.60
found that mismatch repair-proficient colorectal cancer showed a strong correlation between PD-L1
expression and infiltration by CD8+ lymphocytes. They further showed that PD-L1 expression and
IFN-γ genes were significantly correlated in their sample.
It is well-known that CD8+ cells produce IFN-γ upon interaction with tumor targets;39
therefore, PD-L1 induction in response to IFN-γ emerges as an optimal weapon to protect the tumor
from the host immune defense. In oral SCCs, there is substantial evidence of PD-L1 upregulation by
IFN-γ secreted by TILs,30,54,55 and coexistence of TILs and PD-L1.63 Schaper et al.22 reported that the
severity of inflammation was positively correlated with PD-L1 expression in both tumor cells and
TILs of cutaneous SCCs and showed upregulation of PD-L1 protein in response to IFN-γ in vitro. In
melanomas, PD-L1 expression was also correlated with higher CD8+T cell infiltration,23,61 and
improved survival for the patients.61
In fact, despite several reports that PD-L1 expression is a negative prognostic factor in a
variety cancer types,65-67 many others have described PD-L1 as a favorable prognostic marker.59,64
Moreover, at a transcriptional level, the coexistence of pro-inflammatory (active Th1 signaling, and
cytotoxic-related transcripts) and immunosuppressive factors (PD-L1, PD-1, CTLA4, etc.) is
characterized not only by improved prognosis for cancer patients, but also by good responsiveness to
immunotherapy in solid tumors such as melanoma, breast, ovarian, cervical and bladder
cancer.26,36,68,69
Even though PD-L1 was not associated with other prognostic features in our sample, this
protein was correlated with higher cytotoxic infiltration, supporting the hypothesis that PD-L1
expression in the TME may be induced by the presence of TILs, rather than an intrinsic tumor-driven
58
pathway for immune evasion. This is a novel finding for LSCCs and indicates the need for further
investigations to clarify whether IFN-γ plays a key role in triggering PD-L1 expression in these
tumors.
From our study, we underline that immune checkpoint molecules PD-L1 and HLA-G are
overexpressed at different stages of lip tumorigenesis, and therefore, indicate that immune escape
mechanisms can occur from the onset precancerous microenvironment to advanced stages of the lip
cancer. We also hypothesize that in LSCCs invasive front, PDL1 expression might represent a
negative feedback mechanism that follows CD8+ T cell infiltration. Given the recent developments
using blockade of immune checkpoints pathways as immunotherapy for cancer, and the possibility to
use it in the malignant transformation prevention, further investigations are warranted to establish the
precise role and triggering mechanisms of these molecules in the lip carcinogenesis.
Acknowledgements
This work was supported by the National Council for Scientific and Technological Development
(CNPq) [grant number 401610/2016-0]. The authors also wish to thank the Araújo Jorge Hospital,
Goiás Cancer Combat Association, Goiânia, Brazil.
Conflicts of interest
The authors declare no conflict of interest.
References
1. Pastuszek A, Hanson M, Grigg R. Squamous cell carcinoma of the lip: depth of invasion, local
recurrence and regional metastases. Experience of a rural multidisciplinary head and neck unit.
J. Laryngol. Otol. 2016; 130; S32-S37.
2. Han AY, Kuan EC, Mallen-St Clair J, et al. Epidemiology of squamous cell carcinoma of the lip
in the United States. JAMA Otolaryngol. Neck Surg. 2016; 142; 1216.
59
3. Xavier FCA, Takiya CM, Reis SRA, et al. P63 immunoexpression in lip carcinogenesis. J. Mol.
Histol. 2009; 40; 131-137.
4. Nishisgori C. Current concept of photocarcinogenesis. Photochem. Photobiol. Sci. 2015; 14;
1713-1721.
5. Jadotte YT, Schwartz RA. Solar cheilosis: An ominous precursor: part I. Diagnostic insights. J.
Am. Acad. Dermatol. 2012; 66; 173-184.
6. Lopes MLD de S, da Silva Júnior FL, Lima KC, et al. Clinicopathological profile and
management of 161 cases of actinic cheilitis. An. Bras. Dermatol. 2015; 90; 347-350.
7. Sarmento DJ de S, de Almeida WL, Miguel MC da C, et al. Immunohistochemical analysis of
mismatch proteins in carcinogenesis of the lower lip. Histopathology 2013; 63; 371-377.
8. Schwarz T. Mechanisms of UV-induced immunosuppression. Keio J. Med. 2005; 54; 165-171.
9. Schwarz T. 25 years of UV-induced immunosuppression mediated by T cells - from disregarded
T suppressor cells to highly respected regulatory T cells. Photochem. Photobiol. 2008; 84; 10-
18.
10. Kripke ML. Reflections on the field of photoimmunology. J. Invest. Dermatol. 2013; 133; 27-
30.
11. Schreiber RD, Old LJ, Smyth MJ. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in
cancer suppression and promotion. Science. 2011; 331; 1565-1570.
12. Fridman WH, Pagès F, Sautès-Fridman C, et al. The immune contexture in human tumours:
impact on clinical outcome. Nat. Rev. Cancer 2012; 12; 298-306.
13. Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer
2012; 12; 252-264.
14. Kochan G, Escors D, Breckpot K, et al. Role of non-classical MHC class I molecules in cancer
immunosuppression. Oncoimmunology 2013; 2; e26491-8.
60
15. Yagyuu T, Hatakeyama K, Imada M, et al. Programmed death ligand 1 (PD-L1) expression and
tumor microenvironment: Implications for patients with oral precancerous lesions. Oral Oncol.
2017; 68; 36-43.
16. Gonçalves AS, Mosconi C, Jaeger F, et al. Overexpression of immunomodulatory mediators in
oral precancerous lesions. Hum. Immunol. 2017; 78; 752-757.
17. Cho YA, Yoon HJ, Lee J Il, et al. Relationship between the expressions of PD-L1 and tumor-
infiltrating lymphocytes in oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 2011; 47; 1148-1153.
18. Gonçalves AS, Wastowski IJ, Capeletti LR, et al. The clinicopathologic significance of the
expression of HLA-G in oral squamous cell carcinoma. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral
Radiol. 2014; 117; 361-368.
19. Gonçalves AS, Arantes DAC, Bernardes VF, et al. Immunosuppressive mediators of oral
squamous cell carcinoma in tumour samples and saliva. Hum. Immunol. 2015; 76; 52-58.
20. Gonçalves AS, Oliveira JP, Oliveira CFP, et al. Relevance of HLA-G, HLA-E and IL-10
expression in lip carcinogenesis. Hum. Immunol. 2016; 77; 785-790.
21. Wu P, Wu D, Li L, et al. PD-L1 and survival in solid tumors: A meta-analysis. PLoS One 2015;
10; 1-15.
22. Schaper K, Köther B, Hesse K, et al. The pattern and clinicopathological correlates of
programmed death-ligand 1 expression in cutaneous squamous cell carcinoma. Br. J. Dermatol.
2017; 176; 1354-1356.
23. Kaunitz GJ, Cottrell TR, Lilo M, et al. Melanoma subtypes demonstrate distinct PD-L1
expression profiles. Lab. Invest. 2017; 97; 1063-1071.
24. Cai MB, Han HQ, Bei JX, et al., Expression of human leukocyte antigen G is associated with
prognosis in nasopharyngeal carcinoma, Int. J. Biol. Sci. 2012; 8; 891–900.
25. Carosella ED. The tolerogenic molecule HLA-G. Immunol. Lett. 2011; 138; 22-24.
26. Herbst RS, Soria J-C, Kowanetz M, et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1
antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature 2014; 515; 563-567.
61
27. Powles T, Eder JP, Fine GD, et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical
activity in metastatic bladder cancer. Nature 2014; 515; 558-562.
28. Pai SI, Zandberg DP, Strome SE. The role of antagonists of the PD-1:PD-L1/PD-L2 axis in
head and neck cancer treatment. Oral Oncol. 2016; 61; 152-158.
29. Rojas IG, Spencer ML, Zapata PA, et al. CD8+ and FoxP3+ T-cell infiltration in actinic
cheilitis. Int. J. Dermatol. 2017; 56; 54-62.
30. Malaspina TS de S, Gasparoto TH, Costa MRSN, et al. Enhanced programmed death 1 (PD-1)
and PD-1 ligand (PD-L1) expression in patients with actinic cheilitis and oral squamous cell
carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 2011; 60; 965-974.
31. Barnes L, Eveson JW, Reichart P, Sidransky D. Pathology and genetics of head and neck
tumours. Lyon: IARC Press, 2005.
32. Bryne M, Koopang HS, Lilleng R, Kjaer-heim A. Malignancy grading of the deep invasive
margins of oral squamous cell carcinomas has high prognostic value. J. Pathol. 1992; 166; 375–
381.
33. El-Naggar AK, Chan JKC, Grandis JR, Takata T, Slootweg PJ. WHO classification of head and
neck tumours. Lyon: IARC Press, 2017.
34. Sato E, Olson SH, Ahn J, et al. Intraepithelial CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes and a high
CD8+/regulatory T cell ratio are associated with favorable prognosis in ovarian cancer. Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005; 102; 18538-18543.
35. Teng MWL, Ngiow SF, Ribas A, et al. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-
L1. Cancer Res. 2015; 75; 2139-2145.
36. Webb JR, Milne K, Kroeger DR, et al. PD-L1 expression is associated with tumor-infiltrating T
cells and favorable prognosis in high-grade serous ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 2016; 141;
293-302.
62
37. Santos HBP, Silva ALO, Cavalcante LHA, et al. Histopathological grading systems and their
relationship with clinical parameters in lower lip squamous cell carcinoma. Int. J. Oral
Maxillofac. Surg. 2014; 43; 539-545.
38. Strieder L, Coutinho-Camillo CM, Costa V, et al. Comparative analysis of three histologic
grading methods for squamous cell carcinoma of the lip. Oral Dis. 2017; 23; 120-125.
39. Pagès F, Kirilovsky A, Mlecnik B, et al. In situ cytotoxic and memory T cells predict outcome
in patients with early-stage colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 2009; 27; 5944-5951.
40. Wolf GT, Chepeha DB, Bellile E, et al. Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) and prognosis in
oral cavity squamous carcinoma: A preliminary study. Oral Oncol. 2015; 51; 90-95.
41. Zancope E, Costa NL, Junqueira-Kipnis AP, et al. Differential infiltration of CD8+ and NK cells
in lip and oral cavity squamous cell carcinoma. J. Oral Pathol. Med. 2010; 39; 162-167.
42. Silveira EJD, Miguel MCDC, Lima KC, et al. Analysis of local immunity in squamous cell
carcinoma of the tongue and lower lip. Exp. Mol. Pathol. 2010; 88; 171-175.
43. Costa NL, Gonçalves AS, Souza-Lima NC, et al. Distinct expression of perforin and granzyme
B in lip and oral cavity squamous cell carcinoma. J. Oral Pathol. Med. 2011; 40; 380-384.
44. Pereira J dos S, da Costa Miguel MC, Guedes Queiroz LM, et al. Analysis of CD8+ and CD4+
cells in oral squamous cell carcinoma and their association with lymph node metastasis and
histologic grade of malignancy. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 2014; 22; 200-205.
45. Fang J, Li X, Ma D, et al. Prognostic significance of tumor infiltrating immune cells in oral
squamous cell carcinoma. BMC Cancer 2017; 17; 1-9.
46. Ferreira LMR, Meissner TB, Tilburgs T, et al. HLA-G: at the interface of maternal–fetal
tolerance. Trends Immunol. 2017; 38; 272-286.
47. Rouas-Freiss N, Moreau P, Ferrone S, et al. HLA-G proteins in cancer: do they provide tumor
cells with an escape mechanism? Cancer Res. 2005; 65; 10139-10144.
48. Barrier BF, Kendall BS, Sharpe-Timms KL, et al. Characterization of human leukocyte antigen-
G (HLA-G) expression in endometrial adenocarcinoma. Gynecol. Oncol. 2006; 103; 25-30.
63
49. Zheng J, Xu C, Chu D, et al. Human leukocyte antigen G is associated with esophageal
squamous cell carcinoma progression and poor prognosis. Immunol Lett. 2014; 161; 13-19.
50. Lin A, Xu HH, Xu DP, et al. Multiple steps of HLA-G in ovarian carcinoma metastasis: Alter
NK cytotoxicity and induce matrix metalloproteinase-15 (MMP-15) expression. Hum. Immunol.
2013; 74; 439-446.
51. Lemaoult J, Caumartin J, Daouya M, et al. Immune regulation by pretenders: cell-to-cell
transfers of HLA-G make effector T cells act as regulatory cells. Blood 2007; 109; 2040-2048.
52. Dong H, Zhu G, Tamada K, et al. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell
proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 1999; 5; 1365-1369.
53. Haile ST, Dalal SP, Clements V, et al. Soluble CD80 restores T cell activation and overcomes
tumor cell programmed death ligand 1-mediated immune suppression. J. Immunol. 2013; 191;
2829-2836.
54. Chen J, Feng Y, Lu L, et al. Interferon-γ-induced PD-L1 surface expression on human oral
squamous carcinoma via PKD2 signal pathway. Immunobiology 2012; 217; 385-393.
55. Shah S, Caruso A, Cash H, et al. Pools of programmed death-ligand within the oral cavity tumor
microenvironment: Variable alteration by targeted therapies. Head Neck 2016; 38; 1176-1186.
56. Tumeh PC, Harview CL, Yearley JH, et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting
adaptive immune resistance. Nature 2014; 515: 568-571.
57. Song M, Chen D, Lu B, et al. PTEN loss increases PD-L1 Protein expression and affects the
correlation between PD-L1 expression and clinical parameters in colorectal cancer. PLoS One
2013; 8.
58. Ock CY, Keam B, Kim S, et al. Pan-cancer immunogenomic perspective on the tumor
microenvironment based on PD-L1 and CD8 T-cell infiltration. Clin. Cancer Res. 2016; 22;
2261-2270.
64
59. Taube JM, Anders RA, Young GD, et al. Colocalization of inflammatory response with B7-h1
expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune
escape. Sci. Transl. Med. 2012; 4; 127ra37.
60. Droeser RA, Hirt C, Viehl CT, et al. Clinical impact of programmed cell death ligand 1
expression in colorectal cancer. Eur. J. Cancer 2013; 49; 2233-2242.
61. Kluger HM, Zito CR, Barr ML, et al. Characterization of PD-L1 expression and associated T
cell infiltrates in metastatic melanoma samples from variable anatomic sites. Clin. Cancer Res.
2015; 21; 3052–3060.
62. Beckers RK, Selinger CI, Vilain R, et al. Programmed death ligand 1 expression in triple-
negative breast cancer is associated with tumour-infiltrating lymphocytes and improved
outcome. Histopathology 2016; 69; 25-34.
63. Satgunaseelan L, Gupta R, Madore J, et al. Programmed cell death-ligand 1 expression in oral
squamous cell carcinoma is associated with an inflammatory phenotype. Pathology 2016; 48;
574-580.
64. Kim MY, Koh J, Kim S, et al. Clinicopathological analysis of PD-L1 and PD-L2 expression in
pulmonary squamous cell carcinoma: Comparison with tumor-infiltrating T cells and the status
of oncogenic drivers. Lung Cancer 2015; 88; 24-33.
65. Hsu M-C, Hsiao J-R, Chang K-C, et al. Increase of programmed death-1-expressing
intratumoral CD8 T cells predicts a poor prognosis for nasopharyngeal carcinoma. Mod. Pathol.
2010; 23; 1393-1403.
66. Lin YM, Sung WW, Hsieh MJ, et al. High PD-L1 expression correlates with metastasis and
poor prognosis in oral squamous cell carcinoma. PLoS One 2015; 10; 1-11.
67. Chen MF, Chen PT, Chen WC, et al. The role of PD-L1 in the radiation response and prognosis
for esophageal squamous cell carcinoma related to IL-6 and T-cell immunosuppression.
Oncotarget 2016; 7; 7913-7924.
65
68. Bedognetti D, Hendrickx W, Marincola FM, et al. Prognostic and predictive immune gene
signatures in breast cancer. Curr. Opin. Oncol. 2015; 27; 433-444.
69. Bedognetti D, Hendrickx W, Ceccarelli M, et al. Disentangling the relationship between tumor
genetic programs and immune responsiveness. Curr. Opin. Immunol. 2016; 39; 150-158.
66
Tables
Table 1 Patient demographic and clinicopathological data.
Variable LSCC
n (%)
AC
n (%)
Healthy lip mucosa
n (%)
Age
< 58 years
> 58 years
15 (37.5)
25 (62.5)
26 (47.3)
29 (52.7)
9 (90)
1 (10)
Gender
Male
Female
26 (65)
14 (35)
42 (76.4)
13 (23.6)
4 (40)
6 (60)
Ethnicity†
Caucasian
Non-caucasian
15 (55.6)
12 (44.4)
39 (78)
11 (22)
8 (80)
2 (20)
Chronic sun exposure†
Yes
No
15 (88.2)
2 (11.8)
35 (72.9)
13 (27.1)
0 (0)
10 (100)
T stage
T1
T2
T3
T4
15 (37.5)
19 (47.5)
4 (10)
2 (5)
NA
NA
N stage
N0
N1/N2/N3
25 (62.5)
15 (37.5)
NA
NA
M stage
M0
M1
37 (92.5)
3 (7.5)
NA
NA
TNM stage
I
II
III
IV
12 (30)
11 (27.5)
9 (22.5)
8 (20)
NA
NA
Local recurrence
Yes
No
8 (20)
32 (80)
NA
NA
Clinical outcome
Dead
Alive (overall survival)
8 (20)
32 (80)
NA
NA
LSCC histological grading (WHO31)
Well differentiated
Moderately differentiated
Poorly differentiated
19 (47.5)
16 (40.0)
5 (12.5)
NA
NA
LSCC histological grading (Bryne et al. 32)
Low grade
High grade
15 (37.5)
25 (62.5)
NA
NA
AC histological grading (WHO33)
Non-dysplasia
Mild dysplasia
Moderate dysplasia
Severe dysplasia
NA
2 (5)
16 (40)
16 (40)
6 (15)
NA
†, some cases were missing this information; NA, not applicable; LSCC, lip squamous cell carcinoma; AC, actinic
cheilitis; WHO, World Health Organization.
67
Table 2 Median, quartiles 25 and 75, mean ranks, and statistical significance for PD-L1 and HLA-G expression according to clinicopathological features of LSCCs and ACs.
Variable
PD-L1 Neoplastic cells/ Keratinocytes
PD-L1
Stroma/connective tissue
HLA-G Neoplastic cells/ Keratinocytes
HLA-G
Stroma/connective tissue
Median (Q25-Q75)
Mean
ranks P
Median (Q25-Q75)
Mean
ranks p
Median (Q25-
Q75) Mean
ranks p
Median (Q25-
Q75) Mean
ranks p
T stage
T1-T2
T3-T4
1 (0-3)
2 (0-3)
20.12
22.67
0.644
1 (0-1)
1 (0-1)
20.74
19.17
0.782
2 (1-3)
1.5 (0.75-3)
20.82
18.67
0.698
1 (1-2.25)
1.5 (1-2.25)
20.41
21.00
0.926
N stage
N0
N1/N2/N3
2 (0-3)
1 (0-2)
21.92
18.13
0.299
1 (0.5-1)
0 (0-1)
22.40
17.33
0.141
1 (1-3)
2 (1-3)
19.48
22.20
0.443
2 (1-3)
1 (1-2)
22.32
17.47
0.164
M stage
M0
M1
1 (0-3)
2 (1-2.5)
20.32
22.67
0.771
1 (0-1)
1 (0.5-1.5)
20.27
23.33
0.697
1 (1-3)
3 (3-3)
19.45
33.50
0.041*
1 (1-2)
1 (0.5-2)
20.84
16.33
0.557
TNM stage
I-II
III-IV
2 (0-3)
1 (0-2)
22.39
17.94
0.213
1 (0-1)
1 (0-1)
22.17
18.24
0.242
2 (1-3)
2 (1-3)
20.67
20.26
0.906
2 (1-3)
1 (1-2)
23.22
16.82
0.061
Local recurrence
Yes
No
1.5 (0.25-2.75)
1.5 (0-3)
21.50
20.25
0.803
1 (0-1)
1 (0-1)
20.31
20.55
0.960
1.5 (1-3)
2 (1-3)
20.69
20.45
0.961
1.5 (1-2)
1 (1-2.75)
19.25
20.81
0.752
LSCC histological grading
(WHO31)
Well/moderately differentiated
Poorly differentiated
2 (0-3)
0 (0-2)
21.23
15.40
0.316
1 (0-1)
0 (0-0.5)
21.86
11.00
0.052
1 (1-3)
3 (1.5-3)
19.60
26.80
0.212
1 (1-2)
1 (0.5-2)
21.34
14.60
0.244
LSCC histological grading (Bryne
et al.32)
Low grade
High grade
1 (0-2)
2 (0-3)
19.93
20.84
0.804
1 (0-1)
1 (0-1)
23.00
19.00
0.245
1 (1-2)
2 (1-3)
16.97
22.62
0.111
1 (1-2)
1 (1-2.5)
19.80
20.92
0.748
AC histological grading (WHO33)
Non-dysplasia/Mild dysplasia
Moderate/Severe dysplasia
2 (0-3)
1 (0-3)
30.29
25.95
0.294
1 (0-2)
1 (0-1)
29.17
26.95
0.584
1 (1-2.25)
3 (1-3)
23.33
32.19
0.031*
1 (1-2)
2 (1-3)
24.17
31.43
0.078
Mann-Whitney U Test; LSCC, lip squamous cell carcinoma; AC, actinic cheilitis; WHO, World Health Organization; *Results are statistically significant.
68
Table 3 Median, quartiles 25 and 75, mean ranks, and statistical significance for CD8 and GrB expression according to clinicopathological features of LSCCs and
ACs.
Variable
CD8 GrB
Median (Q25-Q75)
Mean ranks p Median
(Q25-Q75) Mean
ranks P
T stage
T1-T2
T3-T4
135.5 (60.5-213)
130.8 (103.2-181.2)
20.35
21.33
0.868
15.6 (5.35-43.3)
16.4 (6.8-70.1)
20.10
22.75
0.617
N stage
N0
N1/N2/N3
157.8 (109.7-243.9)
96 (49.8-180.6)
23.56
15.40
0.033*
27.8 (6.9-48.4)
7.6 (4.6-32)
22.82
16.63
0.105
M stage
M0
M1
127.2 (66.2-183)
181.4 (116.3-232.2)
20.27
23.33
0.698
15.6 (6-47.4)
32 (16.1-37)
20.65
18.67
0.809
TNM stage
I-II
III-IV
157.8 (101-286.2)
104.4 (505-181)
23.39
16.59
0.069
27.8 (7.6-48.4)
7.6 (4.6-37)
22.83
17.35
0.143
Local recurrence
Yes
No
135.5 (108.8-196.5)
130.8 (63.6-196.1)
22.00
20.12
0.702
15.6 (7.6-47.8)
16.4 (52-46)
21.75
20.19
0.752
LSCC histological grading (WHO31)
Well/moderately differentiated
Poorly differentiated
155.6 (86-201.6)
51.2 (41.9-115.8)
22.06
9.06
0.023*
18 (6.2-48.4)
0.8 (0.3-11.8)
22.26
8.2
0.009*
LSCC histological grading (Bryne et al.32)
Low grade
High grade
150.4 (96-286.2)
120.6 (57.1-179.4)
23.60
18.64
0.194
18 (6.2-38.3)
13.2 (5.3-38.3)
23.23
18.86
0.252
AC histological grading (WHO33)
Non-dysplasia/Mild dysplasia
Moderate/Severe dysplasia
10.8 (4.4-40.6)
25 (8-60.6)
24.73
30.93
0.152
3.4 (0.8-12)
8.2 (1.8-22.2)
24.62
31.03
0.137
Mann-Whitney U Test. LSCC, lip squamous cell carcinoma; AC, actinic cheilitis; WHO, World Health Organization; *Results are statistically significant.
69
Table 4 Overall survival for LSCC patients (n = 40) using log-rank test.
Variable n (%) Number of
deaths
Overall
survival
(%)
CI95%
p
Age
< 58 years
> 58 years
15 (37.5)
25 (62.5)
4
4
69.84
37.43
37.79-87.60
1.42-79.69
0.478
Gender
Male
Female
26 (65)
14 (35)
7
1
48.77
90.91
14.13-76.40
50.81-98.67
0.229
Ethnicity†
Caucasian
Non-caucasian
15 (55.6)
12 (44.4)
3
3
57.44
63.64
8.53-88.26
22.20-87.31
0.546
T stage
T1-T2
T3-T4
34 (85)
6 (15)
6
2
55.31
68.57
16.52-82.30
21.28-91.21
0.346
N stage
N0
N1/N2/N3
25 (62.5)
15 (37.5)
1
7
95.24
25.86
70.72-99.32
1.63-64.11
0.008*
M stage
M0
M1
37 (92.5)
3 (7.5)
6
2
57.94
33.33
17.89-84.11
0.90-77.41
0.002*
TNM stage
I-II
III-IV
23 (57.5)
17 (42.5)
0
8
100
26.29
-
1.75-64.32
0.002*
Local recurrence
Yes
No
8 (20)
32 (80)
2
6
75.00
48.01
31.48-93.09
8.97-79.99
0.872
Histological grading (WHO)
Well/moderately differentiated
Poorly differentiated
35 (87.5)
5 (12.5)
4
4
77.65
0.00
40.44-93.17
-
0.008*
Histological grading (Bryne et al.)
Low grade
High grade
15 (37,5)
25 (62.5)
2
6
85.56
45.35
53.27-96.21
8.50-77.60
0.667
PD-L1 neoplastic cells
Low expression
High expression
20 (50)
20 (50)
4
4
52.01
73.89
8.85-83.84
42.73-89.79
0.453
PD-L1 stromal cells
Low expression
High expression
29 (72.5)
11 (10.5)
2
6
80.00
46.26
40.87-94.59
8.51-78.57
0.791
HLA-G neoplastic cells
Low expression
High expression
19 (47.5)
21 (52.5)
3
5
66.41
50.35
17.69-90.78
9.41-81.94
0.228
HLA-G stromal cells
Low expression
High expression
22 (55)
18 (45)
6
2
33.56
84.00
1.64-74.82
48.74-95.86
0.314
CD8
Low expression
High expression
21 (52.5)
19 (47.5)
6
2
45.57
86.67
8.88-77.48
56.39-96.49
0.479
GrB
Low expression
High expression
23 (57.5)
17 (42.5)
6
2
53.34
85.71
16.78-80.15
53.94-96.22
0.792
Microenvironment
Type I (PD-L1+CD8+)
Type IV (PD-L1-CD8+)
29 (72.5)
11 (27.5)
6
2
46.26
80.00
8.51-78.57
40.87-94.59
0.791
LSCC, lip squamous cell carcinoma; WHO, World Health Organization; CI 95%, confidence interval of 95%; *Results
are statistically significant.
70
Figures
Figure 1 Representative images of lip squamous cell carcinoma (LSCC), actinic cheilitis (AC), healthy lip mucosa (HLM) and respective PD-L1 (panels A-C),
HLA-G (panels E-G), CD8 (panels I-K), and GrB (panels M-O) immunohistochemical expression. Trophoblasts stained for PD-L1 and HLA-G; and oral lichen
planus stained for CD8 and GrB are shown in panels D, H, I, P, respectively (original magnification x200).
71
Figure 2 Mean ranks of the scores for PD-L1, HLA-G, CD8, and GrB expression in
keratinocytes/neoplastic cells, and tumor stroma/connective tissue + 95% confidence interval
(Kruskal Wallis test with the Dunn test for post hoc comparisons). There was a statistically
significant difference when PD-L1 (A, B), and HLA-G (C, D) expression in lip squamous cell
carcinoma (LSCC), and actinic cheilitis (AC) was compared to healthy lip mucosa (HLM) group.
CD8 and GrB expression was higher in LSCCs compared to ACs and controls (E, F), while AC
group showed a significantly greater GrB expression than controls (F). *p < 0.05; **p < 0.01;
***p < 0.001; ****p < 0.0001.
72
Figure 3 Spearman's rank correlation matrix between PD-L1, HLA-G, CD8, and GrB expression in lip squamous cell carcinoma (A), and actinic cheilitis (B).
Green represents a positive correlation, yellow represents a low correlation, and red is a negative correlation, as shown in the color key (*p < 0.05; **p < 0.01;
***p < 0.001; ****p < 0.0001).
73
Supplementary information
Table 1 Distribution of LSCC cases according to the histopathological grading system and clinical features.
Variable
WHO system31
p
Bryne et al.32
p Well/Moderately
differentiated
n (%)
Poorly
differentiated
n (%)
Low
grade
n (%)
High
grade
n (%)
T stage
T1-T2
T3-T4
30 (88.2)
5 (83.3)
4 (11.8)
1 (16.7)
1.000
12 (35.3)
3 (50)
22 (64.7)
3 (50)
0.654
N stage
N0
N1/N2/N3
25 (100)
10 (66.7)
0 (0)
5 (33.3)
0.005*
10 (40)
5 (33.3)
15 (60)
10 (66.7)
0.746
M stage
M0
M1
33 (89.2)
2 (66.7)
4 (10.8)
1 (33.3)
0.338
14 (37.8)
1 (33.3)
23 (62.2)
2 (66.7)
1.000
TNM stage
I-II
III-IV
23 (100)
12 (70.6)
0 (0)
5 (29.4)
0.009*
9 (39.1)
6 (35.3)
14 (60.9)
11 (64.7)
1.000
Local recurrence
Yes
No
7 (87.5)
28 (87.5)
1 (12.5)
4 (12.5)
1.000
2 (25)
13 (40.6)
6 (75)
19 (59.4)
0.686
Fisher’s exact test. LSCC, lip squamous cell carcinoma; WHO, World Health Organization; *Results are
statistically significant
74
Table 2. Distribution of LSCCs according to the type of microenvironment and histopathological grading
system and clinical features.
Variable
Type of microenvironment
p Type I (PD–L1+CD8+)
n (%)
Type IV (PD–L1-CD8+)
n (%)
T stage
T1-T2
T3-T4
24 (70.6)
5 (83.3)
10 (29.4)
1 (16.7)
1.000
N stage
N0
N1/N2/N3
20 (80)
9 (60)
5 (20)
6 (40)
0.273
M stage
M0
M1
27 (73)
2 (66.7)
10 (27)
1 (33.30
1.000
TNM stage
I-II
III-IV
18 (78.3)
11 (64.7)
5 (21.7)
6 (35.3)
0.477
Local recurrence
Yes
No
7 (87.5)
22 (68.8)
1 (12.5)
10 (31.2)
0.405
Histological grading
(WHO31)
Well/moderately differentiated
Poorly differentiated
27 (77.1)
2 (40)
8 (22.9)
3 (60)
0.117
Histological grading
(Bryne et al.32)
Low grade
High grade
11 (73.3)
18 (72)
4 (26.7)
7 (28)
1.000
Fisher’s exact test. LSCC, lip squamous cell carcinoma; WHO, World Health Organization.
75
Figure 1. Kaplan-Meier survival curves of lip squamous cell carcinoma according to PD-L1, HLA-G, CD8,
and GrB expression. The curves were compared by using the log-rank test.
76
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados da presente pesquisa nos permitem reforçar que os mecanismos de evasão
da resposta imune antitumoral podem representar um importante potencial terapêutico para o
câncer, mas ainda permanecem pouco explorados no contexto da carcinogênese labial. Embora
o presente estudo apresente limitações inerentes ao tamanho da amostra e ao seu caráter
retrospectivo, os resultados acrescentam informações relevantes para a caracterização da
resposta imune que ocorre no microambiente de CCEs de lábio e QAs, tais quais:
• A atividade citotóxica nos CCEs de lábio é maior que nas QAs; contudo, esta atividade
parece diminuir nos estágios mais avançados desta neoplasia maligna.
• A expressão de PD-L1 e HLA-G em células epiteliais e em células do tecido conjuntivo
esteve aumentada nos CCEs de lábio e QAs, quando comparada aos espécimes de mucosa
labial saudável, o que sugere que as alterações visando a imunossupressão no
microambiente destas lesões começam a se estabelecer desde a fase potencialmente
maligna, permanecendo até estágios mais avançados do carcinoma já estabelecido;
• A expressão de PD-L1 nos CCEs de lábio foi correlacionada com uma maior infiltração de
LTCs, o que se enquadra na hipótese de que a expressão desta proteína possa ser estimulada
como uma resposta à atividade imunológica antitumoral mediada por linfócitos T
infiltrando o tumor. Assim, embora não tenhamos observado uma associação da expressão
de PD-L1 com fatores clinicopatológicos das lesões, ou com a sobrevida global dos
pacientes com CCEs de lábio, acreditamos que esta molécula seja biologicamente
importante no contexto da resposta imune destes tumores.
• A maior frequência do microambiente tumoral do tipo I (PD-L1+/CD8+) nos CCEs de lábio
reforça a possibilidade de que neste tipo de tumor, a expressão de PD-L1 seja estimulada
pela presença de uma resposta antitumoral ativa.
• A presença consistente destas moléculas do checkpoint imunológico nas lesões estudadas
incentiva a realização de novas investigações que esclareçam as funções destas moléculas
tanto na carcinogênese de lábio, quanto em um contexto mais amplo de doenças induzidas
pela exposição à radiação ultravioleta.
77
5 REFERÊNCIAS
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI S. Cellular and molecular immunology. 8 ed.
Philadelphia: Saunders, 2015.
ABYANEH, M. A. Y. et al. Photodynamic therapy for actinic cheilitis. Dermatol. Sur., v.
41, p. 189–198, 2015.
AKBAY, E. A. et al. Activation of the PD-1 pathway contributes to immune escape in EGFR-
driven lung tumors. Cancer Discov., v. 3, n. 12, p. 1355–1363, 2013.
ALMANGUSH, A., et al. Depth of invasion, tumor budding, and worst pattern of invasion:
Prognostic indicators in early-stage oral tongue cancer. Head Neck, v. 36, n. 6, p. 811–818,
2014.
AMODIO, G.; ALBUQUERQUE, R. S..; GREGORI, S. New insights into HLA-G mediated
tolerance. Tissue Antigens, v. 84, n. 3, p. 255–263, 2014.
ANITEI, M. G. et al. Prognostic and predictive values of the immunoscore in patients with
rectal cancer. Clin. Cancer. Res., v. 20, n. 7, p. 1891–1899, 2014.
ARACTINGI, S. et al. Selective expression of HLA-G in malignant and premalignant skin
specimens in kidney transplant recipients. Int. J. Cancer, v. 106, n. 2, p. 232–235, 2003.
AYRES, S. Chronic actinic cheilitis. J. Am. Med. Assoc., v. 81, n. 14, p. 1183–1186, 1923.
BARNES, L. et al. World Health Organization classification of tumours - pathology and
genetics of head and neck tumours, Lion: IARC Press, 2005.
BEDOGNETTI, D. et al. Disentangling the relationship between tumor genetic programs and
immune responsiveness. Curr. Opin. Immunol., v. 39, p. 150–158, 2016.
BEDOGNETTI, D. et al. Prognostic and predictive immune gene signatures in breast cancer.
Curr. Opin. Oncol., v. 27, n. 6, p. 433–444, 2015.
BERRY, S.; TAUBE, J. M. Innate vs. Adaptive: PD-L1-mediated immune resistance by
melanoma. Oncoimmunology, v. 4, n. 10, p. e1029704, 2015.
BEZUHLY, M. et al. Quantitative HLA-G expression in metastasising and non-metastasising
primary thin cutaneous melanomas. Dermatology, v. 217, n. 3, p. 281–283, 2008.
BHANDARI, K.; WANG, D. C.; LI, S. C.; JIANG, B. H.; GUO, Y. X.; KOIRALA, U. D. X.
Primary cN0 lip squamous cell carcinoma and elective neck dissection: systematic review and
meta-analysis. Head Neck, v. 37, n. 9, p. 1392–1400, 2015.
BIASOLI, É. R. et al. Lip cancer: a clinicopathological study and treatment outcomes in a 25-
year experience. J. Oral. Maxillofac. Surg., v. 74, n. 7, p. 1360–1367, 2016.
BOTA, J. P.; LYONS, A. B.; CARROLL, B. T. Squamous Cell Carcinoma of the Lip—A
review of squamous cell carcinogenesis of the mucosal and cutaneous junction. Dermatol.
78
Surg., v. 43, n. 4, p. 494–506, 2017.
BRANDWEIN-GENSLER, M. et al. Oral squamous cell carcinoma histologic risk
assessment, but not margin status, is strongly predictive of local disease-free and overall
survival. Am. J. Surg. Pathol., v. 29, p. 167–178, 2005.
BREMNES, R. M. et al. The role of tumor-infiltrating lymphocytes in development,
progression, and prognosis of non-small cell lung cancer. J. Thorac. Oncol., v. 11, n. 6, p.
789–800, 2016.
BRYNE, M. Is the invasive front of an oral carcinoma the most important area for
prognostication? Oral Dis., v. 4, p. 70–77, 1998.
CABESTRÉ, A. F. et al. HLA-G expression in human melanoma cells: Protection from NK
cytolysis. J. Reprod. Immunol., v. 43, n. 2, p. 183–193, 1999.
CAI, M. Y. et al. Human leukocyte antigen-G protein expression is an unfavorable prognostic
predictor of hepatocellular carcinoma following curative resection. Clin. Cancer. Res., v. 15,
n. 14, p. 4686–4693, 2009.
CALDEIRA, P. C.; ABREU, M. H. N. G.; CARMO, M. A. V. Binary system of grading oral
epithelial dysplasia: Evidence of a bearing to the scores of an immunohistochemical study. J.
Oral Pathol. Med., v. 41, n. 6, p. 452–453, 2012.
CÂMARA, P. R. et al. A comparative study using WHO and binary oral epithelial dysplasia
grading systems in actinic cheilitis. Oral Dis., v. 22, n. 6, p. 523–529, 2016.
CAROSELLA, E. D. The tolerogenic molecule HLA-G. Immunol. Lett., v. 138, n. 1, p. 22–
24, 2011.
CAVALCANTE, A. S. R.; ANBINDER, A. L.; CARVALHO, Y. R. Actinic cheilitis: clinical
and histological features. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 66, n. 3, p. 498–503, 2008.
CHEN, B. G. et al. NK cytolysis is dependent on the proportion of HLA-G expression.
Human Immunol., v. 74, n. 3, p. 286–289, 2013.
CHEN, C. et al. Expression of programmed-death receptor ligands 1 and 2 may contribute to
the poor stimulatory potential of murine immature dendritic cells. Immunobiology, v. 212, n.
3, p. 159–165, 2007.
CHEN, H.; WENG, Q. Y.; FISHER, D. E. UV signaling pathways within the skin. J. Invest.
Dermatol., v. 134, n. 8, p. 2080–2085, 2014.
CHEN, J. et al. Interferon-γ-induced PD-L1 surface expression on human oral squamous
carcinoma via PKD2 signal pathway. Immunobiology, v. 217, n. 4, p. 385–393, 2012.
CHEN, M. F. et al. The role of PD-L1 in the radiation response and prognosis for esophageal
squamous cell carcinoma related to IL-6 and T-cell immunosuppression. Oncotarget, v. 7, n.
7, p. 7913–7924, 2016.
79
CHEN, N. et al. Up-regulation of PD-L1 by EGFR activation mediates the immune escape in
EGFR-driven NSCLC. J. Thor. Oncol., v. 10, n. 6, p. 901-923, 2015a.
CHEN, T. C. et al. Associations among pretreatment tumor necrosis and the expression of
HIF-1α and PD-L1 in advanced oral squamous cell carcinoma and the prognostic impact
thereof. Oral Oncol., v. 51, n. 11, p. 1004–1010, 2015b.
CHEN, Y.-M. Immune checkpoint inhibitors for nonsmall cell lung cancer treatment. J. Chin.
Med. Assoc., v. 80, n. 1, p. 7-14, 2017.
CHO, Y. A. et al. Relationship between the expressions of PD-L1 and tumor-infiltrating
lymphocytes in oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol., v. 47, n. 12, p. 1148–1153, 2011.
COLLIN, M.; MCGOVERN, N.; HANIFFA, M. Human dendritic cell subsets. Immunol., v.
140, n. 1, p. 22–30, 2013.
COLOTTA, F. et al. Cancer-related inflammation, the seventh hallmark of cancer: Links to
genetic instability. Carcinogenesis, v. 30, n. 7, p. 1073–1081, 2009.
COSTA, N. L. et al. The clinicopathological significance of the expression of Granzyme B in
oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol., v. 46, n. 3, p. 185–189, 2010.
COSTA, N. L. et al. Distinct expression of perforin and granzyme B in lip and oral cavity
squamous cell carcinoma. J. Oral Pathol. Med., v. 40, n. 5, p. 380–384, 2011.
CURIEL, T. J. et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell–mediated antitumor
immunity. Nat. Med., v. 9, n. 5, p. 562–567, 2003.
CURIGLIANO, G. et al. Molecular pathways: human leukocyte antigen G (HLA-G). Clin.
Cancer Res., v. 19, n. 20, p. 5564–5571, 2013.
D’ELISEO, D. et al. Granzyme B is expressed in urothelial carcinoma and promotes cancer
cell invasion. Int. J. Cancer, v. 127, n. 6, p. 1283–1294, 2010.
DESCHOOLMEESTER, V. et al. Tumor infiltrating lymphocytes: an intriguing player in the
survival of colorectal cancer patients. BMC Immunol., v. 11, n. 1, p. 19, 2010.
DONG, H. et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism
of immune evasion. Nat. Med., v. 8, n. 8, p. 793–800, 2002.
D’ORAZIO, J. et al. UV radiation and the skin. Int. J. Mol. Sci., v. 14, n. 6, p. 12222–12248,
2013.
EL-NAGGAR, A. K. et al. WHO Classification of Head and Neck Tumours. 4 ed. Lyon:
IARC Press, 2017.
FANG, J. et al. Prognostic significance of tumor infiltrating immune cells in oral squamous
cell carcinoma. BMC Cancer, v. 17, n. 375, p. 1–9, 2017.
FELLER, L.; ALTINI, M.; LEMMER, J. Inflammation in the context of oral cancer. Oral
80
Oncol., v. 49, n. 9, p. 887–892, 2013.
FERREIRA, L.M.R. et al. HLA-G: At the interface of maternal–fetal tolerance. Trends
Immunol., v. 38, p. 272-286, 2017.
FONTES, A. et al. The severity of epithelial dysplasia is associated with loss of maspin
expression in actinic cheilitis. J. Cut. Pathol., v. 36, n. 11, p. 1151–1156, 2009.
FOURNEL, S. et al. Cutting edge: soluble HLA-G1 triggers CD95/CD95 ligand-mediated
apoptosis in activated CD8+ cells by interacting with CD8. J. Immunol., v. 164, p. 6100–
6104, 2000.
FRANCISCO, L. M. et al. PD-L1 regulates the development, maintenance, and function of
induced regulatory T cells. J. Exp. Med., v. 206, n. 13, p. 3015–3029, 2009.
FREEMAN, G. J. et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7
family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J. Exp. Med., v. 192,
n. 7, p. 1027–1034, 2000.
FREGONEZI, P. A. G. et al. Expression of nonclassical molecule human leukocyte antigen-G
in oral lesions. Am. J. Otolaryngol., v. 33, n. 2, p. 193–198, 2012.
FRIDMAN, W. H. et al. The immune contexture in human tumours: impact on clinical
outcome. Nat. Rev. Cancer, v. 12, n. 4, p. 298–306, 2012.
FRUMENTO, G. et al. Melanomas and melanoma cell lines do not express HLA-G, and the
expression cannot be induced by gamma IFN treatment. Tissue antigens, v. 56, n. 1, p. 30–
37, 2000.
GAMBICHLER, T. et al. Expression of PD-L1 in keratoacanthoma and different stages of
progression in cutaneous squamous cell carcinoma. Cancer Immunol. Immunother.2017.
GAUR, P. et al. Inter-relation of Th1, Th2, Th17 and Treg cytokines in oral cancer patients
and their clinical significance. Human Immunol., v. 75, n. 4, p. 330–337, 2014.
GERAGHTY, D. E.; KOLLER, B. H.; ORR, H. T. A human major histocompatibility
complex class I gene that encodes a protein with a shortened cytoplasmic segment (non-HLA-
A, -B, -C class I gene/Qa structural homolog). Immunology, v. 84, p. 9145–9149, 1987.
GIBBS, N. K.; TYE, J.; NORVAL, M. Recent advances in urocanic acid photochemistry,
photobiology and photoimmunology. Photochem. Photobiol. Sci., v. 7, n. 6, p. 655–667,
2008.
GONÇALVES, A. S. et al. Immunosuppressive mediators of oral squamous cell carcinoma in
tumour samples and saliva. Human Immunol., v. 76, n. 1, p. 52–58, 2015.
GONÇALVES, A. S. et al. Relevance of HLA-G, HLA-E and IL-10 expression in lip
carcinogenesis. Human Immunol., v. 77, n. 9, p. 785–790, 2016.
GONÇALVES, A. S. et al. The clinicopathologic significance of the expression of HLA-G in
81
oral squamous cell carcinoma. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol., v. 117, n.
3, p. 361–368, 2014.
GONÇALVES, A. S. et al. Overexpression of immunomodulatory mediators in oral
precancerous lesions. Hum. Immunol., v. 78 n. 11-12, p. 752-757, 2017.
GONZAGA, A.K.G. et al. Diclofenac sodium gel therapy as an alternative to actinic cheilitis.
Clin. Oral Investig. 2017. No prelo.
GUO, Z. Y. et al. Predictive value of HLA-G and HLA-E in the prognosis of colorectal
cancer patients. Cell. Immunol., v. 293, n. 1, p. 10–16, 2015.
GUTIÉRREZ-PASCUAL, M. et al. Squamous cell carcinoma of the lip. A retrospective study
of 146 patients. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol., v. 26, n. 9, p. 1116–1121, 2012.
HAMANISHI, J. et al. Programmed cell death 1 ligand 1 and tumor-infiltrating CD8+ T
lymphocytes are prognostic factors of human ovarian cancer. PNAS, v. 104, n. 9, p. 3360–
3365, 2007.
HAN, A. Y. et al. epidemiology of squamous cell carcinoma of the lip in the United States.
JAMA Otolaryngol. Head Neck Surg., v. 142, n. 12, p. 1216-1223, 2016.
HANSEN, H.; LEE, D. R. Mechanism of class I assembly with beta 2 microglobulin and
loading with peptide. Adv. Immunol., v. 64, p. 105–137, 1997.
HARARI, A. et al. Distinct profiles of cytotoxic granules in memory CD8 T cells correlate
with function, differentiation stage, and antigen exposure. J. Virol., v. 83, n. 7, p. 2862–2871,
2009.
HARRIS, N. L.; RONCHESE, F. The role of B7 costimulation in T-cell immunity. Immunol.
Cell Biol., v. 77, n. 4, p. 304–311, 1999.
HASSON, O. Squamous cell carcinoma of the lower lip. J. Oral. Maxillofac. Surg., v. 66, n.
6, p. 1259–1262, 2008.
HERBST, R. S. et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody
MPDL3280A in cancer patients. Nature, v. 515, n. 7528, p. 563–567, 2014.
HSU, M. C. et al. Increase of programmed death-1-expressing intratumoral CD8 T cells
predicts a poor prognosis for nasopharyngeal carcinoma. Mod. Pathol., v. 23, n. 10, p. 1393–
1403, 2010.
HUANG, B. et al. The expression status and prognostic significance of programmed cell
death 1 ligand 1 in gastrointestinal tract cancer: a systematic review and meta-analysis. Onco.
Targets Ther., v. 8, p. 2617–2625, 2015.
HUBER, M. A. White oral lesions, actinic cheilitis, and leukoplakia: confusions in
terminology and definition: facts and controversies. Clin. Dermatol., v. 28, n. 3, p. 262–8,
2010.
82
IBRAHIM, E. C. et al. Analysis of HLA antigen expression in benign and malignant
melanocytic lesions reveals that upregulation of HLA-G expression correlates with malignant
transformation, high inflammatory infiltration and HLA-A1 genotype. Int. J. Cancer, v. 108,
n. 2, p. 243–250, 2004.
JADOTTE, Y. T.; SCHWARTZ, R. A. Solar cheilosis: an ominous precursor: part I.
Diagnostic insights. J. Am. Acad. Dermatol., v. 66, n. 2, p. 173-84; quiz 185-6, 2012a.
JOFFRE, O. P. et al. Cross-presentation by dendritic cells. Nat. Rev. Immunol., v. 12, n. 8, p.
557–569, 2012.
JUNQUEIRA, J. L. C. et al. Actinic cheilitis among agricultural workers in Campinas, Brazil.
Community Dent. Health, v. 28, n. 1, p. 60–63, 2011.
KAPASI, K. et al. HLA-G has a concentration-dependent effect on the generation of an allo-
CTL response. Immunol., v. 101, n. 2, p. 191–200, 2000.
KAUGARS, G. E. et al. Actinic cheilitis - A review of 152 cases. Oral Surg. Oral Med.
Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v. 88, p. 181–186, 1999.
KIM, H. R. et al. PD-L1 expression on immune cells, but not on tumor cells, is a favorable
prognostic factor for head and neck cancer patients. Sci. Rep., v. 6, n. 1, p. 36956, 2016.
KIM, M.Y. et al. Clinicopathological analysis of PD-L1 and PD-L2 expression in pulmonary
squamous cell carcinoma: Comparison with tumor-infiltrating T cells and the status of
oncogenic drivers. Lung Cancer, v. 88, p. 24–33, 2015.
KOCHAN, G. et al. Role of non-classical MHC class I molecules in cancer
immunosuppression. Oncoimmunology, v. 2, n. 11, p. e26491-8, 2013.
KORN, T. et al. IL-17 and Th17 cells. Annu. Rev. Immunol., v. 27, p. 485-517, 2009.
KRIPKE, M. L. Reflections on the field of photoimmunology. J. Invest. Dermatol., v. 133,
n. 1, p. 27–30, 2013.
KRUIJF, E. M. et al. HLA-E and HLA-G expression in classical HLA class I-negative tumors
is of prognostic value for clinical outcome of early breast cancer patients. J. Immunol., v.
185, n. 12, p. 7452–7459, 2010.
KUANG, D. M. et al. Activated monocytes in peritumoral stroma of hepatocellular carcinoma
foster immune privilege and disease progression through PD-L1. J. Exp. Med., v. 206, n. 6,
p. 1327–1337, 2009.
LAMBERT, R. et al. Epidemiology of cancer from the oral cavity and oropharynx. Eur. J.
Gastroenterol. Hepatol., v. 23, n. 8, p. 633–641, 2011.
LEI, Y. et al. Telltale tumor infiltrating lymphocytes (TIL) in oral, head & neck cancer. Oral
Oncol., v. 61, p. 159–165, 2016.
83
LEMAOULT, J. et al. Immune regulation by pretenders: cell-to-cell transfers of HLA-G
make effector T cells act as regulatory cells Immune regulation by pretenders: cell-to-cell
transfers of HLA-G make effector T cells act as regulatory cells. Blood, v. 109, n. 5, p. 2040–
2048, 2007.
LIMA, G. D. S. et al. Diclofenac in hyaluronic acid gel: an alternative treatment for actinic
cheilitis. J. Appl. Oral Sci., v. 18, n. 5, p. 533–537, 2010.
LIMA, L. C. D. A. Resposta a danos no DNA após exposição à luz ultravioleta: apagando o
fogo antes do incêndio celular. Rev. Biol., v. 14, n. 1, p. 6–16, 2015.
LIN, Y. M. et al. High PD-L1 expression correlates with metastasis and poor prognosis in oral
squamous cell carcinoma. PLoS ONE, v. 10, n. 11, p. 1–11, 2015.
LIU, W. et al. Malignant transformation of oral leukoplakia: a retrospective cohort study of
218 Chinese patients. BMC cancer, v. 10, n. 1, p. 685, 2010.
LOPES, M. L. D. S. et al. Clinicopathological profile and management of 161 cases of actinic
cheilitis. An. Bras. Dermatol., v. 90, n. 4, p. 347–350, 2015.
LOPES, M. L. D. S. et al. Correlation between cell cycle proteins and hMSH2 in actinic
cheilitis and lip cancer. Arch. Dermatol. Res., v. 308, n. 3, p. 165–171, 2016.
LOURENÇO, S. D. Q. C. et al. Classificações histopatológicas para o carcinoma de células
escamosas da cavidade oral: revisão de sistemas propostos. Rev. Bras. Cancer., v. 53, n. 3, p.
325–333, 2007.
LUCENA, E. E. S. et al. Prevalence and factors associated to actinic cheilitis in beach
workers. Oral Dis., v. 18, n. 6, p. 575–579, 2012.
LYDIATT, W. M. et al. Head and neck cancers - Major changes in the American Joint
Committee on Cancer eighth edition Cancer Staging Manual. CA Cancer J. Clin., v. 67, n. 2,
p. 122-137, 2017.
LYFORD-PIKE, S. et al. Evidence for a role of the PD-1:PD-L1 pathway in immune
resistance of HPV-associated head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res., v. 73, n.
6, p. 1733–1741, 2013.
MALASPINA, T. S. S. et al. Enhanced programmed death 1 (PD-1) and PD-1 ligand (PD-L1)
expression in patients with actinic cheilitis and oral squamous cell carcinoma. Cancer
Immunol. Immunother., v. 60, n. 7, p. 965–974, 2011.
MALEKI, S. et al. Lymphocytic host response to oral squamous cell carcinoma: An adaptive
T-cell response at the tumor interface. Head Neck Pathol., v. 5, n. 2, p. 117–122, 2011.
MANDAI, M. et al. Dual faces of IFNγ in cancer progression: A role of PD-L1 induction in
the determination of pro and antitumor immunity. Clin. Cancer Res., v. 22, n. 10, p. 2329–
2334, 2016.
84
MANTOVANI, A. et al. Tumour immunity: effector response to tumour and role of the
microenvironment. Lancet, v. 371, n. 9614, p. 771–783, 2008.
MAO, Y. et al. The prognostic value of tumor-infiltrating lymphocytes in breast cancer: A
systematic review and meta-analysis. PLoS ONE, v. 11, n. 4, p. 1–13, 2016.
MARKOPOULOS, A; ALBANIDOU-FARMAKI, E.; KAYAVIS, I. Actinic cheilitis:
clinical and pathologic characteristics in 65 cases. Oral Dis., v. 10, n. 4, p. 212–6, jul. 2004.
MARTINS-FILHO, P. R. S.; SILVA, L. C. F.; PIVA, M. R. The prevalence of actinic
cheilitis in farmers in a semi-arid northeastern region of Brazil. Int. J. Dermatol., v. 50, n. 9,
p. 1109–1114, 2011.
MARZEC, M. et al. Oncogenic kinase NPM/ALK induces through STAT3 expression of
immunosuppressive protein CD274 (PD-L1, B7-H1). PNAS, v. 105, n. 52, p. 20852–20857,
2008.
MATOS, F. R. et al. Analysis of inflammatory infiltrate, perineural invasion, and risk score
can indicate concurrent metastasis in squamous cell carcinoma of the tongue. J. Oral
Maxillofac. Surg., v. 70, n. 7, p. 1703–1710, 2012.
MEULENAERE, A. et al. Prognostic markers in oropharyngeal squamous cell carcinoma:
focus on CD70 and tumour infiltrating lymphocytes. Pathology, v. 49, n. 4, p. 1–8, 2017.
MINO-KENUDSON, M. Programmed cell death ligand-1 (PD-L1) expression by
immunohistochemistry: could it be predictive and/or prognostic in non-small cell lung
cancer? Cancer Biol. Med., v. 13, n. 2, p. 157–170, 2016.
MITTAL, D. et al. New insights into cancer immunoediting and its three component phases
— elimination, equilibrium and escape. Curr. Opin. Immunol., v. 27, p. 16–25, 2014.
MONTEIRO, L. S. et al. Incidence rates and trends of lip, oral and oro-pharyngeal cancers in
Portugal. J. Oral Pathol. Med., v. 42, n. 4, p. 345–351, 2013.
MORSELLI, P. et al. Clinical parameters in T1N0M0 lower lip squamous cell carcinoma. J.
Craniofac. Surg., v. 18, n. 5, p. 1079–1082, 2007.
MU, C. Y. et al. High expression of PD-L1 in lung cancer may contribute to poor prognosis
and tumor cells immune escape through suppressing tumor infiltrating dendritic cells
maturation. Med. Oncol., v. 28, n. 3, p. 682–688, 2011.
NAKABEPPU, Y. et al. Mutagenesis and carcinogenesis caused by the oxidation of nucleic
acids. Biol. Chem., v. 387, n. 4, p. 373–379, 2006.
NANKIVELL, P. et al. The binary oral dysplasia grading system: Validity testing and
suggested improvement. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol., v. 115, n. 1, p.
87–94, 2013.
NEVILLE, B. W. et al. Patologia Oral e Maxilofacial. 4. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2016.
85
NIELSEN, C. M. et al. Functional significance of CD57 expression on human NK cells and
relevance to disease. Front. Immunol., v. 4, n. DEC, p. 1–8, 2013.
NISHISGORI, C. Current concept of photocarcinogenesis. Photochem. Photobiol. Sci., v.
14, p. 1713–1721, 2015.
NOLAN, A. et al. The prevalence of dysplasia and malignant lip lesions in transplant patients.
J. Oral Pathol. Med., v. 41, p. 113–118, 2012.
OCHSENIUS, G. et al. Estudio retrospectivo de 232 casos de cáncer y precáncer de labio en
pacientes chilenos. Correlación clínico-histológica. Rev. Med. Chil., v. 131, p. 60–66, 2003.
OCK, C. Y. et al. Pan-Cancer immunogenomic perspective on the tumor microenvironment
based on PD-L1 and CD8 T-cell infiltration. Clin. Cancer Res., v. 22, n. 9, p. 2261–2270,
2016.
OHAEGBULAM, K. C. et al. Human cancer immunotherapy with antibodies to the PD-1 and
PD-L1 pathway. Trends Mol. Med., v. 21, n. 1, p. 24–33, 2015.
ÖHMAN, J. et al. Oral and lip cancer in solid organ transplant patients - A cohort study from
a Swedish Transplant Centre. Oral Oncol., v. 51, p. 146–150, 2015.
OLIVEIRA-COSTA, J. P. et al. Gene expression patterns through oral squamous cell
carcinoma development: PD-L1 expression in primary tumor and circulating tumor cells.
Oncotarget, v. 6, n. 25, p. 20902–20920, 2015.
PAGÈS, F. et al. In situ cytotoxic and memory T cells predict outcome in patients with early-
stage colorectal cancer. J. Clin. Oncol., v. 27, n. 35, p. 5944–5951, 2009.
PALUCKA, K.; BANCHEREAU, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat. Rev.
Cancer, v. 12, n. 4, p. 265–277, 2012.
PARDOLL, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev.
Cancer, v. 12, n. 4, p. 252–264, 2012.
PARSA, A. T. et al. Loss of tumor suppressor PTEN function increases B7-H1 expression
and immunoresistance in glioma. Nat. Med., v. 13, n. 1, p. 84–88, 2007.
PASCUAL-GARCÍA, M. et al. CD8 down-regulation on cytotoxic T lymphocytes of patients
with endometrioid endometrial carcinomas. Human Pathol., v. 56, p. 180–188, 2016.
PASTUSZEK, A.; HANSON, M.; GRIGG, R. Squamous cell carcinoma of the lip: depth of
invasion, local recurrence and regional metastases. Experience of a rural multidisciplinary
head and neck unit. J. Laryngol. Otol., v. 130, n. S1, p. S32-37, 2016.
PEREIRA, J. S. et al. Analysis of CD8+ and CD4+ cells in oral squamous cell carcinoma and
their association with lymph node metastasis and histologic grade of malignancy. Appl.
Immunohistochem. Mol. Morphol., v. 22, n. 3, p. 200–205, 2014.
86
PILATI, S. F. M. et al. Histopathologic features in actinic cheilitis by the comparison of
grading dysplasia systems. Oral Dis., v. 23, n. 2, p. 219–224, 2017.
PIÑERA-MARQUES, K. et al. Actinic lesions in fishermen’s lower lip: clinical,
cytopathological and histopathologic analysis. Clinics (São Paulo, Brazil), v. 65, n. 4, p.
363–367, 2010.
PRATHEEK, B. M. et al. Mammalian non-classical major histocompatibility complex I and
its receptors: Important contexts of gene, evolution, and immunity. Indian J. Hum. Genet.,
v. 20, n. 2, p. 129–141, 2014.
RAHIMA, B. et al. Prognostic significance of perineural invasion in oral and oropharyngeal
carcinoma. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endodont., v. 97, n. 4, p. 423–
431, 2004.
RAJAGOPALAN, S. et al. Activation of NK cells by an endocytosed receptor for soluble
HLA-G. PLoS Biology, v. 4, n. 1, p. 0070–0086, 2006.
RAJAGOPALAN, S. et al. Cutting Edge: Induction of IFN-gamma production but not
Cytotoxicity by the Killer Cell Ig-Like Receptor KIR2DL4 (CD158d) in resting NK Cells. J.
Immunol., v. 167, p. 1877–1881, 2001.
RISTICH, V. et al. Tolerization of dendritic cells by HLA-G. Eur. J. Immunol., v. 35, n. 4,
p. 1133–1142, 2005.
ROJAS, I. G. et al. CD8+ and FoxP3+ T-cell infiltration in actinic cheilitis. Int. J. Dermatol.,
v. 56, n. 1, p. 54–62, 2017.
ROUAS-FREISS, N. et al. Direct evidence to support the role of HLA-G in protecting the
fetus from maternal uterine natural killer cytolysis. PNAS, v. 94, n. 21, p. 11520–11525,
1997.
RUFFELL, B.; AFFARA, N. I.; COUSSENS, L. M. Differential macrophage programming in
the tumor microenvironment. Trends Immunol., v. 33, n. 3, p. 119–126, 2012.
LADOIRE, S. et al. Biomarkers of immunogenic stress in metastases from melanoma
patients: Correlations with the immune infiltrate. Oncoimmunology, v. 5, n. 6, p. e1160193,
2016.
SANTOS, H. B. P. et al. Histopathological grading systems and their relationship with
clinical parameters in lower lip squamous cell carcinoma. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., v.
43, n. 5, p. 539–545, 2014.
SATO, E. et al. Intraepithelial CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes and a high
CD8+/regulatory T cell ratio are associated with favorable prognosis in ovarian cancer.
PNAS, v. 102, n. 51, p. 18538–18543, 2005.
SAVAGE, N. W.; MCKAY, C.; FAULKNER, C. Actinic cheilitis in dental practice. Aust.
Dent. J., v. 55, n. 1, p. 78–84, 2010.
87
SAWAZAKI-CALONE, I. et al. The prognostic value of histopathological grading systems in
oral squamous cell carcinomas. Oral Dis., v. 21, n. 6, p. 755–761, 2015.
SCHAPER, K. et al. The pattern and clinicopathological correlates of programmed death-
ligand 1 expression in cutaneous squamous cell carcinoma. Brit. J. Dermatol., v. 176, n. 5, p.
1354–1356, 2017.
SCHREIBER, R. D.; OLD, L. J.; SMYTH, M. J. Cancer immunoediting: Integrating
immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science, v. 331, n. 6024, p. 1565–
1570, 2011.
SCHWARZ, T. 25 years of UV-induced immunosuppression mediated by T cells-from
disregarded T suppressor cells to highly respected regulatory T cells. Photochem. Photobiol.,
v. 84, n. 1, p. 10–18, 2008.
SCHWARZ, T. Mechanisms of UV-induced immunosuppression. Keio J. Med., v. 54, n. 4,
p. 165–171, 2005.
SENA, M. F. et al. Avaliação dos fatores prognósticos relacionados ao câncer de lábio:
revisão sistemática. Rev. Bras. Cancer., v. 56, n. 1, p. 93–102, 2010.
SHAH, A. Y.; DOHERTY, S. D.; ROSEN, T. Actinic cheilitis: a treatment review. Int. J.
Dermatol., v. 49, n. 11, p. 1225–1234, 2010.
SHAH, S. et al. Pools of programmed death-ligand within the oral cavity tumor
microenvironment: Variable alteration by targeted therapies. Head Neck, v. 38, n. 8, p. 1176–
1186, 2016.
SHEU, J.; SHIH, I. M. HLA-G and immune evasion in cancer cells. J. Form. Med. Assoc., v.
109, n. 4, p. 248–257, 2010.
SHIMOJI, M. et al. Clinical and pathologic features of lung cancer expressing programmed
cell death ligand 1 (PD-L1). Lung Cancer, v. 98, p. 69–75, 2016.
SILVEIRA, E. J. D. et al. Analysis of local immunity in squamous cell carcinoma of the
tongue and lower lip. Exp. Mol. Pathol., v. 88, n. 1, p. 171–175, 2010.
SLATER, N. A.; GOOGE, P. B. PD-L1 expression in cutaneous squamous cell carcinoma
correlates with risk of metastasis. J. Cut. Pathol., v. 43, n. 8, p. 663–670, 2016.
SONG, M. et al. PTEN loss increases PD-L1 protein expression and affects the correlation
between PD-L1 expression and clinical parameters in colorectal cancer. PLoS ONE, v. 8, n.
6, 2013.
FREITAS, V. S. et al. Mast cells and matrix metalloproteinase 9 expression in actinic cheilitis
and lip squamous cell carcinoma. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod.,
v. 112, n. 3, p. 342–348, 2011.
88
SOUZA, L. R. et al. Lip squamous cell carcinoma in a Brazilian population: Epidemiological
study and clinicopathological associations. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal., v. 16, n. 6, p.
757–762, 2011.
STASIKOWSKA-KANICKA, O.; WĄGROWSKA-DANILEWICZ, M.; DANILEWICZ, M.
Immunohistochemical analysis of Foxp3+, CD4+, CD8+ cell infiltrates and PD-L1 in oral
squamous cell carcinoma. Pathol. Oncol. Res. No prelo.
STRAUB, M. et al. CD274/PD-L1 gene amplification and PD-L1 protein expression are
common events in squamous cell carcinoma of the oral cavity. Oncotarget, v. 7, n. 11, p.
12024–34, 2016.
SWANSON, M. S.; SINHA, U. K. Rationale for combined blockade of PD-1 and CTLA-4 in
advanced head and neck squamous cell cancer - Review of current data. Oral Oncol., v. 51,
n. 1, p. 12–15, 2015.
TAUBE, J. M. et al. Association of PD-1, PD-1 ligands, and other features of the tumor
immune microenvironment with response to anti-PD-1 therapy. Clin. Cancer Res., v. 20, n.
19, p. 5064–5074, 2014.
TENG, M. W. L. et al. Classifying cancers basedon T-cell infiltration and PD-L1. Cancer
Res., v. 75, n. 11, p. 2139–2145, 2015.
THANH PHAM, T. et al. Squamous Cell Carcinoma of the Lip in Australian Patients.
Dermatol. Surg., v. 41, n. 2, p. 219–225, 2015.
TOSOLINI, M. et al. Clinical impact of different classes of infiltrating T cytotoxic and helper
cells (Th1, th2, treg, th17) in patients with colorectal cancer. Cancer Res., v. 71, p. 1263–
1271, 2011.
TSUSHIMA, F. et al. Predominant expression of B7-H1 and its immunoregulatory roles in
oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol., v. 42, n. 3, p. 268–274, 2006.
UROSEVIC, M.; DUMMER, R. HLA-G in skin cancer: A wolf in sheep’s clothing? Human
Immunol., v. 64, n. 11, p. 1073–1080, 2003.
VAN HOUDT, I. S. et al. Absence of Granzyme B positive tumour-infiltrating lymphocytes
in primary melanoma excisional biopsies is strongly associated with the presence of sentinel
lymph node metastasis. Cell. Oncol., v. 31, n. 5, p. 407–413, 2009.
VANDERLEI, J. P. D. M. et al. Management of neck metastases in T2N0 lip squamous cell
carcinoma. Am. J. Otolaryngology, v. 34, n. 2, p. 103–106, 2013.
VASSILAKOPOULOU, M. et al. Evaluation of PD-L1 expression and associated tumor-
infiltrating lymphocytes in laryngeal squamous cell carcinoma. Clin. Cancer Res., v. 22, n. 3,
p. 704–713, 2015.
VIEIRA, R. A. M. A. R. et al. Actinic cheilitis and squamous cell carcinoma of the lip:
clinical, histopathological and immunogenetic aspects. An. Bras. Dermatol., v. 87, n. 1, p.
105–114, 2012.
89
VINAY, D. S. et al. Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies.
Sem. Cancer Biol., v. 35, p. S185–S198, 2015.
VOSKOBOINIK, I.; WHISSTOCK, J. C.; TRAPANI, J. A. Perforin and granzymes:
function, dysfunction and human pathology. Nat. Rev. Immunol., v. 15, n. 6, p. 388–400,
2015.
WANG, E.; WORSCHECH, A.; MARINCOLA, F. M. The immunologic constant of
rejection. Trends Immunol., v. 29, n. 6, p. 256–262, 2008.
WANG, W. et al. PD1 blockade reverses the suppression of melanoma antigen-specific CTL
by CD4+CD25Hi regulatory T cells. Int. Immunol., v. 21, n. 9, p. 1065–1077, 2009.
WARNAKULASURIYA, S.; REIBEL, J.; BOUQUOT, J.; DABELSTEEN, E. Oral epithelial
dysplasia classification systems: predictive value, utility, weaknesses and scope for
improvement. J. Oral Pathol. Med., v. 37, p. 127–133, 2008.
WATANABE, Y. et al. Tumor-infiltrating lymphocytes, particularly the balance between
CD8+ T cells and CCR4+ regulatory T cells, affect the survival of patients with oral
squamous cell carcinoma. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v. 109,
n. 5, p. 744–752, 2010.
WEBB, J. R. et al. PD-L1 expression is associated with tumor-infiltrating T cells and
favorable prognosis in high-grade serous ovarian cancer. Gynecologic Oncology, v. 141, n. 2,
p. 293–302, 2016.
WERMKER, K. et al. Prediction model for lymph node metastasis and recommendations for
elective neck dissection in lip cancer. J. Craniomaxillofac. Surg., v. 43, n. 4, p. 545–552,
2015.
WHERRY, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol., v. 12, n. 6, p. 492–499, 2011.
WIENDL, H. et al. A functional role of HLA-G expression in human gliomas: an alternative
strategy of immune escape. J. Immunol., v. 168, p. 4772–4780, 2002.
WOOLGAR, J. A. Histopathological prognosticators in oral and oropharyngeal squamous cell
carcinoma. Oral Oncol., v. 42, n. 3, p. 229–239, 2006.
WU, P. et al. PD-L1 and survival in solid tumors: A meta-analysis. PLoS ONE, v. 10, n. 6, p.
1–15, 2015.
XAVIER, F. C. A. et al. p63 Immunoexpression in lip carcinogenesis. J. Mol. Histol., v. 40,
n. 2, p. 131–137, 2009.
YAGYUU, T. et al. Programmed death ligand 1 (PD-L1) expression and tumor
microenvironment: Implications for patients with oral precancerous lesions. Oral Oncol., v.
68, p. 36–43, 2017.
90
YIE, S. M. et al. Expression of HLA-G is associated with prognosis in esophageal squamous
cell carcinoma. Am. J. Clin. Pathol., v. 128, n. 6, p. 1002–1009, 2007.
ZANCOPE, E. et al. Differential infiltration of CD8 + and NK cells in lip and oral cavity
squamous cell carcinoma. J. Oral Pathol. Med., v. 39, p. 162–167, 2010.
ZANDBERG, D. P.; STROME, S. E. The role of the PD-L1:PD-1 pathway in squamous cell
carcinoma of the head and neck. Oral Oncol., v. 50, n. 7, p. 627–632, 2014. ZOU, W.;
ZHANG, J.P. et al. Increased intratumoral IL-17-producing cells correlate with poor survival
in hepatocellular carcinoma patients. J. Hepatol., v. 50, p. 980–989, 2009.
ZOU, W.; CHEN, L. Inhibitory B7-family molecules in the tumour microenvironment. Nat.
Rev. Immunol., v. 8, n. 6, p. 467–477, 2008.
91
ANEXOS
Anexo A
92
93
94
Anexo B
