REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA, VOLUMEN 40, nro. 2 DE … · SDS-PAGE), análise de imagens e técni-cas de bioinformática. ... La concentración de proteínas totales en el plasma

REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA, VOLUMEN 40, nro. 2 DE 2011

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Rev. Colomb. Quím., 2011, 40(2): 131-148

1 EscueladeQuímica,FacultaddeCiencias,UniversidadIndustrialdeSantander,calle9carrera27,CiudadUniversitaria,Bucaramanga,Colombia.

2 DepartamentodeCienciasBásicas,EscueladeMedicina,FacultaddeSalud,UniversidadIndustrialdeSantander,calle9carrera27,CiudadUniversitaria,Bucaramanga,Colombia.

3 GrupodeInvestigaciónenBioquímicayMicrobiología,UniversidadIndustrialdeSantander,calle9carrera27,CiudadUniversitaria,Bucaramanga,Colombia.

4 [email protected]

IMPLEMENTACIÓN DE TÉCNICAS SENCILLAS DE REMOCIÓN DE PROTEÍNAS MAYORITARIAS DE PLASMA SANGUÍNEO PARA ANÁLISIS

POR ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL (2D)

IMPLEMENTATION OF SIMPLE TECHNIQUES FOR REMOVAL MAJORITY PROTEINS FROM BLOOD PLASMA AND ITS POSTERIOR ANALYSIS BY

BI-DIMENSIONAL (2D) ELECTROPHORESIS

APLICAÇÃO DE TÉCNICAS SIMPLES DE REMOÇÃO DE PROTEÍNAS MAJORITÁRIAS DO PLASMA SANGUÍNEO PARA SUA POSTERIOR

ANÁLISE POR ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (2D)

Yenny Bueno2,3, Gerardo Muñoz2,3, Rodrigo Torres Sáez1,3,4

Recibido:27/05/11–Aceptado:22/08/11

orgánicosadiferentesconcentraciones.Laremocióndeproteínasdelplasma tratadomediante estas metodologías se verificó poranálisisproteómicosusandoelectrofo-resisdeproteínas(1D-y2D-SDS-PAGE),análisis de imágenesy técnicasdebioin-formática.Elanálisismostróquemetodo-logías sencillas como el tratamiento conacetona75%(v/v)disminuyólaconcentra-cióndealbúmina,retiró las interferenciasque dificultan la detección de proteínas minoritarias,aumentandolaintensidaddelasmanchasproteicasseparadasmedianteelectroforesis2D,yporconsiguiente,me-jorandolaresoluciónyladeteccióndelasproteínasseparadasdelplasmasanguíneo.

Resumen

Elplasmasanguíneorepresentaunadelasmuestrasdemayor interéseneldiagnós-tico-pronósticodediversasenfermedades.Sinembargo,constituyelamuestradema-yor dificultad para establecer su proteoma, debido a la presencia de interferencias yproteínas abundantes que dificultan la de-tección de proteínas minoritarias. Con elobjetivo de mejorar la resolución de lasproteínasseparadasportécnicaselectrofo-réticas,serealizóunacomparacióndedi-ferentesmétodosderemocióndeproteínasmayoritariasdel plasmadepacientes consíndrome coronario agudo, usando técni-casdeprecipitaciónconsalesysolventes


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Palabras clave: plasma sanguíneo,proteómica, síndrome coronario agudo,electroforesis.

AbstRAct

Thebloodplasmasamplesareoneofthemost interesting in the diagnosis, prog-nosis of various diseases. However, thesample is more difficult when setting its proteome,duetothepresenceofinterfe-renceandabundantproteins thathinderthe detection of minor proteins.To im-provetheresolutionofproteinsseparatedbyelectrophoretictechniques,wecompa-redifferentmethodsofremovalofmajorproteinsinplasmaofpatientswithacutecoronarysyndrome,byusingtechniquesof precipitation with salts and organicsolventsatdifferentconcentrations.Sub-sequently,theremovalofplasmaproteinstreated by these methods was verified by proteomicanalysisbyusingproteinelec-trophoresis (1D-and 2D-SDS-PAGE),imageanalysisandbioinformatics tech-niques.Theanalysisshowedthatsimplemethodssuchastreatmentwithacetone75%(v/v)decreasedtheconcentrationofalbumin, removed the interferences thathinder the detection of minor proteins,increasing the intensityofprotein spotsseparatedby2Delectrophoresis,andim-proving the resolution and detection ofseparatedproteinsofbloodplasma.

Key words: Bloodplasma,proteomics,acute coronary syndrome, electrophore-sis.

Resumo

Oplasmasanguíneorepresentaumadasamostrasdemaiorinteressenodiagnós-

tico-prognóstico de diversas doenças.Noentanto,constituiaamostrademaiordificuldade no momento de estabelecer o seuproteômadevidoàs interferênciaseàs proteínas abundantes que dificultam a detecção de proteínas minoritárias.Afim de melhorar a resolução de proteínas separadas por técnicas eletroforéticas,comparam-se diferentes métodos de re-moçãodeproteínasmajoritáriasdoplas-madepacientescomsíndromecoronáriaagudo, usando técnicas de precipitaçãocomsaisesolventesorgânicosemdife-rentes concentrações. Posteriormente, aremoçãodeproteínasdoplasmatratadopor meio destas metodologias foi verifi-cadaatravésdaanáliseproteômicausan-do eletroforese de proteínas (1D e 2DSDS-PAGE),análisedeimagensetécni-casdebioinformática.Aanálisemostrouquemetodologiassimplescomootrata-mentocomacetona75%(v/v)diminuiuaconcentraçãodealbumina,retirouasin-terferências que dificultavam a detecção deproteínasminoritárias,aumentandoaintensidadedosspotsdeproteínassepa-radosporeletroforese2D,emelhorandoaresoluçãoedetecçãodasproteínasse-paradasdoplasmasanguíneo.

Palavras–chave: plasma sanguíneo,proteômica, síndrome coronária aguda,eletroforese2D.

IntRoDuccIÓn

Elplasmasanguíneoesunamezclacom-plejadeproteínas,aminoácidos,hidratosdecarbono,lípidosysalesendisolución.Eslamuestrahumanamásutilizadaeneldiagnóstico de enfermedades, y su pro-teomaeselmásgrandeycomplejoquesepuedaobtener,yaquenosolosecom-pone de proteínas plasmáticas sino que


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también reúne una infinidad de biomar-cadoresprovenientesde todos losórga-nosytejidos(1).Enlosúltimosañoshancomenzado a usarse herramientas paradescubrir e identificar nuevos biomarca-doresenmuestrasdeplasma,quepodríanactuar como indicadores de enfermeda-des o estados fisiológicos de un paciente (2).Dentrodeéstas, sedestaca la elec-troforesisbidimensional2D-PAGE;unaherramienta útil en proteómica, ya quepermite separar mezclas complejas quecontienen miles de proteínas e inclusoresolveraquellasquecompartenpropie-dadesfísico-químicassimilares(3).

A pesar de la importancia del plas-madesdeelpuntodevistaclínico,sobretodoparaeldiagnósticoyelpronósticodeenfermedades,sonpocoslosestudiosde expresión de proteínas (proteómicadiferencial) realizados en el plasma depacientesconsíndromecoronarioagudo(SCA).Además,esdifícilladeteccióndeproteínas minoritarias en el plasma hu-mano,debidoprincipalmentea lasmúl-tiples dificultades asociadas a la determi-naciónde suproteoma, entre las cualessecuentalapresenciadeproteínascomoalbúminae inmunoglobulinas.Estas re-presentan aproximadamente el 70% delcontenidoproteicototaldelplasma(1,4).Además,lasproteínasplasmáticascomolaalbúminapuedenactuarcomotraspor-tadoresounirseaotrasproteínasymo-léculasde la sangrede interésdiagnós-tico y biomédico, tales como citocinasyquimioquinas(5).Paralaremocióndeestasproteínasmayoritarias,porejemploalbúmina e inmunoglobulina G, se hanutilizado métodos como cromatografíade afinidad (6, 7), precipitación por sol-ventes orgánicos–por ejemplo, acetona,etanol o TCA– o separación por ultrafil-

tración (4, 8). Sin embargo, algunas deestasmetodologíaspuedenpresentarar-tefactos metodológicos que dificultan la separacióndeproteínasygeneranruidoen los métodos de tinción utilizados enelectroforesis. Estas dificultades mues-tranqueunaadecuadapreparacióndelamuestra de plasma es uno de los pasosclave en la separación de proteínas porelectroforesis2D-PAGE,locualpermiteunamejorresolucióndeproteínasenlosgelesbidimensionales(9).

Aunque se han realizado grandesesfuerzos en el desarrollo de diversosmétodospararetirar lasproteínasabun-dantes del plasma, los procedimientosdisponibles presentan dificultades de disponibilidad y especificidad. En los métodos basados en la afinidad de la albúmina por algunos colorantes, se hadeterminado que su baja especificidad permite la unión de diversas proteínas(10). Además, se ha comprobado quelaalbúminapresentamúltiplessitiosdeuniónaproteínasymetabolitos, locualsugiereque,alretirarladelplasma,tam-biénseestánperdiendoproteínasdebajaabundancia (11). Se han utilizado tam-bién técnicasbasadas en launión espe-cífica de la albúmina a anticuerpos, pero sualtocosto,bajacapacidaddemuestraylareactividadcruzadaconotrasproteí-nashanlimitadosuuso(9).Porestara-zón,esnecesariobuscaralternativasmáseconómicas para mejorar la resoluciónde proteínas menos abundantes. Se hadeterminadoque laalbúminaessolubleensolventesorgánicosyquemezclasdeacetona al 80% con ácido trifluoroacético (TFA)hanpermitidosepararlaalbúminade laglobulina en el suero (2).En estetrabajo comparamos varios métodos deprecipitacióndeproteínasdelplasmacon


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elobjetivodemejorarlaresoluciónylaseparacióndeestasmedianteelectrofore-sisbidimensional (2D)conmuestrasdeplasmasdepacientesconSCA.

mAteRIALes Y mÉtoDos

obtención de la muestra

Lasmuestrasde sangre fueron tomadasdel plasma de un individuo con angi-na inestableyunpaciente sano tomadocomocontrol.Lospacientesparticipan-tes en el estudio firmaron el consenti-mientoinformadoyelestudiocontóconla aprobación del comité de ética delHospitalUniversitariodeSantander.Lospacientesanalizadosnopresentabanan-tecedentespatológicosyel tipode san-gre en ambos casos fue O Rh positivo.Laconcentracióndeproteínastotalesenelplasmadelpacienteconanginainesta-bleyelpacientecontrolfue88,5(±0,5)mg/mL y 86,1 (±0,5) mg/mL, respectiva-mente.Laconcentracióndeproteínasto-tales se cuantificó mediante el método de Bradford(12).Seutilizó1mgdeproteí-naenlasexperienciasderemocióndelasproteínasmayoritarias por precipitaciónporsolventesorgánicos,mientrasqueelmétodo de precipitación con sulfato deamoniofuerealizadocon2,7mgdepro-teínasoluble.

Preparación de la muestra

Con el propósito de retirar proteínasabundantes y compuestos interferentes,serealizóunacomparaciónentrediversosprocedimientos:usodeunkitcomercial–Aurumserumproteinmini-Kit (Bioradlaboratories,Hércules,CA,USA)–,pre-cipitación con ácido trifluoroacético-ace-tonitrilo (TFA-A) (Sigma-Aldrich, ST.

Louis,MO,USA)(13),precipitaciónconacetona(Sigma-Aldrich,ST.Louis,MO,USA)(14),precipitaciónconacetonitrilo(Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO, USA)(15)yprecipitaciónconsulfatodeamo-nio(al30,50y70%desaturación)(Sig-ma-Aldrich,ST.Louis,MO,USA).

Kit Aurum serum protein mini-kit (ASP): parausarlo,sesiguieronlasins-truccionesdelacasacomercialBio-Rad.

Precipitación con ácido trifluoroacé-tico-acetonitrilo (TFA/ACN): 300 µL deplasmasemezclaroncon200µLdeunasolución de TFA/ACN (1mL/L). Pos-teriormente, se centrifugó la mezcla a10000g durante 10 minutos, se retiró elsobrenadanteyserepitióelciclodecen-trifugaciónhastaobtenerunsobrenadanteclaro. Finalmente, los precipitados obte-nidosfuerondisueltosenbufferderesus-pensión (BR), compuesto por urea 8M,3-[(3-colamidopropil) dimetilamonio]-1-propanosulfonato(CHAPS)2%p/vydi-tiotreitol (DTT)50mM(Sigma-Aldrich,ST.Louis,MO,USA).

Precipitación con acetona: unamuestradeplasmaquecontenía799,5µgde proteína fue diluida hasta 50 µL enPBS (buffer fosfato salino). Tres volú-menesdeacetonafría fueronagregadosalamezclaeincubadatodalanocheenhielo.Posteriormente,fuecentrifugadaa10000g durante 30 min. El precipitadoobtenidosedejósecaralaireyseresus-pendióenbufferBR.

Precipitación con acetonitrilo: 50µldeplasmasediluyeronen350µldeaguadesionizaday100µldeacetonitrilo.Lasmuestras fueron incubadas por 30 mi-nutos y posteriormente centrifugadasa 14000g durante el mismo periodo. El


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precipitado obtenido se resuspendió enbufferBR.

Precipitación con sulfato de amonio (30%, 50% y 70% de saturación): sedi-solvieron2mgdeproteínadeplasmaenPBS hasta un volumen final de 500 µl, se adicionaron 88mg de sulfato de amoniohastaalcanzarun30%desaturación.Semezclósuavementepor10min,seincubóduranteunahoraatemperaturaambienteysecentrifugóa10000ga20°Cdurante30min.Lasproteínasenelsobrenadantefueron fraccionadas al 50 y 70% de sa-turaciónaladicionar72y77mg,respec-tivamente. La mezcla fue tratada comosedetalló.Cadaprecipitadoobtenidofuelavadocon300µldeacetonafríaal90%yresuspendidosen200µldeBR.

electroforesis en geles de poliacrila-mida 1D-PAGe. Lasfraccionesproteicasobtenidasconlosdiferentestratamientosfueronevaluadasmedianteelectroforesisunidimensional en condiciones desnatu-ralizantes.Elplasmatratadofuemezcla-doconbufferdecargaqueconteníaTris-HCl 0,125M pH 6,8, glicerol 20% v/v, 2-mercaptoetanol10%p/v,SDS4%p/vyazuldebromofenol0,05%p/v.Posterior-mente, la mezcla fue sometida a ebulli-ciónycongelaciónporcincominutos.Acontinuación, la separacióndeproteínassellevóacaboencámarasdeelectrofo-resisMini-Protean(BIO-RAD,Hércules,CA,USA),usandogelesdepoliacrilami-daSDS-PAGEal10%p/v,preparadosdeacuerdo con el método de Laemmli (16). Laseparaciónserealizóa120Vduranteunahoraydiezminutos.Finalmente,losgeles obtenidos fueron teñidos con azuldeCoomassieR-250.

electroforesis bidimensional 2D-PAGe

Losprocedimientosquepresentaron losmejoresresultadosfueronevaluadosme-diante electroforesis bidimensional conelsiguienteprocedimiento:

Unvolumendeplasmaquecontenía180µgdeproteínafuedisueltoenbufferde rehidratación que contenía urea 8M,CHAPS 2% p/v, DTT 50mM, anfolitos(3-10 pH) 0,2% v/v (Biorad laborato-ries,Hércules,CA,USA)yazuldebro-mofenolal0,001%p/v.Estamezclafueaplicada a tiras de 7cm en un rango depHde4-7, conservadasenunabandejaderehidratacióndurante10horas.Poste-riormente,lasmuestrasfueronenfocadasenunequipoProteanIEF(BioradLabo-ratories,Hércules,CA,USA)durante14horasa20°C,segúnelsiguienteprogra-ma: 30’ 300V, 3h 3500V, 1.5h 6000V (en gradiente),hasta50000V/htotales.

Unavezseequilibraronlasmuestrasconagentesalquilantesy reductores, serealizólaseparacióndelasproteínasdeacuerdoconsumasa,encámarasdeelec-troforesisMini-Protean(Bioradlaborato-ries,Hércules,CA,USA),mediantegelesdepoliacrilamidaal10%p/vpreparadossegún el método de Laemmli (16). La se-paraciónserealizómedianteunafuentedevoltajePowerPac250(BioradLabo-ratories,Hércules,CA,USA)durante1horay25minutosa120V.

tinción de los geles. Se realizó latincióndelosgelesconazuldeCoomas-siecoloidalG-250medianteelsiguienteprocedimiento: el gel fue incubado du-rantetreshorasatemperaturaambiente,conagitaciónconstanteenunasoluciónfijadora que contenía etanol 30% v/v y


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ácido fosfórico2%v/v.Posteriormente,selerealizarontreslavadosde10minu-toscadaunoconaguatipoI.Mantenien-dolaagitación,fueincubadoduranteunahoraenlasolucióndetincióncompuestapor 17% p/v de sulfato de amonio, 3%v/vdeácidofosfóricoy33%v/vdeme-tanol.Aestasoluciónfueagregadoazulde Coomassie G-250 al 0,06% disuelto enmetanol.Elgelpermanecióenestaso-lucióndurante20minutos.El contrasteadecuadoparaobservarlasproteínasfuealcanzadoaldesteñirconagua.

captura de imágenes y análisis de los resultados de electroforesis bidimensional (2D)

Después de decolorar por 14 horas, losgeles fueron escaneados mediante unescáner UMAX Powerlook 2100 XL(Umaxtechnologies,Dallas,TX,USA).Posteriormente, fueronenviados al pro-gramaPDQuest2Dsoftwaredeanálisis(BIORAD,Philadelphia,PA,USA),don-de las imágenes fueron filtradas y nor-malizadaslasdiferenciasdetinciónme-dianteelmodeloderegresiónlocal.Lasmanchas identificadas fueron detectadas yemparejadasconuna revisiónmanualpormenorizada de los emparejamientosdetectados automáticamente. Finalmen-te,fueronestablecidaslasdiferenciasenelnúmeroylaintensidaddelasproteínasidentificadas en cada tratamiento.

Análisis bioinformático

Comounaaproximaciónparaencontrarlaidentidadpresuntivadeaquellasman-chasausentesenelgeldelamuestradeplasmasin tratamiento, seorganizóunabase de datos con las proteínas identi-ficadas en el plasma mediante análisis

proteómicos, relacionadasconenferme-dades cardiovasculares. Posteriormente,sedeterminóelpesomolecular(PM)yelpuntoisoeléctrico(pI)deestasproteínasconlaherramientaproteómicadecarac-terizacióncompute pI/Mw.Estasaplica-ciones están disponibles en el sistema experto de análisis de proteínas(expasy)(www.expasy.org). A continuación, secompararonlosvaloresdePMypIteóri-coscalculadosmedianteexpasy,conlosvalores de PM y pI que se asignaron alas proteínas identificadas en el presente estudio.Solofueronasignadasidentida-desalasproteínasquepresentabandife-rencias en sus valores de MP iguales aomenoresde±1,5kDa,ydiferenciasenpIigualesaomenoresde±0,2unidadesconrespectoalosvaloresdePMypIto-madosde lasbasesdedatos.Elcriteriode identificación se determinó teniendo en cuenta las variaciones reportadas enlas proteínas identificadas, separadas por 2D-PAGE,queseencuentranenlabasededatosSWISS2D-PAGE(basededa-tosdeproteínas,quecontienelosvaloresde PM y pI, encontrados experimental-menteengeles2D-PAGE,delasproteí-nas identificadas por espectrometría de masas(Ms)enelmapadeproteínasdelplasmahumano).

ResuLtADos Y DIscusIÓn

Elplasmahumanoeslamuestramásim-portanteymásusadaeneldiagnósticodediversasenfermedades(1).Sinembargo,es una de las muestras más difíciles deanalizarpor2D-PAGE.Ennuestroestu-dio, esta situación no fue la excepción,sobre todo debido a la gran proporciónde albúmina, el amplio rango dinámicoobservadodeabundanciadeotrasproteí-


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nas,lagranheterogeneidaddesusglico-proteínaspredominantes(17)ylasinter-ferencias que contiene y que dificultan la separacióndeproteínas(9).

comparación de los métodos de precipitación utilizando electrofore-sis unidimensional (1D-PAGe).Conelpropósito de monitorear los resultadosdelosdiversosmétodosdeprecipitación

empleados,seanalizaroninicialmentelasproteínasdelosplasmascontratamientodeprecipitaciónysineste,medianteelec-troforesis unidimensional (1D-PAGE)(Figura1).Inicialmente,serealizólase-paracióndetodoslossobrenadantesypre-cipitadosobtenidos.Sinembargo,solosepresentanlosprocedimientosquemostra-rondisminuciónenlosnivelesdealbúmi-naypresenciadeproteínasminoritarias.

Figura 1.Gel1D-PAGEcomparativodelostratamientosdeprecipitaciónempleados.1)Mar-cadordepesomolecular,2)Muestradeplasmasin tratamiento,3)Muestradeplasma tratadautilizandoelkitaurumserumprotein(BIORAD),4)Muestradeplasmatratadaconprecipitacióncon sulfatode amonioal50%de saturación,5)Sobrenadantede lamuestradeplasma tratadacon precipitación con acetonitrilo/ácido trifluoroacético (ACN/TFA 1 L/mL), 6) Precipitado de la muestra de plasma tratada con acetonitrilo/ácido trifluoroacético (ACN/TFA 1 L/mL), 7) Muestra deplasmatratadaconprecipitaciónconACN,8)Muestradeplasmatratadaconacetonaal75%.Laseparaciónunidimensionalserealizóutilizandogelesdepoliacrilamidaal10%,teñidosconazuldeCoomassieR-250.

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IgG cadenas pesadas

IgG cadenas livianas


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ComoseobservaenlaFigura1,lostra-tamientosdeprecipitacióncon(NH4)2SO4al50%p/vdesaturaciónyconacetonaal75%v/v,representadosporlospatronesdeproteínas presentes en los carriles 4 y 8,mostraronpatroneselectroforéticossimila-resalosobtenidosconelkitAurumserumprotein(Bioradlaboratories,Hércules,CA,USA) (carril 2). Los resultados de estostratamientos((NH4)2SO450%yacetonaal75%)muestrandisminuciónenlaconcen-tracióndealbúmina,mayor intensidadenlasbandasseparadasypresenciadealgu-nasproteínasquenofuerondetectadasenelpatrónelectroforéticodelamuestrasintratamiento(carril1).

La reducción en los niveles de al-búmina por precipitación con acetona(75%v/v)ysulfatodeamonio(50%p/v)mostróresultadossatisfactoriosen laeliminación de proteínas mayoritariasdelplasma.Engeneral,estastécnicasdeprecipitación con solventes orgánicos ysalessonprocedimientossimplesypococostosos,ypresentanmayorestabilidad,eficiencia y manipulación (18). Sin em-bargo, el exceso de sales en la muestradeplasmatratadaconsulfatodeamonio(50% p/v) dificulta la migración de las proteínas, locual requeriríaunprocedi-miento adicional de desalinización, querepresenta un aumento en el tiempo de

análisisyenelcostodelprocedimientodepreparacióndelasmuestras.

separación de las proteínas de las muestras de plasma tratadas con los métodos de precipitación seleccionados, utilizando electroforesis bidimensional 2D-PAGe

EnlasFiguras2y3seobservan lasimágenes de los geles bidimensionalesobtenidosparalasmuestrasdeplasmasintratamientoylasmuestrasdeplasmatra-tadasconsulfatodeamonioal50%desa-turaciónyacetona(75%v/v),obtenidospara el paciente con SCA y el pacientecontrol. Los geles bidimensionales 2D-PAGEdelasmuestrastratadasconsulfa-to de amonio presentan aparentes dificul-tadesenlamigracióndelasproteínas.Seobservaapiñamientode lasproteínasdepesosmoleculares consecutivos, apesardequeentodaslasseparacionesrealiza-dasseusarongelesdeSDS-PAGEal10%p/v.Además,seobservadistorsióndelasmanchas separadas y disminución enel número de proteínas detectadas. Estopuede ser producto de sales remanentesdespuésdel tratamiento,quepodríandi-ficultar la separación de las proteínas. Se ha establecido que las sales interfieren al enfocarlasproteínasenlaseparaciónporpuntoisoeléctrico(9)(Figura2).


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Figura 2A.Gel2D-PAGEdelplasmahumanocontratamientodeprecipitaciónysinéste.(A)Muestradeplasmasintratamiento(pacienteconSCA).Laseparaciónbidimensionalserealizóusandotirasde7cmde4-7depHenlaprimeradimensiónygelesdepoliacrilamidaal10%enlasegundadimensión.LosgelesfueronteñidosconazuldeCoomassiecoloidalG-250.

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Figura 2b.Gel2D-PAGEdelplasmahumanocontratamientodeprecipitaciónysineste.(B)Muestradeplasmatratadaconsulfatodeamonioal50%desaturación(pacienteconSCA).Laseparaciónbidimensionalserealizóusandotirasde7cmde4-7depHenlaprimeradimensiónygelesdepoliacrilamidaal10%enlasegundadimensión.LosgelesfueronteñidosconazuldeCoomassiecoloidalG-250.

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Figura 2c.Gel2D-PAGEdelplasmahumanocontratamientodeprecipitaciónysineste.(C)Muestradeplasmatratadaconprecipitaciónconacetona(pacienteconSCA).Laseparaciónbi-dimensionalserealizóusandotirasde7cmde4-7depHenlaprimeradimensiónygelesdepoliacrilamidaal10%enlasegundadimensión.LosgelesfueronteñidosconazuldeCoomassiecoloidalG-250.

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Figura 2D.Gel2D-PAGEdelplasmahumanocontratamientodeprecipitaciónysineste.(D).Muestra de plasma sin tratamiento (paciente control). La separación bidimensional se realizóusandotirasde7cmde4-7depHenlaprimeradimensiónygelesdepoliacrilamidaal10%enlasegundadimensión.LosgelesfueronteñidosconazuldeCoomassiecoloidalG-250.


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Figura 2e.Gel2D-PAGEdelplasmahumanoconysintratamientodeprecipitación.(E).Mues-tradeplasmatratadaconsulfatodeamonio50%desaturación(pacientecontrol).Laseparaciónbidimensionalserealizóusandotirasde7cmde4-7depHenlaprimeradimensiónygelesdepoliacrilamidaal10%enlasegundadimensión.LosgelesfueronteñidosconazuldeCoomassiecoloidalG-250.

Figura 2F.Gel2D-PAGEdelplasmahumanoconysintratamientodeprecipitación.(F).Muestradeplasmatratadaconacetona75%v/v(pacientecontrol).Laseparaciónbidimensionalserealizóusandotirasde7cmde4-7depHenlaprimeradimensiónygelesdepoliacrilamidaal10%enlasegundadimensión.LosgelesfueronteñidosconazuldeCoomassiecoloidalG-250.

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Asimismo,alobservarde formage-nerallatincióndecadagel,losgelesco-rrespondientesalasmuestrasdeplasmasin tratar tienenporcionesmásoscuras,apesardelauniformidadenlaconcen-traciónde lasoluciónde tinción,en lostiempos de corrido, tinción y desteñidoaplicadosentodoslosgeles.Delmismomodo,sepresentamayorruidoeinterfe-renciasenlosgelescorrespondientesalamuestradeplasmasintratarcomparadosconaquellosobtenidosparalasmuestrastratadas con acetona. Por consiguiente,estos últimos presentan mayor eficiencia alretiraralbúminadelamuestradeplas-ma.Portanto,aumentalanitidezenlasproteínasseparadasy,talcomoresaltaenlosóvalosdelasFiguras2C,2F,seiden-tifican proteínas que no aparecieron en el geldelamuestradeplasmasintratar.

Análisis de los resultados de electroforesis bidimensional (2D)

Elanálisisdelasimágenesdelamuestraoriginalylamuestratratadaconacetonaal 75% v/v del paciente con SCA, me-diante el software PD-Quest Advanced(versión 8.0.1), mostró la presencia de104manchas,delascuales22nofueronidentificadas en el gel sin tratamiento y 44 manchas cuyas intensidades fueronmayores en el gel correspondiente a lamuestra tratada con acetona (75% v/v).Se determinó la presencia de 18 man-chas que mostraron aumentos mayoresdel20%enlaintensidaddesusniveles,19manchascuyoaumentosobrepasael

50%y7manchasenlascualesladetec-ción fue mayor del 100%, comparadascon las intensidadesdetectadasdeestasmanchasenlamuestrasintratamiento.

Alanalizarlasimágenesdelpacientecontrol, se identificaron 119 manchas, de lascuales38estabanausentesenelgelsintratamiento y 26 manchas cuyas intensi-dadesfueronmayoresenelgelcorrespon-diente a la muestra tratada con acetona.Sedetectaron9manchasquepresentabanniveles de expresión aumentados en un20%,12manchascuyoaumentosobrepa-sael50%y5manchascuyosnivelesdeexpresiónexcedenel100%.

Estos resultados se deberían a quelas proteínas del plasma podrían estarenlazándose a lípidos mediante interac-cioneshidrofóbicas,lascualesproducenartefactosenlosgelesde2D-PAGE.Esteefectoseríamitigadoporlaprecipitacióndelasproteínasdelplasmaconacetona,lo cual disminuiría estas interacciones,permitiendo una mejor separación delas proteínas del plasma. Se ha demos-tradoqueloscomplejoslípidos-proteínapuedensercompletamenteinsolublesensoluciones acuosas y, por consiguiente,podríannomigrarenlamatrizdepolia-crilamida(19).

EnlaTabla1sepresentalacaracteri-zaciónpormasaypuntoisoeléctrico(pI)de las proteínas que no fueron identifi-cadasenlosgelescorrespondientesalamuestrasdeplasmasintratamiento(Ta-bla1).


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tabla 1. Valores de masa y punto isoeléctrico de las proteínas identificadas en el gel correspon-dientealasmuestrasdeplasmatratadasconacetona,ausentesenelgeldelamuestradeplasmasin tratamiento.Elanálisis se realizóenel softwaredeanálisisPD-QUESTversión8.0.1; losvaloresdepuntoisoeléctricosedeterminarontomandocomoreferencialasmasasyelpIdepro-teínas conocidas. Inicialmente, se presentan las proteínas identificadas en el plasma del paciente conSCA;enseguidaseincluyenlasproteínasquecoincidenenlasdosmuestras(sombreadas).Finalmente,sepresentanlasproteínasdetectadasenelpacientecontrol.

Masa (kDa) Punto isoeléctrico, pI (unidades) Masa (kDa) Punto isoeléctrico, pI (unidades)

28,70 6,5 56,10 5,1

77,40 5,2 76,50 4,7

63,30 4,3 60,20 4,1

76,40 4,5 63,60 4,5

48,60 4,5 44,10 5,2

78,30 6,1 58,80 5,2

78,60 6,0 58,10 5,0

78,70 6,0 78,20 4,9

46,50 5,3 57,30 5,2

49,00 5,6 76,30 4,4

43,40 5,0 52,30 4,7

15,30 4,85 30,30 5,53

14,80 4,65 34,15 4,98

19,40 5,7 35,43 4,96

34,07 4,71 27,38 5,21

28,84 4,85 41,17 5,9

48,59 4,69 58,22 6,41

LaFigura3presentauna imagen tri-dimensional de las imágenes obtenidaspara la muestra precipitada con acetonaylamuestrasintratamientodelpacienteconSCA.Laaparienciadeestasimágenesmuestra el gran ruido de fondo presenteen lamuestradeplasmasin tratamiento,el cual solapa las proteínas de interés;mientrasquelaimagenobtenidaaltratarlamuestraconacetona(75%v/v)mues-tra los picos más definidos y la reducción significativa de las interferencias que pro-ducen ruido de fondo con el método de

tinciónusado.Estasdiferenciasenlaapa-rienciade la tinciónde losgelespuedenserresultadodelasinteraccionesdeloslí-pidosydelasimpurezasconlaspartículascoloidalesdelcolorante.Lainteraccióndeimpurezasenlasolucióndetinciónpodríainterferirenelanclajedelasmoléculasdecolorante a la fracción de proteína y, deesta manera, obstaculizar las interaccio-neshidrofóbicasdeesteconlosresiduosaromáticos del esqueleto polipeptídico(20)(Figura3).


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Figura 3.Imagentridimensionaldelasregionesmarcadasenlosóvalosmarcadosenlosgeles.A)Geldelamuestratratadaconprecipitaciónconacetonaal75%v/v(pacienteconSCA).B)Geldelamuestradeplasmasintratamiento(pacienteconSCA).LasimágenestridimensionalesfueronobtenidasmedianteelsoftwarePD-QUEST(8.0.1).

Análisis bioinformático

La base de datos de proteínas del plas-ma (HUPO)y losestudiosdeproteínasplasmáticas basados en herramientasproteómicas(15,21-24)nospermitieron,mediantelacomparacióndesusvaloresde masa molecular (PM) y punto iso-eléctrico(pI),conrespectoalosvaloresteóricos establecidos para las proteínasidentificadas en el proteoma del plasma, asignar la aparente identidad a las pro-teínas identificadas en los geles de las muestrasdeplasmatratadasconacetona(75% v/v), ausentes en los geles de lasmuestrasdeplasmasintratamiento.

EnlaTabla2semuestranlasidentida-desasignadasaaquellasproteínascuyosvaloresdePMypIcumplenconelcriteriodecomparaciónestablecidoenelanálisisbioinformáticorealizado(Tabla2).

La asignación de la presunta identi-dadalasproteínasausentesenlosgelesdelamuestrasintratamientomuestralapresencia de proteínas relacionadas conprocesos como inflamación, coagulación, remodelamientodelostejidosymetabo-lismootransportedelípidos(24-27).Es-tosresultadoscorroboranlaimportanciadelosprocedimientosdepreparacióndela muestra en los análisis de proteínaspor2D-PAGE.

Además, se realizó la comparacióndel patrón de proteínas observado parael paciente con SCA con respecto alobservado en el paciente control. Sedeterminaron diferencias claras en losniveles de expresión de más de veinteproteínas.Entreestas,sobresaleuncon-juntodeisoformasquepresentannivelesdeexpresiónaumentadosenelpacienteconSCA,conrespectoalcontrol(Figu-


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ra 4). El análisis bioinformático revelóqueestaproteínapodría corresponder ala α-1-antiquimiotripsina, serpina queinhibe laactividaddealgunasproteasas(28).Estasproteínashansidovinculadasal remodelamientode los tejidos en lossitios de inflamación y lesión posteriores aunSCA.ElaumentoenlosnivelesdeestaproteínaenelpacienteconSCAco-incideconlosresultadosdeotrosautores(29,30).Elaumentoenlosnivelesplas-máticosdeestaproteínaenpacientesconSCApodríaindicarsuimportanciacomobiomarcadordediagnósticoopronósticoenlospacientesconSCA.

Los resultados muestran que la pre-cipitaciónconacetonapropuestaenestetrabajo reduce la interferencia de la al-búminayelruidodefondoenlatinciónconazuldeComassiecoloidalG-250,locualmejoralaaparienciadelasproteínasseparadas. Esto permitiría identificar un

grannúmerodecandidatosabiomarca-dores que podrían ser relevantes en uncontextoclínicoyquepodrían servali-dados en el plasmausandouna cohortedepacientes(21).

tabla 2. Identidadpresuntivade lasproteínasausentes enelgelde lamuestradeplasma sintratamiento.Enlaasignacióndelaidentidadseempleóanálisisbioinformáticomediantelashe-rramientasdeanálisisdeproteínaspresentesenlaExpasy.

Código PDB Proteína PMEx pIeEx PMT pIT

P00738 Haptoglobina 28,7 6,50 27,3 6,32

P10636 Proteína Tau 78,3 6,10 78,8 6,26

P00740 Factor de coagulación IX 46,5 5,30 46,6 5,20

P01011 α-1 antiquimiotripsina 46,2 5,20 45,0 5,26

P01019 Angiotensinogeno 49,0 5,60 49,8 5,60

P14136 Proteína ácida glial fibrilar 48,7 5,39 49,9 5,42

P06727 Apolipoproteína A-IV 43,4 5,00 43,4 5,18

P01009 α-1 antitripsina 44,1 5,20 44,3 5,37

P09603 Factor estimulante de macrófagos 57,3 5,20 56,9 5,07

P0C0L5 Complemento C4 77,4 5,20 75,5 5,05

P06805 Hexosaminidasa 52,3 4,70 50,6 4,83

P10645 Cromogranina A 48,6 4,50 48,9 4,57

Figura 4.Patrónrepresentativodelosnivelesdeexpresiónde la1-antiquimiotripsinaenelplasmadeunpacienteconSCAyunpacientesanotomadocomocontrol.

PacienteconSCA

control


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Eltratamientoconacetonarepresen-taunprocedimientoútilysencilloenlapreparacióndelasmuestrasdeplasmadepacientesconSCA,previaseparacióndeproteínascon2D-PAGE.Estametodolo-gíareducelasinterferenciascausadasporelexcesodealbúmina,mejoralaresolu-cióndeproteínasmenosabundantesyre-duce las líneashorizontalesyverticalesengelesteñidosconazuldeCoomassiecoloidal. Además, el procedimiento esdebajocostoynorequiereequipos tanespecializados, locualpermitequeestéalalcancedecualquiercentrode inves-tigación.

AGRADecImIentos

Elgrupode investigaciónenBioquími-cayMicrobiología(GIBIM)agradeceala Universidad Industrial de SantanderyaColcienciasporelapoyoeconómicobrindadopararealizarestainvestigacióna través del proyecto código 1102-408-20435.

conFLIcto De InteReses

Losautoresdeclaranquenoexistenin-gún conflicto de interés en relación con la originalidaddeltrabajoysucontenido.

Fuente De FInAncIAcIÓn

Este trabajo fue financiado por el Insti-tutoColombianoparaelDesarrollodelaCienciaylaTecnologíaFranciscoJosédeCaldas(Colciencias)mediantelaaproba-ción del proyecto “Identificación de mar-cadoresderivadosdelpéptidonatriuréticoproBcomopredictoresdemortalidadenpacientesconsíndromecoronarioagudo”,código1102-408-20435.

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