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Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 1

2 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003

mal da vaca louca, conhecido cientificamente comoBSE (sigla em inglês para encefalopatiaespongiforme bovina), afeta o cérebro do animal,provocando descontrole motor. As células morreme o cérebro fica com a aparência de uma esponja.

A vaca passa a agir como se estivesse enlouquecida, o que explicao fato de ser conhecida popularmente como mal da vaca louca.Não há tratamento conhecido para essa doença, que já foidetectada em cerca de 20 países da Europa, atingindo mais de 180mil cabeças de gado. Ao contrário da maior parte das enfermida-des, o mal da vaca louca não é transmitido por fungos, vírus oubactérias, e sim por proteínas específicas denominadas prions.

Essa doença nunca foi detectada no Brasil e a sua entrada, certamente,resultaria em um desastre para o país, que tem na pecuária um de seusprincipais alicerces econômicos, representando ganhos de mais de R$ 55bilhões por ano. Sem falar que o rebanho brasileiro é hoje maior do que asoma dos rebanhos da Argentina, Paraguai e Uruguai. Diante da necessidadeurgente de conter a sua disseminação, a Empresa Brasileira de PesquisaAgropecuária (Embrapa), por meio de uma de suas 40 unidades de pesquisa,a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, localizada em Brasília, DF,desenvolveu um método para detecção de proteínas de origem animal emrações destinadas a mamíferos, especialmente ruminantes, que tem comoobjetivo monitorar a qualidade do alimento e evitar a transmissão de doençascausadas por substâncias infecciosas, tais como prions transmissores deencefalopatias espongiformes transmissíveis (TSE), principalmente o mal davaca louca.

O método, desenvolvido pela equipe do pesquisador Carlos Bloch Jr hácerca de três anos, cuja patente foi depositada pela Embrapa em 2002, utilizaaparelhos de última geração denominados espectrômetros de massa, para adetecção das proteínas. Para se ter uma idéia do grau de modernidade e deeficiência desses aparelhos, eles possuem tecnologia comparável à que estásendo usada pelos robôs Spirit e Opportunity nas pesquisas que estão sendofeitas pela NASA no Planeta Marte, para a detecção de outros tipos demoléculas. De acordo com o pesquisador, esses aparelhos são hipersensíveis,com um limite de detecção altíssimo, de uma parte por milhão, ou seja, sefizermos uma comparação com uma balança na qual fossem colocadas ummilhão de pessoas, o espectrômetro de massa seria capaz de detectar a ausênciade apenas uma delas.

Nova tecnologiano combate ao

“mal da vaca louca”Metodologia detecta proteínas na ração e evita a contaminação de animais

Entrevista

Entrevista concedida aMaria Fernanda Diniz


Para falar sobre essa metodolo-gia e a sua importância para a pesqui-sa agropecuária brasileira, a revistaBiotecnologia, Ciência & Desen-volvimento entrevistou o pesquisa-dor da Embrapa Recursos Genéticose Biotecnologia, Carlos Bloch Jr. Du-rante a entrevista, ele falou sobre ométodo desenvolvido por sua equi-pe e das vantagens que representasobre os outros métodos utilizadosaté o momento, além dos rumosdessas pesquisas para o futuro.

BC&D – Em que consiste ométodo utilizado pela EmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnolo-gia e há quanto tempo foi desen-volvido?

Bloch – O método começou aser desenvolvido pela nossa equipehá cerca de três anos, foi aperfeiçoa-do ao longo de 2001 e em 2002 foidepositada a patente. O objetivodesse método é avaliar a qualidadedas rações destinadas a ruminantese, assim, evitar a transmissão deTSE’s (encefalopatias espongiformestransmissíveis), especialmente aencefalopatia espongiforme bovina(BSE), pela detecção de proteínas deorigem animal, em particular daque-las provenientes de restos de carca-ças de animais abatidos que pudes-sem ser misturados à ração. Odesenvolvimento dessa metodologiacompreende três etapas: a primeira emais trabalhosa é a extração do ma-terial protéico para separá-lo, princi-palmente de lipídeos e dos carboi-dratos. Em seguida, cada amostrapode ser analisada em dois tipos deespectrômetros de massa simultane-amente, o primeiro analisa em pou-cos minutos a presença de moléculasde proteína animal, como a mioglo-bina, cadeias alfa e beta da hemoglo-bina e proteínas plasmáticas, paradizer se existe ou não algum indíciode contaminação. O segundo analisae quantifica os seus fragmentos(peptídeos) derivados de moléculasinteiras de contaminantes, que po-dem se formar a partir do ataque demicrorganismos e/ou da ação mecâ-

nica durante o processo de fabrica-ção. A terceira etapa é a interpreta-ção dos dados para determinar osníveis de contaminação e a sua ori-gem, ou seja, se as moléculas conta-minantes encontradas eram proveni-entes de bovinos, suínos, eqüinos,ovinos, aves, peixes, etc.

BC&D – Qual é a vantagem daespectrometria de massa sobreos outros métodos utilizados parao controle dessas doenças?

Bloch – A espectrometria demassa é um método muito mais sen-sível, rápido e seguro para se diag-nosticar a presença desse tipo demolécula. Não é à toa que vocêencontra espectrômetros de massaespalhados por locais e em ativida-des que até bem pouco tempo atrásnão se poderia imaginar. Só paracitar alguns exemplos, encontram-sehoje espectrômetros de massa nosaeroportos, nos correios, nos espor-tes, nos tanques e aviões de guerra,sem falar nas missões espaciais. Sãoesses equipamentos que produzem,com mais rapidez e eficiência, res-postas sobre a presença ou não deexplosivos, material de guerra quí-mica ou biológica. Atualmente, sãoutilizados três métodos para monitorara qualidade dos alimentos dos rumi-nantes: o primeiro é o de microscopiaótica, que se baseia na procura defragmentos de pele, ossos etc. naração; o segundo é o método ELISA,que utiliza anticorpos para detectaras proteínas alvo; e o terceiro e maisnovo é o método PCR, que detecta oDNA das proteínas por meio de umprimer (um tipo de gene marcador).Todos esses métodos apresentam li-

mitações da mesma natureza, ou seja,não detectam diretamente a presen-ça de proteína. O primeiro, e maisutilizado ainda hoje na União Euro-péia é também o mais falho de todos,já que a microscopia ótica não permi-te a detecção de proteínas. O méto-do ELISA tem como fator limitante ofato de utilizar anticorpos específicospara determinadas classes de proteí-nas, o que impede a identificação deoutros grupos; e o terceiro, o de PCR,esbarra no problema do DNA serfragmentado depois do processo deindustrialização, tornando difícil asua amplificação para a análise. Logo,a espectrometria de massa aparececomo o método mais preciso para adetecção direta e não indireta deproteínas. O grande avanço propici-ado por essa metodologia é o fato depoder detectar as proteínas inteirasou fragmentos delas com uma preci-são de uma parte por milhão (PPM).O que isso significa? Se fizermos umaanalogia com uma balança na qualsão colocadas um milhão de pessoas,o espectrômetro é capaz de detectara ausência de apenas uma delas. E osníveis de detecção estão sendo me-lhorados cada vez mais. Os últimosespectrômetros lançados já têm po-der de menos de uma parte pormilhão, ou seja, menos de uma pes-soa, se continuarmos a seguir aquelaanalogia, e tudo isso com muita rapi-dez e eficiência automatizáveis. Aparte mais demorada desse processoé a primeira etapa, na qual é feita aextração do material a ser analisado.Essa etapa pode demorar de 36 a 72horas, mas é comum a todos osoutros métodos. Em suma, ao quetudo indica, essa metodologia é oque existe hoje de mais moderno eseguro para monitorar a qualidadedos alimentos oferecidos aos rumi-nantes e, logo, controlar a dissemina-ção das encefalopatias espongifor-mes transmissíveis, ou TSE’s, comosão conhecidas.

BC&D – As TSE’ s , entre asquais a mais nociva é a BSE(encefalopatia espongiforme bo-vina), ou mal da vaca louca, re-

“““““O grande avanço propiciadoO grande avanço propiciadoO grande avanço propiciadoO grande avanço propiciadoO grande avanço propiciadopor essa metodologia é o fatopor essa metodologia é o fatopor essa metodologia é o fatopor essa metodologia é o fatopor essa metodologia é o fatode poder detectar as proteínasde poder detectar as proteínasde poder detectar as proteínasde poder detectar as proteínasde poder detectar as proteínasinteiras ou fragmentos delasinteiras ou fragmentos delasinteiras ou fragmentos delasinteiras ou fragmentos delasinteiras ou fragmentos delas

com uma precisão de umacom uma precisão de umacom uma precisão de umacom uma precisão de umacom uma precisão de umaparte por milhão (PPM).”parte por milhão (PPM).”parte por milhão (PPM).”parte por milhão (PPM).”parte por milhão (PPM).”


presentam uma ameaça não ape-nas para os animais como tam-bém para os seres humanos.Como se dá a contaminação equal o tratamento existente hojepara essas doenças?

Bloch – As encefalopatias es-pongiformes transmissíveis, ou TSE’s,são doenças progressivas e letais queafetam o sistema nervoso central e secaracterizam por alterações anatômicaslocalizadas no cérebro. Essas altera-ções são um tipo de lesão histológica,constituídas de vacúolos e depósitosprotéicos. As TSE’s podem resultar deinfecções espontâneas, transmissãohereditária ou exposição a materiaiscontaminados. As TSE’s incluem: aBSE, conhecida popularmente como“mal da vaca louca”; a scrapie, ouparaplexia enzoótica dos ovinos, queafeta ovinos e caprinos em muitospaíses há mais de 200 anos; e adoença de Creutzfeldt-Jakob (CJD)que afeta seres humanos, principal-mente com mais de 50 anos de idade.Essa doença tem distribuição mundi-al, com incidência anual de aproxima-damente um caso por milhão e ocorrede três formas: esporádica (responsá-vel por 85 a 90% dos casos). familiar(associada a mutações genéticas, re-presenta 5 a 10% dos casos) eiatrogênica, ou seja, por contamina-ção, (responsável por menos de 5%dos casos). Logo, em humanos, achance de desenvolver a doença porcontaminação é de menos de 5%. Nosoutros 95% dos casos, a doença sedesenvolve naturalmente. Em ovinose bovinos, os principais sintomas sãoagressividade e falta de coordenaçãomotora. Em humanos, os principaissintomas são: mioclonia – contraçãomuscular brusca e breve – e demên-cia. Não existe tratamento conhecidopara a BSE, portanto, a única forma decombatê-la é evitando a contamina-ção. Cerca de 125 casos foramregistrados no mundo em humanos,segundo os Centros de Controle ePrevenção de Doenças dos EstadosUnidos, e na Europa, aproximada-mente 100 pessoas morreram em fun-ção dessa doença. Mas, para os ani-

mais, a situação é bem mais séria,visto que já foi detectada em mais de20 países da Europa, atingindo maisde 180 mil cabeças de gado.

BC&D – Então a BSE tem sedisseminado de forma rápida, es-pecialmente na Europa. Como sedá a contaminação?

Bloch – A natureza do agenteinfeccioso da BSE, assim como dasoutras TSE’s, é ainda motivo decontrovérsia. Acredita-se que aspartículas infecciosas responsáveispela BSE são predominantementeproteínas específicas denominadasprions, que são compostas, em qua-se a sua totalidade, de umaglicoproteína de conformação anor-mal, que se prende à superfícieexterna das células. Em outraspalavras, a teoria mais aceita hojeafirma que o agente infeccioso,prion, é derivado de uma proteínada membrana celular, que sofreuma mutação e forma um tipo inso-lúvel e patogênico de prion. Aindahoje não está totalmente esclareci-do o mecanismo pelo qual essaproteína anormal produz as altera-ções patológicas no cérebro dosanimais ou indivíduos afetados.

BC&D – Desde que foi diag-nosticada pela primeira vez nomundo, como se deu a evoluçãoda BSE ao longo dos anos?

Bloch – Os primeiros casos deBSE foram diagnosticados no ReinoUnido, em 1986. No final de 1987,o Departamento de Epidemiologiado Laboratório Veterinário Centraldaquele país concluiu que a disse-minação da doença entre os bovi-nos ocorria mediante o consumo defarinha de carne e ossos, obtida apartir de carcaças de animais conta-minados e incorporada à ração ofe-recida aos bovinos. Essa teoria foiplenamente confirmada, já que aproibição do uso daquele produtona alimentação de ruminantes teveefeito claro, resultando em reduçãosignificativa no aparecimento de

novos casos de BSE. Foram levan-tadas outras possibilidades de con-taminação, como por exemplo, atransmissão vertical da vaca para obezerro. Mas, o que se sabe de fatoé que a epidemia do “mal da vacalouca” não teria acontecido se nãohouvesse disseminação por meioda farinha de carne e ossos. Diantedisso, pode-se dizer que se umbovino contaminado for introduzi-do num país ou região onde nãoexiste BSE, como é o caso do Brasil,só poderá ocorrer uma epidemia sea carcaça desse animal for utilizadapara produzir farinha destinada àalimentação de ruminantes porqueisso gera um sistema de dissemina-ção e amplificação do agente infec-cioso na população animal. Apóso início da epidemia no Reino Uni-do, surgiu a teoria de que os primei-ros casos de BSE teriam resultadoda utilização de carcaças de ovinoscontaminados com scrapie na ali-mentação de bovinos e que umamudança no processo industrial deprodução de farinha de carne eossos teria diminuído a probabili-dade de inativação do agente infec-cioso. Entretanto, foram surgindoevidências de que a BSE e a scrapiesão doenças diferentes, embora per-tencentes ao mesmo grupo. Umadas evidências foi obtida a partir dainoculação experimental de scrapieem bovinos, que resultou em umadoença diferente da BSE. Alémdisso, a BSE mantém as suas carac-terísticas durante toda a epidemia,mesmo quando é transmitida a ou-tra espécie animal, ao contrário dascrapie. Sem falar que essa doençanão pode contaminar seres huma-nos, como é o caso da BSE. Naverdade, o ponto em comum entreas TSE’s é a elevada resistência atratamentos físico-químicos de es-terilização.

BC&D – Mas há indícios deque a doença possa ter surgidoantes de 1986, não é verdade?

Bloch – Alguns relatórios téc-nicos mais recentes indicam que os


casos de BSE diagnosticados a par-tir de 1986 não teriam sido os pri-meiros casos da doença que, prova-velmente, já existia no Reino Unidoanteriormente. Alguns veterináriosbritânicos alegam ter visto casossemelhantes antes de 1986 que, naépoca, foram diagnosticados comodoenças metabólicas comuns emvacas de alta produção. Mas não hácomprovação científica sobre essasevidências.

BC&D – Então a causa maisprovável para a transmissão daBSE em bovinos está mesmo namudança no processo de fabrica-ção de farinha de carne e ossos,que tornou possível a reciclagemdo agente infeccioso?

Bloch – Essa, sem dúvida, é acausa mais provável para a transmis-são dessa doença, o que tem repre-sentado um prejuízo para os produ-tores em escala mundial, já que asrações à base de farinha de osso,sangue e carne vinham sendo larga-mente recomendadas e usadas naalimentação de animais, como umafonte de proteína, devido à presençade aminoácidos essenciais, mineraise vitamina B12. Além disso, essaforma de aproveitamento é uma ma-neira eficaz de reciclar os subprodutosproveniente do abate, evitando cus-tos econômicos e ambientais adicio-nais. No entanto, como os materiaisà base de osso e carnes de animaismamíferos presentes em dietas pararuminantes foram considerados a pro-vável causa da BSE em bovinos, o seuuso foi proibido na Comunidade Eu-ropéia, nos EUA e também no Brasil.Diante das vantagens desse tipo dealimentação para os bovinos, váriastêm sido as tentativas de cessar atransmissão das TSE’s, em particularda BSE. Alguns trabalhos têm sidodirecionados para a inativação daspartículas infecciosas, favorecendo,assim, o aproveitamento dos resídu-os do abate. Outros têm visado elimi-nar a possibilidade da transmissãopela detecção de proteínas animaisnas rações e a sua rejeição no caso de

teste positivo. Ambas as formas fa-zem uso de procedimentos analíticospara garantir a ausência de agentescausadores das TSE’s na alimentaçãoanimal. Dentre esses procedimentos,estão os que eu já descrevi na ques-tão anterior, ou seja, a microscopiaótica, o método ELISA e as análisesde DNA por PCR. A complexidade eespecificidade das biomoléculas têmdificultado em muito a aplicação dastécnicas freqüentemente utilizadaspara a identificação e caracterizaçãode compostos inorgânicos e orgâni-cos nas rações. Esse fato vem moti-vando o desenvolvimento de técni-cas analíticas cada vez mais sofistica-das e eficientes, com ênfase na pre-cisão requerida pela moderna biotec-nologia. Dessa forma, chegamos hojeaos espectrômetros de massa que,como eu também já mencionei antes,são o que há de mais moderno epreciso para a detecção de proteínasnas rações de ruminantes.

BC&D – E quais são os passosdaqui pra frente, já existe algumaparceria para repasse dessatecnologia à iniciativa privada?Existe alguma demanda do gover-no brasileiro para que essatecnologia se torne obrigatória,de modo a evitar a entrada do“mal da vaca louca” no Brasil?

Bloch – Creio firmemente queantes de nos preocuparmos comqualquer tipo de avanço tecnológi-co e sua comercialização, como é ocaso desse método, devemos vê-locomo uma ferramenta de trabalho.Ela só poderá servir ao seu propó-sito e alcançar sua plenitude de usose houver a visão clara do objetivofinal que queremos atingir. Ou seja,se o nosso objetivo final for o lucroimediato, puro e simples para satis-fazer acionistas, balanças de paga-mentos e manutenção dos mesmosparadigmas de produção vigenteshá décadas, essa tecnologia terá umimpacto modesto e servirá somentenos momentos de crise, como o queestamos vivendo hoje, caso contrá-rio cairá no esquecimento, como de

fato ela se encontrava, até osurgimento da BSE nos Estados Uni-dos. Contudo, se tomarmos a deci-são de priorizar a vida, a qualidadee a sanidade dos alimentos quechegam às mesas dessa geração edas próximas, essa tecnologia comcerteza será de grande utilidade,não somente no processo de iden-tificação de contaminantes intenci-onais ou acidentais, mas poderádidaticamente demonstrar interna-mente e para o exterior que essepaís possui tecnologia de alto nívelpara responder a problemas mun-diais imediatos, bem como paraoferecer alternativas mais inteligen-tes e com visão de perspectiva paraum setor tão importante como o doagronegócio. No que diz respeitoaos aspectos legais dessa tecnologia,ela já está patenteada e pronta paraser licenciada à iniciativa privada.Estamos aguardando propostas deempresas interessadas em utilizá-la. Quanto ao governo brasileiro, aEmbrapa e o Ministério da Agricul-tura, Pecuária e Abastecimento(MAPA) estão em entendimentopara discutir a melhor forma deimplementá-la e, assim, dar um gran-de passo para reduzir ainda mais apossibilidade da presença de prote-ínas animais nas rações. Provavel-mente, será por meio de uma porta-ria que obrigue as empresas a testa-rem seus produtos. A nossa equipeda Embrapa Recursos Genéticos eBiotecnologia tem plenas condiçõesde atender a essas demandas. Se-rão necessárias apenas algumasadaptações nos laboratórios de es-pectrometria de massa, de forma atorná-los mais aptos a prestar servi-ços – visto que hoje são laboratóri-os de pesquisa – além da contrataçãode pessoal especializado. Nós jáatendemos a uma demanda doMAPA para análise de 800 amostrase, dessas, grande parte continhaproteínas animais. No final do mêsde fevereiro, teremos uma novareunião com a equipe do Ministériopara fechar essa questão.___________________________________

O e-mail do Professor Carlos Bloch Júnior é:[email protected]

Carta ao Leitor

Prezados Leitores,

Já está bem divulgado o problema do “mal da vacalouca” no mundo todo, principalmente sobre os surtosque aconteceram na Europa e dizimaram milhares decabeças de gado, causando imenso prejuízo.Aqui no Brasil, felizmente até agora, fomos poupados,mas sabemos também que pode ser apenas umaquestão de tempo. Por isso mesmo o apoio à pesquisadessa importante doença é primordial para a pecuáriano país.Para falar sobre o assunto convidamos o Dr. CarlosBloch Jr., que desenvolve, na Embrapa-Cenargen, ummétodo de combate à doença. Confira a entrevista.

Dr. Henrique da Silva Castro

BIOTECNOLOGIA Ciência & DesenvolvimentoKL3 Publicações

FundadorDr. Henrique da Silva Castro

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Os artigos assinados são deinteira responsabilidade

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Nota: Todas as edições da Revista Biotecnologia Ciência &Desenvolvimento estão sendo indexadas para o AGRIS(International Information System for the Agricultural Sciencesand Technology) da FAO e para a AGROBASE (Base de Dadosda Agricultura Brasileira).

Conselho CientíficoDr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento VegetalDr. Henrique da Silva Castro - Saúde;Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia;Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal;Dr. Naftale Katz - Saúde;Dr. Pedro Jurberg - Ciências;Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos;Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.

Conselho Brasileiro de Fitossanidade - CobrafiDr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia

Fundação Dalmo Catauli GiacomettiDr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética;Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico;Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos

Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPENDr. José Roberto Rogero

Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotecDr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPADr. Diógenes Santiago Santos - UFRGSDr. José Luiz Lima Filho - UFPEDra. Elba P. S. Bon - UFRJ

Colaboraram nesta edição:

Adriano Luiz Tonetti, Alessandra Pereira Fávero, AlexandrePatto Kanegae, Ana Paula Pacheco Clemente, AndersonKurunczi Domingos, Antonio Costa de Oliveira, BrunoCoraucci Filho, Carla M. Y. Lemos, Celso Omoto, DavidJohn Bertioli, Eleni Gomes, Eliane Cristina GruszkaVendruscolo, Elza Fernandes de Araújo, Enio Luiz Pedrotti,Erica Fuchs, Everaldo Gonçalves de Barros, Fábio RuedaFaucz, Fernando Irajá Félix de Carvalho, Francismar CorrêaMarcelino, Gabrielle Mouco, Gaspar Malone, Gláucia MariaPastore, Helena Maria Wilhelm, Jorge Fernando Pereira,José Fernandes Barbosa Neto, Juliana Oliveira Lima, KarinaProite, Karla Thomas Kucek, Luiz Pereira Ramos, MairaJardim Bernardino, Marcio Antônio Silva Pimenta, Márciode Carvalho Moretzsohn, Márcio Nitschke, Marcos Barrosde Medeiros, Maria Fernanda Diniz, Maria José AraújoWanderley, Marisa Vieira de Queiroz, Marta FonsecaMartins, Maurílio Alves Moreira, Melânia Lopes Cornélio,Monita Fiori de Abreu, Patrícia Messenberg Guimarães,Paulo Alves Wanderley, Paulo Dejalma Zimmer, PauloHenrique Machniewicz, Pilar Ximena Lizarazo Medina,Ricardo Antonio Polanczyk, Roberto da Silva, RodrigoBarros Rocha, Ronaldo Stefanutti, Rubens Onofre Nodari,Samuel Martinelli, Sérgio Batista Alves, Soraya CristinaLeal-Bertioli, Valdir Marcos Stefenon.

EntrevistaEntrevistaEntrevistaEntrevistaEntrevistaNova tecnologia no combate ao “mal da vaca louca” 2

PPPPPesquisaesquisaesquisaesquisaesquisaSilenciamento Gênico e Transgênicos 8Detecção de resíduos de transgênicos em grãos e produtos derivados 14Bacillus thuringiensis no Manejo Integrado de Pragas 18Biodiesel 28Biofertilizantes Líquidos 38Iniciativas Genômicas 45Associação de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 53Biosurfatantes a partir de resíduos agroindustriais 63Controle de qualidade de ervas medicinais 68Nitrato Redutase em Fungos Filamentosos 74Glucoamilase:Estrutura e termoestabilização 86Marcadores Moleculares no Melhoramento Genético de Araucária 95Micropropagação de Macieira 100Método Alternativo de Tratamento de Esgotos 109Amendoim Selvagem 116Bioética 120


Pesquisa

Silenciamento Gênicoe Transgênicos

Eliane Cristina Gruszka VendruscoloMSc, Melhoramento Genético Vegetal.Professora de Genética/UFPR - Campus [email protected];[email protected]

Importância, mecanismos e modelos do silenciamento gênico

Introdução

A estrutura genômica de plan-tas pode ser alterada por transfor-mação genética durante o processode transferência gênica utilizando-se Agrobacterium tumefaciens, bio-balística e outras técnicas que inte-gram parte de um genoma (geneexógeno) em um outro genoma (nocaso, vegetal). A transgenia tem sidousada com o propósito de integrarseqüências gênicas de interesse comconseqüente alteração da expressãogênica. A expressão desse transgenenem sempre pode ser predita. Dessemodo, o estudo das conseqüênciasdessas transformações tem-se torna-do relevante nos últimos anos(VOINNET & BAULCOMBE, 1997;WATERHOUSE et al . , 1998;VAUCHERET et al., 2001).

Vários termos podem ser en-contrados na literatura para descre-ver o silenciamento gênico. Essesincluem cossupressão, RNAi (RNAde interferência) e quelling (inter-rupção da seqüência gênica) emleveduras. A cossupressão seria otermo aplicado ao silenciamentogênico do gene endógeno pela açãodo RNA do transgene. Aqui ambosos genes, exógeno e endógeno, sãocoordenadamente suprimidos.Quelling é um termo de cossupres-são usado em Neurospora crassa, eo RNAi é aplicado ao silenciamentogênico em animais, quando esseacontece pela ação de uma fita du-pla de RNA, causando a não transcri-ção nem a tradução de determinadogene(BAULCOMBE, 2002).

Em vários experimentos, fo-ram obtidas evidências do silencia-mento gênico em plantas, que leva-ram à conclusão que, ao aumentaro número de cópias de um gene deinteresse em particular, poderia re-duzir a sua expressão (MAZTKE &MAZTKE, 1995; DEPICKER & VANMONTAGU, 1997). WEI et al. (2001)comentam sobre uma correlaçãopositiva entre o número de insertoscom pobre expressão gênica. Vári-os transgenes inseridos podem sersilenciados após uma (relativamen-te) longa fase de expressão e po-dem, às vezes, silenciar a expres-são (parcialmente) de genes homó-logos localizados em posiçõesectópicas no genoma (FAGARD &VAUCHERET, 2000). Em alguns ca-sos, o silenciamento gênico detransgenes pode desencadear a re-sistência a vírus e, em outros casos,a infecção viral pode silenciar aexpressão de genes endógenos nasplantas (BAULCOMBE, 1996).

Mecanismos desilenciamento gênico

O silenciamento gênico, comoprocesso, corresponde a uma intera-ção entre seqüências homólogas deDNA ou RNA. Até hoje, sabe-se queo RNA está envolvido em 2 tipos desilenciamento gênico dependente dehomologia (SGDH): 1) SGPTS (si-lenciamento gênico pós-transcricio-nal), onde a degradação de RNAshomólogos no citoplasma levaria anão tradução e 2) SGT (silenciamen-to gênico transcricional), que está


relacionado com o bloqueio na trans-crição induzido por um RNA anti-senso derivado do próprio DNA,que promoveria uma metilação naregião promotora, a nível nuclear, ea homologia para a metilação dirigidaocorreria nas regiões transcritas(WASSENEGGER, 2000; FAGARD &VAUCHERET, 2000; VAUCHERET etal., 2001).

Embora os genes que interagempodem estar muito próximos nomesmo cromossomo e iniciar ainativação em cis, muitos sistemasestudados envolvem a interação deseqüências localizadas em diferen-tes cromossomos ou a trans-inativação. Ambos os tipos de SGDHestão freqüentemente associadoscom metilações de novo em se-qüências-específicas do DNA nu-clear (KOOTER et al . , 1999;WASSENEGGER, 2000).

O mecanismo de silenciamentogênico transcricional (SGT) estaria as-sociado a metilações de novo na regiãodo promotor do transgene, que pode-riam ser meioticamente herdáveis(KOOTER et al., 1999). Essa metilaçãoseria induzida por pareamento de regi-ões homólogas de DNA ou ainda DNA-RNA. Esse pareamento constitui o pas-so inicial para a iniciação do SGPT(WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998).O pareamento induziria a umametilação dentro da região codificantedo transgene, que levaria a uma pre-matura interrupção de sua transcrição.Como resultado dessa síntese irregularde mRNA, um RNA aberrante (abRNA)seria formado (WASSENEGGER &PÉLISSIER, 1998; HAMILTON &BAULCOMBE, 1999; MATZKE et al.,2001).

Estudos recentes têm encontra-do presença de um RNA de, aproxi-madamente, 25 nt em sense eantisense, com homologia ao RNAalvo, em plantas que apresentamcossupressão e resistência a vírus,mas que não são encontradas emplantas usadas como controle. Talfato contribui para evidenciar queexistem diferentes formas de silenci-amento, porém todas agindo nummesmo mecanismo (HAMILTON &BAULCOMBE, 1999).

A resistência a vírus seriaexplicada pelo fato de estes abRNAserem o molde para que as RNApolimerases dependentes de RNA(RPdR) do hospedeiro (vegetal) pos-sam sintetizar pequenas moléculasde RNA anti-sense (METTE et al.,1999; MATZKE et al . , 2001;MLOTSHWA et al., 2002). Esses pe-quenos RNA antisense agiriam emtrans, em seqüências de RNA com-plementares (RNA viral), levando àformação de RNA fita dupla (dfRNA).Um complexo de RNAses específi-cas para esses dfRNAs (conhecidascomo Complexo DICER ou RNAsestipo III, específicas para as dfRNAs),levariam a degradação dessas molé-culas híbridas e, em conseqüência,tornariam a planta resistente ao ví-rus (METZLAFF et al . , 1997;CERUTTI, 2003).

No caso das integrações múlti-plas, como as cópias do transgene, osilenciamento se iniciaria por umpareamento não recíproco entre otransgene e o gene endógeno, ouentre os transgenes e, como conse-qüência desse pareamento, o locusreceptor seria metilado, levando auma terminação prematura da trans-crição (ENGLISH & BAULCOMBE,1996; WASSENEGGER, 2000).

A posição de integração dotransgene também parece ser impor-tante para o silenciamento pelo fatode o loci silenciador usualmente con-sistir de múltiplas cópias do transgeneligadas. Outro modelo que explica osilenciamento de transgenes em có-pias múltiplas e invertidas é a forma-ção de um RNA em alça (alRNA),que, posteriormente, se transforma-ria em dfRNA pela ação de RNAnucleases causando o efeito do silen-ciamento conforme foi descrito aci-ma (WATERHOUSE et al., 2001). Demodo similar, o dfRNA poderia tam-bém ser usado como molde paraalgumas RNA polimerases que trans-creveriam moléculas de RNA anti-senso, homólogos aos mRNAs, for-mando os dfRNAs e continuando ociclo de silenciamento por induçãodo SGT e SGPT (KOOTER et al.,1999; FAGARD & VAUCHERET,2000).

Modelos para explicar osilenciamento gênico

Vários autores têm sugeridomodelos para os mecanismos mole-culares envolvidos no silenciamen-to gênico, que não são eventos mu-tuamente exclusivos, mas que po-dem ser usados individualmente ouem conjunto para explicar o silenci-amento gênico.

1. Silenciamento mediadopelo pareamento DNA-DNA

Esse modelo tem sido propostopara explicar certos tipos de cossu-presssão (JORGENSEN, 1990; MEYER& SAEDLER, 1996); a trans-inativação(MATZKE & MATZKE; 1990;CHANDLER & VAUCHERET, 2001) ea paramutação (MEYER et al., 1993;CHANDLER & VAUCHERET, 2001).

O pareamento de regiões homó-logas do DNA, devido à interaçãoentre duas seqüências homólogasnuma interfase da meiose, levaria àformação de estruturas em alças, queseria o precursor da difusão demetilações no DNA, induzindo o SGT(ENGLISH & BAULCOMBE, 1996).

Os transgenes diferem muito emsua capacidade de trans-inativar cópi-as homólogas, o que parece estar asso-ciado à capacidade de procurar outrasposições cromossomais com homolo-gia. A presença de genes silenciadoresmuito próximos ao telômero sugereque regiões teloméricas são sítios favo-ráveis para a interação com seqüênciashomólogas (MEYER & SAEDLER, 2001).

2. Degradação de RNA emexcesso

Em transgênicos, é comum ouso de promotores fortes para seconseguir a alta expressão dotransgene. Como conseqüência, paraa detecção de planta com o inserto,são esperados níveis altos do mRNAdo transgene. Nesse modelo, osabRNA seriam produzidos devido auma alta taxa de transcrição do DNA,com isso, os altos níveis de mRNA. Seessa taxa de mRNA exceder a taxa detradução, pode ocorrer, além da de-


gradação parcial desses mRNA, aterminação abrupta da transcrição, oprocessamento irregular, originandoabRNAs e induzindo ao SGPT(WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998).

Outrossim, o excesso de produ-ção de uma determinada proteína podetransmitir um sinal para a maquinariade tradução a fim de induzir a termi-nação de sua própria transcrição. Asproteínas em excesso seriam marcadaspor ubiquitinas, por fosforilação oupor outras modificações pós-transcri-cionais (HOCHSTRASSER, 1996;WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998).

3. Híbridos DNA-RNA

A observação de que o parea-mento DNA-RNA pode induzir pa-drões de metilação sugere mudançasno estado epigenético caracterizadopor um estado específico de metilaçãodo DNA ou da estrutura da cromatina,durante o período pré-meiótico oude hibridização somática (MEYER &SAEDLER, 2001). Estudos indicaramque fragmentos de RNA poderiaminduzir uma hipermetilação em se-qüências homólogas (pareamentoDNA -RNA), causando as mudançasepigenéticas. Tal fenômeno foi com-provado em estudos com plantastransgênicas que continham o cDNAdos virióides do PSTV da batata. Ametilação no genoma do viróide foiobservada mesmo sem que areplicação do seu RNA tivesse ocor-rido (WASSENEGGER et al., 1994;WASSENEGGER, 2000).

Os transcritos poderiam induzira metilação em regiões homólogasde DNA, que seria comum em trans-formantes, os quais acumulariamgrandes concentrações dos transcri-tos no núcleo, devido às altas taxasde tradução e do processamento irre-gular desses RNAs. Como conseqü-ência dessa marcação, a proteína eseus produtos, após degradação, po-deriam reconhecer seqüências ho-mólogas surgindo nos ribossomos, elevando ao término prematuro datranscrição, além de uma deadenila-ção na posição 3’ e, com isso, aosurgimento dos abRNAs e a induçãodo SGPT (JONES et al., 1999).

4. Modelo mediado porRNA antisenso

O RNA antisenso parece serfundamental nos mecanismos decossupressão. As fitas duplas de RNAseriam alvos gerados pelos promo-tores presentes no DNA do transgenee pela ação de RNA polimerasesdependente de RNA ( RPdR)(LINDBO et al., 1993).

WASSENEGGER & PÉLISSIER(1998) ainda propõem que esse RNApoderia surgir devido à posição daseqüência de DNA produtora doRNA antisenso, próximo a um pro-motor localizado adjacente a umacópia de T-DNA integrado e emanti-senso .

A produção de RNA antisensopelas RPdR dependeria de níveisespecíficos do RNA senso e doacúmulo de intermediários de RNA(durante o processamento ou trans-porte). Essa hipótese se baseia nofato de que as RPdR reconheceriamos transcritos aberrantes, que seri-am derivados de transcrição, trans-porte ou tradução incorreta dotransgene. A produção de abRNApoderia induzir as mudançasepigenéticas do gene que influenci-aria o seu processamento (MEYER &SAEDLER, 1996; WASSENEGGER,2000).

Certos transgenes somente po-dem silenciar ou cossuprimir seqüên-cias caso contenham um final 3’homólogo, enquanto certos transgenescom regiões 5’ homólogas não sãoafetadas (ENGLISH et al., 1996). Essasobservações sugerem que os transcri-tos antisenso são feitos preferencial-mente nas regiões 3’ do transgene(WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998).

O papel da metilação e daestrutura da cromatina no

silenciamento gênico

Em recentes estudos sobre si-lenciamento em plantas, a ocorrên-cia de pareamento entre seqüênciashomólogas parece ser condição im-portante para o silenciamento(BAULCOMBE & ENGLISH, 1996;VOINNET et al., 1998). O silencia-

mento em trans seria quando umaregião metilada teria homologia coma região promotora de um determi-nado gene, dirigindo uma metilaçãode novo nessa região, para induzir oSGT. Tal fenômeno é conhecidocomo metilação do DNA dirigidapor DNA (MDdD)(JONES et al., 1999;METTE et al., 1999; WASSENEGGER,2000).

Muitos genes eucarióticos e ele-mentos transponíveis exibem umaforte correlação inversa entre den-sidade de metilação do DNA e ati-vidade transcricional ou transposi-cional. Ao certo, não se sabe se aação da metilação da citosina alte-raria a estrutura da cromatina, masestudos em plantas demonstramuma correlação positiva entre onúmero de cópias do transgene, oaumento da metilação e a diminui-ção da atividade transcricional(KUMPATLA et al.,1997).

Em eucariontes, os resíduos decitosina do DNA genômico podemser metilados na posição 5’da citidina.As enzimas das DNA metiltransferasesque realizam essa reação têm prefe-rências por grupos CpG ou CpNpG.Em ambos os casos, o DNA recente-mente replicado, que contém gruposCpG ou CpNpG hemimetilados, sãofortes substratos para a ação dasDNA metiltransferases. Tal padrãoasseguraria as metilações de manu-tenção e de padrões de metilaçãopré-existentes nos cromossomos fi-lhos (ATHERLY et al.,1999).

Em transgenes, esse padrão demetilação não é igual. As metilaçõeslocalizadas em resíduos de citosinanão estão localizadas em seqüênci-as CpG ou CpNpGp. Os fatores queespecificam esse padrão de metilaçãonão simétrico são ainda uma incóg-nita, mas parece que a metilação doDNA é dirigida por um RNA. Não sesabe se esse RNA seria o sinal emtodos os casos da metilação nãosimétrica das citosinas em plantas(FINNEGAN et al., 1998). Algunsautores denominam esse fenômenode metilação do DNA dirigida porRNA (MDdR)(WASSENEGGER, 2000;BAULCOMBE, 2002). Esse padrãotambém não parece ser conservado


durante a meiose, em contraste como padrão de metilação simétrica(PARK et al., 1996; LUFF et al.,1999).

Estudos têm demonstrado quea metilação do DNA e a estrutura dacromatina têm um importante papelno SGT e SGPT. Nessa forma desilenciamento, a região promotorae, às vezes, a região codificante dostransgenes silenciados apresentam-se densamente metilados (KOOTERet al., 1999). Plantas mutantes parao gene da proteína DDM1, que re-modela a cromatina, não apresenta-ram o silenciamento gênico. Issoindica um possível papel dametilação do DNA e da estrutura dacromatina no estabelecimento e namanutenção de SGPT. Supõe-se queo aumento da metilação leve àheterocromatização do DNA e, comisso, ao difícil acesso às RNApolimerases, diminuindo a açãotranscricional (YE et al., 1996;WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998;WASSENEGGER et al., 2000).

Embora os modelos atuais pro-ponham que a produção de umRNA aberrante, fruto de umametilação, seja o causador de umafinalização prematura da transcri-ção do mRNA, existem estudos comlinhagens defeituosas de N. crassapara o gene da metilase da citosina(dim2) que exibiram a mesma capa-cidade de silenciamento que a li-nhagem controle (dim +) (COGONI& MACINO, 1999). Fato semelhantefoi observado em estudos realiza-dos com plantas transgênicas defumo, onde o gene nptII (neomicinafosfotransferase) metilado teve atranscrição e o SGPT normais quan-do comparado com uma cópia dogene nptII não metilado e não si-lenciado (VAN HOUDT et al., 1997).Tais fatos indicam que a metilaçãonão parece ser condição sine quanon para a indução e a manutençãodo SGPT (PARK et al., 1996).

Razões para a ocorrência dosilenciamento gênico

Diversos autores têm levantadoo papel do silenciamento gênico . O

silenciamento gênico parece estarenvolvido com a defesa a ácidosnucléicos estranhos (COVEY, 2000;JORGENSEN, 1995; MOURAIN et al.,2000), com a proteção do genomacontra a inserção de elementostransponíveis (KETTING et al., 1999;BAULCOMBE, 2002) e com aregulação da expressão gênica defamílias de multigenes ou aindagenes duplicados em plantas(TANZER et al., 1997; CHANDLER &VAUCHERET, 2001).

Uma outra questão poderia serlevantada, se seqüências homólogasde DNA podem parear e se tornarsilenciadas, como então explicar quemembros de famílias de genes pode-riam escapar da inativação? MATZKE& MATZKE (1995) propõem a exis-tência de duas maneiras de preveniresse pareamento: ou pela divergên-cia de seqüências encontradas emalelos (heterozigosidade) ou devidoà redução do comprimento de se-qüências homólogas, o que sugereum papel muito importante para osíntrons, que dividiriam a regiãocodificante da proteína em segmen-tos pequenos demais para realizarum pareamento efetivo.

Parece bastante unânime en-tre vários autores que o silencia-mento gênico tem como funçãoprincipal prevenir a superexpres-são gênica, controlando o númerode cópias de determinado gene ouainda ser um mecanismo de defesacontra a superexpressão detransgenes (WASSENEGGER &PÉLISSIER, 1998; KOOTER et al.,1999; WASSENEGGER, 2000).

Difusão e amplificação dosilenciamento gênico

Um dos mais importantes aspec-tos do silenciamento gênico é queeste é um mecanismo autômato, istoé, pode ser induzido localmente epode se espalhar para distantes locaisno organismo (VOINNET et al., 1998;COVEY, 2000). Esse transportesistêmico do sinal de silenciamentoparece relacionar-se com um sinalmóvel, não metabólico, ainda nãocompletamente identificado. Esse si-

nal, sendo parte integral do processode silenciamento, parece interagir comproteínas de membranas, movendo-se de célula em célula através dofloema (plasmodesmata), assemelhan-do-se com o padrão de infecção devírus nas plantas (PALAUQUI et al.,1997; VOINNET & BAULCOMBE, 1997;VOINNET et al., 1998; MLOTSHWAet al., 2002).

O SGPT teria três fases: início,manutenção e difusão propriamen-te dita. Os transgenes, os vírus e atémesmo o DNA exógeno (proveni-ente da transformação) poderiaminiciar o SGPT. Alguns autores su-gerem que esse sinal seja na formade RNA, mas não é conhecido aindaqual o tipo de RNA que estariaenvolvido: se abRNA, dfRNA ouainda o asRNA (METTE et al., 1999;KOOTER et al., 1999; MATZKE etal., 2001; MLOSTHWA et al., 2001).

Esse conceito de difusão célula-célula e de transporte a longas dis-tâncias não pode ser descartado,visto que o vírus tem seu genomacomposto por RNA e esse RNA di-funde-se para dentro da planta, po-dendo se mover de célula-célulaatravés de proteínas codificadas peloseu próprio genoma (WATERHOUSEet al., 2001).

Ainda não está completamenteelucidado como o sinal para o silen-ciamento pode se espalhar sistemi-camente pela planta e ainda ter seusefeitos amplificados. O silenciamen-to parece ser um mecanismo de pre-venção, como a vacina é para oshumanos. Parece sensato estabele-cer que o silenciamento nada mais éque uma mensagem enviada pelascélulas já infectadas pelo vírus paraaquelas que ainda não o foram, masque estejam na iminência de o ser,para que essas preparem suas defe-sas contra o agente invasor. Se essesinal contiver fragmentos da seqüên-cia viral, as células receptoras pode-riam estar preparadas para degradarqualquer RNA que contivesse essasseqüências, mesmo antes de o víruschegar (RATCLIFF et al., 1997;WATERHOUSE et al., 2001).

Esse modelo poderia explicar al-gumas observações:1) de que plantas


transgênicas com transgenes deriva-dos de vírus podem apresentar umarecuperação, isto é, apresentar os sin-tomas da infecção inicial do vírus,seguida de crescimento sem os sinto-mas e de resistência ao vírus. 2) plan-tas transgênicas apresentando cossu-pressão tendem, inicialmente, a apre-sentar atividade do transgene, masum silenciamento progressivo em te-cidos em crescimento (WATERHOUSEet al., 2001).

Considerações finais

Na última década, o estudo dosilenciamento gênico cresceu consi-deravelmente. Já existem evidênci-as de que características específicasdo DNA, como a metilação e a estru-tura da cromatina, são importantespara o fenômeno do silenciamento.Todavia, o seu mecanismo molecu-lar ainda não foi totalmenteelucidado, mas, em razão de obser-vações funcionais dos RNA anti-sen-so, abRNA, dfRNA, RNA polimerasese RNA nucleases, os estudiosos des-se assunto puderam elaborar mode-los para os mecanismos de SGDH ,o SGT e SGPT.

É notória a existência de algu-mas dificuldades para o estudo dosilenciamento gênico em plantastransgênicas. Variações entre as li-nhas de plantas transgênicas consti-tuem uma grande barreira para ocompleto estudo desses mecanismos.Duas linhas transgênicas não sãosimilares pelo fato de o transgene emcada planta se situar em diferentedomínio no cromossomo, em dife-rente arranjo e também devido àassociação com diferentes quantida-des de DNA do vetor de transforma-ção (IGLESIAS et al., 1997; STAM etal., 1997).

Apesar das dificuldades, vislum-bram-se para essa área da ciênciagrandes e importantes descobertas: ocompleto entendimento da regulaçãogênica, a identificação dos fatoresque podem afetar a expressão gênicae dos transgenes (talvez se discuta nofuturo algumas propriedades dessatecnologia) e, ainda mais, a compre-ensão dos mecanismos evolutivos.

Agradecimentos

Aos pesquisadores IvanSchuster (Coodetec) e Maria JúliaCorazza Nunes (UEM/PR) pelas

correções e sugestões dadas. Agra-deço a Deus por tudo.

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Detecção de resíduos detransgênicos em grãos e

produtos derivados

Francismar Corrêa MarcelinoMestre em Genética Molecular, Laboratóriode Análises Genéticas - AgroGené[email protected]

Marta Fonseca MartinsDoutora em Genética Molecular, Laboratóriode Análises Genéticas - AgroGené[email protected]

Marcio Antonio Silva PimentaDoutor em Genética Molecular,Universidade Federal de Viç[email protected]

Maurilio Alves MoreiraPhD, Bioquímica & Genética de Plantas,Universidade Federal de Viç[email protected]

Everaldo Gonçalves de BarrosPhD, Biologia Molecular de Plantas,Universidade Federal de Viç[email protected]

Ilustrações cedidas pelos autores

A experiência da Universidade Federal de Viçosa

Pesquisa

Mais de 58 milhões de hectares sãocultivados atualmente no mundo comespécies transgênicas, sendo a soja, omilho, o algodão e a canola, as principaisdelas. Os países com as maiores áreascultivadas com transgênicos são, nestaordem, os Estados Unidos, a Argentina, oCanadá e a China. Estes países respondempor cerca de 99% da área total plantadacom cultivos transgênicos. O cultivo deplantas geneticamente modificadas vemcrescendo rapidamente em vários países,inclusive no Brasil, onde no mês desetembro foi aprovado, embora com res-trições, o plantio de soja transgênica parao ano agrícola 2003/2004 (Medida Provi-sória 131, de 25 de setembro de 2003).

A demanda por análises da presen-ça de resíduos de transgênicos em maté-rias-primas e em alimentos tem aumenta-do significativamente no Brasil, nos últi-mos dois anos, principalmente após acomprovação do cultivo ilegal da sojatransgênica, resistente ao herbicidaglifosato, destacadamente no estado doRio Grande do Sul, com sementes prove-nientes da Argentina. A maior parte das

análises tem sido demandada por em-presas exportadoras de grãos de soja e deprodutos derivados. Esses produtos sãoexportados, na maioria, para a Europa,Japão e Coréia. Já antevendo esse cená-rio, a Universidade Federal de Viçosa(UFV), por intermédio do Instituto deBiotecnologia (BIOAGRO), desenvolveue otimizou metodologias baseadas natécnica de PCR (Polymerase ChainReaction) para determinar a presença equantificar resíduos de transgênicos emamostras de DNA extraídas de grãos,bem como de seus produtos derivados.Recentemente, a AgroGenética, labora-tório incubado na Incubadora de Empre-sas de Base Tecnológica da UFV, foicredenciado junto ao Ministério da Agri-cultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA)- Portaria Nº 27, de 15 de maio de 2003,para a “detecção de modificação genéti-ca em produtos de origem vegetal”.

As modificações genéticas intro-duzidas que derivam os organismosgeneticamente modificados (OGMs)podem ser produzidas por pelo me-nos três metodologias:

Figura 1 - Representação da construção presente na soja RR® (Roundup Ready).Região promotora 35S do vírus do mosaico da couve flor, peptídeo de trânsito dePetúnia, gene que codifica a proteína EPSPS, que confere a resistência ao herbicida,e o terminador do gene da nopalina sintase (NOS).


- técnicas do DNA recombinante,utilizando vetores para transforma-ção de plantas;- técnicas envolvendo a introduçãodireta do material genético noorganismo;- fusão celular por métodos nãonaturais.

A construção genética utilizada paraproduzir OGMs consiste de três elemen-tos básicos: o promotor, que controla aexpressão do transgene no organismo;a região codificadora, que codifica aproteína de interesse; e a regiãoterminadora, que determina o final doprocesso de transcrição do gene. Alémdisso, pode ser usado um gene marcadorque serve para selecionar as células que,de fato, foram transformadas. A sojaresistente ao herbicida glifosato, porexemplo, tem como região reguladora opromotor 35S do vírus do mosaico dacouve flor (CaMV); como regiãocodificadora, o gene para a proteínaEPSPS de Agrobacterium tumefasciens,que confere a resistência ao herbicida, ecomo região terminadora, o terminadordo gene da nopalina sintase (NOS),também de Agrobacterium (Figura 1).

A identificação de alimentos geneti-camente modificados pode ser feita facil-mente com o auxílio de técnicas debiologia molecular. OGMs podem seridentificados pela detecção direta do DNAexógeno nele contido, do mRNA corres-pondente produzido, da proteína resul-tante ou, ainda, pela característica intro-duzida. Os principais métodos analíticosde detecção utilizam a técnica da reaçãoem Cadeia da DNA Polimerase (PCR) paradetectar o DNA exógeno, ou métodosimunológicos, como o ELISA, para detec-tar a proteína. O método analítico escolhi-do deve ser sensível, confiável,reprodutível, minimizando, assim, falsospositivos e falsos negativos.

Em nosso laboratório a detecção equantificação de resíduos de OGMs emgrãos, ingredientes e produtos derivadosé feita pela técnica de PCR. Para tal, énecessária a extração de DNA das amos-tras e amplificação do fragmento de inte-resse. Para ser amplificado, o DNA purifi-cado deve apresentar boa qualidade. Alémdisso, como controle, um gene normal-mente presente no organismo, é amplifi-cado em uma reação paralela. Para pro-dutos que contenham soja na sua compo-sição é utilizado o gene da lectina. Paraprodutos à base de milho, é utilizado o

Figura 3 - Curva de amplificação de uma análise quantitativa em PCR de tempo real. Adeterminação da porcentagem de resíduos de OGM é baseada na comparação da curva deamplificação da amostra analisada com as curvas de amplificação de padrões certificadoscontendo quantidades conhecidas de OGMs.

Figura 2 - Análise qualitativa de OGM em amostras de grãos de soja. O DNA das amostras foiextraído pelo método Wizard e amplificado com primers específicos que anelam ou no geneda lectina (controle A e B), ou na região do promotor 35S do CaMV (C e D), ou na regiãoterminadora NOS (E e F), ou na região codificadora do gene EPSPS (G e H). Após a reação dePCR, os produtos amplificados foram separados em géis de agarose. À esquerda (A, C, E e G)está exemplificado um resultado negativo e à direita (B, D, F e H), um resultado positivo. Ossímbolos nas canaletas representam: (–), reação de PCR sem DNA (controle); N, soja normal(controle); T, soja transgênica (controle); 1, 2 e 3, referem-se a amostras de grãos de soja. Assetas indicam as bandas de DNA de interesse.


gene da delta zeína. Quando se querdetectar a presença de OGM em umaamostra de salsicha, por exemplo, ampli-fica-se como controle o gene da lectina,uma vez que a salsicha geralmente con-tém pelo menos 2% de proteína de soja nasua composição.

O nosso laboratório procura utili-zar métodos validados internacional-mente nas suas análises. Para a extraçãode DNA das amostras é utilizada ametodologia Wizard, método já valida-do pela Comunidade Econômica Euro-péia. O transgene, ou seja, o segmentode DNA que foi introduzido na planta,é amplificado com primers específicos.Para a detecção do gene RR (RoundupReady) são utilizados primers que seligam ou à região do promotor 35S doCaMV, ou à região codificadora, ou aoterminador NOS. Após a reação de PCRos produtos amplificados são separadosem géis de agarose. Para as análisesquantitativas, o DNA das amostras éextraído pela metodologia PrepMan-Ultra e a análise é baseada no métodoTaqMan®, que utiliza a técnica de PCRem Tempo Real, para amplificar a se-qüência de DNA do promotor 35S, oqual está presente na maioria dos OGMscomercializados até o momento. O pro-cedimento é extremamente preciso de-vido à perfeita complementaridade en-tre os primers usados na reação de PCR,a sonda TaqMan® e as seqüências alvode DNA que estão sendo amplificadas.A fluorescência liberada durante a rea-ção é lida pelo sistema de detecção ABIPRISM® 7000 e os dados gerados sãoanalisados eletronicamente. Como ametodologia é bastante sensível, pode-se detectar, numa dada amostra, umacontaminação da ordem de 0,01%. Noentanto, devido ao limite de recupera-ção do DNA durante o processo deextração e também aos erros inerentesao processo de amostragem, temos tra-balhado com um nível de detecção equantificação da ordem de 0,1%. Isto é,uma amostra contendo 0,1% de transgê-nicos é classificada como positiva nanossa análise, tendo como referênciaum padrão certificado. Amostras comuma contaminação menor que 0,1% sãoclassificadas como negativas. A Figura 2mostra os possíveis resultados obtidosem uma análise qualitativa, enquantoque na Figura 3 pode ser visualizadauma curva de amplificação numa análi-se quantitativa em tempo real. Aquantificação de uma determinada amos-Figura 7 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2003.

Figura 6 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2002

Figura 5 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2001.

Figura 4 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2000.


tra é feita com base na comparação dasua curva de amplificação com as depadrões certificados contendo quanti-dades conhecidas de OGMs.

Desde o ano de 2000, o laboratóriovem realizando a detecção de OGMs emgrãos e em produtos derivados. Inicial-mente a demanda era concentrada emamostras de grãos de soja e milho e emdiferentes tipos de preparações de pro-teínas de soja. Com o passar dos anos,observamos um aumento na demandapelas análises bem como uma diversifi-cação das amostras enviadas. Atual-

mente, temos recebido amostras de con-dimentos e temperos, óleos, amido demilho, sopas, fubá, entre outras. A partirde 2001 foram feitas as primeiras análi-ses de produtos cárneos. A partir de2002 houve um aumento expressivo nonúmero de análises para esse tipo deproduto. Naquele ano, 12,3% do total deamostras analisadas foram de produtoscárneos. Até setembro de 2003 a porcen-tagem foi de 7,3%.

As Figuras 4, 5, 6 e 7 mostram aporcentagem de cada classe de produtoanalisado em relação ao total de amos-

latotoaoãçalermocesartsomaedessalcadacedortnedsavitisopsartsomaedmegatnecroP-1ordauQsadasilanasartsomaed

edopiTartsomA

ed%sartsomasavitisoplatotolep

edsartsoma0002me

ed%sartsomasavitisop

ortnedessalcadadasilana0002me


edsartsoma1002me




edsartsoma2002me




edsartsoma3002me



oãrgajoS 98,3 69,21 47,7 24,53 61,6 96,13 22,9 02,46

setnerefiDedsopitsaníetorp

ajosed

00,0 0200,0 00,0 00,0 69,0 19,3 31,2 14,7

edoleraFajos

11,1 67,11 73,1 46,41 39,7 27,45 33,8 94,45

sotudorPsoenrác

00,0 00,0 00,0 00,0 39,7 40,36 23,5 71,37

oãrgohliM 00,0 00,0 00,0 00,0 00,0 00,0 60,1 40,31

oãçaR 00,0 00,0 28,1 26,12 65,3 60,94 03,2 41,53

odasilordiHajosed

00,0 00,0 32,0 67,4 00,0 00,0 81,0 00,52

sapoS 00,0 00,0 00,0 00,0 00,0 00,0 00,0 00,0

edábuFohlim

00,0 00,0 00,0 00,0 00,0 00,0 81,0 92,41

-nemidnoCesot

sorepmet00,0 00,0 00,0 00,0 55,0 63,63 24,1 45,16

edaniticeLajos

00,0 00,0 00,0 00,0 28,0 00,57 00,0 00,0

esoelÓsarudrog

00,0 00,0 00,0 00,0 72,0 00,04 00,0 00,0

sortuO 00,0 00,0 32,0 22,2 72,0 88,5 03,2 41,73

tras desde o ano de 2000. Ao longo dosanos que temos realizado análises deOGM em grãos e diferentes tipos dealimentos, pudemos observar um au-mento gradual no número de amostraspositivas, demonstrando que emboraseja proibido o plantio e a comercializa-ção de OGM no país, estes de algumaforma estão presentes no mercado, pelomenos, desde o ano de 2000. Naqueleano apenas 5% das amostras analisadasforam positivas para a presença deresíduos de OGM. Em 2001, essepercentual subiu para 11,5%. Em 2002,para 28,5%, e até setembro de 2003,32,3% das amostras apresentaram resul-tado positivo. A Figura 8 representa deforma gráfica estes resultados.

A porcentagem de amostras positi-vas dentro de cada classe de produtostambém sofreu elevação, principalmenteno caso de grãos de soja, farelo de soja eração. A porcentagem de amostras degrãos de soja positivas para a presença deOGM em 2000 foi de 3,89 % com relaçãoao total de amostras analisadas. Comrelação apenas às amostras de grãosanalisadas, esse percentual foi de 12,96%,atingindo 35,42%, 31,69% e 64,20%, res-pectivamente, em 2001, 2002 e 2003. Asamostras de farelo OGM subiram de1,11% do total de amostras analisadas,em 2000, para 8,33% em 2003, enquantoas de ração eram 1,82% em 2001 e 2,3%em 2003. A porcentagem de amostras deprodutos cárneos contendo resíduos deOGM foi de 7,93% do total de amostrasanalisadas e 63,04% com relação ao totalde amostras dessa classe de produtos em2002. Em 2003, esses valores foram de5,32% e 73,17%, respectivamente. Comrelação às amostras de milho e derivadosapenas em 2003 começamos a detectaralgumas amostras positivas, o que refletea presença de outros cultivos transgêni-cos, que não a soja RR®, no mercadomundial. O Quadro 1 mostra a porcenta-gem de amostras positivas em relação aonúmero total de amostras analisadas edentro de cada classe de amostras.

Os nossos dados permitem concluirque no período de 2000 a 2003 houve umaumento gradual da presença de resíduosde transgênicos em grãos, ingredientes ealimentos derivados no país, especialmen-te com relação à soja. Os dados apontamtambém para a necessidade de definiçãode normas claras de rotulagem de alimen-tos. Para esse fim, é importante que sedisponham de laboratórios qualificadospara realizar esse tipo de análise.

Figura 8 - Percentual de amostras positivas para a presença de resíduos de OGMs comrelação ao número total de amostras analisadas, entre os anos de 2000 e 2003.


Bacillus thuringiensisno Manejo Integrado de Pragas

Ricardo Antonio. PolanczykEngenheiro Agrônomo, Doutorando – Programa dePós Graduação em Entomologia (Escola Superior deAgricultura Luiz de Queiroz, ESALQ -USP)[email protected]

Samuel MartinelliEngenheiro Agrônomo, Doutorando – Programa dePós Graduação em Entomologia (Escola Superior deAgricultura Luiz de Queiroz, ESALQ -USP)[email protected]

Celso OmotoEngenheiro Agrônomo, Prof. Dr. DeptoEntomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola(ESALQ-USP)[email protected]

Sérgio Batista AlvesEngenheiro Agrônomo, Prof. Dr. DeptoEntomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola(ESALQ-USP)[email protected]


Do uso convencional em Pulverização à Biotecnologia

1. Introdução

A exploração agrícola intensi-va, necessária para atender à cres-cente demanda interna por alimen-tos, aumento do volume de expor-tações agrícolas e necessidade porprodutos como fibras, tem comofator limitante o impacto negativonos ecossistemas. De acordo comTilman et al. (2001), diante da con-tinuidade dos impactos ambientaisglobais provocados pela agricultu-ra, 109 hectares de ecossistemas na-turais serão convertidos em siste-mas agrícolas até o ano de 2050. Domesmo modo, os agroquímicos, uti-lizados para o controle de pragasagrícolas são muitas vezes respon-sáveis por contaminações do meioambiente e intoxicações de produ-tores rurais. Portanto, é importanteo desenvolvimento e implementa-ção de táticas de controle de pragasmenos agressivas, que estejam deacordo com as premissas do Mane-jo Integrado de Pragas, e que, aomesmo tempo, proporcionem o re-torno econômico ao agricultor.

Neste sentido, o controle bioló-gico é uma importante estratégiaque, através da liberação, incremen-to e conservação de insetos parasi-tóides, predadores e microrganis-mos, impede que os insetos-pragaatinjam níveis populacionais capa-zes de causar dano econômico. Indi-retamente, diminui o impacto dosagroquímicos sobre o meio ambien-te, pois minimiza ou torna desneces-sário o seu uso. Entre os microrga-nismos com potencial para seremempregados no controle biológico

destaca-se o entomopatógenoBacillus thuringiensis (Bt). Esta bac-téria é capaz de produzir inclusõescristalinas durante a esporulação,que são responsáveis pela sua ativi-dade tóxica. As suas toxinas, após aingestão, solubilização e ativaçãono intestino do inseto, unem-se àscélulas do epitélio, formando porose desestabilizando os gradientesosmótico e iônico, fazendo com queeste cesse a alimentação, morrendopor inanição ou septicemia (Priest,2000; Glare & OĆallagham, 2000).Para que a patologia de Bt ocorra énecessário que o intestino do insetopermita a eficiente solubilização docristal e que proteases ativem asprotoxinas resultantes desta solubi-lização. Estas etapas são essenciaispara que a toxina passe pela mem-brana peritrófica e se ligue aos re-ceptores presentes na parede dointestino médio do inseto. Em fun-ção da variabilidade genética, entreos insetos há diferenças específicase não específicas com relação àespecificidade dos receptores dastoxinas de Bt. A especificidade doreceptor assume papel vital na defe-sa do organismo contra esta açãoinseticida, juntamente com a solubi-lização do cristal e ativação da toxi-na. A ausência de necessidade desolubilizar o cristal e ativar as toxi-nas produzidas pelas plantas trans-gênicas pode influenciar a suscetibi-lidade dos organismos-alvos e não-alvos de controle. A morte do inseto,no caso de produtos à base de Bt éuma interação da ação da toxina edos esporos; o primeiro fator leva àformação de poros no tecido epitelial,

Pesquisa


causando desiquilíbrio osmótico eiônico e a segundo causa septicemiadevido à germinação dos esporos,proporcionada pela redução do pHintestinal devido à ação das toxinas.No caso de plantas-Bt, a causa damorte é somente a toxina.

As primeiras tentativas de utili-zação de Bt no controle de pragasforam feitas na Europa durante adécada de 30. Devido aos êxitosiniciais, a produção deste patógenocomeçou na França em 1938. NosEUA, o interesse por este patógenoaumentou após 1950, principalmen-te para o controle de lepidópteros(Lambert & Peferoen, 1992; Beegle &Yamamoto, 1992).

Deve-se salientar que a pressãoda opinião pública quanto à saúdehumana e preservação do meio ambi-ente incentivou a utilização de produ-tos microbianos, principalmente emhortaliças e frutíferas com alto valorcomercial. Em 1970 foi lançado nomercado o Dipel (Bt kurstaki) queprovou ser 20 a 200 vezes mais poten-te que outros isolados desta bactéria(Beegle & Yamamoto, 1992). Esteproduto, atualmente, é utilizado parao controle de mais de 167 lepidópteros-praga (Glare & O’Callagham, 2000).Além disso, em 1976 foi caracterizadoum isolado eficaz para o controle deinsetos da ordem Diptera, denomina-do Bt israelensis e em 1983 outro letalpara coleópteros denominado de Bttenebrionis. O sucesso do uso de Btno mundo só não é maior até agora,em função da existência de inseticidasquímicos baratos que podem substi-tuí-lo no controle de lepidópteros.

Além de ser utilizado comobioinseticida, a partir da metade dadécada de 1980, foram obtidas asprimeiras plantas transgênicas coma incorporação dos genes codifica-dores das proteínas tóxicas de Btem plantas de fumo e tomate (Dias,1992). Segundo Ely (1993), mais de50 espécies de plantas sofreramtransformações deste tipo com re-sultados satisfatórios. Formastruncadas dos genes que codificamproteínas inseticidas de Bt na suaforma ativa foram introduzidas eexpressas com sucesso em plantasde fumo (Vaeck et al., 1987) ealgodão (Perlak et al., 1990). Koziel

et al. (1993), através da inserção deuma versão modificada do genetruncado cry1Ab, conseguiram a ex-pressão da proteína Cry1Ab em al-tos níveis em plantas de milho e,em testes de campo, foi verificada aproteção contra o consumo foliar eperfuração de colmos por Ostrinianubillalis, uma importante pragada cultura do milho nos EUA.

De acordo com Clive (2002),estima-se que foram ocupados cercade 58,7 milhões de hectares comculturas transgênicas no ano de 2002,com um aumento de 11,6% em rela-ção ao ano anterior (Figura 1). AÍndia, o maior produtor mundial dealgodão, comercializou algodão-Btpela primeira vez em 2002. Também,foi verificado um aumento da áreapré-comercial de algodão-Bt na Co-lômbia e em Honduras. O EUA foi opaís com maior área plantada, cercade 39 milhões de hectares (66%),seguido pela Argentina (23%), Cana-dá (6%) e China (4%). A China apre-sentou o maior incremento anual(40%) entre 2001 e 2002 na áreaplantada com algodão-Bt, ocupando51% da área cultivada com esta espé-cie. Em termos mundiais, o milhogeneticamente modificado ocupou12,4 milhões de hectares (com au-mento de 9% em relação à área de2001), seguido pelo algodão e canolacom 6,8 e 3 milhões de hectares,respectivamente (Figura 2).

2. Vantagens e Limitações

O emprego de biopesticidas àbase de Bt é altamente desejável emprogramas de controle de insetos devi-

do à sua alta especificidade e rápidadegradação do ambiente. No entanto,de acordo com Vaeck et al. (1987),independentemente das vantagens douso de inseticidas à base de toxinasproduzidas pela bactéria Bt, o empre-go destes produtos em escala comerci-al é limitado em função da instabilida-de do cristal protéico em campo, devi-do à ação da luz ultravioleta e do seualto custo de produção. Em relação aoefeito destas toxinas sobre insetos be-néficos, Glare & OĆallagham (2000)relatam estudos realizados sobre oefeito de várias subespécies e produ-tos à base de Bt sobre 9 ordens depredadores, distribuídos em 25 famíli-as. Em relação aos parasitóides, osmesmos autores enumeram uma sériede trabalhos realizados com Diptera(Tachinidae) e Hymenoptera(Aphelinidae, Braconidae, Chalcididae,Encyrtidae, Eulophidae, Eupelmidae,Ichneumonidae, Pteromalidae, Scelio-nidae e Trichogrammatidae). Em am-bos os casos, embora os estudos te-nham mostrado alguma variação nosresultados, os produtos formulados comBt e suas subespécies apresentam pou-co ou nenhum efeito sobre estes inimi-gos naturais.

Os benefícios potenciais do usode plantas geneticamente modifica-das como, por exemplo, milho-Bt,não se limitam apenas à redução naaplicação de inseticidas de largoespectro. Estudos mostram a dimi-nuição dos níveis de micotoxinasnos grãos destas plantas (Munkvoldet al., 1999).

De acordo com Obrycki et al.(2001), os riscos ou limitações nouso das plantas geneticamente mo-

Figura 1. Adoção mundial de plantas geneticamente modificadas (GM)


dificadas podem ser agrupados emtrês categorias: troca de materialgenético entre as plantas genetica-mente modificadas e espécies selva-gens aparentadas por meio da dis-persão de grãos de pólen; a seleçãode indivíduos resistentes na popula-ção do inseto-alvo de controle e oimpacto da tecnologia sobre outrosinsetos e organismos não-alvos docontrole. Com relação à troca dematerial genético, segundo Ellstrandet al. (1999), as plantas domestica-das e utilizadas em sistemas agríco-las não podem ser consideradascomo indivíduos evolutivamente se-parados de seus parentes selvagens.Dentre as 13 mais importantes espé-cies utilizadas para a produção dealimentos, 90% destas formam híbri-dos com seus parentes selvagensem algum local dentro de sua áreade distribuição agrícola. Deste modo,os centros de origem das espéciesseriam os locais mais suscetíveis atal fenômeno. A taxa de fluxo gêniconeste caso tende a ser extremamen-te variável e as suas conseqüênciasevolutivas dependem de sua magni-tude. A conseqüência evolutiva maisclara do fluxo gênico é a sua tendên-cia em homogeneizar a composiçãogenética das populações. A taxa defluxo gênico pode ser efetivamentezero entre plantas com incompatibi-lidade de cruzamento que estejamisoladas espacialmente ou que nãoapresentem sobreposição de suasépocas de florescimento. Porém, osautores chamam a atenção em parti-cular para os agroecossistemas. Emtais casos, o plantio concentrado deuma espécie de interesse econômi-co pode permitir que outras espéci-es (ex: plantas daninhas) soframhibridização e introgressão de genesvindos do campo de produção agrí-cola. Assim, o fluxo gênico entre asplantas domesticadas e seus paren-tes selvagens apresenta potencial-mente duas conseqüências danosas:o aumento da capacidade de inva-são de ambientes por algumas espé-cies e o aumento do risco de extinçãodestes parentes selvagens. De acor-do com Wolfenbarger & Phifer(2000), modificações genéticas atra-vés do melhoramento genético, con-vencional ou através de engenharia

genética, de uma espécie cultivada,ou não, podem produzir mudançase promover a habilidade de um or-ganismo se tornar invasor de dife-rentes ecossistemas. Deste modo, atransferência de pólen de plantas demilho-Bt para plantas selvagens apa-rentadas é uma preocupação decor-rente da adoção desta tecnologia(Bergelson et al., 1998). No entanto,esta transferência é limitada a regi-ões do México e América Centralonde ocorrem plantas do grupo dosteosíntos (Ellstrand et al., 1999).

O impacto das plantas genetica-mente modificadas sobre a entomo-fauna benéfica começou a recebergrande atenção após a publicação deLosey et al. (1999) na revista Nature.Este estudo mostrou que o pólen domilho transgênico expressando toxi-nas de Bt causou mortalidade decerca de 50% das lagartas da borbo-leta monarca (Dannaus plexippus)(Lepidoptera: Nymphalidae), quatrodias após a ingestão. Porém, estetrabalho foi bastante criticado, prin-cipalmente, por não relatar precisa-mente a quantidade de toxina utiliza-da nos bioensaios. Outros estudos,como os realizados por Leong et al.(1992) e Hansen & Obrycki (1999)indicam que este inseto pode serafetado pelo milho-Bt, porém os ní-veis de mortalidade são bastante in-feriores aos verificados por Losey etal., (1999). Glare & OĆallagham(2000) ressaltam que o comporta-mento do inseto, migração a partir deáreas com esta toxina, poderia redu-zir o efeito da toxina sobre estaespécie.

Deve-se ressaltar que o im-pacto das plantas geneticamentemodificadas sobre os organismosnão-alvos do controle pode seraval iado at ravés de es tudostoxicológicos e/ou ecológicos(Obrycki et al., 2001). Nos estudostoxicológicos, o parâmetro avalia-do é a mortalidade dos herbívorose dos consumidores de pólen quan-do expostos às toxinas de Bt comorealizado por Losey et al. (1999).Por sua vez, nos estudos ecológi-cos são observados os efeitos dautilização destas plantas sobre osdemais níveis tróficos constituin-tes de uma cadeia alimentar (her-bívoros predadores e parasitóides).Ainda existem questionamentosquanto ao impacto das toxinas pre-sentes em plantas de milho-Bt so-bre insetos polinizadores de ou-tras plantas. Vandenberg (1990)detectou valores significativos demortalidade de abelhas domestica-das quando expostas à solução deBt tenebrionis, o qual é considera-do específico para coleópteros. Ain-da, segundo Obrycki et al. (2001),os efeitos das plantas de milho-Bttambém deveriam ser avaliadossobre decompositores presentes nosolo (ex: Collembola) e outros pre-dadores vertebrados. Estes últimosestudos se justificam já que algu-mas espécies de pássaros e morce-gos são predadoras de lepidópterosque freqüentemente ocorrem emcampos de milho.

Em relação ao efeito de plan-tas transgênicas sobre inimigos na-turais, de acordo com Orr & Landis

Figura 2. Taxa de adoção mundial das principais culturas GM em 2002


(1997), o número de predadores eo parasitismo de massas de ovosde O. nubilalis não foram adversa-mente afetados por plantas de mi-lho-Bt expressando Cry1A(b). En-tre os predadores foram avaliadosadultos e ninfas do percevejo pre-dador Orius insidiosus, bem comoadultos e larvas de coccinelídeos ecrisopídeos.

Pilcher et al. (1997) conduziramestudos em laboratório e campo paradeterminar os efeitos de milho-Btexpressando Cry1A(b) sobre insetospredadores. No laboratório, não foiverificado qualquer efeito detrimen-tal agudo sobre o desenvolvimentopré-imaginal e sobrevivência deColeomegilla maculata , O.insidiosus e Chrysoperla carnea. Nocampo, em estudo realizado por doisanos consecutivos, não foram ob-servados efeitos adversos sobre aabundância de predadores de O.nubilalis (coccinelídeos, crisopídeose antocorídeos) quando compara-das a áreas de milho não genetica-mente modificado. Ainda, os núme-ros de predadores observados an-tes, durante e após a liberação dosgrãos de pólen pelas plantas demilho-Bt sugerem que movimentodos inimigos naturais no campo nãofoi afetado por este tipo de pólen.

Os efeitos de presas alimenta-das com milho-Bt sobre a mortalida-de e desenvolvimento de larvas dopredador C. carnea foram estuda-dos em condições de laboratório porHilbeck et al. (1998a). O predadorfoi criado com lagartas de O.nubilalis, e Spodoptera litorallis ali-mentadas com milho contendo atoxina Cry1A(b). Foi observado pro-longamento no período larval decrisopídeos criadas continuamentecom presas que foram alimentadascom o milho geneticamente modifi-cado foi significativamente maiorcomparada com a testemunha, bai-xo valor nutricional. Ainda, foi ob-servado prolongamento no períodolarval de crisopídeos criados comlagartas de O. nubilalis alimentascom milho geneticamente modifica-do. Este efeito pode ser atribuído àexposição à toxina inseticida emconjunto com o uso de presas debaixo valor nutricional.

O desenvolvimento e mortali-dade de formas larvais do preda-dor Orius majusculus criadas so-bre tripes Anaphothrips obscurus,alimentados com milho genetica-mente modificado expressando ad-endotoxina Cry1A(b), foi estu-dado por Zwahlen et al. (2000). Aatividade inseticida das plantas demilho Bt foi comprovada atravésde bioensaios utilizando-se lagar-tas de O. nubilalis. Não houvediferença significativa na mortali-dade e no desenvolvimento dasformas imaturas do predador cria-das em A. obscurus alimentadoscom milho transgênico expressan-do a toxina Cry1A(b), quando com-parados à testemunha criada comtripes não expostos à proteína in-seticida de B. thuringiensis. Osresultados obtidos não evidencia-ram efeitos letais ou subletais nosindivíduos de O. majusculus nomodelo de interação tritrófica (mi-lho Bt – herbívoro – predador)elaborado pelos autores. Segundoos autores, a resposta de O.majusculus alimentados com tripesexpostos à Cry1A(b) pode serexplicada pela insensibilidade des-te percevejo à toxina ou pela baixaquantidade de proteína inseticidaingerida pelos tripes que se ali-mentaram do milho Bt.

AlDeeb & Wilde (2003) nãoidentificaram diferenças significati-vas entre parcelas com milho BtCry3Bb1 e o isogênico, com relaçãoao número de insetos não alvos decontrole coletados em armadilhasdo tipo alçapão. As inspeções visu-ais de adultos e formas imaturas deC. maculata , O. insidiosus eHippodamia convergens tambémnão mostraram diferenças significa-tivas entre os materiais testados.Segundo Al-Deeb et al. (2001), nãohouve diferença significativa entre onúmero de adultos e ninfas de O.insidiosus em plantas milho Bt ex-pressando a toxina Cry1A(b) e mi-lho convencional em condições decampo, em duas localidades estuda-das. Ainda os autores conduziramteste em laboratório para avaliar osefeitos de estilo-estigmas de milho-Bt na mortalidade de formas imatu-ras de O. insidiosus. Os resultados

mostraram que quando criados con-tinuamente sobre estilo-estigmas demilho convencional ou milho Bt asninfas deste percevejo predadorapresentaram 100% de mortalidade,sugerindo que estes insetos sofre-ram com insuficiência nutricionalnesta dieta. Porém, não houve dife-rença significativa na mortalidadedas ninfas do percevejo quando ali-mentadas com estilo-estigmas de mi-lho-Bt ou convencional e ovos de O.nubilalis em dias alternados.

Segundo Barton & Dracup et al.(2000), as práticas agrícolas têm cau-sado impactos ambientais nos ecos-sistemas. Deste modo, os riscos ebenefícios em potencial da adoção datecnologia de plantas geneticamentemodificadas devem ser ponderadostomando-se como referencial os im-pactos ambientais decorridos dos sis-temas atuais de produção agrícola.Porém, os riscos ao ambiente dasplantas geneticamente modificadasdevem ser avaliados antes de sualiberação para o plantio comercial, eposteriormente as áreas ocupadas comestas culturas devem ser monitoradas.Portanto, conforme apontado porFernandes & Martinelli (2000), os es-tudos com plantas transgênicas resis-tentes a insetos em áreas extensascom o objetivo de se determinar quaissão as espécies indicadoras de impac-to ambiental destas plantas em umdeterminado sistema devem serpriorizados. Ainda há a necessidadede se padronizar métodos de avalia-ção e interpretação de resultados, pos-sibilitando a avaliação destas plantaspor todo o Brasil. Deste modo, estesresultados poderiam ser levados apúblico promovendo uma ampla dis-cussão sobre o tema.

Não obstante, a evolução da re-sistência às toxinas presentes nasplantas geneticamente modificadasresistentes a insetos é uma das prin-cipais preocupações para a liberaçãocomercial destas plantas. De acordocom Heckel (1997) a partir do mo-mento em que ocorrer a liberaçãopara plantio em áreas extensas, astoxinas de Bt representarão um im-portante fator de mortalidade para aspopulações dos insetos-alvos. Estaalta pressão de seleção pode condu-zir à evolução da resistência a estas


toxinas inseticidas nas populaçõesdos insetos expostos. Existem váriasconseqüências negativas no desen-volvimento de resistência às toxinasde Bt. Além da perda das plantastransgênicas que expressam tais to-xinas como opção no controle deinsetos, há o risco de que o uso deformulações comerciais de insetici-das à base de Bt não seja mais viávelpara a aplicação em lavouras de mi-lho ou em outras culturas. Os produ-tores orgânicos perderiam uma im-portante opção para o manejo depragas, o qual é certificado para o seusistema de produção. Além disso, aspossibilidades de substituição destesprodutos de origem biológica poroutros são mínimas. O aumento dautilização de inseticidas sintéticostambém é outra conseqüência empotencial do desenvolvimento da re-sistência às toxinas de Bt (EPA, 1998).

3. Evolução da Resistênciaa Produtos à Base de Bt ePlantas Geneticamente

Modificadas

A resistência é um fenômenopré-adaptativo que se desenvolvepor seleção de indivíduos raros quepodem sobreviver à aplicação deum inseticida a uma determinadadose. Um grande número de fatoresgenéticos, bio-ecológicos e opera-cionais influenciam a taxa de evo-lução da resistência. Os fatores ge-néticos incluem a variabilidade na-tural nas populações, número degenes envolvidos na manifestaçãoda resistência e sua freqüência ini-cial na população (Georghiou &Taylor, 1977), a herança da caracte-rística (ex: grau de dominância) ecusto adaptativo associado à resis-tência (Van Rie & Ferré, 2000). Opotencial das populações de inse-tos em desenvolver resistência aosprodutos formulados com Bt utili-zados no controle de pragas é umadas principais ameaças ao empregodesta estratégia de controle de pra-gas agrícolas. A evolução da resis-tência dos insetos para inseticidasquímicos é bastante comum, commais de 500 espécies sendo resis-tentes a um ou vários inseticidas Jápara os bioinseticidas é comparati-

vamente mais rara, principalmentedevido ao fato de que estes sãopouco utilizados, se compararmoscom a área tratada com inseticidasquímicos em todo mundo.

Há dois modos de estudar a influ-ência da variabilidade em populaçõesnaturais sobre a resistência a Bt. Aprimeira envolve os estudo das dife-renças na suscetibilidade entre e den-tro de populações. Trabalhos nestesentido foram desenvolvidos por vanFrankenhuyzen et al. (1995) e Huanget al. (1997) para Choristoneurafumiferana e O. nubilalis, respectiva-mente. Outra estimativa da variabilida-de para genes de resistência em popu-lações naturais é medir a herdabilidade(h2) em experimentos laboratoriais apartir de uma amostra da população.Este índice representa a proporção davariação fenotípica de um determina-do caráter responsável pela variaçãogenética. Tabashnik (1994a) estimou oh2 para 8 espécies de insetos, com valorrelativamente alto para Plodiainterpunctella, mostrando abaixa vari-ação fenotípica e alta variação genéticaaditiva deste inseto.

A estimativa indireta da freqüên-cia dos alelos de resistência éfornecida por experimentos labora-toriais que obtiveram êxito em sele-cionar populações resistentes a Bt(Van Rie & Ferré, 2000). Nestes ca-sos, pelo menos uma cópia do alelode resistência deve estar presentepara o início da seleção. Em experi-mentos com lepidópteros (Gould etal., 1992; 1995), a freqüência dealelos de resistência nas populaçõestestadas foi relativamente alta (de 1a 5 x 10-3).

Quanto à herança da resistên-cia, McGaughey (1985, 1988) mos-traram que para P. interpunctella aherança é autossômica de parcial-mente a completamente recessiva.O mesmo foi verificado para Plutellaxylostella por Tabashnik et al. (1992)e Tang et al. (1997). Em outro traba-lho com este mesmo inseto, (Ferréet al., 1991) verificaram que a susce-tibilidade da progênie F1 dependedo sexo do inseto no cruzamentoparental, ainda que a ligação com osexo tenha sido eliminada com basena razão sexual 1:1 dos sobreviven-tes da F1 a várias doses da Cry1Ab.

Já para H. virescens os trabalhosdemostraram que os resultados de-pendem da linhagem do inseto estu-dada. Por exemplo: para a linhagemSEL a herança mostrou-se autossô-mica, incompletamente dominante,e controlado por vários fatores ge-néticos (Sims et al., 1991).

Em relação ao número de genesenvolvidos na resistência, para P.xylostella há trabalhos que indicama ocorrência de mais de um geneenvolvido (Tang et al., 1997). Po-rém, segundo Glare & OĆallagham(2000), a resistência deste insetopara Cry1Ab mostra-se recessivacontrolada principalmente por umúnico alelo autossômico e recessivo,embora isto não seja sempre atribu-ído ao mesmo “loci”. Tabashnik etal. (1997) relatou que populaçõesdo Hawai e Pensilvânia dividem um“locus” em que uma mutação reces-siva associada com a reduzida liga-ção ao receptor confere resistênciaextremamente alta a 4 toxinas deBt. Entretanto, outra população, dasFilipinas, mostrou um controle“multilocus”, de espectro mais re-duzido, e para algumas toxinas deBt, a herança genética não é reces-siva e não está associada com aredução da ligação ao receptor. Jápara Heliothis virescens é provávelque um gene principal parcialmen-te recessivo confere resistência avárias toxinas: Cry1Aa, Cry1Ab,Cry1Ac e Cry1Fa, causando modifi-cações no receptor (Gould et al.,1995; Lee et al., 1995).

Embora a resistência em labora-tório seja obtida em poucas gera-ções em alguns insetos, ela é namaioria dos casos instável, reduzin-do logo após a diminuição da pres-são de seleção, como foi observadopor Tabashnik et al. (1994) e Tang etal. (1997) para P. xylostella. O custoadaptativo associado à evolução daresistência é a causa mais provávelda instabilidade da resistência em P.xyllostella. Groeters et al. (1994)mostraram tal redução no custo adap-tativo, sendo que após 5 gerações, aeclosão das lagartas e fecundidadeforam reduzidos em 10% na linha-gem resistente em comparação coma suscetível. A compreensão destainstabilidade pode indicar porque a


edesabàsotudorpaaicnêtsiseredotnemivlovnesededsotaleR-1alebaT sisneigniruhtsullicaB uo.)3002,.latekinhsabaTe0002,mahgallaCÓ&eralGedodacifidom(oirótarobalmesanixot

otesnI eicépsebuSedlevíNaicnêtsiser

)s(anixoTaicnêtsiseR

adazurcaruenotsirohC

anarefimufottos x8,3 - -

atpircsalemosyrC - x000.5amica aA3yrC aB1yrCsinoirbenet x95 3yrC -

alletuacaitsehpE ikatsruk x7 - -amosoeoemoH

mulletceleikatsruk x7,1 -

aregimrasihtoileH cA1yrC x75-31 -snecseriv.H ikatsruk 1-DH x42edsiam 1yrC -

ikatsruk 1-DH x96-21 bA1yrC -- x35-05 cA1yrC A2yrC,bA1yrC

- x000.01 cA1yrC,bA1yrC,aA1yrCC1yrC,B1yrC,F1yrC

A2yrCeasratonitpeL

ataenilmecedA3yrC x004e001amica

silalibunainirtsO - levínoxiab bA1yrCikatsruk x37amica - -

arohponitceP

alleipyssog- 001.3 cA1yrC -

alletcnupretniaidolP ikatsruk x052edamica - -

ikatsruk )lepiD( x052amica -,sisneigniruht

ikatsruk sonem(e)1-DH eairellag

ikatsruk )lepiD( x52edamica - -ikatsruk )lepiD( x601amica bA1yrC -

x578edacrec bA1yrC -ikatsruk x041 - -iawazia x16-82 - -sudicomotne x12 - -

alletsolyxalletulP ikatsruk x66-51 - -

- x26-22,aA1yrC,C1yrC,cA1yrC,bA1yrC

2yrCeF1yrCJ1yrC,F1yrC

C1yrC 004.21 -

cA1yrC008.6edamica-003

x-

augixearetpodopS ikatsruk x2-1 - -

x058 C1yrC,C1yrC,bA1yrCH1yrC,C1yrC/E1yrC

A2yrCeadrepigurf.S ikatsruk x9,4 - -

silarottil.S iawazia x005edsiam C1yrCeE1yrC,D1yrC

bA1yrCinaisulpohcirT x13 bA1yrC cA1yrCuoaA1yrC

iawazia+ikatsruk x51 - -ikatsruk 1-DH x703 - -

iawazia e211-DH331-DH

x79e82e331,891,1-DH891e211,1-DH

-

sudicomotne -DH891

x23 331e211,1-DH -

iawazia+ikatsruk x001-26e461 sudicomotne -


evolução da resistência ao Bt é tãorara e pode auxiliar na elaboraçãode estratégias para incrementar auti l ização deste bioinseticida(Tabashnik et al., 1994).

A alteração da atividade proteo-lítica (ativação da toxina) foi verifica-da em P. interpunctella para Btentomocidus e Bt kurstaki (Johnsonet al., 1990; Oppert et al., 1997). Emtrabalho semelhante realizado porVan Rie et al. (1990), foi observada aredução de 50 vezes na afinidade datoxina pelo receptor. Porém, os auto-res não verificaram alteração no nú-mero de receptores presentes paraCry1Ab na linhagem resistente. Estesdados indicam que a resistência, nes-te caso, é devida a alterações noreceptor de Cry1Ab, pois o mesmodecréscimo de afinidade não foi ob-servado para Cry1Ca, que possui 3vezes mais receptores que a outratoxina. Este elevado número de re-ceptores pode explicar a alta susceti-bilidade da linhagem selecionada paraCry1Ca. Para H. virescens foi verifica-do por Lee et al. (1995) que a ligaçãoda toxina Cry1Aa ao receptor foidrasticamente reduzida, mas o mes-mo não foi verificado para Cry1Ab eCry1Ac. Porém, as toxinas do grupoCry1A dividem os mesmos recepto-res nesta espécie de inseto, portantoCry1Ac e Cry1Ab também se ligamao receptor de Cry1Aa. Consequen-temente foi considerada a hipóteseque o receptor alterado para Cry1Aacausa resistência ao 3 subclasses deCry1A (Van Rie & Ferré, 2000).

Exemplos de Resistência de In-setos a produtos à base de Bacillusthuringiensis:

1) Em laboratório

Existem vários relatos de evolu-ção da resistência a Bt em laboratório

(Tabela 1). Para a maioria das espé-cies testadas a resistência evolui rapi-damente para Bt kurstaki, Btentomocidus e Bt tenebrionis ou Btaizawai. Quando a diferença entreas populações suscetíveis e resisten-tes é menor que 10, não fica claro sea população desenvolveu resistên-cia, propriamente dita, ou se existetolerância entre subgrupos ougenótipos da espécie em questão(Glare & OĆallagham, 2000).

O primeiro exemplo de resistên-cia em laboratório ocorreu com Muscadomestica ao Bt thuringiensis, pro-vavelmente envolvendo b-exotoxina.De modo semelhante, trabalhos mos-traram uma evolução de resistênciade 10 da mesma toxina paraDrosophila melanogaster em 30 ge-rações (Harvey & Howell, 1964; Wil-son & Burns, 1968; Carlberg &Lindstrom, 1987).

A partir do primeiro relato deresistência de Plodia interpunctella ad-endotoxina (McGaughey &Beeman, 1988), vários relatos de de-senvolvimento de resistência em la-boratório foram feitos. Em algunscasos os estudos envolvem a suspen-são esporo + cristal enquanto que emoutros casos apenas toxina(s). Emalguns casos níveis elevados de re-sistência foram obtidos em apenasalgumas gerações usando-se alta pres-são de seleção, como por exemplo:P. interpunctella para Bt kurstaki e P.xylostella para Bt aizawai Cry1C, de3 e 6 gerações respectivamente (Glare& OĆallagham, 2000).

2) Em campo

Embora alguns trabalhos reali-zados em laboratório com alta pres-são de seleção de Bt sobre P.xylostella (traça-das-crucíferas) [sic]não tenha sido verificado alteraçãosignificativa na suscetibilidade

(Devriendt & Martouret, 1976), esteinseto foi o primeiro a mostrar evo-lução de resistência para Bt emcampo (Tabashnik et al., 1997),sendo, até o momento, o únicoexemplo em que foi verificada aevolução da resistência em campode um inseto para Bt, embora paraoutras espécies de lepidópteros (Ta-bela 1) tenha sido sugerido estapossibilidade, porém pouca dife-rença na suscetibilidade foi verifi-cada entre as populações de campo(resistente) e a de referência emlaboratório (suscetível). SegundoGlare & OĆallagham (2000), ou-tros relatos de resistência deste in-seto a produtos à base de Bt foramfeitos em vários países comoTailândia, Havaí, Japão, Coréia, Chi-na, EUA e América Central.

A espécie influencia a probabi-lidade de evolução da resistênciadevido à variabilidade genética napopulação e à possibilidade de en-contrar o inóculo. Por exemplo, ohábito migratório e polífago deHelicoverpa punctigera leva à dilui-ção de qualquer população resisten-te devido ao cruzamento de indiví-duos resistentes com suscetíveis,entretanto, P. xylostella é um insetocom mobilidade limitada, não ocor-rendo à diluição da resistência, pelocruzamento com insetos suscetíveisvindos de outras áreas (Glare &OĆallagham, 2000).

A incidência de resistência cru-zada é geralmente baixa, mas foiverificada para várias toxinas (Ta-bela 1). Esta parece estar ligada acomposição da toxina do isoladoutilizado. McGaughey & Johnson(1994) realizam um estudo detalha-do abordando a resistência para astoxinas individualmente após a se-leção para resistência aos isoladosBt kurstaki (HD-1), Bt aizawai (HD-112 e 133) e Bt entomocidus (HD-198). Para P. interpunctella, HD-1resultou em resistência para Cry1Abe Cry1Ac, mas não para Cry1Aa,Cry1B, Cry1C e Cry2A. Resistênciapara HD-133 e HD-198 resultou emresistência a uma maior gama detoxinas: Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac,Cry1B, Cry1C e Cry2A. Os autoressugeriram que o espectro relativa-mente limitado de resistência às

sotesniedaicnêtsiseredotnemivlovnesedlevíssopedsotaleR-2alebaTarap sisneigniruhtsullicaB .)0002,mahgallaCÓ&eralG(opmacme

otesnI eicépsebuS aicnêtsiseredlevíN )s(anixoTaregimraaprevocileH ikatsruk -

snecserivsihtoileH IIPVM etnareloT cA1yrCalletcnupretniaidolP ikatsruk oxiaB

alletsolyxalletulP ikatsruk x624-52 bA1yrCiawazia x02-3 cA1yrC

adrepigurfaretpodopS ikatsruk x84,1


diferentes toxinas em Bt kurstakiindicou que a resistência cruzada aoutras subespécies era menos pro-vável de ocorrer, portanto produtosbaseados em Bt kurstaki deveriamser utilizados primeiro. A resistên-cia de Heliothis virescens é normal-mente relatada à toxina Cry1Ac,porém existem relatos de resistên-cia para outras toxinas como:Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1F e Cry2A(Gould et al., 1992).

4. Manejo da Resistência

Os programas de manejo daresistência apresentam 3 objetivosprincipais: evitar, retardar e rever-ter a evolução da resistência (Croft,1990). Estes objetivos são os mes-mos para o manejo da resistência aprodutos à base de Bt sendo mui-tas táticas baseadas nos princípiosmostrados para plantas genetica-mente modificadas. No caso dasplantas Bt são preconizadas váriasestratégias, tais como plantas comaltas doses das toxinas associadasa áreas de refúgio, misturas deplantas com diferentes toxinas, mo-saicos de plantas geneticamentemodificadas, combinações de toxi-nas com diferentes modos de ação,ou a combinação de plantas ex-pressando baixas doses das toxi-nas e controle complementar daspragas pelos inimigos naturais e aexpressão das toxinas em determi-nados tecidos ou em um períodode ataque mais intenso da praga(Neppl, 2000).

A estratégia empregada nospaíses com plantio de milho Btonde as pragas apresentam hábitomigratório dos adultos e alta mobi-lidade nas formas larvais tem sidoa utilização de plantas expressan-do altas doses das toxinas associa-das às áreas de refúgio. Esta táticacomeçou a ser adotada baseando-se no princípio de que os insetossuscetíveis poderiam imigrar parauma área com predominância deinsetos resistentes e, por cruza-mento, diluir os alelos de resistên-cia na população da praga. Esteprincípio apenas é valido com aexpressão das toxinas de Bt emaltas doses de modo que a resis-

tência seja funcionalmente reces-siva. Deste modo, apenas restari-am na área com plantas genetica-mente modificadas os indivíduosresistentes. O refúgio pode variarem tamanho e disposição e servircomo reservatório de insetos sus-cetíveis. O sucesso desta estraté-gia depende das seguintes condi-ções: que o acasalamento seja ale-atório entre os indivíduos resisten-tes e suscetíveis, que os insetossuscetíveis migrem da área de re-fúgio para a área com as plantasgeneticamente modificadas e exis-ta sincronia na emergência de in-setos entre as duas áreas.

Outra estratégia possível paraa liberação de plantas genetica-mente modificadas é a mistura desementes transgênicas e convenci-onais na forma de linhas da culturaou faixas de plantio. Uma área queutilize esta estratégia resulta numamistura de plantas-Bt e convencio-nais. Deste modo, o refúgio deplantas convencionais seria dis-posto internamente na área com asplantas transgênicas. Este refúgiointerno consistiria no reservatóriode suscetibilidade para o forneci-mento de indivíduos suscetíceispara acasalamento aleatório comos resistentes que restariam nasplantas geneticamente modifica-das. A principal limitação destemétodo é a taxa de movimentoentre plantas nas formas larvais dapraga-alvo de controle. Esta táticaé indicada para casos específicosnos quais a forma larval da pragaque se encontra nas plantas con-vencionais não se disperse paraplantas geneticamente modificadasresistentes causando a morte dosindivíduos suscetíveis.

A mistura de sementes na for-ma de linhas de plantio com semen-tes convencionais internamente àárea de algodão Bt têm sido utiliza-da com sucesso no Arizona, EUA,para o manejo de lagarta rosadaPectinophora gossypiella. Nestecaso, a lagarta rosada permanecedentro das maçãs atacadas o quelimita o movimento das formaslarvais desta espécie entre as plan-tas garantindo a sobrevivência dosindivíduos suscetíveis. Esta estraté-

gia não seria adequada para o ma-nejo de S. frugiperda já que estáespécie apresenta alta mobilidadena sua larval. A técnica do plantioem forma de mosaico envolve áreascom plantas Bt expressando dife-rentes toxinas inseticidas. Destemodo, os insetos estariam sofrendodiferentes pressões de seleção aolongo da faixa de plantio de áreasgeneticamente modificadas. Noentanto, para que esta estratégiafuncione é importante que não ocor-ra resistência cruzada entre as toxi-nas empregadas. Além disso, exis-tem críticas quanto à possível efici-ência das diferentes áreas Bt ematuarem como reservatórios de sus-cetibilidade recíprocos, o que pos-sibilitaria a imigração de indivíduossuscetíveis entre as diferentes áre-as para a diluição dos alelos deresistência.

Outra alternativa viável é a rota-ção de plantas dispondo deferentestoxinas inseticidas. Assim como nocaso do mosaico, a resistência cruza-da entre as toxinas pode comprome-ter a eficácia deste método. As basesteóricas na estratégia da rotação sãoque o custo adaptativo associado àresistência leva a redução da fre-qüência dos indivíduos suscetíveis ea imigração de indivíduos suscetí-veis. (Hoy, 1988).

A expressão da toxina de Bt emtecidos e estádio fenológicos ade-quados específicos é uma estratégiaque visa diminuir a pressão de sele-ção das plantas-Bt sobre a popula-ção de insetos (Frutos et al., 1999).Esta estratégia é similar ao uso deáreas refúgio e mistura de sementesno sentido que a própria plantapode atuar como refúgio (Mallet &Porter, 1992). As plantas poderiamproduzir as toxinas somente quandoo nível de dano fosse alcançado ouem determinados tecidos mais pro-pensos ao ataque. No entanto, estaestratégia não funcionaria para pra-gas que atacam todas as partes daplanta. Além disso, esta tática édependente de estudos avançadosem biologia molecular a fim de seencontrar os promotores específi-cos que seriam responsáveis pelodirecionamento da expressão dastoxinas inseticidas.


Embora estudos conduzidos emlaboratório relatem a casos de resis-tência as toxinas de Bt e freqüênciainicial elevada de resistência, nospaíses que adotam a tecnologia deplantas Bt no manejo das pragas osprogramas de monitoramento nãodetectaram ainda aumento nafrequência de resistência (Tabashniket. al.,2003). Exemplos de progra-mas de monitoramento estabeleci-dos e bem sucedidos incluem O.nubilalis (Estados Unidos – 6 anos),P. gossypiella (Arizona-5 anos),Helicoverpa armigera (Nordeste daChina-3 anos) e Helicoverpa zea (Ca-rolina do Norte-2 anos).

Assim, torna-se fundamental odesenvolvimento de programas demonitoramento como parte dos pro-gramas que visem manejar a evolu-ção da resistência. Entretanto, asestratégias para o manejo da resis-tência somente obtêm o êxito espe-rado se forem adequadamenteimplementadas. É importante que oagricultor compreenda estas estraté-gias, além do monitoramento e as-sistência técnica para o sucesso des-tes programas (Neppl, 2000). Aindasão necessários estudos para otimizaros resultados obtidos com as estra-tégias de manejo da resistência, en-tre estes, destacam-se as pesquisasvoltadas para os hábitos dos insetos(migração e acasalamento) que po-dem influenciar decisivamente naviabilidade das táticas empregadas.Dificilmente pode-se assegurar oêxito destes programas, pois emcampo muitas variáveis são soma-das aos modelos propostos e, atual-mente, nenhuma das táticas acimadescritas são completamente aceitá-veis em termos de eficácia.

5. Considerações Finais

O uso das estratégias de mane-jo implica significativa demanda demão-de-obra especializada, princi-palmente no sentido de monitorar aevolução da resistência em áreascultivadas com plantas genetica-mente modificadas expressandotoxinas de Bt. Geralmente, a assis-tência técnica disponível aos agri-cultores limita-se a recomendaçãode insumos para viabilizar sua ativi-

dade agrícola, de maneira que osextensionistas dificilmente atuamcomo agentes introdutórios de no-vas tecnologias e conhecedores doseu impacto sobre o meio ondeatuam. Além de determinar o im-pacto das plantas transgênicas so-bre o meio ambiente, é necessáriotambém instruir e qualificar tanto oagricultor como o extensionista so-bre o potencial desta moderna táti-ca de controle de pragas. A imple-mentação de estratégias de manejode resistência e programas de mo-nitoramento são fundamentais paraa exploração sustentável da tecno-logia das plantas Bt. Estas ativida-des são exigentes em mão-de-obratreinada e apoio logístico pelos pro-dutores rurais, órgãos de assistên-cia técnica, grupos de consultoresenvolvidos com a cultura e dasempresas produtoras de sementesgeneticamente modificadas.

Por fim, não é correto se pensarque as plantas geneticamente modi-ficadas serão a alternativa definitivapara o controle de pragas. O sistemaplanta-inseto deve ser estudado eavaliada a relação custo x benefícioda adoção destas plantas genetica-mente modificadas resistentes a in-setos. Deve-se conhecer toda a gamade alternativas existentes e escolheraquela que melhor viabiliza a ativi-dade agrícola, porém levando-se emconta o seu impacto sobre o meioambiente em comparação às demaisalternativas disponíveis para o con-trole de pragas.

6. Referências

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Biodiesel

Luiz Pereira Ramos, Ph.D.Professor Adjunto IV, Departamento de Química,Universidade Federal do Paraná[email protected]

Karla Thomas Kucek, B.Sc.Mestranda em Química Orgânica, Departamentode Química, Universidade Federal do Paraná[email protected]

Anderson Kurunczi Domingos, B.Sc.Mestrando em Química Orgânica, Departamentode Química, Universidade Federal do Paraná[email protected]

Helena Maria Wilhelm, Ph.D.Pesquisadora, Unidade Tecnológica de QuímicaAplicada, Depto. de Química Aplicada, Institutode Tecnologia para o Desenvolvimento, [email protected]


Um projeto de sustentabilidade econômica e sócio-ambiental para o Brasil

Pesquisa

1 - Introdução

Desde o século passado, os com-bustíveis derivados do petróleo têmsido a principal fonte de energiamundial. No entanto, previsões deque esse recurso deva chegar ao fim,somadas às crescentes preocupaçõescom o ambiente, têm instigado abusca de fontes de energia renovável(Ghassan et al., 2003).

O Protocolo de Quioto, concebi-do durante o fórum ambiental Rio-92e ratificado, desde então, por mais de93 países, vem tentando mobilizar acomunidade internacional para quepromova uma ação conjunta com oobjetivo de estabilizar na atmosfera aconcentração dos gases causadoresdo efeito estufa e, assim, limitar ainterferência antropogênica sobre osistema climático global (GreenpeaceInternational, 2003). Infelizmente, ostermos do referido acordo somenteentrarão rigorosamente em vigorquando o conjunto de seus signatári-os somar, no mínimo, 55% do total depaíses emissores do globo, algo quesomente será possível com a ratifica-ção de, pelo menos, uma das grandespotências mundiais, a Rússia ou osEstados Unidos. Em pronunciamen-tos recentes, o Presidente da Rússia,Vladimir Putin, declarou estar aindaavaliando as condições que levarão oseu país a tomar tal decisão, demons-trando que, apesar da evidência deque o acúmulo desses gases na at-mosfera comprometa fortemente oequilíbrio dos diferentes ecossiste-mas terrestres, interesses geopolíticose/ou comerciais têm prevalecido so-

bre os mais eloqüentes interesses dahumanidade.

O Brasil, apesar de não ser umgrande emissor de gases poluentes,vem promovendo medidas condizen-tes com essa nova conjuntura, atra-vés do desenvolvimento e da atuali-zação periódica de inventários naci-onais sobre o tema (Ministério daCiência e Tecnologia, 2002). Nomomento em que o mercado de car-bono estiver regulamentado, essesinventários terão uma importânciavital para que o país possa conquistarespaço e usufruir dessa nova estraté-gia de redistribuição de riquezas e deinclusão social.

Sabe-se que as metas estabele-cidas pelo Protocolo de Quioto so-mente poderão ser alcançadas pelouso sustentado da biomassa parafins energéticos. No entanto, recen-tes levantamentos demonstram queapenas 2,2% da energia consumidano mundo é proveniente de fontesrenováveis (Pessuti, 2003), o queevidencia um extraordinário poten-cial para a exploração de outrasfontes. Considerando-se apenas abiomassa proveniente de ativida-des agroindustriais, ou seja, resídu-os agrícolas, florestais e agropecu-ários, calcula-se que o potencialcombustível desse material sejaequivalente a, aproximadamente,6.587 milhões de litros de petróleoao ano (Staiss e Pereira, 2001). Di-ante de todo esse potencial, temhavido uma crescente dissemina-ção de projetos e de ações voltadospara o uso de óleos vegetais e deresíduos urbanos e agroindustriais


para a geração de energia, particu-larmente por meio de projetos deco-geração (Cenbio, 2003).

2 - Óleos vegetais comofonte de energia renovável

Por se tratar de uma fonte deenergia renovável e por seu usosustentado não provocar danos aomeio ambiente, a biomassa tem atra-ído muita atenção nos últimos tem-pos (Ministério da Indústria e doComércio, 1985; Ministério da Ciên-cia e Tecnologia, 2002; U.S.Department of Energy, 1998). Den-tre as fontes de biomassa pronta-mente disponíveis, os óleos vege-tais têm sido largamente investiga-dos como candidatos a programasde energia renovável, pois proporci-onam uma geração descentralizadade energia e um apoio à agriculturafamiliar, criando melhores condi-ções de vida (infra-estrutura) emregiões carentes, valorizando po-tencialidades regionais e oferecen-do alternativas a problemas econô-micos e sócio-ambientais de difícilsolução.

A utilização de óleos vegetais innatura como combustível alternati-vo tem sido alvo de diversos estudosnas últimas décadas (Nag et al., 1995;Piyaporn et al., 1996). No Brasil, jáforam realizadas pesquisas com osóleos virgens de macaúba, pinhão-manso, dendê, indaiá, buriti, pequi,mamona, babaçu, cotieira, tingui epupunha (Barreto, 1982; Ministérioda Indústria e do Comércio, 1985;Serruya, 1991) e nos testes realizadoscom esses óleos em caminhões emáquinas agrícolas, foi ultrapassadaa meta de um milhão de quilômetrosrodados (Ministério da Indústria e doComércio, 1985). No entanto, essesestudos demonstraram a existênciade algumas desvantagens no uso di-reto de óleos virgens: (a) a ocorrên-cia de excessivos depósitos de carbo-no no motor; (b) a obstrução nosfiltros de óleo e bicos injetores; (c) adiluição parcial do combustível nolubrificante; (d) o comprometimentoda durabilidade do motor; e (e) umaumento considerável em seus cus-tos de manutenção.

Outros autores (Goering e Fry,1984; Kobmehl e Heinrich, 1998;Ghassan et al., 2003) demonstraramque a alta viscosidade e a baixavolatilidade dos óleos vegetais innatura podem provocar sérios pro-blemas ao bom funcionamento domotor. Dentre os problemas quegeralmente aparecem após longosperíodos de utilização, destacam-sea formação de depósitos de carbonopor combustão incompleta, a dimi-nuição da eficiência de lubrificaçãodo óleo pela ocorrência de polime-rização (no caso de óleos poli-insa-turados) e a atomização ineficientee/ou entupimento dos sistemas deinjeção (Peterson et al., 1983; Pryde,1983; Ma e Hanna, 1999).

Para resolver as desconformi-dades descritas acima, houve umconsiderável investimento na adap-tação dos motores para que o usode óleos vegetais in natura pudes-se ser viabilizado, particularmentena produção de energia elétrica emgeradores movidos por motores es-tacionários de grande porte. Nessescasos, o regime de operação domotor é constante e isso facilita oajuste dos parâmetros para garantiruma combustão eficiente do óleovegetal, podendo ser utilizada, in-clusive, uma etapa de pré-aqueci-mento (pré-câmaras) para diminuira sua viscosidade e facilitar a inje-ção na câmara de combustão. Noentanto, para motores em que oregime de funcionamento é variá-vel (e.g., no setor de transportes),foi necessário desenvolver uma me-todologia de transformação quími-ca do óleo para que suas proprieda-des se tornassem mais adequadasao seu uso como combustível. As-sim, em meados da década de 70,surgiram as primeiras propostas demodificação de óleos vegetais atra-vés da reação de transesterificação(Figura 1), cujos objetivos eram osde melhorar a sua qualidade deignição, reduzir o seu ponto de

fluidez, e ajustar os seus índices deviscosidade e densidade específica(Shay, 1993, Stournas et al., 1995;Ma e Hanna, 1999).

3 - O biodiesel comoalternativa para a matriz

energética nacional

Por definição, biodiesel é umsubstituto natural do diesel de pe-tróleo, que pode ser produzido apartir de fontes renováveis comoóleos vegetais, gorduras animais eóleos utilizados para cocção de ali-mentos (fritura). Quimicamente, édefinido como éster monoalquílicode ácidos graxos derivados delipídeos de ocorrência natural epode ser produzido, juntamente coma glicerina, através da reação detriacilgliceróis (ou triglicerídeos)com etanol ou metanol, na presen-ça de um catalisador ácido ou bási-co (Schuchardt et al., 1998; Zagonele Ramos, 2001; Ramos, 1999, 2003).Embora essa tenha sido a definiçãomais amplamente aceita desde osprimeiros trabalhos relacionadoscom o tema, alguns autores prefe-rem generalizar o termo e associá-lo a qualquer tipo de ação quepromova a substituição do dieselna matriz energética mundial, comonos casos do uso de: (a) óleosvegetais in natura, quer puros ouem mistura; (b) bioóleos, produzi-dos pela conversão catalítica deóleos vegetais (pirólise); e (c) mi-croemulsões, que envolvem a inje-ção simultânea de dois ou maiscombust íveis , gera lmenteimiscíveis, na câmara de combus-tão de motores do ciclo diesel (Mae Hanna, 1999). Portanto, é impor-tante frisar que, para os objetivosdeste artigo, biodiesel é tão-somentedefinido como o produto da tran-sesterificação de óleos vegetais queatende aos parâmetros fixados pe-las normas ASTM D6751 (AmericanStandard Testing Methods, 2003) e

Figura 1. Reação de transesterificação de óleos vegetais e/ou gorduras animais.


DIN 14214 (Deutsches Institut fürNormung, 2003), ou pela Portariano 255 da ANP (Agência Nacionaldo Petróleo, 2003) que, apesar deprovisória, já estabelece as especi-ficações que serão exigidas paraque esse produto seja aceito nomercado brasileiro. A grande com-patibilidade do biodiesel com odiesel convencional o caracterizacomo uma alternativa capaz de aten-der à maior parte da frota de veícu-los a diesel já existente no merca-do, sem qualquer necessidade deinvestimentos tecnológicos no de-senvolvimento dos motores. Poroutro lado, o uso de outros com-bustíveis limpos, como o óleo innatura, as microemulsões, o gásnatural ou o biogás requerem umaadaptação considerável para que odesempenho exigido pelos moto-res seja mantido (Laurindo, 2003).

Do ponto de vista econômico, aviabilidade do biodiesel está relacio-nada com o estabelecimento de umequilíbrio favorável na balança co-mercial brasileira, visto que o dieselé o derivado de petróleo mais consu-mido no Brasil, e que uma fraçãocrescente desse produto vem sendoimportada anualmente (Nogueira ePikman, 2002).

Em termos ambientais, a ado-ção do biodiesel, mesmo que deforma progressiva, ou seja, em adi-ções de 2% a 5% no diesel depetróleo (Ministério da Ciência eTecnologia, 2002), resultará em umaredução significativa no padrão deemissões de materiais particulados,óxidos de enxofre e gases que con-tribuem para o efeito estufa(Mittelbach et al., 1985). Sendo as-sim, sua difusão, em longo prazo,

proporcionará maiores expectati-vas de vida à população e, comoconseqüência, um declínio nos gas-tos com saúde pública, possibili-tando o redirecionamento de ver-bas para outros setores, como edu-cação e previdência. Cabe aqui ain-da ressaltar que a adição de biodieselao petrodiesel, em termos gerais,melhora as características do com-bustível fóssil, pois possibilita aredução dos níveis de ruído e me-lhora a eficiência da combustãopelo aumento do número de cetano(Gallo, 2003).

Em diversos países, o biodieseljá é uma realidade. Na Alemanha,por exemplo, existe uma frota signi-ficativa de veículos leves, coletivose de carga, que utilizam biodieselderivado de plantações específicaspara fins energéticos e distribuídopor mais de 1.000 postos de abaste-cimento. Outros países também têmdesenvolvido os seus programas na-cionais de biodiesel e, como conse-qüência, o consumo europeu de bi-odiesel aumentou em 200.000 ton.entre os anos de 1998 e 2000. Já nosEstados Unidos, leis aprovadas nosestados de Minnesotta e na Carolinado Norte determinaram que, a partirde 1º/1/2002, todo o diesel consu-mido deveria ter a incorporação de,pelo menos, 2% de biodiesel embase volumétrica.

No Brasil, desde as iniciativasrealizadas na década de 80, pouco seinvestiu nesse importante setor daeconomia, mas a reincidência de tur-bulências no mercado internacionaldo petróleo, aliada às pressões que osetor automotivo vem sofrendo dosórgãos ambientais, fez com que oGoverno atual iniciasse um novo tra-

balho com vistas à utilizar óleos ve-getais transesterificados na matrizenergética nacional. Esse trabalho foirecentemente materializado na for-ma de um programa nacional,intitulado PROBIODIESEL (Portariano. 702 do MCT, de 30 de outubro de2002), cujo lançamento solene foirealizado em Curitiba durante a ceri-mônia de abertura do Seminário In-ternacional de Biodiesel (24 a 26 deoutubro, Blue Tree Towers Hotel).Naquela mesma ocasião, foi tambémdivulgada a criação do CERBIO, Cen-tro Nacional de Referência em Bio-combustíveis, nas dependências doTecpar, em Curitiba. A missão doCERBIO será a de desenvolver oconceito de biocombustíveis em suaplenitude, desde a certificação deprodutos até o desenvolvimento tec-nológico de novas rotas que contri-buam para o aumento da viabilidadee competitividade técnica do biodieselnacional.

Ao longo dos últimos anos, oPROBIODIESEL vem se desenvol-vendo por meio de ações integradasentre instituições de tecnologia, en-sino e pesquisa, e empresas e asso-ciações direta ou indiretamente liga-das ao tema, sob a forma de gruposde trabalho que integram a chamadaRede Brasileira de Biodiesel. Esseprograma tem como principal obje-tivo promover o desenvolvimentodas tecnologias de produção e ava-liar a viabilidade e a competitividadetécnica, sócio-ambiental e econômi-ca do biodiesel para os mercadosinterno e externo, bem como de suaprodução e distribuição espacial nasdiferentes regiões do país (Andrade,2003; Ministério da Ciência e Tecno-logia, 2002).

siategevsoelósiapicnirpsodsnuglaedsoxargsodicámeacimíuqoãçisopmoceodoiedoremúN.1alebaT.)8291,rolyaTegrebslAedodatpada(leseidoibedoãçudorpaarapsievínopsidsiaminasarudroge

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onivobobeS 64-83 - 0,2 0,92 5,42 5,44 - -)soníus(ahnaB 07-64 - - 6,42 0,51 4,05 0,01 -

ocôC 01,8 0,54 0,02 0,5 0,3 0,6 - -avilO 88-97 - - 6,41 - 4,57 0,01 -

niodnemA 001-38 - - 5,8 0,6 6,15 0,62 -oãdoglA 011-801 - - 4,32 - 6,13 0,54 -

ohliM 031-111 - - 0,6 0,2 0,44 0,84 -xalF 102-371 - 0,3 0,6 - - 0,47 0,71ajoS 341-731 - - 0,11 0,2 0,02 0,46 0,3


4 - Principais matérias-primas para a produção de

biodiesel

De uma forma geral, pode-seafirmar que monoalquil-ésteres deácidos graxos podem ser produzi-dos a partir de qualquer tipo deóleo vegetal (Tabela 1), mas nemtodo óleo vegetal pode (ou deve)ser utilizado como matéria-primapara a produção de biodiesel. Issoporque alguns óleos vegetais apre-sentam propriedades não ideais,como alta viscosidade ou alto nú-mero de iodo, que são transferidaspara o biocombustível e que o tor-nam inadequado para uso diretoem motores do ciclo diesel. Portan-to, a viabilidade de cada matéria-prima dependerá de suas respecti-vas competitividades técnica, eco-nômica e sócio-ambiental, e pas-sam, inclusive, por importantes as-pectos agronômicos, tais como: (a)o teor em óleos vegetais; (b) aprodutividade por unidade de área;(c) o equilíbrio agronômico e de-mais aspectos relacionados com ociclo de vida da planta; (d) a aten-ção a diferentes sistemas produti-vos; (e) o ciclo da planta (sazonali-dade); e (f) sua adaptação territorial,que deve ser tão ampla quantopossível, atendendo a diferentescondições edafoclimáticas (Ramos,1999, 2003).

Dada a grandeza do agrone-gócio da soja no mercado brasilei-ro, é relativamente fácil e imediadoreconhecer que essa oleaginosaapresenta o maior potencial paraservir de modelo para o desenvol-vimento de um programa nacionalde biodiesel. Apenas como exem-plo, dados divulgados pela Abiove(Associação Brasileira dos Produ-tores de Óleos Vegetais) demons-tram que o setor produtivo da sojajá está preparado para atender àdemanda nacional de misturar até5% de biodiesel no diesel de petró-leo, sendo que proporções superi-ores a esta mereceriam uma novaavaliação para que não haja dúvi-das quanto ao abastecimento deóleo a esse novo setor da econo-mia. Por outro lado, segundo da-

dos oficiais da Embrapa (Peres eJunior, 2003), o Brasil apresentaum potencial de 90 milhões dehectares disponíveis, em áreas de-gradadas e/ou não exploradas, paraa expansão da atual fronteira agrí-cola. Considerando-se apenas a uti-lização da soja como matéria-pri-ma para a produção de biodiesel,serão necessários apenas 3 milhõesde hectares, ou 1,8 bilhões de li-tros de óleo, para a implementa-ção do B5 (mistura composta de5% de biodiesel e 95% do petrodi-esel), o que culminaria na geraçãode cerca de 234 mil empregos dire-tos e indiretos.

Além da soja, várias outras olea-ginosas (e.g., Tabela 1), que aindase encontram em fase de avaliaçãoe desenvolvimento de suas cadeiasprodutivas, podem ser empregadaspara a produção do biodiesel (Pa-rente, 2003). A região norte, porexemplo, apresenta potencial parauso de dendê, babaçu e soja; aregião nordeste, de babaçu, soja,mamona, dendê, algodão e coco; aregião centro-oeste, de soja,mamona, algodão, girassol, dendêe gordura animal; a região sul, desoja, colza, girassol e algodão; e aregião sudeste, de soja, mamona,algodão e girassol (Campos, 2003;Peres e Junior, 2003). Várias dessasoleaginosas já tiveram as suas res-pectivas competitividades técnica esócio-ambiental demonstradas paraa produção de biodiesel, restando,na maioria dos casos, um estudoagronômico mais aprofundado queratifique os estudos de viabilidade.

Deve-se ainda destacar que ainserção do biodiesel na matriz ener-gética nacional representa um po-deroso elemento de sinergia paracom o agronegócio da cana, cujoefeito será extremamente benéficopara a economia nacional (Ramos,1999, 2003). A produção de etanolé expressiva em, praticamente, to-das as regiões do país, e o novoprograma somente terá a contribuirpara o aumento da competitividadedo setor, valendo-se, inclusive, darede de distribuição já existente edo excelente desempenho das tec-nologias desenvolvidas para a ca-

deia produtiva da cana (Campos,2003). Nesse contexto, o Brasil seencontra em uma condição que paísalgum jamais esteve na história domundo globalizado. Com a eviden-te decadência das fontes fósseis,nenhuma outra região tropical temporte e condições tão favoráveispara assumir a posição de um dosprincipais fornecedores de biocom-bustíveis e tecnologias limpas parao século XXI (Vidal, 2000).

5 - O processo de produçãode biodiesel por catálise

homogênea em meioalcalino

A transesterificação de óleos ve-getais ou gordura animal, tambémdenominada de alcoólise, pode serconduzida por uma variedade de ro-tas tecnológicas em que diferentestipos de catalisadores podem ser em-pregados, como bases inorgânicas(hidróxidos de sódio e potássio ebases de Lewis), ácidos minerais (áci-do sulfúrico), resinas de troca iônica(resinas catiônicas fortemente ácidas),argilominerais ativados, hidróxidosduplos lamelares, superácidos,superbases e enzimas lipolíticas(lipases) (Schuchardt et al., 1998; Ra-mos, 2003). Não há dúvidas de quealgumas dessas rotas tecnológicas,particularmente aquelas que empre-gam catalisadores heterogêneos, apre-sentam vantagens interessantes comoa obtenção de uma fração glicerínicamais pura, que não exija grandesinvestimentos de capital para atingirum bom padrão de mercado. Porém,é também correta a afirmação de quea catálise homogênea em meio alcali-no ainda prevalece como a opçãomais imediata e economicamente viá-vel para a transesterificação de óleosvegetais (Zagonel e Ramos, 2001; Ra-mos, 2003). Um fluxograma simplifi-cado do processo de produção debiodiesel, utilizando a transesterifica-ção etílica em meio alcalino comomodelo, encontra-se apresentado naFigura 2.

Seja qual for a rota tecnológicaescolhida, a transesterificação deóleos vegetais corresponde a umareação reversível, cuja cinética é


regida pelo princípio enunciado em1888 pelo químico francês Henry-Louis Le Chatelier (1850-1936) (Fi-gura 1). Portanto, o rendimento dareação dependerá do deslocamen-to do equilíbrio químico em favordos ésteres, através da otimizaçãode fatores, tais como a temperaturade reação, a concentração e caráterácido-base do catalisador, bemcomo o excesso estequiométricodo agente de transesterificação (ál-cool). Porém, conversões totais se-rão literalmente impraticáveis emuma única etapa reacional, pois,além de reversível, tem-se a ocor-rência de reações secundárias comoa saponificação. Para limitar a pre-sença de triacilgliceróis não reagi-dos além dos limites tolerados pelomotor, muitos processos recorrem

à condução da reação em duas eta-pas seqüenciais, que garantam ta-xas de conversão superiores a 98%.Por outro lado, a eliminação desabões, catalisador residual eglicerol livre somente é possívelatravés de etapas eficientes de la-vagem.

De acordo com a literatura, areação de obtenção do éster metílicoexige um excesso estequiométrico demetanol igual a 100% (razão molarálcool:óleo de 6:1), e uma quantidadede catalisador alcalino equivalente a0,5% a 1,0% em relação à massa deóleo, para que sejam obtidos rendi-mentos superiores a 95% (Freedmanet al., 1986). No entanto, duas obser-vações limitam a simples aplicação deuma recomendação como esta: (a)primeiramente, a matéria-prima a ser

utilizada em cada região é diferente eisso implica na necessidade de estu-dos localizados, que permitam umaotimização realística ligada a avalia-ções confiáveis de toda a cadeia pro-dutiva; e (b) as condições utilizadaspara a reação de metanólise não po-dem ser transferidas para situaçõesem que outros álcoois, como o etanol,sirvam de modelo. Com efeito, a tran-sesterificação com metanol é tecnica-mente mais viável do que a cometanol comercial, porque a água exis-tente no etanol (4%-6%) retarda areação. O uso de etanol anidro efeti-vamente minimiza esse inconvenien-te (Figura 2), embora não impliquesolução para o problema inerente àseparação da glicerina do meio dereação que, no caso da síntese doéster metílico, é indiscutivelmentemuito mais facilitada (Freedman et al.,1986; Schuchardt et al., 1998; Ramos,1999). No entanto, basta um ajuste nascondições de reação para que a sepa-ração de fases aconteça espontanea-mente, sendo que a eficiência doprocesso de decantação (da fraçãoglicerínica) pode ser acelerada pelouso de centrífugas contínuas, auxilia-das ou não pela adição de compostostensoativos (Ramos, 2003).

O processo de produção de bi-odiesel deve reduzir ao máximo apresença de contaminações no pro-duto, como glicerina livre e ligada,sabões ou água (Figura 2). No casoda glicerina, reações de desidrata-ção que ocorrem durante a combus-tão podem gerar acroleína, umpoluente atmosférico muito perigo-so, que pode, devido a suareatividade, envolver-se em reaçõesde condensação, que acarretam umaumento na ocorrência de depósitosde carbono no motor (Mittelbach etal., 1985). Sabões e ácidos graxoslivres acarretam a degradação decomponentes do motor, e a umida-de, desde que acima de um limitetolerável, pode interferir na acidezdo éster por motivar a sua hidrólisesob condições não ideais de estoca-gem. Por essas e outras razões, éimprescindível que sejam definidasespecificações rígidas para o biodi-esel, de forma que o sucesso doprograma não venha a ser compro-

Figura 2. Fluxograma simplificado de produção de ésteres etílicos a partir de óleosvegetais e gordura animal.


metido por ocorrências associadasao mau controle de qualidade doproduto.

Independentemente da rotatecnológica, a aceitação do biodie-sel no mercado precisa ser assegu-rada e, para isso, é indispensávelque esse produto esteja dentro dasespecificações internacionalmenteaceitas para o seu uso. No Brasil,esses parâmetros de qualidade en-contram-se pré-fixados pela Porta-ria no. 255 da ANP, cuja proposta foibaseada em normas já existentes naAlemanha (DIN) e nos Estados Uni-dos (ASTM). Tais características e/ou propriedades, determinantes dospadrões de identidade e qualidadedo biodiesel, incluem ponto de ful-gor, teor de água e sedimentos,viscosidade, cinzas, teor de enxo-fre, corrosividade ao cobre, núme-ro de cetano, ponto de névoa, resí-duo de carbono, número de acidez,curva de destilação (ou a tempera-tura necessária para a recuperaçãode 90% do destilado), estabilidadeà oxidação, teor de glicerina livre etotal, cor e aspecto (Agência Naci-onal do Petróleo, 2003). Dentreesses parâmetros, alguns têm mere-cido críticas da comunidade cientí-fica por não apresentarem aplica-ção direta ao biodiesel, como oíndice de corrosividade ao cobre ea curva de destilação. Por essa ra-zão, a especificação definida pelaportaria é ainda provisional e pode-rá ser modificada em função denovas argumentações e dados ex-perimentais gerados pela comuni-dade científica.

Um aspecto extremamente im-portante da Portaria no 255 da ANPestá relacionado com as limitaçõesque oferece para o aproveitamentode todos os óleos vegetais que seencontram disponíveis no territórionacional. No entanto, é importanteesclarecer que a especificação defi-ne a qualidade do produto a serutilizado puro, ou seja, sem a suadiluição com diesel de petróleo.Por outro lado, se a concepção doprograma nacional é a de facultar ouso de misturas dos tipos de B2 aB20, restringindo o uso de B100apenas a situações especiais (como

na geração de energia elétrica emgrupo-geradores), talvez fosse ade-quada (e possível) a flexibilizaçãodas especificações com vistas a umamaior inserção das diferentes olea-ginosas que compõem o conjuntode alternativas regionais de nossoterritório. Essa flexibilização esta-ria, portanto, restrita somente aouso do biodiesel em misturas, va-lendo-se do fator de diluição que arazão volumétrica definida pelamistura proporciona (Ramos, 2003).Vale ressaltar que a adição de umbiodiesel de qualidade ao diesel,até um limite de 20% (B20), nãomodifica drasticamente as suas pro-priedades e não o desqualifica pe-rante a Portaria no. 310 da ANP, cujoconteúdo estabelece as especifica-ções para comercialização de óleodiesel automotivo em todo o terri-tório nacional. Obviamente, tal hi-pótese precisa ser estudada em to-das as suas implicações, pois preci-sam ser dadas garantias para que acredibilidade do programa não so-fra o impacto de serem considera-das experiências mal sucedidaspossíveis falhas no funcionamentodo motor e o subseqüente aumentonos seus custos de manutenção.

Da mesma forma como foramdefinidos alguns aspectos agronô-micos essenciais para que um deter-minado óleo vegetal apresente com-petitividade como matéria-primapara a produção de biodiesel, im-portantes aspectos tecnológicos tam-bém precisam ser atendidos e estesestão relacionados: (a) à complexi-dade exigida para o processo deextração e tratamento do óleo; (b) àpresença de componentes indesejá-veis no óleo, como é o caso dosfosfolipídeos presentes no óleo desoja; (c) ao teor de ácidos graxospoli-insaturados; (d) ao tipo e teorde ácidos graxos saturados; e (e) aovalor agregado dos co-produtos,como hormônios vegetais, vitami-nas, anti-oxidantes, proteína e fibrasde alto valor comercial.

Diferentes oleaginosas apre-sentam diferentes teores em óleosvegetais (Tabela 1) e a complexida-de exigida para a extração do óleopode contribuir negativamente para

a viabilidade do processo (Alsberge Taylor, 1928). Oleaginosas debaixo teor de óleo, como a soja,exigem procedimentos de extraçãocaros e relativamente complexosque praticamente restringem a via-bilidade dessa matéria-prima àque-las regiões em que já exista umarazoável capacidade instalada parao esmagamento de grãos. Porém,oleaginosas de maior teor em óleosvegetais, cujos processos de extra-ção sejam mais simplificados, cer-tamente apresentarão melhor com-petitividade econômica por não exi-girem a instalação de operaçõesunitárias complexas para esse obje-tivo. Por outro lado, a qualidade doóleo poderá exigir uma etapa derefino para que também a qualida-de no produto final seja garantida.Esse é certamente o caso da soja,que depende do refino para reduzira presença de gomas e fosfolipíde-os no biodiesel. Mais uma vez, éprovável que essa observação te-nha pouco significado para regiõesonde a agroindústria da soja estejaverticalizada ao óleo refinado, mas,onde não haja esse potencialagroindustrial, seria desejável queas matérias-primas selecionadaspara a produção não apresentas-sem tal limitação e pudessem sofrera alcoólise sem exigir a implanta-ção de uma unidade de refino. Háevidências de que alguns óleos ve-getais podem oferecer essa vanta-gem, como os de girassol e devárias espécies de palmáceas (óle-os laurílicos).

O tipo e o teor de ácidos graxospresentes no óleo vegetal (Tabela1) têm um efeito marcante sobre aestabilidade do biodiesel diante doarmazenamento e da oxidação. Porexemplo, quedas bruscas na tem-peratura ambiente promovem o au-mento da viscosidade e a cristaliza-ção de ésteres graxos saturadosque, eventualmente, podem causaro entupimento de filtros de óleo esistemas de injeção. A tendência à“solidificação” do combustível émedida através dos pontos de né-voa e de fluidez (ou de entupimen-to), que devem ser tanto mais baixoquanto possível. Abaixamentos no


ponto de fluidez, muitas vezes mo-tivados pela aditivação de inibido-res de cristalização (Stournas etal., 1995; Ramos, 2003), represen-tam menores restrições do biocom-bustível à variações de temperatu-ra, evitando problemas de estoca-gem e de utilização em regiõesmais frias. Obviamente, esse pro-blema não é exclusivo do biodiesel,pois o diesel de petróleo contémparafinas que apresentam tipica-mente o mesmo comportamento.

A formação de depósitos porprecipitação também ocorre em fun-ção do envelhecimento e/ou oxida-ção do biodiesel. Testes realizadospela Bosch (Dabague, 2003), emparceria com a ANFAVEA (Associa-ção Nacional dos Fabricantes deVeículos Automotores), AEA (Asso-ciação Brasileira de EngenhariaAutomotiva) e Sindipeças (Sindica-to Nacional da Indústria de Compo-nentes para Veículos Automotores),constataram que a degradaçãooxidativa do biodiesel gera resinifi-cação que, por aderência, constituiuma das principais causas da for-mação de depósitos nos equipa-mentos de injeção. Em decorrênciadesse fenômeno, foi também ob-servada uma queda no desempe-nho, aumento da susceptibilidade àcorrosão e diminuição da vida útildos motores.

O ranço oxidativo está direta-mente relacionado com a presençade ésteres monoalquílicos insatura-dos. Trata-se da reação do oxigênioatmosférico com as duplas ligaçõesdesses ésteres, cuja reatividade au-menta com o aumento do númerode insaturações na cadeia (Morettoe Fett, 1989). Assim, por ser relati-vamente insaturado, o biodiesel de-rivado do óleo de soja é muitosusceptível à oxidação. Os ácidoslinoleico e linolênico, que, juntos,correspondem a mais de 61% dacomposição desse óleo, apresen-tam, respectivamente, duas e trêsduplas ligações, que podem reagirfacilmente com o oxigênio.

A oxidação de óleos insatura-dos representa um processo relati-vamente complexo que envolve re-ações entre radicais livres e oxigê-

nio molecular. Todo esse processoé geralmente resumido em três eta-pas, denominadas de iniciação, pro-pagação e finalização. O processode polimerização pode ser iniciadopor traços de metais, calor (termó-lise), luz (fotólise) ou radicaishidroxila e hidroperoxila, geradospela cisão homolítica de moléculasde água expostas à radiação(Kumarathasan et al., 1992).

Os peróxidos e hidroperóxi-dos produzidos através da reaçãode auto-oxidação podem se poli-merizar com outros radicais e pro-duzir moléculas de elevada massamolar, sedimentos insolúveis, go-mas e, em alguns casos, pode que-brar a cadeia do ácido graxo oxida-do, produzindo ácidos de cadeiasmenores e aldeídos (Prankl eSchindlbauer, 1998). Estudos ante-riores (Clark et al., 1984; Tao, 1995;System Lab Services, 1997) consta-taram que a formação desses ácidospode estar ligada à corrosão dosistema combustível dos motoresporque, devido à alta instabilidadedos hidroperóxidos, eles apresen-tam forte tendência a atacarelastômeros.

A maioria dos trabalhos até en-tão realizados sobre a estabilidadediante da oxidação do biodiesel re-ferem-se ao estudo de ésteresmetílicos (Prankl e Schindlbauer,1998; Ishido et al., 2001; Pedersen eIngermarsson, 1999), visto que amaioria dos países que instituíram ouso desse biocombustível não apre-senta disponibilidade nem infra-es-trutura para produzir etanol como oBrasil. Esses trabalhos têm confir-mado que, de um modo geral, obiodiesel de natureza metílica seoxida após curtos períodos de esto-cagem, e que sua inércia químicaestá diretamente relacionada comos óleos vegetais empregados nasua produção (Prankl e Schindlbauer,1998).

Um dos meios mais comumenteutilizados para se inferir sobre asusceptibilidade de um determina-do óleo à oxidação é a avaliação deseu número de iodo. O número deiodo revela o número de insatura-ções de uma determinada amostra e

esse valor constitui um dos parâme-tros de identidade dos óleos vege-tais. Sendo assim, diferentes tiposde biodiesel apresentam númerosde iodo semelhantes aos dos trigli-cerídeos de origem. No entanto,deve-se salientar que, quando oobjetivo é avaliar a estabilidade àoxidação de um dado óleo, as infor-mações obtidas através desse mé-todo não são adequadas, pois onúmero de iodo não discrimina quecompostos estão contribuindo parao valor encontrado. Desse modo,há óleos diferentes com númerosde iodo semelhantes, porém, comestabilidades à oxidação considera-velmente distintas. Para se inferirprevisões acerca da estabilidade àoxidação de um dado óleo é, por-tanto, necessário que se conheça asua composição percentual em áci-dos graxos, o que só é possívelatravés do emprego de métodoscromatográficos de análise.

Somente através do conheci-mento pleno das propriedades quedeterminam os padrões de identi-dade e a qualidade do biodiesel éque será possível estabelecer pa-râmetros de controle que garanti-rão a qualidade do produto a serincorporado na matriz energéticanacional.

6 - Aspectos ambientaisrelacionados com o uso do

biodiesel

Sabe-se que o aumento na con-centração dos gases causadores doefeito estufa, como o dióxido decarbono (CO

2) e o metano (CH

4), tem

acarretado sérias mudanças climáti-cas no planeta. Efeitos como o au-mento da temperatura média global,as alterações no perfil das precipita-ções pluviométricas e a elevação donível dos oceanos poderão ser catas-tróficos frente à contínua tendênciade aumento da população mundial(Peterson e Hustrulid, 1998; Shay,1993). Nesse sentido, a inserção decombustíveis renováveis em nossamatriz energética precisa ser incenti-vada para frear as emissões causadaspelo uso continuado de combustí-veis fósseis.


Vários estudos têm demonstra-do que a substituição do diesel depetróleo por óleos vegetais transes-terificados reduziria a quantidadede CO

2 introduzida na atmosfera. A

redução não se daria exatamente naproporção de 1:1, pois cada litro debiodiesel libera cerca de 1,1 a 1,2vezes a quantidade de CO

2 liberada

na atmosfera por um litro de dieselconvencional. Todavia, diferente-mente do combustível fóssil, o CO

2

proveniente do biodiesel é recicladonas áreas agricultáveis, que geramuma nova partida de óleo vegetalpara um novo ciclo de produção.Isso acaba proporcionando um ba-lanço muito mais equilibrado entre amassa de carbono fixada e aquelapresente na atmosfera que, por suavez, atua no chamado efeito estufa.Portanto, uma redução real noacúmulo de CO

2 somente será pos-

sível com a diminuição do uso dederivados do petróleo. Para cadaquilograma de diesel não usado, umequivalente a 3,11 kg de CO

2, mais

um adicional de 15% a 20%, referen-te à sua energia de produção, deixa-rá de ser lançado na atmosfera. Foitambém estimado que a reduçãomáxima na produção de CO

2, devi-

do ao uso global de biodiesel, seráde, aproximadamente, 113-136 bi-lhões de kg por ano (Peterson eHustrulid, 1998).

A utilização de biodiesel notransporte rodoviário e urbano ofe-rece grandes vantagens para o meioambiente, tendo em vista que aemissão de poluentes é menor que ado diesel de petróleo (Masjuk eSapuan, 1995; Clark et al., 1984).Chang et al. (1996) demonstraramque as emissões de monóxido edióxido de carbono e materialparticulado foram inferiores às dodiesel convencional, enquanto queos níveis de emissões de gases nitro-genados (NOx) foram ligeiramentemaiores para o biodiesel. Por outrolado, a ausência total de enxofreconfere ao biodiesel uma grandevantagem, pois não há qualqueremissão dos gases sulfurados (e.g.,mercaptanas, dióxido de enxofre)normalmente detectados no escapedos motores movidos a diesel.

Outro aspecto de interesse am-biental está relacionado com as emis-sões de compostos sulfurados. Sabe-se que a redução do teor de enxofreno diesel comercial também reduz aviscosidade do produto a níveis nãocompatíveis com a sua especificaçãoe que, para corrigir esse problema,faz-se necessária a incorporação deaditivos com poder lubrificante. Con-sumada a obrigatoriedade na redu-ção dos níveis de emissão de com-postos sulfurados a partir da combus-tão do diesel, a adição de biodieselem níveis de até 5% (B5) corrigiráesta deficiência viscosimétrica, queconfere à mistura propriedades lubri-ficantes vantajosas para o motor.

Trabalhos já desenvolvidos noBrasil na década de 80, quandoforam utilizados vários óleos vege-tais transesterificados, também de-monstraram bons resultados quan-do utilizados em motores de cami-nhões e tratores, tanto puros quan-to em misturas do tipo B30 (Minis-tério da Indústria e do Comércio,1985). Mais recentemente, foramrealizados testes no transporte ur-bano da cidade de Curitiba comésteres metílicos de óleo de soja(Laurindo, 2003). Cerca de 80 millitros de biodiesel foram cedidospela American Soybean Association(EUA) e testados na forma da mis-tura B20, apresentando resultadosbastante satisfatórios em relação aocontrole. Os testes foram realiza-dos em 20 ônibus de diferentesmarcas durante três meses conse-cutivos, no primeiro semestre de1998; ao final dos trabalhos, osresultados obtidos mostraram umaredução média da fumaça emitidapelos veículos de, no mínimo, 35%(Laurindo e Bussyguin, 1999).

O caráter renovável do biodieselestá apoiado no fato de as matérias-primas utilizadas para a sua produçãoserem oriundas de fontes renováveis,isto é, de derivados de práticas agríco-las, ao contrário dos derivados depetróleo. Uma exceção a essa regradiz respeito à utilização do metanol,derivado de petróleo, como agentetransesterificante, sendo esta a maté-ria-prima mais abundantemente utili-zada na Europa e nos Estados Unidos.

Isso significa que a prática adotada noBrasil, isto é, a utilização do etanol,derivado de biomassa, torna o biodi-esel um produto que pode ser consi-derado como verdadeiramenterenovável (Zagonel, 2000). Assim, porenvolver a participação de vários seg-mentos da sociedade, tais como ascadeias produtivas do etanol e dasoleaginosas, a implementação do bio-diesel de natureza etílica no mercadonacional abre oportunidades para gran-des benefícios sociais decorrentes doalto índice de geração de empregos,culminando com a valorização do cam-po e a promoção do trabalhador rural.Além disso, há ainda as demandas pormão-de-obra qualificada para o pro-cessamento dos óleos vegetais, per-mitindo a integração, quando neces-sária, entre os pequenos produtores eas grandes empresas (Campos, 2003).

5 - Conclusão

A intensidade com que o temabiodiesel tem sido abordado em reu-niões políticas, científicas e tecnoló-gicas tem dado testemunho do inte-resse com que a sociedade e o setorprodutivo vem encarando essa novaoportunidade de negócios para opaís. Com efeito, diante de tantosbenefícios, como a criação de novosempregos no setor agroindustrial, ageração de renda, o fomento aocooperativismo, a perspectiva decontribuição ao equilíbrio de nossabalança comercial e pelos compro-vados benefícios ao meio ambiente,pode-se dizer que o biodiesel tempotencial para constituir um dos prin-cipais programas sociais do governobrasileiro, representando fator dedistribuição de renda, inclusão soci-al e apoio à agricultura familiar. Noentanto, neste momento em que asbases do programa nacional estãosendo ainda definidas, o desenvol-vimento de projetos de cunho cien-tífico e tecnológico, que possamoferecer maior segurança aos nos-sos tomadores de decisão, é, nomínino, estrategicamente imprescin-dível ao país.

No que diz respeito à evoluçãodo programa nacional de biocom-bustíveis, algumas ações governa-


mentais poderiam ser de extremaimportância para acelerar o atendi-mento às suas principais metas tec-nológicas: (a) instalação de umaunidade-piloto, desinteressada dequalquer ganho comercial e prefe-rencialmente estabelecida em par-ceria com instituições públicas depesquisa e desenvolvimento, paraauxiliarem nos estudos de viabili-dade técnica e econômica do biodi-esel; (b) estabelecimento das espe-cificações a serem exigidas para olicenciamento do produto (proces-so já iniciado pela ANP, através daPortaria no. 255); (c) ampliaçãodos testes em frota cativa para diri-mir quaisquer dúvidas que aindapersistam sobre o desempenho e aviabilidade do biodiesel, particu-larmente de natureza etílica, sejapuro ou em misturas do tipo B2 aB20; e (d) abertura de linhas definanciamento para o desenvolvi-mento de novas rotas tecnológicas,com vistas a simplificar e/ou aotimizar o processo, a ampliaçãodas perspectivas para a utilizaçãode seus subprodutos e a diversifica-ção da matéria-prima para atendera vocações regionais.

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Pesquisa

BiofertilizantesLíquidos

Marcos Barros de MedeirosDoutor em Entomologia - ESALQ/USPProfessor Adjunto Centro de Formação deTecnólogos / UFPB - Campus de [email protected];[email protected]

Paulo Alves WanderleyDoutor em Agronomia - FCAV/UNESP,Professor nível E do Centro de Formação deTecnólogos / UFPB - Campus de Bananeiras

Maria José Araújo WanderleyDoutora em Agronomia - FCAV/UNESP,Bolsista de Desenvolvimento Científico RegionalCNPq, UFPB Departamento de Ciências Básicas eSociais, Campus de Bananeiras


Processo trofobiótico para proteção de plantas em cultivos orgânicos

1 - Introdução

Nos países desenvolvidos e emvários outros em desenvolvimento,como o Brasil, os organoclorados fo-ram proibidos para o uso agrícola.Porém, essa foi apenas uma medidaisolada, uma vez que tais produtoscirculam hoje por toda a biosfera(Paschoal, 1995). O uso de produtosquímicos sem a observação da com-plexidade de fatores que interagemnos agroecossistemas tem sido a mai-or causa de desequilíbrio nesses siste-mas, tais como o desenvolvimento deresistência ao pesticida, ressurgimen-to e desencadeamento de pragas se-cundárias e quebra de cadeias alimen-tares a partir da eliminação de seusinimigos naturais (parasitóides e pre-dadores) (Medeiros, 1998).

Até 1945 os ácaros fitófagos eramtidos como pragas secundárias daagricultura. No entanto, o desenvol-vimento destas espécies nocivas vematingindo, cada vez mais, uma eleva-da significação econômica, ao mes-mo tempo em que sua lista não párade crescer. Antes de 1946, haviaapenas 10 espécies de insetos e car-rapatos resistentes, todas a produtosinorgânicos minerais. Em 1969 a re-sistência foi confirmada para 424 es-pécies, sendo 97 de importânciamédica ou veterinária e 127 de im-portância agrícola e florestal e deprodutos armazenados (Paschoal,1979; Chaboussou 1980). Na décadade 90, pelo menos 504 espécies deinsetos e ácaros foram dadas comoresistentes a pelo menos um pesticida.Destas, 23 espécies são benéficas e481 são nocivas, sendo 283 de impor-

tância agrícola e 198 de importânciamédico-veterinária (Georghiou &Lagunes-Tejeda, 1991).

Uma nova teoria, hoje ampla-mente difundida, converge ao expli-car que, além destes fatores, estesdesequilíbrios também estão forte-mente associados ao estado deproteólise dominante nos tecidos daplanta. Estudos comprovam que pro-dutos químicos sintéticos, tais comoagrotóxicos e fertilizantes mineraissolúveis, contêm substâncias que in-terferem na proteossíntese, provocamo acúmulo de aminoácidos livres eaçúcares redutores nos tecidos da plan-ta, reduzindo sua resistência às pragase doenças (Alves et al., 2001;Chaboussou, 1999; Tokeshi, 2002).

Segundo Primavesi (1998), trêscondições são necessárias para queuma planta seja atacada por pragas edoenças: 1) a planta deve ser defici-entemente nutrida, oferecendo algu-ma substância utilizável para o agen-te; 2) o agente possa se multiplicarlivremente sem controle biológico, oque ocorre mais facilmente emmonoculturas; 3) o sistema de auto-defesa da planta deve estar desequi-librado, em função da nutrição e douso de agrotóxicos. Estes princípiosconvergem com os fundamentadospor Francis Chaboussou, então dire-tor do “Institut National de laRecherche Agronomique” (INRA) naFrança, que em 1979 formulou aTeoria da Trofobiose. Segundo essateoria, todo processo vital está nadependência da satisfação das ne-cessidades dos organismos vivos,sejam eles vegetais ou animais. Des-sa forma, a planta, ou mais precisa-


mente o órgão vegetal, será atacadosomente quando seu estado bioquí-mico, determinado pela natureza epelo teor de substâncias nutritivassolúveis, corresponder às exigênciastróficas (de alimentação) da praga oudo patógeno em questão.

Estudando-se a relação entre oestado nutricional de plantas e suaresistência às doenças constatou-seque toda circunstância desfavorávelao crescimento celular tende a pro-vocar um acúmulo de compostossolúveis não utilizados, como açú-cares e aminoácidos, diminuindo aresistência da planta ao ataque depragas e doenças (Dufrenoy, 1936).Comprovou-se mais tarde que a açãodos agrotóxicos na planta resulta nainibição da proteossíntese, resultan-do num aumento de ácaros, pulgõese lepidópteros e de doenças(Chaboussou, 1999; Tokeshi, 2002).Espécies de pulgões, cochonilhas,cigarrinhas, cigarras, tripes, outrosinsetos sugadores e várias espéciesde ácaros fitófagos, não são capazesde desdobrar proteínas em aminoá-cidos para serem posteriormenterecombinados à conveniência decada um. Por isso, eles dependemde aminoácidos livres existentes naseiva das plantas ou suco celular ede microrganismos simbiontes(Chaboussou, 1980; Panizzi & Parra,1991; Pinheiro & Barreto, 1996; Gallo

et al., 2002) Os adubos mineraissolúveis, especialmente os nitroge-nados, e os agrotóxicos orgânicossintéticos, que quando absorvidospelas plantas e translocados em seuinterior, são capazes de interferircom a fisiologia vegetal, reduzem aproteossíntese, desencadeando pro-cesso de acúmulo de aminoácidoslivres e açúcares redutores, substân-cias prontamente utilizáveis pelaspragas e agentes fitopatogênicos, oque foi correlacionado positivamen-te com o aumento populacional des-ses organismos (Chaboussou, 1985).

Na agricultura orgânica o uso debiofertilizantes líquidos, na forma defermentados microbianos enriqueci-dos, têm sido um dos processos maisempregados no manejo trofobióticode pragas e doenças. Essa estratégiaé baseada no equilíbrio nutricionalda planta (trofobiose), onde a resis-tência é gerada pelo melhor equilí-brio energético e metabólico do ve-getal (Chaboussou, 1985; Pinheiro &Barreto, 1996). Os biofertilizantes fun-cionam como promotores de cresci-mento (equilíbrio nutricional) e comoelicitores na indução de resistênciasistêmica na planta. Além disso, aju-dam na proteção da planta contra oataque de doenças, por antibiose(Bettiol et al, 1998) e contra o ataquede pragas, por ação repelente,fagodeterrente (inibidores de alimen-

tação) ou afetando o seu desenvolvi-mento e reprodução.

2 - Biofertilizantes líquidose sua aplicação na

proteção de plantas

Os biofertilizantes possuem com-postos bioativos, resultantes dabiodigestão de compostos orgânicosde origem animal e vegetal. Em seuconteúdo são encontradas células vi-vas ou latentes de microrganismosde metabolismo aeróbico, anaeróbicoe fermentação (bactérias, leveduras,algas e fungos filamentosos) e tam-bém metabólitos e quelatos organo-minerais em soluto aquoso. SegundoSantos & Akiba (1996), os metabólitossão compostos de proteínas, enzimas,antibióticos, vitaminas, toxinas,fenóis, ésteres e ácidos, inclusive deação fitohormonal produzidos e libe-rados pelos microrganismos.

Na citricultura paulista, os bio-fertilizantes vêm sendo produzidospelo método de compostagem líqui-da contínua em “piscinas” escavadasno solo, revestidas de lona plásticade polietileno, com capacidade deaté 50 mil litros. No processo sãoutilizados água não clorada e oinoculante à base de esterco frescobovino, e posteriormente enriqueci-do com um composto orgânico nutri-tivo. O Microgeo é um compostoorgânico, com registro no Ministérioda Agricultura e certificado pelo IBD,preparado à base de diversas fontesorgânicas e inorgânicas, sendo enri-quecido com rochas moídas que con-têm cerca de 48% de silicatos demagnésio, cálcio, ferro e outrosoligoelementos, fundamentais paraestimulação do metabolismo primá-rio e secundário das plantas. Segun-do Alves et al. (2001) biofertilizantesobtidos com o Microgeo vêm sendoutilizados, em pulverização sobre asplantas, em mais de 8 milhões de pésde laranja no estado de São Paulo.

A potência biológica de um bio-fertilizante é expressa pela grandequantidade de microrganismos aliexistentes, responsáveis pela libera-ção de metabólitos e antimetabólitos,entre eles vários antibióticos ehormônios vegetais. Castro et al.(1992) e Bettiol et al. (1998) isolaram

Figura 01. Simulação da cinética de crescimento celular e da produção de metabólitosao longo da fermentação aeróbica do biofertilizante no processo de CLC. Metabólitosprimários: (Etapas de anabolismo e catabolismo): Açúcares, aminoácidos, ácidosgraxos, proteínas, lipídeos, bases nitrogenadas (nucleotídeos e ácidos nucleicos),precursores moleculares etc. Metabólitos secundários: (Biossíntese de macro-moléculas de elevado peso molecular): toxinas, antibióticos, fitoreguladores (IAAe giberelinas), ácidos graxos de cadeia longa, fosfolipídeos, polissacarídeos, terpenosfenóis, polifenois, citoquininas, etc.


várias leveduras e bactérias, desta-cando Bacillus subitilis, reconhecidoprodutor de antibióticos. Atualmenteos biofertilizantes vêm sendo aplica-dos em diversas culturas associadascom o fungo entomopatogênicoBeauveria bassiana, importante ini-migo natural de pragas.

Os efeitos do biofertilizante nocontrole de pragas e doenças de plantastêm sido bem evidenciados. Efeitosfungistático, bacteriostático e repelentesobre insetos já foram constatados. San-tos & Sampaio (1993) verificaram umapropriedade coloidal do biofertilizanteque provoca a aderência do insetosobre a superfície do tecido vegetal. Osautores destacaram também o efeitorepelente e deterrente de alimentaçãocontra pulgões e moscas-das-frutas.Medeiros et al. (2000b) verificaram queo biofertilizante à base de conteúdo derúmen bovino e o composto orgânicoMicrogeoÒ reduziu a fecundidade, perí-odo de oviposição e longevidade defêmeas do ácaro-da-leprose dos citros,Brevipalpus phoenicis, quando pulveri-zado em diferentes concentrações. Es-ses mesmos autores comprovaram queeste biofertilizante agiu sinergicamentecom Bacillus thuringiensis e o fungo B.bassiana, reduzindo a viabilidade dosovos e sobrevivência de larvas do bi-cho-furão-dos-citros (Ecdytolophaaurantiana) (Medeiros et al. 2000c).

Estudos recentes comprovaram a redu-ção de até 95% da fecundidade do ácarorajado Tetranychus urticae, de hábitopolífago, em concentrações entre 5 e50% (Medeiros et al., 2000a; Berzaghi etal., 2001). Também verificou-se redu-ção de até 64% da população do pulgãoAphis sp., quando utilizado o biofertili-zante (10%) associado aos inseticidasBoveril® e Metarril®, 5 kg/ha, em cultivode acerola (Medeiros et al., 2001). Apli-cações do biofertilizante associadas àcalda viçosa ou com o Bacillusthuringiensis reduziram significativa-mente o ataque da traça (Tuta absoluta)e a broca pequena (Neoleucocinodeselegantalis) em tomateiros (Picanço etal., 1999; Nunes & Leal, 2001). Tambémfoi constatado menor severidade deoídio e de cigarrinha verde em plantasde feijoeiro pulverizadas com diferen-tes misturas de biofertilizantes (Cunhaet al., 2000). Trabalhos conduzidos porMedeiros (2002) no Laboratório de Pa-tologia e Controle Microbiano de Inse-tos da ESALQ/USP comprovaram que obiofertilizante líquido reduziu de modocrônico e significativamente a fecundi-dade e o potencial de crescimento po-pulacional e o tempo de desenvolvi-mento de descendentes dos ácaros daleprose dos citros Brevipalpus phoenicis,criados sobre plantas tratadas com bio-fertilizantes. O estudo comprovou queo biofertilizante testado agiu por conta-

to direto e residual e também funcionoude forma sistêmica na planta.

A ação antibiótica e indução deresistência sistêmica da planta sãoprovavelmente os principais meca-nismos de ação do biofertilizantesobre a praga (DÁndréa & Medeiros,2002). Os fenômenos podem estardiretamente associados à complexae pouco conhecida composição quí-mica e biológica dos biofertilizantes.Compostos metabólitos (micro emacromoléculas), tais como enzimas,antibióticos, vitaminas, toxinas, fenóise outros voláteis, ésteres e ácidos,inclusive de ação fitohormonal têmsido identificados nos biofertilizan-tes (Santos, 1992). Um compostocoloidal, de consistência mucilagino-sa (goma) e de composição aindanão conhecida, foi observado porMedeiros (2002) causando a imobili-zação e morte do ácaro B. phoenicissobre a folha devido à obstrução deseu sistema digestivo.

3 - Processos envolvidos naprodução de

biofertilizantes

Não existe uma fórmula padrãopara produção de biofertilizantes.Receitas variadas vêm sendo testadas,utilizando-se componentes mineraispara o enriquecimento do meio decultivo (Santos, 1992; Magro, 1994).

O processo de fermentação écomplexo e os microrganismos exis-tentes passam quatro fases distintasde crescimento celular: 1) Latência -Compreende o período de adaptaçãodos microrganismos, após o qual ascélulas dão início à fermentação. 2)Crescimento exponencial – Nessa faseocorre elevado processo de divisãocelular, com a produção de biomassae liberação dos metabólitos primári-os: carboidratos, aminoácidos,lipídeos, nucleotídeos, vitaminas eproteínas e enzimas. 3) Fase estacio-nária – As células param de se dividire as colônias, após juntarem-se, inici-am um processo de diferenciaçãocelular produzindo metabólitos se-cundários como forma de defesa (an-tibióticos, toxinas, fenóis, ácidos or-gânicos e outras proteínas de cadeialonga, de alto interesse biotecnológi-co). 4) Morte Celular-Esgotadas to-

Figura 2. Produção de biofertilizantes pelo sistema de compostagem líquida contínuaa céu aberto, em recipientes plásticos.


das as reservas de energia, as célulascomeçam a morrer numa velocidadeexponencial.

Cada microrganismo participan-te degrada alimento para outro, numarelação de interdependência mútua eharmônica e, assim, o processo defermentação acaba sendo contínuo,desde que seja alimentado com meionutritivo, o que fundamentou o pro-cesso de compostagem líquida des-crito por D’Andréa & Medeiros (2002).

4 - Produção dobiofertilizante pelo

processo de CompostagemLíquida Contínua (CLC)

4.1 - Dimensionamento daProdução

Tanques para compostagem dobiofertilizante podem ser utilizadospara volumes de até 1.000 litros, cai-xas de fibrocimento ou plásticas. Paravolumes maiores constrói-se direta-mente no solo, ‘piscinas’ com as di-mensões do volume pretendido, ecom a profundidade máxima de ummetro, as quais são revestidas comlona plástica. A localização do tanquedeve ser em área ensolarada, manten-do-o descoberto. Para o dimensiona-mento do volume do tanque, deveráser considerado um consumo diário

máximo de 10% de biofertilizante, dasua capacidade. Exemplo: Para umconsumo diário de 100 litros de bio-fertilizante, o tanque deverá ter ovolume de 1.000 litros.

4.2- CLC com uso de esterco ecomposto orgânico enriquecido

Início da CLC: Para início daprodução do biofertilizante, adiciona-se no tanque o esterco fresco de gado(inoculante), um composto orgânicoenriquecido com minerais (Ex.:MICROGEO MCO) e água (nãoclorada). No caso do Microgeo,pesquisado e desenvolvido pela equi-pe do Laboratório de Patologia e Con-trole Microbiano da ESALQ, o preparoé feito nas seguintes proporções:1,0quilo do composto orgânico / 4,0litros esterco de gado / 20,0 litros água(completando o volume ). Exemplo:Para a produção de 1.000 litros debiofertilizante, adiciona-se no tanque50 quilos do composto, mais 200 litrosde esterco de gado de qualquer ori-gem, completando com água ovolume de 1.000 litros do tanque.Agitar duas vezes ao dia manualmen-te com um ‘rodo’, que também permi-tirá determinar a espessura da camadaorgânica (biomassa) depositada nofundo do tanque, com o objetivo de sequantificar a reposição do esterco de

gado no processo CLC. Iniciar o usodo biofertilizante com aproximada-mente 15 dias, após a mistura inicialdos insumos. Manutenção da CLC:Para manter a compostagem em meiolíquido de forma contínua, contabilizardiariamente os volumes de biofertili-zante consumidos repondo no tanqueos insumos nas seguintes proporções:a) Reposição do composto orgânico:para cada 30,0 a 40,0 litros de biofer-tilizante usado, repor 1,0 quilo docomposto/inoculante. O intervalo dereposição poderá ser semanal atémensal, ou seja, intervalos menoresquanto maior o volume de biofertili-zante utilizado. b) Reposição do ester-co de gado: adicionar um volume deesterco de gado (fresco) suficientepara manter a mesma proporçãobiomassa/ água do início do proces-so, sempre quando se verificar comajuda do ‘rodo’ a diminuição da cama-da orgânica no fundo do tanque. c)Reposição da água: está em função dovolume de biofertilizante consumido,da evaporação e das chuvas. O volu-me de água a ser adicionado deveráser o suficiente para a manutenção donível inicial do tanque. A freqüênciade reposição poderá ser diária, usan-do-se registro bóia ou até mensal,também em função do volume debiofertilizante usado. Nos períodos dechuvas, recomenda-se fechar os tan-ques de até 1.000 litros nos momentosde ocorrência delas. Manter descober-tos os tanques maiores de 1.000 litros,retirando para uso posterior o volumedo biofertilizante que eventualmentepoderá transbordar, armazenando-oem tambores. É importante sempremanter as proporções de compostoinoculante e esterco de gado, descri-tas acima, evitando o uso do bioferti-lizante muito diluído (Microbiol, 2001;D’Andréa & Medeiros, 2002).

5 - Recomendações de uso

Segundo Pinheiro & Barreto(1996), devido aos elevados efeitoshormonais e altos teores das substân-cias sintetizadas, o uso de biofertili-zantes em pulverizações foliares nor-malmente são feitos com diluiçõesentre 0,1 e 5%. Concentrações maio-res, entre 20 e 50%, foram utilizadaspor Santos & Akiba (1996) com o

Figura 3. Detalhes do experimento utilizando-se ácaros de B. phoenicis criados emarena, sobre a folha a planta de Canavalia ensiformis. Fonte: Medeiros (2002)


biofertilizante “Vairo”. Porém, emconcentrações muito elevadas, o bi-ofertilizante pode causar estresse fi-siológico na planta retardando seucrescimento, floração ou frutificação.Isso se deve provavelmente ao ex-cessivo desvio metabólico para pro-dução de substâncias de defesa. Parahortaliças recomendam-se pulveriza-ções semanais, utilizando entre 0,1 e3 % de concentração do biofertilizan-te, considerando que as plantas sãode ciclo vegetativo curto e possuemmaior velocidade de crescimento, comdemanda constante de nutrientes.Em fruteiras, pulverizações entre 1 e5% do biofertilizante com Microgeoproduziram resultados significativosna sanidade na cultura. Este bioferti-lizante também vem sendo emprega-do sobre o solo em concentrações deaté 20%. Este quando aplicado sobreo mato roçado, como “input”microbiano, é capaz de aumentar acompostagem laminar, isto é direta-mente no campo, acelerando os pro-cessos bioquímicos e potencializandomaior atividade microbiana sobre osolo (D’Andréa & Medeiros, 2002).

As aplicações de biofertilizantesdeverão ser realizadas durante asfases de crescimento e/ou produção,evitando-se no florescimento. Deve-se dar preferência pelos dias de chu-

va ou irrigação e os horários vesper-tino ou noturno, evitando-se os perí-odos secos e as horas mais quentesdo dia. Altas concentrações do bio-fertilizante podem provocar na plan-ta demanda de água muito maiorpara o seu equilíbrio. Mesmo assim,pulverizações com o biofertilizante,na diluição de 1%, nos períodos se-cos são possíveis. Apesar de estaremsob os efeitos do estresse hídrico, asplantas estarão recebendo energiaentrópica (não utilizável pelos inse-tos) e outros fatores de proteção.

6 - Biofertilizantes,bioinseticidas ebiorremediação

O aumento da população e amaior atividade industrial fizeram comque o problema da poluição do am-biente atingisse níveis alarmantes.Além de contaminação por detritospouco biodegradáveis, como plásti-cos e detergentes, soma-se o proble-ma dos resíduos de industrias e, prin-cipalmente, dos resíduos agroindus-triais, como a vinhaça ou o vinhoto,resultante da produção de etanol emgrande escala. Estes problemas po-dem ser atacados pelo desenvolvi-mento de linhagens microbianas ca-pazes de degradar ou assimilar esses

compostos para uso como agentesde biorremediação.

O processo da biorremediaçãoconsiste na descoberta e procriaçãode bactérias capazes de “comer” osagrotóxicos que ficam por muitos anosno solo e na água. Estas bactériasdevoram os componentes químicosexistentes nos venenos, fazendo comque o produto perca sua capacidadede poluir o solo, a água e até mesmoo organismo humano. Estas bactériastambém não são prejudiciais ao meioambiente. Caso os resultados da pes-quisa sejam confirmados, será umgrande avanço para a preservação domeio ambiente, pois o uso do venenoé um grande vilão que prejudica osolo, a água, os animais e o homem(Azevedo, 1998). Uma saída promis-sora para esses problemas seria amultiplicação em massa desses agen-tes de biodegradação de agentes quí-micos, em tanques abertos, adotando-se a técnica de cultura em composta-gem líquida contínua. A produção debiofertilizantes líquidos, à base deresíduos oriundos da agricultura e daindústria, modificados por microorga-nismos, gerarão substratos úteis comofertilizantes de solo e como bioprote-tores de plantas para a agricultura.

A partir de compostos ricos emnutrientes, facilmente acessíveis e debaixo custo operacional, como osresíduos sólidos e líquidos oriundosda agricultura e da indústria, é possí-vel a adição de microrganismos (le-veduras, bactérias e actinomicetos,por exemplo) previamente selecio-nadas, com as condições necessáriasde ecologia nutricional, que promo-verem o rápido crescimento popula-cional, resultando em alta produçãode massa microbiana.

Técnicas sofisticadas, porém como mesmo princípio, têm sido utiliza-das em laboratórios, sob condiçõescontroladas em biofermentadores, naprodução líquida de inseticidas à basede microrganismos entomo patogê-nicos (fungos, vírus, bactérias enematóides) capazes de controlar aspragas em níveis aceitáveis, econô-micos e ecológicos (Alves, 1998).

A preocupação em se gerar alter-nativas ecológicas ao problema dosrejeitos líquidos e sólidos na agricultu-ra, transformá-los em insumos de bai-

Figura 4. Caracterização de cadáveres do ácaro da leprose dos citros Brevipalpusphoenicis: (a) control, (b) Ácaro morto por ação de contato do biofertilizante; (c) e (d)Foco microbiano e vista ventral e dorçal do gnatosoma e pernas anteriores aderidaspor uma substancia coloidal (goma). Fonte: Medeiros (2002).


Figura 5. Crescimento do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana em meiode biofertilizante líquido

Figura 6. Leveduras isoladas de um biofertilizante produzido por compostagemlíquida contínua

xo custo e capazes de serem aplicadosna atividade produtiva primária, emcultivos orgânicos, representa um gran-de avanço na preservação do meioambiente. Contudo, serão necessáriosalguns anos de investigação e desen-volvimento, para que se produzammetodologias de elevado alcance soci-al, e grandes esforços no sentido de seconsolidar o emprego desses proces-sos bioquímicos como forma de sepromover a sustentabilidade dos ambi-entes agrícolas.

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Pesquisa

IniciativasGenômicas

Paulo Dejalma Zimmer, Dr.Professor do Departamentode de FitotecniaFAEM / [email protected]

Gaspar MaloneDoutorando do Programa de Pós Graduação emCiência e Tecnologia de Sementes / FAEM / [email protected]

Fernando Irajá Félix de Carvalho, PhD.Professor do Departamento de FitotecniaFAEM / [email protected]

José Fernandes Barbosa Neto, PhD.Professor do Departamento de Plantas de LavouraFaculdade de Agronomia / [email protected]

Antonio Costa de Oliveira, PhD.Professor do Departamento de FitotecniaFAEM / [email protected]


Aplicações da ciência genômica no melhoramento de plantas para as regiões de várzea do sul do Brasil

melhoramento ge-nético de plantastem contribuído deforma decisiva parao incremento daprodução mundial

de grãos (BORLAUG, 1983). Entre-tanto, a necessidade e os desafiospara as próximas duas décadas sãoimensos, o ganho genético para aprodutividade está se reduzindo acada ano e já não acompanha mais oaumento da demanda por alimentos(BORLAUG, 1997; MANN, 1997 e1999). Atualmente, grandes esfor-ços estão sendo direcionados nosentido de elucidar o potencial ge-nético das espécies cultivadas,objetivando incrementar a produti-vidade e a qualidade. Para o lança-mento de novos cultivares que aten-dam à demanda crescente por ali-mentos, os programas de melhora-mento de plantas necessitam de gran-des mudanças, principalmente noque tange à estrutura, à estratégia eà própria ciência envolvida (STUBERet al., 1999; KOORNNEEF & STAM,2001). Além do foco na qualidade ena produtividade, o melhoramentogenético também pode ser direcio-nado no sentido de aumentar a adap-tabilidade das espécies. Essa tam-bém pode ser considerada uma for-ma de incrementar a produção dealimentos, pois áreas marginais po-dem ser incorporadas ao sistemaprodutivo mediante o desenvolvi-mento de genótipos adaptados. NoSul do Brasil, há cerca de 6,8 mi-lhões de hectares de terras baixas,

caracterizadas por solos hidromórfi-cos, que têm o seu sistema agrícolaalicerçado na pecuária extensiva eno plantio do arroz irrigado. A ex-ploração inadequada dessa região,possivelmente associada às dificul-dades operacionais, não tem permi-tido uma apropriada rotação de cul-turas nem o requerido tempo depousio, o que favorece a infestaçãoda cultura por espécies daninhas,principalmente o arroz vermelho. Adegradação das características físi-cas do solo provocada pela intensamovimentação de máquinas e equi-pamentos extremamente pesadostambém impõe a necessidade depousio (Figura 1).

Dessa forma, extensas áreasestão sendo inviabilizadas a cadaano, tornando-se, muitas vezes, ex-tremamente árdua a sua recupera-ção. A busca de alternativas paracompor o sistema agrícola regionaltem motivado iniciativas importan-tes nas Universidades Federais dePelotas e do Rio Grande do Sul(UFPel e UFRGS) e na EmbrapaClima Temperado (PORTO et al.,1998). A inclusão de novas cultu-ras, como a aveia, o milho e oazevém, no sistema agrícola dasáreas de várzea tem recebido aten-ção especial, porém a simples in-trodução de genótipos não é sufici-ente para a correção, em função dainexistência de constituições gené-ticas adaptadas à condição de en-charcamento dos locais. Dessemodo, há uma grande demanda poriniciativas voltadas para a geração


de variabilidade genética, seleção deconstituições genéticas adaptadas àscondições do ambiente e aumento daeficiência dos programas de melho-ramento de plantas.

Advento das TécnicasMoleculares

Até a década de 70, pouco seconhecia sobre a organização doDNA. A composição dos pequenossegmentos com função conhecida,os genes, era a jóia mais desejadanaquela época. Nos últimos anos,com o surgimento das técnicasmoleculares, e entre elas a técnicade clonagem molecular, tornou-sepossível o isolamento e a purifica-ção de porções genômicas. Essesavanços contribuíram para tornar amolécula de DNA o foco das princi-pais investigações nos últimos anos.A clonagem molecular consiste noisolamento e na multiplicação demoléculas de DNA idênticas, e com-preende, pelo menos, dois estágiosimportantes: primeiro, o fragmentodo DNA de interesse, chamado deinserto, é ligado a uma outra molé-cula de DNA, denominada vetor,para formar o que se chama de DNArecombinante; segundo, a molécu-la do DNA recombinante é introdu-zida numa célula hospedeira com-patível, num processo chamadotransformação bacteriana. A célulahospedeira que adquiriu a molécu-la do DNA recombinante passa,então, a ser chamada transformanteou célula transformada. Atualmen-te, as fronteiras da Tecnologia doDNA recombinante, principalmen-te para fins comerciais, parecem serilimitadas. Além dos reflexos dire-tos, a tecnologia do DNA recombi-nante proporcionou avanços emtodas as áreas da bioquímica, dafisiologia e da genética. Esses avan-ços permitiram a caracterização, aidentificação e a clonagem de umasérie de genes de enzimas, que setornaram ferramentas decisivas parao surgimento de técnicas como a demarcadores moleculares e de se-qüenciamento de DNA, o que con-

tribuiu para a elucidação de impor-tantes vias de biossíntese.

No que tange aos desafios paratornar eficiente o melhoramento deplantas e para incrementar a produ-ção mundial de grãos, várias ferra-mentas moleculares podem ser in-corporadas aos programas de melho-ramento de plantas com o objetivo deotimizar a obtenção de genótipossuperiores, por exemplo, a transgenia(YE et al., 2000), a seleção assistidapor marcadores (FRARY et al., 2000),a mutação induzida (MALUSZYNSKI,1998) e a genômica (LIU, 1998;McCOUCH, 2001).

A busca por soluções para diver-sificar o sistema agrícola nas áreas devárzea do sul do Brasil passa pelaelucidação dos mecanismos fisioge-néticos envolvidos na tolerância doscereais ao encharcamento. Embora játenham sido relatadas (DANTAS et al.,2001), algumas respostas à deficiên-cia de oxigênio no solo provocadapelo excesso de água (encharcamen-to), ainda permanecem muitas dúvi-das relacionadas com as interaçõesgenéticas que facultam algumas espé-cies ou variedades a suportarem soloscom hipoxia decorrente do excessode água. A incorporação de tecnologiasmoleculares e a formação demelhoristas treinados para selecionargenes poderão se refletir em grandesganhos de eficiência nos programasde melhoramento de plantas.

Sintenia e GenomasModelos

A sintenia é caracterizada pelaconservação na ordem e no conteú-do de genes, ou grupos gênicos,entre espécies relacionadas. Essacaracterística também é denomina-da colinearidade, e poderá ser alta-mente informativa para estudoscomparativos de função, ação eregulação gênica entre diferentesgenomas (Figura 2). Embora nãoseja uma condição estável, pois asintenia pode ser perdida no decor-rer da evolução, vários trabalhosevidenciam a importância das regi-ões cromossômicas conservadaspara estudos genéticos comparati-vos (BENNETZEN et al., 1998; GALE& DEVOS, 1998; DEVOS et al., 1999;FEUILLET & KELLER, 2002).

A sintenia é bastante estudadana família Brassicaceae e na famíliaGramineae, atualmente denomina-da Poaceae. Essa família é constitu-ída por muitas espécies, entre elasalgumas das principais espécies agrí-colas como milho, arroz, trigo, sorgo,cevada, centeio e aveia (cereais).Além das variações fenotípicas egenotípicas existentes entre os cere-ais, há muitas variações na estruturadesses genomas. A variação podeser no número de cromossomos, nonível de ploidia e no tamanho dogenoma - estimado em pares de

Figura 1 - Sistema de preparação do solo para plantio de arroz pré-germinado em solosde várzea, utilizando máquinas extremamente pesadas em solos inundados. Essaassociação afeta negativamente a estrutura física do solo. Cortesia Prof. Silmar Peske.


bases (pb), podendo existir genomasmuito grandes como o genoma dotrigo, com cerca de 16 bilhões debases, como também pode ocorrergenomas muito pequenos, como é ocaso do do arroz, com cerca de 430milhões de bases. A estratégia atualestá sendo estudar e caracterizar ossistemas gênicos em genomas pe-quenos (arabidopsis e arroz) e, con-siderando a sintenia existente, infe-rir sobre os genomas grandes (milho– 2 500 Mpb, trigo – 16 000 Mpb ecevada - 4 800 Mpb, por exemplo).

Características de umGenoma Modelo

A presença de determinadas ca-racterísticas numa espécie podetorná-la altamente atraente para aciência. Sob esse enfoque, as carac-terísticas mais atraentes numa espé-cie vegetal, as quais poderão contri-buir para que ela se torne um mode-lo, estão relacionadas com a dura-ção do ciclo, com o número de

sementes produzidas, com o tama-nho do seu genoma, com a capaci-dade de multiplicação em diferentesambientes, com a facilidade de ma-nipulação da polinização (direcio-namento de cruzamentos), com acapacidade de cultivo in vitro e coma disponibilidade de informações jáexistentes (banco de dados para aespécie). Essas características geral-mente definem a facilidade de seobterem resultados, bem como oseu volume e sua qualidade. A pri-meira espécie vegetal utilizada comomodelo para estudos genéticos foi aervilha (Pisum sativum L.), quandoGregor Mendel publicou os resulta-dos dos primeiros estudos genéti-cos, no ano de 1865. É lógico quenaquela época Mendel não conside-rou os critérios utilizados atualmen-te, mas certamente escolheu a ervi-lha pela familiaridade que ele tinhacom o cultivo daquela espécie. Em-bora as leis de Mendel não tenhamsido validadas até o seu redescobri-mento, no início do século XX, cons-

tituíram a base científica dos estu-dos realizados até hoje. Na históriarecente da Biologia de Plantas, umaoutra espécie apresentava muitascaracterísticas atraentes e surgiacomo modelo entre as dicotiledône-as; tratava-se da Arabidopsisthaliana. Essa espécie vegetal émembro da família Brassicaceae, aqual inclui espécies cultivadas comoo repolho, o rabanete e a canola.Embora a arabidopsis não possuaimportância agronômica, essa espé-cie apresenta vantagens importan-tes para a pesquisa básica em gené-tica e biologia molecular. Além dis-so, ou como conseqüência disso,essa espécie possui o maior volumede informação disponível dentre to-dos os vegetais. No entanto, o mo-delo genético Arabidopsis thalianalimitava-se principalmente ao siste-ma genético das dicotiledôneas,quando um complemento para asmonocotiledôneas começou a serprocurado. Nos últimos anos, estásendo dispensada muita atenção auma outra espécie, o arroz (Oryzasativa L.), por ele possuir tambémbons atributos para se tornar ummodelo genético vegetal. Emboraseu genoma seja pouco maior, cercade três vezes maior que o genomade Arabidopsis thaliana L., aindaassim é cerca de 40 vezes menor doque o genoma do trigo (Triticumaestivum L.). Entretanto, a estraté-gia de direcionar os esforços paratornar o arroz um genoma modeloestá alicerçada no interesse de seobter um modelo entre as gramíneas,principalmente aquelas produtorasde grãos, pois, praticamente, todasas ações dos programas de melhora-mento de plantas estão voltadas paraprodutividade, resistência a molés-tias e adaptabilidade. Outro fatorfundamental no interesse de tornaro arroz um genoma modelo é aexistência de sintenia ou colineari-dade entre os genomas dessa famí-lia. Atividades voltadas para a iden-tificação e a clonagem de genes coma utilização de genomas modelos,como o arroz, são bem mais eficien-tes do que em genomas grandes.

Figura 2 – Sintenia entre os genomas do arroz, milho, cevada e trigo. As informaçõesprovenientes do genoma menor podem ser utilizadas para guiar ações no sentido delocalizar, mapear e clonar genes em genomas maiores. Os pontos em amareloindicam o posicionamento de alguns genes e os números indicam o cromossomo(Modificado de GALE & DEVOS, 1998).


Portanto, atualmente a estratégiamais racional será estudar o arroz,identificar, clonar e caracterizar seusgenes e, quando tudo estivermensurado, atingir os genomas maiscomplexos, como os do trigo e domilho. Dessa forma, os programas demelhoramento de plantas poderãoaumentar em muito sua eficiência.

A particularidade que o arrozpossui, de ser cultivado sob irrigaçãopor inundação (várzeas) e sequeiro(terras altas), também torna essa es-pécie modelo para o entendimentodos mecanismos que controlam a adap-tabilidade das plantas. O Centro deGenômica e Fitomelhoramento (CGF)da UFPel está buscando, mediante autilização de tecnologias modernas, oentendimento do sistema de raízes doarroz (modelo genético). A identifica-ção de mecanismos morfofisiológicose os respectivos controles genéticospermitirão a identificação e a clonagemdos genes envolvidos. A sintenia e autilização de ferramentas genômicasadequadas conduzirão à rápida utili-zação desse conhecimento para o de-senvolvimento e lançamento degenótipos superiores, de diversas es-pécies que poderão ser adaptadas aossolos encharcados do sul do Brasil.

Seqüenciamento deGenomas

Os primeiros passos para o se-qüenciamento de DNA foram dadospor Sanger, em 1977, com o desenvol-vimento do método de seqüencia-mento manual conhecido tambémcomo método da cadeia interrompi-da. Hoje o método de Sanger baseia-se na amplificação, por PCR, de frag-mentos de DNA clonados previamen-te dentro de vetores conhecidos. Des-sa forma, oligonucleotídeos iniciado-res (primers), complementares à se-qüência do vetor, são utilizados paraamplificar o inserto do DNA a serseqüenciado. A metodologia foi cha-mada de “cadeia interrompida” emfunção de que são utilizados dNTPs(deoxi-Nucleotídeos Trifosfatos) mo-dificados, os ddNTPs (dideoxi-Nucle-otídeos Trifosfatos), os quais, quando

incorporados pela enzima Taq poli-merase (a enzima que amplifica oDNA), não permitem a inclusão donucleotídeo seguinte por não apre-sentarem a hidroxila no carbono 3 dadideoxi-ribose do nucleotídeoterminador. Portanto, a síntese damolécula de DNA pára nesse ponto(Figura 3).

Pelo método de Sanger, o pro-cesso de seqüenciamento é realizadoem quatro reações independentes.Em cada uma delas é adicionado umddNTP diferente (ddATP, ddCTP,ddGTP e ddTTP), geralmente marca-dos radiativamente com 32P. Na cópiade cada fita de DNA, a partir domolde, as moléculas são sintetizadasaté que incorporem o nucleotídeoterminador (ddNTP). O acúmulo demoléculas terminadas numa mesmabase possibilita sua visualização nogel. A geração aleatória de moléculasterminadas nas bases distintas de umafita molde de DNA permitirá o estabe-lecimento da seqüência de nucleotí-deos do referido molde. A leitura daseqüência de bases é realizada medi-ante a separação, num gel de poliacri-lamida de alta resolução, dos frag-mentos amplificados por PCR. Nessetipo de técnica, é possível identificarcerca de 200 a 300 nucleotídeos. AFigura 3 apresenta um esquema sinte-tizado dessa metodologia.

Na última década, o surgimentodos seqüenciadores automáticos, ali-ado à elevada capacidade de proces-sar informações que a informáticaproporcionou, revolucionou agenômica, dando origem a bioinfor-mática. O seqüenciamento automáti-co mantém o mesmo princípio dométodo de seqüenciamento manualproposto por Sanger, mas a possibi-lidade de utilizar ddNTPs marcadosfluorescentemente com cores distin-tas para cada um deles (ddCTP,ddGTP, ddATP e ddTTP) permitiuautomatizar o processo (veja Figura3). Outra grande vantagem do se-qüenciamento automático é a incor-poração de metodologias laser e pro-gramas computacionais que fazem aleitura dos resultados. As moléculasfluorescentes utilizadas nos ddNTPs,quando sensibilizadas pelo laser, emi-tem um comprimento de onda, que écapturada por uma câmera acopladaao seqüenciador. A informação é pro-cessada e transformada em seqüênci-as nucleotídicas por softwares ade-quados.

Devido à baixa capacidade deprodução proporcionada pelo méto-do de Sanger, as primeiras seqüênciasnucleotídicas foram geradas para es-tudos pontuais, como o estabeleci-mento da seqüência de alguns genese de pequenas regiões cromossômi-

Figura 3 – Esquema representativo do método de seqüenciamento desenvolvido porSanger (A) e do método de seqüenciamento automatizado (B). Consulte o texto paraconferir os detalhes de cada método.


cas. À medida que foram desenvolvi-dos os seqüenciadores de nucleotíde-os automatizados, a capacidade deprodução de seqüências foi aumenta-da muito rapidamente. Em funçãodisso, surgiram, mediante a associa-ção de grupos de pesquisa, váriasiniciativas voltadas para o seqüencia-mento de alguns genomas. Os primei-ros esforços foram direcionados paraalguns microorganismos e, em segui-da, para a Arabidopsis thaliana (TheArabidopsis Genome Initiative*, 2000)e para a Drosophila melanogaster(ADAMS et al., 2000), dois organis-mos utilizados como modelo na biolo-gia. Na seqüência, apresentaremos oque já foi realizado com o intuito degerar informações genéticas das prin-cipais espécies, com vistas ao melho-ramento vegetal.

Arabidopsis thaliana - ogenoma da Arabidopis (125 milhõesde nucleotídeos – 125 Mpb) foiseqüenciado por uma associação in-ternacional de pesquisadores cha-

mada de Iniciativa Genoma da Arabi-dopsis (The Arabidopsis GenomeInitiative*, 2000). A seqüência, o mapae as anotações disponíveis atualmen-te são resultado de esforços conjun-tos do TIGR (The Institute forGenomic Research), MIPS (MunichInformation Center for ProteinSequences) e TAIR (The ArabidopsisInformation resource). Veja uma fotodessa espécie vegetal observando aFigura 4.

Arroz (Oryza sativa L.) – Fo-ram empregados esforços públicos eprivados para seqüenciar essa espé-cie. O primeiro esforço privado foirealizado pela Monsanto (PENNISI,2000). Mais tarde, os resultados gera-dos seriam somados aos resultados doIRGSP (International Rice GenomeSequencing Project). O segundo es-forço privado, uma associação entreduas empresas, a Myriad Genetics e aSyngenta, utilizou o método wholegenome shotgun, e não acrescentouresultados significativos ao conjuntode dados disponibilizados pelos ou-tros projetos (GOFF et al., 2002).Foram implementados também doisesforços públicos para o seqüencia-mento do arroz. O primeiro deles, oProjeto Internacional de Seqüencia-mento do Genoma do Arroz (IRGSP –International Rice Genome SequencingProject), teve como objetivo seqüenciar

a subespécie japonica. Essa associa-ção teve início no ano de 1997, emuma reunião do Simpósio Internacio-nal de Biologia Molecular de Plantasrealizado em Singapura. Naquela oca-sião, o objetivo da comunidade cien-tífica era socorrer o idealizador doprojeto de seqüenciamento estruturaldo arroz, o RGP (Rice Genome Project)do Japão. O segundo esforço públicofoi liderado pela Academia Chinesade Ciências (Chinese Academy ofSciences) de Beijing, China. Esse pro-jeto iniciou-se em abril de 2000 e, doisanos mais tarde, seus resultados fo-ram publicados pela revista Science(YU et al., 2002). A grande distinçãoestabelecida entre as subespéciesseqüenciadas por esses dois esforçospúblicos foi em relação à importânciaeconômica e geográfica que elas apre-sentam. A subespécie seqüenciadapelo grupo liderado pelos japoneses,spp japonica, é amplamente cultiva-da no Japão, nos Estados Unidos, naCoréia do Sul e em parte da China. Poroutro lado, a subespécie seqüenciadapelos chineses, spp indica, é bastantecultivada na China e no Sudeste Asiá-tico, bem como no Sul do Brasil. Alémdisso, as estratégias de seqüencia-mento utilizadas pelos dois gruposforam distintas; enquanto o grupo doschineses focava a anotação de genes,pois utilizou a estratégia whole genomeshotgun, o grupo liderado pelo RGP

Figura 5 – Esquema representativo das principais etapas na geração de bibliotecasde seqüenciamento. A – Para seqüenciamento estrutural via construção de bibliotecaBAC (Bacterial Artificial Chromosomes). 1 – DNA genômico; 2 – Alinhamento defragmentos de 100 a 200 kb em mapa físico (Biblioteca BAC); 3 – Fragmentaçãoindividual dos BACs; 4 – Subclonagem de fragmentos entre 2 e 5 kb. B – Paraseqüenciamento de ESTs (Expressed sequence tags) ou do transcriptoma. 1 – Extraçãode RNA mensageiro; 2 – Síntese reversa utilizando RT-PCR; 3 – Síntese de cDNA duplafita; 4 – Clonagem dos cDNAs.

Figura 4 – Detalhes de um exemplar deArabidopsis thaliana L. cultivado emlaboratório. Cortesia Dra. M. E. Alvarez.CIQUIB – CONICET, Universidad Nacio-nal de Córdoba – Argentina.


focou, além da anotação dos genes, ageração de informações precisas aonível de estruturação e organizaçãodo genoma, pois utilizou a técnica deseqüenciamento estrutural via cons-trução de bibliotecas BAC (BacterialArtificial Chromosomes) (Figura 5 A).Veja uma foto dessa espécie vegetalobservando a Figura 6.

Trigo (Triticum aestivum) –os esforços para determinar a se-qüência de nucleotídeos do trigo

depararam-se com duas grandes bar-reiras. A primeira delas se refere aotamanho do genoma, que é, aproxi-madamente, de 16 bilhões de nucle-otídeos (16.000 Mpb) - cerca de 40vezes maior que o genoma do arroz.A segunda delas é que o seu genomaé diferente do do arroz e daarabidopsis, ambos diplóides, en-quanto o trigo é hexaplóide. Essesimpedimentos impuseram uma es-tratégia preliminar para que fossemdeterminadas as seqüências trans-critas: o transcriptoma (bibliotecasde cDNA) de diferentes estádios dodesenvolvimento da planta (Figura5 B) Portanto, considerando a estru-tura e o tamanho do genoma dotrigo essa ação é mais lógica do quepensar num inexeqüível projeto deseqüenciamento estrutural dessa es-pécie. De uma forma geral, a estra-tégia visa a gerar seqüências nucle-otídicas dos genes transcritos emdeterminados estádios de desenvol-vimento ou sob determinadosestresses do ambiente. O esboço deuma associação internacional volta-da para a geração dessas informa-ções começou a ser definido em1998, com a criação de uma açãoInternacional Cooperativa para a pro-dução de ESTs (Expressed SequenceTags) de trigo. Atualmente, as ações

com a intenção de determinar aposição no mapa dos transcritos sãocoordenadas pelo InternationalTriticeae Mapping Initiative. Os prin-cipais esforços para a criação deuma coleção de ESTs representati-vos do trigo estão sendo lideradospelos EUA (U. S. Wheat GenomeProject), pelo Canadá (AAFC –Agriculture and Agri-Food Canada)e pela Inglaterra (BBSRC –Biotechnology and BiologicalSciences Research Council). Veja umafoto dessa espécie vegetal obser-vando a Figura 7.

Cevada (Hordeum vulgare) –os esforços para determinar a se-qüência de nucleotídeos da cevadatambém sofrem impedimentos devi-do ao tamanho do seu genoma ~ 4,8bilhões de nucleotídeos (4800 Mpb).O primeiro passo para contornar esseimpedimento foi a produção de ma-pas físicos do genoma da cevada comalta densidade de marcadores; issoproporcionará a realização de com-parações com o genoma do arroz. Opróximo passo será a criação dotranscriptoma da espécie. Essas deci-sões estão sendo implementadas emum esforço combinado entre cientis-tas da América do Norte (NorthAmerican Barley Genome Mapping

Figura 8 - Detalhes de uma lavoura de cevada (Hordeum vulgare), safra 2003, daLinhagem CEV 97043 da propriedade do Produtor Adelar Crespi.

Figura 7 – Detalhes de uma lavoura detrigo (Triticum aestivum). Cortesia Prof.Silmar Peske.

Figura 6 – Detalhes de uma lavoura dearroz irrigado do cultivar BRS 7 “Taim”.Cortesia Prof. Silmar Peske.


Project, USA e North American BarleyGenome Mapping Project, Canadá) eda Europa (Plant Genome ResourceCentre, Alemanha e Scottish CropResearch Institute, Inglaterra), paracriar uma biblioteca de ESTs(Expressed Sequence Tags) o maiscompleta possível (Figura 5 B). Vejauma foto dessa espécie vegetal ob-servando a Figura 8.

Milho (Zea mays) – a principaliniciativa para seqüenciamento dogenoma do milho foi anunciada emsetembro de 2002 pelo NFS (NationalScience Foundation) dos EstadosUnidos. No entanto, há muito tempoos geneticistas da área do milhobuscavam somar esforços com esseobjetivo (BENNETZEN et al., 2001).Quatro fatores contribuíram para queessa iniciativa fosse retardada até2002. Primeiro, os avanços natecnologia de seqüenciamento re-duziram consideravelmente o custoem comparação com o passado. Se-gundo, novas metodologias defingerprinting, de alta resolução eprodução, permitiram aumentar aeficiência na seleção de clones parao seqüenciamento, reduzindo ao mí-nimo a sobreposição de regiõesseqüenciadas. Terceiro, foram de-senvolvidas novas metodologias parapreparar frações do genoma do mi-lho ricas em genes (YUAN et al.,

2002). Quarto, análises comparati-vas do milho com o arroz (Oryzasativa) ou Arabidopsis sugerem quea seqüência do genoma dessas duasespécies não serão suficientes paraentender detalhadamente o conteú-do de genes do milho e sua expres-são (BENNETZEN et. al., 2001;CHANDLER & BRENDEL, 2002).Além disso, algumas característicasno genoma do milho sempre dificul-taram a implementação de projetosde seqüenciamento da espécie. Des-taca-se a existência de váriassubespécies importantes (Zea maysspp. Huehuetenangensis, Zea maysspp. mays (mayze), Zea mays spp.mexicana (teosinto), e Zea maysspp. Parviglumis); o elevado con-teúdo de DNA repetitivo (regiõesduplicadas) presente no genoma domilho (HELENTJARIS, 1995) e o ta-manho do seu genoma, cerca de2500 Mpb.

Da mesma forma que está ocor-rendo na geração de seqüênciasnucleotídicas da cevada e do trigo, ofoco para o milho também será ageração de seqüências dos genes (otranscriptoma). As interações do sis-tema gênico poderão ser obtidas emgenomas como o arroz, principal-mente devido à ocorrência dasintenia entre os cereais. Veja umafoto dessa espécie vegetal obser-vando a Figura 9.

Reflexos da Tecnologia naProdução de Cereais

Os grandes avanços na produ-ção mundial de grãos, gerados apartir de meados do século passado,são decorrentes de uma contribuiçãodecisiva do melhoramento clássicode plantas (BORLAUG, 1983). Aocontrário do que alguns entusiastasesperavam, as grandes expectativasdecorrentes das inovações científicasdos últimos 30 anos não se refletiramem significativos incrementos na pro-dução de grãos. Para que astecnologias moleculares possam ren-der os resultados esperados, algu-mas barreiras precisam ser supera-das. A principal delas diz respeito àmudança de cultura nos programasde melhoramento de plantas, sendonecessário selecionar genes ao invésde selecionar plantas (KOORNNEEF& STAM, 2001). Superadas as barrei-ras culturais, a eficiência na imple-mentação de ferramentas molecula-res em programas de melhoramentode plantas poderá ser incrementadamediante a automatização dos pro-cessos de extração de DNA, a gera-ção de um maior número de seqüên-cias ligadas (marcadores) a caracteresde importância agronômica e o bara-teamento dos equipamentos einsumos utilizados. O treinamentode novos melhoristas também deve-rá merecer atenção especial, pois,além da sólida formação em melho-ramento clássico e em estatística, érecomendado que esses profissio-nais sejam treinados em genéticamolecular e técnicas molecularesaplicadas ao melhoramento de plan-tas. Principalmente por que é atravésdesses novos profissionais que osprogramas de melhoramento clássi-cos poderão incorporar as novas fer-ramentas da biologia molecular.

O setor de melhoramento deplantas também necessita se articu-lar para melhorar a capacidade deprocessamento das informações jádisponíveis, principalmente aque-las decorrentes dos diferentes proje-tos de seqüenciamento de genomas.Atualmente, dois fatores contribu-

Figura 9 – Detalhes de uma lavoura de milho (Zea mays) e de espigas maduras(direita inferior). Cortesia Prof. Silmar Peske.


em para que as informações dispo-níveis não sejam aplicadas rotineira-mente. A primeira delas é que hácarência de bons sistemas deinformática capazes de trocar infor-mações com os bancos de dadoscom a agilidade requerida; a segun-da é que poucos profissionais estãohabilitados a realizarem buscas e afazerem comparações de seqüênci-as através de computadores.

Buscando alternativas para com-por o sistema agrícola das várzeas doSul do Brasil, sugerimos a implemen-tação de ferramentas moleculares ede bons sistemas de informática paraos programas de melhoramento lo-cais. Essas ações devem estar volta-das para a: i) identificação de genesde tolerância a estresses abióticos emgenomas “modelo” (arroz), com pos-terior caracterização em espécies deinteresse (trigo, milho, cevada, sorgo,aveia e azevém); ii) caracterizaçãomolecular do germoplasma local; iii)identificação de “genes maiores”, res-ponsáveis pela adaptação do arrozao encharcamento; e, iv) criação deum banco de mutantes para o sistemade raízes.

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_______________________________________

* A autoria deste trabalho deverá ser “The Arabidopsis Genome Iniative”. Uma lista completa dos colaboradores aparece no final do artigo original(Nature, 408: 796-815).


Pesquisa

Associação de mutações nosgenes BRCA1 e BRCA2

Paulo Henrique MachniewiczBiólogo - Faculdades Integradas “Esprírita”Especialista em Genética Humana PUC-PR,Responsável pelos laboratórios de Genética,Imunologia e Microbiologia do Centro UniversitárioCampos de Andrade - UniAndrade - [email protected]

Fábio Rueda Faucz, DrBiologo - UFPRMestrado em Ciências Biológicas - UFPRDoutorado em Genética - UFPRProfessor adjunto - PUC-PRProfessor Titular - [email protected]


Resumo

Cerca de 10% dos cânceres demama podem ser associados a muta-ções na linhagem germinativa. Em1990, foi identificado, no cromosso-mo 17, o gene BRCA1, composto de24 exons e codifica para uma proteínade 1.863 aminoácidos. Mutações nes-te gene são responsáveis por metadede todos os casos familiares de câncerde mama. Já em 1995, identificaram oBRCA2, com 27 exons, codificandopara uma proteína de 3.350 aminoáci-dos. Este gene encontra-se no cro-mossomo 13. Mutações neste genesão responsáveis por cerca de 35%dos casos familiares precoces de cân-cer de mama. Estes dois genes, asso-ciados a outras proteínas, desencadei-am a doença que mais mata mulheres.No Brasil, registram-se cerca de 35.000novos casos de câncer de mama porano. O câncer representa uma proli-feração maligna das células ou lóbu-los epiteliais que revestem os ductosou lóbulos da mama. O câncer femini-no é raramente encontrado antes dos25 anos de idade, exceto em casoshereditários. A transmissão hereditá-ria de câncer de mama segue o clássi-co padrão mendeliano de transmissãoautossômica dominante, com 50% dascrianças de carreadoras, herdando mu-tações BRCA1. As portadoras femini-nas de mutações são estimadas aterem um risco de 85% de desenvolvi-mento de câncer de mama e ovário,com maior incidência de câncer bila-teral e mais de 50% dos cânceres demama, ocorrendo, antes dos 50 anos.A prevalência de mutações de BRCA1e BRCA2 é ocasionalmente mais alta

que o esperado, devido à transmissãoaumentada de algumas mutações, emcertas populações, devido ao efeitodo fundador. A população de JudeusAskenazi é a que representa um exem-plo claro de mutações, devido aoefeito do fundador, por cultivaremsuas tradições de união restrita. Porconseqüência, as mutações encontra-das nesta população são iguais eminúmeros países para onde migraram.Outras populações, como Espanhóis,Indianos, Paquista-neses, Russos e atétribos Aborígines do Canadá, tambémapresentam algumas mutações quesão mais freqüentes e que podem seratribuídas ao efeito do fundador.

1. Introdução

O nosso organismo é constituídopor trilhões de células, que se repro-duzem pelo processo de divisão celu-lar. Este é um processo ordenado econtrolado, responsável pela forma-ção, crescimento e regeneração detecidos saudáveis do corpo. Algumasvezes, no entanto, as células perdema capacidade de limitar e comandarseu próprio crescimento, passando,então, a se multiplicarem muito rapi-damente e de maneira aleatória edesordenada, formando nódulos.

O câncer surge por causa dealterações no DNA, que resulta naproliferação incontrolável de célu-las. A maioria dessas alterações en-volve modificações seqüenciais re-ais de DNA. Elas podem surgir comoconseqüência de erros de replicaçãoaleatórios, exposição a carcinógenos,ou processos defeituosos de reparodo DNA.

Associação de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 causadoras do câncer de mama hereditário


As lesões da mama limitam-se,predominantemente, ao sexo femi-nino por possuir uma estrutura ma-mária mais complexa, volume ma-mário maior e extrema sensibilidadeàs influências endócrinas predis-põem esse órgão a diversas condi-ções patológicas (COTRAN, KUMAR,COLLINS, 2001).

As neoplasias constituem as le-sões mais importantes da mama fe-minina, apesar de não serem as maiscomuns. Elas podem surgir a partirde epitélio escamoso, estruturas glan-dulares e tecido conjuntivo.

Existem três grupos de influên-cias importantes no câncer de mama:

• Fatores genéticos;• Influências hormonais;• Fatores ambientais.

No Brasil, registram-se 35.000novos casos de câncer de mama porano, 11.000 deles, só no Estado de SãoPaulo. Fatores de risco de câncer nafamília, alimentação rica em gorduras,início precoce da menstruação, me-nopausa tardia, 1ª gestação após os 30anos e o fato de a mulher nunca terengravidado são alguns dos fatoresque influenciam para desenvolver umtumor maligno na mama.

O câncer de mama representauma proliferação maligna das célu-las epiteliais que revestem os ductosou lóbulos da mama. É consideradoo mais comum em mulheres, poden-do existir por um longo período,como doença não-invasiva ouinvasiva, mas não-metástica. Estefato torna-se mais urgente a necessi-dade do diagnóstico precoce e daconduta apropriada.

Cerca de 10% dos cânceres demama podem ser associados a muta-ções na linhagem germinativa. Estaárea tem sofrido uma elevação notá-vel com a identificação de genesresponsáveis por casos em famílias(BATES, HOCKELMAN, 1982 ).

KING, et al. (1990), usou análisegenética de ligação para identificar ogene BRCA1 localizado no cromos-somo 17q21. Ele é responsável poraproximadamente metade de todosos casos familiares precoces de cân-cer de mama, bem como pela maioriados casos familiares de câncer demama e ovário.

SCHUTTE, et al. (1995), identifi-cou um gene na região 13q12-q13,com seis mutações diferentes em famí-lias com câncer de mama e identificoucomo BRCA2. Mutações nesse genesão responsáveis por aproximadamente35% dos casos familiares precoces decâncer de mama. Estão ainda associa-dos a um risco aumentado de câncer demama e de próstata em homens, e decâncer ovariano e pancreático.

Estes dois genes associados aoutras proteínas desencadeiam a do-ença que mais mata mulheres.

Para que se tenha uma avaliaçãoprecisa do risco de desenvolver umcâncer é necessário que se obtenhauma história da paciente, umagenealogia do câncer precisa, onde épossível confirmar os tipos de cânce-res através de documentos hospitala-res e exames.

Devido aos altos custos e difi-culdades para testar mutações emBRCA1 e BRCA2, são realizadas pro-vas nas mutações mais prováveisnas populações. Nas famílias de Ju-deus as três principais mutações defundador mais freqüentes, 185 delAG, 5382 ins C em BRCA1 e 617 delT em BRCA2. Estas três mutaçõesmais freqüentes respondem por maisde 90% da população. Quando umamutação de fundador é encontrada,esta já é suficiente para autorizar ablindagem para todos as três muta-ções (BAST, et al 2000).

2. Localização da mama

A mama está localizada entre a2ª e a 6ª costela, entre a margemesternal e a linha medioaxilar. Otecido mamário possui três compo-nentes principais:

• Tecido glandular: é organiza-do em 12 a 20 lobos, onde cadaqual termina num canal que seabre na superfície do mamilo.• O tecido glandular é sustenta-do por tecido fibroso, incluindoos ligamentos suspensórios queestão conectados tanto à pelequanto à fascia que fica pordebaixo da mama.• A gordura circunda a mama epredomina tanto superficial-mente, quanto na periferia(SPENCER, 1991).

Os vasos linfáticos de grandeparte da mama drenam para a axila.A borda anterior da axila é formadapelos músculos peitorais; as bordasposteriores incluem o subescapular eo grande dorsal; a borda interna peloquadril cortal e músculo denteadoanterior; e a borda externa pela partesuperior do braço.

Os gânglios axilares na partealta da axila, perto das costelas e dodenteado anterior. Para dentro deles,drenam canais provenientes de trêsoutros grupos de gânglios linfáticos:

1. o grupo peitoral ou anterior;2. o grupo subescapular (poste-rior);3. o grupo lateral;

Convém observar que nem to-dos os linfáticos da mama drenampara a axila. Dependendo da locali-zação de uma lesão no seio, a disse-minação pode se processar direta-mente para os gânglios infraclavicu-lares, para dentro dos canais profun-dos existentes no interior do tórax oudo abdômen, e até para a mamaoposta (BATESE, HOCKENAM, 1982).

Na glândula mamária, os lobospossuem muitas subdivisões quesão chamadas de lóbulos; estes ter-minam em dezenas de pequenosbulbos produtores de leite. Os lo-bos, lóbulos e bulbos são interliga-dos por tubos finos denominadosductos. Estes ductos vão até o ma-milo (papilo), localizado no centroda área escura da pele que se cha-ma auréola.

Somente com o início da gravi-dez é que a mama assume amaturação morfológica e atividadefuncional completa. Após a cessa-ção da lactação, os lóbulos regrideme sofrem atrofia, havendo uma re-dução notável no tamanho total damama. A maioria das neoplasiasmamárias não contém tecidoadiposo e, em exames como a ma-mografia, elas aparecem como mas-sas de maior densidade, contras-tando com o estroma circundante.Por conseguinte, a mamografia émenos sensível em mulheres jo-vens, nas quais essas massas po-dem ser obscurecidas por tecidodenso circundante (COTRAN,KUMAR, COLLINS, 2001).


3. Sinais visíveis de CâncerMamário

BATES, HOCKELMAN, (1982)descreveram alterações na mama quecaracterizam um tumor, entre elasdestacam-se:

• Produção de fibrose, ou for-mação de tecido cicatricial;• Sinais de retração que inclu-em covas cutâneas, alteraçõesnos contornos mamários e acha-tamento ou desvio do mamilo;• Aparecimento de nódulo ouendurecimento da mama ou em-baixo do braço;• Mudanças no tamanho e ouformato da mama;• Alteração na coloração ou nasensibilidade da pele da mamaou da auréola;• Secreção contínua por umdos ductos;• Retração da pele da mama oudo mamilo;• Inchaço significativo oudistorção da pele.• As alterações no contornosão identificadas por inspeçãocuidadosa das superfícies nor-malmente convexas das ma-mas e comparando uma mamacom a outra.• Edema de pele, produzindopor bloqueio linfático.

4. Classificação dos tiposde Câncer de Mama

O câncer de mama é subdividi-do em dois grandes grupos:

• Carcinomas: que podem serdiferenciados em câncer lobularonde começa nos bulbos (pe-quenos sacos que produzemleite); ou câncer dos ductal,que se formam nos ductos quelevam o leite dos lóbulos para omamilo (papila).

• Sarcomas: formam-se nostecidos conjuntivos, onde é maiscomum o câncer se dissiparpara outras partes do corpo.

O carcinoma é o mais comum.Ele é mais comumente encontrado ediagnosticado na mama esquerda do

que na mama direita.Os cânceres são bilatérias ou

seqüenciais na mesma mama em 4%ou mais dos casos. Entre os carcinomasde mama pequenos o suficiente paraidentificar sua área de origem, cerca de50% surgem no quadrante superiorexterno, 10% em cada um dosquadrantes restantes e cerca de 20% naregião central ou subareolar, o local deorigem influência de modo considerá-vel o padrão de metástase linfonodal.

Os carcinomas são divididos emcarcinomas não–inflitrantes ou in situe carcinomas inflitrantes.

♦ Carcinomas in situ:• Carcinoma ductal in situ;• Carcinoma lobular in situ;

♦ Carcinomas Invasivos (infil-trante):

• Carcinoma ductal infiltrantesem tipo específico;• Carcinoma lobular invasivoou infiltrante;• Carcinoma medular;• Carcinoma colóide;• Carcinoma tubular;• Carcinoma papilar invasivo.

5. Estágios dedesenvolvimento do

Câncer de Mama

Os diferentes tipos de câncer demama, quando são diagnosticados econfirmados com exame laboratorial,são classificados conforme o seu ta-manho e presença de metástases noslinfonodos e a distância. Esta classi-ficação foi criada para que o médicopossa saber indicar qual o tratamentomais adequado para o paciente (HARRISON, et al. 1998 ).

• TX: tumor primário que nãopode ser demonstrado.• T0: não existe evidência detumor primário.• TIS carcinoma in situ: carci-noma intraductal e carcinomalobular in situ.• T1: tumor de até 2 cm.• T1a: tumor de até 0,5 cm.• T1b: tumor 0,5 > 1 cm.• T1c: tumor 1cm > 2 cm.• T2: tumor com mais de 2 cme menos de 5 cm.• T3: tumor com mais de 5 cm.

• T4: tumor de qualquer tama-nho com possível extensão di-reta a parede do tórax.• T4a: extensão a parede dotórax.• T4b: edema, ou ulceração, ounódulos satélites na parede damesma mama.• T4c: quando encontra-se T4ae T4b.• T4d: carcinoma inflamatório.

Gânglios Linfáticos (N)

• NX: quando não se pode afirmaro comprometimento dos gânglios.

• N0: sem metástase em gângliosregionais.

• N1: metástase em gânglios axi-lares unidos uns aos outros e a outrasestruturas.

• N3: metástase em gânglios lin-fáticos da mama interna.

Classificação Patológica

• PNX: quando não se podeexcluir a presença de gânglios.• PN0: sem metástase em gân-glios regionais.• PN1: metástase em gângliosregionais laterais móveis.• PN1a: somente micrometásta-ses < 0,2 cm.• PN1b: metástase em gângliosmaiores de 0,2 cm.• PN1b1: metástase de 1 a 3gânglios > 0,2 < 2 cm.• PN1b2: metástases de 4 oumais gânglios > 0,2 a < 2 cm.• PN1b3: quando atravesa aparede do gânglio < 2 cm.• PN1b4: metástase a gânglioslinfáticos de 2 cm ou massa edimensão maior.• PN2: metástase em gângliosaxilares unidos uns aos outros ea outras estruturas.• PN3: metástase em gânglioslinfáticos da mama interna.

Metástase a Distância (M)

• MX: presença de metástase àdistância, mas que não pode serdemonstrado.• M0: não há evidência demetástase à distância.• M1: presença de metástasesupraclaviculares.


São considerados cinco estágiosde desenvolvimento de tumor segun-do o Comitê Americano de Câncer.

• Estágio 0:Carcinoma ductal insitu e carcinoma lobular in situ.Sem evidência de tumor noslinfonodos e metástase à dis-tância.• Estágio 1: Quando o tumortem até 2 cm , mas sem qual-quer evidência de ter se espa-lhado pelos gânglios linfáticospróximos.• Estágio 2: Inclui tumores deaté 2 cm, mas com envolvimen-to de gânglios linfáticos, ou,então, um tumor primário deaté 5 cm, com linfonodos axila-res afetados, porém móveis, semmetástase à distância, ou tumorcom mais de 5 cm sem compro-metimento linfonodal nemmetástases distantes.• Estágio 3: Quando o tumortem mais de 5 cm e há envolvi-mento dos gânglios linfáticosda axila do lado da mama afeta-da.• Estágio 4: Quando existemmetástases distantes, como nofígado, ossos, pulmão, pele ououtras partes do corpo.

6. Frequência eepidemiologia

O câncer de mama feminino éraramente encontrado antes dos 25anos de idade, exceto em casosfamiliares. A idade habitual que seidentifica gira em torno dos 30–80anos, sendo mais comum na meiaidade e velhice.

Encontra-se entre as doençasmais comuns e a que mais matamulheres no Brasil. Dados do Insti-tuto Nacional do Câncer –I NCAmostram que foram diagnosticadosneste ano cerca de 30 mil casosnovos e oito mil morreram por causada doença.

Este tipo de tumor foi considera-do o 3º que mais mata no Brasil. Aobtenção de uma história familiarconstitui um fator de risco para de-senvolvimento do câncer de mama; 5a 10% dos casos são atribuíveis áherança de um gene autossômicodominante.

A probabilidade de herança ge-nética aumenta se houver vários pa-rentes afetados e se for constatada aocorrência do câncer numa idadejovem.

Dois genes são responsáveis pelamaioria dos cânceres de mama here-ditário: o BRCA1 e BRCA2.

O BRCA1, localizado no cro-mos-somo 17, quando mutante, écapaz de produzir alto risco (talvezaté 85% ao longo da vida) de câncerde mama e também de câncer ovari-ano (talvez50% de risco ao longo davida). Cerca de 1/500 mulheres car-regam uma mutação BRCA1 na linha-gem germinativa, com freqüência,dando origem a uma história familiarconsistente. Homens com mutaçõesBRCA1 podem ter um aumento mo-desto no risco de câncer de próstata.

“... há uma série de heteroge-neidade mutacional descrito para oBRCA1, como em geral é o caso nosdistúrbios genéticos. Uma exceção sãoas populações Judia Askenazi, emque um de 100 indivíduos carregamuma deleção 2-pb particular a 185del AG no BRCA1.” 1

Mutações em outro gene no cro-mossomo 13, o BRCA2 tambémconfere alto risco de câncer de mama,e um risco um pouco menor decâncer ovariano; em homens essasmutações também os tornam pro-pensos ao desenvolvimento de cân-cer de mama.

“Estima-se que a freqüência dasMutações BRCA 2 seja cerca dametade da freqüência do BRCA 1 .Cerca de 1% de Judeus Askenazioutra vez tem uma mutação comumhá 6174 del T .” 2

A incidência global do câncer demama é menor em mulheres negras.As mulheres nesse grupo desenvol-vem câncer com uma idade maisavançada e apresentam um aumentoda taxa de mortalidade, em compara-ção com as caucasóides.

Os Estados Unidos e a EuropaSetentrional apresentam a maior inci-dência da doença.

Tumores de mama associadosao BRCA1 são mais prováveis emmulheres com filhos, possuem uma

fase S maior, e quantidade elevadade estrógeno e baixos receptores deprogesterona.

7. Hereditariedade

A transmissão hereditária de cân-cer de mama segue o clássico padrãomendeliano de transmissão autossô-mica dominante, com 50% das crian-ças de carreadoras herdando muta-ções BRCA1.

As portadoras femininas de mu-tações são estimadas a ter um riscode 85% de desenvolvimento de cân-cer de mama e/ou ovariano, comuma maior incidência de câncer bila-teral e mais de 50% dos cânceres demama ocorrendo antes dos 50 anos.(BIESECKER, et al. 1993).

“... o câncer de mama genéticoincide, geralmente, em mulheres jo-vens, antes dos 50 anos de idade. Aocorrência de mais de 2 casos emuma família de mulheres jovens,com menos de 50 anos, sugere queexiste a possibilidade de que seja umdefeito genético na família. Além dis-so, estes tumores costumam ser bila-terais; é freqüente que surjam nasduas mama, ás vezes não ao mesmotempo. A ocorrência de múltiplos ca-sos em mulheres jovens de tumoresbilaterais, chama a atenção paraque esta seja pela falta de risco .Outro sinal se dá pelo fato de o câncerde mama estar associado, nestes ca-sos genéticos, ao câncer de ovário. Aincidência, em uma mesma família,de uma mutação genética que pre-disponha à ocorrência do câncer.Estes casos constituem, aproximada-mente, de 6% a 10% dos casos gené-ticos de câncer de mama. De 90% a94% não temos uma história famili-ar.” 3

CROOP, et al (1990), constata-ram que mutações na linhagem ger-minativa do BRCA1 são responsáveispor 2% a 4% de todos os cânceresmamários. Embora mais que 90%deles sejam casos esorádicos ocor-rendo em mulheres sem evidênciasde susceptibilidade hereditária, aná-lises de espécies de tumores mamá-_________________________________________________________________

1 COLLINS,Francis S. 1998.2 TRENT, Jeffrey M. 1998.3 Revista Hands nº3 , 2002.


rios sugerem que anormalidadessomáticas adquiridas no BRCA1 pos-sam também desempenhar um papelem muitos desses cânceres.

8. Estudo de associação

Os dois principais genes respon-sáveis pela transmissão hereditária docâncer de mama, o BRCA1 e BRCA2,codificam proteínas de 1.863 e 3.350aminoácidos, respectivamente (Ane-xo 03). Ambos os genes são comple-xos formados por mais de 20 exons.

O BRCA1 foi identificado nolócus 17q21. Este gene codifica umaproteína zíncica cujo produto pode,portanto, atuar como fator de trans-crição. (FAUCI, et al 1998) descreveuque este gene possui 22 exons codi-ficantes e 2 exons não-codificantes,estendendo-se por cerca de 100 kbde seqüência genômica. Seu produtoé uma proteína de 1.863 aminoácidos.

O BRCA2, localizado no cro-mos-somo 13q12-q13, está associadocom uma maior incidência de câncerda mama em homens do que emmulheres, (FAUCI, et al 1998). Estegene possui 27 exons dispersos por70 kb de DNA genômico, e seu trans-crito estende-se por cerca de 10 à 12

kb codificando para uma proteína de3.418 aminoácidos.

Acredita-se que o BRCA1 e oBRCA2 se comportam como genessupressores de tumores clássicos, eque com a perda de uma cópia pre-dispõem o portador ao desenvolvi-mento do câncer (BAST, et al. 2000).

WOOSTER, et al. (1994), estuda-ram o acoplamento do genoma em15 famílias com alto risco de câncerde mama no BRCA1 em 17q21. Estaanálise descobriu um segundo lugarsuscetível ao câncer de mama, oBRCA2 no cromossomo 13q12–q13.O estudo em BRCA2 confere um altorisco de câncer de mama e não con-fere um risco substancialmente ele-vado de câncer ovariano, como é orisco do BRCA1.

Várias pesquisas indicaram umaassociação entre BRCA1 e a proteínap53, e o encarecimento subseqüentede atividade de p53 incrimina BRCA1.O BRCA1 forma complexos comBRCA2 e Rad 51, que é homólogo dogene Rec A da E. coli em humanos eque é essencial à recombinação nor-mal e estabilidade do genoma (BAST,et al 2000).

O BRCA1 também pode fazerum papel de regulação na transcri-

ção, controle do ciclo celular e de-senvolvimento. O BRCA1 foi associ-ado com a RNA polimerase holoenzi-ma 32 e fita CREB33, que implica naregulação de transcrição.

Em uma mulher que desenvolvecâncer de mama, antes dos 40 anos, achance que ela leva uma mutação emBRCA1 pode ser tão alta quanto 10%.O que não é aplicado para BRCA2,que pode ser associado a uma idadeligeiramente mais elevada.

A prevalência de certas muta-ções de BRCA1 e BRCA2 é ocasional-mente mais alta que o esperado,devido à transmissão aumentada dealgumas mutações, em certas popu-lações, devido ao efeito do fundador(BAST, et al. 2000).

Foram identificadas mutações defundador características para BRCA1e BRCA2 em famílias de JudeusAshkenazi e de descendentes na Is-lândia, Finlândia, Hungria, Rússia,França, Holanda, Bélgica, Suécia, Di-namarca e Noruega. A maioria dosestudos realizados em BCRA1 eBCRA2 foram feitos em caucasóidesdos Estados Unidos e Europa (BAST,et al. 2000).

Significantemente, existem me-nos dados sobre as taxas de muta-

2ACRBe1ACRBsenegsodseõçnufesedadeirporpsaodnartsomovitarapmocordauQ:1alebaT

1ARCB 2ARCB

omossomorC 12q71 21q31eneG bk001 bk07

aníetorP adetnenopmoCsodicáonima368.1esaremilop-ANRamizneoloh

sodicáonima814.3

oãçnuF mocegaretnIlaromutrosserpuSonlepaplevíssoPseraelcunsaníetorp

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mocegaretnIlaromutrosserpuSonlepaplevíssoPseraelcunsaníetorp

ANDodoraperseõçatuM sadacifitnedi005> sadacifitnedi002>

amamedrecnâcedocsiR edadiedsona08soa%07edsiaM edadiedsona07soa%06edsiaMoicíniededadI atniuqáatrauq(mevojsiamedadI

)adivedadacéd.1ARCBoeuqodasodisiam;sona05

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.1002.T,SNILLOC;.V,RAMUK;.S.R,NARTOC:etnoF


ções de BRCA1 e BRCA2 em famíliasde outros grupos étnicos e raciais(BAST, et al 2000).

TRAVTIGIAN, et al (1996), ob-servaram como o BRCA1, a proteí-na de BRCA2 é altamente carrega-da, ¼ dos resíduos é ácido ou bási-co. Porém, havia poucas pistas so-bre a função bioquímica de BRCA2.Foram observados níveis mais altosde expressão em mama e timo, eligeiramente níveis mais baixos empulmão, ovário e baço. Em estudode 18 famílias, em 9 foi observadoa deleção de 3 nucleotídeos quealtera a armação de leitura, e con-duzem a mutilação da proteínaBRCA2. Os autores notaram que oBRCA2 é notavelmente semelhantea BRCA1. Ambos possuem o exon11 grande; em ambos a traduçãocomeça no exon 2; ambos têm su-cessões de codificação que são ri-cas em Adenina; e são compostosde aproximadamente 70 Kb de Dnagenômico. O BRCA2 é composto de27 exons.

WEBER, et al. (1996), estudaram3 exons de BRCA2 ( exons 10, 11 e27) em 69 amostras aleatórias detumor de mama congelados. Elesidentificaram uma mutação somáticatruncada de BRCA2 em carcinomaductal primário: deleção de 1 par debases e substituídas pela adição de 9aminoácidos modernos e terminaçãoda tradução no códon 894.

CONNOR, et al. (1997), em seusestudos com ratos observaram que oBRCA1 e BRCA2 são altamente ex-pressos proliferando células ao limi-te de G1/S do ciclo celular da mamacomum vistos em pacientes commutações nestes genes, sugere queBRCA1 e BRCA2 possam estar agin-do no mesmo tempo.

SARAN, et al. (1997), identifica-ram uma interação de proteína deBRCA2 com a proteína de DNA con-serto Rad51. DAVIS, et al. (2001)mostrou que o BRCA2 faz um papelduplo na regulação da Rad51, que éuma proteína essencial para a recom-binação homóloga e conserto de DNA.

Primeiramente, as interações deRad51 e o BCR3, ou regiões de BCR4do BRCA 2, bloqueiam a formação defilamentos nucleoprotéicos porRad51. Alterações para a região deBCR3 que imitam mutações associa-

das ao câncer de BRCA2 não exibemeste efeito.

Em segundo, o transporte deRad51 para o núcleo estava defeituo-so em células que carregam umamutação associada ao câncer deBRCA2. Assim, BRCA2 regula a loca-lização intracelular e a habilidade deligação de DNA de Rad51.

STRUEWING, et al. (1997), estu-daram 120 portadoras de mutaçõesem BRCA1 e BRCA2. As mutaçõesem BRCA1 estudadas eram 185delAG,e 5382insC; a mutação de BRCA2estudada era 6174delT. O risco calcu-lado de câncer de mama em pacien-tes com até 70 anos era de 56%, decâncer ovariano 16%; e de câncer depróstata 16%, não havia diferençasignificante no risco de câncer decólon entre os parentes dos portado-res. Concluíram que de 2% de JudeusAshkenazi levam mutações emBRCA1 e BRCA2, o que confere umrisco aumentado de câncer de mama,ovário e próstata.

NEUHAUSEN, et al. (1998), ana-lisaram famílias Judias e identificou 3mutações mais freqüentes, possivel-mente através do efeito do fundadorque são: 185del AG e 5832 ins C emBRCA1 e 6174 del T em BRCA2.

JERNISTON, et al. (1999), con-cluíram em seus estudos que os por-tadores do BRCA1 e mutações doBRCA2, que têm filhos, estão maissuscetíveis a desenvolverem câncerde mama, antes dos 40 anos, que asportadoras que são nulíparas. Cadagravidez aumenta o risco de desen-volver câncer de mama.

As mutações da linhagem ger-minativa do BRCA1 são responsáveispor 2% a 4% de todos os cânceresmamários. Embora mais que 90%deles sejam casos esporádicos, ocor-rendo em mulheres sem evidênciasde susceptibilidade hereditária, aná-lises de espécies de tumores mamá-rios sugerem que anormalidadessomáticas adquiridas no BRCA1 pos-sam também desempenhar um papelem muitos desses cânceres (CROOP,et al. 1990).

FODOR, et al. (1998) determi-nando a freqüência do BRCA1 co-mum e mutações de BCRA2: 185 delAG, 5382 ins C e 6174 del T, o DNAfoi analisado para as 3 mutaçõesatravés de hibridização de oligonu-

cleotídeos alelo–específicos (ASO).Oito pacientes (3%) eram heterozi-gotos para a mutação 185 del AG,dois pacientes (0,75%) para 5382 insC e oito pacientes (3%) para 6174del T. O risco vitalício para câncerde mama em Judeus Ashkenazi por-tadores do BCRA1 185del AG ouBRCA2 6147 del T foram calculadaspara ser 36%, aproximadamente 3vezes o risco global para a popula-ção em geral.

Na Austrália, BAHAR, et al.(2001), encontraram em JudeusAshkenazi a mesma prevalência altade 4 mutações do fundador, da mes-ma forma que acha em JudeusAshkenazi nos Estados Unidos e Isra-el. As quatro mutações analisadas era185 del AG e 5182 ins C em BRCA1;6174 del T em BRCA2 e 11307K emAPC.

STRUEWING, et al. (1995) de-clarou que mais de 50 mutações semigual tinham sido descobertas no geneBRCA1, em indivíduos com câncerde mama e ovário. Em genealogiasde alto risco, portadoras femininasde uma mutação de BRCA1 tiveram80 a 90% de risco vitalício em câncerde mama e 40 a 50% de risco decâncer de ovário.

STRUEWING, et al. (1995), de-terminaram a freqüência da mutação185 del AG em 858 Ashkenazi, quebuscam prova genética para condi-ções sem conexão para câncer, e em815 pessoas de referência não seleci-onadas pela origem étnica. Eles acha-ram a mutação 185 del AG em 0,9%de Ashkenazi . Os resultados sugeri-am que 1/100 mulheres de descen-dência Ashkenazi possam ter altorisco de desenvolver câncer de mamaou ovário.

Entre as 39 mulheres Judias comcâncer de mama antes dos 40 anos,(FITZ, et al. 1996) acha que 8 (2%)carregam a mutação 185 del AG.

Em câncer de mama esporádico,(THOMPSON, et al. 1995) acha oRNAm do BRCA1 em níveis notada-mente diminuídos durante a transcri-ção de carcinoma in situ para câncerinvasivo.

THOMPSON, et al. (1995), acha-ram que aquela inibição experimen-tal da expressão de BRCA1 com oli-gonucleotídeos antisense produziucrescimento acelerado de células nor-


mais e células malignas, mas nãoteve nenhum efeito em célulasepiteliais não mamárias. Eles inter-pretaram estes resultados como indi-cado que o BRCA1, normalmentepode servir como um regulador ne-gativo de crescimento de célulasepiteliais mamárias.

HEDENFALK, et al. (2001),usando a tecnologia de microarraypara determinar a expressão degenes em câncer de mama, foi acha-do BRCA1 positivos como constata-do com cânceres de mama BRCA2positivos. A suspeita de que umadiferença poderia ser achada veiodo fato que os 2 tipos de tumoressão freqüentemente distintos,histologicamente. Além disso, tu-mores com mutações de BRCA1 sãogeralmente negativos para estróge-no e receptores de progesterona,considerando que a maioria dostumores, com mutações de BRCA2,é positivo para receptores dehormônios. Amostras de RNA detumores primários de 7 portadoresda mutação de BCRA1 e 7 portado-res da mutação de BCRA2 foi comum microarray de 6.512 clones decDNA de 5.361 genes.

ROA, et al. (1996), observaram amutação 185 del AG em 1,09% deaproximadamente 3000 JudeusAshkenazi, e a mutação 5382 ins Cem 0,13%, a análise do BCRA2 em3.058 indivíduos da mesma popula-ção mostraram uma freqüência deportador de 1,52% pela 6174 del T.Estes dois alelos são os mais freqüen-tes, que predispõem o câncer demama hereditário entre JudeusAshkenazi .

BAR–SADE, et al. (1997), emestudo com 639 Judeus Iraquianossaudáveis, que são um grupo depouco risco para a mutação 185 delAG, que é predominantemente emAshkenazi, foram identificados 3 in-divíduos portadores da mutação 185del AG . As análises de haplótipoiraquiano mostram que 2 comparti-lham um haplótipo em comum com 6portadores Ashkenazi, e um terçoteve um haplótipo que diferiu por umúnico marcador. Isto sugeriu que amutação 185 del AG do BCRA1 podeter sugerido antes da dispersão daspessoas judias no Diáspora, pelamesma época de Cristo.

Alelos mutantes de genessupressores de tumores, quando her-dados, predispõem os indivíduos atipos particulares de câncer. Alémde um envolvimento na suscetibili-dade herdada para câncer, estesgenes de supressão tumoral sãoobjetivos para mutações somáticasem tipos de câncer esporádicos. Umaexceção é o BRCA1, que contribuicom uma fração significante de cân-cer de mama e ovário, mas sofremutação a taxas baixas em câncerde mama e ovário esporádicos. Esteachado sugere que outros genespossam ter como objetivo principalcausar mutações somática em carci-noma de mama. O outro gene BRCA2conta, neste estudo, com uma pro-porção quase igual a do BRCA1. OBRCA1 e o BRCA2 se comportam deforma dominante, tendo em vistaque herda um alelo mutante e têmum risco maior de desenvolver umtumor; tumores que eles desenvol-verem perdem o alelo do tipo selva-gem através da perda da heterogozi-dade. (TENG, et al. 2002.)

STEPHENSON, em (2003), estu-dou mulheres com mutações noBRCA1 e BRCA2, que têm um riscomais elevado de desenvolverem cân-cer de mama, se fizeram uso demétodos contraceptivos orais, por,pelo menos, 5 anos ou antes de 1975(quando preservativos orais geral-mente tinham um conteúdo de estró-geno mais alto que os produzidosdepois). Estas têm um risco vitalíciode 50 a 80% de desenvolverem cân-cer de mama. O estudo contou com1311 pares de mulheres que eramportadoras de mutações danosas, emum ou ambos genes, a metade dequem teve câncer de mama e a meta-de de quem não tiveram.

LLORT, et al. (2002), em seusestudos com pacientes espanholas,analisando mutações em BRCA1 eBRCA2 têm uma proporção hereditá-ria significativa baixa, no que dizrespeito ao câncer de mama. O espec-tro mutacional nestes genes é muitogrande, com centenas de mutações deBRCA diferentes mundialmente infor-madas. Mutações devido ao efeito dofundador têm uma fração significativade todas as mutações de grupos étni-cos. Em estudo com 35 famílias espa-nholas que desenvolveram câncer de

ovário e mama, foram achadas 13mutações, das quais se tinham notíci-as de apenas 3, na Espanha. As dezmutações modernas são: IVS5+1G>A,1491delA Leu 1086 Ter, e Gln 895Terem BRCA1; Glu 49 Ter, 5373del GTAT,5947del CTCT, 6672 del TA, 8281 insA, e Pro 3039 Leu em BRCA2. Esteestudo, comparado com outros reali-zados no país, mostra que das váriasmutações encontradas na Espanha,nenhuma parece ter relação, com efei-to, do fundador.

KUMAR, et al. (2002), analisa-ram a sucessão de codificação dogene BRCA1 e BRCA2 em 14 pacien-tes de câncer de mama hereditárioem mulheres Indianas. A análise foirealizada em gel de eletroforese sen-sível (CSGE), seguido de seqüencia-mento. Três mutações delas moder-nas no exon 7, enquanto a outra é umapagamento de par básico no exon11 que resulta em mutilação de pro-teína. A mutação 185 del AG, previ-amente descrita, em Judeus Askenazi,também foi encontrada nesta popu-lação. Mesmo este sendo o 1º estudorealizado com famílias da Índia (14no total) sugestiona uma baixaprevalência, mas com um envolvi-mento definitivo de mutações nogene BCRA1, entre mulheres India-nas com câncer de mama.

A população do Paquistão pos-sui uma taxa de câncer de mamaextremamente alta para populaçõesAsiáticas e uma das taxas mais altas,mundialmente, do câncer ovariano.Neste estudo com 341 casos de cân-cer de mama, 120 casos de câncerovariano e 200 controles femininos.A prevalência de mutações no BRCA1e BRCA2 em pacientes com câncerde mama são de 6,7%, de câncerovariano são 15,8%. Mutações nogene BRCA1 respondem por 84% dasmutações de câncer ovariano e 65%das mutações de câncer de mama. Amaioria das mutações descobertassão novas para o Paquistão. Cincomutações de BRCA1: 2080 ins A,3889 del AG, 4184 del 4, 4284 del AG,e IVS14 – 1A>G , e uma mutação deBRCA2 3337C>T, foram encontradasem múltiplos casos e representamfortes candidatos ao efeito do funda-dor, segundo (LIEDE, et al. 2002).

TERESCHENKO, et al. (2002), es-tudaram 25 famílias Russas com cân-


cer de mama e ovário, onde analisa-ram mutações nos genes BRCA1 eBRCA2, usando análise de heterodu-plex e multiplex. Além disso, foramtestadas 22 pacientes com câncer demama diagnosticados antes dos 40anos, sem história familiar e 6 pacien-tes com câncer de mama bilateral. Afreqüência de mutações no BRCA1era de 16%. Uma mutação de BRCA1,5382 ins C, foi achada em 3 famílias.Este estudo juntamente com outrosugere que 5382 ins C no BRCA1 éuma mutação de fundador na popula-ção Russa. No BRCA2 foram encontra-das 3 mutações em pacientes comcâncer de mama sem história familiar,2 em pacientes jovens e 1 em pacien-tes com câncer bilateral. Foram en-contradas 4 mutações modernas : 695ins T, 1528 del 4, 9318 del 4, S1099X.

No ano de 2000 foram diagnosti-cados quase 80.000 casos novos decâncer de mama na Índia. Embora aidentificação de BRCA1 e BRCA2 au-mentou a compreensão na genéticado câncer de mama em populações dedescendência da Europa Ocidental, opapel destes genes no restante dapopulação indiana é inexplorado. Aanálise de 20 pacientes com câncer demama com qualquer história familiar,ou idade precoce, conduziu a identi-ficação de duas variantes (331+1G>T;4476+2T>C) em BRCA1 (10%)(SAXENA, et al. 2002).

RUIZ, et al. (2002), analisaramheteroduplex de pacientes mexica-nos com câncer de mama, ondeidentificaram mutação truncada emBRCA1 e BRCA2 (3857 del T; 2663 –2664 ins A) e oito variantes raras designificação desconhecida, princi-palmente no gene BRCA2, um casode câncer de mama masculino tam-bém foi identificada. A maioria dasalterações parecia ser distinta comuma única observada em mais deuma família.

LIEDE, et al. (2002), encontra-ram duas famílias de descendênciaaborígines, ambas com as mesmasalterações de BRCA1 (1510 ins G;1506 A>G). As famílias representamduas Aborígines de tribos canaden-ses, embora uma origem ancestralcomum é provável. Esta é a primeiraevidência de uma mutação de BRCA1,específica para pessoas aboríginesdo Norte da América.

A detecção de mutações nos genesBRCA1 e BRCA2 é feita por técnicas debiologia molecular capazes de identifi-car a alteração de uma única base naseqüência de DNA. Devido ao grandetamanho das seqüências de BRCA1 e 2,primeiramente, busca-se identificar qualexon contém o sítio mutado, antes dese proceder ao sequenciamento doDNA. A seqüência de DNA correspon-dente aos vários exons é amplificadapor PCR (reação em cadeia da polime-rase) para a realização desses testes.

Para o screening inicial de muta-ções, uma técnica muito utilizada é ade single strand conformationpolymorphism - SSCP, combinadacom heteroduplex analysis. A técnicade SSCP baseia-se no fato de que aconformação tridimensional de frag-mentos de DNA de fita simplesdepende da seqüência de nucleotí-deos, sendo que a diferença de umnucleotídeo altera o padrão de mi-gração eletrofo-rética. A técnica deheteroduplex analysis deriva da ob-servação de que, em reações de PCR,onde estão presentes moléculas deDNA selvagens e mutantes, duranteos últimos ciclos, podem ser forma-dos heteroduplex entre essas duasespécies de moléculas, os quais terãoum padrão de migração eletroforéticadiferente dos homoduplexes. Utili-zando-se fragmentos de tamanho en-tre 100 e 350 pares de bases, a taxa dedetecção de mutações para o SSCPcomo para o heteroduplex analysis, ea associação dos dois métodos podeelevar essa taxa para perto de 100%(sob condições bem controladas eprocessamento semi-automatizado).

Após a identificação do exon,que a abriga a mutação, esta é carac-terizada pelo sequenciamento doDNA. Conhecida a mutação, torna-sepossível, também, por sequenciamen-to, pesquisá-lo em outros membrosda família do paciente, com vistas aoaconselhamento genético.

9. Discussão

Com a identificação dos doisprincipais genes responsáveis pelocâncer de mama hereditário, o BRCA1e o BRCA2, a genética deu um grandesalto em busca da cura de doençasque são estritamente comuns e quemais matam mulheres.

Em muitas populações, algumasmutações tornam-se mais freqüentesdevido ao efeito do fundador. Umadas populações que teve suas muta-ções amplamente estudadas foi o deJudeus Askenazi, onde cerca de 2%da população leva mutações emBRCA1 e BRCA2 o que confere umrisco aumentado de câncer de mama,ovário e próstata.

Em Judeus Askenazi, as princi-pais mutações encontradas devidoao efeito do fundador e que jáforam descritas em inúmeros paí-ses, são a 185 del AG e 5382 ins Cno gene BRCA1, e no BRCA2 a 6174del T. A prevalência alta destasmutações de fundador na linhagemgerminativa são responsáveis por2% a 4% de todos os tipos de câncermamário.

Em pacientes Espanholas, dasinúmeras mutações já analisadas emBRCA1 e BRCA2 tem uma proporçãohereditária significativa baixa. A com-paração com outros estudos realiza-dos no país mostra que nenhuma temrelação, com efeito, do fundador.

Em mulheres indianas, 3 muta-ções modernas foram encontradas ea 185 del AG foi amplamente encon-trada. Existe uma baixa prevalência,mas com um envolvimento definitivode mutações no gene BRCA1.

No Paquistão, dentre as muitasmutações já descritas, a 3337 C>T noBRCA2 representam uma fortecandidata ao efeito do fundador.

Na Rússia, a mutação no BRCA15382 ins C foi caracterizada por seruma mutação de fundador, e tribosdo Canadá também têm 2 mutaçõesque são estritamente freqüentes.

A identificação de portadoras demutações BRCA1 está limitada a umnúmero contado de laboratórios, comacesso para raras famílias, na qual aanálise de vários parentes ofereceinformação suficiente para identifi-car carreadores com um alto grau decerteza. Com base na taxa decarreadoras de uma em 200 a 400mulheres, a demanda para umrastreamento populacional será pro-vavelmente substancial.

A atenção deve ser voltada paraos riscos sociais do teste genético,como potencial perda de seguro,estigmatização e discriminação doempregado.


Uma vez que o gene BRCA1 eBRCA2 tenham sido identificados eum teste clínico para mutações co-muns esteja disponível, os proble-mas levantados no aconselhamentode uma única família irão assumirenormes proporções. A prevalênciade carreadoras de mutações BRCA1,com um risco de aproximadamente85% de desenvolverem câncer demama, em muito excedem a inci-dência de qualquer outra doençagenética para qual o rastreamentopré-sintomático esteja atualmentedisponível.

O rastreamento para mutaçãoBRCA1 é provavelmente o 1º testepré-sintomático que terá lugar naprática clínica geral, e um sucessoou falha desses esforços trará umgrande impacto no futuro deste cam-po, com todo o seu potencial para oavanço da medicina preventiva,evitando doenças e reduzindo oscustos da saúde. Tem-se a esperan-ça de que, com o rastreamento ge-nético, a suscetibilidade ao câncerde mama, muitas armadilhas pos-sam ser evitadas.

10. ReferênciasBibliográficas

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Pesquisa

Biosurfatantes a partir deresíduos agroindustriais

Márcia NitschkeDoutoranda em Ciência de AlimentosFaculdade de Engenharia de Alimentos – [email protected]

Gláucia Maria PastoreProfa Dra - Laboratório Bioquímica de AlimentosFaculdade de Engenharia de Alimentos – [email protected]


Avaliação de resíduos agroindustriais como substratos para a produção de biosurfatantes por Bacillus

Introdução

Os surfatantes constituem umaclasse importante de compostos quí-micos amplamente utilizados em di-versos setores industriais. Estima-seque a produção mundial de surfatan-tes exceda 3 milhões de toneladaspor ano (Banat, 2000), sendo utiliza-dos principalmente como matéria-prima na fabricação de detergentesde uso doméstico.

A grande maioria dos surfatan-tes disponíveis comercialmente ésintetizada a partir de derivados depetróleo. Entretanto, o crescimentoda preocupação ambiental dos con-sumidores combinado com novaslegislações de controle do meio am-biente levaram os cientistas apesquisar surfatantes biológicoscomo alternativa para os produtosexistentes.

Os biosurfatantes produzidospor microrganismos vêm, nos últi-mos anos, despertando considerá-vel interesse devido à sua naturezabiodegradável, baixa toxicidade ediversidade de aplicações. Entre asaplicações comerciais dos biosurfa-tantes destacam-se a recuperaçãodo petróleo, biorremediação depoluentes, formulação de lubrifican-tes, além de diferentes utilizaçõesna indústria têxtil, cosmética, ali-mentícia e farmacêutica.

Atualmente, os biosurfatantesainda não são amplamente utilizadospela indústria, devido ao seu altocusto de produção, associado a mé-todos ineficientes de recuperação doproduto e ao uso de substratos caros.

Porém, o problema econômico daprodução de biosurfatantes pode sersignificativamente reduzido por meiodo uso de fontes alternativas de nu-trientes facilmente disponíveis e debaixo custo.

Uma possível alternativa paraa produção de biosurfatantes seriao uso de subprodutos agrícolas oude processamento industrial. Atual-mente, o aproveitamento de resí-duos vem sendo incentivado porcontribuir para a redução da polui-ção ambiental, bem como por per-mitir a valorização econômica dosresíduos que seriam simplesmentedescartados.

O que são biosurfatantes?

Os biosurfatantes possuem umaestrutura comum: uma porçãolipofílica, usualmente composta porcadeia hidrocarbonada de um ou maisácidos graxos, que podem sersaturados, insaturados, hidroxiladosou ramificados, ligados a uma porçãohidrofílica, que pode ser um éster,um grupo hidróxi, fosfato, carboxilatoou carbohidrato (Cameotra & Makkar,1998; Bognolo, 1999). Os microrga-nismos produtores distribuem-se emdiversos gêneros, sendo a maioriaproduzida por bactérias. As princi-pais classes de biosurfatantes inclu-em glicolipídios, lipopeptídios elipoproteínas; fosfolipídios e ácidosgraxos; surfatantes poliméricos e sur-fatantes particulados (Desai &Desai,1993).

Em relação aos surfatantes con-vencionais, os biosurfatantes apre-


sentam vantagens como (Bognolo,1999):

• elevada atividade superficial einterfacial, o que os torna com-paráveis ou superiores aos sinté-ticos (detergentes aniônicossulfatados) em termos deefetividade e eficiência;• maior tolerância a pH, tem-peratura e força iônica;• biodegradabilidade;• baixa toxicidade.

Os biosurfatantes apresentamainda a vantagem de poder ser sin-tetizados a partir de substratosrenováveis e de possuir grande di-versidade química, possibilitandoaplicações específicas para cada casoparticular (Desai & Banat, 1997).Outra vantagem dos biosurfatantesreside no fato de não serem com-postos derivados de petróleo, fatorimportante à medida que os preçosdo petróleo aumentam. Além disso,a estrutura química e as proprieda-des físicas dos biosurfatantes po-dem ser modificadas através de ma-nipulações genéticas, biológicas ouquímicas, permitindo o desenvolvi-mento de novos produtos para ne-cessidades específicas.

Substratos não convencionais

O sucesso da produção indus-trial de biosurfatantes depende dodesenvolvimento de processos maisbaratos e do uso de matérias-primasde baixo custo, uma vez que estasrepresentam entre 10% a 30% docusto total (Cameotra & Makkar,1998). Apesar disso, poucos traba-lhos têm sido publicados com vistasa produzir biosurfatantes a partir deresíduos (Tabela 1). A dificuldade

na seleção de um resíduo está emencontrar a composição adequadade nutrientes que permita o cresci-mento celular e o acúmulo do pro-duto de interesse. Em geral, substra-tos agroindustriais que contenhamaltos níveis de carbohidratos ou delipídeos suprem a necessidade defonte de carbono para a produçãode biosurfatantes. O estabelecimen-to de um processo biotecnológico apartir desses substratos alternativostambém apresenta outra dificulda-de, que é a padronização devido àsvariações naturais de composição,bem como os custos de transporte ,armazenagem e tratamento prévionecessários. Entretanto, a utilizaçãode resíduos pode diminuir os custosde produção para níveis competiti-vos em relação aos similares obtidospor via petroquímica e, ao mesmotempo, reduzir os problemas ambi-entais relativos ao descarte e aoscustos do tratamento (Mercade &Manresa, 1994; Makkar & Cameotra,1999a; Makkar & Cameotra, 2002).Finalmente, deve-se considerar queo Brasil é um país essencialmenteagrícola e que, portanto, a quantida-de e a facilidade de acesso aossubprodutos agroindustriais é bas-tante significativa.

Biosurfatantes produzidos porBacillus

Algumas bactérias do gêneroBacillus produzem diversos lipo-peptídeos que demonstram ativida-de tensoativa ( Rosenberg & Ron,1999). As culturas de Bacillussubtilis produzem um lipopeptídeocíclico conhecido como surfactinaou subtilisina (Arima et al., 1968),considerado um dos mais potentesbiosurfatantes conhecidos (Figura1). A surfactina também demons-trou atividade anticoagulante, anti-tumoral, antimicrobiana, e, mais re-centemente, estudos comprovaramatividade antiviral e antimicoplas-ma (Vollenbroich et al, 1997a,1997b).

O objetivo deste estudo foi veri-ficar a potencialidade do uso de subs-tratos alternativos para a produçãode biosurfatante por isolados deBacillus.

Materiais e Métodos

Foram utilizados cinco isola-dos de Bacillus sp. produtores debiosurfatante pertencentes à cole-ção de culturas do Laboratório deBioquímica de Alimentos. Para a

Figura 1. Estrutura da surfactina produzida por Bacillus subtilis.

setnatafrusoibedoãçudorpansoudíseredoãçazilituedsolpmexE.1alebaT

sotartsbuS acimíuqessalC omsinagrorciM aicnêrefeRavilooelóoãçartxeetneulfE soedípilonmahr .pssanomoduesP edacreM .late 3991,ajosedoelóonifersoudiseR soedípilonmahr asonigurea.P solabA late 1002,

satatabedmegavalaugÁ soedítpepopil silitbus.B &xoF alaB 0002,oçaleM soedítpepopil silitbus.B 7991,artoemaC&rakkaM

etieledoroS soedípilonmahr asonigurea.P hcoK late 8891,afrutedaugÁ soedítpepopil silitbus.B 7891nagilluM&drappehS

odasuarutirfedoelÓ soedípilonmahr asonigurea.P abaH late 0002,odasuetnacifirbuloelÓ soedípilocilg .pssuccocodohR edacreM late 6991,

odazinietorpsedetieloroS soedípilorohpos alocibmob.C leinaD late 8991,arieupinaM soedítpepopil silitbus.B sotnaS late 9991,


produção de biosurfatante foramutilizados:

• melaço (3% v/v sólidos solú-veis) pH 6,0;• manipueira (resíduo líquidoproveniente da fabricação de fa-rinha de mandioca) pH 5,8-5,9;• soro de leite (fabricação dequeijo mussarela) pH 6,4 ;• meio sintético proposto porCooper et al. (1981) pH 6,8-6,9.

A manipueira foi tratada previa-mente com aquecimento a 100°C,por 3 minutos e centrifugação a10.000 rpm, por 20 minutos, pararemoção de sólidos. O pH dos resí-duos não foi ajustado. Os meiosforam esterilizados em autoclave a121°C, por 20 minutos.

Uma alçada das culturas mantidasa 4°C foi transferida para erlenmeyer de50 mL, com 20 mL de caldo nutriente eincubada em agitador rotatório a 120rpm, 30°C, por 24 horas. Após, 1 mL decada cultura a ser testada foi inoculadoem frascos erlenmeyers de 50 mL con-tendo 15 mL dos respectivos meios,que foram incubados em agitadorrotativo tipo shaker a 30°C e 150 rpm,por 72 horas. Os meios foram centrifu-gados a 10.000 rpm, por 15 minutos, eo sobrenadante, livre de células, utiliza-do para determinações analíticas.

A tensão superficial foi determi-nada em tensiômetro Krüss, modeloK12, utilizando o método da placa. Obiosurfatante foi isolado do meio decultivo por precipitação ácida a pH2,0, seguida de extração com cloro-fórmio/metanol (65:15), segundoMakkar & Cameotra (1999b). A ativi-dade emulsificante (E

24) foi realizada

em tubos com tampa rosca contendo4 mL de solução aquosa, 1mg/mL debiosurfatante (obtido em manipueira)adicionados de 6 mL de hidrocarbo-netos, sendo que cada tubo foi sub-metido a vortex máximo por 2 minu-tos e deixado em repouso por 24horas. O índice E

24 foi determinado

medindo-se a altura da camada emul-sionada (cm) dividindo-a pela alturatotal de líquido x 100. A remoção depetróleo de areia contaminada foitestada através da saturação de 60g deareia com 5 mL de petróleo. Porçõesde 20g da areia contaminada foram

colocadas em erlenmeyer de 250 mL,adicionando-se-lhe 20 mL de água(frasco controle) e 20 mL de soluçãoaquosa 1mg/mL de biosurfatante ob-tido (frasco teste). Os frascos foramagitados a 150 rpm, por 12 horas emtemperatura ambiente. Retirou-sedeles o líquido da primeira lavagem eprocedeu-se a uma segunda adição de20 mL de água e biosurfatante, incu-bando-os nas mesmas condições aci-ma. O líquido da segunda lavagem foiremovido e a areia foi retirada dofrasco sendo colocada em estufa a50°C até a secagem.

Resultados e Discussão

Os resultados obtidos nos en-saios de produção de biosurfatante emdiferentes substratos alternativos sãomostrados na Figura 2. Nota-se quetodos os isolados testados demonstra-ram capacidade de produzir biosurfa-tante e, conseqüentemente, de reduzira tensão superficial dos meios testa-dos, sendo que a manipueira forneceuas maiores percentagens de redução ,na ordem de 42% , para todos osisolados testados; entretanto, o soro deleite apresentou uma redução média

Figura 2. Percentagem de redução na tensão superficial obtida por isolados de Bacillussp. em diferentes substratos.

Figura 3. Atividade emulsificante (E24) de solução de biosurfatante frente à diferentes

hidrocarbonetos. (1) Hexano, (2) Tolueno, (3) Heptano, (4) Decano, (5) Querosene,(6) Tetradecano, (7) Hexadecano, (8) Óleo de soja, (9) Gordura de côco.


de 10% , ressaltando que o isoladoLB5a não produziu surfatante nesseresíduo. O melaço também demons-trou boa potencialidade como substra-to para produção de biosurfatante pe-los microrganismos testados e apre-sentou redução média de, aproxima-damente, 33%. O meio sintético utili-zado como padrão foi definido porCooper et al. (1981), para a produçãode surfactina por Bacillus subtilis ATCC21332 e vem sendo utilizado, desdeentão, como uma referência para aprodução de biosurfatantes de Bacillus.Nota-se que, apesar de permitir a pro-dução de biosurfatante por todos osisolados, esse meio mostrou resulta-dos inferiores (com redução média de21,5%) aos da manipueira e do mela-ço, sugerindo que estes dois resíduospossuem uma composição de nutrien-tes adequada para a produção de bio-surfatantes.

Embora a composição químicavarie de acordo com a época do ano ecom o tipo de cultivar de mandioca, amanipueira possui em sua composiçãouma grande quantidade de carbohidra-tos (40-60 g/L ) destacando-se ainda apresença de frutose, glicose e sacarose,além de nitrogênio (1-2 g/L) e mine-

rais como P, K, Mg, Mn, S, Fe, Cu, Zn,Ca (Cereda, 1994). Segundo Cooper etal. (1981), os sais minerais, principal-mente Fe e Mn, são fatores nutricionaisimportantes para a produção de surfa-tantes por linhagens de Bacillus. Apresença desses minerais, além defontes de carbono e nitrogênio, seja,provavelmente, o principal motivo dehaver maior produção de biosurfatan-tes nesse resíduo.

Em adição à tensão superficial,a estabilização de emulsões é freqüen-temente utilizada como um indicadorda atividade superficial (Abu-Ruwaida

et al, 1991). A capacidade emulsificantedo biosurfatante obtido em manipueirapelo isolado LB5a foi avaliada atravésdo índice E

24 com diferentes hidrocar-

bonetos (Tabela 2). Os índices obtidos(60%-80%) revelam alta especificida-de do biosurfatante contra todos oshidrocarbonetos testados, formandoemulsões estáveis do tipo A/O (Figura3). O composto obtido possui potenci-al para uso na biorremediação, recupe-ração de petróleo e emulsificação deóleos e gorduras.

Com vistas a avaliar a capacida-de do biosurfatante produzido em

Figura 5 . Águas de lavagem da areia impregnada com petróleo.A1-A2: água; BS1-BS2: solução biosurfatante 1mg/mL.

Figura 4. Capacidade de remoção de petróleo de amostra de areia utilizando solução de biosurfactante.(1) Biosurfatantes, (2) controle, (3) água.

edadivitA.2alebaT

etnatafrusoibodetnacifislume

arieupinammeoditbo

otenobracordiH )%(42EonaxeH 6,66oneuloT 7,27onatpeH 6,66onaceD 4,07enesoreuQ 4,07onacedarteT 9,07onacedaxeH 0,96ajosedoelÓ 0,47ocôcearudroG 9,07

oelórteP 0,96


manipueira pelo isolado LB5a em re-mover petróleo de areia contamina-da, procedeu-se a um experimentoilustrado nas Figuras 4 e 5, onde seobserva que a areia tratada com solu-ção de biosurfatante apresenta aspec-to mais claro e as respectivas águas delavagem demonstram maior capaci-dade de recuperação do petróleo emrelação ao tratamento sem tensoativo.

Conclusões

Entre os resíduos agroindustriaistestados, a manipueira foi que de-monstrou a maior potencialidade parauso como substrato alternativo naprodução de biosurfatantes por isola-dos de Bacillus, sendo que o compos-to obtido apresentou capacidade parauso em biorremediação de poluentese em recuperação de petróleo.

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Controle de qualidadede ervas medicinais

Gabrielle MoucoAluna de graduação em Farmácia - [email protected]

Maira Jardim BernardinoAluna de graduação em Farmácia - [email protected]

Melânia Lopes Cornélio, Ph.DFarmacêutica, Ph.D- Química de Produtos NaturaisProfessora Titular da Disciplina de FarmacognosiaUNIP - Universidade [email protected]


Controle de qualidade de Phyllanthus niruri L . (quebra-pedra)

Pesquisa

Introdução

O controle de qualidade dadroga vegetal é imprescindível,pois muitas espécies vegetais sãovendidas sem nenhuma garantiade qualidade, o que favorece des-de a venda de espécies falsificadasaté o armazenamento inadequadoda droga vegetal durante a suacomercialização. A análise aqui des-crita foi realizado com a drogavegetal adquirida e conhecida po-pularmente como quebra-pedra. Ocontrole de qualidade dessa drogavegetal foi feito a começar da suadescrição microscópica, para veri-ficar a autenticidade da espécie afim de evitar equívocos. Tambémforam realizados testes químicospara confirmar as principais clas-ses de seus constituintes químicosdescritos na literatura (De Souzaet. al., 2002; Duke, 2000). Os inte-resses terapêuticos do Phyllanthusniruri L. provêm principalmentede suas propriedades diuréticaspara o combate de cálculos renais.Devido a isso, estão sendo desen-volvidos vários estudos para isolara substância responsável por taispropriedades, além de elucidar amelhor maneira de tratamento(Teske et. al., 1995).

Estudos experimentais com asfolhas e as sementes também têmdemonstrado a sua ação hipoglice-miante, antibacteriana e anticance-rígena. Em ensaios especiais, mos-trou-se que é ativa contra o vírus dahepatite B in vivo e in vitro. Alémdisso, possui a virtude de dissolver

cálculos renais, impedindo a con-tração do ureter e promovendo asua desobstrução. Desenvolve ati-vidade diurética pela elevação dafiltração glomerular e excreçãourinária dos sais de uratos (Tona et.al., 2001; Teske et. al., 1995; Ogataet. al., 1992).

Outro estudo realizado mos-trou o efeito do Phyllanthus nirurisobre a cristalização do oxalato decálcio in vitro. Por meio desse estu-do, pôde-se concluir que o extratode quebra-pedra interfere no cres-cimento e na agregação dos cristaisna urina humana, sugerindo queessa planta tem um papel potencialna prevenção de cálculo renal oudo desenvolvimento (Barros, 2002;Freitas et. al., 2002; Campos et. al.,1999; Dias et. al., 1995).

Materiais e Métodos

1 - Dados da Amostra

A amostra analisada foi adqui-rida em uma farmácia comercial eapresentava as folhas secas em frag-mentos de 0,5 cm a 1,0 cm.

Apresentava uma coloraçãoesverdeada que indicava que aamostra havia passado por proces-so de secagem.

2 - Controle Físico

Processo de Catação -Determinação da Pureza

Esse processo visou a avaliarse a amostra apresentava material


estranho, partículas que não cor-respondessem à droga analisada. Aquantidade de amostra analisadafoi de 25 g de material vegetal.

3 - Descriçãomicroscópica

Os fragmentos da parte da fo-lha foram submetidos a estudohistológico, e neles foram realiza-dos cortes do tipo paradérmico etransversal

4 - Análise química

As folhas secas foram submeti-das a processos químicos de iden-tificação das seguintes classes deconstituintes químicos: taninos,heterosídeos flavanoídicos, hetero-sídeos saponínicos, heterosídeoantraquinônicos, alcalóides e óleosvoláteis (Costa, 2001).

A seguir serão apresentadas asmetodologias dos ensaios de iden-tificação das classes dos constitu-intes químicos mencionados. Valelembrar que são testes qualitativoscom vistas a somente verificar apresença ou a ausência do constitu-inte químico em questão.

4.1 - Métodos de Identificação

4.1.1 - Taninos

Os taninos são substânciaspolifenólicas, polihidroxiladas, dealto peso molecular, de origens ve-getais, capazes de precipitar prote-ínas, pectinas, alcalóides e metaispesados em solução aquosa (Simõeset. al., 2001).

A estrutura química é complexana sua maioria, apresenta caracterís-ticas adstringentes ao paladar e sãocapazes de curtir a pele dos animais,transformando-a em couro.

Os taninos são sólidos, amorfosna sua maioria, solúveis em água,álcool, glicerina e polietilenoglicol.São insolúveis em solventes orgâni-cos apolares.

Classifica-se em gálicos, hi-drolisáveis, catequínicos ou con-densados.

Extração Genérica de Taninos

Pesou-se cerca de 2g da droga(quebra-pedra) pulverizada;

Extraíram-se os taninos comcerca de 40 mL de água destilada,deixando-a ferver durante, aproxi-madamente, 2 minutos;

Filtrou-se em papel de filtro,procurando manter o pó no fundodo recipiente;

Repetiram-se mais duas extrações,com cerca de 10 mL de água cada;

Filtrou-se novamente, como in-dicado anteriormente;

Utilizou-se o filtrado para asreações de identificação seguintes.

Reação com Cloreto Férrico

Em um tubo de ensaio colo-cou-se cerca de 1,0 mL da soluçãoextrativa e adicionaram-se-lhe 5,0mL de água destilada e uma gota decloreto férrico 2% (escorrendo-opela parede do tubo).

Foi necessário que se obser-vasse a formação de um precipita-do ou o aparecimento de colora-ções: preta, verde, azul, conforme otipo de estrutura química.

Reação com Solução Aquosa deAlcalóides

Em um tubo de ensaio colo-cou-se 1,0 mL da solução extrativa,diluída a uma proporção 1:5. Adici-onaram-se-lhe 5 gotas de ácido clo-rídrico a 5% e 1 ou 2 gotas desolução de sulfato de alcalóides.

Esperou-se para observar a for-mação de um precipitado brancoou castanho esbranquiçado.

Reação com Acetato Neutro deChumbo

Em um tubo de ensaio colo-cou-se 1,0 mL da solução extrativadiluída na proporção 1:5. Adicio-naram-se-lhe 1 ou 2 gotas de solu-ção aquosa de acetato neutro dechumbo a 10%.

Esperou-se para observar a for-mação de um precipitado castanhoavermelhado volumoso e denso.

Reação com Solução de Acetatode Cobre

Em um tubo de ensaio colo-cou-se cerca de 1,0 mL de soluçãoextrativa diluída na proporção de1:5. Adicionaram-se-lhe 1 ou 2 go-tas de solução aquosa de acetato decobre a 5%.

Esperou-se para se observar aformação de um precipitado casta-nho avermelhado.

Reações Específicas deTaninos:

Reação com Acetato dechumbo e Ácido Acético

Glacial

Em um tubo de ensaio coloca-ram-se cerca de 3 mL de soluçãoextrativa e adicionaram-se-lhe cer-ca de 2 ml de ácido acético glaciala 10% e 3 mL da solução de acetatode chumbo a 10%.

Esperou-se para observar a for-mação de um precipitado castanhoavermelhado que indicasse a pre-sença de taninos gálicos.

Obs: A adição de ácido acéticoimpede a precipitação de taninoscatequínicos.

Reação com Reativo deWasicky

Eliminou-se o precipitado dareação com acetato de cobre (ante-rior) por filtração e utilizou-se ofiltrado.

Adicionaram-se cerca de 0,5mL de solução de poli-metil-amino-benzaldeído. Esperou-se para ob-servar a formação de um precipita-do carmim ou róseo que indicasse apresença de tanino catequínico.

4.1.2– Saponinas

Saponinas são glicosídeos deesteróides ou terpenos policíclicos.Esse tipo de estrutura, que possuiuma parte lipofílica (triterpeno ouesteróide) e outra hidrofílica (açú-cares), determina a propriedade deredução da tensão superficial da


água, característica de suas açõesdetergente e emulsificante (Simõeset. al., 2001).

Extração Genérica dasSaponinas

Em um aparelho de refluxocolocaram-se 90 mL de extrato aquo-so 1% da droga.

Adicionaram-se-lhe cerca de 10mL de ácido clorídrico.

Deixou-se o processo em re-fluxo por aproximadamente umahora para, em seguida, desligá-lo edeixá-lo esfriar.

Transferiu-se o líquido para umfunil de separação de 200 mL eadicionaram-se-lhe 50 mL de cloro-fórmio. Repetiu-se a extração comclorofórmio por mais duas vezes.

Reduziu-se o volume a 75 mLem banho-maria.

Processos Gerais deIdentificação de Saponinas

Obs.: Para cada reação de iden-tificação, evaporou-se cerca de 5mL da fase orgânica obtida anteri-ormente.

Reação de Rossol: No tubo deensaio onde se realizou a evapora-ção de 5 mL da fase orgânica, adici-onou-se uma gota de ácido sulfúri-co concentrado.

Esperou-se para observar oaparecimento de uma coloração ver-melha ou violeta que indicasse apresença da sapogenina.

Reação de Mitchell: No tubode ensaio onde se realizou a evapo-ração de 5 mL da fase orgânica,adicionou-se uma gota de ácidosulfúrico concentrado e vestígiosde nitrato de prata.

Esperou-se para observar o apa-recimento de uma coloração aver-melhada que indicasse a presençade sapogenina.

Reação de Rosenthalen: Notubo de ensaio onde se realizou aevaporação de 5 mL da fase orgâni-ca, adicionaram-se uma ou duas

gotas de solução de vanilina a 1%em ácido clorídrico.

Esperou-se para observar oaparecimento de coloração azul quese desenvolvesse somente a quente.

Reação com Reativo deSulfo-vanílico: No tubo de en-saio onde se realizou a evapora-ção de 5 mL da fase orgânica,adicionaram-se uma ou duas go-tas de solução de vanilina 1% emácido sulfúrico.

Esperou-se para observar oaparecimento de coloração violeta-azulada.

Reação de Liebermann: Notubo de ensaio onde se realizoua evaporação de 5 mL da faseorgânica, dissolveu-se o resíduoem 2 mL de ácido acético glacial.Adicionaram-se-lhe 1 ou 2 gotasde cloreto férrico a 3%. Em se-guida, verteram-se , pela parededo tubo, 1 ou 2 mL de ácidosulfúrico sem agitar . Na superfí-cie de contato entre os dois lí-quidos, poderia formar-se umanel com coloração pardo-aver-melhada ou verde, que indicariaa presença de derivados esteroi-dais, ou com coloração azul, queindicaria a presença de deriva-dos triterpenóides.

4.1.3- Flavonóides

Os flavonóides, biossintetiza-dos a partir da via dos fenilpropa-nóides, constituem uma importanteclasse de polifenóis, presentes comrelativa abundância entre osmetabólitos secundários de vege-tais (Simões et. al. 2001).

Extração Genérica deCompostos Flavonoídicos:

Pesaram-se cerca de 2,0 g dadroga;

Colocada em um béquer, adici-onaram-se-lhe cerca de 15 mL deetanol a 75%;

Foi fervida por alguns minutos;Em seguida, foi esfriada e fil-

trada em papel de filtro;

Reservou-se esse extrato paraexecutar as reações gerais de iden-tificação.

Reações Genéricas deIdentificação de Flavonóides

Reação de Shinoda: Adicio-naram-se cerca de 5 mL do extratoem um tubo de ensaio que continhauma pitada de magnésio metálico.Acrescentaram-se-lhe 0,5 - 1,0 mLde ácido clorídrico.

Observou-se o desenvolvimen-to de coloração rósea-avermelhadaindicaria a presença de flavonóis;violeta indicaria a presença deflavanonas e laranja indicaria a pre-sença de flavonas.

Obs.: O desenvolvimento dacor pode ocorrer imediatamente ouapós algum tempo.

Reação com Cloreto de Alu-mínio: Sobre um papel de filtro,demarcaram-se duas áreas A e B.Depositaram-se em cada uma de-las algumas gotas do extrato dadroga e esperou-se secar. Em se-guida, colocou-se em uma das áre-as 1 gota de solução de cloreto dealumínio 5% em etanol. Eliminou-se o etanol. Verificou-se o com-portamento da substância nas duasáreas frente à luz ultravioleta. Ob-servou-se o aspecto fluorescenteque indicasse a presença deflavonóides.

Reação com Cloreto Férri-co: Diluiu-se o extrato com água naproporção de 1:5, em seguida, co-locaram-se em dois tubos de ensaio5 mL do extrato diluído. Adicionou-se pela parede de um dos tubos 1gota de cloreto férrico 2%.

Esperou-se para observar o de-senvolvimento de cor, que poderiavariar entre verde, amarelo-casta-nho e violeta, de acordo com o tipode composto flavonoídico.

Reação com Hidróxido deSódio: Diluiu-se o extrato na pro-porção de 1:5. Colocaram-se 5 mLdesse extrato diluído em um tubode ensaio e adicionaram-se-lhe 1


ou 2 gotas de NaOH 5%.Observou-se o desenvolvimen-

to de coloração amarela, que variade intensidade.

4.1.4- GlicosídeosAntraquinônicos

São compostos naturais encon-trados sob forma glicosídica oulivres derivados do núcleo antra-cênico. Relacionam-se diretamen-te com antraquinona, uma dicetonainsaturada. Possuem ação catárticae são classificadas, como catárticoestimulante (Akisue, 2002).

Extração dos glicosídoesantraquinônicos

Reação de Bornträeger: Pesou-se cerca de 1g da droga, adiciona-ram-se-lhe cerca de 20 mL de etanola 75% e foi aquecida durante 2minutos em banho-maria.

Em seguida, realizou-se a fil-tração em funil simples e adicio-naram-se ao filtrado cerca de 2mLde ácido sulfúrico que foi leva-do ao banho-maria durante 1 mi-nuto.

Deixou-se o filtrado acidificadoesfriar.

Realizou-se a extração em umfunil de separação com 10 mL deacetato de etila, e repetiu-se a ex-tração por mais duas vezes.

Mediram-se cerca de 5 mL dafase orgânica e adicionaram-se-lhecerca de 1 ou 2 gotas de hidróxidode amônio.

Esperou-se para observar a for-mação de uma coloração amarela,que indicasse a presença da antra-quinona na forma reduzida, ou ver-melha, que indicasse a presença daantraquinona na forma oxidada.

Reação com Hidróxido desódio: Pesaram-se 0,5 g de dro-ga, que foi colocada em um vidrode relógio e adicionaram-se-lhealgumas gotas de hidróxido desódio a 0,5%.

Esperou-se para observar oaparecimento de uma coloraçãoamarelada, que indicasse a pre-

sença da antraquinona na formareduzida, ou de uma coloraçãoavermelhada que indicasse a pre-sença da antraquinona na formaoxidada.

4.1.5 - Alcalóides

Os alcalóides que contêm umátomo de nitrogênio em um anelheterocíclico são chamados dealcalóides verdadeiros e são classi-ficados de acordo com o sistemaanelar presente na molécula. Assubstâncias com o átomo de nitro-gênio que não pertença a um siste-ma heterocíclico são denominadosde protoalcalóides.

Compostos nitrogenados come sem anéis heterocíclicos, que nãosão derivados de aminoácido, sãochamados de pseudoalcalóides(Simões et. al., 2001).

Métodos de Identificação deAlcalóides

Pesar cerca de 1g da droga emum béquer, adicionar 30 mL desolução de HCL 1,5% e aquecer poraproximadamente 3 minutos. Emseguida, filtrar o sobrenadante emalgodão e transferir o filtrado paraum funil de separação.

Testes de Identificação

Alcalinizar o filtrado obtidoanteriormente com solução deHidróxido de Amônio (NH

4OH)

até atingir um pH entre 9 e 10(utilizar papel tornassol para de-terminar o pH).

Em seguida, adicionar ao filtra-do alcalinizado cerca de 15 mL deClorofórmio (CHCl

3) e agitar para

que os alcalóides presentes passempara a porção orgânica. Colocarcinco gotas do extrato em cadacápsula de porcelana, colocá-las emuma chapa e esperar secar, apósisso, dissolver o resíduo com 4 go-tas de solução de HCl 1,5% emtodas as cápsulas e em cada umaadicionar o reagente de identifica-ção de alcalóides:

Reagente de Sheibler - Adicio-

nar algumas gotas sobre o resíduo eobservar desenvolvimento de colo-ração amarelo claro.

Reagente de Bourchardat - Adi-cionar algumas gotas sobre o resí-duo e observar o desenvolvimentode coloração amarelo tijolo.

Reagente de Bertrand - Adicio-nar algumas gotas sobre o resíduo eobservar o desenvolvimento de co-loração amarelo tijolo.

Reagente de Mayer - Adicionaralgumas gotas sobre o resíduo eobservar desenvolvimento de umprecipitado floculoso branco.

Reagente de Dragendorff - Adi-cionar algumas sobre o resíduo eobservar desenvolvimento de colo-ração amarelo tijolo.

4.1.6 - Óleos voláteis

Os óleos voláteis são definidoscomo produtos obtidos de partes deplanta por meio da destilação porarraste com vapor d’água. São mis-turas complexas de substâncias vo-láteis lipofílicas, geralmente odorí-feras e líquidas (Simões et. al., 2001).

Pesar cerca de 1 g da droga aser analisada, colocar em um gralde vidro, adicionar cerca de 1 mL deetanol absoluto e triturar. Pingaruma gota em um papel de filtro,evaporar e sentir o aroma, o qualindica a presença de óleos voláteis.

5 - Resultados

Na amostra continha fragmen-tos de folhas e caules de tamanhosque variavam de 0,1 a 1,0 cm detamanho.

Observou-se que em 25 g daamostra que 0,75 g correspondia afragmentos de materiais estranhosà planta. A Farmacopéia Brasileirarecomenda que a porcentagem dematerial estranho de outra parte daplanta tenha um limite de tolerênciaem torno de 10%.

A análise microscópica da dro-ga vegetal através dos corteshistológicos e a sua descriçãomacroscópica foram comparadascom dados da literatura, o que per-mitiu confirmar que a droga vegetal


em análise era mesmo a espéciePhyllanthus niruri L (Souza, 2003).

Nos testes realizados para iden-tificar os taninos, foi usada comodroga padrão o cajueiro (Anacardiumoccidentale), droga vegetal que temcomo principais constituintes quími-cos os taninos, e a droga em estudonão indicou a presença de taninosnos testes realizados (Tabela-1).

5.1 - Saponinas

Para as reações de identifica-ção de heterosídeos saponínicosfoi utilizada como droga padrão aquilaia (Quilaia saponaria) paracompará-la com a droga em estudo.Os resultados demonstraram que aP. niruri não possui saponinas (Ta-bela-2).

5.2 - Flavonóides

Para as reações de identificaçãode flavonóides, utilizou-se como dro-ga padrão a Ginkgo (Ginkgo biloba). Os resultados das análises mostra-ram que a espécie P. niruri apresen-tou flavonóides na sua composiçãoquímica, de acordo com que se podeobservar na tabela (Tabela-3).

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sovitaeR airanopasaialiuQ irurinsuhtnallyhP

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5.3 - GlicosídeosAntraderivados

Para os resultados das rea-ções indicativas da presença ouausência foi utilizada como drogapadrão o faveiro (Dimorphandramollis ) e a droga vegetal emanálise - P. niruri – apresentou,na sua composição química,indicativo da presença de glicosí-deos antraquinônicos na formaoxidada, como podemos observarna tabela (Tabela-4).

5.4 - Alcalóides

Para as reações de identifica-ção de alcalóides, utilizou-se comodroga padrão a quina (Chichonacalisaya) e a espécie P. niruri emestudo apresentou resultado posi-tivo na presença dos reativos paraalcalóides, como se pode observarna tabela (Tabela-5).

5.5 - Óleos Voláteis

No teste realizado para indi-car a presença ou ausência deóleos voláteis, não foi possível,por meio dele, verificar a presen-ça de óleos voláteis na espécie emanálise - P. niruri

6 - Discussão

Por meio das análises realiza-das, foi possível identificar a dro-ga vegetal em estudo comoPhyllanthus niruri (quebra-pe-dra). Antes de se utilizar qualquerdroga no preparo de medicamen-tos, deve-se submetê-la a umaanálise rigorosa. A identificação ea pureza da droga, bem como aavaliação de seus princípios ati-vos são tarefas indispensáveisàqueles que buscam produtos dequalidade.

De acordo com a literatura, oPhyllanthus niruri apresenta emsua constituição substâncias comoglicosídeos antraquinônicos, fla-vonóides e alcalóides, além deoutras que não foram investigadas

no presente trabalho, mas que sesabe fazem parte da constituiçãoquímica da planta. Acredita-se quealgumas dessas substâncias sejamresponsáveis pelo efeito terapêu-tico atribuído ao quebra-pedra,porém não se sabe ao certo qualdessas substâncias é especifica-mente a responsável por tal pro-priedade. Assim, os constituin-tes ident i f i cados na aná l i sefitoquímica foram suficientes paraafirmarmos que a planta utilizadaera realmente o Phyllanthusniruri, sendo identificada a drogacomo verdadeira.


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Pesquisa

Nitrato Redutase emFungos Filamentosos

Jorge Fernando PereiraBiólogo, MS em Microbiologia Agrícola,Doutorando em Microbiologia Agrícola;Universidade Federal de Viç[email protected]

Juliana Oliveira LimaBióloga; Mestranda em Microbiologia Agrícola;Universidade Federal de Viç[email protected]

Rodrigo Barros RochaBiólogo; Mestrando em Genética e Melhoramento;Universidade Federal de Viç[email protected]

Pilar Ximena Lizarazo MedinaBacteriologista; MS em Microbiologia Agrícola;Doutoranda em Microbiologia Agrícola;Universidade Federal de Viç[email protected]

Elza Fernandes de AraújoBióloga; DS em Genética UFRGS;Profª Titular do Departamento de Microbiologia;Universidade Federal de Viç[email protected]

Marisa Vieira de QueirozBióloga; DS em Genética e Melhoramento ESALQ-USP; Professora Adjunta do Departamento deMicrobiologia; Universidade Federal de Viç[email protected]


O potencial multifuncional da nitrato redutase em pesquisas com biologia molecular de fungos

Introdução

ungos filamentosos podemmetabolizar uma série decompostos nitrogenadospara obterem o requeri-mento nutricional neces-sário para seu desenvolvi-

mento. Nesses organismos, o meta-bolismo do nitrogênio é um processoaltamente controlado por um com-plexo de proteínas reguladoras, queassegura grande eficiência na utiliza-ção das fontes de nitrogênio disponí-veis. Esse complexo é constituídopor uma série de proteínas que sãorequeridas para que vários compos-tos secundários sejam assimiladosquando as fontes preferenciais denitrogênio, isto é, o amônio ou aglutamina, não estão disponíveis(Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997).Entre os compostos secundários, onitrato inorgânico é uma excelentefonte utilizável por muitos fungosfilamentosos. Seu transporte para omeio intracelular é mediado pelapermease do nitrato, e após sua assi-milação, ocorre a redução seqüencialdo nitrato a nitrito e do nitrito aamônio, catalisada, respectivamen-te, pelas enzimas nitrato e nitritoredutase. O amônio é considerado oponto de partida para o metabolismoanabólico do nitrogênio em fungos ea sua incorporação em moléculasorgânicas é, então, realizada por doissistemas: glutamato desidrogenase(GDH) ou glutamina sintase (GS)/Glutaminaamida: 2-oxoglutaratoamino transferase (GOGAT), que pro-duzem glutamato e glutamina (Griffin,1994) (Figura 1). A enzima nitratoredutase de fungos é um grandecomplexo multiredox, que possui

duas subunidades idênticas, cada umacomposta de três grupos prostéticosem domínios separados. Na extremi-dade C-terminal, localiza-se o domí-nio FAD, mais ao centro da proteína,o domínio heme, e, na extremidadeN-terminal, o domínio molibdênio. Areação catalítica envolve a transfe-rência de um par de elétrons doNADH ou NADPH para os domíniosFAD, heme e molibdênio e, então,para o nitrato. A especificidade pelodoador de elétrons é utilizada paraclassificar as nitrato redutaseseucarióticas em 3 grupos: NADH-específica (EC 1.6.6.1), que está pre-sente na maioria das plantas superi-ores e em algumas algas, NADPH-específica (EC 1.6.6.2), que é encon-trada em fungos e NAD(P)H-biespecífica, que é encontrada emalgumas plantas e em algumas algas(Losada, 1976; Shen et al., 1976;Renosto et al., 1982).

Em 1989, foi descrito o isola-mento do primeiro gene da nitratoredutase de fungos filamentosos uti-lizando-se o organismo modeloAspergillus nidulans (Malardier et al.,1989). Desde então, genes que codi-ficam para a enzima nitrato redutasevêm sendo clonados e seqüenciadosem diversas espécies de fungosfilamentosos representados por or-ganismos modelos de estudos gené-ticos em eucariotos, espécies compotencial de aplicação industrial oucom importância fitopatológica emicorrízica. O interesse na clonagemdesse gene é baseado, principalmen-te, no estabelecimento de protocolosde transformação genética cujo valorbiotecnológico é muito importantepor representar um método de sele-ção geral e conveniente. Mas, além


de marca de seleção para transforma-ção, esse gene também pode serutilizado para estudos de organiza-ção e regulação gênica, análisesfilogenéticas, obtenção de mutantes,estudos de grupos de compatibilida-de vegetativa e como isca paradetecção e isolamento de elementostransponíveis. Baseado nesse con-texto, este trabalho tem como objeti-vo apresentar resultados que contri-buam para esse potencial multifunci-onal do gene da nitrato redutase emfungos filamentosos. Mesmo que,muitas vezes, dentro de uma mesmaespécie, esse gene possa não serutilizado com toda essa potencialida-de, ele representa uma das maioresversatilidades de uso na micologiamolecular.

Organização dos genes deassimilação do nitrato

O seqüenciamento e a compara-ção das seqüências de genes quecodificam para nitrato redutase têmcontribuído para estudos de organi-zação gênica em fungos filamento-sos, sendo esses estudos imprescin-díveis para o conhecimento de carac-terísticas importantes como númeroe tamanho de íntrons, seqüênciasenvolvidas com mecanismo desplicing, tamanho de regiões promo-toras, ligação de genes e sentido datranscrição entre genes ligados. Umquadro comparativo da organizaçãogênica entre os genes da nitratoredutase de 16 diferentes espécies defungos filamentosos é apresentadona Figura 2.

A análise de seqüências do geneda nitrato redutase revela a ausênciade íntrons nos fungos Ustilago maydis

(Banks et al., 1993) e Botryotiniafuckeliana (Levis et al., 1997a) e ummáximo de 12 íntrons para Hebelomacylindrosporum (Jargeat et al., 2000).Em Aspergillus fumigatus , A.nidulans, A. niger, A. oryzae, A.parasiticus, Penicillium chrysogenume P. griseoroseum, ocorre a presençade 6 íntrons que, embora possuamtamanhos diferentes, estão localiza-dos nas mesmas posições (Johnstoneet al., 1990; Unkles et al., 1992;Kitamoto et al., 1995; Chang et al.,1996; Haas et al., 1996; Amaar eMoore, 1998; Pereira, 2001). EmLeptosphaeria maculans eStagonospora nodorum, esse gene éinterrompido por 4 íntrons que cor-respondem aos íntrons II, III, IV e VIde Aspergillus e Penicillium (Williamset al., 1994; Cutler et al., 1998), en-quanto em Beauveria bassiana (nú-mero de acesso no Genbank X84950),Fusarium oxysporum, Gibberellafujikuroi, Metarhizium anisopliae(número de acesso no GenbankAJ001141) e Neurospora crassa, ape-nas 1 íntron está presente na mesmaposição do íntron VI de Aspergillus ePenicillium (Okamoto et al. 1991;Diolez et al., 1993; Tudzynski et al.,1996). O gene da nitrato redutase deH. cylindrosporum parece ser o úni-co que possui íntrons (11 e 12) naregião correspondente ao domínioFAD (Jargeat et al., 2000). Pode-seobservar na Figura 2 que o tamanhomédio dos íntrons é de, aproximada-mente, 58 pares de bases (pb), sendoo menor de 46 pb e o maior de 92 pb.Na grande maioria das vezes, essesíntrons não apresentam similaridadea não ser nas seqüências envolvidascom o processo de sua retirada(splicing). Os íntrons encontrados

nos genes que codificam a nitratoredutase em eucariotos não inter-rompem a seqüência codificadoraem éxons com os respectivos domí-nios funcionais da enzima, sendoque a maioria deles parece estardentro e não entre os domínios fun-cionais (Zhou e Kleinhofs, 1996). Alocalização dos íntrons é conservadadentro de fungos, algas e plantassuperiores, em relação a genes paranitrato redutase, mas, mesmo assim,difere entre esses grupos. Em algas,os genes da nitrato redutase deChlamydomonas reinhardtii e Volvoxcarteri possuem 15 e 9 íntrons, res-pectivamente, localizados nos domí-nios molibdênio, heme e FAD. Aposição de 8 dos 10 íntrons em Volvoxé idêntica à de Chlamydomonas. Osquatro íntrons presentes em Oryzaesativa, Phaseolus vulgaris, Lypersiconesculentum e Nicotiana tobacum es-tão localizados, precisamente, na mes-ma posição (Zhou e Kleinhofs, 1996).Com base no número e na posiçãodos íntrons presentes nos genes danitrato redutase de fungos filamento-sos, algas e plantas, Zhou e Kleinhofs(1996) não puderam afirmar se, du-rante a evolução, os íntrons foramincorporados (gain hypotheses) ouperdidos (loss hypotheses). Então, osíntrons podem ter sido inseridos nogene da nitrato redutase após a diver-gência entre fungos e plantas, ou oancestral desses grupos possuía to-dos os íntrons e esses foram perdidosindependentemente após a divergên-cia. Ainda, segundo esses autores, ahipótese de embaralhamento deéxons (exon shuffling), em que asseqüências que codificam regiões es-truturais ou funcionais da proteínaestariam delimitadas por íntrons, nãoparece se aplicar a esse caso, pois asseqüências que codificam os domíni-os funcionais das proteínas nitratoredutase apenas são separadas poríntrons em H. cylindrosporum (íntron9 entre domínios molibdênio e heme).

Além dos íntrons, a organizaçãodos três genes relacionados com aassimilação do nitrato em fungos fila-mentosos pode ser separada em, pelomenos, quatro grupos diferentes (deA a D). No grupo A, os três genesestão ligados, mas os genes da nitratoe nitrito redutase são transcritos emdireções opostas, sendo o gene dotransportador transcrito na mesmaFigura 1 - Assimilação de nitrato em fungos filamentosos.


direção da nitrito redutase. Essa orga-nização é encontrada em A. nidulans,A. niger, A. parasiticus, A. fumigatuse P. chrysogenum (Johnstone et al.,1990; Unkles et al., 1992; Chang et al.,1996; Amaar e Moore, 1998; Haas eMarzluf, 1995). O tamanho da regiãointergênica é de 1.262 pb em A.nidulans (Johnstone et al., 1990), 1.668pb em A. niger (Unkles et al., 1992),1.670 pb em A. parasiticus (Chang etal., 1996), 1.229 pb em A. fumigatus(Amaar e Moore, 1998) e 661 pb em P.chrysogenum (Haas e Marzluf, 1995).No grupo B, os três genes tambémestão ligados, mas o gene do transpor-tador está entre os genes da nitrato eda nitrito redutase, sendo transcritosna mesma direção descrita no grupo

A. Essa organização é encontrada emH. cylindrosporum (Jargeat et al.,2003). No grupo C, os genes da nitratoe da nitrito redutase estão ligados, sãotranscritos na mesma direção, mas ogene do transportador não está liga-do, como é observado em L. maculanse S. nodorum (Williams et al., 1994;Cutler e Caten, 1999). O tamanho daregião intergênica é de 1.438 pb em L.maculans (Williams et al., 1994) e 829pb em S. nodorum (Cutler e Caten1999). No grupo D, apesar da posiçãodo transportador ainda não ter sidodeterminada, os três genes não pare-cem estar ligados, como ocorre emNeurospora crassa (Exley et al., 1993)e em Gibberella fujikuroi (Tudzynskiet al., 1996).

Regulação do gene danitrato redutase

As maiores contribuições para oconhecimento da regulação do meta-bolismo do nitrogênio em fungosfilamentosos baseiam-se nos traba-lhos realizados com os organismos A.nidulans e Neurospora crassa(Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997),sendo que, nos últimos anos, estudostambém têm sido relatados para ou-tras espécies como, por exemplo,Penicillium chrysogenum (Haas eMarzluf, 1995; Haas et al., 1996).

A utilização de fontes de nitrogê-nio secundárias é controlada de ma-neira positiva e negativa, existindoum sistema de controle global e um

Figura 2 - Comparação da organização dos genes de assimilação do nitrato em fungos filamentosos. Em alaranjado, a regiãopromotora intergênica dos genes nos quais foram relatadas ligação entre nitrito e nitrato redutase. As setas representam o sentidoda transcrição nesses genes. As caixas abertas indicam a região estrutural com tamanho e posição dos íntrons em relação às regiõescodificadoras dos domínios molibdênio, heme e FAD. O tamanho da região promotora e dos íntrons é dado em pares de bases.O número de aminoácidos das respectivas proteínas é dado à direita.


específico. A desrepressão de mais de100 genes estruturais, incluindo, porexemplo, genes que codificam trans-portadores de aminoácidos, transpor-tadores de purinas, proteasesextracelulares e enzimas catabólicas,é dependente da presença do indutore da ausência de fontes preferenciaisde nitrogênio (amônio e glutamina).Essa desrepressão é realizada tantopelo regulador global positivo areAem A. nidulans e seus corresponden-tes nit-2 em N. crassa e nre em P.chrysogenum, quanto por regulado-res específicos. O gene areA codificauma proteína reguladora de 876 resí-duos de aminoácidos que contém umúnico domínio de ligação ao DNA, oqual reconhece e se liga a seqüênciasque contêm o core GATA (Kudla etal., 1990; Langdon et al., 1995). Asproteínas AREA, NIT-2 e NRE possu-em somente 30% de homologia, mas,considerando apenas o domínio deligação ao DNA, a identidade é de98% (Haas e Marzluf, 1995). Em AREA,o domínio de ligação ao DNA é cons-tituído por um único dedo de Zn comquatro cisteínas, seguido de um domí-nio terminal básico, que apresentauma estrutura compacta formada pordois pares de folhas-β seguidas poruma α-hélice e uma cauda nãoestruturada. As cadeias laterais aodedo de Zn fazem contato altamentehidrofóbico no sulco maior da molé-cula de DNA e a cauda carboxi-termi-nal faz contato com o esqueleto defosfato (Scazzocchio, 2000). Elemen-tos com, pelo menos, duas cópias deseqüências GATA, que podem estarna mesma direção, ou em direçõesopostas, e com espaço de, pelo me-nos, 30 pb, são considerados fortessítios de ligação para NIT-2 (Chiang eMarzluf, 1994). Para P. chrysogenum,Haas e Marzluf (1995) descreveramfortes sítios de ligação de NRE comoregiões com, pelo menos, duas se-qüências GATA com espaçamentoentre 5 e 27 pb, configuradas namesma direção ou em direções opos-tas. Elementos GATA separados por74 ou 96 pb não demonstraram serfortes sítios de ligação NRE (Haas eMarzluf, 1995). Para A. parasiticus,Chang et al. (2000) relataram a ligaçãode AREA a segmentos de 42 pb daregião promotora dos genes da nitratoe da nitrito redutase que continhamum ou dois elementos GATA.

Outro gene importante para ometabolismo do nitrogênio é o nmr(do inglês nitrogen metabolismrepressor), que atua de maneira nega-tiva, reprimindo a síntese de váriosgenes. O gene nmr codifica umaproteína de 54,8 KDa, que não pos-sui domínio de ligação ao DNA, masé capaz de se ligar a uma pequenaregião do domínio de ligação aoDNA e à região carboxi-terminal daproteína NIT-2 (e possivelmente deAREA), impedindo a ação dessa pro-teína, sendo a glutamina o possívelsinal para essa ligação (Xiao et al.,1995). Pelo menos para AREA, aindaexistem outros dois níveis deregulação: a transcrição de areA éauto-regulada e a estabilidade domRNA de areA é menor em célulasque crescem em fontes de nitrogêniopreferenciais (Platt et al., 1996). Des-sa forma, na presença de fontes pre-ferenciais, além de uma menor esta-bilidade do mRNA do gene areA, oregulador NMR se liga à proteínaAREA já sintetizada e impede queessa proteína se ligue aos promoto-res e induza a transcrição dos genesrelacionados com o metabolismo defontes secundárias de nitrogênio. As-sim, a célula assegura a assimilaçãode nitrogênio a partir de compostosque são prontamente metabolizáveis.

A indução do gene da permeasedo nitrato e dos genes da nitratoredutase (niaD para Aspergillus sp. eP. chrysogenum ou nit-3 para N.crassa) e nitrito redutase (niiA paraAspergillus sp. e P. chrysogenum ounit-6 para N. crassa) requer síntesede novo, sendo necessária a ausênciadas fontes preferenciais e a presençade nitrato como indutor. Nesse caso,além do fator de regulação global, énecessária a presença de um fatorespecífico chamado nirA em A.nidulans e nit-4 em N. crassa(Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997).A proteína NIRA liga-se ao DNA apartir de um domínio na sua regiãoamino-terminal (Burger et al., 1991).Essa proteína se liga à seqüência 5’-CTCCGHGG-3’, sendo que foram de-tectados sítios putativos ou já com-provados para essa proteína em vári-as espécies de ascomicetos (Punt etal., 1995). Para o reconhecimento decis-elementos e expressão do genenit-3 em N. crassa (Feng e Marzluf,1998), é requerida uma interação

específica entre os fatores deregulação NIT-2 e NIT-4. Em N. cras-sa, um acúmulo máximo de mRNAde nit-3 ocorre apenas 15 minutosapós a indução por nitrato, sendoque o acúmulo máximo de proteínaocorre após 60 minutos, e em P.chrysogenum transcritos de niaD sãodetectados com 15 minutos deindução, e atingem um nível máximoapós 60 minutos (Okamoto et al.,1991; Haas et al., 1996). Até a presen-te data, a única exceção é obasidiomiceto H. cylindrosporum,onde o gene da nitrato redutase pos-sui alto nível de transcrição na pre-sença de nitrato, uréia, serina e glicina,sendo possível, neste caso, ainexistência de fatores de regulaçãoespecíficos. Entretanto, na presençade amônio, ocorre uma forte, masincompleta, repressão desse gene,indicando a existência de um sistemade regulação geral (Jargeat et al.,2000). Recentemente, foi reportado,para H. cylindrosporum, que a trans-crição dos genes da permease donitrato e da nitrito redutase tambémnão é induzida por nitrato, mas écompletamente reprimida por amônio(Jargeat et al., 2003).

Relações filogenéticasbaseadas na proteína

nitrato redutase

Apesar da proteína nitrato redutaseapresentar regiões comprovadamenteimportantes para seu funcionamento,outras regiões parecem poder sofrervariação sem acarretar perda de funcio-nalidade para a proteína. A região N-terminal e 2 regiões curtas, entre osdomínios molibdênio e heme e heme eFAD, apresentaram menor identidadeentre 17 outras proteínas nitrato redutasede plantas, algas e fungos quando fo-ram comparadas por Zhou e Kleinhofs(1996). Essa característica de apresentarregiões conservadas que flanqueiamregiões que podem sofrer variação éinteressante para estudos de filogenia.Esses mesmos autores verificaram queo gene da nitrato redutase pode serutilizado como relógio molecular, poisgenes de diferentes espécies evoluemem uma taxa constante, e, baseadosnesse gene, estimaram o tempo dedivergência entre fungos e plantas, emtorno de 1 bilhão de anos e, entre algase plantas superiores, em torno de 750


milhões de anos. Além do uso comorelógio molecular, estudos filogenéticoscom a proteína nitrato redutase de fun-gos filamentosos têm revelado umatendência de agrupar espécies que per-tençam a categorias taxonômicas co-muns (Williams et al., 1994; Cutler et al.,1998). Assim, esse gene possui caracte-rísticas interessantes para uso em estu-dos evolucionários. Na Figura 3 é apre-sentada uma árvore filogenética nãoenraizada baseada na seqüência deaminoácidos da proteína nitrato redutase.Para a construção dessa árvore, seqüên-cias da proteína nitrato redutase de 16fungos filamentosos e 1 planta foramretiradas do GenBank na página doNational Center for BiotechnologyInformation (www.ncbi.nlm.nih.gov)por meio dos seguintes números:Aspergillus fumigatus (AF336236), A.nidulans (M58291), A. niger (M77022),A. oryzae (D49701), A. parasiticus(U38948), Arabdopsis thaliana(P11832), Beauveria bassiana

(X84950), Botryotinia fuckeliana(U43783), Fusarium oxysporum(Z22549), Gibberella fujikuroi(X90699), Hebeloma cylindrosporum(AJ238664), Leptosphaeria maculans(U04445), Metarhizium anisopliae(AJ001141), Neurospora crassa(X61303), Penicillium chrysogenum(U20779), P. griseoroseum (AY255803),Stagonospora nodorum (AJ009827) eUstilago maydis (AJ315577). O alinha-mento de toda a seqüência de amino-ácidos foi realizado no programaClustal X (Thompson et al., 1997),sendo o alinhamento resultante anali-sado pelo método de parsimônia noprograma PAUP* versão 3.1 (Swofford,1993). Foi feita uma busca heurísticae análise de bootstrap com 1.000 répli-cas para gerar índices de confiabilidadepara cada ramo.

Pode-se observar claramente atendência de se agruparem as espé-cies analisadas pela ordem à qualessas pertencem de acordo com a

taxonomia clássica. Dessa forma, aseqüência de aminoácidos da prote-ína nitrato redutase apresenta umaaplicação para estudos filogenéticos,com forte reflexo da história naturaldos fungos filamentosos.

Obtenção de mutantesdeficientes na enzima

nitrato redutase

Uma das grandes vantagens naaplicação do gene da nitrato redutaseé a fácil obtenção de mutantes es-pontâneos por seleção positiva viaresistência ao clorato. Essa seleçãopositiva, que favorece o crescimentodo mutante em relação ao selvagem,é baseada na “similaridade” entre amolécula de nitrato e seu análogotóxico, o clorato. Da mesma formaque o nitrato, o clorato presente nomeio de cultura é transportado parao meio intracelular pela permease donitrato e é reduzido a clorito pelaação da enzima nitrato redutase. En-tretanto, diferentemente do nitrito, oclorito é um composto tóxico quepromove a morte da célula. A teoriade que o clorato por si só não étóxico, mas se torna tóxico pela con-versão a clorito como resultado daação da nitrato redutase, foi primei-ramente sugerida por Aberg (1947) etem sido confirmada por uma sériede trabalhos. Análises do efeito doclorito de sódio, tanto in vitro comoin vivo, sugerem que o clorito causeestresse oxidativo em células de fun-gos e, por causar oxidação debiomoléculas importantes, torna-setóxico (Ingram et al., 2003). Dessamaneira, a célula que apresenta umaenzima nitrato redutase funcionalmorre e aquela que apresenta umaforma não-funcional sobrevive, poisnão é capaz de reduzir o clorato aclorito.

Nesse momento, a colôniamutante, que cresce no meio de cul-tura, é resistente ao clorato, mas nãonecessariamente é mutante para aenzima nitrato redutase. Mutaçõesem, pelo menos, cinco genes podemlevar ao fenótipo de resistência aoclorato: (i) mutação no gene dapermease do nitrato (crnA), que in-capacite a célula de absorver o cloratodo meio extracelular; (ii) mutação nogene do regulador específico da assi-milação de nitrato (nirA), que impos-

Figura 3 - Árvore filogenética não enraizada, baseada em análises pelo método deparsimônia da seqüência de aminoácidos da proteína nitrato redutase de vários fungosfilamentosos. Os números indicam porcentagem dos valores de bootstrap em análisecom 1.000 réplicas.


sibilite a célula de expressar a enzimanitrato redutase; (iii) mutação no genedo regulador geral da assimilação denitrogênio (areA), que também im-possibilite a célula de expressar aenzima nitrato redutase; (iv) muta-ção em algum gene envolvido nabiosíntese do cofator molibdênio

(cnxA-J), que, não estando presente,torna ineficazes a enzima nitratoredutase e outras enzimas depen-dentes desse cofator; e (v) mutaçãono próprio gene da nitrato redutase(niaD), impossibilitando a célula desintetizar essa enzima (Cove, 1976;Cove, 1979). Dessa forma, após a

obtenção das colônias resistentes aoclorato, é necessário fazer uma dis-criminação do fenótipo mutante pormeio de um fácil teste de crescimen-to em meio mínimo contendo asseguintes fontes de nitrogênio: nitra-to, nitrito, hipoxantina, glutamato eamônio . O crescimento ou não nes-

Figura 4 - Obtenção de mutantes nitrato redutase. 1-) Esquema do protocolo para obtenção de mutantes resistentes ao clorato etestes de crescimento para anotação da mutação; 2-) Vias metabólicas envolvidas com o fenótipo de resistência ao clorato (possíveisgenes mutados são mostrados em laranja); 3-) Fenótipo de crescimento em placas contendo MM + nitrato (A), MM + nitrito (B) eMM + hipoxantina (C) de mutantes de Penicillium griseoroseum resistentes ao clorato. Colônias que não crescem em A mas crescemem B e C são mutantes nitrato redutase; S indica o tipo selvagem utilizado como controle positivo.

.oinêgortinedsetnofsetnerefidme,otarolcoasetnetsisersetnatumedotnemicsercedsetseT-1alebaT

oãçatuMoãçangiseD*etnatumod

otnemicsercedsetseT

otarolC otartiN otirtiN anitnaxopiH otamatulG oinômA

amuhneN megavleS - + + + + +

esatuderotartiN Dain + - + + + +

ocifícepserodalugeR Arin + - - + + +

oinêdbilomrotafoC J-Axnc + - + - + +

laregrodalugeR Aera + - - - - +

esaemreP Anrc + + + + + +

arapsenegsodoãçanimoned* ;snaludinsulligrepsA .otnemicsercedaicnêsuaacidni-eotnemicsercacidni+


sas diferentes fontes (Tabela 1) é,então, correlacionado com a muta-ção em um dos cinco possíveis genesacima relacionados (Figura 4). Comoem todas as espécies de fungosfilamentosos estudadas até o mo-mento, apenas uma cópia funcionaldo gene da nitrato redutase foi en-contrada, mutantes nitrato redutasesão reportados com alta freqüência.

A razão do teste de crescimentoem hipoxantina é que, além do re-querimento por NAD(P)H, asenzimas nitrato redutase são depen-dentes de uma molécula chamadacofator molibdênio. A ausência des-se cofator impossibilita a célula deutilizar o nitrato como tambémpurinas como adenina, hipoxantinae xantina como única fonte de nitro-gênio. Os mutantes incapazes decrescer em nitrato e hipoxantinaapresentam uma perda pleiotrópicada atividade das enzimas nitratoredutase e xantina desidrogenase,respectivamente. Como essesmutantes são defectivos na síntesede um cofator comum, tanto para anitrato redutase como para xantinadesidrogenase, os genes envolvidosna síntese desse cofator foram deno-minados cnx (do inglês commoncomponent for nitrate reductase andxanthine dehydrogenase) (Patemanet al., 1964; Cove, 1979). Por meiode testes de complementação entrediferentes mutantes, Pateman et al.(1964) reportaram a existência devários loci (cnx ABC, E, F, G e H)relacionados com vários genes res-ponsáveis pela produção do cofatormolibdênio, e Arst et al. (1982) rela-taram a existência de outro locus(cnxJ). Unkles et al. (1997) compro-varam que o locus cnxABC é partede um único gene que codifica umaproteína com dois domínios catalíti-cos requeridos para a síntese de umintermediário do cofator molibdênio.

Um protocolo para obtenção demutantes deficientes na enzima ni-trato redutase é apresentado a seguire está esquematizado na Figura 4.Esse protocolo baseia-se em espéci-es que apresentam reproduçãoassexual e/ou sexual possibilitandoo uso de esporos na análise. Como nagrande maioria das espécies de fun-gos filamentosos os esporos sãouninucleados e contêm genomahaplóide, a mutação é expressa sem

efeito de dominância. Mesmo assim,algumas espécies de fungos não pro-duzem esporos in vitro, e esse proto-colo pode ser modificado para ob-tenção de mutantes por intermédiode fragmentos de micélio, onde seto-res resistentes ao clorato apresentamcrescimento mais vigoroso. Entretan-to, em algumas espécies de fungos, aresistência ao clorato parece ser na-tural, o que impossibilita a obtençãode mutantes por essa técnica.

Protocolo para obtenção demutantes nitrato redutase (segundoCove, 1976; Cove, 1979; Unkles etal., 1989):

• Preparar uma suspensão deesporos em tween 80 0,05%contendo cerca de 107.ml-1

esporos;• Plaquear 0,1 ml dessa soluçãoem meio mínimo (MM) sólido(Pontecorvo et al., 1953) semnitrato e acrescido de 470 mMde clorato de potássio e 10 mMde glutamato de sódio (cloratode potássio 57,6 g; glutamatode sódio monobásico 1,87 g;KH

2PO

4 1,5 g; KCl 0,5 g; MgSO

4

0,5 g; FeSO4 0,01 g; ZnSO

4 0,01

g; glicose 10 g; ágar 15 g; águadestilada 1.000 ml; pH 6,8);• Incubar as placas a 25oC porcerca de 7 a 10 dias;• Transferir as colônias resis-tentes ao clorato para placascontendo meio completo (MC)sólido, Pontecorvo et al. (1953)modificado por Azevedo e Cos-ta (1973) [meio mínimo adicio-nado de peptona 2,0 g; caseínahidrolisada 1,5 g; extrato delevedura 2,0 g; solução de vita-minas 1,0 ml; (biotina 0,2 mg;ácido p-aminobenzóico 10,0 mg;piridoxina 50,0 mg; tiamina 50,0mg; ácido nicotínico 100,0 mg;riboflavina 100,0 mg; água des-tilada 100 ml); ágar 15 g; águadestilada 1.000 ml; pH 6,8];• Fazer purificação monospóricados mutantes;• Inocular as colônias resisten-tes em placas de MM contendo10 mM das seguintes fontes denitrogênio : nitrato de sódio,nitrito de sódio, cloreto deamônio, hipoxantina e gluta-mato de sódio;• Incubar a 25oC por 3 a 5 dias;

• Verificar o crescimento e ano-tar os fenótipos mutantes;• Separar e identificar osmutantes nitrato redutase.Assim, o sistema nitrato redutase

apresenta vantagens sobre outrossistemas, como a fácil obtenção demutantes espontâneos por seleçãopositiva via resistência ao clorato, e,como não há emprego de mutagê-nese, a possibilidade de mutaçõessecundárias que atinjam genes im-portantes ou de interesse é reduzi-da. Também esses mutantes apre-sentam um único fenótipo desejá-vel, não utilizar nitrato como únicafonte de nitrogênio, sendo que essefenótipo é dispensável sem alterar ocrescimento ou fluxos metabólicosimportantes.

Utilização de mutantesdeficientes na utilização do

nitrato em estudos degrupos de compatibilidade

vegetativa

Isolados de uma espécie fúngicapodem ser caracterizados pela com-patibilidade ou incompatibilidade ve-getativa. A compatibilidade ocorrequando micélios de diferentes isola-dos podem sofrer anastomoses e ori-ginar heterocários (hifas que contêmnúcleos geneticamente diferentes),enquanto a incompatibilidade ocorrequando não há formação de hetero-cários. Nem sempre é possível for-mar essas anastomoses, principal-mente quando os cruzamentos sãointerespecíficos ou intergenéricos,pois o fator determinante da intera-ção entre as células pode estar naparede celular manifestando-se comobloqueio da fusão celular (Peberdy,1991). Os isolados que apresentemcompatibilidade podem ser coloca-dos dentro de um mesmo grupo,formando um grupo de compatibili-dade vegetativa (GCV). Em fungosde reprodução assexuada, isoladosde um mesmo GCV são mais simila-res geneticamente que isolados dediferentes GCV.

A heterocariose também é a pri-meira etapa para que fungosassexuados troquem material genéti-co por meio de um ciclo alternativochamado parassexual. Nesse ciclo,os diferentes núcleos no heterocáriose fundem, originando diplóides he-


terozigotos, e, a seguir, ocorre a pro-dução de recombinantes por meio derecombinação mitótica e haploidiza-ção (Pontecorvo & Roper, 1952).

A detecção de heterocários podeser alcançada pelo cruzamento deindivíduos portadores de diferentesmutações. Quando são formadasanastomoses entre as hifas dessesdiferentes mutantes, o heterocáriopode ser visualizado já que o núcleode um indivíduo contém o gene sel-vagem que complementa a mutaçãodo outro. As diferentes mutaçõespodem estar relacionadas, por exem-plo, à coloração da colônia, mas aobtenção de mutantes por técnicasde mutagênese tradicionais é muitotrabalhosa, o que torna esse procedi-mento difícil de ser empregado paraestudo com muitos isolados de cam-po. Assim, vários trabalhos reportamo estudo de GCVs utilizando muta-ções auxotróficas que incapacitem acélula de utilizar nitrato como únicafonte de nitrogênio (Puhala, 1985;Correl et al., 1986; Brooker et al.,1991). Nesses estudos, é suficientefazer a triagem de populações utili-zando indivíduos que contenham mu-tações únicas em diferentes genes daassimilação do nitrato, que possamser testados para a sua habilidade decomplementar as mutações e de for-mar heterocário em meio contendonitrato como única fonte de nitrogê-nio. Como o isolamento de mutantesresistentes ao clorato gera mutaçõesde diferentes tipos, essas mutaçõespodem ser utilizadas como marcasde seleção para a formação dos hete-rocários. Assim, esse sistema torna-se simples e rápido para ser utilizadopara essa finalidade.

Estudos de compatibilidade ve-getativa são de particular interesseem fungos que se reproduzemassexuadamente, já que os indivídu-os dentro de um GCV podem trocarinformações genéticas por meio deheterocariose e de ciclo parasexual.Em fungos fitopatogênicos, os GCVspodem ser correlacionados com apatogenicidade, embora essa corre-lação não esteja sempre ligada.Puhalla (1985) utilizou mutantes de-ficientes na assimilação de nitratopara testar a compatibilidade vegeta-tiva entre 21 isolados de F. oxysporum,reportando que membros do mesmoGCV pertenciam à mesma formae

speciales. Correl et al. (1986) tambémutilizaram mutantes incapazes demetabolizar nitrato em testes de com-patibilidade vegetativa para identifi-car F. oxysporum f. sp. apii raça 2 deuma população de raças de F.oxysporum que colonizava raízes deaipo. Assim, o teste de compatibili-dade vegetativa é uma ótima ferra-menta para estudos de diversidadegenética constituindo marcadores ge-néticos naturais que podem ser utili-zados para diferenciar isolados. Alémdisso, em fungos que se reproduzemsexuadamente, esses estudos tam-bém são importantes para determi-nar genes relacionados com o tiposexual (mating type), importantes noreconhecimento e desenvolvimentodo ciclo sexual.

Transformação genéticabaseada no gene da nitrato

redutase

Um dos principais passos no de-senvolvimento de uma tecnologia paramanipulação e análise molecular deum organismo é o estabelecimento deum protocolo que permita introduzirseqüências de DNA clonadas em umalinhagem recipiente. A disponibilida-de de um sistema de transformaçãooferece possibilidade de adição e dedeleção de rotas metabólicas em umorganismo de interesse, alterando ofenótipo selvagem para uma aplica-ção específica. As seqüências a seremintroduzidas têm interesses distintos,dependendo do tipo de organismoestudado. Dessa forma, o principalobjetivo da clonagem de genes quecodificam nitrato redutase é o estabe-lecimento de protocolos de transfor-mação baseados na complementaçãode mutações no gene da nitratoredutase. Nesse ponto, além das van-tagens inerentes a esse sistema, outracaracterística importante é ser basea-do na complementação de uma muta-ção auxotrófica, o que evita a introdu-ção de genes de seleção baseados naresistência a drogas.

A transformação é realizada pelaintrodução do gene da nitrato redutaseem um mutante nitrato redutase porbiobalística ou Agrobacteriumtumefaciens, sendo que o métodomais comum é o da transformação deprotoplastos pela técnica do polieti-lenoglicol (PEG)/CaCl

2. Após a trans-

formação, os protoplastos sãoplaqueados por pour-plate em meiomínimo contendo estabilizadorosmótico e nitrato como única fontede nitrogênio. Apenas aquelas célu-las mutantes onde o gene da nitratoredutase se integrar, serão capazesde crescer (Figura 5). Para tanto,pode-se utilizar um gene da nitratoredutase já isolado de um organismoem uma espécie de interesse. Quan-do o gene é de uma espécie diferenteda espécie receptora, o sistema é ditoheterólogo, e quando o gene foiisolado do organismo receptor, osistema é dito homólogo.

Nos sistemas heterólogos, geral-mente há baixa similaridade entre ovetor de transformação e o genomado organismo receptor, o que resultaem baixa freqüência de transforma-ção, integração aleatória e alto núme-ro de cópias do vetor. Esse padrão deintegração aleatório pode ser interes-sante para obtenção de mutantes pelatécnica de REMI (do inglês restrictionenzyme-mediated integration), des-crita por Schiestl e Petes (1991), que éuma variação da técnica de transfor-mação, onde enzima de restrição éadicionada à mistura de transforma-ção juntamente com o plasmídeo line-ar. Queiroz et al. (1998) verificaramque o gene da nitrato redutase de F.oxysporum se integrava aleatoriamen-te no genoma de P. griseoroseum,sendo essa característica utilizada porSoares (2002) para obtenção demutantes de P. griseoroseum pela téc-nica de REMI.

Mesmo assim, sistemas de trans-formação homólogos têm sido de-senvolvidos para vários fungos fila-mentosos, incluindo A. oryzae(Unkles et al., 1989), Cephalosporium

Figura 5 - Seleção de transformantes basea-da no gene da nitrato redutase. Placas commeio mínimo contendo nitrato como úni-ca fonte de nitrogênio. (A) Controle neg-ativo - protoplastos do mutante nitratoredutase que não foram transformados;(B) protoplastos do mesmo mutante queforam transformados com gene homól-ogo da nitrato redutase.


acremonium (Whithead et al., 1990),P. chrysogenum (Gouka et al., 1991),Fusarium oxysporum (Diolez et al.,1993), G. fujikuroi (Tudzynski et al.,1996), B. cinerea (Levis et al., 1997a),S. nodorum (Cutler et al., 1998) e P.griseoroseum (Pereira, 2001). Na lite-ratura, existem relatos para A. oryzae(Unkles et al., 1989) e S. nodorum(Cutler et al., 1998) de 100% deintegração do vetor no locus da nitra-to redutase, sendo que nesses estu-dos foram analisados 22 transfor-mantes para A. oryzae e 13 transfor-mantes para S. nodorum. Para B.cinerea (Levis et al., 1997a), a análisede 36 transformantes revelou 34integrações homólogas, sendo 29eventos de troca gênica. Mesmo quea utilização de genes homólogos au-mente a probabilidade de ocorrênciade integração em sítios homólogos,para fungos filamentosos e outrosorganismos eucariotos, parecem sermais comuns eventos de integraçãoheteróloga. Sistemas de transforma-ção homólogos, baseados na com-plementação de mutações nitratoredutase, desenvolvidos paraCephalosporium acremonium(Whitehead et al., 1990) e P.chrysogenum (Gouka et al., 1991)resultam, na maioria dos transfor-mantes, na integração do vetor emsítios diferentes do locus da nitratoredutase, enquanto que G. fujikuroi(Tudzynski et al., 1996) e F.oxysporum (Diolez et al., 1993) ocor-reu um número similar de integra-ções, dentro e fora desse locus.

Um sistema de transformação comalta incidência de integração homólo-ga, especialmente troca gênica, podeser utilizado para estudos de regiõesimportantes, tanto em nível deregulação como em nível estrutural.Assim, mutações geradas in vitro,como alteração dos sítios de ligaçãode proteínas reguladoras, podem serintroduzidas e avaliadas in vivo noexato local onde reside o gene. Alémdisso, essa alta taxa de integraçãohomóloga é interessante em experi-mentos de co-transformação, pois di-minui a probabilidade de integraçõesem sítios heterólogos que sejam im-portantes para o metabolismo celulare/ou de interesse biotecnológico.

Vários trabalhos relatam a utili-zação de vetores de transformaçãoque carregam o gene da nitrato

redutase como marcadores de sele-ção em experimentos de co-trans-formação para introduzir genes deinteresse biotecnológico. Por exem-plo, Ribeiro (2001) relatou a obten-ção de transformantes com até 89%de aumento na produção de poliga-lacturonase quando co-transformouum mutante nitrato redutase de P.expansum com o plasmídeo pPE 15,que carrega o gene homólogo depoligalacturonase, e o plasmídeopNH24, contendo o gene da nitratoredutase de F. oxysporum comomarcador de seleção. Linhagenstransformantes de A. oryzae apre-sentaram a produção de poligalactu-ronase aumentada em até 3,2 vezesquando transformadas com um genede poligalacturonase de Penicilliumjanthinellum, sendo os transforman-tes selecionados pela complemen-tação de uma mutação nitratoredutase (Ishida et al. 1997). Cardo-so et al. (2003) utilizaram o genehomólogo da nitrato redutase de P.griseoroseum para introduzir umaconstrução do gene da pectina liasee obtiveram transformantes com au-mento expressivo na atividade des-sa enzima.

Utilização do gene danitrato redutase como

vetor de expressão

Uma outra perspectiva na apli-cação biotecnológica do gene da ni-trato redutase é sua utilização comovetor de expressão. Isso é baseadonas análises de expressão onde sãoobservadas grandes quantidades detranscrito do gene da nitrato redutaseapenas poucos minutos após suaindução por nitrato (Okamoto et al.,1991; Haas et al., 1996), sendo esseindutor acessível e de baixo custo.Essa perspectiva é importante umavez que muitos genes de valor bio-tecnológico somente são expressosna presença de um indutor específi-co que, muitas vezes, é oneroso eacarreta a inviabilidade da aplicaçãoindustrial. Para tanto, a região estru-tural do gene de interesse pode serclonada sob controle do promotor dogene da nitrato redutase, abrindo apossibilidade para a indução do genepor uma fonte mais acessível e ape-nas no momento em que o indutorestiver presente.

Uso da nitrato redutasepara detecção e isolamento

de elementostransponíveis

Elementos transponíveis são se-qüências de DNA que podem semover no genoma integrando-seem regiões não homólogas, e queconstituem importantes agentes demutação e reorganização gênica,sendo também utilizados em siste-mas de inativação de genes. Assim,detectar e isolar esses elementos éum importante passo para estudosde biologia básica e aplicada emum organismo. Diferentes estraté-gias são empregadas para o isola-mento de elementos transponíveisem fungos filamentosos. Entre es-sas diferentes estratégias, o métodode armadilha para transposons(“transposons trapping”) é o me-lhor método para detecção e isola-mento de elementos transponíveisativos. Esse método requer, alémde um sistema de seleção positivade mutantes espontâneos, que ogene alvo esteja clonado e caracte-rizado. Conforme discutido anteri-ormente, um dos melhores siste-mas para seleção positiva demutantes espontâneos é o sistemanitrato redutase. Dessa maneira,esse sistema vem sendo emprega-do com muito sucesso para o isola-mento de vários elementos trans-poníveis em fungos filamentosos.Os elementos Fot1, impala, Ant1,Vader, Flipper e hupfer, são exem-plos de transposons clonados pelaseleção de mutações espontâneasno gene da nitrato redutase emFusarium oxysporum, Aspergillusniger, A. fumigatus, Botrytis cinereae Beauveria bassiana (Daboussi etal., 1992; Langin et al., 1995; Glayzeret al., 1995; Amutan et al., 1996;Levis et al., 1997b; Maurer et al.,1997).

Para isolar esses elementos utili-zando-se o sistema nitrato redutase,é necessário isolar mutantes nitratoredutase e caracterizar, por hibridiza-ção com o gene alvo, o tipo demutação que originou o fenótipomutante. Nos mutantes isolados po-dem ocorrer mutações de diferentestipos no gene da nitrato redutase,como, por exemplo, mutações pon-tuais, deleções ou inversões. Além


desses tipos, também pode ocorrer ainserção de um fragmento de DNA,como a inserção de um elementotransponível. Assim, espera-se que oresultado da hibridização apresentealgum mutante com o fragmento dogene alvo maior quando comparadoao tipo selvagem (Figura 6). Após aobtenção de um mutante com a in-serção, pode-se fazer um teste deestabilidade plaqueando-se esporosdo mutante em meio mínimo conten-do nitrato como única fonte de nitro-gênio. Se a inserção for oriunda deum transposon ativo, esse pode sal-tar e reconstituir o fenótipo selva-gem, apresentando maior instabili-dade. O fragmento inserido, ou partedele, pode ser recuperado por meiode bancos genômicos parciais ou deamplificação com oligonucleotídeosespecíficos e, então, seqüenciado ecaracterizado.

Mesmo que o gene da nitratoredutase não tenha sido clonado parauma espécie de interesse, há possibi-lidade de usar um gene heterólogoconforme realizado com sucesso porDaboussi et al. (1992). Esses autoresintroduziram o gene da nitrato redutasede A. nidulans em uma linhagemmutante para nitrato redutase de F.oxysporum e isolaram o elementoFot1 inserido no gene heterólogo.

Assim, a fácil seleção de mutantesnitrato redutase têm-se mostrado umaótima ferramenta no isolamento deelementos transponíveis ativos emdiferentes espécies de fungos fila-mentosos.


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Figura 6 - Esquema da detecção e isolamento de elementos transponíveis utilizando o gene da nitrato redutase como isca.

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Pesquisa

Glucoamilase:Estrutura e termoestabilização

Carla M. Y. LemosLab. de Bioquímica e Microbiologia aplicadaIBILCE - UNESP, Pós Graduação em MicrobiologiaAplicada IB/UNESP - Rio Claro-SP

Erica FuchsDepartment of Food Science and Human NutritionIowa State University, IA-USA

Eleni GomesLab. de Bioquímica e Microbiologia aplicadaDepartamento de BiologiaIBILCE - UNESP - São José Rio Preto-SP

Roberto Da SilvaLab. de Bioquímica e Microbiologia aplicada,Departamento de Química e Ciências Ambientais,IBILCE - UNESP - São José Rio [email protected]


Estrutura e termoestabilização de glucoamilase por técnicas moleculares

Resumo

A glucoamilase (GA) é umaenzima hidrolítica que catalisa a libe-ração sucessiva de β-D-glucose a par-tir do amido e oligossacarídeos relaci-onados. A GA catalisa eficientementea reação de sacarificação do amidodentro de uma faixa estreita de tem-peratura. A sua termoestabilidade li-mitada afeta seu uso no processoindustrial, onde a incubação prolon-gada em altas temperaturas é necessá-ria. As estratégias tradicionais paramelhorar a termoestabilidade da GAde Aspergillus, tais como a imobiliza-ção e modificação química têm falha-do no uso industrial. Atualmente, astécnicas de evolução dirigida utilizan-do a biologia molecular proporcio-nam uma importante ferramenta paramelhorar ou mesmo criar novas pro-priedades nas enzimas existentes, emum curto espaço de tempo. Esta revi-são apresenta a importância, estruturae função da glucoamilase e as recen-tes estratégias da biologia molecularcomo ferramenta para melhorar a ter-moestabilidade desta enzima.

1. Glucoamilase deAspergillus

A glucoamilase (α-1,4-glucanglucohidrolase, EC 3.2.1.3), tambémconhecida como amiloglucosidase, éuma enzima hidrolítica que catalisa aquebra das ligações glicosídicas α-1,4 a partir de uma extremidade nãoredutora das moléculas de amiloseou amilopectina do grânulo de ami-do e oligossacarídeos relacionadosliberando β-D-glucose. Em uma ve-

locidade menor, a glucoamilase tam-bém atua hidrolisando as ligações α-1,6 (Fleetwood e Weigel, 1962). Su-gere-se, portanto, que a ação daglucoamilase ocorra através de ummecanismo multisseriado no qual aenzima atua aleatoriamente em todaa molécula de substrato (James e Lee,1997).

A glucoamilase (GA) é ampla-mente usada na indústria alimentíciapara a produção de xaropes com altoteor de glucose e também é empre-gada na produção de álcool e xaro-pes com alto teor de frutose (1989;Brumm, 1998; Mathewson, 1998).

Vários microrganismos, plantase animais produzem glucoamilase.Estas enzimas disponíveis comercial-mente são, na sua maior parte, pro-duzidas por linhagens dos fungosAspergillus e Rhizopus. Dentre estas,a glucoamilase de Aspergillus é amais termoestável, apresentando amáxima atividade em torno do pH4,5, em temperaturas de 50 a 55°C,mas ela é rapidamente inativada emtemperaturas próximas a 60°C(Manjunath et al.,1983; Brumm, 1998).

A glucoamilase catalisa eficien-temente a reação de sacarificaçãodentro de um limite relativamenteestreito de temperatura, porque asua conformação cataliticamente ati-va muda com o aumento da tempe-ratura. Esta termoestabilidade limi-tada afeta seu uso no processo in-dustrial, onde a atuação prolongadaem altas temperaturas é necessária.Na produção de xaropes com altoteor de glucose, uma pasta de amido(30-40% BS) é primeiro liquefeita a105°C por 5 minutos e em seguida,


Figura 1. Imagem da estrutura estendida da glucoamilase de Aspergillus niger idêntica a glucoamilase de Aspergillus awamori.No lado esquerdo o domínio catalítico (DC), ao centro o filamento ligante ou “linker” (L) e à direita o domínio de ligação aosubstrato (amido) (DLS).http://nte-serveur.univ-lyon1.fr/nte/heyde/www.public.iastate.edu/_pedro/glase/glase.html (10/10/03)

DC L DLS

a 95°C por 2 horas, usando a a-amilase bacteriana termoestável, empH 6.0-6.5. Finalmente, o amidoliquefeito é resfriado a 60°C ehidrolisado por mais 48 a 72 horasusando a glucoamilase (James e Lee,1997, Brumm, 1998). Está claro quea termoestabilidade da glucoamila-se determina a velocidade do pro-cesso como um todo. Trabalhar emaltas temperaturas não apenas podeacelerar a taxa da reação e conse-quentemente diminuir o tempo doprocesso, como também pode pre-venir a contaminação microbiológi-ca, além de reduzir a viscosidade damistura de reação. Portanto, o de-senvolvimento de uma glucoamila-se mais termoestável poderá contri-buir para a otimização do processode sacarificação do amido. Entretan-to, o conhecimento da estrutura daproteína e o processo de termoinati-vação da enzima são necessáriospara elaboração de prognósticos ra-cionais e planos efetivos de experi-mentos de estabilização da estruturaproteica.

A glucoamilase de Aspergillus écodificada por um único gene, masexistem duas ou três formas variáveisda enzima produzidas por proteóliselimitada (Svensson et al., 1986). Pazuret al (1971) constatou que as formasda glucoamilases de Aspergillus nigersão glicoproteinas que possuem quan-tidades diferentes de glicosilações.Como em outras proteínas, após asíntese no citoplasma, a GA é trans-portada em um estado desdobradoatravés da membrana do retículo

endoplasmático (RE). Durante o sub-seqüente processo de dobramento,ocorre a O-glicosilação do “linker”,filamento que liga o domínio catalítico(CD) ao domínio de ligação ao subs-trato (DLS), e pontes dissulfetos sãoformadas (Pryer et al, 1992; Gaut eHendershot, 1993). Assim, a GA, nasua conformação nativa estendida,assume uma forma de alteres, ondedois domínios volumosos, o domíniocatalítico e o domínio de ligação aoamido, estão ligados por um filamentofino como mostra a figura 1. Esta éuma imagem simplificada ilustrativa,uma vez que a estrutura real da GAcompleta ainda não está disponível.A organização dos domínios da mo-lécula tem sido deduzida através dasdiferentes técnicas biofísicas e rela-tos disponíveis (Coutinho, 1997;Sauer, 2000).

As inúmeras proteínas desdo-bradas, que entram no lúmem do RE,devem ser protegidas de quaisqueragressões e serem mantidas em umestado de dobramento-competente.Dobramentos ineficientes ou muta-ções em proteínas secretadas resul-tam em enzimas com conformaçãoincorreta e defeito na atividade(Bonifacino e Klausner, 1994).

Em Aspergillus awamori, o genecodifica uma GAI de tamanho com-pleto contendo de 615 a 616 resíduosde aminoácidos (figura 2), bem comoo peptídeo sinalizador de secreçãono N-terminal. O peptídeo sinalizadoré cortado após a secreção da proteí-na pela célula. O outro maior produ-to de proteólise da GAI (diz-se da GA

competente) é a GAII resultante daperda do sítio de ligação ao substratolocalizado na extremidade C-termi-nal. A GAII é uma mistura depolipeptídeos de tamanhos entre 512e 514 resíduos de aminoácidos, comatividade catalítica normal mas sem ahabilidade para se ligar ao amido noestado natural, não gelatinizado(Svensson et al., 1986).

As proteínas originais deAspergillus niger e Aspergillusawamori, cujas seqüências são idên-ticas (Svensson et al., 1989; Nunberget al., 1984), consistem de três prin-cipais áreas funcionais (Coutinho eReilly, 1994 a-b, Coutinho e Reilly,1997): (1) o domínio catalítico, cons-tituído dos resíduos 1 ao 440, (2) ofilamento ligante, formado pelos re-síduo 441 ao 512, que é altamente O-glicosilado, e (3) um domínio deligação ao amido no estado naturalna extremidade C-terminal, conten-do os resíduo 513 a 616 (Svensson etal., 1986; et al., 1989). Além da regiãode O-glicosilação do “linker”, doisoutros sítios de N-glicosilação estãolocalizados nos resíduos Asn 171 eAsn 395 (Svensson et al., 1989; Aleshinet al., 1992). Acredita-se que os resí-duos de carboidratos desempenhamuma importante função na estabiliza-ção da glucoamilase (Manjunath etal.,1983, Svensson et al.,1989;Williamson et al., 1992a). Em altastemperaturas, a GA de A. niger, qui-micamente desglicosilada, (Shenoyet al., 1984) e a glucoamilase de A.awamori, geneticamente truncada,sem parte da região de O-glicosilação


(Evans et al, 1990), deterioraram-semais rapidamente do que as suasformas selvagens. Além disso, a GAIIem que falta apenas do domínio deligação ao substrato, tem termoesta-bilidade similar a da GAI (Svenssonet al., 1986), enquanto que umaglucoamilase especial (GAI’), na qualfaltam parte da região O-glicosilada eo domínio de ligação ao amido, émenos estável do que a sua formaoriginal (Hayashida et al., 1989). Aregião de O-glicosilação também fa-cilita a secreção de GA (Evans et al.,1990).

A estrutura da GA nativa é muitodifícil de determinar em função doalto grau de glicosilação. Aleshin etal (1992) determinou a estrutura cris-talina de uma GA muito próxima daforma nativa denominada A. awamorivar. X100 (GA’) (figura 3), a qual foiobtida por proteólise limitada comsubtilisina e apresenta os primeiros470 resíduos de aminoácidos da pro-teína original. Esta seqüência de ami-noácidos da GA’ é 99,4% similar aGAI de A. niger e A. awamori, comuma deleção no resíduo 102 (Aleshinet al, 1992, 1994a). Assim, o estudodesta estrutura cristalina elucidou aconformação do domínio catalíticocompleto e a conformação da primei-ra metade N-terminal da região O-glicosilada da glucoamilase deAspergillus. A estrutura cristalina daGA de A. awamori var. X100 mos-trou que o domínio catalítico consis-te de treze a-hélices que compreen-dem cerca de 51% dos resíduos deaminoácidos do polipeptídeo total, eregiões menores de β filamentosantiparalelos. Doze das α-hélicesestão arranjadas dentro de uma estru-tura denominada barril α/α, consis-tindo de seis α-hélices externas e seisinternas que envolvem o sítiocatalítico em forma de funil, constitu-ído por seis segmentos α/α altamen-te conservados (Sauer, 2000). O sítiocatalítico da GA possui uma barreirade resíduos hidrofóbicos no centro,os quais separam o núcleo em duasregiões de volume morto (void), con-tendo apenas água. Uma serve comoo sítio ativo propriamente dito e aoutra, tem uma função ainda nãoconhecida (Aleshin et al., 1994a). Osítio ativo contém Glu179 e Glu400

como os dois resíduos de aminoáci-dos catalíticos localizados no fundodo sítio (Harris et al., 1993; Sauer,2000). A estrutura em barril α/α doDC da GA de A. awamori, A. niger ede Saccharomyces fibuligera são si-milares, sendo que esta última apre-senta 14 α-hélices, 12 das quais estãona conformação barril α/α (Sevcik etal, 1998; Sauer et al, 2000). Estaconformação contrasta com atopologia de organização em barrilα/β encontrada em outras enzimasamilolíticas tais como α e β-amilases(Buisson et al., 1987; e Mikami et al.,1993) e ciclodestrina glucosiltransfe-rases (Klein e Schulz, 1991). Obser-vou-se uma pequena similaridadeentre a estrutura da GA e proteínastransportadoras de glucose. Assim, aorganização das hélices na GA podeser relevante para a conformação deproteínas que transportam glucose(Aleshin et al, 1994a).

O segmento O-glicosilado estánuma conformação de cinto estendi-do em torno do barril α/α catalítico.Isto sugere que este segmento servecomo um elo de ligação estruturalentre o domínio catalítico e o domí-nio de ligação. A primeira parte (ami-noácidos 441 a 471) desta região O-glicosilada possui cerca de 10 resídu-os de manoses expostos, que juntos

com 2 unidades de glucoses ligadasN-glicosidicamente nos resíduos Asn171 e Asn 395, formam um cinto deglicosilações ao redor do domíniocatalítico (Aleshin et al, 1992). Foisugerido que a outra parte altamenteO-glicosilada (aminoácidos de 472 a512) envolva o domínio catalíticocomo uma continuação do resíduo471, fazendo com que o domínio deligação ao amido fique próximo aosítio ativo (Sauer et al, 2000). Osegmento C-terminal do “linker” con-tém cerca de 30 aminoácidos, princi-palmente serina e treonina, sendo,portanto, muito O-glicosilado. A estaparte particular do linker tem sidoatribuída papéis na estabilidade, se-creção e na digestão do amido cru(Libby et al, 1994; Sauer et al, 2000).Embora algumas características comoa compactação da conformação dobarril α/α, a proteção dos carboidra-tos e a região O-glicosilada, façam aGA de Aspergillus mais estável doque algumas proteínas, uma maiorestabilidade ainda é requerida paraos processos industriais, como expli-cado anteriormente.

O domínio de ligação ao amidopossui este nome por causa da suacapacidade de se ligar ao grânulo deamido nativo e permitir sua digestãopelo domínio catalítico (Svensson et

Figura 2. Seqüência de aminoácidos (1 letra) da GA de A. niger. Letras vermelhas: α-helice; letras azuis: fita-β; C dentro dos retângulos: resíduos de cisteínas envolvidosem pontes dissulfetos; N dentro dos retângulos: sitios N-glicosilados; T e S dentro dosretângulos: sítios O-glicosilados; E dentro dos retângulos: resíduos dos aminoácidoscatalíticos glutâmico 179 e 400; seqüências sombreadas: regiões conservadas S1 a S5;seqüência sublinhada: sitio de ligação ao substrato. Fonte: Flory, 1993.


al., 1983). Este domínio parece ter acapacidade de ligar a GA à parede dacélula isto porque tem afinidade porα-1,4 e α-1,6 glucanos que pertencemà parede celular. Esta afinidade au-menta a concentração de GA próximada micromembrana da célula(Neustroev et al., 1993). A GAII, naqual faltam os resíduos 513 a 616, temuma habilidade semelhante a GAIpara digerir amido solúvel, mas pos-sui uma habilidade drasticamente re-duzida para se ligar e hidrolisar oamido nativo (Svensson et al., 1989).Recentemente, foi demonstrado queo DLS isolado, atuando em grânulosde amido juntamente com a GAII,apresentaram um efeito sinergísticona degradação do substrato insolúvel,sugerindo que o domínio de ligaçãoao substrato se liga ao amido comouma porção individual e rompe acompacta estrutura do grânulo deamido facilitando a hidrólise pelodomínio catalítico (Southall et al, 1999;Sauer et al, 2000). O domínio deligação ao amido da GA possui umasignificante similaridade de seqüên-cia de aminoácidos com o domínio deligação ao amido da ciclodextrina gli-cosiltransferase (CGTase) (Svensson

et al., 1989). A estrutura tridimensionalda CGTase é globular, contendo de 6a 8 fitas β (Klein e Schulz, 1991). Aestrutura do domínio de ligação aoamido da GA revela uma estruturabem definida em fitas β consistindode um par paralelo e 6 paresantiparalelos que formam um barril βaberto na lateral. Dois sítios de liga-ção para outros ligantes foram encon-trados neste domínio, sendo cada umno final da molécula em faces opostas(Sorimachi et al., 1996). O mecanismoproposto de ligação deste domínioaos grânulos de amido, parece envol-ver a formação de um complexo deinclusão entre os resíduos hidrofóbicosdo domínio de ligação e os grânulosde amido (Goto et al., 1994).

Existem quatro pontes dissulfe-tos na GA, das quais três estão nodomínio catalítico e uma no domíniode ligação. No domínio catalítico, aspontes estão entre os resíduos 210 e213 (conectando o N-terminal com omeio da hélice 7), 262 e 270 (conten-do um filamento β antiparalelo) e 222e 449 (associando o trigésimo resí-duo O-glicosilado do “cinto” com odomínio catalítico) (Aleshin et al.,1992). Experimentos sugerem que

existe uma ligação dissulfeto entre osresíduos 509 e 604 que conecta o N-terminal com o C-terminal do domí-nio de ligação ao substrato (Coutinhoe Reilly, 1994 b).

Existem dois resíduos N-glicosi-lados (Asn 171 e Asn 395) na GA, nosarredores do sítio ativo. Em cadacaso, o N da Asn está ligado à posiçãoC1 do primeiro resíduo de açúcar (N-acetil-D-glucosamina), que está liga-do por β (1→4) ao segundo (N-acetil-D-glucosamina) que por suavez se liga ao terceiro resíduo (D-manose) (Aleshin et al., 1992). Onúmero total de resíduos de açúcarespara formar a cadeia glicosil ligada aAsn 171 e Asn 395 é 5 e 8 respectiva-mente (Aleshin et al., 1994 a). Amutação Asn 395→ Gln que removeuo sítio de N- glicosilação no resíduo395, diminuiu drasticamente tanto asecreção como a termoestabilidade,mas não alterou a atividade específi-ca (Chen et al., 1994 b).

Embora a GA de A. awamoriprimariamente catalise a clivagemhidrolítica de ligações a (1,4) comliberação de β-glucose a partir deuma extremidade não redutora dacadeia de amido e oligossacarídeos,ela também cliva ligações glicosídicasa (1,6) com uma eficiência catalítica(Kca

t/ Km) por volta de 500 vezes

menor do que para as ligações a (1,4)(Fleetwood e Weigel, 1962).

2. Termoestabilização daGlucoamilase

2.1. Estratégias tradicionais

A modificação química e a imo-bilização são as duas principais estra-tégias tradicionais que têm sido ex-ploradas para melhorar a termoesta-bilidade da GA.

Modificação química: altera umgrupo funcional específico nas pro-teínas, tal como um grupo carboxila,por reação química. Embora estatécnica tenha aumentado a estabili-zação da a α-quimotripsina em 1000vezes (Moshaev et al., 1988), elageralmente tem um rendimento ne-gativo ou relativamente muito pe-queno na termoestabilização da GA(Sinitsyn et al.,1978; Munch e Tritsch,1990).

Figura 3. Esquema da glucoamilase (GA’) de Aspergillus awamori var. X100 (Aleshinet al., 1992). α- hélices (H1 a H13) são simbolizadas por cilindros, sítios de O-glicosilação são representados por hexágonos simples, e sítios de N-glicosilação sãosimbolizados por cadeias de três hexágonos.


Imobilização: geralmente resul-ta em alguma perda da atividadeenzimática (Lee et al., 1976; Svenssone Ottesen, 1981; Lenders e Crichton,1988), mas apesar disso, foi usadaem GA porque ela permite o proces-so contínuo de operação. Emboramuitas GAs imobilizadas tenhammelhor estabilidade do que as formassolúveis, elas ainda não substituíramestas últimas no uso industrial, istoporque as GAs imobilizadas devemser usadas em temperaturas operaci-onais baixas a fim de serem preserva-das por vários meses, e continuaremviáveis (Lee et al., 1976). Desde quea energia de ativação para a atividadeenzimática deva ser menor do quepara a inativação da enzima, umatemperatura de 38 a 40°C é recomen-dada para a GA imobilizada. Entre-tanto, o decréscimo na temperaturaoperacional resulta numa baixa taxade reação e em contaminaçãomicrobiológica, que é menos facil-mente controlado em fábricas do queem laboratório. Lee et al., (1976)relataram que a GA imobilizada ren-deu xaropes com teores mais baixode glucose, 1,0-1,5%, e de DextroseEquivalente (DE), 1,0-1,5 unidades,do que aqueles produzidos porenzimas solúveis. Isto é atribuído alimitação da difusão de partículas deglucose, que resulta em um gradien-te de concentração de glucose e,consequentemente, leva a uma mai-or incidência de reações reversíveisdo que se o gradiente não estivessepresente (Lee et al., 1980). Alémdisso, numa aplicação real, as altasconcentrações do substrato estabili-zam tão bem a GA que o aumento datermoestabilização proporcionadopela imobilização torna-se relativa-mente insignificante (Klesov eGerasimas, 1979).

2.2. Estratégiasmoleculares (EvoluçãoDirigida de Enzimas)

O advento da engenharia deproteínas, empregando técnicas debiologia molecular, proporcionounovas estratégias para a termoestabi-lização de enzimas. O gene da GA deA. awamori foi clonado e expressadoem Saccharomyces cerevisiae (Innis

et al., 1985) e em Pichia pastoris(Fierobe et al. 1997), o que permitiuo emprego da manipulação genéticacomo uma maneira de modificar aenzima para melhorar suas proprie-dades catalíticas ou físicas.

Estas estratégias para criar novasou melhoradas propriedades emenzimas, atualmente podem ser sepa-radas em duas estratégias comple-mentares 1) desenho racional e 2)evolução dirigida. O desenho racio-nal de proteínas é baseado no conhe-cimento detalhado da seqüência pri-maria, estrutura, função e mecanismode catálise. Através destes conheci-mentos, alterações são introduzidas,principalmente, por mutação sitiodirigida, como será discutido abaixo.A evolução dirigida, (Zhang, 1997)não exige conhecimento da relaçãoestrutura-função da enzima. A evolu-ção dirigida é também chamada debiotecnologia evolutiva (Arnold eVolkov, 1999; Reetz e Jaeger, 1999;Sutherland,2000). O termo evoluçãodirigida subtende uma série de expe-rimentos que reproduzem, de formaacelerada e em tubos de ensaios, aevolução da diversidade natural eadaptação ambiental. Mutações erecombinações são feitas dando aoprocesso uma direção no sentido deatingir a otimização de uma proprie-dade específica (Lehman e Wyss,2001). Muitas pistas de como melho-rar enzimas vêm dos estudos de comoas enzimas evoluem na natureza. As-sim, esta poderosa técnica objetivaotimizar o processo de melhoramentodas enzimas utilizando mecanismosenvolvidos na evolução natural (mu-tação, recombinação e seleção natu-ral). Entretanto, a evolução dirigidadifere do processo natural no sentidoem que são os pesquisadores quedefinem as propriedades a seremotimizadas e o processo biotecnológi-co acontece em um período curto detempo (semanas ou meses) (Reetz,1999).

Num experimento de evoluçãodirigida, primeiramente é induzidauma alteração no DNA visando umaresposta específica. Isto resulta emuma biblioteca de populações comdiferentes graus de possíveis respos-tas, incluindo ou não a resposta espe-rada. O próximo passo é encontrar

dentre as milhões de possibilidades,a solução ou as soluções corretas, ouseja, a enzima que exibe a proprieda-de desejada (Arnold, 1996).

Em suma, este processo consistena combinação de técnicas da biolo-gia molecular apropriadas para amutação e expressão do gene,acopladas a um eficiente e rápidosistema de seleção. (Reetz e Jaeger,2000). A idéia é partir de uma enzimaselvagem, realizar a mutagênese nogene que codifica a enzima e seleci-onar os melhores mutantes de acor-do com a característica fenotípicadesejada (Zhang, 1997). Após a sele-ção dos mutantes, segue-se novosciclos de mutações buscando melho-res mutantes.

Quando a taxa de mutação, ta-manho da biblioteca e o processo deseleção são adequados, o fenótipodesejado de uma enzima geralmenteaumenta a cada ciclo de mutações(Zhang, 1997).

Existe um grande número dediferentes estratégias de mutagênesepara criar diversidade de seqüências,tais como a mutação pontual ao aca-so por PCR mutagênico (error-pronePCR), e o embaralhamento de DNA(DNA shuffling). Combinações des-tas técnicas também vêm sendo utili-zadas. Tais estratégias serão discuti-das a seguir:

2.2.1 Mutação Sítio Dirigida(MSD)

É uma poderosa técnica na qualapenas um ou poucos aminoácidosespecíficos são substituídos por ou-tros aminoácidos, por alteração noscorrespondentes nucleotídeos nogene codificador da proteína. Quan-do realizada com sucesso, ela tem avantagem de melhorar a característi-ca desejada da enzima sem afetaroutras propriedades e até mesmo decriar mutantes carregando várias ca-racterísticas melhoradas.

Nesta ferramenta, as mudançasprecisas, efetuadas na seqüência dosaminoácidos, são baseadas no conhe-cimento detalhado da estrutura daproteína, função e mecanismo (Chen,1999). Por exemplo, um resíduo par-ticular de aminoácido pode ser iden-tificado como sendo importante para


a atividade catalítica da enzima (Reetz,1999), sendo assim, uma substituiçãoindividual deste aminoácido poderiaprovocar mudanças na estrutura se-cundária resultando em enzimas comcaracterísticas desejáveis (Chen, 1999).Entretanto, seria impossível predizerqual dos 19 aminoácidos remanes-centes seria o melhor alvo para amutação que resultaria em subsequen-te melhoria da propriedade procurada(Reetz, 1999). Muitas tentativas paraalterar especificamente algumas daspropriedades das enzimas atravésdesta técnica falharam, isto porque aintrodução de aminoácidos substitu-tos têm efeitos inesperados na estru-tura e função da enzima. (Kikuchi,1999). Além disso, tem sido observa-do que em muitos estudos de muta-ção sítio dirigida, o aumento da ter-moestabilidade está vinculada ao de-créscimo da atividade catalítica (Carreae Colombo, 2000). As falhas tambémpodem ser porque este processo re-quer conhecimento de detalhes daestrutura tridimensional da enzima,de seu mecanismo de catálise, bemcomo um certo grau de intuição naescolha do aminoácido a ser substitu-ído (Reetz, 1997). Em muitos casos,estas substituições foram feitas semlevar em consideração as proprieda-des estruturais da proteína (Chen, 1999).

2.2.2. PCR mutagênico (Error-prone PCR):

A introdução de mutações atra-vés desta técnica envolve uma modi-ficação no protocolo de PCR (Jaegere Reetz, 2000). Uma reação de PCR énormalmente realizada de modo aamplificar qualquer dado DNA comalta fidelidade. A atividade de corre-ção de erro 3’ → 5’ da DNA polime-rase assegura que a amplificação doDNA siga de maneira precisa. Ocasi-onalmente, nucleotídeos errados sãoincorporados durante a amplificaçãolevando a mutações com uma fre-qüência de 0,1 a 2x 10-4 pornucleotídeo para a DNA polimerasetermoestável do Thermus aquaticus(Taq polimerase). Esta baixa taxa deerro pode ser aumentada para 7x 10-3

por nucleotídeo através de um oumais dos seguintes procedimentos:aumento da concentração de MgCl

2,

adição de MnCl2, aumento na con-

centração de dCTP e dTTP e aumentona quantidade taq polimerase. Para opropósito de evolução dirigida deenzima, estas condições devem sermodificadas a fim de se obter umataxa média de 1 a 2 nucleotídeosmutados por gene, levando a umamudança média de 1 aminoácido porenzima mutante (Reetz, 1999). A van-tagem de tal processo é que pode serrealizado rapidamente envolvendoqualquer proteína, mesmo sem oconhecimento preciso de sua estru-tura (Zhang et al, 1997 e Jaeger eReetz, 2000).

2.2.3. Embaralhamento de DNA(DNA shuffling)

Este poderoso processo de evo-lução dirigida, que gera diversidadepor recombinação, é baseado na com-binação de mutações úteis de genesindividuais. Bibliotecas de genes qui-méricos podem ser geradas por frag-mentação aleatória de um gene, se-guido por recombinação dos frag-mentos em uma reação de PCR(Crameri, 1998).

O embaralhamento de DNAcombinado com uma seleção para aatividade pode acelerar a evoluçãodirigida das características deseja-das. Nesta técnica, a diversidade éintroduzida a partir de uma bibliote-ca de mutações pontuais aleatórias(Christians et al, 1999). Os genesselecionados podem ser submetidosa mais ciclos de mutações (reemba-ralhamento) e melhorar ainda mais asua mutação benéfica original(Stemmer, 1994a) simulando de for-ma acelerada, o processo natural derecombinação sexual (Christians etal, 1999).

A técnica consiste basicamentena fragmentação de um gene comdiferentes mutações pontuais porDNAse I. A recombinação dos frag-mentos aleatoriamente resulta emmoldes trocados e recombinados. Umgene recombinante contendo 4“crossovers” pode ser selecionado dabiblioteca de recombinantes basea-do na função melhorada. O conjuntoselecionado promove o ponto departida para outro ciclo de mutaçõese recombinações. Este processo iso-

lado causa um baixo número demutações pontuais, mas se for dese-jado, mutações adicionais podem serincorporadas por PCR mutagênicoou mutagênese por UV no “pool” degenes (Stemmer, 1994a).

A técnica de embaralhamentopode ser realizada com mutantes domesmo gene e também com geneshomólogos de diferentes espécies(family shuffling) (Reetz e Jaeger,1999). Esta recente adaptação permi-te que duas ou mais seqüências queocorram naturalmente sejam usadascomo material genético iniciador.Neste método, genes similares sãomisturados, fragmentados aleatoria-mente e recombinados sob condi-ções que permitam o anelamento e aextensão de fitas complementaresnão idênticas (Christians et al, 1999).A recombinação que ocorre nestatécnica é causada pela incorporaçãode um fragmento derivado de umaseqüência dentro de outra, baseadona homologia.

Análises evolutivas de famíliasde enzimas sugerem que mudançasdrásticas na função da enzima exi-gem uma considerável mudança naseqüência de aminoácidos de umpolipeptídeo. Tais mudanças prova-velmente não ocorrem durante o pro-cesso de evolução in vitro, no qual asenzimas são principalmente melho-radas por mutações de ponto comuma tendência a transições etransversões limitando o acesso a umamplo espectro de substituições. Emcontraste, a mutação natural, tipica-mente resultante de recombinaçãosexual ou homóloga, gera deleções,inserções, duplicações ou fusões.Neste último processo, tais muta-ções alteram o espaçamento entreos resíduos de aminoácidos e seg-mentos de cadeias de polipeptídeose pode resultar em mudanças naespecificidade e novas atividadescatalíticas (Chen, 2001).

“Screening” e Seleção: Grandesbibliotecas de mais de 1010 genesmutantes podem facilmente ser cri-adas usando as técnicas acima. Por-tanto, o desenvolvimento de umsistema apropriado de seleção é deimportância chave no processo deevolução dirigida de enzimas (Reetz,1999). Seleções efetivas, nas quais


apenas aqueles clones carregando acaracterística desejada sobrevivamou cresçam mais rápido são raras(Arnold e Volkov, 1999). No caso doemprego de vetores (plasmídios), o“screening” é feito para obter osmutantes que incorporaram o vetorcontendo o gene desejado. O vetorgeralmente carrega um gene pararesistência a algum antibiótico, porisso utiliza-se o plaqueamento daslinhagens submetidas ao processode mutagênese em um meio conten-do o antibiótico. As colônias quecrescerem neste meio, certamenteincorporaram o vetor e podem serescolhidas para a próxima etapa. Emoutros casos, a mutação positivaresulta em reparo de algum defeitoque poderá ser usado como ferra-menta para a seleção. Por exemplo,a recuperação da habilidade de pro-dução de enzimas formadoras dehalos na placa de seleção. A etapaseguinte é a escolha de colônias quetenham a característica desejada, porexemplo, o aumento na termoesta-bilidade enzimática. Assim, asenzimas das colônias positivas no“screening” serão submetidas a tes-tes de termoinativação a fim de seisolar as colônias produtoras deenzimas termoestáveis.

2.3. Enzimastermoestabilizadas porestratégias moleculares

Akanuma et al (1998) introduzi-ram o gene leuB (que codifica para a3-isopropilmalato desidrogenase en-volvida na biossíntese de leucina) nomicrorganismo termofílico Thermusthermophilus usando técnicas de evo-lução dirigida de enzimas. Após mu-tação no gene da enzima, eles obtive-ram uma variante termoestável. Aestabilidade térmica da enzimamutante foi 10°C acima da observadana enzima selvagem.

A técnica da evolução dirigidafoi aplicada à kanamicina nucleoti-diltransferase (KNTase), uma enzimaque confere resistência ao antibióti-co kanamicina. Variantes destaenzima apresentaram resistência akanamicina a uma temperatura de63°C e foram produzidas por doisciclos seguidos de mutações resul-

tando em duas substituições de ami-noácidos (Reetz e Jaeger, 1999).

Kikuchi et al (1999) aplicaramesta técnica nos genes xylE e nahHque codificam para a enzima catecol2,3-dioxigenase. Mais de 2000 cloneshíbridos foram criados e posterior-mente selecionados para estabilida-de térmica. A melhor enzima quimé-rica selecionada foi testada a 50°C ea vida média foi de 70 min, muitomaior do que a enzima codificadapelos genes selvagens xylE (2,7min)e nahH (5,4min).

Yang et al (2000) criaram ummutante para o gene da subtilisina Eatravés da técnica de PCR mutagênico.Análises do seqüenciamento revela-ram apenas uma substituição (A→G).O tempo de vida médio da atividadeda enzima mutante, quando encubadaa 65°C, foi de aproximadamente 80min enquanto que uma outra linha-gem mutante (mutante original usadono PCR mutagênico) e a linhagemselvagem apresentaram um tempo de13 e 15 min respectivamente.

Miyazaki et al (2000) usaram atécnica de embaralhamento de DNAem uma subtilisina S41 psicrofílicacom o objetivo de aumentar sua ter-moestabilidade e atividade. Após aterceira geração de bibliotecas cria-das por PCR mutagênico, três varian-tes termoestáveis foram identifica-das. Das três, uma enzima mutanteem particular teve a maior atividaderesidual após incubação a 70°C. Estasubtilisina S41 variante contém 7 subs-tituições de aminoácidos, todas con-tribuindo para o aumento da suatermoestabilidade.

A temperatura ótima da lipasefoi aumentada em até 15°C atravésda mutagênese aleatórea utilizando atécnica de PCR com tendência aoerro (Kohno et al, 2001).

Utilizando-se da técnica de em-baralhamento de DNA Hayashi et al.(2001), obtiveram quimeras de β-glucosidase com a termoestabilidadeaumentada em até 16°C quando com-paradas com a enzima original.

A evolução dirigida foi tambémusada para melhorar a termoestabi-lidade da galactose oxidase (Sun etal, 2001). Foi observado que asenzimas mutantes obtidas, manti-nham a atividade enzimática e a

especificidade pelo substrato seme-lhantes às da enzima selvagem, en-tretanto, a termoestabilidade foi au-mentada. O T

50 (temperatura na qual

as enzimas perdem 50% da sua ativi-dade) foi aumentado para 67°C paraos dois mutantes mais termoestáveisenquanto que a selvagem não ultra-passou 63°C.

Experimentos com a GA usamna sua grande maioria a MSD comoferramenta para a obtenção de carac-terísticas desejadas melhoradas, umaboa revisão neste assunto foi apre-sentada por Ford (1999). Várias abor-dagens preconizadas para estabiliza-ção podem ser acessadas pela MSD,como por exemplo, as substituiçõesdos resíduos flexíveis de glicina emα-helices, substituições de seqüênci-as susceptíveis a desamidação e que-bra Asn-Gly, alterações em ligaçõesfrágeis como Asp-X, introdução deprolina que reduz o número de con-formações no estado desdobrado,acréscimo cisteínas para aumentar onúmero de pontes dissulfetos, alémde combinações destas abordagensem mutantes múltiplos etc. (Ford,1999; Sauer, 2000).

Libby et al (1994) testaram oefeito de deleções de aminoácidosna região O-glicosilada da GA deAspergillus awamori. Foram feitasdeleções para remover os resíduosde 466 a 512 (GAI), de 485 a 512(GAII) e de 466 a 483 (GAIII). Anali-sando as frações intracelulares eextracelulares, observou-se que aregião deletada da GAIII afetou asecreção enquanto que a deleção daGAII contribuiu para a produção euma estrutura estável da proteína.Para todos os mutantes foram encon-tradas atividades catalíticas similaresà selvagem indicando que as deleçõesnão afetaram o sítio catalítico.

Chen et al. (1994) substituírama seqüência susceptível a desamida-ção, Asn182-Gly, por Ala182-Gly, oque resultou em decréscimo de 2,5vezes na taxa de termoinativação a60 e 65°C.

O efeito da substituição de resí-duos flexíveis de glicina por alaninaem quatro diferentes α-hélices na GAde Aspergillus awamori foram estu-dados (Chen et al, 1996). Substitui-ções simples de Gly137 e Gly139 e


no mutante múltiplo contendo ambasas mutações estabilizaram a GA con-tra a termoinativação irreversível.

Com o objetivo de estudar opapel das regiões conservadas na GAde Aspergillus awamori, Sierks et al(1993) realizaram substituições nosresíduos de Leu177, Trp178 e Asn182por His, Arg e Ala, respectivamente.Quando se substituiu Leu177 por Hishouve um grande aumento na ener-gia de ativação para substratos comligação α(1→4) e α(1→6); na substi-tuição Trp178 por Arg, a energiaaumentou para substratos com liga-ções α(1→6), mas não para α(1→4).Estas substituições indicaram que osresíduos de aminoácidos Leu177 eTrp178 estão localizados no subsítio1 e 2 respectivamente. Por outrolado, a substituição Asn182 por Hisnão alterou os valores de energia deativação para nenhum tipo de liga-ção do substrato, sugerindo que esteresíduo não é crucial para o mecanis-mo catalítico da GA.

Fiorobe et al. (1996) substitui-ram Ala246 por Cys, criando maisuma ponte dissulfeto entre este resí-duo e o resíduo Cys320. O mutanteapresentou maior atividade residuale atividade catalítica por 15 minutoscomparado a linhagem selvagem.Fiorobe et al. (1998) produziram ummutante substituindo o Glu 400 porCys. A atividade do mutante, apósoxidação da cisteina para acidocisteinosulfínico, elevou a atividadedo mutante para 160% em relação alinhagem selvagem. Entretanto, nãohouve ganho de termoestabilidade.

Uma ponte dissulfeto foi criadasubstituindo Asn20 e Ala27 por Cysna GA de Aspergillus awamori eobservou-se um aumento na termo-estabilidade de 1,2 kJ/mol a 65°C (Liet al, 1998).

Mutantes contendo prolina emsubstituição a vários aminoácidos fo-ram estudados por Allen et al. (1998).O maior sucesso com mutação sim-ples foi obtido no mutante Ser30→Pro,resultando em um aumento da ener-gia livre de termoinativação de 1,6 kJ/mol a 65°C. Os autores ainda combi-naram diferentes mutações termoes-táveis e obtiveram um triplo mutantecontendo Gly137→Ala, Ser30→Pro eAsn20→Cys/Ala27→Cys que apresen-

tou aumento cumulativo de termoes-tabilidade de 4,4 kJ/mol.

Estes experimentos, embora te-nham como objetivo principal a me-lhora em propriedades da enzima,paralelamente desempenham um pa-pel de extrema importância, o deelucidar as funções de inúmeros seg-mentos da cadeia polipeptídica daproteína.

3. Conclusão eperspectivas futuras

As técnicas de evolução dirigidadisponíveis, associadas a considera-ções teóricas e às várias experiênciasrelatadas de sucesso ou não, disponí-veis na literatura, têm levado a umacrescente seleção de mutações bemsucedidas para termoestabilização daGA. Todavia, este sucesso ainda nãorefletiu significativamente na produ-ção de enzima industrialmente satis-fatória, deixando o campo ainda aber-to para novas experiências.

Os organismos atualmente dis-poníveis para clonagem e expressãoda GA são mesofílicos, criando difi-culdades para a seleção de enzimasmais termoestáveis. Além disso aslinhagens de E. coli utilizadas sãodeficientes em glicosilação e forma-ção de pontes dissulfetos, essenciaispara a GA ativa. Pesquisas combacterias termofílicas e/ou bacteriascompetentes para a clonagem e ex-pressão da GA estruturalmente ativa,podem ser alternativas viáveis parareduzir tempo e manipulação.

A maior parte das informaçõessobre seqüências de GA são dosfungos mesofílicos, A. niger e A.awamori. Informações de seqüênci-as de GAs termoestáveis, seriam im-portantes para orientação racional dedesenhos de experimentos de evolu-ção dirigida. Entretanto, poucas GAstermoestáveis de fungos termofílicosforam relatadas. Dentre estes estãoHumicola grisea var. thermoidea(Tosi et al. 1993), Aspergillusfumigatus (Brandani e Peralta, 1998)e Thermomyces lanuginosus (Li et al1998). Informações sobre seqüênciasgenéticas são ainda mais raras. Aprocura por novas fontes de GAstermoestáveis, bem como informa-ções sobre a proteína e seu gene

codificador são um campo aberto ecom enormes perspectivas futuras.

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Pesquisa

Marcadores Molecularesno Melhoramento Genético

de Araucária

Valdir Marcos StefenonBiólogo – Mestre em BiotecnologiaDepto. de Ciências Biológicas e da Saúde – [email protected]

Rubens Onofre NodariEng. Agrônomo – Doutor em GenéticaDepartamento de Fitotecnia – CCA – UFSC


Caracterização da diversidade genética em Araucaria angustifolia

Introdução

A exploração florestal foi umaimportante alavanca para o desenvol-vimento econômico do Sul do Brasildesde o início do século XX, comintensidade crescente nas décadas de1950 a 1970 (Guerra et al., 2002).

A principal espécie explorada nes-se ciclo foi a Araucaria angustifolia(Bert.) O. Ktze., única representanteda Família Araucariaceae no Brasil eprincipal espécie que compõe a flo-resta ombrófila mista ou mata dearaucária (Guerra et al., 2002). NoBrasil, a distribuição natural dessaespécie se dá em amplas áreas nosestados do Rio Grande do Sul, SantaCatarina e Paraná, e em alguns pontosmais elevados de São Paulo, Rio deJaneiro e Minas Gerais (Reitz e Klein,1966).

Todavia, a alta qualidade de suamadeira para os mais diversos fins,desde a construção civil até a produ-ção de celulose e de papel, fez comque essa espécie fosse exaustivamenteexplorada, tendo como conseqüênciauma drástica redução das grandes re-servas de A. angustifolia no sul do país.

Além dessa exploração desor-dena-da, o avanço das fronteiras agrí-colas foi outro fator responsável pelaredução das populações naturais des-sa importante espécie florestal.

Em função desses acontecimen-tos, a araucária encontra-se hoje naLista Oficial de Flora Ameaçada deExtinção (IBAMA, 2002) e os rema-nescentes de floresta ombrófila mistaestão reduzidos a fragmentos isoladosde diversos tamanhos.

Em alguns desses fragmentos, es-tima-se que grande parte da diversida-de genética tenha sido perdida (Schögl,

2000; Auler et al., 2002), fato queinviabiliza a regeneração natural daespécie, devido à endogamia acentu-ada e à redução do fluxo gênico entresuas populações.

Nos últimos anos, diversas dis-cussões a respeito desse tema vêmapontando para a necessidade de sedesenvolver o melhoramento genéti-co dessa conífera, com vista a regene-rar a Floresta de Araucária e discipli-nar os plantios com finalidade lucra-tiva, seja pela exploração da madeira,seja pela venda das sementes comes-tíveis ou de outros subprodutos.

Entretanto, antes de os progra-mas de melhoramento genético seremimplementados, é necessário que seconheça a diversidade genética exis-tente entre as populações remanes-centes e dentro delas. Esses estudossão importantes para que se interpreteo efeito da fragmentação dos rema-nescentes sobre a estrutura genéticadas populações: informação essencialpara o planejamento de programas demelhoramento.

Esse conhecimento, além de re-duzido, tem sido produzido basica-mente a partir de marcadores morfo-lógicos (Shimizu e Higas, 1980;Monteiro e Spelz, 1980; Kageyama eJacob, 1980) e isoenzimas (Shimizu etal., 2000; Auler et al., 2002; Mantovaniet al., 2002).

Considerando a utilização de mar-cadores RAPD (Williams et al., 1990;Welsh e McClelland, 1990) e AFLP(Vos et al., 1995) para estudos genéti-cos em diversas espécies florestais, oobjetivo deste estudo foi determinar acapacidade informativa desses marca-dores para a caracterização da diver-sidade genética de populações natu-rais de A. angustifolia.


Material e Métodos:

Material vegetal eExtração de DNA

O material vegetal utilizado nesteestudo foi composto por amostras foliaresde trinta indivíduos adultos de umapopulação natural do Parque EcológicoMunicipal de Lages, Estado de SantaCatarina, coletados e acondicionadosem sacos plásticos que continham sílicagel. Inicialmente, foram testados seteprotocolos para extração de DNA vege-tal com base na utilização do detergenteCTAB. Com esses testes, chegou-se àconclusão de que era necessário otimizarum protocolo específico para a espécie,a fim de eliminar os compostos contami-nantes do DNA presentes nas folhas dearaucária (principalmente proteínas epolifenóis) e a fim de evitar a liofilizaçãodo material vegetal.

Aproximadamente 150 mg de fo-lhas foram congeladas em nitrogêniolíquido e maceradas completamente emgral de porcelana. Ao pó resultante,acrescentou-se 1,5 mL de tampão deextração [CTAB 2%; NaCl 1,5 M; EDTA 20mM; Tris-HCl (pH 8,0) 100 mM; PVP 2%;2-mercaptoetanol 1%]. O material foitransferido para tubos eppendorf de 2 mLe mantido em banho-maria (60°C) por 40min. A cada 15 minutos, o material foihomogeneizado por inversão. Após essaetapa, o material foi deixado sobre abancada até alcançar a temperatura am-biente, quando lhe foram acrescidos, emcada tubo, 600 µL de CIA [clorofórmio:álcool isoamílico 24:1]. O material foihomogeneizado durante três minutos,por inversão, e centrifugado a 13.000RPM, por 5 min. A porção aquosa quecontinha o DNA foi transferida para doisnovos tubos e foram acrescidos a ela 5 µLde RNAse A (10 µg/mL). Após 40 min, a34°C, realizou-se uma segunda extraçãoorgânica com CIA. Após a centrifugação(13.000 RPM, por 5 min), a porçãoaquosa foi transferida para novos tubos,aos quais adicionaram-se 50 µL de solu-ção de CTAB 10% [CTAB 10%; NaCl 1,4M], a 60°C. Após a homogeneização,realizou-se uma terceira extração orgâni-ca com CIA. A porção aquosa foitransferida para novos tubos e o DNA foiprecipitado pela adição de 2/3 do volu-me de álcool isopropílico gelado(-20°C).O material foi mantido por 30 min a -20°C e, posteriormente, centrifugado a7.000 RPM, por 5 min . O álcoolisopropílico foi descartado e o DNA

desidratado novamente com 1 mL deálcool etílico 95%. O material permane-ceu por 10min a -20°C e centrifugado a8.000 RPM, por 5 min. O álcool etílico foidescartado e deixou-se o precipitadosecar a temperatura ambiente. O DNA foidiluído em 100 µL de TE, a temperaturaambiente, por um período de 12 a 16horas, e armazenado a -20°C.

A concentração de DNA foi de-terminada pela comparação com quan-tidades conhecidas de DNA de fagolambda (20, 50, 100 e 200 ng/µL), apóseletroforese em gel de 0,8% de agarose,corado com solução de 0,02% debrometo de etídio. A leitura espectro-fotométrica da razão OD260/OD280foi utilizada para determinar a purezadas amostras frente à contaminaçãopor proteínas.

Reações RAPD

Para reações RAPD, foram utiliza-dos seis iniciadores comercializadospela Operon Technologies ® (OPA04,OPA09, OPA17, OPC06, OPF16,OPAN15). O coquetel da reação cons-tou de tampão de PCR 1X, 3,8 mM deMgCl

2, 0,4 mM de dNTPs, 0,4 µM de

iniciadores, 1 U de Taq DNA polimerasee 1,5 ng/ µL de DNA. As reações de PCRforam desenvolvidas em termocicladorPTC-100 (MJ Research Inc.) em umvolume de 13 µL. O programa utilizadofoi composto de uma etapa inicial dedesnaturação (4 min. a 92°C), seguidade 35 ciclos de amplificação (45 s. a92°C; 45 s. a 35°C; 1 min e 15 s. a 72°C),e terminada com uma etapa final deelongação das cadeias de DNA (3 min a72°C). Os produtos amplificados foramseparados por eletroforese horizontalsubmersa em tampão TBE 1X, em gel de1,5% de agarose, corado com soluçãode 0,02% de brometo de etídio. Asbandas foram visualizadas sob luz ultra-violeta e os géis fotografados com filmePolaroid preto e branco.

Reações AFLP

Sete combinações de iniciadorespara reações AFLP foram selecionadasaleatoriamente no kit AFLP ® AnalysisSystem I / Life Technologies ® (E-ACG+M-CAC, E-ACT+M-CAA, E-ACA+M-CTT, E-ACG+M-CAG, E-AAG+M-CTG, E-ACC+M-CAT e E-ACC+M-CAC) e as reações foram desen-volvidas de acordo com o protocolo deVos et al. (1995), com pequenas modi-ficações. Inicialmente, realizou-se a res-trição do DNA com as enzimas EcoRI eMseI, durante duas horas, a 36°C. Aligação dos oligonucleotídeos adapta-dores foi realizada por 2 horas, a 20°C,em um volume de 25 µL. Na etapaseguinte (pré-amplificação), o DNA foiamplificado com a utilização de inicia-dores com uma base seletiva (EcoRI-A eMseI-C). O DNA pré-amplificado foidiluído em uma razão de 1:25 e ampli-ficado novamente, utilizando-se inicia-dores com três bases seletivas (EcoRI-ANN e MseI-CNN). As etapas de restri-ção enzimática, de ligação dos adapta-dores e de amplificações foram realiza-das em termociclador PTC-100 (MJResearch Inc.). Os produtos amplifica-dos foram separados por eletroforesevertical em tampão TBE 1X, em gel de6% de poliacrilamida. As bandas foramvisualizadas após coloração com nitratode prata.

Para a coloração, os géis foramfixados com solução de 0,5% de ácidoacético + 5% de etanol, por 10 min., ecom solução de 1% de ácido nítrico,por três minutos. Posteriormente, fo-ram impregnados com solução de ni-trato de prata 0,2%, durante trinta mi-nutos. Após esse tempo, uma soluçãode 3% de carbonato de sódio + 0,2% deformaldeído foi utilizada para a revela-ção das bandas, durante o tempo ne-cessário. As revelações foram finaliza-das com a utilização de uma soluçãode 5% de ácido acético. Após cada

Figura 1: Polimorfismo revelado em marcadores RAPD em A. angustifolia, entre os trintaindivíduos da população do Parque Ecológico Municipal de Lages, utilizando o iniciadorOPA04. Linhas 1 a 30: indivíduos da população. M= marcador de peso molecular 1kb.


etapa, os géis foram lavados durante 20segundos com água destilada. Todosos tratamentos foram realizados sobleve agitação. Após a secagem dos géisem temperatura ambiente, as bandasforam visualizadas sob luz branca e osgéis fotografados com máquina digital.

Caracterização daDiversidade Genética eCapacidade Informativa

Os índices de diversidade esti-mados foram: a similaridade genética,o número médio de bandas, a porcen-tagem de bandas polimórficas e adiversidade genética. Os padrões debandas obtidos com os marcadoresRAPD e AFLP foram analisados e paraeles construiu-se uma matriz binária,que identificava sua presença ou suaausência, codificadas por 1 ou 0, res-pectivamente. A partir dessa matrizde dados, com o auxílio do softwareNTSYS-pc 2.02 (Rohlf, 1990), foi de-terminado o índice de similaridadegenética de Jaccard entre os indivídu-os e pelo método de agrupamentoUPGMA (método das médias das dis-tâncias), foram gerados, separadamen-te e de maneira agrupada, osdendrogramas para marcadores RAPDe AFLP. Para determinação da diversi-dade genética, foi utilizado o índicede Shannon, dado pela fórmula H= -Σ pi ln(pi), onde pi corresponde àfreqüência de cada alelo (Lewontin,

1970). Como ambos os marcadoresapresentam característica dominante,considerou-se cada banda amplificadacomo sendo um loco com dois alelos,presente ou ausente no gel.

Para determinar a capacidade in-formativa dos marcadores RAPD eAFLP, foram utilizados para a compa-ração dados gerados a partir de mar-cadores isoenzimáticos (Auler et al.,2002) e PCR-RFLP (Schögl, 2000) pro-venientes da mesma população. Devi-do à diferente natureza dos marcado-res, o índice de diversidade deShannon foi determinado para todosos dados e usado como parâmetro decomparação.

Resultados e Discussão:

A partir dos seis iniciadores utili-zados para as reações RAPD, foramobtidos dezoito marcadores polimórfi-cos, de um total de 62 bandasamplificadas, com uma média de 11,16bandas amplificadas por iniciador. Amédia de bandas polimórficas foi de3,0 por iniciador, com uma porcenta-gem média de 26,9%. O índice dediversidade de Shannon foi igual a 0,53(Tabela 1). A figura 1 apresenta opadrão de bandas obtido com o inici-ador OPA04, para reações RAPD.

As sete combinações emprega-das para as reações AFLP revelaram 62

Figura 2: Dendrograma de similaridade genética entre indivíduos, estimado peloíndice de Jaccard para a população de A. angustifolia do Parque Ecológico Municipalde Lages, gerado a partir de 18 marcadores RAPD (r=0,83).

aarapaciténegedadisrevidedsecidnísovitcepsereDPARseõçaersansodazilituserodaicinI:1alebaT.segaLedlapicinuMocigólocEeuqraPodailofitsugna.Aedoãçalupop

serodaicinI latotoremúNsadnabed

sacimrófilopsadnaB edecidnÍ)H(edadisrevidedaditnauQ %

4APO 21 30 %0,52 85,09APO 31 20 %4,51 95,071APO 60 10 %7,61 85,06CPO 90 30 %3,33 25,061FPO 31 50 %5,83 65,051NAPO 90 40 %4,44 34,0

DPARserodacramarapsaidéM 61,11 0,3 %9,62 35,0

edadisrevidedsecidnísovitcepserePLFAseõçaersansodazilituserodaiciniedseõçanibmoC:2alebaT.segaLedlapicinuMocigólocEeuqraPodailofitsugna.Aedoãçalupopaarapaciténeg

serodaicinI latotoremúNsadnabed

sacifrómilopsadnaB edecidnÍ)H(edadisrevidedaditnauQ %

CAC-M+CGA-E 09 4 %4,4 56,0AAC-M+TCA-E 001 01 %0,01 54,0TTC-M+ACA-E 06 3 %0,5 86,0GAC-M+GCA-E 001 12 %0,12 55,0GTC-M+GAA-E 08 6 %5,7 65,0TAC-M+CCA-E 501 7 %6,6 55,0CAC-M+CCA-E 09 11 %2,21 05,0

PLFAserodacramarapsaidéM 3,98 8,8 %8,9 45,0


marcadores polimórficos, em um totalde 625 bandas amplificadas. A médiade bandas totais amplificadas foi de89,3 e de bandas polimórficas foi de8,8 por combinação de iniciadores. Aporcentagem média de bandaspolimórficas foi de 9,8%. Para marca-dores AFLP, o índice de diversidadede Shannon foi de 0,54 (Tabela 2).

Quando os dois tipos de marca-dores foram analisados conjuntamen-te, o total de bandas amplificadas foide 687, com 80 bandas polimórficas,que correspondiam a 11,6%. As médi-as de bandas totais e polimórficasamplificadas foram de 52,8 e 6,15 poriniciador, respectivamente. A diversi-dade genética determinada pelo índi-ce de Shannon foi de 0,54 (Tabela 3).

Marcadores isoenzimáticos (Auleret al., 2002) empregados na mesmapopulação acessaram uma diversida-de genética de Shannon de H=0,29, aopasso que marcadores PCR-RFLP deDNA de cloroplastos (Schögl, 2000)detectaram um único haplótipo napopulação, correspondendo a umadiversidade virtualmente inexistente.Nesse caso, marcadores RAPD e AFLPmostraram-se altamente eficientes, de-tectando uma diversidade genéticaquase duas vezes maior (1,8 x) queaquela determinada por isoenzimas.

Apesar de caracterizar-se pela aná-lise da molécula de DNA da mesmaforma que as técnicas RAPD e AFLP, atécnica PCR-RFLP aplicada a genomasde cloroplastos não possibilitou adetecção de diversidade nesta popu-lação. Já as técnicas RAPD e AFLP nãodemonstraram limitações para acessara diversidade genética em populaçõesaltamente exploradas, como a utiliza-da nesta pesquisa.

Quando os valores obtidos nopresente trabalho são comparados aoutros estudos que utilizaram as técni-cas RAPD e AFLP, estes podem serconsiderados baixos. Contudo, há dese considerar que os estudos comisoenzimas e PCR-RFLP utilizados comoparâmetro para a comparação tambémapresentaram valores baixos para essapopulação, quando comparados a ou-

tras populações de A. angustifolia ana-lisadas antes.

Por outro lado, uma criteriosaseleção de combinações de iniciado-res permite que a técnica AFLP apre-sente um polimorfismo muito maior(Stefenon, 2003).

A similaridade genética foi anali-sada em função dos três dendrogramasgerados: um, a partir dos 18 marcado-res RAPD polimórficos (Figura 2), osegundo, a partir dos 62 marcadoresAFLP polimórficos (Figura 3) e o ter-ceiro, a partir dos 80 marcadores RAPDe AFLP polimórficos agrupados (Figu-

ra 4). A maior similaridade genéticaentre indivíduos foi de 86% (indivídu-os L11 e L13), com marcadores RAPD;81 % (indivíduos L5 e L26), commarcadores AFLP e 71% (indivíduosL6 e L7), com o agrupamento dos doistipos de marcadores. Nesse ponto,percebe-se que o maior número demarcadores permite uma maior discri-minação entre os indivíduos analisa-dos.

A comparação entre os trêsdendrogramas permite ainda perce-ber que, no agrupamento dos marca-dores, o maior número de bandas

Figura 4: Dendograma de similaridade genética entre indivíduos, estimado pelo índicede Jaccard para a população de A. angustifolia do Parque Ecológico Municipal de Lages,gerado a partir de 18 marcadores RAPD e 62 marcadores AFLP agrupados (r=0,80).

Figura 3: Dendrograma de similaridade genética entre indivíduos, estimado peloíndice de Jaccard para a população de A. angustifolia do Parque Ecológico Municipalde Lages, gerado a partir de 64 marcadores AFLP (r=0,83).

ailofitsugna.AedoãçalupopaarapsodamitseaciténegedadisrevidedsecidnísoarapsaidéM:3alebaT.PLFAeDPARserodacramedritrapa,segaLedlapicinuMocigólocEeuqraPod

serodacraM latotoremúNsadnabed

sacifrómilopsadnaB edecidnÍ)H(edadisrevidedaditnauQ %

DPARserodacramarapsaidéM 61,11 0,3 %9,62 35,0PLFAserodacramarapsaidéM 3,98 8,8 %8,9 45,0

PLFA+DPARsaidéM 8,25 51,6 %6,11 45,0


AFLP fez com que o dendrogramaficasse muito semelhante ao geradounicamente dos marcadores AFLP.

Utilizando-se um valor máximode 50% para a similaridade genéticaentre os indivíduos, o dendrogramagerado a partir de marcadores RAPD(Figura 2) dividiu-se em doze grupos.A maior similaridade genética foi ob-servada entre os indivíduos L11 e L13,com 86% de similaridade e o ponto deunião de todos os grupos apresenta30,5% de similaridade.

O dendrograma gerado de mar-cadores AFLP (Figura 3) dividiu-se emquinze grupos, utilizando-se 50%como similaridade máxima; o pontode união de todos os grupos apresen-ta 24% de similaridade. Com essesmarcadores, a similaridade genéticaentre pares de indivíduos variou de24% a 81%.

Deve-se considerar que existe umarelação entre o número dado a cadaplanta e sua proximidade geográfica,sendo mais próximos geograficamenteos indivíduos cujos números são maispróximos. Dessa forma, pode-se ob-servar que os argumentos de plantassão aleatórios, formados por indivídu-os dispersos pelo Parque, em uma áreade 2,34 km2. Esse dado sugere queindivíduos geograficamente, os quaispodem ser aparentados, não apresen-tam grande similaridade genética.

Considerações Finais

Um aspecto importante a ser con-siderado é que a A. angustifolia prova-velmente possuía uma grande diversi-dade genética antes da exploração ocor-rida durante o ciclo da madeira no suldo Brasil (Auler et al., 2002).

Dessa forma, antes de qualquerprevisão de melhoramento genético éessencial conhecer a diversidade ge-nética existente nas populações rema-nescentes, para possibilitar a seleçãode plantas e sementes a serem utiliza-das, tanto para a produção de mudas,quanto para cruzamentos controlados.

A exemplo do ocorrido no Par-que Ecológico Municipal de Lages,durante o ciclo da madeira, a seleçãopromovida pelo homem até o mo-mento, foi a retirada dos melhoresfenótipos, em detrimento dos demais.

Devido ao acesso aleatório a am-plas regiões genômicas praticamentelivres da ação da seleção natural, astécnicas RAPD e AFLP geram um gran-

de número de marcadores virtual-mente neutros. Neste caso, dos resul-tados obtidos no presente trabalho,pode-se concluir que essas técnicasapresentam-se como poderosas ferra-mentas para a caracterização da diver-sidade genética dos remanescentes deA. angustifolia, com vistas ao melho-ramento genético da espécie.

Agradecimentos

Ao CNPq, UNIPLAC e FUNCITECpelo apoio financeiro e à Prefeiturado Município de Lages, pelo apoio naobtenção do material vegetal.


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Pesquisa

Introdução

A cultura da macieira possui pa-pel de destaque no cenário frutícolabrasileiro. Atualmente, a área cultiva-da no Brasil está estimada em 30 milhectares, com uma produção aproxi-mada de 967 mil toneladas (ABPM,2003). Visando atender às demandasde mudas da pomicultura nacional,faz-se necessária a aplicação de méto-dos eficientes para garantir grandequantidade de material vegetal de altaqualidade genética e fitossanitária.

A produção de mudas da maciei-ra tradicionalmente é efetuada atra-vés de técnicas de propagação vege-tativa, como a enxertia de cultivarescopa sobre um porta-enxerto. Tradi-cionalmente a muda é obtida atravésde mergulhia de cepa (Driessen &Souza Filho, 1986). Porém, esse mé-todo restringe o número de mudasobtidas, requer muito tempo, alémde poder resultar em mudas de baixaqualidade fitossanitária.

Diante da problemática relacio-nada às técnicas convencionais depropagação, a biotecnologia atravésdo aperfeiçoamento das técnicas decultivo in vitro, tem sido uma exce-lente opção para a multiplicação des-ta frutífera (Figura 1). Possibilita aprodução de mudas de alta qualida-de sanitária oriundas da cultura demeristemas livres de vírus, evitando,desta forma, os problemas de disse-minação de vírus e outros patógenosdurante a fase de propagação.

Diversos trabalhos vêm sendoconduzidos no Laboratório deMorfogênese e Bioquímica Vegetal(CCA/UFSC) a partir de projetos fi-

Micropropagaçãode Macieira

Monita Fiori de AbreuAcadêmica do curso de Agronomia,Bolsista PIBIC/BIP/CNPq - Laboratório deMorfogênese e Bioquímica Vegetal - CCA/[email protected]

Enio Luiz PedrottiPh.D., Prof. Adjunto IV , Departamento deFitotecnia - Laboratório de Morfogênese eBioquímica Vegetal -CCA/[email protected]


Avanços nos protocolos de micropropagação

nanciados pelo CNPq e FINEP. Asprincipais linhas de pesquisa foramno sentido de desenvolver metodo-logias que abrangem desde o isola-mento e inoculação in vitro demeristemas, até a aclimatização dasplantas micropropagadas.

Metodologia

1 - Isolamento e Inoculaçãoin vitro

A introdução e o estabeleci-mento de meristemas in vitro é umadas fases mais delicadas da micro-propagação. O isolamento demeristemas é um processo oneroso(Nunes et al., 1999) mas é primordi-al, pois é uma condição que garantea produção de brotações livres depatógenos. A oxidação e a contami-nação provocam grandes perdas domaterial. Os meristemas extraídosdas gemas apicais apresentam taxasde oxidação acima de 40%. A per-centagem de contaminação é cons-tatada em cerca de 35% dosexplantes. Num trabalho conduzidocom o porta-enxerto M.9, todos ostubos de ensaio com meio de culturacontaminado apresentaram oxida-ção (Tabela 1). Os agentes contami-nantes como fungos e bactérias libe-ram compostos que causam a oxida-ção. O estabelecimento in vitro éexecutado segundo metodologiasconsideradas clássicas para esta fase(Pedrotti, 1993; Nunes et al. 1999).As gemas são extraídas com o auxí-lio de um bisturi e estas, são subme-tidas à lavagem com água destilada/autoclavada e detergente Tween


20®por 20 minutos. Em seguida, asgemas são imersas em solução deAnfotericina B®(25 mg.L-1) por 10minutos. Em câmara de fluxo laminar,as gemas são imersas em etanol 70%por 1 minuto, seguida de solução dehipoclorito de sódio 4%, por 10 mi-nutos. Durante este processo os fras-cos são mantidos sob agitação con-tínua. Posteriormente, faz-se umatríplice lavagem com água destila-da/autoclavada e as gemas perma-necem em uma solução de ácidoascórbico 15% por 10 minutos atéserem inoculadas em sais e vitami-nas de MS (Murashige e Skoog, 1962),sacarose (30 g.L-1), ágar (6 g.L-1) sem

suplementação de fitorreguladores(Souza et al.,2003).

As gemas axilares introduzidasin vitro têm apresentado oxidaçãoacima de 50%, enquanto que os mei-os de cultura contaminados com fun-gos e bactérias são normalmente aci-ma de 30% (Tabela 1). Da mesmaforma, todos os tubos contendo meiode cultura contaminados apresenta-ram oxidação. Quando os explantesnão apresentam oxidação nem con-taminação, são transferidos de tubosde ensaio com novos meios de cultu-ra para eliminar resíduos fenólicosliberados pelas plantas no meio decultura inicial (Zanol, 1996). Nos tra-

balhos conduzidos no laboratório,após a transferência dos meristemasprovenientes de gemas apicais e seg-mentos nodais com gemas axilares,não ocorrem mais problemas de con-taminação nem oxidação.

O crescimento e desenvolvimen-to dos meristemas e gemas axilaressão normalmente lentos até 30 diasapós a inoculação, não sendo obser-vado o crescimento de brotações.Aos 60 dias, é possível observar odesenvolvimento de brotações. Parao porta-enxerto M.9, os meristemas egemas axilares introduzidos in vitro,formam um número médio de 3 e 5gemas por broto, respectivamente(Tabela 1).

As diferenças observadas na in-trodução in vitro e multiplicação po-dem ser consequência do estado fisi-ológico das plantas matrizes, ondeforam coletados os explantes comosalientaram Grattapaglia & Machado(1990). Quando material vegetal co-letado é retirado das matrizes no finaldo verão, possivelmente, as gemas jáiniciam o processo de entrada emdormência, o que diminui a sobrevi-vência dos meristemas e gemas intro-duzidos in vitro. Desta forma, a épo-ca mais interessante para a introdu-ção in vitro é aquela que correspon-de a um intenso crescimentovegetativo nas condições naturais.

2 - Multiplicação domaterial vegetal

A composição salina mais utili-zada nos meios de cultura é a MS(Murashige & Skoog, 1962), geral-mente suplementada com regula-dores de crescimento que permi-tem direcionar as respostas morfo-genéticas (George, 1996). Para afase de multiplicação in vitro damacieira, Ribas & Zanette (1992)

Figura 1: Frascos do cultivo in vitro de macieira

esotorbesamegedsoremún,oãçadixo,oãçanimatnoC.1alebaT('9-M'arieicamedotrexne-atroponsolacedlautnecrep sulaM

allimup .seralixasamegesametsiremedarutlucadritrapa,).M

sodasilanAsortemâraPsotnematarT

sametsireM sameG )%(VC)%(oãçanimatnoC a6,83 a2,23 1,41

)%(oãçadixO b3,24 a4,85 5,21otorbropsamegedoidémºN b0,3 a0,5 6,21sodamrofsotorbedoidémºN a0,3 a0,4 6,9

)%(solaC a3,26 b4,21 1,41

esafanedatsopseraerbosSMarutlucedoiemmePABedseõçartnecnocsetnerefidedotiefE.2alebaToãçacilpitlumed ortivni (arieicamed apracytalpsulaM .arutlucedsaid54sópa)

edoãçartnecnoCPAB

seõçatorbedºNetnalpxerop

sadarutlA)mc(seõçatorb

sodotnemirpmoC)mc(sónertne

)%(oãçacifirtiV

Mµ00,0 c0,1 a3,2 b95,0 a0,24Mµ11,1 b0,2 a6,2 b95,0 c0,81Mµ22,2 a0,3 a6,2 c45,0 c0,81Mµ44,4 b0,2 a9,2 a56,0 b0,42)%(VC 2,41 3,51 3,31 9,81

ed%5edlevínoa,isertneetnemavitacifingismerefidoãnlacitrevanartelamsemedsadiugessaidéM.nacnuDedetsetolep,edadilibaborp


utilizaram o meio MS suplementa-do com 1,0 mg.L-1 de BAP e 1,0mg.L-1 de tiamina, e Modgil et al.(1999) obtiveram a maior taxa demultiplicação de brotações da culti-var Tydeman´s Early Worcester adi-cionando ao meio de cultura 4,4 µMde BAP e 5,0 µM de KIN. Para oporta-enxerto Marubakaido Nuneset al. (1999) utilizaram concentra-ções de BAP entre 1,11 e 4,44 µM.

Quando se pretende estudar ocomportamento de um novo genótipo,os explantes são repicados para tubosde ensaio (2,5 x 15,0 cm) contendo 15mL de sais e vitaminas de MS, suple-mentado com diferentes concentra-ções de benzilaminopurina (BAP) (0;0,25; 0,50 e 1.0 mg.L-1), 30,0g.L-1 desacarose, 6,0 g.L-1 de ágar. Para umgenótipo usado com planta indicadorade viroses, é possível verificar que asconcentrações de BAP influenciam suaresposta in vitro (Tabela 2). O materialé mantido no escuro por 48 horas, apóseste período, é transferido para a salade crescimento sob fotoperíodo de 16horas e temperatura de 25 ± 2°C e 40µmol.m-2.s-1 de radiação luminosa,fornecidas por lâmpadas fluorescentesPhillips® Super 84.

3 - Microenxertia

Tendo em vista as característicasda cultura, a associação das técnicasde micropropagação e microenxertiapermite combinar as vantagens darápida multiplicação in vitro, com aunião de dois genótipos diferentes:um clone copa, selecionado paraproduzir frutos de alta qualidade, eum clone de porta-enxerto, que con-fere à cultivar copa característicasrelevantes, como: vigor, produtivida-de, qualidade de frutos, resistência afatores adversos como a patógenosdo solo, além de realizar funçõesbásicas de suporte da planta, forneci-mento de água e nutrientes e a adap-tação às condições de solo, clima edoenças.

A micronexertia foi inicialmen-te desenvolvida por Murashige et al.(1972) e posteriormente melhoradapor Navarro et al.(1975), buscando aprodução de citrus livres de viroses.Esta técnica permite a obtenção deplantas livres de patógenos, aplica-

ção de quarentena em espécies ve-getais cuja disponibilidade seja deapenas algumas gemas vegetativas,separação entre viroses e outras do-enças, além de estudos fisiológicos,histológicos e histoquímicos nasenxertias. Porem ainda é um desafiopromover com sucesso a enxertia deum material tão pequeno e frágilcomo aquele proveniente de plantasproduzidas in vitro. (Obeidy & Smith,1991). Para garantir a viabilidade domicroenxerto é necessário que ascélulas da base do microenxerto dacultivar copa, entrem novamente emdivisão, pois são diferenciadas, ouseja, já deixaram o ciclo celular enão sofrem mais desdiferenciação.Na retomada do ciclo celular é pos-sível induzir novas competências ediferenciar para estabelecer os teci-dos estruturais e condutores (Taiz &Zeiger, 1991). O estabelecimento denovos tecidos condutores é o resul-tado do sucesso do método.

Nos trabalhos desenvolvidos noLaboratório de Morfogênese e Bio-química Vegetal, como modelo, fo-ram utilizados dois porta-enxertos(M9 e Marubakaido) e uma cultivarcopa (Gala) de macieira. O porta-enxerto M9 (Malus pumila Mill.) é omais utilizado no sul do Brasil, tendocomo característica principal dimi-nuir o vigor da planta. Além de redu-

zir o porte da planta, o M9 aumentaa precocidade e é um dos poucosporta-enxertos que apresenta boaresistência à podridão do colo(Phytophthora cactorum) (Barrit,1999). O porta-enxerto Marubakaido(Malus prunifolia Borkh.) é de ori-gem japonesa, sendo bastante utili-zado como porta-enxerto comercialno Japão, Europa bem como no Bra-sil (Bessho et al., 1993). É vigoroso,apresenta resistência à podridão-do-colo, relativa resistência a Roselliniasp. e é muito sensível a viroses(Denardi, 1986). A culitvar copa Gala(Malus domestica Borkh.) é a primei-ra em volume de produção no Brasil,apresenta frutificação precoce, altaprodutividade e boa adaptação a al-titudes superiores a 1000m (Denardi,1986).

4 - Estudos histológicos

A microenxertia é realizada emfenda simples conforme a metodo-logia proposta por Hartmann et al.(1990). Em câmara de fluxo laminar,a parte apical das plântulas dosporta-enxertos é retirada e a alturadas plantas uniformizada em 5 cmde altura. Para a variedade copaGala sãopreparados microgarfoscom uma única gema lateral. Atra-vés de um corte em fenda simples

Figura 2: Fenda do microenxerto de macie-ira., início de brotação na copa, 30 dias apósa microenxertia.

Figura 3: Detalhes dos pontos de conexãoobservados no corte histológico do microenx-erto de macieira, 90 dias após a microenxertia.


realizado nas plântulas dos porta-enxertos, e um corte em bisel nominigarfo da cultivar copa, é reali-zada a enxertia com o auxílio deduas pinças. Os microenxertos sãoentão inoculados em frascos commeio de cultura MS (Murashige &Skoog, 1962) e transferidos para asala de crescimento, com tempera-tura de 25±2ºC, fotoperíodo de 16horas e luminosidade de 40 µmol.m-

2.s-1, onde permanecem até as cole-tas dos segmentos. Para os estudoshistológicos, de ambas as combina-ções enxerto-porta-enxerto, Gala so-bre Marubakaido e Gala sobre M9,são realizadas 120 microenxertias,o que diminuem os erros experi-mentais. O material vegetal coleta-do é fixado em glutaraldeído 2,5%em tampão fosfato de sódio 0,1M –pH7,2, desidratado em série etílicae emblocado em parafina (Johansen,1940). Os cortes são corados comazul de toluidina e montados, entrelâmina e lamínula, com bálsamo doCanadá. A análise dos corteshistológicos é feita em microscopiaóptica e em lupa, 30 e 90 dias apósa microenxertia (Figuras 2 e 3). A

conexão dos microenxertos évizualizada a partir de duas etapas.O primeiro momento se dá em pou-cos dias e é caracterizado pela mor-te de camadas celulares da interfacedo enxerto e pela formação de cé-lulas parenquimáticas que preen-chem o ponto de enxertia, resultan-do no desenvolvimento de umacamada necrótica na fenda. Na se-gunda etapa, ocorre a proliferaçãode um calo em associação com aregião vascular da copa e do porta-enxerto, formando uma ponte nainterface do enxerto. Posteriormen-te, há a diferenciação de algumascélulas do calo em novas célulascambiais. Ocorre, então, a uniãoentre os tecidos afins da copa e doporta-enxerto resultando no esta-belecimento de uma conexão cam-bial contínua. Na última fase, acontinuidade da epiderme no pon-to de enxertia é restaurada. O pos-terior desenvolvimento da copa peloalongamento e desenvolvimento debrotações caracteriza o sucesso damicroenxertia, observado em até30 dias em macieira (Abreu et al.,2003).

5 - Enraizamento deplantas micropropagadas

O enraizamento de microesta-cas é considerado por vários autoresum dos estágios mais críticos doprocesso de propagação massal deplantas perenes (Wang, 1991), poisdepende do genótipo e de sua condi-ção fisiológica no momento daindução ao enraizamento (Martins &Pedrotti, 2001). A emissão de raízespor uma microestaca pode ser dividi-da em três fases, que compreendema desdiferenciação celular, a induçãoe a organização dos primórdiosradiculares (Hartmann et al., 1997;Blakesley et al., 1991). Na maioriados protocolos estabelecidos para amicropropagação de plantas, o enrai-zamento é induzido in vitro, utilizan-do meios de cultura contendo umaauxina (Harbage & Stimart, 1996;Deklerk et al., 1997; Ferri et al., 1998).Para a maioria das espécies, a auxinaé necessária na fase de indução dasraízes enquanto que, na fase de dife-renciação dos primórdios e no cresci-mento das raízes, a presença deauxinas no meio de cultura pode

edsotrexne-atropsodsadagaporporcimsatnalpmesezíaredotnemirpmoceoremúN.3alebaTedoãçacilpaedsamrofeseõçartnecnocsetnerefidasoditembus,odiakaburaMe9.M,7.Marieicam

.sotartsbussetnerefidmesezíarsadotnemicsercoae)BIA(ocirítublodnIodicÁ

sezíaredoremúN )mc(sezíarsadotnemirpmoCsotnematarT "7.M" "9.M" "odiakaburaM" "7.M" "9.M" "odiakaburaM"

1 c0,1±0,4 a0,1±0,5 a0,2±0,01 b1,0±7,1 a5,0±7,2 b4,0±8,12 b5,0±0,6 b0,1±0,3 b0,1±0,3 ba1,0±9,1 c2,0±5,0 c3,0±5,03 a0,1±0,8 c0,0±0,0 c5,0±0,2 a2,0±2,2 d0,0±0,0 c3,0±4,04 a0,1±0,9 a0,1±0,5 a0,2±0,31 a2.0±2,2 b2,0±6,1 a5,0±4,3

ed%5edlevínoa,isertneetnemacitsitatsemerefidoãnartelamsemadsadiugesanulocansaidéM.yekuTedetsetolep,edadilibaborp

:sotnematarToãçudnI-1 ortivni sezíarsadotnemicserceragámeBIAedMµ5.1me ortivni ;ragámeoãçudnI-2 ortivni sezíarsadotnemicserceragámeBIAedMµ5.1me ortivni ;larenimotartsbusmeoãçudnI-3 ortivni otnemicserceBIAedM94,0moc ortivni ;larenimotartsbusmeoãçudnI-4 ortivxe esafamocetnatimocnoclarenimotartsbusmesezíarsadotnemicserceBIAedM94,0moc

.oãçazitamilcaed

edotrexne-atropodsacatseorcimedsezíaredotnemirpmoceoremún,otnemaziarnE.4alebaT(9.Marieicam alimupsulaM otnemaziarneoasaditembuseBIAmocsadatart,) ortivxe otartsbusme,

.said03edodoírepmurop,)v/v(1:1atilucimreveadazinobraczorraedacsaced

)L/gm(BIA )%(otnemaziarnE sezíaredoremúN )mc(sezíarsadotnemirpmoC0 b46 b5,3 a5,3005 a28 a0,6 a1,40001 a48 a0,6 a5,40051 c03 a5,7 a7,4

.%5anacnuDedetsetolepetnemavitacifingismerefidoãnsanulocsansartelsamsemedsadiugessaidéM*.ovitacifingisoãn-sn


inibir o processo (Deklerk et al.,1995).A concentração de auxina a ser adici-onada ao meio de cultura para oestágio de indução, depende da con-centração endógena deste hormônioem cada genótipo utilizado (Blakesleyet al., 1991), sendo que altas concen-trações, por períodos de exposiçãoprolongados, podem determinar aformação de calos na base das micro-estacas. Para Pasqual & Ishida (1992),o melhor enraizamento in vitro foiobtido em meio MS, geleificado, con-tendo 1 mg/L de AIB.

As condições de temperatura, aluminosidade da câmara de cresci-mento e a disponibilidade de oxigê-nio junto à base das microestacas,além de fatores anatômicos inerentesao genótipo, podem inibir a evolu-ção do processo morfogenético in-duzido pelas auxinas. Apesar deHarbage & Stimart (1996), Deklerk etal. (1997) e outros autores utilizaremo processo de indução e crescimentodas raízes in vitro, McClelland et al.(1990) ressaltam que as raízes produ-zidas in vitro não são funcionais quan-do transferidas para a fase de aclima-tização. Para garantir a sobrevivêncianesse estágio, é necessário que aplanta produza novas raízes, o quedemanda um grande consumo dereservas que deveriam ser utilizadaspara o crescimento da parte aérea.Além disto, Debergh & Maene (1981)salientam a necessidade de desen-volver sistemas de indução que per-mitam a produção de raízes funcio-nais para o processo de aclimatiza-ção e para o aumento da qualidadedas plântulas.

5.1 - Enraizamento in vitro

Os resultados obtidos com aindução in vitro de raízes em porta-enxertos de macieira, mostraram di-ferenças em relação aos parâmetrosavaliados, em função do genótipo eda concentração e forma de aplica-ção da auxina (Martins & Pedrotti,2001). (Tabela 3). Resultados seme-lhantes foram obtidos com macieirapor Harbage et al. (1998), os quaisconcluíram que a capacidade de emitirraízes e de estabelecer um sistemaradicular, é uma condição intrínsecade cada genótipo

No caso do porta-enxerto M.7, oenraizamento realizado in vitro emágar apresentou resultados inferioresquanto ao número de raízes. Provavel-mente as concentrações de AIB utiliza-das não possibilitaram a indução domesmo número de raízes que foi ob-servado para o ‘Marubakaido’, já que asrespostas são dependentes do genótipo(Blakesley et al., 1991). É possível que,para este porta-enxerto, o pH do meiode cultura não tenha favorecido a ab-sorção de auxinas pelas células dabase da microestaca, tendo em vistaque a penetração de auxinas nas célu-las depende do equilíbrio entre ácidoslivres e formas aniônicas, que sãodependentes do pH (Harbage et al.,1998). O maior número de raízes obti-do para as microestacas do ‘M.9’ e do‘Marubakaido (Tabela 4), induzidas exvitro com o AIB dissolvido em água etransferidas diretamente para o subs-trato mineral para a aclimatização, re-força as conclusões emitidas por Rogers& Smith, (1992). Estes autores aumen-taram a eficiência no enraizamento deroseiras quando utilizaram substratosminerais para o crescimento das raízes,comparados com meios de culturageleificados. Estes resultados abremperspectivas concretas para o uso desubstratos porosos para o enraizamen-to in vitro, o que diminui os custos deprodução de plantas micropropaga-das. Com esta metodologia é possívelsubstituir os meios de cultura conten-do ágar por substratos minerais, o quediminui custos e produz raízes demelhor qualidade do que as produzi-das in vitro.

5.2 - Enraizamento ex vitro

Em função dos custos da fase deenraizamento e aclimatização dasplantas micropropagadas, uma sériede trabalhos foram conduzidos noLaboratório de Morfogênese e Bio-química Vegetal (Pedrotti & Voltolini,2001). Os principais objetivos foramde induzir o enraizamento ex vitroem substratos porosos que servemapenas de suporte para as plântulascomo acontece na estaquia tradicio-nalmente usada para a propagaçãode várias espéceis. Para isto, sãoutilizadas miniestacas do porta-en-xerto M.9, de 2 a 2,5 cm de compri-mento, com dois pares de folhas,preparadas a partir de brotações mi-cropropagadas. A indução ao enrai-zamento é efetuada submergindo10mm da base das miniestacas du-rante 10 segundos em diferentes con-centrações de ácido indolbutírico (0,500, 1000, ou 1500 mg/L ). Em segui-da, as miniestacas são transferidaspara bandejas alveoladas contendo osubstrato terra roxa e casca de arrozcarbonizada 1:1 (v/v.). As bandejassão então colocadas dentro de caixasplásticas com uma lâmina de água de5 mm para manter a umidade relativaelevada. As caixas são cobertas comuma lâmina de vidro, conforme me-todologia descrita por Pedrotti (1993).Durante 30 dias essas caixas sãomantidas em câmara de aclimatiza-ção com temperatura de 27±2 °C,fotoperíodo de 16 horas com intensi-dade luminosa de 30 µmol.m-2.s-1.Após esse período, as plantas sãoavaliadas quanto ao percentual deenraizamento, número e comprimen-to das raízes emitidas.

As maiores percentagens de en-raizamento com 82 e 84 % são obser-vadas nas miniestacas tratadas com500 e 1000 mg/L de AIB, respectiva-mente O menor percentual de enrai-zamento (29,6%) é obtido com 1500mg/L de AIB. As microestacas-con-trole produzem em média 3,4 raízes.

Estes valores são inferioresàqueles observados nos tratamentoscom AIB. Para os níveis de AIB de500, 1000 e 1500 mg/L, o resultado éa produção de 5,6 a 7,6 raízes respec-tivamente, não diferindo estatistica-mente entre si.

Figura 4 : Crescimento de raízes emporta-enxertos de macieira, após induçãoao enraizamento


Considerando que o porta-en-xerto M.9 é de difícil enraizamentoé possível sugerir que o mesmonecessite de níveis maiores deauxinas ou outros coofatores paraaumentar o enraizamento, já queJames & Thurnbon (1981) só obti-veram 45% de enraizamento comeste porta-enxerto quando adicio-naram fluoroglucinol no meio decultura. Possivelmente as condiçõesde indução in vitro, utilizadas porestes autores dificultaram a absor-ção da auxina, como constatadopor Harbage et al. (1998). Alémdisto, a intensidade luminosa dacâmara de crescimento pode tercontribuído para inativar parte daauxina aplicada. Khosh-khui & Sink(1982) obtiveram aumento no en-raizamento de roseira com osombreamento da base das estacas.Valores mais elevados no enraiza-mento de pereira (Wang, 1991) eem macieira (Fortes & Leite,1993)foram obtidos com a manutençãodas plantas no escuro. A maior po-rosidade e aeração dos substratosutilizados também podem favore-cer a indução e o crescimento deraízes, como foi observado por Jay-Allemand et al. (1992).

Os níveis de AIB superiores a500 mg/L não aumentam a percenta-gem de enraizamento do porta-en-xerto M.9. Estes resultados podemestar relacionados com os teoresendógenos de auxinas produzidaspor gemas e folhas jovens, comosugerem Hartmann et al. (1997), poismesmo sem aplicação de AIB, aspercentagens de enraizamento doporta-enxerto M.9 foram de 63,5 %.A exposição das miniestacas ao AIBpor 10 segundos é suficiente para aindução de primórdios radiculares eo desenvolvimento e crescimentoposteriores das raízes (Figura 4).Jarvis et al. (1983) observaram umaumento na síntese de RNA 20 horasapós a aplicação de auxina o quecorresponde às primeiras divisõescelulares.

6 - Aclimatização

Durante a fase de aclimatização,as plantas micropropagadas devemse adaptar a um ambiente completa-mente diferente das condições emque ela foi produzida in vitro. Duran-te este período a planta deve comporuma estrutura anatômica e fisiológi-ca capaz de suportar as condições de

alta demanda evaporativa da atmos-fera e de alta radiação luminosa.Quando transferidas para condiçõesex vitro, as mudas normalmente apre-sentam altas taxas de transpiração,em função da alta condutividade hi-dráulica de suas folhas e a funciona-lidade dos estômatos (Brainerd &Fuchigami, 1981; Schakel et al., 1990),o que, na maioria das situações, pro-voca elevado déficit hídrico, poden-do provocar a morte das mudas (Díaz-Pérez et al., 1995).

Apesar dos avanços nos protoco-los de multiplicação in vitro, poucostrabalhos foram realizados no sentidode elucidar problemas ligados à acli-matização das plantas (Avanzato &Cherubini, 1993). Para Ziv (1995), aaclimatização pode comprometer oprocesso de micropropagação por en-volver a neoformação de um sistemaradicular e a passagem para condi-ções de cultivo ex vitro.

Durante a fase de multiplicaçãodas brotações in vitro, os estômatosapresentam-se com formas e estru-turas anormais (Blanke & Belcher,1989) e a densidade pode ser dife-rente das folhas de plantas cultiva-das ex vitro (Cappelades et al., 1990;Sciutti & Morini, 1993). Para diver-

Figura 5.: Desenho esquemático da metodologia de aclimatização de plantas micropropagadas (Pedrotti, 1993).A e B: Indução ao enraizamento in vitro.C: Indução ao enraizamento ex vitro.D: Início do processo de aclimatização.E: Plantas sendo mantidas em sala com nebulização.F: Fotoperíodo sendo mantido em 16 horas de luz para evitar a entrada em dormência.G e H: Plantas transferidas à campo para completar o crescimento.


sos autores, (Pospisilova et al., 1997),os estômatos in vitro não são funci-onais, permanecem contentementeabertos ou fechados e são insensí-veis aos estímulos habituais de es-curo, alta concentração de CO

2, ABA

e potencial hídrico. Desta forma, agrande transpiração pode causar di-ficuldades durante o processo deaclimatização.

A metodologia recomendadapor Pedrotti (1993) (Figura 5) eutilizada no LMBV por Pedrotti &Voltolini (2001), possibilitou bonsresultados para vários genótipos demacieira. Neste processo, as plan-tas são induzidas ao enraizamentoex vitro e transferidas para bande-jas alveoladas.

As bandejas são colocadas emcaixas plásticas cobertas com umaplaca de vidro transparente. Estacondição, permite a manutenção daumidade relativa em 100%. Comesta metodologia, a sobrevivênciadas plantas situa-se entre 70 e 95%(Tabela 5). No que concerne à ma-téria seca produzida pelas raízes e

parte aérea das plantas, os maioresvalores são obtidos quando as plan-tas receberam 1000 mg/L de AIB nafase de indução ao enraizamento. Aaclimatização pode ser efetuada emcâmaras de nebulização que man-tém alta umidade relativa, o quediminuem as possibilidades de de-sidratação e morte das plantas. Nestesentido, Maciel et al. (2002)demostraram que é possível obteraltos índices de sobrevivência deplantas do porta-enxerto M.7. Nes-te processo, as bandejas são trans-feridas para diretamente para a câ-mara de nebulização. Aos 30 diasapós a transferência ex vitro, a per-centagem de enraizamento é maiornas mudas que foram aclimatizadasno substrato composto por casca dearroz carbonizada, já que esta au-menta o espaço poroso como foiobservado por Lê & Collet (1991) epor Avanzato & Cherubini (1993).

As altas percentagens de enrai-zamento coincidem com as de so-brevivência, pois todas as plantasque enraizaram sobreviveram, e co-

incidem com os de crescimento dasmudas (Figura 6). Maciel et al. (2002)sugerem que a umidade relativa noambiente utilizado garantiu as con-dições adequadas para a aclimatiza-ção das mudas. Esta hipótese é cor-roborada por Campostrini & Otoni(1996), pois plântulas produzidas invitro não estão adaptadas ao novoambiente, pois não possuem meca-nismos de proteção contra a desi-dratação, já que seus estômatos ge-ralmente se encontram abertos(Schackel et al., 1990). No entanto,segundo Pospíslová et al.(1997) eBolar et al. (1998), durante a aclima-tização as mudas ativam os mecanis-mos que permitem sua sobrevivên-cia após a transferência para a casade vegetação. Possivelmente as con-dições de aclimatização utilizadasneste trabalho possibilitaram a so-brevivência da planta até a entradaem funcionamento dos estômatos, oque permitiu um maior controle so-bre as perdas de água, o que está deacordo com Sutter (1988).

Considerações Finais

Os resultados obtidos nesse la-boratório corroboram com aquelesque foram publicados por váriosgrupos de pesquisa nacionais e es-trangeiros. As metodologias desen-volvidas permitem a produção co-mercial de mudas de porta-enxertose copa de macieira micropropagados.Em que pese as peculiaridades decada genótipo a grande maioria dosclones utilizados atualmente podemser produzidos seguindo protocolossemelhantes. A perspectiva do usoda indução ao enraizamento realiza-do simultaneamente à aclimatizaçãodas plantas ex vitro pode diminuir ematé 50% o custo de produção de uma

Figura 6: Crescimento e desenvolvimento de mudas de macieira após aclimatização.

odsacatseinimedsahlofedoremúnearutlasezíaredotnemirpmoceoremún,aicnêviverboS.5alebaT(9.Marieicamedotrexne-atrop alimupsulaM otnemaziarneoasaditembus,) ortivxe setnerefidme,

.larenimotartsbusarapmegaciperasópasaid54,BIAedseõçartnecnocBIA

)L/gm(sadaicnêviverboS

)%(satnalpedoremúN

sezíarsadotnemirpmoC

)mc(sezíarsadotnemirpmoC

)mc(seõçatorbedoremúN

sahlof0 58 b sn1,01 sn0,21 sn3,5 sn5,7

005 59 a 5,11 5,21 3,6 0,8

0001 07 c 0,61 6,11 9,6 5,7

0051 37 c 0,02 3,11 9,6 8,7.%5anacnuDedetsetolepetnemavitacifingismerefidoãnsanulocsansartelsamsemedsadiugessaidéM*

ovitacifingisoãn-sn


muda micropropagada, o que tornaviável o uso comercial da micropro-pagação.

A produção de mudas de altaqualidade genética e sanitária é umfator de extrema importância para agarantia da competitividade dapomicultura nacional. Neste sentido,a aplicação das técnicas aqui aborda-das abrem perspectivas para a insta-lação de laboratórios comerciais paraatender à demanda de mudas para arenovação de pomares pouco produ-tivos e a implantação de novos po-mares com alta densidade.


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Método Alternativo deTratamento de Esgotos

Adriano Luiz TonettiMestre em Saneamento e Ambiente - [email protected]

Bruno Coraucci Filho, DrProfessor Associado da Faculdade de EngenhariaCivil - UNICAMP

Alexandre Patto KanegaeMestre em Saneamento e Ambiente - UNICAMP

Ronaldo Stefanutti, DrDoutor pelo CENA-USP


Reator anaeróbio com recheio de bambu associado com filtros biológicos de areia

Pesquisa

Resumo

ste artigo apresenta os re-sultados encontrados parao estudo de um sistemaalternativo de tratamentode esgotos constituído porreator anaeróbio com re-

cheio de bambu associado a um filtrobiológico de areia. Tal combinaçaãopossui baixo custo e busca minimizaro sério problema de saneamento peloqual o Brasil passa.

O reator anaeróbio foi alimenta-do com uma vazão de 2 l/min e seuefluente era aplicado em cinco cargashidráulicas (20, 40, 60, 80 e 100 l/m2)sobre a superfície de quatro filtros deareia com diferentes profundidadesde leitos (25, 50, 75 e 100 cm).

Devido à ação dos microrganis-mos anaeróbios e aeróbios, que ade-rem à superfície do bambu e da areia,obteve-se uma excelente remoçãode matéria orgânica do esgoto que,caso fosse lançada em um corpo deágua antes do processo de tratamen-to, levaria ao consumo de oxigênio ea uma mortandade da fauna e floraaquáticas. Quanto ao nitrogênio, ocor-reu uma grande transformação dasua parte orgânica em nitrato, de-monstrando a grande adaptação dasbactérias responsáveis por esta rea-ção bioquímica ao meio formadopela areia. Os organismos patogêni-cos foram em grande medida removi-dos, adequando o efluente a algumaprática de reuso.

Palavras-chave: filtro de areia,pós-tratamento, efluente anaeróbio,baixo custo.

Introdução

O Brasil é um dos países quepossuem o maior fluxo interno deágua. Porém, há uma enormedisparidade na distribuição deste re-curso entre suas diferentes regiões.Enquanto que no norte existe umaabundância hídrica, no sul e sudeste,industrializados e populosos, ocorrea escassez causada pelo elevado con-sumo e grande poluição dos rios,resultante da precária situação dosaneamento básico.

Este quadro alarmante acarretasérios problemas à saúde pública eao meio ambiente levando a mortan-dade de um grande número de espé-cies. Portanto, um dos desafios atuaispara a melhoria desta situação é odesenvolvimento de sistemas de tra-tamento simples, eficientes e adaptá-veis às condições econômicas e es-truturais do nosso país.

O Tratamento Anaeróbio

O tratamento anaeróbio depen-de dos microrganismos que agem naausência de oxigênio, transforman-do os dejetos gerados pela açãohumana em produtos mais simplescomo metano, gás carbônico e água(METCALF e EDDY, 1991). Estescompostos mais simples podemretornar ao meio ambiente sem com-prometer o planeta e seu ecossiste-ma. Apesar da boa eficiência destesistema, entre 10 e 30% da matériaorgânica não é degradada, o queimpede que seu efluente atenda à


legislação brasileira quanto a esteparâmetro, havendo necessidade deum pós-tratamento.

O reator anaeróbio é caracteriza-do pela presença de um material derecheio estacionário e inerte no inte-rior de um tanque fechado. O esgotopenetra pela parte inferior e flui até asua saída na área superior. No decor-rer do escoamento, o esgoto entra emcontato com este material. Sobre asuperfície deste recheio ocorre a for-mação natural de um biofilme quedegrada o substrato contido no fluxode esgoto (Figura 1).

O material de recheio no qualos microrganismos aderem deveter as seguintes características: es-trutura resistente, ser biológica equimicamente inerte, leveza, po-rosidade elevada e preço reduzi-do. Tal sistema possui a vantagemde consumir pouca energia e pro-duzir uma quantidade mínima delodo, além de não depender dautilização de complexos equipa-mentos mecânicos.

Pesquisadores da UNICAMP di-agnosticaram que o uso de anéis debambu poderia satisfazer a tais pré-requisitos (CAMARGO, 2000). Estematerial apresenta a vantagem depossuir um baixo custo e ser facil-mente encontrado no Brasil. Destaforma, construíram e operaram qua-tro reatores que possuíam o bambucomo recheio e obtiveram uma re-moção média de matéria orgânica(DBO) superior a 75%. Quanto aonitrogênio orgânico, somente umaparcela de sua concentração foi trans-formada em amônia.

Pode-se concluir ao final deste

trabalho inicial que, apesar dos bonsresultados, havia a necessidade de serealizar um pós-tratamento doefluente anaeróbio gerado pelo rea-tor de bambu, pois ele não se ade-quava à legislação brasileira. Assim,buscando manter as característicasde um tratamento alternativo e bara-to decidiu-se aplicar o efluente gera-do sobre a superfície de filtros bioló-gicos de areia.

A associação do reator anaeró-bio com filtros biológicos de areiaseria uma alternativa que preserva-ria o baixo custo total. Outro itemimportante seria a possibilidade dedispor o efluente gerado diretamen-te sobre os cursos d’água, oureutilizá-lo na irrigação, ou no con-sumo não-humano, seguindo a ori-entação da Organização Mundial deSaúde (OMS, 1989).

No Brasil, esta combinação seriaaplicável nas pequenas cidades, embairros isolados e condomínios fe-chados das metrópoles, onde a insta-lação de uma rede coletora de esgo-tos apresentaria custo elevado.

Filtros Biológicos de Areia

O filtro biológico de areia é ummétodo de tratamento bastante anti-go, inicialmente adotado na remoçãode turbidez da água potável. A partirdo século XIX, na Europa e nosEstados Unidos, passou a ser apro-veitado na depuração de esgotos(MICHELS, 1996).

O funcionamento deste sistemabaseia-se na aplicação de afluenteintermitentemente sobre a superfíciede um leito de areia. Durante a infil-tração do líquido ocorre a purificaçãopor mecanismos físicos, químicos ebiológicos.

O tratamento físico é resultan-te do peneiramento e o químicoocorre pela adsorsão de determina-dos compostos. A purificação de-pende principalmente da oxidaçãobioquímica que ocorre no contatodo afluente com a cultura biológi-ca. Devido a esta característica,Jordão e Pessoa (1995) afirmamque este tipo de sistema é incorre-tamente chamado de filtro, pois seufuncionamento não possui comoexplicação primordial o peneira-mento ou a filtragem. Neste mesmosentido, KRISTIANSEN (1981) sus-tenta que o leito de areia, em con-junto com os microrganismos, for-ma um filtro vivo.

Material e Métodos

Este projeto de pesquisa estáinstalado em uma área experimentalsituada na Estação de Tratamento deEfluentes Graminha, na cidade deLimeira, Estado de São Paulo. O es-goto bruto é originário de um bairroresidencial denominado Graminha.Inicialmente esta água residuária pas-sa por um tratamento preliminar com-posto por grades de retenção e caixade areia e em seguida, uma pequena

Figura 1: Filtro anaeróbio de fluxo ascen-dente.

Figura 2: Vistas externa (esquerda) e interna (direita) dos reatores anaeróbios.


porção do seu fluxo é direcionada atéquatro reatores anaeróbios com re-cheio de bambu.

Cada reator possui volume de500 l e foi construído em aço inoxtendo formato cilíndrico e fundocônico, que funcionou como umcompartimento para a distribuiçãodo esgoto (Figura 2). O meio supor-te foi constituído de anéis de bam-bu da espécie Bambusa tuldoides.O caule do bambu foi cortado empedaços de aproximadamente 5 cm(CAMARGO, 2000).

Estes reatores anaeróbios foramoperados com fluxo ascendente, ten-do uma vazão de 2 l/min e tempo dedetenção hidráulica de 3 horas, con-trolados diariamente.

Filtros de Areia

Na construção do leito dos fil-tros foram empregadas três camadasposicionadas a partir da base. A pri-meira foi constituída por brita e pos-

suía 20 cm de profundidade. Logoacima estava a camada formada porpedregulho, com 10 cm de profundi-dade, que objetivava sustentar a areia,impedindo que suas partículas fos-sem arrastadas para fora da estruturado sistema. Quanto à camada deareia, buscando-se determinar qualera a espessura ideal para a realiza-ção do tratamento, empregou-se qua-tro filtros com diferentes profundida-des de leito, conforme apresentadona Tabela 1.

A areia empregada foi a popu-larmente denominada de grossa co-mercial, possuindo um diâmetro efe-tivo (D

10) de 0,093 mm. Salienta-se

que estes materiais foram os maiscomumente encontrados na regiãode desenvolvimento do projeto.

Na construção dos filtros, foiutilizada uma caixa cilíndrica comestrutura de fibra de vidro e diâmetrode 100 cm. Na Figura 3 há um esque-ma da disposição das diferentes ca-madas que compõem os filtros.

Para a distribuição uniformedo afluente sobre o leito dos filtros,empregou-se uma placa quadradade 20 cm de comprimento, feita demadeira e posicionada no centro dacamada superficial (Figura 4). Apóso lançamento do afluente pela tu-bulação de distribuição, existe ochoque do líquido com esta placa,distribuindo as gotículas sobre asuperfície.

Buscando-se determinar a ca-pacidade de tratamento dos filtrosbiológicos de areia, foram aplica-das as cargas hidráulicas de 20, 40,60, 80 e 100 l/m2 de efluente prove-niente dos reatores anaeróbios so-bre as superfícies. Cada carga hi-dráulica foi empregada pelo perío-do de um mês entre as segundas esextas-feiras.

Na Figura 5 está apresentado deforma esquemática o fluxograma defuncionamento deste sistema de tra-tamento em estudo.

As seguintes amostras foram ob-tidas semanalmente: esgoto bruto,efluente dos reatores anaeróbios comrecheio de bambu e efluentes dosfiltros de areia. Todas as análisesforam baseadas no Standard Methodsfor the Examination of Water andWastewater (AWWA/ANHA/WEF,1999).

Os parâmetros físicos, quími-cos e biológicos analisados foram osseguintes: pH, demanda bioquímicade oxigênio (DBO), série do nitro-gênio (nitrogênio orgânico eamoniacal, nitrito e nitrato) ecoliformes totais.

Resultados

pH

O estudo deste parâmetro é deextrema importância em um sistemabiológico. Isto porque os microrga-nismos responsáveis pelo tratamen-to dos esgotos necessitam de um pHque varie entre 4 e 8. Caso contrárioexiste o impedimento da formaçãodo biofilme responsável pela depu-ração do efluente.

De acordo com a Figura 6 pode-se fazer uma divisão dos valores de

Figura 3: Esquema dos filtros de areia.

odsedadidnuforpesocigóloibsortlifsodoãçanimoneD:1alebaT

.aieraedotiel

ortliFotieLodedadidnuforP

)sortemítnec(520F 52

050F 05

570F 57

001F 001


pH encontrados para os filtros bioló-gicos de areia em dois grupos bási-cos. O primeiro engloba os pHs en-contrados nas cargas hidráulicas de20, 40 e 60 l/m2 onde houve tendên-cia para valores superiores a 7. Nosegundo grupo, constituído pelascargas de 80 e 100 l/m2 nota-se valo-res inferiores ao pH neutro.

A característica encontrada parao primeiro grupo não se adequa aos

resultados esperados. De acordo coma análise dos compostos nitrogena-dos, esperava-se que a transforma-ção dos nitrogênios orgânico eamoniacal em nitrato causasse a re-dução do pH. Tal fato ocorreria devi-do à redução de alcalinidadeprovocada pelas bactérias aeróbiasno processo metabólico da degrada-ção da matéria orgânica. Uma possí-vel explicação para esta característi-

ca pode ser a formação de um siste-ma tampão químico pela areia. As-sim, apesar do consumo de compos-tos alcalinos, haveria o impedimentoda queda do pH do efluente dosfiltros de areia.

A formação do sistema tam-pão pelo leito de areia pode sercomprovada pelo fato do filtroF025, que possui o menor volumede areia, possuir tendência aosmenores pHs e também por tersido o primeiro a apresentar osvalores mais baixos. O filtro de 100cm manteve valores altos de pHate o final da aplicação da carga de100 l/m2.

Vê-se também que o sistema,mesmo sob condições temporáriasde aplicações de pHs bastante anor-mais, conforme encontrado na sex-ta semana, mostrou-se capaz deamortecê-los. Isso também podeser notado nas duas últimas sema-nas de aplicação da carga de 100 l/m2, quando houve a geração de umefluente ácido pelos reatores anae-róbios de bambu. Observa-se quenesta situação os efluentes dos qua-tro filtros não tiveram uma tendên-cia a acompanhá-lo nesta quedabrusca.

Quando se comparam os valo-res encontrados para o pH com aque-les exigidos pela legislação brasileira(CONAMA 20/86), que permite aemissão de um efluente cujo pHvarie entre 4 e 9, nota-se que osistema propiciou valores bastantesatisfatórios.

Demanda Bioquímica deOxigênio - DBO

Caso seja lançado em um cor-po de água uma grande quantidadede matéria orgânica, haverá o con-sumo parcial dela pelos microrga-nismos presentes no meio. Comoconseqüência desta degradação,esta colônia formada consome gran-de quantidade de oxigênio, levan-do à morte diversas espécies dafauna e da flora.

No que se refere a DBO, parâ-metro que determina a quantidadede matéria orgânica, os reatores

Figura 5: Fluxograma do sistema de tratamento em estudo.

Figura 6: Variação do pH durante as semanas de coleta.

Figura 4: Vista externa (esquerda) e superior(direita) de um filtro de areia, tendo ao centroa placa de distribuição de afluente.


anaeróbios propiciaram uma remo-ção média de aproximadamente48%. Este resultado está de acordocom as possibilidades dos micror-ganismos anaeróbios e com os da-dos encontrados para materiais derecheio normalmente empregadosem estações de tratamento de gran-de porte.

Quanto aos filtros de areia, vê-se pela Figura 7 a excelente remoçãode DBO. O maior valor encontradofoi de somente 29 mg/l, obtido noefluente do filtro com 25 cm deprofundidade, durante a aplicaçãoda maior carga hidráulica. Este resul-tado está muito abaixo do máximopermitido pela legislação brasileira,que é de 90 mg/l.

Outra característica observadaé que quanto mais profundo o leitode areia, melhores foram os resulta-dos. Isto pode ser explicado pelofato de que quanto maior a profun-didade, maior a quantidade de areiarevestida com biofilme. Assim exis-te uma ampla possibilidade de con-tato do material orgânico com osmicrorganismos.

Quando se observa a Tabela 2,que apresenta os percentuais deremoção da DBO em todo o siste-ma, observa-se o valor mínimo de91,3%. O filtro com 100 cm deprofundidade nunca removeu me-nos que 97,6%, independente dacarga de aplicação.

Nitrogênio

A remoção dos compostos nitro-genados presentes no esgoto é deextrema importância. Caso isto nãoocorra tem-se o lançamento de umefluente tóxico que pode levar àmorte de micro e macrorganismos.Tal fato ocorre devido ao nitrogênioamoniacal ou devido à eutrofização,que acaba por criar um meio propícioà floração de algas.

Pela Figura 8 percebe-se quetanto o esgoto bruto como oefluente dos reatores de bambueram constituídos de compostosnitrogenados pouco degradados(nitrogênio orgânico e amoniacal).Assim, desde a produção dos

Figura 7: DBO média para cada uma das cargas hidráulicas aplicadas.

Figura 8: Média para a concentração dos compostos nitrogenados no esgoto bru-to e efluente dos reatores de bambu em cada carga hidráulica.

sanotnematartedametsisonOBDedaidémoãçomeR:2alebaT.sadacilpasaciluárdihsagrac

edotnoPateloC

)%(OBDedaidémoãçomeR2m/l02 2m/l04 2m/l06 2m/l08 2m/l001

520F 3,59 3,79 7,39 8,59 3,19050F 0,89 9,89 7,89 5,69 9,49570F 5,79 9,89 8,89 3,89 0,79001F 6,79 8,89 4,99 3,99 7,89


dejetos pelo ser humano até a che-gada à estação de tratamento ocor-reram poucas transformações emsua composição. Isto ocorre prin-cipalmente devido ao fato de osorganismos responsáveis pela de-composição dos compostos nitro-genados agirem somente em pre-sença de oxigênio.

Ao comparar-se o esgoto brutocom o efluente dos reatores de bam-bu, nota-se que apesar da sua carac-terística anaeróbia, a amônia na mai-oria das situações superava o valorde nitrogênio orgânico. Quanto àsconcentrações de nitrato e nitrito,observa-se que foram muito peque-nas para estes dois pontos de coleta.

Pelas Figuras 9 e 10, nota-seque o efluente dos reatores anaeró-bios de recheio de bambu aoinfiltrar-se através do leito de areiados filtros biológicos sofreu gran-des alterações no que se refere aoscompostos nitrogenados. Ou seja,

Figura 9: Média para a concentração dos compostos nitrogenados no filtro F025 eF050 em cada carga hidráulica.

existiu uma grande transformaçãodo nitrogênio orgânico e doamoniacal para nitrato, indepen-dente da carga que era empregada.Tal modificação é resultante dasnitrobactérias, que em ambientesaerados levam tais compostos à suaforma mais oxidada.

Para os filtros F025 e F050, apartir da carga de 60 l/m2 passa ahaver um aumento da concentraçãode nitrogênio amoniacal, que foiampliada na de 80 l/m2. Este au-mento pode ser explicado peloacréscimo de carga, que acarretouna diminuição do tempo de contatoentre o líquido que se infiltrava e acultura biológica aderida à areia.

Quanto maior era a profundida-de do leito, maior era o processo denitrificação, ou seja, de transforma-ção do nitrogênio orgânico em nitra-to. Assim, de acordo com a Figura 10,nota-se que o filtro com 100 cm deprofundidade de leito propiciava uma

completa nitrificação. Assim, asomatória das concentrações de to-dos os compostos nitrogenados eramuito semelhante à de nitrato.

Coliformes Totais

Os coliformes totais são umaclasse de organismos adotada pelaengenharia sanitária como um indi-cador da presença de organismospatogênicos. Assim, caso esteja empequenas quantidades, pode-se su-por que a água também não conteráseres vivos que possam causar algumdano a saúde.

Ao analisar-se as concentraçõesde coliformes totais pela Figuras 11,vê-se que o afluente sempre possuíavalores superiores a 106 NMP/100 ml,chegando em alguns casos a superar109 NMP/100 ml. Desta forma, pode-se constatar que os reatores anaeró-bios com recheio de bambu realmen-te não removem estes organismos,conforme afirma a literatura.

Quanto aos filtros de areia, nasbaixas cargas o F025 já apresentavavalores mais altos que os outros três,e no decorrer do desenvolvimento doprojeto, sempre possuía as maioresconcentrações. Por outro lado, o filtrocom 100 cm de profundidade chegavaa gerar um efluente capaz de atenderà legislação brasileira para a águapotável quanto a coliformes totais.

Ao observar-se a comparaçãoentre o afluente e o efluente do filtrode areia apresentada na Tabela 3,percebe-se a grande remoção decoliformes totais que este sistemapropiciou. O filtro com menor pro-fundidade de leito, o F025, apresen-tou altos percentuais, sendo no míni-mo igual a 84%. Os dois filtros maisprofundos tiveram valores superio-res a 99% em praticamente todas assituações em estudo.

Conclusões

A análise destes resultados de-monstra a grande viabilidade destesistema biológico para o tratamentode efluente de pequenas comunida-des, utilizando materiais presentesnas próprias comunidades.


Figura 10: Concentração dos compostos nitrogenados nos filtros F075 e F100.

O efluente gerado estava em con-formidade com o exigido pela legisla-ção brasileira para a emissão em umcorpo receptor, sendo compatível comaqueles produzidos nas grandes esta-ções de tratamento existentes nas gran-des cidades brasileiras. Outro ponto éa possibilidade do reuso deste líquidoem alguma atividade humana, resguar-dando os mananciais naturais parausos mais nobres.

Agradecimentos

A FAPESP, CNPq, FINEP, CaixaEconômica Federal e PROSAB peloapoio e financiamento na construçãodo projeto e em sua manutenção.


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)%(siatoTsemrofiloCsodoãçomeR2m/l02 2m/l04 2m/l06 2m/l08 2m/l001

520F 5,79 8,98 8,48 9,48 0,78050F 9,99 2,99 0,89 4,78 3,69570F 0,001 9,99 4,99 5,99 0,79001F 0,001 0,001 9,99 9,99 9,99

Figura 11: Concentração de coliformes totais.


Amendoim Selvagem

Soraya Cristina Leal-Bertioli - PhDPesquisadora EMBRAPA RecursosGenéticos e Biotecnologia,[email protected]

Patrícia Messenberg Guimarães - PhDPesquisadora EMBRAPA RecursosGenéticos e Biotecnologia,[email protected]

Alessandra Pereira Fávero - MsCPesquisadora EMBRAPA RecursosGenéticos e Biotecnologia,[email protected]

Márcio de Carvalho Moretzsohn - MsCPesquisador EMBRAPA RecursosGenéticos e Biotecnologia,[email protected]

Karina Proite - MsCEstudante de doutorado da UnB,[email protected]

David John Bertioli - PhDPesquisador Universidade Católica de Brasí[email protected]


Uma fonte de resistência a pragas

Pesquisa

amendoim cultivado,Arachis hypogaea, éuma das leguminosasprodutoras de grãosmais plantada em todo

o mundo, devido ao seu alto conteú-do de proteína e óleos insaturados. Écultivado extensivamente na China,Índia e Estados Unidos, além de di-versos países da América Latina eÁfrica (Conab, 2002). Os principaisproblemas da cultura estão relacio-nados ao ataque de fungos da parteaérea e nematóides, necessitando pe-riodicamente da utilização de defen-sivos agrícolas (Hagan, 1998 ;Subrahmanyam et al., 1983; Bailey,2002). Espécies silvestres de Arachistêm-se mostrado altamente promis-soras como fonte de resistência adiversas pragas que atingem o amen-doim e outras culturas, sendo que jáforam identificadas algumas espéci-es com resistência a três fungosfoliares (Cercospora arachidicola,Cercosporidium personatum ePuccinia arachidis) e ao nematóidedas galhas (Meloidogyne spp.). Bus-ca-se, agora, desenvolver ferramen-tas para a utilização destas espéciessilvestres em programas de melhora-mento genético, visando à obtençãode cultivares de amendoim com re-sistência mais duradoura (Fig.1).

O projeto “Identificação de resis-tências a stress biótico em Arachis sel-vagem e desenvolvimento de ferra-mentas para o melhoramento genéticoatravés de mapeamento e genômicacomparativa” combina esforços e habi-lidades de pesquisadores da EmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia,Universidade Católica de Brasília, IBONE(Instituto Botanico del Nordeste, Ar-gentina), Universidade de Aarhus (Di-

namarca) e Sainsbury’s Laboratories (In-glaterra) na busca de genes de resistên-cia a fungos e nematóides patogênicosao amendoim, e no desenvolvimentode um mapa genético para Arachis quepossibilite a utilização destes genes.

Produção de um mapagenético para facilitar a

seleção assistida

Espécies silvestres de Arachis pos-suem alta diversidade genética e cons-tituem uma rica fonte de genes deresistência. Diversos trabalhos têm mos-trado que as espécies silvestres sãomuito mais resistentes a doenças doque a espécie cultivada (Arachishypogaea) (Holbrook et al., 2000). Oamendoim cultivado é tetraplóide (temquatro conjuntos de cromossomos, doisconjuntos do chamado genoma A edois conjuntos do genoma B), enquan-

foto ilustrativa


to que a maioria das espécies silvestresé diplóide (apenas dois conjuntos decromossomos). Esta diferença deploidia dificulta a introgressão de genesdos parentes silvestres, uma vez que oshíbridos obtidos de maneira tradicio-nal são triplóides estéreis. Por isso,para obter híbridos férteis, necessita-sefazer cruzamentos entre espécies sil-vestres com genomas AA e BB. Oshíbridos obtidos (AB) são então sub-metidos a tratamento com colchicinapara duplicar o número de cromosso-mos, obtendo-se, assim, anfidiplóidessintéticos (AABB), que, em princípio,são compatíveis com o amendoim cul-tivado. Estes híbridos são então cruza-dos com A. hypogaea dando continui-dade ao programa de pré-melhora-mento de Arachis.

Tradicionalmente, nos programasde melhoramento de plantas que en-volvem hibridações seguidas de retro-cruzamentos, grande parte do genomada parental doadora é incorporada aogenoma da planta receptora e, porisso, são necessárias várias geraçõespara a eliminação gradual dos genesindesejáveis, enquanto o genótipo do

parental recorrente é mantido para osdemais locos. Em cada geração sãoselecionadas as plantas que apresen-tam a característica de interesse a serintrogredida, e as demais característi-cas do parental recorrente. Este pro-cesso de seleção, após a introgressão,pode ser otimizado através da cons-trução de mapas genéticos e da iden-tificação de marcadores molecularesfortemente associados aos genes deinteresse. Desta forma, é possível, emcada fase de seleção, a escolha dosindivíduos que contenham o máximode características do parental recor-rente, diminuindo assim o tempo doprocesso de melhoramento. Isso éparticularmente importante em pro-gramas que visam à introgressão degenes de resistência a pragas. Nestecaso, a seleção indireta através demarcadores moleculares possibilita,além da redução de tempo, a identifi-cação e seleção de genótipos resisten-tes na ausência do patógeno e atransferência e manutenção de maisde um gene de resistência principaldurante a seleção (piramidização degenes de resistência).

Para a implementação de umesquema efetivo de seleção assistidapor marcadores em programas demelhoramento genético, três reque-rimentos são essenciais: (1) algunsmarcadores devem estar fortementeligados aos genes que controlam ascaracterísticas de interesse; (2) osmarcadores devem estar facilmentedisponíveis para a análise de grandespopulações e (3) as técnicas utiliza-das devem ser reproduzíveis entrelaboratórios e com baixo custo.

Mapeamento comparativo:Um atalho para um mapa

genético

Espécies de Arachis têm geno-mas muito grandes. O genomahaplóide de Arachis hypogaea temaproximadamente 1,74 x 109 pares debases. Isto dificulta a identificação e omapeamento direto de genes de inte-resse. Uma outra espécie da famíliadas leguminosas, Lotus japonicus, temum genoma bem menor, tem ummapa genético de alta resolução jádisponível e os projetos de seqüenci-

Fig.1 - Sementes de diferentes espécies de Arachis


amento de ESTs (expressed sequencedtags) e do genoma estrutural estãoquase completos (Asamizu et al., 2000;Sato et al., 2001). Por isso, L. japonicustem sido considerada uma planta-modelo para todas as leguminosas,auxiliando no entendimento de ou-tras espécies de genomas mais com-plexos. A comparação entre estes doisgêneros e a análise da ordem dosgenes nos cromossomos possibilita aidentificação de regiões correlatasentre os dois genomas (chamadasintenia), ou seja, o mapeamento com-parativo. Neste processo, são identifi-cados marcadores moleculares comunsaos diversos genomas, chamados mar-cadores-âncoras. Como exemplo detransferência de informação da plantamodelo para leguminosas cultivadaspode-se citar o caso dos fenótiposmutantes: uma vez que o gene res-ponsável por um fenótipo mutanteseja clonado em Lotus, a análisefenotípica comparativa e a informa-ção do mapa podem ser utilizadascomo base para identificar genes can-didatos para o gene correspondenteem outras leguminosas.

No caso específico de Arachis, aanálise genômica comparativa pode-rá auxiliar no desenvolvimento demarcadores para o melhoramento ge-nético da cultura, o que certamentefacilitará a clonagem de genes deinteresse. A exploração da colineari-dade entre genes de Arachis e Lotusbuscando a identificação entre as duasespécies e a identificação de regiões

cromossômicas ortólogas (genes ho-mólogos localizados em genomas dediferentes organismos) tem sido reali-zada através do desenvolvimento deum banco de ESTs de Arachis (Gui-marães et al., 2003 ). Este banco dedados deverá acelerar o mapeamentodo genoma de Arachis, a identificaçãode resistências e o desenvolvimentode marcadores a serem utilizados nosprogramas de melhoramento. Um be-nefício adicional do projeto é o desen-volvimento de um sistema genéticounificado para a família das legumino-sas, pois trabalhando com Lotus que éconsiderado um dos gêneros maisadaptados desta família e Arachis queé considerado um dos mais primiti-vos, qualquer região de similaridadeencontrada provavelmente existirá emtodas as leguminosas. Até o momen-to, já foram encontradas homologiasentre Lotus e Arachis em vários genesque codificam para enzimas envolvi-das em importantes cadeias metabóli-cas, além da homologia entre genesenvolvidos na simbiose destas plantascom bactérias fixadoras de nitrogênioestarem sendo estudadas (Sandal, etal., 2003) (Fig. 2). A identificação detais regiões pode facilitar o isolamen-to de genes envolvidos neste proces-so, possibilitando o desenvolvimentode variedades de Arachis com maiorcapacidade de fixação de nitrogênio,o que resultaria na redução da utiliza-ção de fertilizantes nitrogenados, con-tribuindo para uma produção de ali-mentos mais sustentável.

Estudos de expressão gênica

O estudo da expressão gênica temdemonstrado ser uma importante ferra-menta no entendimento dos processosbiológicos em nível molecular. Por exem-plo, estes estudos podem ser utilizadosna identificação de uma rede de genesexpressos de fundamental importânciano desenvolvimento de uma determina-da estrutura, ou na resposta de umorganismo a um estímulo externo. Oestudo da expressão gênica diferencialpode contribuir para a caracterização deresistências, pois possibilita a identifica-ção de genes–chave desta rede atravésda comparação da expressão gênicadurante o desenvolvimento de uma es-trutura sob condições normais e emorganismos carregando uma mutaçãoou submetidos a algum tipo de stress.Através do acúmulo de dados da expres-são diferencial de vários genes sob dife-rentes condições, pode-se reconstruir asvias reguladas por estes genes, predizeronde eles atuam e identificar novosgenes associados ao processo.

Para o entendimento da função deum gene, é fundamental o estudo deonde e quando ele é expresso. Recente-mente, várias estratégias foram desen-volvidas para permitir o estudo da fun-ção de vários genes simultaneamente,entre elas: a genética reversa (geração demutações específicas em genes de inte-resse), screens mutagênicos (geração demutações randômicas e screening de umpool de mutantes para se identificarfenótipos de interesse) e bioinformática(a análise dos dados gerados por todas asestratégias acima). As estratégias acima,associadas aos projetos genoma, quetêm como objetivo o sequenciamento dogenoma inteiro de vários organismos,têm possibilitado o estudo sistemático daexpressão diferencial de genes em nívelde genoma como um todo. A análise daexpressão diferencial de genes em res-posta ao ataque de um patógeno consti-tui, portanto, uma ferramenta importan-te no isolamento de genes de resistênciaou de fatores envolvidos com a interaçãopatógeno-hospedeiro.

Neste projeto, a identificação degenes expressos diferencialmente emgermoplasma resistente de Arachis estásendo realizada através da análise de ESTse de microarranjos. Para tal, várias biblio-tecas de cDNA foram construídas a partirde Arachis stenosperma submetido adiferentes situações de stress (inoculadocom nematóides e fungos) as quais estão

Fig.2 - Exemplo de estudo de sintenia: Marcadores moleculares (M1 a M4) em posiçõescolineares nos genomas de Lotus e Arachis.


sendo seqüenciadas de forma massalvisando à construção de um banco dedados de ESTs e dos chips de DNA.

Uma vez isolados e confirmadasua função, estes genes podem serintrogredidos para o amendoim cultiva-do ou transferidos a outras plantas deinteresse econômico, que sejam atingi-das pelas mesmas pragas, como a sojae feijão, para as quais já existem dispo-níveis métodos de transformação.

O impacto da utilizaçãodestas novas técnicas no

cultivo do amendoim

O Brasil produz atualmente apro-ximadamente 170 mil toneladas deamendoim, sendo o maior produtor oestado de São Paulo, com aproximada-mente 60 mil ha plantados e 80-90% daprodução do país (Conab, 2002). Umdos principais problemas dos produto-res de amendoim deste estado é oataque de doenças fúngicas de parteaérea, como a mancha barrenta(Didymella arachidicola), mancha cas-tanha (Cercospora arachidicola), man-cha preta (Cercosporidium personatum),ferrugem (Puccinia arachidis) everrugose (Sphaceloma arachidis). Aprincipal cultivar plantada no país é acv. Tatu, com aproximadamente 80%da área plantada e é altamente suscep-tível às doenças acima citadas. A últimacultivar de A. hypogaea lançada peloInstituto Agronômico de Campinas(IAC), a IAC-Caiapó, é de ciclo longo(com 130 dias) e possui resistênciamoderada às cercosporioses, à manchabarrenta e a ferrugem (Conab, 2002).

As espécies silvestres da secçãoArachis têm sido utilizadas no melhora-mento do amendoim na Índia, Argentina,Estados Unidos e Brasil. Várias das espé-cies, que, na maioria, são brasileiras,possuem níveis de resistência a pragas edoenças superiores aos encontrados emacessos de A. hypogaea (Stalker & Moss,1987; Fávero et al., 2000 e 2001). A falta deinformações sobre o potencial destasespécies para o melhoramento de cultiva-res é a principal barreira para seu uso. As69 espécies silvestres de Arachis descritase existentes são restritas ao Brasil, Bolívia,Paraguai, Argentina e Uruguai, sendo 57endêmicas ao Brasil. As expedições decoleta realizadas desde 1959 têm permiti-do a preservação de mais de 1600 acessosno banco de germoplasma, localizado naEmbrapa Recursos Genéticos e Biotecno-logia, através de seu curador e principal

coletor, Dr. José Francisco M. Valls. Nestebanco de germoplasma, há acessos querepresentam todas as espécies de Arachis,exceto uma, Arachis martii, consideradaextinta.

A identificação de espécies resis-tentes a doenças e pragas e a localizaçãode marcadores associados aos genes deinteresse auxiliarão sobremaneira a sele-ção de plantas com resistência, desde asprimeiras fases do programa de melho-ramento, até a obtenção de novas culti-vares. Acredita-se que a possibilidade dapiramidização de genes tornará as novascultivares com resistências mais dura-douras do que se fosse utilizada apenasa seleção baseada em avaliação agronô-mica e fitopatológica das plantas, poisserá possível a identificação de marcado-res moleculares ligados a genes de resis-tência localizados nos genomas A e Boriundos de espécies silvestres e incor-porados ao amendoim cultivado.

O projeto irá propiciar o diálogomais intenso entre os parceiros na coope-ração científica e tecnológica entre aUnião Européia e América Latina. Istotambém beneficiará o treinamento dejovens pesquisadores em tecnologias deponta em genômica e citogenética. Osmapas genéticos gerados e o mapeamen-to comparativo entre os genomas deArachis e Lotus poderão facilitar o melho-ramento de amendoim e, possivelmente,os programas de melhoramento de outrasleguminosas. O desenvolvimento de va-riedades melhoradas de amendoim adap-tadas à América Latina auxiliará na redu-ção do uso de defensivos agrícolas epoluição associada, sem perdas na produ-tividade, contribuindo para o desenvolvi-mento sustentável da agricultura.

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Pesquisa

Bioética

Ana Paula Pacheco ClementeBióloga, Especialista em Bioética, Direito eaplicações, coordenadora e professora dos cursos depós-graduação lato sensu e extensão em Bioética daPUCMinas e UFLA, e do curso de extensão emTanatologia e Bioética do IEC-PUC Minas, membroda diretoria do Capítulo de Bioética da SBCM,consultora da Comissão de Bioética e Biodireito daOAB-MG, membro fundador e da DiretoriaExecutiva da Sociedade Brasileira de BioéticaRegional Minas [email protected];[email protected]

Pluralidade e transdisciplinaridade

A área das ciências biológicas éa que mais privilegia o conceito deBioética da forma como foi concebi-do inicialmente. Ela possui um cam-po muito vasto de atuação para oprofissional que transita entre a áreada saúde e a do meio ambiente.Segundo Potter, criador do termo,que era biólogo e oncologista, a atu-ação da Bioética seria buscar a boaqualidade de vida, pela interação doser humano com o meio ambiente.Esse conceito foi adaptado pelo Ins-tituto Rose e Kennedy de Reprodu-ção Humana e Bioética, que tornouassim a Bioética voltada para abiomedicina e a biotecnologia. ABioética tradicional, dos EUA, é ba-seada em quatro princípios funda-mentais, que são:

Autonomia: direito do pacientede participar ativamente de seu trata-mento, refutando, concordando, dis-cutindo e decidindo junto com omédico a melhor conduta a ser toma-da. Esse conceito vem da filosofia,uma vez que o termo supramencio-nado significa autogoverno. Entre-tanto, para que tal aconteça, o sujeito(paciente) deve receber informaçõesclaras e precisas sobre seu quadroclínico, diagnóstico, tratamento eprognóstico.

Beneficência e não-maleficência,as quais possuem origem hipocrática.A primeira pugna por sempre buscaro bem do paciente; já a segundadetermina que, existindo dúvidaquanto ao bem a ser ofertado aopaciente e sobre os seus efeitos

colaterais, ou seja, se estes foremmaiores que aqueles, o médico nãodeve atuar, uma vez que a atuaçãomédica deve sempre buscar o bemdo paciente.

O princípio da justiça prega olivre acesso de todos a um tratamen-to médico de qualidade, e a livredistribuição dos progressos da medi-cina para todos os seres humanos.

Deve-se ressaltar a existência,antes de Potter, dos movimentospré-bioéticos, tais como o Códigode Nuremberg, o qual estabeleceuregras mínimas para pesquisas clíni-cas em seres humanos, e a Declara-ção Universal dos Direitos Huma-nos, que estipula direitos e garantiasmínimos de respeito à vida humana.Ambos buscaram impedir reincidên-cias das atrocidades cometidas pelahumanidade nas duas grandes guer-ras mundiais.

Hodiernamente, bioética é aparte da ética que cuida das questõesreferentes à vida humana, à saúde,aos avanços da biotecnologia e aosefeitos destes sobre o homem. Buscasempre o bom e o melhor para o serhumano, possuindo, desta forma, umcaráter antropocentrista bastanteacentuado, que busca privilegiar ainteração homem/meio ambiente.

A atuação do biólogo no meioambiente busca a proteção da biodi-versidade, a manutenção de espéciesem vias de extinção, a preservaçãodo meio ambiente e da qualidade devida. O licenciamento ambiental e orelatório de impacto ambiental de


responsabilidade técnica do biólogoé de extrema importância para evitaracidentes ecológicos. O Brasil possuiuma legislação ambiental que regu-lamenta as atividades dos profissio-nais que atuam na área. A Bioéticainfluencia nas decisões à medidaque analisa a interação do ser huma-no com o ambiente e os reflexoscausados pelas ações propostas pelohomem.

Mais recentemente temos tidodiscussões sobre transgênicos eOGMs, não só na área de meioambiente, mas também na área mé-dica, com a produção de animaistransgênicos para transplante deórgãos, vacinas e medicamentosmanipulados geneticamente. Temostambém biotecnologia na formaçãode biomateriais, reprodução huma-na assistida, que gera grandes polê-micas por causa da doação de sê-men, óvulo, útero de substituição,que muda os pilares de filiação,trazendo gêmeos em idades diferen-tes, crianças com até cinco pais,crianças com material genético detrês pais em resultado de exame deDNA com técnica de rejuvenesci-mento de óvulo; gestação após amorte dos pais biológicos, mudançade paradigma quanto à filiação, pri-vilegiando a paternidade e materni-dade sócio-afetivas.

O Projeto Genoma Humana coma descoberta de todos os genes hu-manos , trará benefícios e proporcio-nará, daqui a alguns anos, a cura paravárias doenças. Nesse âmbito haveráum avanço na medicina preditivaque, através da avaliação genética,pode fazer o diagnóstico de váriasdoenças que poderiam se manifestarou não no futuro. Hoje já é possívelfazer o diagnóstico de algumas doen-ças, porém não é possível curá-las, osbenefícios são apresentados namelhoria da qualidade de vida e daadaptação do paciente.

Já há algumas décadas, a medi-cina fetal proporciona, através dodiagnóstico pré-natal, a possibilida-de de diagnóstico de doenças cro-mossômicas, como a síndrome deDown. Hoje, contamos com a biotec-nologia por meio do diagnóstico ge-

nético pré-implantação; podemosfazer a análise genética retirando umblastômero do embrião, ou seja, umacélula totipotente, que poderá viraroutro ser humano idêntico ao dacélula de onde foi retirado. Dessaforma, o diagnóstico é realizado noembrião, não havendo necessidadede retirar nenhum material biológicoapós a implantação, para não correro risco de um aborto.

Com a descoberta de doençasgenéticas pela micromanipulação deembriões, é possível descartar essesembriões “anormais” pondo em prá-tica a chamada Eugenia doce, queseria o descarte de embriões e fetoscom defeitos congênitos. Aí surge adiscussão sobre o que é normal e oque é anormal. Caso do casal surdo-mudo que recorreu ao banco de sê-men para buscar um doador de sê-men surdo para ter seu bebê.

A terapia gênica vai proporcio-nar através da utilização de vetores,como vírus e bactérias, a cura dasdoenças das quais forem localizadosos genes que as causam, removendoou acrescentando o gene saudável àpessoa.

Outra questão discutida pelaBioética é o direito à identidade ge-nética nos casos em que a criança foiadotada ou tenha nascido por inter-médio de material genético doado, oque não desfaz o vínculo de paterni-dade; direito não para fins de heran-ça nem tampouco para negatória depaternidade, mas, simplesmente, pelodireito de conhecer suas origens. Oadvento do exame de DNA trouxe acerteza biológica, mas muitos têmutilizado tal exame de forma errônea.Deve-se ter sempre o exame de DNAcomo mais uma prova judicial a serjuntada aos autos do processo, a fimde preservar a dignidade e a privaci-dade humanas. Ninguém é obrigadoa fornecer prova contra si mesmo.

A banalização do exame de DNAtem trazido conseqüências indesejá-veis não só para o Direito de Famíliae de Sucessões, mas também para aCriminalística, porque ainda existemperitos despreparados para coletar omaterial biológico na cena do crime.É preciso seriedade e responsabilida-

de para utilizar tal prova; deve-seevitar contaminação do material,armazená-lo de forma adequada, teruma cadeia de custódia, solicitar au-torização por escrito nos casos deinvestigação de paternidade ou dematernidade.

Assim, as questões da bioéticapodem ser classificadas como emer-gentes, aquelas advindas do avançoda biotecnologia e da biociência, epersistentes as que possuem suasorigens na má distribuição de recur-sos e em um sistema econômicoexcludente. Por esse motivo, abioética deve recortar seu sujeito detrabalho por etnia, raça, sexo e con-dição econômica, uma vez que abusca do que é bom e melhor variade acordo com essas características.

Devido à complexidade dos va-lores envolvidos em sua atuação,esse campo de discussão revela-secomo a ciência da composição, ouseja, todos os assuntos dentro doâmbito de atuação da bioética atin-gem toda a sociedade, logo, as deci-sões sobre eles devem ser tomadascom a participação de todas as par-tes envolvidas.

A Bioética busca uma reflexãoda biotecnologia apresentada pelasciências biomédicas para que elaspossam ser utilizadas em benefícioda sociedade. Busca o melhor para acoletividade, fazendo interagir o ho-mem com o meio ambiente, comvistas a propiciar a ele uma melhorqualidade de vida. O trabalhotransdisciplinar faz-se necessário afim de proporcionar um atendimen-to mais humanizado e justo na áreadas ciências da vida. Dessa forma,buscam-se soluções novas para con-flitos novos.

Destarte, a bioética representa aciência do diálogo transdisciplinar, oumelhor, propõe a composição possí-vel com os vários estranhos morais,pois um médico para atuar bioetica-mente deve respeitar a individualida-de de seu paciente e o advogado queabraçar causa tão apaixonante deveconhecer biomedicina e os avançosbiotecnológicos. Assim como cadaprofissional, na sua área de atuação,deve buscar essa composição.

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